DE2733203A1 - Verfahren zur gewinnung von bakterienstaemmen fuer die herstellung von poly-(d-3-hydroxybuttersaeure) - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von bakterienstaemmen fuer die herstellung von poly-(d-3-hydroxybuttersaeure)

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DE2733203A1
DE2733203A1 DE19772733203 DE2733203A DE2733203A1 DE 2733203 A1 DE2733203 A1 DE 2733203A1 DE 19772733203 DE19772733203 DE 19772733203 DE 2733203 A DE2733203 A DE 2733203A DE 2733203 A1 DE2733203 A1 DE 2733203A1
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poly
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hydroxybutyric acid
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Description

A 2532
Fall 3
Agroferm AG, Chur (Schweiz)
Verfahren zur Gewinnung von Bakterienstämmen für die Her-Stellung von Poly-(D-3-hydroxybuttersäure)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von neuen Bakterienstämmen, welche imstande sind, mikrobiologisch aus billigen, nicht erschöpflichen Rohstoffen Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) in grosstechnischem Massstabe zu produzieren. Die Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) kann u.a. zur Herstellung von Gebilden und Formkörpern, wie Fäden, Fasern, Folien und dergleichen, welche biologisch abbaubar sind, verarbeitet
7.7.77/Dr.FR/z
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werden.
Der heutige Stand der Technik ist u.a. ohne Zweifel der Verwendung von synthetischen, hochmolekularen Stoffen zu verdanken, die aufgrund ihrer breit gestreuten physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihrer leichten Verarbeitbarkeit im täglichen Geschehen eine unersetzliche Rolle spielen. Die bekannten chemischsynthetisch gewonnenen Polymere sind jedoch mit einer grossen Zahl von schwerwiegenden Nachteilen behaftet.
Ihre monomeren Ausgangsmaterialien werden fast ausnahmslos Fraktionen der Erdölspaltung oder der Kohleverarbeitung entnommen, wie z.B. das Aethylen, Propylen - d.h. lineare Kohlenwasserstoffe -. oder das Cyclohexan - d.h. cyclische Kohlenwasserstoffe - oder deren Reaktionsprodukte, wie z.B. Aethylenoxyd oder Cyclohexanon. Die genannten Quellen für die Ausgangsstoffe von chemisch- synthetischen Polymeren sind bekanntlich begrenzt und werden noch für andere lebenswichtige Zwecke eingesetzt, so dass das Angebot einer steigenden Verknappung unterworfen wird.
Anderseits stellen die chemisch-synthetischen Polymere eine Belastung der Umwelt dar. Erstens sind sie nur durch Verbrennung zu beseitigen, wobei in der Regel eine starke Russentwicklung, sowie eine unerwünschte Kohlenmonoxyd- und Kohlendioxyd-Entwicklung auftritt.
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Zudem entstehen bei der Verbrennung vieler Kunststoffe äusserst schädliche Nebenprodukte, wie Salzsäure, Ammoniak, Stickstoffoxyde, Benzpyrene usw., welche nachgewiesenermassen stark korrosiv oder sogar krankheitserzeugend sind (z.B. Krebs) und dadurch die Qualität des Lebensraumes eindeutig beeinträchtigen. Weil der Konsum von synthetischen Kunststoffen erhebliche Mengen erreicht hat, bedingt deren Beseitigung eine enorme Belastung der öffentlichen Abfallverbrennungsanlagen. Schliesslich beinhaltet die chemisch-synthetische Herstellung von Polymerstoffen ausnahmslos das Auftreten von gefährlichen Zwischenprodukten, die z.T. hoch toxisch oder explosiv sind, weshalb durch die Behörden stets aufwendigere Vorkehrungen bei der Fabrikation verlangt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Beitrag zur Lösung dieser Probleme dar, indem sie Wege zur Herstellung von Polymeren aufzeigt, welche auf praktisch unerschöpflichen Ausgangsmaterialien, wie Kohlendioxyd oder Kohlehydraten, beruhen oder von Stoffen ausgehen, welche die Umwelt belastende Abfallprodukte darstellen, wie z.B.
die carbonsäurehaltige Ablauge der Caprolactamsynthese. Die zur Herstellung des Polymerstoffes notwendigen Schritte sind unter ungefährlichen und umweltfreundlichen Bedingungen realisierbar. Ueberdies sind die nach der Erfin- dung hergestellten Polymere biologisch abbaubar, indem
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-X-
daraus hergestellte Folien und dergleichen durch normal bearbeitete Ackererde innert Wochen bis Monaten vollständig aufgelöst werden. In der Tat enthalten sämtliche Böden genügend Mikroorganismen, welche den Polyester Poly-(D-3-hydroxybutt er säure) spalten und die resultierende D-3-Hydroxybuttersäure assimilieren können.
Trotz dieser ubiquitären biologischen Abbaubarkeit zeichnen sich aus den erfindungsgemäss hergestellten Polymeren erzeugte Gebilde durch hohe Resistenz gegenüber Säuren, Alkalien, Licht, Luft und den meisten organischen Lösungsmitteln aus.
Die Polyester der D(-)-3-Hydroxybuttersäure (Kurzform Polybetahydroxybuttersäure oder PHB) entsprechen der Formel:
HO. CHn
CH
CH,
(D
Γ i
CH3 0
wobei η ca. 6-81OOO bedeutet.
Es wurde also ein Verfahren gefunden, durch welches Bakterienstämme gewonnen werden können, welche unter jedwelchen Wachstumsbedingungen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Ablaugen der Caprolactamsynthese, welche Mono- und Dicarbonsäuren enthalten, Kohlehydrate, Methanol, Aethanol, Glycerin und Kohlendioxyd weitgehend in Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) umzusetzen vermögen,
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Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man unter Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) produzierenden Bakterienstämmen jene auswählt, welche auf einem Agar-Nährmedium milchig-weiss aussehende Kolonien bilden, die sich kuppelartig über die Agaroberfläche erheben oder grosse Dimensionen erreichen, unter den derart ausgewählten Bakterienstämmen gegebenenfalls jene auswählt, welche (a) unter der mikrobiologischen Synthese der PoIy-(D-3-hydroxybuttersäure) abträglichen oder nicht förderliehen Bedingungen das geringste spezifische Gewicht besitzen und/oder (b) bei kurzdauernder Ueberflutung mit einer Lösung von Sudanschwarz B die stärkste Anfärbung aufweisen, die derart ausgewählten Bakterienstämme auf stets steigenden Konzentrationen einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle aus der oben erwähnten Gruppe züchtet und dadurch an die Assimilation hoher Konzentrationen dieser Kohlenstoffquelle adaptiert und die Bakterienstämme vor, nach oder im Verlauf der Selektionierung und Züchtung mindestens einmal der Einwirkung von mutagenen Agenzien unterwirft.
Es soll noch hervorgehoben werden, dass die beiden mit (a) und (b) bezeichneten Selektionskriterien zwar fakultative, aber besonders vorteilhafte Massnahmen darstellen. Werden sie nämlich, einzeln oder nacheinander, zusätzlich zu der ersten, auf dem Aussehen der gebildeten
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- fr -
Kolonien beruhenden Auswahl angewendet, so ermöglichen sie in der Tat eine raschere Selektion von Bakterienstämmen höchster Ergiebigkeit inbezug auf die PHB-Produktion. Wenn die beiden zusätzlichen Selektionskriterien zur Anwendung kommen, kann es in beliebiger Reihenfolge geschehen, d.h. gemäss (a, b) oder (b, a).
Die Bakterienstämme werden vorzugsweise mehr als nur einmal der Einwirkung mutagener Agenzien unterworfen. Der Zeitpunkt dieser Behandlung kann frei gewählt werden; beispielsweise kann sie vor der (ersten oder alleinigen) Auswahl auf Grund des Aussehens der Kolonien, und/oder danach, oder auch vor und/oder nach der Adaptierung der ausgewählten Bakterienstämme an die spezielle Kohlenstoffquelle erfolgen.
Gewünschtenfalls kann man unter den erfindungsgemäss ausgewählten und adaptierten Bakterienstämmen in einem zusätzlichen Schritt wiederum jene auswählen, welche nun - im Vergleich zu der Erzeugung durch den Ausgangsstamm vor der Adaptierung - von der Kohlenstoffquelle einen grösseren Anteil in Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) umsetzen. Dieser weitere, fakultative Selektionsschritt beruht also auf der Berechnung der Kohlenstofftransferierung, d.h. der prozentualen Ausnutzung der Kohlenstoffquelle inbezug auf deren Gehalt an Kohlenstoff. Derart ausgewählte Stämme verbrauchen von der Kohlenstoffquelle, der höheren Umsetzung
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in PHB entsprechend, nur einen minimalen Anteil für den Energiestoffwechsel und die Synthese des übrigen Zellmaterials; sie haben deshalb besondere praktische Bedeutung. Ebenfalls kann man unter den erfindungsgemäss ausgewählten Bakterienstämmen oder unter den wie zuvor, durch Berechnung der Kohlenstofftransferierung weiter ausgewählten Stämmen jene aussuchen, welche die Poly-(D-3~ hydroxybuttersäure) nicht oder nur geringfügig depolymerisieren bzw. die monomere D-3-Hydroxybuttersäure nicht verwerten. Es hat sich nämlich gezeigt, dass unter den PHB-produzierenden Mutanten oder Stämmen solche, die das Enzym D-(-)-Betahydroxybuttersäuredehydrogenase (= EC 1.1.1.30; siehe E.T. Barman, Enzyme Handbook, Springer-Verlag, Berlin 1969) nicht oder nicht mehr synthetisieren können, eine zum Teil wesentlich konstantere Erzeugung aufweisen. Die Erhaltung der intrazellular gebildeten PHB-Menge während längerer Zeit auf konstanter Höhe lässt sich vermutlich durch ein Ausbleiben der Depolymerisierung erklären.
Dieser weitere Selektionsschritt erfolgt dadurch, dass man die Stämme auf einem Agar-Nährboden züchtet, welcher als Kohlenstoffquelle ein Gemisch aus einem sehr kleinen Anteil eines assimilierbaren Kohlehydrates und einem stark überwiegenden Anteil der DL-3-Hydroxybuttersäure, zweckmässig in Form des Natriumsalzes, enthält. Es entwickeln sich darauf einerseits sehr kleine, unter-
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schiedlich aussehende Kolonien von ca. 1/4 bis 1 mm Durchmesser und andererseits Kolonien von normaler Grosse. Erstere entsprechen jenen Stämmen, welche D-3-Hydroxybuttersäure nicht zu assimilieren oder verwerten vermögen, PHB jedoch weiterhin erzeugen; sie haben deshalb in der Regel ein milchig-weisses Aussehen.
Im folgenden soll die Erfindung ausführlich beschrieben werden.
Bekanntlich produzieren sehr viele aerobe Schizomyceten PHB als Energiereservestoff, wenn sie entweder ein Ueberangebot an Kohlenstoff erhalten, unter Stickstoffmangel stehen, oder geringen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt sind, d.h. unter der Synthese der PHB günstigen Bedingungen gezüchtet werden. Es wurde nun entdeckt, dass Mikroorganismen gefunden werden können, welche stets, d.h. auch unter für die PHB-Synthese abträglichen, jedoch für die übrigen Lebensvorgänge optimalen Bedingungen, grosse Mengen von PHB aus wirtschaftlich günstigen, bis anhin für diesen Zweck nicht bekannten oder verwendeten Kohlestoffquellen, wie Kohlehydraten - z.B. Melasse, Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose · COp, Methanol, Aethanol, Glycerin und Ablaugen der Caprolactamsynthese (hinfort mit der Abkürzung CAL bezeichnet) produzieren. Solche Mikroorganismen produzieren also PHB stets, d.h. auch unter für die PHB-Synthese ungünstigen
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Bedingungen, wie u.a. falschen C/N-Verhältnissen oder hohem Sauerstoffpartialdruck. Nachdem z.T. bekannte PHB-Produzenten mittels mutagener Agenzien behandelt wurden, konnten aufgrund besonderer morphologischer Merkmale, durch Anfärbung mit Sudanschwarz B sowie auf der Basis des spezifischen Gewichtes Mutanten selektioniert werden, welche konstitutiv, d.h. ungeachtet den Metabolismus des Kohlenstoffs beeinflussender Verhältnisse, wie Stickstoffmangel usw., PHB produzieren. Durch wiederholte Mutation und Selektion wurden Mikrobenstämme erhalten, welche auf den bereits erwähnten Kohlenstoffquellen PHB in einer Menge von bis zu 90 % ihres Zelltrockengewichtes bilden.
Wenn auch PHB sowohl in der Oberflächenkultur als auch in der Submerskultur erzeugt werden kann, wird letzterer im grosstechnischen Massstabe der Vorzug gegeben.
Die Kettenlänge (n in Formel I) wird weitgehend durch die Wahl des zur Isolierung der Polymeren aus der Biomasse verwendeten Extraktionsverfahrens bestimmt. Polare Lösungsmittel, z.B. Aethanol, bewirken vorwiegend die Extraktion von Polymeren mit kleineren Molekulargewichten und tieferen Schmelzpunkten, während lipophi-Ie Lösungsmittel selektiver sind für höher molekulare Polymere mit z.B. η = 80 - 110 und Schmelzpunkten von 1500C - 1900C. Durch die Art des Aufschliessens der Biomasse, wie z.B. durch enzymatische Lyse, Behandlung
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mit Alkalien oder Mineralsäuren, kann nebst einer Verbesserung der Extrahierbarkeit der Polymeren auch dessen Fraktionierung nach molekularer Grosse beeinflusst werden. Bevorzugte Lösungsmittel für die Extraktion von PHB aus der nativen Biomasse sind das Aethylencarbonat und das Propylencarbonat. Beide Lösungsmittel eignen sich für die Extraktion von PHB aus nasser Biomasse auf kontinuierlicher Basis und erlauben überdies durch die Regulation der Extraktionstemperatur und Extraktionsdauer eine weitgehende Beeinflussung des Molekulargewichtes der PHB. So erhält man z.B. mit Propylencarbonat bei 120 0C und einer Ver weilzeit von 1-5 Minuten PHB mit Molekulargewichten über 1Ό00Ό00, während mit Aethylencarbonat bei 110 0C und einer Verweilzeit von 1-10 Minuten PHB mit Molekulargewichten von ca. 30Ό00 - 200Ό00 erhalten werden. Durch Extraktion mit Aethylencarbonat oder Propylencarbonat bei höheren Temperaturen und/oder längerer Verweildauer können auch PHB Molekülen von noch geringerer Kettenlänge erhalten werden. Durch blosses Abkühlen dieser Lösungsmittel fällt reine PHB aus, welche sich leicht abtrennen lässt.
Zur Veränderung der physikalischen Eigenschaften von PHB kann man die PHB-Moleküle unter die Veresterung fördernden Bedingungen (insbesondere wasserentziehenden Massnahmen) untereinander verestern, so dass daraus ein polymerer Stoff mit grösseren Molekulargewichten, d.h.
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einer vervielfachten Kettenlänge von I entsteht. Dadurch erhält man Polymere mit verbesserten mechanischen Eigenschaften .
Die Verfahrensprodukte können durch Methoden, die in der Kunststoffverarbeitung allgemein bekannt sind, wie z.B. Tauchen, Walzen, Pressen, Strangpressen, Spritzgiessen, etc., zu Fasern, Folien oder Werkstücken verarbeitet oder aus Lösungen verarbeitet oder als Lacke verwendet werden.
Die quantitative Bestimmung der Poly-(D-3~hydroxybuttersäure) und die Bestimmung des Molekulargewichtes der Verfahrensprodukte werden mit Vorteil folgendermassen durchgeführt.
Das Polymere (PHB) wird gemäss J.H. Law und R,A. Slepecky, J. Bact. 8j? (1961), 33> in konzentrierter Schwefelsäure durch Hydrolyse und gleichzeitige Dehydratisierung in die Crotonsäure übergeführt, welche im UV-Licht bei 235 nm ein Absorptionsmaximum aufweist. Zur quantitativen, Bestimmung von PHB werden 5 ml der Gärlösung während 10 Minuten bei ca. 151OOO Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Ohne das Sediment zu stören, wird das Ueberstehende dekantiert und zum Sediment 5 ml Natriumhypochloritlösung beigegeben. Nach guter Suspendierung wird das Gemisch unter gelegentlichem Schütteln während 1 Stunde bei 37°C gehalten. Hernach wird durch einen ZeI-
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lulosefaltenfilter filtriert und mit Wasser gut nachgespült. Der Filter samt Rückstand wird mit ca. 10 ml Aceton und hierauf ca. 10 ml Aethanol gewaschen. Filter und fester Rückstand werden in einen 100 ml Rundkolben gebracht, welcher mit 1JO ml Chloroform angefüllt wird.
Der Kolben wird nun in ein kochendes Wasserbad gehalten, bis das Gemisch gut siedet. Hernach wird das Filterpapier herausgenommen und mit siedendem Chloroform über einem in den Kolben mündenden Trichter gut nachgewaschen. Das Chloroform wird dann aus dem Kolben bis zum trockenen Zustand abgedampft. Zum ganz trockenen Kolben werden nun 5,0 ml konzentrierte Schwefelsäure pro analysi beigegeben, die gesamte mit Rückstand belegte Kolbenoberfläche gut befeuchtet, der Kolben mit einem Stopfen verschlossen und während mindestens 10 Minuten bei 95-10O0C gehalten. Während dieser Zeit erfolgt die Hydrolyse und Dehydratisierung der PHB zur Crotonsäure. Nach dem Abkühlen erfolgt die Verdünnung eines aliquoten Teils je nach Bedarf in zwei oder mehr Schritten, z.B. 1:10 mit Wasser und hernach 1:10 mit Schwefelsäure, so dass die Messlösung betreffend die Säure mindestens 9O5?-ig ist. Die Messung der optischen Dichte erfolgt in Quarzglasküvetten, welche mit Stopfen geschlossen werden müssen, um die störende Schlierenbildung möglichst zu verhindern. Es wird bei 235 nm gemessen. Die Menge an PHB lässt sich aus der gemessenen
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optischen Dichte und dem En -Wert von 1521I errechnen.
lern
Eine ca. O,5$ige Lösung eines bestimmten Präparates von PHB in Chloroform wies in der Ultrazentrifuge (siehe H. M. Rauen, Biochemisches Taschenbuch, 2. Teil, Springer-Verlag, Berlin 1964, Seite 746) bei 25 0C eine Flotationskonstante von 1,56 χ 10 Sekunden auf, woraus sich ein mittleres Molekulargewicht von ca. 101OOO errechnen lässt.
Die qualitative Bestimmung von PHB kann mittels des optischen Rotationsdispersionsspektrums erfolgen (siehe Fig. 1). Bei dem in Fig. 1 wiedergegebenen Spektrum erfolgte die Messung in einer Chloroformlösung von 1,646 g Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) pro Liter.
Drehwerte bei: 69Ο nm -5 (Anfang) 625 nm -10
437 nm -2
409 nm 0
400 nm 2 365 nm 7 254 nm 199 (Ende)
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
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Beispiel 1
a) '5OO ml Erlenmeyerkolben, welche 50 ml der Nährlösung 3 % Glucose, 0,5 % KNO3, 0,17 % Na3HPO11-2H2O, 0,13 % KH2PO4, 0,0*1 % MgSo1,. 7H2O, 0,002 % FeSo14^H3O und 0,001 % MnCl3-IH3O enthielten, wurden bei 121 0C autokla-
viert und hernach mit einer Kultur von Bacillus_megaterium NCIB 8508 beimpft und in Gegenwart von Luft bei 28 0C exzentrisch geschüttelt. Nach 48-stündiger Inkubation wurden die Zellen aus der Nährlösung abgetrennt, mit H„0 nachgewaschen und in bekannter Weise z.B. mit UV-Licht, NaN0_, Nitro-nitroso-methylguanidin mutiert (siehe z.B. R. C. Clowes und W. Hayes, Experiments in Microbial Genetics, Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburg I968). Die überlebenden Zellen wurden auf obiges Medium - versehen mit 1,5 % Agar - ausgeplattet, so dass Streukolonien erhalten wurden. Stark milchig-weiss aussehende Kolonien, welche sich kuppelartig über die Agaroberfläche erhoben oder grosse Dimensionen erreichten, wurden zur Prüfung auf PHB unter submersen Bedingungen ausgewählt.
Andere Platten mit voll entwickelten Streukolonien wurden nach ihrer Abstempelung mittels Samtstempeln auf eine erste frische Agarplatte (siehe Clowes und Hayes, loc. cit. "Replication Technique") mit einer Lösung von Sudanschwarz B für kurze Zeit (z.B. 1 bis 5 Minuten)überflutet, um die am stärksten anfärbbaren Kolonien mit blossem Auge zu erkennen
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und die Replikakolonien derselben von der 2. Agarplatte für die Prüfung auf die PHB-Produktivität zu prüfen.
Beide Selektionsmechanismen führten zur Isolierung von Bacillus_megatherium-Mutanten, welche im obigen Medium bedeutend höhere PHB-Mengen speicherten als der Ausgangsstamm.
b.l) Gemäss Teil a wurden selektionierte Stämme unter Bedingungen angezüchtet, welche bekannterweise keine oder nur geringe PHB-Speicherung bewirken, d.h. im Medium von Teil a wurde die Stickstoffquelle um 50 % erhöht (d.h. auf 0,75 % KNO-, gebracht), die Glucosekonzentration auf 0,5 % gesenkt und die Kultur bei 30 0C für 36 Stunden exzentrisch geschüttelt, um hohe Op-Konzentrationen zu erhalten. Die so erhaltenen Kulturen wurden abzentrifugiert, mit H„0 gewaschen und in ca.
2 ml einer CsCl-Lösung mit einer spezifischen Dichte von ca. 1,15 aufgeschlämmt. Diese Suspension wurde auf eine lineare CsCl-Gradientenlösung von ca. 40 ml in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen aus Celluloid vorsichtig aufgetröpfelt. Der CsCl-Gradient (siehe Rauen, loc. cit., Seite 535) war so hergestellt worden, dass die oberste Flüssigkeitszone eine Dichte von 1,15 und die Bodenzone eine solche von 1,38 aufwies. Dieser Gradient wurde samt Zellsuspension für 20 Stunden bei 5 0C und ca. 2501OOO-fächer Erdbeschleunigung zentrifugiert. Dadurch drangen PHB nicht enthaltende
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-ψ-
Zellen, oder solche mit geringem PHB-Gehalt, in die Zonen höherer Dichte des Gradienten ein, während Zellen mit hohen PHB-Gehalten nahe der Oberfläche der Gradientenlösung zu liegen kamen. Nach Beendigung der Zentrifu^ gierung wurden die Gradientenröhrchen am tiefsten Punkt mittels einer Nadel angestochen, so dass die Gradientenlösung sich tropfenweise entleeren liess. Die Tropfen der Zonen mit geringer CsCl-Dichte wurden auf Agarplatten mit Nährlösung von Teil a ausgeplattet, so dass nach deren Bebrütung vorwiegend Streukolonien entstanden. Diese wurden in bekannter Weise als Submerskultur auf ihre Fähigkeit zur PHB-Bildung geprüft. Auf diese Weise wurden von den Stämmen aus Teil a solche gewonnen, welche konstitutiv PHB bildeten, d.h. welche in jeder Wachstumsphase PHB speichern und nicht nur unter speziellen, die PHB-Bildung fördernden Bedingungen, wie dies bei den sogenannten Wildtypen, wie z.B. Bacillus_megatherium
NCIB 8508 und anderen bekannten Wildtypen der Fall ist.
Gleiche Selektionierungserfolge wurden mit Ii-
nearen Saccharosegradienten erzielt.
b.2) Analog zu Teil a und Teil b.l konnten auf dem Medium von Teil a, in welchem Glucose durch 1 % Fructose
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- yr -
und KNO^ durch 0,4 % NH^Cl ersetzt waren, von Bacillus megatherium ATCC 32, Bacillus_megatherium NCIB 8674, Pseudomonas_sg^ B 79 NCIB 9088 und Pseudomonas^sp^ B 175 NCIB 9O89, Pi.facilis ATCC 11228 und ATCC 17695,
ii ATCC II668, Chromatium_violaceum NCIB 8l82, CB 142, Azotobacter_beiierinckii NCIB 9067, A^agilis NCIB 8637, A^_chroococcum DSM 281, Ai_vinelandii NCIB 8789, H^drogenomonas_eutropha ATCC I7699, Alcaligenes eutrop_hus ATCC 23440, Flavobacterium_aguatile ATCC 11947, Bacterium in editio, Zoogloea ramigera ATCC 19623> Mutanten gewonnen werden, die konstitutiv PHB produzierten.
c) ' Auf !constitutive Weise PHB-produzierende Mutanten aus Teil b.2, z.B. diejenigen von Alcaligenes eutroghus ATCC 23440, Bacillus_megatherium ATCC 32, Azotobacter_chroococcum DSM 28l und Zoogloea_ramigera ATCC 19623,wurden aus 24 Stunden alten Submerskulturen des flüssigen Mediums von Teil b.2 auf gleiches durch Agar verfestigtes Medium, welches 0,1 Gew.% von neutralisierter CAL enthielt, ausgeplattet und bei 30 0C solange inkubiert, bis einige Kolonien gut angewachsen waren.
Die grössten Kolonien, welche folglich durch die Anwesenheit von CAL nicht oder am wenigsten im Wachstum beein-
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flusst wurden, wurden in der Folge nach in bekannter Weise durchgeführter Mutation auf analoges Medium ausgeplattet, welches nun aber nur noch 0,8 % Fruktose, dafür aber 0,2 % neutralisierte CAL enthielt, usw., bis von jeder Bakterienart Mutanten resultierten, welche auf CAL als einziger Kohlenstoffquelle gut wuchsen. Zur Adaptierung an höhere CAL-Konzentrationen eignete sich folgende Technik. Bakterienstämme wurden auf Fruktose und CAL enthaltende Agarplatten verimpft, so dass bei ungehemmtem Wachstui dichte Bakterienrasen entstünden. Ins Zentrum solcher Platten wurde hernach eine Spatelspitze voll des das Wachstum hemmenden mutagenen Agens Nitro-nitroso-methylguanidin gebracht und solange.inkubiert, bis sich gutes Wachstum ausgebildet hatte. Kolonien, welche sich sehr nahe dem rnutagenen Agens gut ausbildeten, erwiesen sich oft als bessere CAL-Verwerter.
Durch fortgesetzte Anwendung dieser Methoden, resp. Kombinationen davon, wurden Mutanten erhalten, welche auch höhere Konzentrationen von CAL als einzige Kohlenstoffquelle unter konstitutiver Bildung von PHB durchaus verwerten konnten. Es wurden insbesondere die Mutanten GD-5 von Alcaligenes_eutroghus ATCC 231I1IO und GB 1003 von §§£illys_niegatherium ATCC 32 für weitere Arbeiten ausgewählt, welche 3 % und mehr von neutralisierter CAL als einzige Kohlenstoffquelle assimilierten.
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Beispiel 2
Analog zu Beispiel Ic wurden auf !constitutive Weise PHB-produzierende Mutanten aus Beispiel Ib.2, z.B. diejenigen von B§cillus_megatherium ATCC 32, Azotobacter chroococcum DSM 28l und Zoogloea_ramigera ATCC 19623, so mutiert und selektioniert, dass sie auf Melasse als einziger Kohlestoffquelle hohe Mengen von PHB produzierten. In dieser Weise wurden Mutanten herausgezüchtet, welche auf 30 - hO % Melasse gut wuchsen und ca. 80 - 90 % ihres ZeIltrockengewichtes an PHB speicherten. Es wurden insbesondere die Mutanten GBM-13 von Bacillus_megatherium ATCC 32 und GZ-1018 von Zoogloea_ramigera ATCC 19623 für weitere Arbeiten verwendet.
