KR100346142B1 - Ｐｈｂ합성효소 유전자의 형질전환체 알칼리제너스라투스ｔ1을 이용한 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을촉진하는 방법 - Google Patents
Ｐｈｂ합성효소 유전자의 형질전환체 알칼리제너스라투스ｔ1을 이용한 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을촉진하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폴리-β-하이드록시부탄산 합성효소(poly-β-hydroxybutyrate synthase) 유전자의 형질전환체 알카리제너스 라투스(Alcaligenes latus) T1을 이용하여 폴리-하이드록시알칸산(poly-hydroxyalkanoate)의 생합성을 촉진하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 폴리-하이드록시알칸산의 생합성에 관여하는 폴리-β-하이드록시부탄산 합성효소 유전자phbC의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생합성 촉진 방법에 의하여 미생물 형질전환체로부터 대량 생합성된 생분해성 고분자 물질은 환경 오염을 유발하지 않는 환경친화적인 물질로서 플라스틱과 같은 비분해성 고분자 물질의 대체물질로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 폴리-β-하이드록시부탄산 합성효소(poly-β-hydroxybutyrate synthase) 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스(Alcaligenes latus) T1을 이용하여 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을 촉진시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 폴리-하이드록시알칸산(poly-hydroxyalkanoate)의 생합성에 관여하는 폴리-β-하이드록시부탄산 합성효소 유전자phbC의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을 효율적으로 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
폴리-하이드록시알칸산(poly-hydroxyalkanoate, PHA)은 영양 불균형 상태에 있는 다양한 미생물의 세포 내에 축적되는 생분해성 고분자 물질(biodegradable-polymer)로서 생분해성, 내습성, 압전성 및 생체 적합성 등의 특성을 갖고 있어 산업상 이용 가능성이 매우 높다. 상기 생분해성 고분자 물질들은 산업적으로 실용화될 때 단량체(monomer) 형태로 가공이 되면 결정화도가 높아지기 때문에 강성도 및 메짐성 등을 향상시킥 위하여 일반적으로 공중합체(co-polymer)의 형태로 가공되고 있다. 폴리-하이드록시알칸산의 일종인 폴리-β-하이드록시부탄산(poly-β-hydroxybutyrate, PHB)의 경우는 대표적인 공중합체로 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산)(poly-(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate))과 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)(poly(3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate)) 등이 제조되고 있는데, 이들은 각각 3-하이드록시부탄산 사슬에 3-하이드록시발레릭산 또는 4-하이드록시부탄산 단량체들이 불규칙적으로 중합된 구조를 이루고 있다. 특히 상기의 공중합체들이 제조될 때, 3-하이드록시부탄산 사슬에 중합되는 3-하이드록시발레릭산과 4-하이드록시부탄산 등의 단량체 함량(몰분율)은 생분해성 고분자의 물리적 성질을 결정하는 데 중요한 요인이 된다. 즉, 폴리-β-하이드록시부탄산의 공중합체는 3-하이드록시발레릭산이나 4-하이드록시부탄산 등과 같은 단량체들의 중합도에 따라 다양한 물성을 나타낸다.
이와 같이 중합된 폴리-β-하이드록시부탄산을 포함하는 폴리-하이드록시알칸산 의 공중합체들은 합성고분자인 폴리에틸렌(polyetylene)이나 폴리프로필렌(polypropylene)과 유사한 물리적 성질을 갖게 되어 사출, 성형 및 연신 등의 가공이 용이해질 뿐 아니라, 이들 중합체들을 다른 천연 또는 합성 고분자 물질과 혼합할 경우 물리적 성질이 더욱 개선된 생분해성 고분자 물질을 얻을 수 있다.
