JPH06145311A

JPH06145311A - バイオポリエステル共重合体とその製造方法

Info

Publication number: JPH06145311A
Application number: JP5175895A
Authority: JP
Inventors: Yoshiharu Doi; 義治土肥
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1992-09-16
Filing date: 1993-06-24
Publication date: 1994-05-24
Anticipated expiration: 2017-04-30
Also published as: JP3280123B2

Abstract

(57)【要約】【目的】Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と
３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）をモノマー単位
とする新規な組成の２元共重合体、Ｐ（３ＨＢ／３Ｈ
Ｐ）（ただし、３ＨＰモル分率は１０％以上）およびそ
の微生物による製造法を提供する。【構成】 Alcaligenes latus の菌株を液体培養する
際、炭素源として３ＨＰ単位を生成する炭素化合物をそ
の一部または全部に用いることにより、Ｐ（３ＨＢ／３
ＨＰ）を広範な組成範囲に亘って生合成し、蓄積させて
採取することを実現した。【効果】本発明の２元共重合体は、溶融時熱安定性が
良く、所望の柔軟性を有する特長があり、生分解性、熱
可塑性プラスチックとしての利用に適する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｄ（−）−３−ヒドロ
キシブチレート（３ＨＢ）をモノマー単位として含有す
る新規な脂肪族ポリエステルと、微生物の生合成機能を
利用して該ポリエステルを製造する方法に関するもので
ある。３ＨＢの単独重合体、ポリ（３−ヒドロキシブチ
レート）（ＰＨＢ）に代表される一群の微生物産生ポリ
エステルは、石油由来の合成高分子とは異なり、微生物
により、あるいはヒトを含めた高等動物の体内で容易に
分解される性質（生分解性）を有している。近年夥しい
量の合成高分子がプラスチック等として多方面で利用さ
れると共に、使用済のプラスチックが腐らない嵩高い廃
棄物として蓄積し、自然環境の汚染を起こすことが深刻
な問題となっている。微生物産生ポリエステルは生分解
されることにより自然の物質循環に取り込まれるので、
環境保全を可能とするプラスチックとして利用すること
ができる。また、医療分野においては、回収不用のイン
プラント材料、薬物担体としての利用が可能である。

【０００２】

【従来の技術】従来、多種の細菌がＰＨＢを菌体内に生
成し、粒子として蓄積することが報告されてきた〔 H.B
randle et al, Adv. Biochem. Eng.／ Biotechnol., 4
1, 77−93 (1990) 〕。このＰＨＢの細菌を用いた製造
方法には、特開昭５６−１１７７９３、特開昭６０−１
９９３９２、特開昭６２−５５０９４等が知られてい
る。一方、ＰＨＢの硬くて脆いという欠点を克服するた
めに、３ＨＢと他のモノマー単位から成る共重合ポリエ
ステルの生合成が報告されている。例えば、３ＨＢとＤ
（−）−３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）との共重合体
（特開昭５７−１５０３９３、特開昭６３−２６９９８
９等）や、３ＨＢと４−ヒドロキシ酪酸との共重合体
（特開平１−４８８２１）が知られている。また、３Ｈ
Ｂと３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）との共重合
体の生合成も報告されている〔 Macromolecular Report
s, A 28 ( Suppl. 1 ), 15-24 (1991)〕が、３ＨＰ単位
のモル分率は、最高でわずかに７モル％と低く、広範囲
にわたって物性を調節するには不十分であった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、３ＨＢと３
ＨＰとの共重合体の組成が上記のように著しく限定され
ていた状況に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、該共重合体
の組成を広範囲に変化させ得ることを明らかにし、新規
な共重合体を提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】Macromolecular Report
s, A 28 ( Suppl. 1 ), 15-24 (1991) によると、予備
的培養によりポリエステルを蓄積することなく、予め増
殖させた Alcaligenes eutrophus（ＡＴＣＣ１７６９
９）を、ポリエステル生成に有利な窒素源を含有しない
培地中にて、唯一の炭素源として３−ヒドロキシプロピ
オン酸、１，５−ペンタンジオール、１，７−ヘプタン
ジオールのいずれかを用いて培養することにより、３Ｈ
Ｂと３ＨＰのランダム共重合ポリエステルを得たと報告
されている。しかし、共重合体中の３ＨＰ単位のモル分
率は小さく、１〜７％にすぎないものであった。また、
特開昭５８−６９２２４によれば、 Alcaligenes eutro
phus（ＮＣＩＢ１１５９９）を前半は無機培地に炭素
源としてグルコースを添加しながら培養して菌体を増殖
させ、後半は添加する炭素源を３−クロロプロピオン酸
またはアクリル酸に切り換えて培養した結果、モノマー
単位として３ＨＢ、３ＨＶおよびＡなる単位から成る３
元共重合体を得たことが開示されている。重合体中の単
位Ａのモル分率は０．６〜６．５％であった。そして、
単位Ａは３ＨＰ単位と推定されている。

