KR100377425B1 - 4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 제조방법 - Google Patents

4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100377425B1
KR100377425B1 KR10-1999-0045873A KR19990045873A KR100377425B1 KR 100377425 B1 KR100377425 B1 KR 100377425B1 KR 19990045873 A KR19990045873 A KR 19990045873A KR 100377425 B1 KR100377425 B1 KR 100377425B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hydroxybutanoic acid
acid
poly
hydroxybutanoic
propionic acid
Prior art date
Application number
KR10-1999-0045873A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010038064A (ko
Inventor
이용현
강명신
정영미
Original Assignee
주식회사 엘지생명과학
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엘지생명과학 filed Critical 주식회사 엘지생명과학
Priority to KR10-1999-0045873A priority Critical patent/KR100377425B1/ko
Publication of KR20010038064A publication Critical patent/KR20010038064A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100377425B1 publication Critical patent/KR100377425B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)

Abstract

본 발명은 미생물을 이용하여 생분해성 고분자 소재인 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 제조 방법에서는 4-하이드록시부탄산의 전구물질 이외에 프로피온산을 대사촉진제로 첨가하여 대사경로를 조절하여 줌으로써 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)내의 4-하이드록시부탄산 몰분율을 현저히 향상시켜 물성이 개선된 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)를 제조한다. 생산배지에 포함된 프로피온산은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 수율을 크게 증가시킬 뿐만 아니라 제조된 중합체 내의 4-하이드록시부탄산의 몰분율을 증가시킴으로써 제조되는 중합체의 가공성을 향상시키므로, 본 발명의 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 제조 방법을 이용하면 양적, 질적으로 우수한 생분해성 고분자 소재를 경제적으로 얻을 수 있다.

Description

4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 제조방법{Microbial production of poly(3-hydroxybutyrate-4-hydroxy butyrate) containing high molar fraction of 4-hydroxybutyrate}
본 발명은 미생물을 이용하여 생분해성 고분자 소재인 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)를 제조함에 있어, 4-하이드록시부탄산의 몰분율을 크게 증가시켜 물성이 향상된 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 프로피온산을 포함하는 질소, 황, 인등과 같은 영양원이 결핍된 생산배지에 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 제조 방법에 관한 것이다.
생분해성 고분자 물질은 심각한 공해문제의 한 축을 이루는 합성고분자 소재를 대체할 수 있는 대안으로 제시되고 있으며, 이에 따라 다양한 생분해성 고분자 물질이 개발되고 있다. 그 중 하나인 폴리-베타-하이드록시부탄산(poly-β-hydroxybutyrate)은 영양불균형 상태에서 다양한 미생물들이 축적하는 생분해성 고분자 물질로서 생분해성, 내습성, 압전성, 그리고 생체 적합성 등 우수한 특성을 갖고 있다.
미생물을 이용한 폴리-베타-하이드록시부탄산의 제조 방법으로는, 제 1단계에서 미생물을 증식시키고 제 2단계에서 폴리-베타-하이드록시부탄산의 생합성을 유도하는 2단계 배양법이 이용되고 있다. 그러나, 이와 같이 생산된 폴리-베타-하이드록시부탄산은 결정화도가 높고 강성도, 메짐성이 낮아 고분자 소재 가공시 단점이 있다. 따라서 제 2단계 세포배양시 감마-부티로락톤(γ-butyrolactone), 4-하이드록시부탄산 (4-hydroxybutyrate), 1,4-부타엔다이올 (1,4-butanediol) 등을 전구물질로 첨가하여 3-하이드록시부탄산과 4-하이드록시부탄산이 공중합된 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시 부탄산)을 생산하여 물성의 개선을 시도하고 있다.
공중합체인 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)은 3-하이드록시부탄산 사슬에 4-하이드록시부탄산이 불규칙적으로 중합된 구조를 이루며, 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)내의 4-하이드록시부탄산의 몰분율은 상기 생분해성 고분자의 물리적 성질에 영향을 주는 중요한 인자로 알려져 있다. 즉 4-하이드록시부탄산의 중합도에 따라 물성이 크게 변화하여 합성고분자인 폴리에틸렌이나 폴리프로필렌과 유사한 물리적 성질을 갖게 되며, 사출, 성형, 연신이 용이하게 된다. 또한 이를 다른 천연 또는 합성고분자물질과 혼합할 때 가공성이 크게 개선된다.
폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생산법은 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha)를 중심으로 연구되어 왔으며 2단계 배양법이 활용되고 있다. 즉 상기 균주를 제 1단계의 복합배지에서 배양하여 먼저 균체를 생육시킨 후, 생육된 균체를 회수하여 질소원이 결핍되고 전구물질인 감마-부티로락톤, 4-하이드록시부탄산, 1,4-부타엔다이올 등이 첨가된 생산배지에서 제 2단계 배양하여 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생합성을 유도하여 생산한다.
폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)내의 4-하이드록시부탄산 몰분율은 지금까지 주로 제 2단계 배양시 첨가하는 전구물질의 농도를 조절함으로써 이루어져 왔다. 그러나 전구물질의 농도를 일정농도 이상으로 사용할 경우 균체의 생육저해를 유발하여 일정 수준 이상으로 첨가하여 몰분율을 조절하기는 어려운 형편이다. 뿐만 아니라 일반적으로 고가인 첨가 전구물질이 4-하이드록시부탄산으로 전환되는 수율이 낮다는 결점이 있다. 따라서 기존의 방법으로는 4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 경제적 생산이 어려워 이에 대한 획기적 개선책이 요망된다.
랄스토니아 유트로파의 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생합성 경로를 살펴보면, 주 기질인 당의 대사과정을 통해 생산된 아세틸-CoA를 경유하여 합성되는 3-하이드록시부탄산 단량체와 위에서 열거한 바 있는 전구물질에서 유래되는 4-하이드록시부탄산 단량체가 서로 생합성 효소인 폴리하이드록시부탄산 합성 효소(PHB synthase)에 의해 임의적으로 공중합되어 생합성된다.
폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)내의 4-하이드록시부탄산의 몰분율이 10-20 mol%로 낮게 나타나는 이유는 주로 이와 같은 미생물 균체내에서 일어나는 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생합성 특성 때문이다. 즉 전구물질들이 중간대사물질인 4-하이드록시부티릴-CoA을 경유하여 4-하이드록시부탄산으로 전환되어야 하나, 일반적으로 케토라이시스(ketolysis) 반응을 받아 2분자의 아세틸-CoA로 분해되어 3-하이드록시부탄산으로 유입되게 되며 따라서 사용전구물질에 대한 단량체인 4-하이드록시부탄산의 생산수율이 낮을 뿐만 아니라 4-하이드록시부탄산의 몰분율도 낮아지게 된다.
따라서 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생합성 수율을 향상시키고 4-하이드록시부탄산의 몰분율을 증가시켜 물성이 개선된 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 경제적으로 생산하기 위해서는, 전구물질이 중간대사산물인 4-하이드록시부티릴-CoA를 경유하여 3-하이드록시부탄산으로 유도되는 생합성 경로를 효과적으로 차단시키기 위한 배양 방법 또는 대사공학적 방법을 도입하여야 한다.
이를 위하여 본 발명에서는 제 2단계 배양시 전구물질과 더불어 소량의 프로피온산을 보충적으로 사용하면 전구물질 유래 중간대사물질인 4-하이드록시부티릴-CoA의 케토라이시스 반응을 저해하여 4-하이드록시부탄산으로의 전환수율을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 즉 소량의 프로피온산을 대사촉진제로 보충 첨가하여 줌으로써 4-하이드록시부탄산의 전환수율을 획기적으로 향상시켜, 기존의 방법으로는 얻을 수 없었던 4-하이드록시부탄산 몰분율이 매우 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 생산할 수 있었을 뿐만 아니라 그 생합성 수율 또한 크게 향상시켰다.
