CN1177036C - 一株嗜水气单胞菌及其应用 - Google Patents
一株嗜水气单胞菌及其应用Info
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Abstract
本发明公开了一株嗜水气单胞菌及其应用，涉及一株嗜水气单胞菌及其利用该菌生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法。本发明提供的嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)45/90 CGMCC №0650。利用上述嗜水气单胞菌低成本生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，是将嗜水气单胞菌45/90CGMCC №0650在碳源包括大豆油或花生油或其混合物的培养基中进行发酵。为了促进3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物在嗜水气单胞菌45/90中的合成，培养过程中采用限制氮源、磷源或供氧三种措施中的一种或几种，还可以向培养基中添加月桂酸。利用本发明的方法，使得新型生物可降解材料3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的大规模工业化生产成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一株嗜水气单胞菌及其应用，特别是涉及一株嗜水气单胞菌及其利用该菌生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法。
背景技术
3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物[Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，PHBHHx]是由细菌合成的一种胞内聚酯，在细菌胞内以内含物形式呈颗粒状存在。PHBHHx所具备的热成塑性，力学性能与目前大量应用的以石油化工原料得到的塑料相似，但PHBHHx具有生物可降解性，被认为是一种“新型生物可降解材料”，因此倍受人们的重视。目前，PHBHHx的生产方法主要是利用嗜水气单孢菌在月桂酸为唯一碳源的培养基中发酵得到。但是由于月桂酸价格昂贵、在发酵温度下补料困难(因为难溶于水)、发酵过程中大量起泡、发酵后与产品难分离等原因，限制了PHBHHx的大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一株可用于大规模工业化生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的嗜水气单胞菌。
本发明提供的嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)45/90CGMCC №0650。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)45/90，已于2001年11月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC №0650。
本发明的嗜水气单胞菌自大港油田被石油污染的土壤中分离得到，具有利用碳水化合物产酸的特性。该菌可在Luria-Bertani(LB)(成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，5g/L氯化钠)培养基上生长，浅黄色，圆形菌落，边缘整齐，生长快。
本发明的另一个目的是提供利用上述嗜水气单胞菌低成本生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法。
为实现这一目的，本发明采用以下技术方案：一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，是将嗜水气单胞菌45/90 CGMCC №0650在碳源包括大豆油或花生油或其混合物的培养基中进行发酵。
实验表明，具体利用大豆油或花生油或它们的混合物那种物质为碳源，对3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的产量没有影响，因此可根据生产地的实际情况选择合适的原料作为发酵的碳源。
为了促进3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物在嗜水气单胞菌45/90中的合成，所述培养过程中采用限制氮源、磷源或供氧三种措施中的一种或几种。
为了提高3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物在嗜水气单胞菌45/90中的积累，获得高产量的3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物，所述培养基中还添加有月桂酸。
所述月桂酸占碳源的20-40％。
本发明中适合的培养温度为28-37℃；适合的pH值为6.0-8.0。
本发明以嗜水气单胞菌45/90 CGMCC №0650及其突变体或变异体为生产菌株，巧妙地利用大豆油或花生油或它们的混合物为碳源，彻底解决了用月桂酸作为唯一碳源时，成本高、发酵过程中大量起泡、发酵温度下补料困难、发酵后与产品难分离等问题，从而能够很容易地得到3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物。同时又采用限制氮源、磷源或供氧，向培养基中加入月桂酸等措施，促进3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物在嗜水气单胞菌45/90中的合成，使3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的产量进一步提高，成本进一步下降，使得新型生物可降解材料3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的大规模工业化生产成为可能。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