이러한 폴리-하이드록시알칸산 등의 생분해성 고분자 물질들은 일반적으로 비정상적인 영양 불균형 상태에 있는 미생물에 의하여 생합성된다. 대표적인 미생물로는 영양 불균형 상태에서 폴리-하이드록시알칸산을 세포 내에 축적하는 랄스토니아 유트로파(Ralsotonia eutropha)가 있는데, 상기 미생물에서 폴리-하이드록시알칸산의 생합성은 β-케토씨오라아제(β-ketothiolase), 아세토아세틸-CoA 환원효소(acetoacetyl-CoA reductase) 및 PHB 합성효소(PHB synthase)에 의하여 촉매된다. 또 다른 생산 미생물인 알카리제너스 라투스(Alcaligenes latus)에서는 폴리-하이드록시알칸산의 생합성에 관여하는 다양한 효소 유전자들이 보고되었는데, PHB 합성효소를 발현하는 유전자phbC, β-케토씨오라아제를 발현하는 유전자phbA 및 아세토아세틸 CoA 환원효소를 발현하는 유전자phbB 등이 밝혀졌으며, 이들 유전자들은 순차적으로 연결된 하나의 오페론으로 구성되어 있다. 또한, 상기 유전자들 중 PHB 합성효소를 발현하는 유전자phbC는 폴리-하이드록시알칸산의 생합성 증대와 공중합체 제조 시 물리적 성질을 결정짓는 단량체 함량의 몰분율을 증대시키는데 가장 민감하게 관여한다고 알려져 있다.
이와 같은 미생물로부터의 생분해성 고분자 물질의 생합성은 배양액 내 영양상태에 의해서 조절되는데, 폴리-하이드록시알칸산의 경우 상기의 미생물이 정상적인 영양 균형 상태에서 배양되면, 폴리-하이드록시알칸산의 생합성 첫단계 효소인 β-케토씨오라아제의 활성이 CoA에 의해 저해를 받기 때문에 당 대사과정에서 생긴 아세틸-CoA(acetyl-CoA)의 대부분은 TCA 회로로 유도되어 주로 균체생육에 이용된다. 반면에 비정상적인 영양 불균형 상태가 초래되면, 세포 내에 환원력(reducing power)을 제공하는 NADPH에 의해 TCA 회로의 주요 효소인 구연산 합성효소(citrate synthetase)와 이소구연산 탈수소효소(isocitrate dehydrogenase)의 활성이 저해를 받게되에, 당 대사과정에서 축적된 아세틸-CoA는 TCA 회로로 유도되는 대신 주로 영양 저장물질인 폴리-하이드록시알칸산을 합성하는 생합성 경로로 흐르게 된다.
앞서 언급한 알카리제너스 라투스는 생분해성 고분자 물질을 생합성하는 미생물 중의 하나로서 생장속도가 매우 빠를 뿐만 아니라 균체가 생육하는 기간에도 폴리-하이드록시알칸산 등의 생분해성 고분자 물질을 생합성하므로 1단계 배양법만으로도 생합성을 유도할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 알카리제너스 라투스는 가격이 비교적 저렴한 설탕(sucrose) 등을 탄소원으로 이용하기 때문에 미생물로부터 생분해성 고분자 물질을 대량으로 생합성할 때 생산단가를 낮출 수 있어 생분해성 고분자 물질의 생산 미생물로서 주목받고 있다. 특히, 최근에는 이러한 장점을 가진 알카리지너스 라투스를 이용하여 생분해성 고분자 물질인 폴리-하이드록시알칸산의 생합성 뿐 아니라 물리적 성질이 향상된 공중합체의 생합성을 증대시키기 위한 연구가 활발히 수행되고 있다.