본 발명의 목적은 4-하이드록시부탄산의 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 가공성이 뛰어난 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 적은 비용으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha)의 2단계 배양으로 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 제조하는 과정에서 전구물질인 감마-부티로락톤 이외에 소량의 프로피온산을 대사촉진제로 첨가(-●-)하거나 첨가하지 않고(-○-) 배양할 경우, 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생합성량에 미치는 프로피온산의 효과를 배양 시간에 따라 나타낸 도표이고,
도 1b는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha)의 2단계 배양으로 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 제조하는 과정에서 전구물질인 감마-부티로락톤 이외에 소량의 프로피온산을 대사촉진제로 첨가하거나 첨가하지 않고 배양할 경우, 감마-부티로락톤 및 프로피온산의 소모양상을 배양 시간에 따라 나타낸 도표이고,
-●-: 프로피온산을 첨가하여 배양한 경우의 감마-부티로락톤 농도;
-○-: 프로피온산을 첨가하지 않은 경우의 감마-부티로락톤 농도;
-■-: 프로피온산을 첨가하여 배양한 경우의 프로피온산 농도;
-□-: 프로피온산을 첨가하지 않은 경우의 프로피온산 농도,
도 1c는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha)의 2단계 배양으로 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 제조하는 과정에서 전구물질인 감마-부티로락톤 이외에 소량의 프로피온산을 대사촉진제로 첨가하거나(-●-) 첨가하지 않고(-○-) 배양할 경우, 4-하이드록시부탄산의 생산수율에 미치는 프로피온산의 효과를 배양 시간에 따라 나타낸 도표이고,
도 2a및도 2b는 랄스토니아 유트로파, 알카리게네스 레이투스 (Alcaligenes latus) 그리고 폴리하이드록시부탄산 합성 관련 유전자를 랄스토니아 유트로파에 도입시킨 형질전환균주 등 각종 미생물의 배양액에 프로피온산을 첨가할 때 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산 효과를 비교한 도표이다.
-●-: 랄스토니아 유트로파 배양액에 프로피온산을 첨가한 경우;
-○-: 랄스토니아 유트로파 배양액에 프로피온산을 첨가하지 않은 경우;
-▲-: 알카리게네스 레이투스 배양액에 프로피온산을 첨가한 경우;
-△-: 알카리게네스 레이투스 배양액에 프로피온산을 첨가하지 않은 경우;
-■-: 폴리하이드록시부탄산 합성 유전자를 도입시킨 형질전환 균주의 배양액에 프로피온산을 첨가한 경우;
-□-: 폴리하이드록시부탄산 합성 유전자를 도입시킨 형질전환 균주의 배양액에 프로피온산을 첨가하지 않은 경우.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로피온산을 함유한 생산배지를 사용하여 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 프로피온산을 포함하는 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산용 배지를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저 본 발명은 프로피온산을 함유한 생산배지를 사용하여 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조 방법에서 가장 중요한 특징은 프로피온산을 함유한 생산배지를 이용한다는 점이다. 구체적으로, 상기 제조 방법은 미생물을 이용하여 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 제조하는 방법으로서, 하기와 같은 단계를 포함한다:
1) 복합배지에서 미생물을 회분식 또는 유가식으로 배양함으로써 상기 미생물을 증식시키는 단계; 및
2) 복합배지에서 증식된 미생물을 4-하이드록시부탄산의 전구물질 및 프로피온산을 포함한 생산배지로 옮겨 회분식 또는 유가식으로 배양함으로써 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생합성을 유도하는 단계.
상기 미생물은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 생합성할 수 있는 미생물 전체를 의미하며, 바람직한 것으로는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha), 알카리게네스 레이투스 (Alcaligenes latus) 또는 폴리하이드록시부탄산 생합성 관련 유전자가 도입된 형질전환 균주 등이 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 프로피온산이 생산배지에 포함되어 있는 경우 상기 모든 균주에서 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산량과 상기 중합체에서의 4-하이드록시부탄산의 몰분율이 증가하였음을 확인하였다 (도 2a및도 2b참조)
단계 1)에서 사용되는 복합배지로는 상기 미생물을 양적으로 증식시키기 위해 사용될 수 있는 공지의 배지가 모두 사용될 수 있으며, 사용되는 미생물에 따라 다양하게 변형될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 랄스토니아 유트로파를 증식시키기 위해 10 g/L의 효모 추출물(yeast extract), 10 g/L의 폴리펩톤(polypepton), 5 g/L의 쇠고기 추출물(meat extract), 5 g/L의 (NH4)2SO4로 구성된 복합배지를 사용하였으나 이것이 본 발명의 제조 방법을 한정하기 위해 사용된 것은 아니다.