【０００５】本発明者の知る限り、モノマー単位として
３ＨＰを含有する微生物産生ポリエステルは、上記の２
報に限られる。この両先行技術における培養では、先
ず、ポリエステルを含まない菌体を増殖させ、次いで、
ポリエステル生合成を行っている。このポリエステル生
合成段階では、（ｉ）窒素源をなくすことにより、炭素源の菌体増殖や
エネルギー生産への消費を抑える一方、ポリエステルの
生成を促進している。（ii) ３ＨＰ単位生成炭素源は、単独で使用したり、共
用する炭素源に対し高い量比でも使用を試みている。このようにポリエステル生成、とりわけ３ＨＰ単位の生
成を最大限促進する培養条件にも関わらず、生成したポ
リエステル中の３ＨＰ単位のモル分率は、既述のとおり
７モル％以下であった。

【０００６】このような従来技術の制約に鑑み、本発明
者は、各種の微生物により３ＨＢと３ＨＰの共重合体を
生合成する可能性を検討した結果、Alcaligenes latus
の菌株を液体培地中で培養するに際し、炭素源として３
ＨＰ単位生成炭素化合物を含む炭素源を用いることによ
り、３ＨＰ単位のモル分率が１０％以上の新しい組成の
共重合体を得るに到った。

【０００７】本発明により得られる共重合体は、

【化１】なる構造のＤ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）単
位と

【化２】なる構造の３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）単位
から成る。この中、３ＨＢ単位は光学活性で右旋性を示
し、共重合体中９０モル％以下を占め、３ＨＰ単位は１
０モル％以上を占める。３ＨＰ単位の含有率は、好まし
くは１０〜８０モル％、より好ましくは１０〜６０モル
％である。また、¹³ＣＮＭＲの解析により、共重合体
中でのモノマー単位（Ｉ）と（II）の配列はランダムで
ある。分子量に関しては、数平均分子量で５０，０００
〜５００，０００、好ましくは１００，０００〜５０
０，０００、重量平均分子量で８０，０００〜１，００
０，０００、好ましくは１５０，０００〜１，０００，
０００である。

【０００８】本発明の共重合体を製造するために用いる
微生物は、Alcaligenes latus の全ての公知の菌株、例
えば、ＡＴＣＣ（ American Type Culture Collection
) の菌株 No.２９７１２、２９７１３、および２９７
１４が適当である。Alcaligenes latus に関しては、バ
ージーズ・マニュアル（ Bergey's Manual of Systemat
ic Bacteriology, Vol.1 (1984) ）にその菌学的性質が
示されている。

【０００９】共重合体を製造するための上記の微生物の
培養は、液体培地中にて好気的に行う。培養温度は２５
〜４０℃、好ましくは２８〜３８℃である。培養の初発
ｐＨは６．０〜８．０、好ましくは６．５〜７．５であ
る。培地には合成、半合成、天然の培地のいずれも用い
ることができる。

【００１０】炭素源としては、蔗糖、麦芽糖、Ｄ−グル
コース、Ｄ−フルクトース、でん粉等の炭水化物；グル
コン酸、２−ケトグルコン酸、酢酸、酪酸、３−ヒドロ
キシ酪酸、イソ酪酸、クエン酸、コハク酸、フマール
酸、Ｄ（−）−酒石酸等の有機酸；グリセロール、プロ
ピレングリコール、２，３−ブチレングリコール等の多
価アルコール；Ｌ−α−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、
β−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパ
ラギン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、ザルコシン
等のアミノ酸、その他ブチルアミンが例示される。ま
た、糖蜜、ポリペプトン、肉エキス、カザミノ酸、酵母
エキス等の天然栄養源は、炭素源としてだけでなく複合
的または総合的な栄養源として用いることができる。

【００１１】培地中の窒素源としては、無機アンモニウ
ム塩、例えば、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム等、また、前記したアミノ酸類、天然
栄養源、および有機酸アンモニウム、有機アミドが用い
られる。また、無機イオンとしては、ナトリウム、カリ
ウム、マグネシウム、カルシウム、塩素、硫酸、燐酸の
他、微量の鉄、マンガン、亜鉛、銅、コバルト、ニッケ
ル、モリブデン酸、ホウ酸等が全て、または一部を組み
合わせて用いられる。

【００１２】本発明の共重合体を生成、蓄積させるため
には、上記した炭素源の他に、３ＨＰ単位を生成する炭
素化合物を培地中に存在させることが必要である。３Ｈ
Ｐ単位を生成する炭素化合物は培養開始時に培地中に存
在させてもよいし、増殖期の途中あるいは増殖期の後に
添加してもよい。また、培養開始時に存在させた後、培
養途中で連続的または断続的に添加する方法も効果的で
ある。培養途中で該炭素化合物を添加する場合、他の栄
養源と共に添加してもよいし、単独で添加してもよい。
前記先行技術においては、培養に際して、先ず、ポリエ
ステルを含まない菌体を増殖させているが、本発明にお
いては、３ＨＰ単位を生成する炭素化合物を培養開始時
に培地中に存在させても、菌の増殖と共にポリエステル
の生成が行われる。

【００１３】３ＨＰ単位を生成する炭素化合物として
は、３−ヒドロキシプロピオン酸、β−プロピオラクト
ン、３−クロロプロピオン酸等が挙げられる。特に３−
ヒドロキシプロピオン酸が好ましい。該炭素化合物の使
用量は、通常、培地１リットル当たり０．１〜１０ｇ、
好ましくは０．３〜８ｇに維持される。また、培養に用
いる他の炭素源の種類や量、および蓄積する共重合体の
所望とする組成に対応して、適宜その量を設定すること
が要求される。

【００１４】培養終了後は、遠心分離、濾過などにより
菌体を集める。集めた菌体を蒸留水で洗浄後、凍結乾燥
によって菌体を得る。次いで、該菌体から重合体をクロ
ロホルム等の良溶媒で加熱下に抽出し、濃縮後、ヘキサ
ン、メタノールなどの貧溶媒で再沈澱することにより重
合体を得る。

【００１５】本発明の共重合体は、熱可塑性で溶融成形
に適切である。また、単独重合体のＰＨＢや、３ＨＰの
モル分率の低い公知のＰ（３ＨＢ／３ＨＰ）に比べて融
点が低く、溶融成形時の熱安定性が高い。さらに、ＰＨ
Ｂの欠点である硬さ、脆さが克服され、柔軟性の高い機
械的性質を示す。

【００１６】

【実施例】以下に、Alcaligenes latus 菌株を用いた３
ＨＢと３ＨＰの共重合ポリエステルの製造を実施例をも
って説明する。実施例１〜４容量５００mlの坂口フラスコ中、Alcaligenes latus Ａ
ＴＣＣ２９７１３の凍結保存株を、表１に示す無機培
地１００mlに炭素源として蔗糖と炭素化合物として３−
ヒドロキシプロピオン酸を合計８ｇ／リットルを加えた
培地に無菌的に植菌し、３０℃、４８時間、毎分１３０
ストロークで振盪培養した。ただし、蔗糖と３−ヒドロ
キシプロピオン酸の量比を変えて４種の培地を調製し、
各培地中での培養を実施例１〜４とした。

【００１７】

【表１】＊微量元素溶液は蒸留水１リットル当たり次の化合物を
含む：Ｈ₃ＢＯ₃（０．３ｇ）、ＣａＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ
（０．２ｇ）、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．１ｇ）、Ｍ
ｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ（３０mg）、ＮａＭｏＯ₄・２Ｈ₂
Ｏ（３０mg）、ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（２０mg）、Ｃｕ
ＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ（１０mg）

【００１８】培養終了後、培養液を遠心分離（５０００
rpm 、１５分）し、水洗を経て集菌した。菌体は凍結乾
燥し、乾燥菌体を得た。菌体中に蓄積したポリエステル
は、乾燥菌体から熱クロロホルム約１００mlで抽出後、
溶液を濃縮し、ヘキサンを加えて沈澱させた。沈澱を濾
過、乾燥してポリエステルを得た。

【００１９】得られたポリエステルの組成分析は、５０
０ＭＨｚの¹ＨＮＭＲのスペクトルで行った。なお、
スペクトルの割当ては、Y.Doi et al, Macromolecules,
19,2860 (1986) 等に準じて行った。各実施例の培養結
果を表２に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】さらに、各実施例の共重合体の融点（Ｔ
ｍ）とガラス転移温度（Ｔｇ）を示差熱分析（ＤＳＣ）
で測定した結果、および分子量（数平均分子量）、分子
量多分散度（重量平均分子量／数平均分子量）をゲル濾
過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した結果を表３
に示す。

【００２２】

【表３】

【００２３】さらに、実施例１と４の重合体試料に関し
ては、１２５ＭＨｚの¹³ＣＮＭＲを用いて、カルボニ
ル炭素の多重線共鳴構造からモノマー単位配列のダイア
ッド連鎖分布を決定した（図１および図２参照）。それ
によると、実施例１の共重合体：Ｆ_BB＝０．５６、Ｆ_BP＋Ｆ_PB＝０．３６、Ｆ_PP＝０．０
８実施例４の共重合体：Ｆ_BB＝０．８２、Ｆ_BP＋Ｆ_PB＝０．１６、Ｆ_PP＝０．０
２ただし、Ｆは分率、下付き添字のＢは３ＨＢ単位、Ｐは
３ＨＰ単位を示すものとする。この結果は、各共重合体
の組成と照合することにより、いずれもランダム配列の
共重合体であることを示す。

【００２４】実施例５炭素源として３ーヒドロキシ酪酸１．７ｇ／ｌと炭素化
合物として３ーヒドロキシプロピオン酸４．０ｇ／ｌを
用い、培養時間を７２時間としたこと以外は、実施例１
〜４と同様に培養した。培養終了以降の乾燥菌体取得操
作、ポリエステル抽出操作、およびポリエステルの組成
分析も実施例１〜４と同様に実施した。実施例６炭素源として３ーヒドロキシ酪酸３．３ｇ／ｌと炭素化
合物として３ーヒドロキシプロピオン酸４．０ｇ／ｌを
用い、培養時間を１２０時間としたこと以外は、実施例
５と同様に培養を行い、培養以降の操作も同様に実施し
た。実施例５と６培養結果を表４に示す。

【００２５】

【表４】表５には、実施例５と６で得た共重合体の熱的性質と分
子量を示す。

【００２６】

【表５】

【００２７】

【発明の効果】本発明により、従来３ＨＰモル％が７％
以下に限定されていた微生物産生共重合ポリエステル、
Ｐ（３ＨＢ／３ＨＰ）の３ＨＰ mol％が広範囲に亘る新
組成の物質を得ることができた。この共重合体は、ＰＨ
Ｂや３ＨＰモル分率の低いＰ（３ＨＢ／３ＨＰ）に比
べ、溶融成形時の熱安定性に優れ、また、柔軟性の高い
機械的性質を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得た重合体試料の１２５ＭHzの¹³Ｃ
ＮＭＲスペクトルである。

【図２】図１のスペクトル中の左端の多重線（カルボニ
ル炭素由来）の拡大図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】反復単位としてＤ（−）−３−ヒドロキ
シ酪酸単位を２０〜９０モル％、３−ヒドロキシプロピ
オン酸単位を１０〜８０モル％含み、数平均分子量が５
０，０００〜５００，０００の２元ランダム共重合体ポ
リエステル。
【請求項２】Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓの
菌株を液体培地中で培養するに際し、同菌体の少なくと
も増殖時または（および）増殖後に、３−ヒドロキシプ
ロピオン酸単位を生成する炭素化合物を含む炭素源を存
在させることにより、Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸と
３−ヒドロキシプロピオン酸の２元共重合体を生成、蓄
積させ、これを採取することを特徴とする共重合ポリエ
ステルの製造方法。
【請求項３】Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｌａｔｕｓの
菌株を液体培地中で培養するための炭素源として、３−
ヒドロキシプロピオン酸単位を生成する炭素化合物を含
む炭素源を用いることにより、菌株の増殖と共に、Ｄ
（−）−３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシプロピオ
ン酸の２元共重合体を蓄積させる請求項２記載の製造方
法。
【請求項４】３−ヒドロキシプロピオン酸単位を生成
する炭素化合物が３−ヒドロキシプロピオン酸である請
求項２または３記載の製造方法。