DE69221957T2

DE69221957T2 - Verfahren zur Herstellung eines D-(-)-3-Hydroxybutyrat-monomereinheiten enthaltenden mikrobiellen Polyesters

Info

Publication number: DE69221957T2
Application number: DE69221957T
Authority: DE
Inventors: Minoru Akiyama; Yoshiharu Doi
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1991-06-24
Filing date: 1992-06-24
Publication date: 1998-04-02
Anticipated expiration: 2012-06-25
Also published as: EP0520405A2; US5346817A; EP0520405A3; EP0520405B1; DE69221957D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines mikrobischen Polyesters. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines mikrobischen Polyesters mit 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten, worin ein Stamm der Art Alcaligenes lipolytica in einem flüssigen Medium kultiviert wird. Der hergestellte mikrobische Polyester ist in Kunststoffen und Polymeren brauchbar, die frei von Umweltverschmutzungsproblemen sind und in Implantationsmaterialien und Arzneimittelträgern, deren Wiedergewinnung nicht notwendig ist.

Diskussion von verwandtem Stand der Technik

Mikrobische Polyester, wie Poly(3-hydroxybutyrat), welche durch die biosynthetische Funktion eines Mikroorganismus hergestellt werden, werden leicht durch Mikroorganismen und innerhalb des Körpers von höheren Tieren, einschließlich von Menschen, biologisch abgebaut, wogegen es im allgemeinen unmöglich ist, petrochemisch synthetisierte Polymere biologisch abzubauen. Das durch die biosynthetische Funktion eines Mikroorganismus hergestellte Poly(3-hydroxybutyrat) ist vollständig aus optisch aktiven D-(-)-3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten (optische Reinheit 100%) zusammengesetzt und wird leicht biologisch abgebaut.
Andererseits können Polymere, die vollständig aus optisch aktiven Monomereinheiten zusammengesetzt sind, nicht durch die gegenwärtige petrochemische Technologie hergestellt werden, und durch die gegenwärtige petrochemische Technologie hergestellte Polymere sind im allgemeinen nicht biologisch abbaubar. In jüngerer Zeit sind enorme Mengen an synthetischen Kunststoffen und Polymeren auf verschiedenen Anwendungsgebieten verwendet worden, und enorme Mengen von verbrauchten Kunststoffen und Polymeren haben sich als sperriger, nicht abgebauter Abfall angesammelt. Die Umweltverschmutzung durch derartigen sperrigen nicht abgebautem Abfall stellt heute ein ernstes Problem dar. Die vorstehend erwähnten mikrobischen Polyester werden durch ihren biologischen Abbau in das Öko-System eingeführt, so daß sie als Kunststoffe und Polymere brauchbar sind, die keine Umweltverschmutzungsprobleme aufweisen. Auf dem Gebiet der Medizin können die mikrobischen Polyester außerdem als Implantationsmaterial und als Arzneimittelträger verwendet werden, deren Zurückgewinnung nicht notwendig ist.
Es ist nun berichtet worden, daß eine große Anzahl von Bakterien Poly(3-hydroxybutyrat) in ihren Zellen produzieren, das sich in Form von Teilchen ansammelt (siehe H. Brandle et al., Adv. Biochem. Eng/Biotechnol., 41, Seiten 77-93, 1990). Insbesondere ist berichtet worden, daß 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten und 3-Hydroxyvalerat-Monomereinheiten oder 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten, 3-Hydroxyvalerat-Monomereinheiten und andere Monomereinheiten umfassende Copolymere aus einer vorher ausgewählten, in Wasser löslichen Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Propionsäure, Buttersäure oder Kombinationen davon, durch Verwendung von Alcaligenes eutrophus (siehe offengelegte japanische Patentanmeldungsbeschreibung Nr. 57-150393/1982), Stämme, die zu irgendeiner der Gattungen Nocardia, der Gattungen Corynebacterium und der Gattungen Rhodococcus (siehe europäisches Patent Nr. 396 289) und Rhodospirillum rubrum (siehe H. Brandl et al., Int. J. Biol. Macromol., 11, Seiten 49-55, 1989) gehören, hergestellt werden. Die kommerzielle Verwendung der vorstehend erwähnten Copolymere, die 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten und 3-Hydroxyvalerat-Monomereinheiten umfassen, wird als ein thermoplastisches Harz mit einer verbesserten Festigkeit und Brüchigkeit im Vergleich zu denjenigen aus Poly(3-hydroxybutyrat) angeboten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In