마찬가지로, 단계 1)에서의 구체적 배양 조건, 즉 배양액 주입 방법, 배양 온도, 배양 시간 또한 본 발명의 실시자에 의해 다양하게 변형될 수 있으며, 그 궁극적인 목적은 단계 2)의 중합체 생산을 위한 효과적인 미생물 증식에 있다.
상기 생산배지의 조성은 공지의 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산배지의 조성을 따르는데, 그 구체적인 조성은 상기 미생물의 종류에 따라 다양하게 변화시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 랄스토니아 유트로파에 의해 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산을 유도하기 위해 증류수 1리터당 9 g의 Na2HPO4·12H2O, 1.5 g의 KH2PO4, 그리고 0.2 g의 MgSO4·7H2O 등으로 구성된 합성배지를 사용하였으나 이것이 본 발명의 제조 방법을 한정하기 위한 것은 아니다.
본 발명의 제조 방법의 특징은 공지의 생산배지에 프로피온산을 포함시키는 것에 있다. 생산배지에 포함된 프로피온산은 미생물 내에서 4-하이드록시부티릴-CoA의 케토라이시스 반응을 저해하여 4-하이드록시부탄산으로의 전환수율을 현저히 향상시키는 기능을 한다. 생산배지 중에서 프로피온산의 농도는 0.5 g/L 내지 5.0 g/L인 것이 바람직한데, 이 범위의 농도로 프로피온산이 배지에 첨가되는 경우 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 수율이 높을 뿐만 아니라 생산된 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)에서 차지하는 4-하이드록시부탄산의 몰분율이 높아 물성이 우수한 중합체가 생산되기 때문이다 (표 1참조).
상기 프로피온산을 포함하는 생산배지는 다양한 4-하이드록시부탄산의 전구물질을 포함하는데, 그 예로는 감마-부티로락톤, 4-하이드록시부탄산, 1,4-부타엔다이올, 1,4-클로로부탄산(1,4-chlorobutyric acid)등이 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 감마-부티로락톤을 생산배지에 포함시켰으나, 다른 전구물질이나 이들의 조합 또한 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제조 방법 중 단계 2)에서 생산배지는 회분식 또는 유가식으로 공급될 수 있다. 만일 생산배지가 회분식으로 공급되는 경우, 그 배양은 20시간 내지 50시간 동안 배양하는 것이 바람직하다 (도 1참조). 그러나, 이와 같은 선호성이 본 발명의 제조 방법을 회분식 배지공급 방법에 한정하기 위해 제안된 것은 아니다. 본 발명의 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 제조 방법에서 배지가 유가식으로 공급되는 경우에도 본 발명의 특징인 프로피온산은 약 0.5 g/L 내지 5.0 g/L의 농도가 유지되도록 공급하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 프로피온산을 함유하는 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산용 배지를 제공한다.
상기 생산배지에서 프로피온산의 농도는 0.5 g/L 내지 5.0 g/L 인 것이 바람직하다.
상기 생산배지의 기타 조성은 공지의 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산배지의 조성을 따르는데, 그 구체적인 조성은 상기 미생물의 종류에 따라 다양하게 변화시킬 수 있다. 일례를 들면 알카리지너스 레이투스의 경우 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산을 유도하기 위해 증류수 1리터당 10-20 g의 서당 (sucrose), 8.6 g의 Na2HPO4·12H2O, 1.5 g의 KH2PO4, 1.0 g의 (NH4)2SO4,0.2 g의 MgSO4,0.06 g의 시트르산 암모늄 철 (Ⅲ), 그리고 0.01 g의 CaCl2로 구성되는 배지가 있다.