在下面的实施例中，培养基的配方如表1所示，所用的菌种均为嗜水气单胞菌45/90 CGMCC №0650。
表1 实施例中不同培养条件的培养基配方
营养元素(g/L)* 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
大豆油 100 50 80 70
花生油 50 100 20
(NH4)2SO4 13 13 3 13 13
NaH2PO4·2H2O 3.8 0.84 0.84 3.8 0.84
KH2PO4 2.6 0.89 0.89 2.6 0.89
MgSO4·7H2OD 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
酵母粉 1 1 1 1 1
微量元素溶液* 8ml/L 8ml/L 8ml/L 8ml/L 8ml/L
月桂酸 0 0 0 20 10
*：1升微量元素溶液含有(g)：20 FeCl3·6H2O，10 CaCl2·H2O，0.03 CuSO4·5H2O，0.05 MnCl2·4H2O，0.1 ZnSO4·7H2O，0.5mol HCl。
实施例1、无营养限制条件下的发酵
在30℃条件下，150ml种子液接种到含3L发酵液的6.5升NBS自动发酵罐中，通气量为3L/min，pH值设定为7.0，起始搅拌150rpm，溶氧设置为10％，随着细胞的生长，搅拌不断增加，最后至900rpm，但溶氧始终维持高于10％，发酵共进行24小时。发酵过程中无起泡现象。发酵结束后，对样品离心、洗涤、分析得到细胞干重和PHBHHx的含量。
24小时后得到细胞干重最大值31g/L，PHBHHx占细胞干重的30％，其中3-羟基己酸(HHx)的含量约占10-15％。
实施例2、同时限制磷和氧的条件下的发酵
在28℃条件下，150ml种子液接种到含3L发酵液的6.5升NBS自动发酵罐中，通气量为2 L/min，pH值设定为6.2，起始搅拌150rpm，溶氧设置为10％，随着细胞的生长，搅拌不断增加，最后至900rpm，但溶氧逐渐下降，6小时后，溶氧下降至0，细胞进入限氧生产阶段，12小时后培养液中磷元素浓度下降至0，细胞又进入限磷阶段。发酵共进行24小时，发酵过程中无起泡现象。发酵结束后，对样品离心、洗涤、分析得到的细胞干重和PHBHHx的含量。
发酵24小时得到细胞干重最大值15g/L，相应PHBHHx占细胞干重百分含量为33％，其中HHx的含量约占10-12％。
实施例3、同时限制氮、磷、氧的条件下的发酵
在37℃条件下，150ml种子液接种到含3L发酵液的6.5升NBS自动发酵罐中，通气量为2L/min，pH值设定为6.8，起始搅拌150rpm，溶氧设置为10％，随着细胞的生长，搅拌不断增加，最后至900rpm。12小时后发酵液中氮元素、磷元素和溶氧都下降至0，细胞进入了上述3种元素的限制状态。发酵共进行24小时，发酵过程中无起泡现象。发酵结束后，对样品离心、洗涤、分析得到的细胞干重和PHBHHx的含量。
发酵24小时得到细胞干重最大值18g/L，相应PHBHHx占细胞干重的50％，其中HHx的含量约占10-12％。
实施例4、培养基中加入月桂酸条件下的发酵
在30℃条件下，150ml种子液接种到含3L发酵液的6.5升NBS自动发酵罐中，通气量为3L/min，pH值设定为6.8，起始搅拌150rpm，溶氧设置为10％，随着细胞的生长，搅拌不断增加，最后至900rpm。培养12小时时补加20g/L月桂酸。溶氧始终维持高于10％，发酵共进行24小时。发酵过程中无起泡现象。发酵结束后，对样品离心、洗涤、分析得到的细胞干重和PHBHHx的含量。
发酵24小时得到细胞干重最大值42g/L，相应PHBHHx占细胞干重的40％，其中HHx的含量约占10-12％。
实施例5、限制磷并在培养基中加入月桂酸条件下的发酵
在33℃条件下，150ml种子液接种到含3L发酵液的6.5升NBS自动发酵罐中，通气量为3L/min，pH值设定为8.0，起始搅拌150rpm，溶氧设置为10％，随着细胞的生长，搅拌不断增加，最后至900rpm。培养12小时时发酵液中磷元素下降至0，补加10g/L月桂酸。溶氧始终维持高于10％，发酵共进行24小时。发酵过程中无起泡现象。发酵结束后，对样品离心、洗涤、分析得到的细胞干重和PHBHHx的含量。
发酵24小时得到细胞干重最大值40g/L，相应PHBHHx占细胞干重的50％，其中HHx的含量约占10-12％。
Claims (8)
1、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)45/90 CGMCC №0650。
2、一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，是将嗜水气单胞菌45/90CGMCC №0650在碳源包括大豆油或花生油或其混合物的培养基中进行发酵。
3、根据权利要求2所述的一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养过程中采用限制氮源、磷源或供氧三种措施中的一种或几种。
4、根据权利要求2所述的一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养基中还添加有月桂酸。
5、根据权利要求3所述的一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养基中还添加有月桂酸。
6、根据权利要求4或5所述的一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，其特征在于：所述月桂酸占碳源的10-40％。
7、根据权利要求2或3或4或5所述的一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养温度为28-37℃。
8、根据权利要求2或3或4或5所述的一种生产3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物的方法，其特征在于：所述培养过程中的pH值为6.0-8.0。
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