der wie vorstehend beschriebenen gegenwärtigen Situation haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung umfangreiche und intensive Untersuchungen im Hinblick darauf durchgeführt, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines mikrobischen Polyesters zu entwickeln, der 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten umfaßt. Als Ergebnis ist gefunden worden, daß eine wirksame Produktion derartiger mikrobischer Polyester durch Züchten eines Stammes, der zu der Art Alcaligenes lipolytica gehört, in einem flüssigen Medium erreicht werden kann, das eine spezielle in Wasser unlösliche Kohlenstoffquelle mit einer langen Kohlenstoffkette enthält. Die vorliegende Erfindung ist basierend auf diesem neuen Fund gemacht worden.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines mikrobischen Polyesters bereitzustellen, der 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten umfaßt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Stamm bereitzustellen, der eine verbesserte Fähigkeit zur Herstellung eines derartigen mikrobischen Polyesters aufweist.
Die vorstehenden und anderen Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der vorliegenden detaillierten Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen klar.
Gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines mikrobischen Polyesters mit D- (-)-3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren stufenweise
(1) ein flüssiges Medium mit einem Gehalt an mindestens einer essentiellen Kohlenstoffquelle vorsieht, ausgewählt aus der Gruppe von Fettsäuren mit jeweils 10 bis 22 Kohlenstoffatomen und deren Derivaten;
(2) einen Stamm der Art Alicaligenes lipolytica in dem flüssigen Medium kultiviert und dadurch eine Kulturbrühe mit einem Gehalt an einem mikrobischen Polyester mit D-(-)-3- Hydroxybutyrat-Monomereinheiten erhält; und
(3) den mikrobischen Polyester von der Kulturbrühe isoliert.
Die hierin verwendete Terminologie "3-Hydroxybutyrat-Monomereinheit" bezeichnet eine Monomereinheit von D-(-)-3-Hydroxybutyrat. Zur Einfachheit wird die vorstehende Terminologie hierin verwendet.
Unter einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine neue Art, Alcaligenes lipolytica (Fermentation Research Institute, mit der Hinterlegungsnr. FERM BP-3819), bereitgestellt, die die Fähigkeit aufweist, mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe von Fettsäuren, Fetten und Ölen, die jeweils mindestens 10 Kohlenstoffatome aufweisen, zu verwenden, wodurch ein mikrobischer Polyester hergestellt wird, der 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten umfaßt und sowohl gegenüber einer Nitrat-Reduktion als auch einer Denitrifikationsreaktion negativ ist.
Bei der Messung der Nitrat-Reduktion wird das Züchten in einer nitrathaltigen Bouillon durchgeführt, und eine Nitrat-Konzentration wird jeden Tag während eines Zeitraums vom 2. Tag bis zum 5. Tag nach dem Start des Züchtens bestimmt. Andererseits wird die Denitrifikationsreaktion gemäß dem Verfahren von K. Komagata et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 14, 19 (1968), durchgeführt, wobei das Züchten in einem Medium durchgeführt wird, das eine 1% Natriumnitrat enthaltende Bouillon umfaßt, welches Medium eine mit flüssigem Paraffin bedeckte Oberfläche aufweist, gefolgt von Analysen der Trübung und der Gasbildung.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Stämme verwendet, die zu dem Stamm Alcaligenes lipolytica gehören und die Fähigkeit aufweisen, einen mikrobischen Polyester mit 3- Hydroxybutyrat-Monomereinheiten herzustellen. Insbesondere werden vorzugsweise Stämme verwendet, die zu den vorstehenden Arten gehören und die Fähigkeit besitzen, mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe von Fettsäuren, Fetten und Ölen, die jeweils mindestens 10 Kohlenstoffatome aufweisen, zu verwenden (zu assimilieren), um dadurch einen mikrobischen Polyester mit 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten herzustellen, und die sowohl gegenüber einer Nitrat-Reduktion als auch einer Denitrifikationsreaktion negativ sind. Am stärksten bevorzugt ist ein Stamm, der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, und als Alcaligenes lipolytica AK 201 bezeichnet wurde, welcher am 17. April 1991 bei dem Fermentation Research Institute der Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt wurde, und dem die Hinterlegungsnr. FERM BP- 3819 zugeteilt wurde.