또한, 본 발명의 생산배지는 다양한 4-하이드록시부탄산의 전구물질을 포함하는데, 그 예로는 감마-부티로락톤, 1,4-부타엔다이올, 4-하이드록시부탄산, 및 1,4-클로로부탄산 등이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 배양 조건의 최적화: 합성 배지 중 프로피온산의 농도
공지의 균주 랄스토니아 유트로파 (수탁번호: NCIMB 11599)를 영양복합배지 [증류수 1 리터당 10 g의 효모 추출물(yeast extract), 10 g의 폴리펩톤(polypepton), 5 g의 쇠고기 추출물(meat extract), 5 g의 (NH4)2SO4로 구성됨]를 사용하여 교반속도 150 rpm, 온도 30℃의 조건으로 48시간 동안 제 1단계 배양하여 균체를 증식시켰다. 이로부터 약 4.0 g/L의 균체를 회수하여, 전구물질인 감마-부티로락톤 10.0 g/L과 프로피온산의 농도를 다양하게 첨가한 합성배지 (증류수 1리터당 9 g의 Na2HPO4·12H2O, 1.5 g의 KH2PO4, 그리고 0.2 g 의 MgSO4·7H2O, 10 g의 FeSO4·7H2O, 2.25 g의 ZnSO4·7H2O, 1 g의 CuSO4·5H2O, 0.5 g의 MnSO4, 2 g의 CaCl2·2H2O, 0.23 g의 Na2B4O·7H2O, 0.1 g의 Na2B4O7·7H2O, 0.1g의 (NH4)6Mo7O24·7H2O, 그리고 35% 염산용액 10mL을 첨가하여 제조함)에서 교반속도 150 rpm, 온도 30℃의 조건으로 36시간 동안 제 2단계 배양하여 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생합성을 유도하였다.
제 2단계 배양 후 균체를 취하여 총균체량, 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 농도, 그 축적율, 상기 중합체 중의 4-하이드록시부탄산 몰분율 등을 결정하였다. 구체적으로, 총균체량은 건조중량법에 의거하여 결정하였고, 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 농도는 균체내에 축적된 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 유기용매인 사염화탄소로 추출, 정제한 후 기체크로마토그래피로 분석 결정하였고 이로부터 축적율을 계산하였다. 그 조성은 균체내에 축적된 공중합체를 클로로포름으로 추출, 정제하여 300MHz 프로톤 핵자기 공명 분광광도계(300MHz1H-NMR)으로 분석하였다. 또한, 생산된 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 중에서 4-하이드록시부탄산이 차지하는 몰분율은 4-하이드록시부탄산의 몰농도를 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 몰농도로 나누어 이에 100을 곱하여 결정하였다.
표 1은 대사촉진제인 프로피온산의 첨가량이 총균체량, 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 농도, 축적율, 그리고 4-하이드록시부탄산 몰분율에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
프로피온산 농도(g/L) 총균체량(g/L) Poly(3HB-4HB) 농도 (g/L) 축적율(%) 몰분율(mol%)
0.0 5.62 1.38 24.6 12.3
0.5 5.89 1.68 28.5 22.6
1.0 5.89 1.72 29.2 36.2
1.5 6.04 1.94 32.1 45.6
2.0 6.30 2.32 36.8 51.8
2.5 5.71 2.00 35 44.1
표 1에 나타났듯이 프로피온산을 첨가할 경우 총균체량, 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 축적 농도 및 축적율이 현저히 향상됨을 알 수 있으며, 특히 프로피온산을 소량 첨가함으로써 4-하이드록시부탄산의 몰분율은 비첨가시의 12.3 mol%에서 51.8 mol%로 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
<실시예 2> 배양 조건의 최적화: 생산배지에서의 배양 시간
실시예 1과 같은 방법으로 랄스토니아 유트로파를 성장배지와 생산배지에서 차례로 회분 배양하되, 생산배지에는 0 또는 2.0 g/L의 프로피온산과 10.0 g/L의 감마-부티로락톤을 포함시켰다.
제 2단계 배양 시 12시간마다 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 농도, 감마-부티로락톤 및 프로피온산의 농도, 4-하이드록시부탄산의 생산 수율을 측정하였다. 구체적으로, 감마-부티로락톤의 농도와 프로피온산의 농도는 각각 기체크로마토그래피로 분석하여 결정하였다. 또한, 4-하이드록시부탄산의 생산 수율은 4-하이드록시부탄산의 농도를 감마-부티로락톤산 사용농도로 나누어 결정하였다. 상기 방법에 대한 구체적 실시예는Biotechnology Letters, 19(8), pp771-774, 1997년에 보고된 바 있다.