한편, 미생물로부터 생분해성 고분자 물질의 생합성을 촉진시키면서 전구물질에 대한 수율을 향상시킬 뿐만 아니라 공중합체의 제조시 물성을 결정하는 중요한 요인이 되는 단량체들의 함량을 현저하게 증가시키기 위한 연구가 생산 미생물 자체의 개량 또는 미생물 배양 방법의 개량이라는 측면에서 진행되고 있다. 이에 본 발명은 상기와 같은 장점을 지닌 알카리제너스 라투스에 PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 재조합 발현 벡터를 형질전환시켜 제작한 알카리제너스 라투스 형질전환체를 이용하여 생분해성 고분자 물질을 효율적으로 생합성하는 신규한 제조방법을 제공한다. 본 발명자들은 알카리제너스 라투스 형질전환체를 이용하여 폴리-하이드록시알칸산을 효율적으로 생합성하는 방법을 이용하여 상기 형질전환체로부터 PHB 합성효소 유전자의 발현을 현저하게 증가시킴으로써 폴리-β-하이드록시부탄산 등의 생분해성 고분자 물질과 그의 공중합체의 세포 내 축적 속도와 축적 농도를 증가시키고, 이들 생분해성 고분자 물질의 공중합체 제조에 사용되는 단량체인 3-하이드록시발레릭산과 4-하이드록시부탄산의 몰분율을 현저히 향상시켜 물성이 개선된 공중합체를 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폴리-하이드록시알칸산의 생합성에 관여하는 폴리-β-하이드록시부탄산 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스T1을 이용하여 폴리-β-하이드록시부탄산 등의 생분해성 고분자 물질의 생합성을 효율적으로 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 PHB 합성효소의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1으로부터 생합성된 폴리-β-하이드록시부탄산의 세포 내 축적 농도 및 축적 속도를 모균주와 비교한 것이고,
-●- : 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1
-○- : 모균주
도 1b는 PHB 합성효소의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1으로부터 생합성된 폴리-β-하이드록시부탄산의 축적률을 모균주와 비교한 것이고,
-●- : 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1
-○- : 모균주
도 2a는 PHB 합성효소의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 생합성된 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산)의 세포내 축적율을 모균주와 비교한 것이고,
-●- : 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1
-○- : 모균주
도 2b는 PHB 합성효소의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 생합성된 3-하이드록시발레릭산의 몰분율을 모균주와 비교한 것이다.
-●- : 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1
-○- : 모균주
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리-하이드록시알칸산의 생합성에 관여하는 PHB 합성효소 유전자를 함유한 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을 촉진하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 폴리-하이드록시알칸산의 생합성에 관여하는 PHB 합성효소 유전자를 분리하여 상기 유전자의 발현을 증가시킨 재조합 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 제공한다.
이를 위하여, 폴리-하이드록시알칸산을 생합성하는 대표적인 미생물로 알려진 알카리제너스 라투스 DSM 1123으로부터 PHB 합성효소를 발현하는 유전자phbC를 분리하여 상기 유전자의 발현을 증가시킨 재조합 발현 벡터 pKTC32를 이용한다. 재조합 발현 벡터 pKTC32는 1997년 11월 11일 자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁한 바 있는 형질전환체 알칼리제너스 유트로퍼스 LAR 5로부터 위자드 칼럼 DNA분리 시스템(Wizard column DNA purification system, Promega)을 사용하여 분리한다. 상기와 같이 알카리제너스 라투스 DSM 1123 유래의 PHB 합성효소 유전자phbC를 포함하는 재조합 발현 벡터 pKTC32를 전기 충격법을 이용하여 알카리제너스 라투스 DSM 1123에 형질전환시켜 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 제조한다. 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1은 생명공학 연구소 유전자 은행에 2000년 2월 17일 자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 8993P).
본 발명은 PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법을 이용한 폴리-하이드록시알칸산의 생합성 촉진 여부를 판단하는 지표는 몇 가지로 조사될 수 있다.
(1) 폴리-β-하이드록시부탄산의 생합성능 비교
본 발명은 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1의 생합성능을 조사하기 위하여, 모균주 알카리제너스 라투스 DSM 1123과 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 배양하여 균체생육 및 폴리-β-하이드록시부탄산의 생합성을 유도한 후, 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1과 모균주의 세포 내 폴리-β-하이드록시부탄산 축적 농도, 축적 속도 및 축적율을 측정하여 비교한다.
그 결과, PHB 합성효소 유전자의 발현이 증가된 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 생합성된 폴리-β-하이드록시부탄산의 세포 내 축적 속도 및축적 농도는 모균주에 비하여 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있다(도 1a및도 1b참조).
따라서, 본 발명의 신규한 제조방법에서 폴리-하이드록시알칸산을 생합성을 촉진하기 위하여 사용된 PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알칼리제너스 라투스 T1은 폴리-β-하이드록시부탄산 등의 생분해성 고분자 물질의 생합성에 매우 효율적이다.
(2) 공중합체의 생합성 및 단량체의 몰분율 비교
또한, 본 발명은 PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 공중합체의 생합성 및 공중합체의 제조에 사용되는 단량체의 몰분율을 조사한다. 이를 위하여, 본 발명은 바람직한 실시예로서 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1과 모균주 알카리제너스 라투스 DSM 1123으로부터 생합성된 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산)의 세포 내 축적 농도와 단량체 3-하이드록시발레릭산의 몰분율을 측정하여 비교한다.
그 결과, PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 생합성된 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산)의 세포 내 축적율은 모균주에 비하여 현저하게 증가하며(도 2a참조), 상기 공중합체의 단량체로 사용되는 3-하이드록시발레릭산의 몰분율 역시 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용한 생합성 과정에서 모균주에 비하여 증가함을 확인할 수 있다(도 2b참조).
또한, 본 발명은 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1과 모균주 알카리제너스 라투스 DSM 1123으로부터 생합성된 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 세포 내 축적 농도와 단량체 4-하이드록시부탄산의 몰분율을 측정하여 비교한다.
그 결과, PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 생합성된 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 세포 내 축적 속도 및 축적 농도는 모균주에 비하여 현저하게 증가하며, 상기 공중합체의 단량체로 사용되는 4-하이드록시부탄산의 몰분율 역시 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용한 생합성 과정에서 모균주에 비하여 증가한다(표 1참조).
따라서, PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체를 이용하여 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을 촉진시키는 본 발명의 신규한 제조방법은 폴리-β-하이드록시부탄산 등의 각종 생분해성 고분자 물질과 상기 고분자 물질들의 공중합체를 단 시간안에 대량으로 생산하는데 효과적이며, 또한 산업상 이용 가능성을 높인 공중합체의 제조에 사용되는 단량체들의 함량을 증가시켜 물성에 중요한 역할을 하는 몰분율을 향상시킴므로써 물리적 성질이 더욱 개선된 공중합체를 생산하는데 매우 유용하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1의 제조
본 발명자들은 PHB 합성효소를 발현하는 유전자phbC를 함유한 제조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 얻기 위하여, 폴리-하이드록시알칸산을 생합성하는 대표적인 미생물로 알려진 알카리제너스 라투스 DSM 1123으로부터 PHB 합성효소를 발현하는 유전자phbC를 분리하여 상기 유전자의 발현을 증가시킨 재조합 발현 벡터 pKTC32를 이용하였다. 구체적으로, 상기 재조합 발현 벡터 pKTC32는 1997년 11월 11일 자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁한 바 있는 형질전환체 알칼리제너스 유트로퍼스 LAR 5(수탁번호 : KCTC 8851P)를 영양복합배지에서 30시간 배양한 후 약 10 ㎖의 배양액으로부터 원심분리하여 모은 균체를 위자드 칼럼 DNA 분리 시스템(Wizard column DNA purification system, Promega)을 사용하여 분리하였다.
상기와 같이 알카리제너스 라투스 DSM 1123 유래의 PHB 합성효소 유전자phbC의 발현을 증가시킨 재조합 발현 벡터 pKTC32를 전기 충격법을 이용하여 알카리제너스 라투스 DSM 1123에 형질전환시켜 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 확보하였다. 이때 사용한 전기 충격법은 전기판 위에 0.2 mM 삼투조절용 설탕용액을 떨어뜨린 후 1.5 ㎍ 재조합 발현 벡터 DNA 및 102 cell/ml 숙주 세포를 혼합하여 전압 10.0 kV/㎝, 도체량 25 μF, 저항 200 Ω 및 진동시간 5 msec 조건의 전기충격을 가하여 형질전환시켰다. 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1은 생명공학 연구소 유전자 은행에 2000년 2월 17일 자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 8993P).
<실시예 2> 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용한 폴리-β-하이드록시부탄산의 생합성
본 발명은 실시예 1에서 제조한 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1의 폴리-하이드록시알칸산의 생합성능을 조사하기 위하여, 바람직한 실시예로서 모균주 알카리제너스 라투스 DSM 1123과 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1으로부터의 폴리-β-하이드록시부탄산의 생합성능을 측정하여 비교하였다.
구체적으로, 본 발명은 모균주 알카리제너스 라투스 DSM 1123과 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 각각 10.0 g/L의 설탕이 함유된 영양 복합배지에서 30℃, 48 시간 및 150 rpm의 조건으로 1단계 배양하여 균체생육 및 폴리-β-하이드록시부탄산의 생합성을 유도한 후, 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1과 모균주의 폴리-β-하이드록시부탄산 축적 농도, 축적 속도 및 축적율을 측정하여 비교하였다.
그 결과, PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 생합성된 폴리-β-하이드록시부탄산의 세포 내 축적 속도 및 축적 농도는 모균주에 비하여 증가하였는데, 최대 축적 농도는 형질전환체의 경우 2.9 g/L로 모균주의 최대 축적 농도 2.6 g/L에 비해 1.1 배 증가하였고 최대 축적량에 도달하는 시간 역시 약 6시간 정도 단축되었다(도 1a). 또한, 폴리-β-하이드록시부탄산의 축적률 역시 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용한 폴리-β-하이드록시부탄산의 생합성 과정에서 모균주에 비하여 1.3 배 증가되었다(도 1b).
따라서, 본 발명자들은 폴리-β-하이드록시부탄산 등의 생분해성 고분자 물질의 생합성을 촉진하기 위하여 사용된 본 발명의 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1이 매우 효율적임을 확인하였다.
<실시예 3> 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용한 공중합체의 생합성
본 발명은 실시예 1로부터 확보한 PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 공중합체 및 공중합체의 제조에 사용되는 단량체들의 생합성을 조사하였다.
(1) 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산)의 생합성과 3-하이드록시발레릭산(3-hydroxyvalerate)의 몰분율 측정
이를 위하여, 본 발명은 바람직한 실시예로서 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1과 모균주 알카리제너스 라투스 DSM 1123을 2 단계 배양하여 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산)(poly(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate))의 축적 농도와 단량체 3-하이드록시발레릭산(3-hydroxyvalerate)의 몰분율을 측정하여 비교하였다.
구체적으로, 상기 미생물들을 영양 복합배지에서 30℃, 36 시간 및 150 rpm의 조건으로 1단계 배양하여 균체를 증식시켰다. 1 단계 배양된 상기 균체들을 회수하여 탄소원(carbon source)으로 설탕 10.0 g/L과 발레릭산(valerate) 1.0 g/L이 첨가된 합성배지에 접종하여 30℃, 48 시간 및 300 rpm의 조건으로 2.5 L 발효조에서 배양한 후 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산)의 축적 농도 및 축적 속도와 3-하이드록시발레릭산의 몰분율을 측정하였다.
그 결과, PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 생합성된 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산)의 세포 내 축적율 및 축적 농도는 모균주에 비하여 현저하게 증가하였는데, 최대 축적율은 형질전환체의 경우 51%로 모균주의 최대 축적율 38%에 비해 1.3 배 증가하였고 최대 축적율에 도달하는 시간 역시 6 시간 단축되었다(도 2a). 또한, 상기 공중합체의 단량체로 사용되는 3-하이드록시발레릭산의 몰분율 역시 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용한 생합성 과정에서 모균주에 비하여 증가하였는데, 형질전환체의 몰분율은 48.0 mol%로 모균주의 몰분율 33.0 mol%와 비교하여 1.3 배 증가하였다(도 2b).
(2) 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생합성과 4-하이드록시부탄산의 몰분율 측정
또한, 본 발명은 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1과 모균주 알카리제너스 라투스 DSM 1123을 2 단계 배양하여 또 다른 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)(poly(3-hydroxybutyrate-3-hydroxybutyrate))의 축적 농도와 단량체 4-하이드록시부탄산(4-hydroxybutyrate)의 몰분율을 측정하여 비교하였다. 구체적으로, 상기 미생물들을 영양 복합배지에서 30℃, 36 시간 및 150 rpm의 조건으로 1단계 배양하여 균체를 증식시켰다. 1 단계 배양된 상기 균체들을 회수하여 탄소원으로 설탕 10.0 g/L과 γ-부티릭락톤(γ-butyric lactone) 1.0 g/L이 첨가된 합성배지에 접종하여 30℃, 48 시간 및 300 rpm의 조건으로 2.5 L 발효조에서 배양한 후 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 축적 농도 및 축적 속도와 4-하이드록시부탄산의 몰분율을 측정하여 그 결과를 하기표 1에 나타내었다.
<표 1> 형질전환체와 모균주의 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 생합성 및 4-하이드록시부탄산의 몰분율 측정
상기표 1에서와 같이, PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용하여 생합성된 공중합체 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 세포 내 축적 속도 및 축적 농도는 모균주에 비하여 현저하게 증가하였는데, 최대 축적 농도는 형질전환체의 경우 2.1 g/L로 모균주의 최대축적 농도 1.9 g/L에 비해 1.1 배 증가하였고 최대 축적량에 도달하는 시간 역시 6 시간 단축되었으며, 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)의 축적율 역시 36.0%에 불과한 모균주에 비하여 형질전환체는 43.7%로 1.2 배 증가하였다. 또한, 상기 공중합체의 단량체로 사용되는 4-하이드록시부탄산의 몰분율 역시 형질전환체 알카리제너스 라투스 T1을 이용한 생합성 과정에서 모균주에 비하여 증가하였는데, 형질전환체의 몰분율은 56.0 mol%로 모균주의 몰분율 34.0 mol%와 비교하여 1.6 배 증가하였다.
따라서, PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체를 이용하여 폴리-하이드록시알칸산을 효율적으로 생합성하는 본 발명의 신규한 제조방법은 폴리-β-하이드록시부탄산 등의 각종 생분해성 고분자 물질 및 상기 고분자 물질의 공중합체를 단 시간안에 대량으로 생산하는데 효과적이며, 또한 이들의 공중합체 제조에 사용되는 단량체들의 함량을 증가시켜 물성에 중요한 역할을 하는 몰분율을 향상시킴므로써 물리적 성질이 더욱 개선된 공중합체를 생산하는데 매우 유용하다.
본 발명의 PHB 합성효소 유전자의 발현을 증가시킨 형질전환체를 이용하여 폴리-하이드록시알칸산의 생합성을 촉진시키는 신규한 제조방법은 폴리-β-하이드록시부탄산 등의 생분해성 고분자 물질과 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레릭산) 및 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부탄산)등의 공중합체의 생합성 수율을 현저하게 향상시킬 뿐만 아니라 공중합체 제조에 사용되는 3-하이드록시발레릭산 및 4-하이드록시부탄산 등과 같은 단량체들의 함량을 증가시켜 물성에 중요한 역할을 하는 몰분율을 향상시킴므로써 물리적 성질이 더욱 개선된 공중합체를 생산하는데 매우 유용하다. 따라서, 본 발명의 신규한 제조방법에 의하여 미생물 형질전환체로부터 대량 생합성된 생분해성 고분자 물질은 환경 오염을 유발하지 않는 환경친화적인 물질로서 플라스틱과 같은 비분해성 고분자 물질의 대체물질로 이용될 수 있다.
Claims (4)
- PHB 합성효소(poly-hydroxybutyrate synthase) 유전자로 형질전환된 알칼리제너스 라투스(Alcaligenus latus) T1(수탁번호 : KCTC 8993P) 형질전환체를 이용하여 폴리-하이드록시알칸산 및 그의 공중합체의 생합성을 촉진시키는 방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 폴리-하이드록시알칸산은 폴리-β-하이드록시부탄산(poly-β-hydroxybutyrate) 또는 폴리-하이드록시발레릭산(poly-hydroxyvalerate)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 공중합체는 폴리(3-하이드록시부탄산-3-하이드록시발레산)(poly(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate) 또는 폴리(3-하이드록시부탄산-4-하이드록시부산)(poly(3-hydroxybutyrate-4-hydroxybutyrate)인 것을 특징으로 하는 방법.
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