Alcaligenes lipolytica AK 201 ist auf die nachstehend beschriebene Weise gefunden und isoliert worden.
Der durch Passagieren aufbewahrte Stamm ATCC 29347, der zur Gattung Pseudomonas gehört, wurde in einem flüssigen Medium gezüchtet, wodurch eine Kulturbrühe erhalten wurde. Als Ergebnis wurde die Kulturbrühe mit anderen Bakterien kontaminiert. Daher wurde eine Isolierung des Stamms gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt. D.h. ein Aliquot der Kulturbrühe wurde quantitativen Verdünnungen mit sterilisiertem Wasser (in dem Bereich von 10&sup5;-fach bis 10&sup7;-fach verdünnt) unterzogen, wodurch 7 Verdünnungsgrade erhalten wurden. Jede der Verdünnungen wurde auf einer Platte in einer Petrischale zur Bildung von Kolonien kultiviert. Von fünf daraus ausgewählten Kolonien wurden Stämme ausgewählt und separat einer Züchtung in einem flüssigen Medium unterzogen. Jeder in dem flüssigen Medium gezüchtete Stamm wurde auf ein Schrägmedium geimpft, 4 Tage lang gezüchtet und einem Assay zur Bestimmung der bakteriologischen und chemotaxonomischen Eigenschaften unterzogen.
Sowohl das vorstehend erwähnte Flüssigmedium und das schräge Medium als auch das Medium für die vorstehend erwähnte Züchtung auf einer Platte umfaßten das anorganische Grundmedium mit der in der folgenden Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung, wozu Natrium-n-octanoat als Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von 2,5 g/Liter gegeben wurde.
Sowohl zu dem Schrägmedium als auch dem Medium zur Kultur auf einer Platte wurde weiter Agar in einer Konzentration von 15 g/Liter gegeben. Tabelle 1
* Die Lösung des geringeren Elements ist eine Lösung, die durch Lösen von 2,78 g FESO&sub4; 7H&sub2;O, 1,98 g MnCl&sub2; 4H&sub2;O, 2,81 g COSO&sub4; 7H&sub2;O, 1,67 g CaCl&sub2; 2H&sub2;O, 0,17 g CuCl&sub2; 2H&sub2;O und 0,29 g ZnSO&sub4; 7H&sub2;O in 1 Liter 1 M Salzsäure erhalten wird.
Das Züchten wurde bei einer Temperatur von 30 ºC während eines Zeitraums von 24 Stunden für den Fall des Züchtens in dem flüssigen Medium und 4 Tage im Fall des Züchtens auf einer Platte und des Züchtens in dem schrägen Medium durchgeführt.
Als Ergebnis der vorstehend erwähnten Assays ist gefunden worden, daß der als AK 201 bezeichnete Stamm, der von einer Kolonie stammt, die nachstehend beschriebenen bakteriologischen und chemotaxonomischen Eigenschaften aufweist.
Bezüglich des Äußeren gab es keinen wesentlichen Unteschied zwischen AK 201 und den von anderen Kolonien stammenden Stämmen. Eine weitere Studie mit einem Elektronenmikroskop zeigte jedoch, daß die an dem Stamm AK 201 gewachsenen Geißeln keine für die Gattung Pseudomonas charakteristischen polaren Geißeln sondern periphere Geißeln sind. Weitere Studien bezüglich der physiologischen Eigenschaften zeigten, daß die erhaltenen Ergebnisse bezüglich mindestens fünf Punkten [die Reduktion eines Nitratsalzes, der Nutzung von Zitronensäure, Urease, O(Oxidation)-F(Fermentation)Test und der Nutzung von Glucose] von den Assays bezüglich physiologischer Eigenschaften zwischen dem Stamm AK 201 und den von anderen Kolonien stammenden Stämmen unterschiedlich sind. Daher wurde die taxonomische Position des Stammes AK 201 untersucht, und es wurde festgestellt, daß er zu der Art Alcaligenes lipolytica gehört.
In den Assays bezüglich der physiologischen Eigenschaften wurde dadurch ein Oxidase-Test durchgeführt, daß in einer 1% Pepton enthaltenden Bouillon gezüchtet und dann die Verfärbung mit einem Testpapier beobachtet wurde. Weiter wurde ein Säurebildungstest aus Glucose unter Verwendung von wäßrigem Pepton als Grundmedium durchgeführt und ein Nutzungstest bezüglich Zitronensäure wurde unter Verwendung von Koser, Simmons und Christensen Medien durchgeführt. Bezüglich der morphologischen Eigenschaften wurden die Zustände von gewachsenen Geißeln mittels eines Elektronenmikroskops beobachtet und die anderen Zustände wurden mittels eines optischen Mikroskops gemäß einem üblichen Verfahren beobachtet.
Die bakteriologischen Eigenschaften des neuen Stamms AK 201 sind wie folgt.