도 1a,도 1b및도 1c는 프로피온산을 첨가한 경우와 첨가하지 않는 경우를 비교한 결과로서, 프로피온산을 배지에 첨가할 경우 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 최대축적 도달시간이 약 12시간 단축되었고 (도 1a참조), 전구물질인 감마-부티로락톤의 전환속도도 1.6배로 현저히 증가되었으며(도 1b참조), 전구물질인 감마-부티로락톤에서 4-하이드록시부탄산으로의 전환 수율도 1.9배로 현저히 증가되는 결과를 얻었다 (도 1c참조).
<실시예 3> 다양한 균주에서 프로피온산의 효과
본 실시예에서는 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)를 생합성하는 다양한 균주에서 프로피온산의 효과를 비교하였다. 이때 사용된 균주는, 랄스토니아 유트로파 균주, 알카리게네스 레이투스 균주 (DSM1124), 폴리하이드록시부탄산 합성 유전자를 도입시킨 형질전환 균주 (수탁번호: KCTC8605P)였으며, 상기 균주들을 10.0 g/L의 감마-부티로락톤과 2.0 g/L의 프로피온산을 첨가한 생산배지에서 48시간 동안 제 2단계 회분 배양하였다. 배양 도중 12시간 마다 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 농도와 4-하이드록시부탄산 몰분율을 측정하였으며, 그 구체적인 방법은 실시예 1의 방법과 동일하게 수행하였다.
그 결과, 생산배지에 포함된 프로피온산은 위에서 열거한 모든 균주에서 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생산 촉진 효과를 보였고 (도 2a참조), 4-하이드록시부탄산 몰분율은 48시간 후 랄스토니아 유트로파의 경우 50.3 mol%, 알카리게네스 레이투스의 경우 55.2 mol%, 그리고 형질전환균주의 경우 61.3mol%로 각각 비첨가시의 12.3mol%, 21.3mol%, 그리고 50.6mol%에 비해 현저히 증가하는 결과를 얻었다 (도 2b참조).
본 발명이 제공하는 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 제조 방법을 이용하면, 기존의 제조 방법으로는 얻기 어려운 4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 그 생산수율 또한 크게 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 제조 방법은 물성이 우수한 폴리하이드록시부탄산을 경제적으로 생산하는데 있어서 유용하며, 궁극적으로는 기존 합성 고분자 소재의 단점을 보완할 수 있는 생분해성 고분자 소재를 대량으로 생산하는데에도 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (5)

  1. 미생물을 이용하여 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)을 제조하는 방법에 있어서, 4-하이드록시부탄산의 전구물질 이외에 프로피온산을 첨가함으로써 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)내의 4-하이드록시부탄산 몰분율을 현저히 향상시켜 물성이 개선된 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)를 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로피온산의 배지 중 농도는 0.5 g/L 내지 5.0 g/L인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha), 알카리게네스 레이투스 (Alcaligenes latus) 또는 폴리하이드록시부탄산 생합성 관련 유전자가 도입된 형질전환 균주인 것을 특징으로 하는 제조 방법
  4. 제 1항에 있어서, 상기 4-하이드록시부탄산의 전구물질은 감마-부티로락톤, 1,4-부타엔다이올, 4-하이드록시부탄산, 및 1,4-클로로부탄산으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 프로피온산을 함유하는 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산) 생산용 배지.