Beispiel 3
Um methanolverwertende Mikroorganismen zu finden, wurde ein 500 ml Becherglas mit ca. 100 ml der Nährlösung von Beispiel la, welcher jedoch anstatt KNO-, 0,1» % NH^Cl, sowie 1 % Methylalkohol anstelle der Glucose beigemischt wurden, im Laboratorium offen aufgestellt. Nach einigen Tagen war die Lösung trüb und es konnten daraus nach entsprechenden Verdünnungen mit H3O auf Agarplatten, welche nun sterilisiertes Methanolmedium enthielten, einzelstehende Streukolonien erzeugt werden. Ausgewählte sudanophile Kolonien wurden danach analog der Arbeitsweise von Beispiel Ib.1 und Ib.2 unterworfen. Der beste Stamm produzierte zu ca. 8l %
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seines trockenen Zellgewichtes PHB. Dieser Stamm wurde durch den Kurator der National Collection of Industrial Bacteria (Ministry of Agriculture, Fischeries and Food, Torry Research Station, Aberdeen, Scotland) als Myco-PlaDa_rybra-Stamm identifiziert. Der Stamm wurde beim Centraalbureau voor Schimmelcultures unter der Bezeichnung CBS 385-76 deponiert und ursprünglich Bacterium in_editio Pl genannt. Er wurde wie folgt charakterisiert:
Morphologie (GP Agar, bestehend aus 1 % Glycerin + 1 { Pepton bei pH 7,0 auf Agar, 6 Tage bei 30 0C)
Pleomorphe Stäbchen 0,8 χ 1,5 - 5,0 pm Zellen enthalten einen hochen Prozentsatz von Poly-0-hydroxybuttersäure.
Aeltere Submers-Kulturen, d.h. mehr als 7 Tage alt, enthalten geringe Mengen von Zellen mit primären Zellverzweigungen, welche im Phasenkontrastmikroskop erkennbar sind.
Kolonie (GP Agar, 6 Tage bei 30 0C)
Rosafarbig pigmentiert, durchsichtig, rund, ganz randig, konvex erhoben, glatt und glänzend, Durchmesser 0,5 - 1,0 mm. Pigmentierung verstärkt sich mit zunehmendem Alter. Sehr schlechtes Wachstum auf Blutagarbase (OXOID CM 55).
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- aar -
Submerses Wachstum (GP Nährlösung, b'estehend aus 1 % Glycerin
+ 1 % Pepton bei pH 7,0, 6 Tage bei 30 0C)
Ziemlich schwaches Wachstum, bildet Oberflächenring und Häutchen, wenig leicht viskoses Sediment.
Temperatur:
Bei 10 0C wenig oder kein Wachstum Bei 15 0C Wachstum Bei 30 0C Wachstum Bei 37 0C kein Wachstum
Gram-Färbung negativ bis variabel.
Beweglichkeit + Kovacs'Oxydase +
Katalase +
Hugh und Leifson (Glucose) OF -
Pepton Wasser Kohlehydrate: Säurebildung auf Glycerin. Keine Säurebildung auf Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Lactose, Stärke oder Mannit.
Indol-Produktion Methylrot
Voges-Proskauer Koser's Citrat
Trypton schwache NH1^ -Bildung
Nitrat-Reduktion Urease (Christensen) +
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Stärke schwache Hydrolyse
Gelatine nicht hydrolysiert
Casein nicht hydrolysiert Haemolyse
Antibiotika-Sensitivitat
Resistent gegenüber Penicillin, Chloramphenicol und Polymyxin B; sensitiv gegenüber Streptomycin und Tetracyclin.
Kann Methylalkohol, nicht aber Methan, als einzige Kohlenstoffquelle verwerten.
Beispiel 1J
Die Mutante GD-5 (CBS 388.76) wurde in einem Kleinfermenter mit 20 Liter Totalvolumen in 5 Litern des Mediums von Beispiel la, worin KNO, durch 0,1I % NH^Cl und die Glucose durch 2 % neutralisierte CAL der Firma Emser Werke in Domat/Ems (Schweiz) ersetzt waren, bei 28 0C und unter Begasung mit 0,5 Vol/Vol.Minute Luft unter Rühren gezüch tet. Dabei wurde der pH-Wert durch Beigabe von verdünnter HCl bei 6,8 konstant gehalten. CAL enthielt ca. 150 g Carbonsäuren pro Liter, welche gemäss gaschromatographischer Analyse der Methylester der Carbonsäuren folgende Zusammensetzung aufwiesen:
Bernsteinsäure 6 g/Liter
Glutarsäure 9 g/Liter
Adipinsäure 57 g/Liter
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- ys -
Essigsäure 2,5 g/Liter
Propionsäure 3 g/Liter
Buttersäure 6 g/Liter
Valeriansäure 28,5 g/Liter
Capronsäure lH,5 g/Liter
sowie eine unbekannte Menge von Oxycapronsäure.
Die maximale Wachstumsgeschwindigkeit μ betrug 0,2^/Stunde und die Ertragskonstanten betrugen: Υ (g Zelltrockenmasse/ml CAL) = 0,13, d.h. y(g Zelltrockenmasse/g Carbonsäuren) = 0,65.
Dies entspricht einer Kohlenstofftransferierung
(d.h. Ausnutzung der Kohlenstoffquelle inbezug auf deren Kohlenstoffgehalt) von 68 %, während der Mutterstamm Alcali-S§D§s_eutrop_hus ATCC 23**4OO nur eine solche von 57 % aufwies Die Biomasse enthielt ca. 78 % PHB.
Beispiel 5
Die Mutante GD-5 (CBS 388.76) wurde im Klein-
fermenter im Medium von Beispiel ^, zwar ohne dessen Kohlenstoff quelle, aber unter Begasung mit 0,11 Vol/Vol.Min. des Genisches 10 % CO2, 20 % O2 und 70 % H3 bei 28 0C inkubiert. Es wurde festgestellt, dass die PHB-Speicherung exponentiell verläuft, d.h. parallel der Biomassenbildung. Die PHB-Bildungsrate betrug 3 μg/Minute·mg Protein. Unter ansonst gleichen Bedingungen wurde mit dieser Mutante in einstufiger kontinuierlicher Fermentation im Chemostaten (Klein-
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fermenter) eine maximale Wachstumsgeschwindigkeit μ ov von
' max
0,23/Stunde und eine Produktivität von 0,46 g Zelltrockenmasse/LiStunde mit einem Anteil von 68 % PHB festgestellt.
Beispiel 6
Analog zu Eeispiel k wurde mit der Mutante GB-1OO3 (CBS 389.76) verfahren, wobei u Qv 0,25 pro Stunde
* max
und y (g Zelltrockenmasse/ml CAL) = 0,14 betrugen. Die Biomasse enthielt 81 55 PHB.
Beispiel 7
Die Mutante GBM-13 (CBS 390.76) wurde in einer 500 ml Erlenmeyerflasche mit 100 ml des Mediums von Beispiel 4, in welchem die CAL durch 10 % Rübenmelasse ersetzt war, bei 30 0C für 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Nach dieser Zeit enthielt die Kulturlösung 2,5 ß Bakterientrockenmasse mit einem Gehalt an PHB von 85 %·
Beispiel 8
Die Mutante GZ-IOI8 (CBS 391-76) wurde unter gleichen Bedingungen wie bei Beispiel 7 auf 10 % Rübenmelasse, welche 51 % Saccharose enthielt, gezüchtet. Es resultierten 2,35 g Bakterientrockenmasse mit 79 % PHB.
Beispiel 9
Die Mutante GD-5 (CBS 388.76) wurde analog zu Beispiel 7, jedoch anstatt auf Rübenmelasse auf 3 % Aethanol für 24 Stunden gezüchtet. Es konnten 1,1 g Zellen mit einem PHB-Gehalt von 83 % geerntet werden.
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2«
Die Bakterienschüttelkultur wird auf einer Zentrifuge sedimentiert und die Biomasse mit Wasser gewaschen und in ca. 1J ml physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Nach ca. 1 Stunde werden fakultativ H ml 0,6-normaler Natriumacetat-Puffer von pH 1J,6 und H ml einer 0,05-normalen Natriumnitritlösung zur Mutationserzeugung beigegeben und für wenige Minuten inkubiert. Nach dem Waschen wird die Biomasse der Mikroorganismen auf ca. 10 Erlenmeyerkolben zu 250 ml verteilt, welche mit der Nährlösung von Beispiel la beschickt sind, aber statt Glucose 1-25? D;L- oder D(-)-3-Hydroxybuttersäure als Natriumsalz enthalten. Nachdem die Trübung in den Kolben sichtlich zunimmt, wird je nach Antibiotika-Sensitivität des verwendeten Mikroorganisnus pro Kolben je 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 2-1000 μg/ml Kalium-Penicillin G, bzw. 1 ml einer sterilfiltrierten Lösung von 30-1000 jxg/ml Bacitracin, bzw. von 10-2000 Jig/ml Phosphonomycin, 5-1000 jig Vancomycin, respektive Kombinationen dieser Lösungen oder von anderen, die Zellwandbildung, respektive die Teilung der Mikroben beeinflussende Antibiotika, wie z.B. Colistin-SuIfat, beigefügt. Nach bestimmter Inkubationsdauer, d.h. nach ca. 1-16 Stunden, werden aus bestimmten Kolben die Antibiotika ausgewaschen oder mit Penicillinase zerstört.
Nach weiterem Waschen der Biomasse werden die überlebenden
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Mikroorganismen auf Kolben mit Glucose- oder Fruktosemedium verimpft und inkubiert. Nach I6-36 Stunden werden von jedem Kolben Verdünnungsreihen hergestellt und von jenen Verdünnungen, welche pro ml ca. 50-1000 Keime enthalten, werden 0,1 ml auf Agarplatten ausgestrichen, um einzelstehende Streukolonien zu erhalten. Dieser Agar enthält als Kohlenstoffquelle 2% DL-3-Hydroxybuttersäure-Natriumsalz sowie 0,008# Fructose oder Glucose als einzige Kohlenstoffquelle. Nach 48 Stunden entwickeln sich sehr kleine, unterschiedlich aussehende Kolonien von ca. lM-1 mm Durchmesser, sowie Kolonien von normaler Grosse. Zur Bestätigung werden von den kleinen Kolonievarianten mittels sterilen Zahnstochern Inokula übertragen, die einen auf einen bestimmten Platz einer Agarplatte mit 3-Hydroxybuttersäure-Natriumsalz als einziger Kohlenstoffquelle, die anderen auf den entsprechenden Platz einer Agarplatte mit Glucose oder Fructose als einziger Kohlenstoff quelle.
Die gewünschten Stämme, welche ß-Hydroxybuttersäure nicht mehr zu assimilieren vermögen und doch noch PHB produzieren, findet man unter denjenigen spontan vorhandenen oder durch künstliche Mutagenese erzeugten Kolonien von Mutanten, welche auf 3-Hydroxybuttersäure nicht zu wachsen vermögen, aber auf Glucose oder Fructose wohl gedeihen und milchig-weiss aussehen.
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- η 30
Beispiel 11 ^ 2733203 Von Bacillusjnegatherium ATCC 32 wurde der Stamm GBM-13 mit UV-Licht bestrahlt und von den überlebenden Zellen wurden auf Agar mit der Nährlösung von Beispiel la Kolonien angezüchtet. Gemäss Beispiel 1 wurden gute PHB-Produzenten ausgewählt und in 500 ml Erlenmeyerflaschen mit 100 ml Saccharosemedium mit insgesamt 1,68 g Kohlenstoff, d.h. Ί g Saccharose/L, als Schüttelkultur inkubiert. Nach beendeter Züchtung wurden die entstandene Zelltrockenmasse und der gesamte PHB- und Kohlenstoffgehalt bestimmt. Ebenso wurde in der überstehenden Flüssigkeit der Restsaccharose-Gehalt bestimmt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Stamm 1 Saccharose g/L
Anfang Ende*		 0,59 Zellmasse
g/L		 C in g/L
in Zell
masse		 g 1 PHB/L C-Konver
sion in		 5
GBM-13 0,9 1,50 o. 1 ,05 54, 9
Mutante H 1,52 0. ,0 60,
,78
,795
*) Zeit des Abbruches des Ansatzes, d.h. nach 29 Stunden Inkubation.
Der Stamm mit der besseren Kohlenstoffverwertung wurde analog Beispiel 1 weiterbehandelt, um zu Stämmen mit noch besserer Kohlenstoffverwertung und noch höheren Gehalten an PHB zu gereichen.
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Nummer: 27 33 203
Int. Cl.*: C 12 K 3/00
Anmeldetag: 22. Juli 1977
Offenlegungstag: 9. Februar 1978
I
\ 		300 I I I I I I
Optisches Rotationsdispersionsspektrum
von Polybetahydroxybuttersäure 		I
χΙΟ2
2.0-
Konzentration: 1.646 Gramm pro Liter
Lösungsmittel: Chloroform
Orehwerte bei: 690 nm -5 (Anfang)
625 nm -10
437 nm -2
409 ηm 0
400 η m 2
365 nm 7
254 nm 199 (Ende) 		1.0-
- .
-1.0-
400 500 600
Il ι ι ι ι 		I
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Claims (5)

Patentansprüche 7733203
1) Verfahren zur Gewinnung von Bakterien-Stämmen, welche unter jedwelchen Wachstumsbedingungen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Kohlehydrate, Methanol, Aethanol, Glycerin, Kohlendioxyd und Ablaugen der Caprolactamsynthese, welche Mono- und Dicarbonsäuren enthalten, weitgehend in Poly-(D-3~hydroxybuttersäure) umzusetzen vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass man unter Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) produzierenden Bakterienstämmen jene auswählt, welche auf einem Agar-Nährmedium milchig-weiss aussehende Kolonien bilden, die sich kuppelartig über die Agaroberfläche erheben oder grosse Dimensionen erreichen, unter den derart ausgewählten Bakterienstämmen gegebenenfalls jene auswählt, welche (a) unter der mikrobiologischen Synthese der PoIy-(D-3-hydroxybuttersäure) abträglichen oder nicht förderlichen Bedingungen das geringste spezifische Gewicht besitzen und/oder (b) bei kurzdauernder Ueberflutung mit einer Lösung von Sudanschwarz B die stärkste Anfärbung aufweisenί die derart ausgewählten Bakterienstämme auf stets steigenden Konzentrationen einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle aus der oben erwähnten Gruppe züchtet und dadurch an die Assimilation hoher Konzentrationen dieser Kohlenstoffquelle adaptiert und die Bakterien-
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ORIGINAL INSPECTEO
stamme vor, nach oder im Verlauf der Selektionierung und Züchtung mindestens einmal der Einwirkung von mutagenen Agenzien unterwirft.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man unter den derart ausgewählten und adaptierten Bakterienstämmen jene auswählt, welche von der Kohlenstoffquelle einen grösseren prozentualen Anteil in PoIy-(D-3-hydroxybuttersäure) umsetzen als der Ausgangsstamm vor der Adaptierung.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man unter den derart ausgewählten Bakterienstämmen jene auswählt, welche bei Züchtung auf einem Agar-Nährboden, welcher als Kohlenstoffquelle ein Gemisch aus einem sehr kleinen Anteil eines assimilierbaren Kohlehydrates und einem stark überwiegenden Anteil der DL-3-Hydroxybuttersäure enthält, sehr kleine, milchig-weiss aussehende Kolonien bilden.
4) Nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 gewonnene Bakterienstämme, insbesondere Mutanten von Alcaligenes_eutroghus ATCC 23^0, z.B. die Mutante CBS 388.76 (GD-5); von Bacillus_megatherium ATCC 32, z.B. die Mutanten CBS 389.76 (GB-IOO3) und CBS 390.76 (GBM-13); von Zoogloea_ramigera ATCC 19623, z.B. die Mutante CBS 391.76 (GZ-IOI8); und von My_coglana_rubra, z.B. die Mu tante CBS 385.76.
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5) Verwendung der nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 gewonnenen Bakterienstämme zur Herstellung von Poly-(D-3-hydroxybuttersäure), dadurch gekennzeichnet, dass man besagte Bakterienstamme in einem wässrigen Nährmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle aus der Gruppe Kohlehydrate, Methanol, Aethanol, Glycerin, Kohlendioxyd und Ablaugen der Caprolactamsynthese, welche Mono- und Dicarbonsäuren enthalten, nebst einer assimilierbaren Stickstoffquelle und Spurenelementen enthält, züchtet und die gebildete Poly-(D-3-hydroxybuttersäure) aus der Kulturbrühe nach bekannten Methoden isoliert.
Agroferm AG Vertreter :
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