(a) Morphologie

(1) Form und Größe der Zellen: Bacillus, 0,4 bis 0,7 x 0,7 bis 1,5 µm.
(2) Polymorphismus der Zellen: keiner.
(3) Motilität: positiv.
(4) Wachstum von Geißeln: periphere Geißeln sind gewachsen.
(5) Spore: keine.
(6) Gram-Färbung: negativ.

(b) Wachstumszustand in verschiedenen Kulturmedien

(1) Züchten in einem Plattenbouillon-Agarmedium: weiß, wächst gut.
(2) Züchten in einem schrägen Bouillon-Agarmedium: weiß, wächst gut.
(3) Züchten in einem flüssigen Bouillonmedium: cremefarben, wächst gut.

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Reduktion eines Nitrats: negativ.
(2) Denitrifikationsreaktion: negativ.
(3) Bildung von Indol: negativ.
(4) Nutzung von Zitronensäure: positiv.
(5) Nutzung einer anorganischen Stickstoffquelle: positiv.
(6) Bildung eines Pigments: negativ.
(7) Urease: positiv.
(8) Oxidase: positiv.
(9) Katalase: positiv.
(10) Temperatur und pH zum Wachstum: 20 bis 37 ºC, pH 6-8.
(11) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob.
(12) O(Oxidation)-F(Fermentation)Test: negativ.
(13) Säurebildung aus Glucose: negativ.
(14) Zersetzung von Gelatine: negativ.
(15) Nutzung von Saccharid:
D-Glucose: negativ
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: negativ
D-Mannit: negativ
Maltose: negativ
Es wurde identifiziert, daß der neue Stamm AK 201 zu der Art Alcaligenes lipolytica gehört, wobei seine bakteriologischen Eigenschaften in Betracht gezogen wurden, d.h., er ist ein aerober gram-negativer nicht-fermentierender motiler Bacillus mit peripheren Geißeln, und er ist gegenüber Oxidase positiv und negativ in dem O(Oxidation)-F(Fermentation)Test. Die vorstehenden bakteriologischen Eigenschaften wurden gemäß dem Verfahren gemessen, das in Biseibutsu no Bunrui to Dotei (Klassifikation und Identifikation von Mikroorganismen) (1990), herausgegeben von Takeji Hasegawa und veröffentlicht von Gakkai Shuppan Center, Japan, "Aerobic Bacteria", geschrieben von Kazuo Komagata, und in The Procaryotes: A Handbook of Habitats, Isolation and Identification of Bacteria (Hg.), M.P. Starr et al. (1981) beschrieben wurde. Die Identifizierung des Bakteriums wurde gemäß dem Verfahren durchgeführt, das in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1 (1984), beschrieben ist.
Die folgenden Tabellen 2 bis 4 zeigen Vergleiche bezüglich der bakteriologischen Eigenschaften zwischen dem neuen Stamm AK 201 und den bekannten Spezies, die zu der Art Alcaligenes gehören. Tabelle 2 Bakteriologische Eigenschaften der zu der Gattung Alcaligenes gehörenden Arten
*: M beduetet, daß es positiv ist, wenn es Mutante ist. Tabelle 3 Bakteriologische Eigenschaften der zur Gattung Alcaligenes gehörenden Arten
* Poly(3-hydroxybutyrat) Tabelle 4 bakteriologische Eigenschaften der zur Gattung Alcaligenes gehörenden Arten
Aus den in den vorstehenden Tabellen 2 bis 4 gezeigten Vergleichen kann vernünftigerweise angenommen werden, daß der Stamm AK 201 eine neue Art der Gattung Alcaligenes ist, die sich von den bekannten Arten der Gattung Alcaligenes unterscheidet.
Der Stamm AK 201 ist dadurch gekennzeichnet, daß Fette, Öle und langkettige Fettsäuren in wirksamer Weise als Kohlenstoffquelle beim Wachstum und der Synthese eines mikrobischen Polyesters, wie nachstehend beschrieben, genutzt werden. Daher ist die Art, zu der der Stamm AK 201 gehört, als Alcaligenes lipolytica bezeichnet worden.
Nachstehend werden die Zuchtbedingungen, die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, bezüglich Alcaligenes lipolytica AK 201 beschrieben, das als ein Beispiel der Stämme angenommen wird, die zur Herstellung des gewünschten mikrobischen Polyesters in der vorliegenden Erfindung gezüchtet werden sollen.
Alcaligenes lipolytica AK 201 kann unter ähnlichen Bedingungen, wie denen für andere Stämme der Gattung Alcaligenes, gezüchtet werden. Das heißt, es wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 bis 40 ºC, vorzugsweise von 24 bis 33 C00, gezüchtet. Der Anfangs pH-Wert zur Zucht liegt im allgemeinen im Bereich von 6,0 bis 8,0, vorzugsweise von 6,2 bis 7,5.
Verschiedene Medien, einschließlich synthetischer, halbsynthetischer und natürlicher Medien, können als flüssige Medien in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Wenn die in Tabelle 1 angegebenen anorganischen Medien verwendet werden, wird mindestens eine Kohlenstoffquelle zur Verwendung beim Wachstum des zur Art Alcaligenes lipolytica gehörenden Stamms zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu den anorganischen Medien zugesetzt. Repräsentative Beispiele derartiger Kohlenstoffquellen umfassen gesättigte oder ethylenisch ungesättigte geradkettige Fettsäuren, die jeweils 2 bis 22 Kohlenstoffatome aufweisen; Fette und Öle, wie Tierfette und Pflanzenöle; organische Säuren, wie Zitronensäure, Gluconsäure, Succinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Suberinsäure und Azelainsäure; Alkohole, wie Methanol, Ethanol und Glycerol; und aliphatische geradkettige Kohlenwasserstoffe, wie n-Octan und n-Nonan.
Die Kohlenstoffquelle zur Verwendung beim Wachstum eines zur Art Alcaligenes lipolytica gehörenden Stamms zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann unabhängig von der Kohlenstoffquelle zur Verwendung bei der Synthese eines wie nachstehend beschriebenen Polyesters ausgewählt werden. Unter den Kohlenstoffquellen werden langkettige Fettsäuren, Fette und Öle sowohl für das Wachstum des zu der Art Alcaligenes lipolytica gehörenden Stammes zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung als auch zur Synthese eines Polyesters in wirksamer Weise verwendet.