KR10-1999-0045873A 1999-10-21 1999-10-21 4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 제조방법 KR100377425B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-1999-0045873A KR100377425B1 (ko) 1999-10-21 1999-10-21 4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-1999-0045873A KR100377425B1 (ko) 1999-10-21 1999-10-21 4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010038064A KR20010038064A (ko) 2001-05-15
KR100377425B1 true KR100377425B1 (ko) 2003-03-26

Family

ID=19616371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-1999-0045873A KR100377425B1 (ko) 1999-10-21 1999-10-21 4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100377425B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107014939B (zh) * 2017-02-27 2018-06-08 南京市公安局刑事侦查局 离子排斥-离子交换柱切换联用测定尿液中的γ-羟基丁酸的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0052459A1 (en) * 1980-11-18 1982-05-26 Imperial Chemical Industries Plc Beta-hydroxybutyrate polymers
EP0069497A2 (en) * 1981-07-07 1983-01-12 Imperial Chemical Industries Plc Copolyesters and process for their production
JPH03236784A (ja) * 1990-02-14 1991-10-22 Taisei Corp ポリ―３―ヒドロブチレイトの製造方法
JPH06145311A (ja) * 1992-09-16 1994-05-24 Asahi Chem Ind Co Ltd バイオポリエステル共重合体とその製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0052459A1 (en) * 1980-11-18 1982-05-26 Imperial Chemical Industries Plc Beta-hydroxybutyrate polymers
EP0069497A2 (en) * 1981-07-07 1983-01-12 Imperial Chemical Industries Plc Copolyesters and process for their production
JPH03236784A (ja) * 1990-02-14 1991-10-22 Taisei Corp ポリ―３―ヒドロブチレイトの製造方法
JPH06145311A (ja) * 1992-09-16 1994-05-24 Asahi Chem Ind Co Ltd バイオポリエステル共重合体とその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010038064A (ko) 2001-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Grothe et al. Fermentation optimization for the production of poly (β-hydroxybutyric acid) microbial thermoplastic
Kusaka et al. Molecular mass of poly [(R)-3-hydroxybutyric acid] produced in a recombinant Escherichia coli
Sangkharak et al. Nutrient optimization for production of polyhydroxybutyrate from halotolerant photosynthetic bacteria cultivated under aerobic-dark condition
Du et al. Feeding strategy of propionic acid for production of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) with Ralstonia eutropha
Diniz et al. High-cell-density cultivation of Pseudomonas putida IPT 046 and medium-chain-length polyhydroxyalkanoate production from sugarcane carbohydrates
RU2009107208A (ru) Новый сконструированный микроорганизм, продуцирующий гомо-янтарную кислоту, и способ получения янтарной кислоты с его применением
CA1313635C (en) Copolymer production
Jang et al. Effect of levulinic acid on cell growth and poly-β-hydroxyalkanoate production by Alcaligenes sp. SH-69
Bormann et al. Growth-associated production of poly (hydroxybutyric acid) by Azotobacter beijerinckii from organic nitrogen substrates
US20140378646A1 (en) UTILIZATION OF THE NOVEL, ENVIRONMENTAL ISOLATES PSEUDOMONAS sp. IPB-B26 AND N-128 FOR THE EFFICIENT HIGH YIELD PRODUCTION OF mcl/lcl-PHAs
KR100377425B1 (ko) 4-하이드록시부탄산 몰분율이 높은 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 제조방법
WO2009048202A1 (en) Method for preparing succinic acid using glycerol as carbon source
Tanaka et al. Fermentative production of poly-β-hydroxybutyric acid from xylose by a two-stage culture method employing Lactococcus lactis IO-1 and Alcaligenes eutrophus
EP0392687B1 (en) Polymer production
Lee et al. Production of poly (β-hydroxybutyrate-co-β-hydroxyvalerate) from glucose and valerate in Alcaligenes eutrophus
KR100316467B1 (ko) 미생물 배양에 의한 커들란을 생산하는 방법
KR20070096347A (ko) ４―ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ（４ＨＢ）생성능을가지는 변이체 및 이를 이용한 ４ＨＢ의 제조방법
CN117701486B (zh) 一种生产pha的重组菌及其构建方法与应用
CN1177036C (zh) 一株嗜水气单胞菌及其应用
US8658403B2 (en) Method for producing polyhydroxyalkanoic acid
KR100346142B1 (ko) Ｐｈｂ합성효소 유전자의 형질전환체 알칼리제너스라투스ｔ1을 이용한 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을촉진하는 방법
KR0172961B1 (ko) 폴리-베타-하이드록시 부틸산 및 폴-베타-하이드록시 부티레이트/폴리-베타-하이드록시 발레릭산의 공중합체 구조를 가진 폴리-베타-하이드록시 알카노에이트의 제조방법
KR0159905B1 (ko) 폴리-(3-하이드록시부티릭산-3-하이드록시발레릭산)과 폴리-(3-하이드록시부티릭산-4-하이드록시부티릭산)의 제조방법
CN118048246A (zh) 一种生产pha的重组罗氏真养菌及其构建方法与应用
KR100197356B1 (ko) 칼륨 이온 제한을 이용한 폴리-베타-하이드록시알카노에이트의 생물공학적 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20060105

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee