JPH07103230B2 - ポリエステル共重合体およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は３−ヒドロキシブチレート単位（以下3HB成分
と記す）、４−ヒドロキシブチレート単位（以下4HB成
分と記す）、および３−ヒドロキシバリレート単位（以
下3HV成分と記す）を含有する共重合体およびその製造
方法に関し、更に詳しくは、ポリエステルを蓄積できる
微生物を用いて製造される3HB成分、4HB成分および3HV
成分からなる新規の共重合ポリエステル及びその製造方
法に関する。

〔従来の技術〕

ポリ−３−ヒドロキシブチレート（PHB）は、エネルギ
ー貯蔵物質として数多くの微生物の菌体内に蓄積され、
優れた生物分解性と生体適合性を示す熱可塑性高分子で
あることから、環境を保全する“クリーン”プラスチッ
クとして注目され、手術糸や骨折固定用材などの医用材
料および医薬や農薬を徐々に放出する徐放性システムな
どの多方面への応用が長年にわたり期待されてきた。特
に近年、合成プラスチックが環境汚染や資源循環の観点
から深刻な社会問題となるに至り、PHBは石油に依存し
ないバイオポリマーとして注目されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、PHBは耐衝撃性に劣るという物性上の問
題とともに、生産コストが高いことから工業的生産が見
送られてきた。

近時、3HB成分および3HV成分を含有する共重合体および
その製造法について、研究、開発がなされ、たとえば、
特開昭57-150393号公報および特開昭59-220192号公報に
それぞれ記載されている。

これらの公報のPHBの製造法は、従来のPHBの製造法にお
けると同様に、前段では菌体を増殖させ、後段では窒素
またはりんを制限して微生物を培養し、共重合体を製造
するものである。

しかしながら、前者では、後段の培養において基質とし
て、たとえば、ピロピオン酸およびイソ酪酸を使用する
ことにより、3HB成分99.9〜50モル％と、たとえば、3HV
成分のような他のエステル成分0.1〜50モル％を含む共
重合体を製造するとの記載がある。しかしながら、この
公報においては、たとえば、実施例では最高33モル％の
3HV成分を含む共重合体しか示されておらず、3HV成分が
これよりも多い共重合体は具体的には示されていない。

一方、後者では、後段の培養において、PHB抽出後の廃
菌体の細胞物質からの炭素を使用して、少なくとも40モ
ル％の3HB成分と他のエステル成分とを含む共重合体を
製造するとの定性的な記載がある。しかしながら、この
公報には、3HB成分と3HV成分との割合を具体的に示した
共重合体は全く記載されていない。また、この方法は煩
雑であり、かつ、細胞物質の成分は、培養条件などによ
り物質の種類、量などに大幅の変動があり不安定であっ
て、実際的ではない。

さらに、共重合体の3HV成分が０から33モル％まで増大
すると、この増大に伴って融解温度（Tm）が180℃から8
5℃まで急激に低下することが知られており〔T.L.Bluhm
et al,Macromolecules，19，2871-2876（1986）〕、こ
のことは、工業的には均一な製品を得ることが困難であ
ることを意味している。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、3HB成分に対する共重合成分、即ち4HB、及
び3HV成分の割合（モル比）が比較的大きい共重合体を
工業的に有利にかつ容易に製造すべく鋭意検討した結
果、後段の窒素もしくはリンを制限する培養において （イ）下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物 および （ロ）下記一般式（II）で表わされる化合物の存在下で
PHB生産能を有する微生物を培養すると、この菌体中に3
HB成分に対する4HB成分および3HV成分の割合（モル比）
が比較的大きい共重合体が生成蓄積されるとの新知見を
得て本発明に到達した。

(CH₂XCHYCH₂CH₂COO)_n ^Z （Ｉ） （式中Ｘは水素原子、ハロゲン原子もしくはヒドロキシ
基、Ｙは水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基もしく
はアルキル基、ｎは１〜４の整数、Ｚは水素原子または
１〜４価の金属原子を示す。） (CH₂MCH₂CH₂COO)_n ^N （II） （式中Ｍはヒドロキシ基またはハロゲン原子を、ｎは１
〜４の整数、Ｎは水素原子または１〜４価の金属原子を
示す。） すなわち本発明は3HB:10〜90モル％、4HB:3〜60モル
％、3HV:5〜87モル％から成る〔η〕が0.4〜10.0dl/gの
範囲にあるポリエステル共重合体、及びその製造方法に
存する。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明において共重合体に含有される3HB成分、4HB成分
および3HV成分はそれぞれ次式であらわされる。

本発明で使用される微生物は、PHB生産能を有する微生
物であれば特に制限はないが、実用上は、たとえば、ア
ルカリゲネス フェカリス（Alcaligenes faecalis）、
アルカリゲネス ルーランディィ（Alcaligenes ruhlan
dii），アルカリゲネス ラタス（Alcaligenes latu
s），アルカリゲネス アクアマリヌス（Alcaligenes a
quamarinus）およびアルカリゲネス ニウトロフス（Al
caligenes eutrophs）等のアルカリゲネス属などがあ
る。

これらの菌種に属する菌株の代表例として、アルカリゲ
ネス フェカリスATCC8750,アルカリゲネス ルーラン
ディィATCC15749,アルカリゲネス ラタスATCC29712,ア
ルカリゲネス アクアマリヌスATCC14400ならびにアル
カリゲネス ユウトロフスH-16ATCC17699およびこのH-1
6株の突然変異株であるアルカリゲネス ユウトロフスN
CIB11597,同NCIB11598,同NCIB11599,同NCIB11600などを
挙げることができる。これらのうち、実用上、アルカリ
ゲネス ユウトロフスH-16ATCC17699およびアルカリゲ
ネス ユウトロフスNCIB11599が特に好ましい。

アルカリゲネス属に属するこれらの微生物の菌学的性質
は、たとえば、“BERGEY′S MANUAL OF DETERMINATIVE
BACTERIOLOGY:Eighth Edition,The Williams＆Wilkins
Company/Baltimore"に、また、アルカリゲネス ユウト
ロフスH-16の菌学的性質は、たとえば“J.Gen.Miclobio
l.,15,185〜192（1979）にそれぞれ記載されている。

これらの微生物は、従来の方法と同様に、主として菌体
を増殖させる前段の培養と、窒素もしくはりんを制限し
て菌体内に共重合体を生成、蓄積させる後段の培養との
２段で培養される。

前段の培養は、微生物を増殖させる為の通常の培養法を
適用することができる。すなわち、使用する微生物が増
殖し得る培地および培養条件を採用すればよい。

培地成分は、使用する微生物が資化し得る物質であれば
特に制限はないが、実用上は、炭素源としては、たとえ
ば、メタノール、エタノールおよび酢酸などの合成炭素
源、二酸化炭素などの無機炭素源、酵母エキス、糖蜜、
ペプトンおよび肉エキスなどの天然物、アラビノース、
グルコース、マンノース、フラクトースおよびガラクト
ースなどの糖類ならびにソルビトール、マンニトールお
よびイノシトールなど、窒素源としては、たとえば、ア
ンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合
物および／または、たとえば、尿素、コーン・スティー
ブ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
スなどの有機窒素含有物ならびに無機成分としては、た
とえば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、
ナトリウム塩、りん酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、
銅塩、モリブデン塩、コバルト塩、ニッケル塩、クロム
塩、ほう素化合物およびよう素化合物などからそれぞれ
選択される。

また、必要に応じて、ビタミン類なども使用することが
できる。

培養条件としては、温度は、たとえば、20〜40℃程度、
好ましくは25〜35℃程度とされ、また、pHは、たとえ
ば、６〜10程度、好ましくは6.5〜9.5程度とされる。こ
のような条件で好気的に培養する。

これらの条件をはずして培養した場合には、微生物の増
殖は比較的悪くなるが、これらの条件をはずして培養す
ることを妨げない。

培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよ
い。

前段の培養によって得られた菌体を、さらに窒素および
／またはりん制限条件下で培養する。

すなわち、前段の培養で得られた培養液から微生物の菌
体を、濾過および遠心分離のような通常の固液分離手段
により分離回収し、この菌体を後段の培養に付するか、
または、前段の培養において、窒素および／またはりん
を実質的に枯渇させて、菌体を分離回収することなく、
この培養液を後段の培養に移行させることによってもで
きる。

この後段の培養においては培地または培養液に窒素およ
び／またはリンを実質的に含有させず （イ）前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物 および （ロ）前記一般式（II）で表わされる化合物を炭素源と
して含有させること以外は前段の培養と異なるところは
ない。

本発明で使用しうる一般式（Ｉ）で表わされる化合物と
しては具体的には、吉草酸、４−クロロ吉草酸、４−ヒ
ドロキシ吉草酸、４−メチル吉草酸、４−エチル吉草
酸、５−ヒドロキシ吉草酸、５−クロロ吉草酸等および
それぞれのナトリウム塩およびカリウム塩などが挙げら
れる。本発明で使用しうる前記一般式（II）で表わされ
る化合物としては具体的には、４−ヒドロキシ酪酸、４
−クロロ酪酸、４−ブロモ酪酸等の酪酸誘導体およびそ
れらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等が挙
げられる。

本発明を実施するにあたり前記一般式（Ｉ）および一般
式（II）で表わされる化合物は、後段の培養における培
地もしくは培養液に含有せしめる。後者の場合には、培
養の初期ないし後期のどの時点でもよいが、培養の初期
が好ましい。

本発明に用いられる前記一般式（Ｉ）および一般式（I
I）で表わされる化合物は、共重合体を生成させること
ができ、かつ微生物の生育を阻害しないような量であれ
ばよく使用した微生物の菌株および所望の共重合割合
（モル比）などによって異なるが、一般的には培地もし
くは培養液１に前記一般式（Ｉ）および一般式（II）
の合計が３〜40g程度が適当である。

この後段の培養においては前記一般式（Ｉ）および一般
式（II）で表わされる化合物を唯一の炭素源としてもよ
いが、使用した微生物が資化し得る他の炭素源、たとえ
ば、グルコース、フラクトース、メタノール、エタノー
ル、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪酸、乳酸および吉草酸
などを共存させることもできる。たとえば、グルコース
を使用する場合には、多くても1.5g/l程度とされる。

このように培養して得られた培養液から、濾過および遠
心分離などの通常の固液分離手段によって菌体を分離回
収し、この菌体を洗浄、乾燥して乾燥菌体を得、この乾
燥菌体から、常法により、たとえば、クロロホルムのよ
うな有機溶剤で生成された共重合体を抽出し、この抽出
液に、たとえば、ヘキサンのような貧溶媒を加えて、共
重合体を沈澱させる。

本発明の製造法によれば、共重合体中の3HB成分、4HB成
分、3HV成分の割合は任意に調節することができる。各
成分の割合は3HB:10〜90モル％、4HB:3〜60モル％、3H
V:5〜87モル％の範囲ならいずれも選択し得るが、例え
ば3HB:10〜80モル％、4HB:3〜50モル％、3HV:10〜70モ
ル％が選ばれる。

〔実施例〕

本発明を、実施例によりさらに具体的に説明する。な
お、本発明は、これらの実施例に限定されるものではな
い。

実施例１〜４及び比較例１〜２ アルカリゲネス ユウトロフスNCIB11599を使用して共
重合体を製造した。すなわち、 前段培養： つぎの組成を有する培地で前記の微生物を30℃で24時間
培養し、対数増殖期終期の培養液から遠心分離により菌
体を分離した。

前段培養用培地の組成 酵母エキス 10g ポリペプトン 10g 肉エキス 5g (NH₄)₂SO₄ 5g これらを脱イオン水１に溶解し、pH7.0に調整した。

後段培養： 前段培養で得られた菌体を、つぎの組成を有する培地
に、１あたり5gの割合で懸濁させ30℃で48時間培養
し、得られた培養液から遠心分離により菌体を分離し
て、菌体を得た。

後段培養用培地の組成 0.5M りん酸水素カリウム水溶液 39.0ml 0.5M りん酸水素二カリウム水溶液 53.9ml 20wt/V％硫酸マグネシウム水溶液 1.0ml 炭素源^* ミネラル溶液^** 1.0ml^* 炭素源として表１に記した様に４−ヒドロキシ酪酸お
よび吉草酸を用いた。（単位g/l）培地）^** ミネラル溶液 CoCl₂ 119.0mg FeCl₃ 9.7g CaCl₂ 7.8g NiCl₂ 118.0mg CrCl₂ 62.2mg CaSO₄ 156.4mg を0.1N-HCl1に溶解 これらを脱イオン水１に溶解し、pH7.0に調整した。

菌体の処理： 後段培養で得られた菌体を蒸溜水で洗浄し、引続きアセ
トンで洗浄し、これを減圧乾燥（20℃、0.1mmHg）して
乾燥菌体を得た。

共重合体の分離回収： このようにして得られた乾燥菌体から熱クロロホルムで
共重合体を抽出し、この抽出液にヘキサンを加えて共重
合体を沈澱させ、この沈澱を濾取、乾燥して共重合体を
得た。

共重合体の特性： このようにして得られた共重合体の組成、固有粘度、融
解温度および融解熱を、つぎのようにして測定した。す
なわち、 組 成 ：¹H NMRスペクトルによる。

固有粘度〔η〕:30℃、クロロホルム中。

融解温度Tm :DSC測定による。

（昇温速度10℃／分） 融 解 熱ΔH :DSC測定による。

測定結果などを第１表に示す。

尚、実施例１で得られた共重合体の500MHz¹H-NMRスペク
トルを図１に、125MHz¹³C-NMRスペクトルを図２に各々
示した。

〔発明の効果〕 本発明によれば3HB成分、4HB成分および3HV成分を含有
する新規のポリエステル共重合体を容易に得ることがで
きる。

さらに本発明で得られた共重合体は、優れた種々の特性
を有しているので手術糸および骨折固定用材などの医用
材料の原料として極めて好適であり、また徐放性システ
ムへの利用などの多方面への応用が期待される。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１で得られた共重合体の500MHz、¹H-NMRス
ペクトル、図２は同じく実施例１で得られた共重合体の
125MHz、¹³C-NMRスペクトルを示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】３−ヒドロキシブチレート単位10〜90モル
   ％ ４−ヒドロキシブチレート単位 ３〜60モル％ ３−ヒドロキシバリレート単位 ５〜87モル％ からなり、30℃クロロホルム中で測定した〔η〕が0.4
   〜10.0dl/gの範囲にあるポリエステル共重合体。
2. 【請求項２】ポリ−３−ヒドロキシブチレート生産能を
   有するアルカリゲネス属菌を前段で菌体を増殖させ、後
   段で該菌体を窒素あるいはリンの制限下で培養して該菌
   体内にポリ−３−ヒドロキシブチレートを生成、蓄積さ
   せるに際して後段の培養を （イ）下記一般式（Ｉ）で表わされる化合物 および （ロ）下記一般式（II）で表わされる化合物 の存在下
   におこなうことを特徴とする３−ヒドロキシブチレート
   単位、４−ヒドロキシブチレート単位および３−ヒドロ
   キシバリレート単位からなるポリエステル共重合体の製
   造方法。