Außerdem können verschiedene Aminosäuren als auch organischen Stickstoff enthaltende Nährmittelquellen, wie Polypepton, Fleischextrakt, Casaminosäure (casamino acid), Hefeextrakt und Molassen, zum Wachstum des zu der Art Alcaligenes lipolytica gehörenden Stammes zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gebraucht werden.
Wie bei üblichen flüssigen Medien zur Verwendung beim Züchten von Mikroorganismen, enthält das flüssige Medium zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eine Stickstoffquelle und anorganische Ionen.
Repräsentative Beispiele von Stickstoffquellen umfassen anorganische Ammonioumsalze, wie Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, Aminosäuren, organische stickstoffhaltige, wie vorstehend erwähnte, Nährstoffquellen, Ammoniumsalze von organischen Säuren und Amide von organischen Säuren.
Repräsentative Beispiele von anorganischen Ionen umfassen Ionen von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Chlor, Sulfat, Phosphat, Eisen, Mangan, Zink, Kupfer und Kobalt.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es erforderlich, daß der zur Art Alcaligenes lipolytica gehörende Stamm mit mindestens einer Kohlenstoffquelle (hier nachstehend als "essentielle Kohlenstoffquelle" bezeichnet) zur Verwendung bei der Synthese eines mikrobischen Polyesters mit 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten gefüttert wird.
Die essentielle Kohlenstoffquelle ist in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unabdingbar und wird zur Synthese des mikrobischen Polyesters oder sowohl für die Synthese des mikrobischen Polyesters als auch das Wachstum des zur Art Alcaligenes lipolytica gehörenden Stammes verwendet. Demgemäß erfüllt die essentielle Kohlenstoffquelle eine andere Funktion als die Kohlenstoffquelle, die nur zum Wachstum des Stammes verwendet wird, aber es gibt einige Moleküle, die beide Funktionen erfüllen können.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die essentielle Kohlenstoffquelle aus der Gruppe ausgewählt, die aus Fettsäuren mit jeweils 10 bis 22 Kohlenstoffatomen, Derivaten und Gemische der Fettsäuren und der Derivate besteht. Die Fettsäuren können gesättigt oder ethylenisch ungesättigt sein. Es wird bevorzugt, daß jede der Fettsäuren 11 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen. Die Derivate der Fettsäuren umfassen Metall(Na&spplus;, K&spplus;, Ca²&spplus;, Mg²&spplus; etc.)salze, Ammoniumsalze, Ester von Fettsäuren mit einem Alkylalkohol mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Mono- oder Diester von Fettsäuren mit einem Alkylenglykol mit 2 oder 3 Kohlenstoffatomen, Mono-, Di- oder Triester von Fettsäuren mit Glycerol, und Amide von Fettsäuren der Formel - CONH&sub2;. Weiter umfassen die Derivate der Fettsäuren ein Fett oder ein Öl, das ein Gemisch aus Triglyceriden oder Fettsäuren mit jeweils 10 bis 22 Kohlenstoffatomen umfaßt.
Die Konzentration der essentiellen Kohlenstoffquelle in dem flüssigen Medium zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht wesentlich. Sie liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von 0,5 bis 50 g/Liter, vorzugsweise von 1 bis 10 g/Liter.
Bevorzugte Beispiele von mikrobischen Polyestern, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, sind ein Homopolymer eines 3-Hydroxybutyratmonomers und ein Copolymer eines 3-Hydroxybutyratmonomers und eines 3-Hydroxyvaleratmonomers.
Der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte mikrobische Polyester weist im allgemeinen ein Zahlenmittel des Molekulargewichts von 50.000 bis 2.000.000 und vorzugsweise von 100.000 bis 1.000.000 auf, wie durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von monodispersen Polystyrolen als Referenzmaterial gemessen.
Die Struktur des hergestellten mikrobischen Polyesters hängt von der molekularen Struktur der verwendeten essentiellen Kohlenstoffquelle ab. Wenn z.B. ein zu der Art Alcaligenes lipolytica gehörender Stamm zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung auf einer einzelnen Kohlenstoffquelle gezüchtet wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Fettsäuren, welche eine gerade Anzahl von Kohlenstoffatomen zwischen 10 und 22 aufweisen (nachstehend werden derartige Fettsäuren häufig einfach als "gerade Fettsäuren" bezeichnet) und Derivaten davon besteht, um dadurch den Stamm zu züchten und einen mikrobischen Polyester herzustellen, ist der hergestellte mikrobische Polyester ein Homopolymer eines 3-Hydroxybutyratmonomers. Wenn der Stamm andererseits auf einer einzelnen Kohlenstoffquelle gezüchtet wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Fettsäuren, die eine ungerade Anzahl von Kohlenstoffatomen zwischen 10 und 22 aufweisen (nachstehend werden derartige Fettsäuren hierin häufig einfach als "ungerade Fettsäuren" bezeichnet) und Derivaten davon besteht, um so den Stamm zu züchten und einen mikrobischen Polyester herzustellen, ist der hergestellte mikrobische Polyester ein Copolymer eines 3-Hydroxybutyratmonomers und eines 3-Hydroxyvaleratmonomers. Wenn die aus geraden Fettsäuren und Derivaten davon ausgewählte Kohlenstoffquelle weiter in Kombination der mit der Kohlenstoffquelle verwendet wird, die aus ungeraden Fettsäuren und Derivaten davon ausgewählt wird, wird ein Copolymer eines 3-Hydroxybutyratmonomers und eines 3-Hydroxyvaleratmonomers hergestellt.
Die Struktur des hergestellten mikrobischen Polyesters hängt nicht nur von der molekularen Struktur der wie vorstehend erwähnt verwendeten essentiellen Kohlenstoffquelle ab, sondern auch von der molekularen Struktur einer zusätzlichen Kohlenstoffquelle zur Verwendung bei der Synthese des mikrobischen Polyesters. Zum Beispiel wird ein Copolymer eines 3-Hydroxybutyratmonomers und eines 3-Hydroxyvaleratmonomers hergestellt, wenn ein zu der Art Alcaligenes lipolytica gehörender Stamm zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in einem Gemisch einer essentiellen Kohlenstoffquelle, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Fettsäuren mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoffatomen zwischen 10 und 22 und Derivaten ausgewählt wird, mit mindestens einer zusätzlichen Kohlenstoffquelle gezüchtet wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Verbindungen der Formel:
CH&sub3;(CH&sub2;)2n-1X (1)
besteht, worin X eine Gruppe der Formel
darstellt,
worin R eine Hydroxylgruppe, eine Methoxygruppe oder eine Ethoxygruppe darstellt, oder eine Gruppe der Formel -CH&sub2;-OR', worin R' ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe oder eine Propionylgruppe darstellt, und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein zu der Art Alcaligenes lipolytica gehörender Stamm zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gemäß entweder einem einstufigen Züchtungsverfahren oder einem zweistufigen Züchtungsverfahren gezüchtet werden.
In dem einstufigen Züchtungsverfahren wird der Stamm in mindestens einer Kohlenstoffquelle gezüchtet, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Fettsäuren mit jeweils 10 bis 22 Kohlenstoffatomen und Derivaten davon besteht, so daß der Stamm wächst und gleichzeitig den mikrobischen Polyester produziert. Das Züchten kann in Gegenwart von mindestens einer der vorstehend erwähnten zusätzlichen Kohlenstoffquellen durchgeführt werden, die das Wachstum des Stamms fördert und/oder die Eigenschaften des hergestellten mikrobischen Polyesters steuert.
In dem zweistufigen Züchtungsverfahren wird das Züchten in der ersten Stufe zuerst oder hauptsächlich zum Züchten des Stammes durchgeführt. Ausgewachsene Zellen des Stammes werden gesammelt und in ein Zweitstufenmedium eingeführt, und das Züchten in der zweiten Stufe wird zuerst oder hauptsächlich zur Herstellung des mikrobischen Polyesters durchgeführt. D.h., in der ersten Stufe wird eine Kohlenstoffquelle ausgewählt, die für das Wachstum des Stamms geeignet ist. In der zweiten Stufe wird mindestens eine essentielle Kohlenstoffquelle, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Fettsäuren mit jeweils 10 bis 22 Kohlenstoffatomen und Derivaten davon besteht, entweder unabhängig voneinander oder zusammen mit mindestens einer der vorstehend beschriebenen zusätzlichen Kohlenstoffquellen verwendet. In der zweiten Stufe ist vorteilhaft, das Züchten entweder in einer reduzierten Menge von mindestens einer essentiellen Nahrungsmittelquelle, wie einer Stickstoffquelle und einer Phosphorquelle, oder in deren vollständiger Abwesenheit durchzuführen, um das Wachstum des Stammes zu beschränken und die Herstellung des mikrobischen Polyesters zu fördern.
Nach Abschluß des Züchtens wird der 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten umfassende mikrobische Polyester aus der Kulturbrühe nach üblichen Verfahren isoliert.
In dem Verfahren, in dem ein einstufiges Züchten durchgeführt wird, wird die Kulturbrühe direkt Behandlungen zur Isolation des mikrobischen Polyesters unterworfen. Zum Beispiel werden Zellen des Stammes gesammelt, mit destilliertem Wasser gewaschen und lyophilisiert, um lyophilisierte Zellen zu erhalten. Danach werden diese Zellen unter Erhitzen mit einem guten Lösungsmittel, wie Chloroform, extrahiert, um einen Polyesterextrakt zu erhalten. Der so erhaltene Extrakt wird konzentriert und ein schlechtes Lösungsmittel, wie Methanol und Hexan, dazugegeben, um den mikrobischen Polyester auszufällen.
In dem Verfahren, in dem eine zweistufige Züchtung durchgeführt wird, werden Zellen des Stamms nach einer ersten Stufe des Züchtens gesammelt und in ein Medium zur Verwendung in einer zweiten Stufe des Züchtens eingeführt. Es wird eine zweite Stufe des Züchtens durchgeführt. Danach werden Zellen des Stamms im wesentlichen auf dieselbe Weise wie vorstehend im Hinblick auf das Verfahren behandelt, in dem ein einstufiges Züchten durchgeführt wird.
Die Schmelztemperatur, die Fusionswärme und die Glasübergangstemperatur des mikrobischen Polyesters werden durch Differentialscanningkalometrie gemessen. Das Molekulargewicht und die Molekulargewichtsverteilung des mikrobischen Polyesters werden durch Gelfiltrationschromatographie gemessen.
Die Zusammensetzung des mikrobischen Polyesters wird durch Gaschromatographie bestimmt. Lyophilisierte Zellen, die einen mikrobischen Polyester oder einen isolierten Polyester enthalten, werden einer Methanolyse unterworfen, um Methylester von Monomeren zu erhalten, von denen Proben genommen und in einen Gaschromatographen injiziert werden (siehe H. Brandl et al., Int. J. Biol. Macromol., 11, Seiten 49-55 (1989).

BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird im größeren Detail unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben, die jedoch nicht so konstruiert werden sollen, daß sie den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken.

Beispiele 1 bis 4

Alcaligenes lipolytica AK 201 wird aseptisch in ein flüssiges Medium geimpft, das sich in einem Sakaguchi-Kolben (ein breitschultriger Einhals-Kolben, der in Japan entwickelt und in großem Umfang zum Züchten von Mikroorganismen in einem flüssigen Medium im Laboratoriumsmaßstab verwendet wird, welcher Hals an einem Ende eine mit einem Baumwollstopfen versehene Öffnung aufweist) mit einem Volumen von 500 ml befindet. Als Flüssigmedium wird ein Medium verwendet, das durch Zugabe einer Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von 3 g/Liter zu 100 ml eines anorganischen Mediums mit der in der vorstehenden Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung hergestellt wurde. Die Kohlenstoffquelle ist Undecanonsäure in Beispiel 1, Pentadecanonsäure in Beispiel 2, Natriumstearat in Beispiel 3 und Rapsöl in Beispiel 4. Die Zellen in den beimpften Flüssigmedien werden 48 Stunden lang unter Schütteln mit 130 Bewegungen pro Minute bei 30 ºC gezüchtet.
Nach Abschluß des Züchtens, werden die entstandenen Kulturbrühen einzeln bei 8.000 UpM 15 Minuten lang zentrifugiert und mit Wasser gewaschen, und die Zellen von Alcaligenes lipolytica AK 201 werden gesammelt. Die gesammelten Zellen werden lyophilisiert, um dadurch lyophilisierte Zellen zu erhalten. In den Zellen gesammelter Polyester wird aus den lyophilisierten Zellen unter Verwendung von 100 ml heißem Chloroform extrahiert, wodurch eine Extraktlösung erhalten wird. Die Extraktlösung wird bis zu einer Konzentration von etwa 5 ml konzentriert, und Hexan wird hinzugegeben, um eine Ausfällung eines Polyesters zu bewirken. Der ausgefällte Polyester wird abfiltriert und getrocknet, wodurch ein trockener Polyester erhalten wird.
Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse der Biosynthese eines Polyesters in den Beispielen 1 bis 4. Tabelle 5 Ergebnisse der Biosynthese eines Polyesters
Anmerkung:
Tm: Schmelztemperatur
Mn: Zahlenmittel des Molekulargewichts
3HB: 3-Hydroxybutyrat
3HV: 3-Hydroxyvalerat

Beispiele 5 bis 7

Alcaligenes lipolytica AK 201 wird ein Flüssigmedium geimpft und unter im wesentlichen denselben Bedingungen wie in den Beispielen 1 bis 4 gezüchtet, außer daß Schweinefett (hog's fat) in Beispiel 5, Olivenöl in Beispiel 6 und Ethyllaurat in Beispiel 7 als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird. Nach dem Züchten werden die erhaltenen Polyester analysiert.
Die Ergebnisse der Biosynthese eines Polyesters in den Beispielen 5 bis 7 werden in der nachstehenden Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Ergebnisse der Polyester-Biosynthese
Anmerkung: Die Bedeutungen von 3HB, 3HV und TM sind unter Tabelle 5 definiert.

Beispiel 8

Alcaligenes lipolytica AK 201 wird in ein flüssiges Medium geimpft und 72 Stunden lang unter im wesentlichen denselben Bedingungen wie in den Beispielen 1 bis 4 gezüchtet, außer daß 2 g/Liter Rapsöl als eine essentielle Kohlenstoffquelle verwendet wird, wobei 1 g/Liter Natriumpropionat als eine zusätzliche Kohlenstoffquelle verwendet wird. Der entstandene Polyester wird analysiert. Als ein Ergebnis der Analyse wurde gefunden, daß das Gewicht der trockenen Zellen 1,9 g/Liter der Kulturbrühe beträgt, daß der Polyestergehalt der trockenen Zellen 22 Gew.-% beträgt, daß der Polyester 94 Mol-% 3-Hydroxybutyrat- Monomereinheiten und 6 Mol-% 3-Hydroxyvalerat-Monomereinheiten enthält, und daß die Schmelztemperatur des Polyesters 153 ºC beträgt.

Beispiel 9

100 ml eines Flüssigmediums, das durch Lösen von 10 g Polypepton, 5 g Fleischextrakt, 10 g Hefeextrakt und 5 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in 1 Liter Wasser erhalten worden war, wurde in einen Sakaguchi-Kolben mit einem Volumen von 500 ml gegeben und aseptisch mit Alcaligenes lipolytica AK 201 beimpft. Die Zellen in dem beimpften flüssigen Medium werden 24 Stunden unter Schütteln bei 30 ºC gezüchtet. Nach Abschluß des Züchtens, wird die entstandene Kulturbrühe bei 8.000 UPM 10 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen von Alcaligenes lipolytica AK 201 zu sammeln. Die gesammelten Zellen werden in 100 ml eines Zweistufen- Flüssigmediums eingeführt (ein Medium, das dieselbe Zusammensetzung des anorganischen Mediums aufweist, wie in Tabelle 4, außer daß kein (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; enthalten ist, worin 3 g/Liter Natriumpalmitat als eine essentielle Kohlenstoffquelle und 2 g/Liter n-Nonylacetat als zusätzliche Kohlenstoffquelle enthalten sind). Die Zellen in dem flüssigen Medium der zweiten Stufe werden 48 Stunden lang unter Schütteln bei 30 ºC gezüchtet. Nach dem Züchten wird ein Produktpolyester analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden, daß das Gewicht der trocken Zellen 7,4 g/Liter Kulturbrühe beträgt, der Polyestergehalt der trockenen Zellen 46 Gew.-% beträgt, der Polyester 87 Mol-% 3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten und 13 Mol-% 3-Hydroxyvalerat-Monomereinheiten enthält, und die Schmelztemperatur des Polyesters 134 ºC beträgt.

Vergleichsbeispiel

Zu jeweils 100 ml anorganischer Kulturmedien, die die in Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung aufweisen, werden jeweils 3 g/Liter Natriumpalmitat (Kontrolle), 3 g/Liter Natriumbutyrat (Vergleich) und 1 g/Liter Natriumbutyrat (Vergleich) als Kohlenstoffquellen gegeben. Der pH-Wert eines jeden Gemisches wird auf 7,0 eingestellt. Die entstandenen flüssigen Medien werden getrennt in Sakaguchi-Kolben mit einem Volumen von 500 ml eingebracht und aseptisch mit Alcaligenes lipolytica AK 201 beimpft. Die Zellen in den beimpften flüssigen Medien werden 48 Stunden lang bei 30 ºC gezüchtet, während sie mit 130 Bewegungen pro Minute geschüttelt werden. Nach dem Züchten werden die entstandenen Kulturbrühen einzeln bei 8.000 UPM 15 Minuten lang zentrifugiert. In diesem Stadium wurde gefunden, daß in der unter Verwendung von 3 g/Liter Natriumbutyrat erhaltenen Kulturbrühe keine Zellen von Alcaligenes lipolytica AK 201 gezüchtet werden. Aus den anderen Kulturbrühen werden einzeln Niederschläge erhalten, die mit Wasser gewaschen werden, gefolgt von einem Ernten der Zellen. Danach werden die geernteten Zellen 9 lyophilisiert, wodurch lyophilisierte Zellen erhalten werden. Die in den Zellen angesammelten Polyester werden einzeln aus den lyophilisierten Zellen mit 100 ml heißem Chloroform extrahiert. Nach der Extraktion werden die entstandenen Extraktlösungen einzeln zu etwa 5 ml konzentriert und Hexan wird zugegeben, um eine Ausfällung der Polyester zu bewirken. Die ausgefällten Polyester werden einzeln abfiltriert und getrocknet, wodurch trockene Polyester erhalten werden.
Die Ergebnisse der Biosynthesen der Polyester werden in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
Anmerkung: Die Bedeutungen von 3HB, 3HV, Tm und Mn sind unter Tabelle 5 angegeben.

Referenzbeispiel

Jeder der Stämme Alcaligenes lipolytica AK 201, Alcaligenes eutrophus (ATCC 17699) und Alcaligenes latus (ATCC 29713) werden aseptisch in ein flüssiges Medium geimpft, das sich in einem Sakaguchi-Kolben mit einem Volumen von 500 ml befindet. Das vorstehend erwähnte flüssige Medium wird dadurch erhalten, daß 3 g/Liter Maisöl als eine Kohlenstoffquelle zu 100 ml eines anorganischen Kulturmediums mit der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung gegeben werden. Die Zellen in dem beimpften Flüssigmedium werden bei 30 ºC gezüchtet, während mit 130 Bewegungen pro Minute geschüttelt wird. Die Wachstumsbedingungen der Zellen eines jeden der Stämme werden alle 24 Stunden visuell geprüft, und das Züchten wird 120 Stunden nach dem Start des Züchtens beendet.
Als Ergebnis wird gefunden, daß eine Umwandlung der Kulturbrühe in eine Suspension, was ein Wachstum der Zellen anzeigt, 24 Stunden nach dem Start der Züchtung bezüglich der Kulturbrühe beobachtet wird, in der Alcaligenes lipolytica AK 201 gezüchtet wird. Andererseits wird eine derartige Umwandlung zu einer Suspension bis zum Ende des Züchtens bezüglich sowohl der Kulturbrühe, in der Alcaligenes eutrophus gezüchtet wurde, als auch der Kulturbrühe, in der Alcaligenes latus gezüchtet wurde, nicht beobachtet. Zur Bestätigung wurden die nach dem Züchten gesammelten Zellen einer Zentrifugation unterzogen. Es wurde gefunden, daß eine Zellausfällung bezüglich der Zuchtbrühe stattfindet, in der Alcaligenes lipolytica AK 201 gezüchtet worden ist, wohingegen bezüglich der anderen Kulturbrühen keine Zellausfällungen stattfanden. Das Gewicht der trockenen Zellen von Alcaligenes lipolytica AK 201 beträgt 3,2 g/Liter der Kulturbrühe.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines mikrobischen Polyesters mit D-(-)-3-Hydroxybutyrat-Monomereinheiten, wobei man bei dem Verfahren stufenweise

(1) ein flüssiges Medium mit einem Gehalt an mindestens einer essentiellen Kohlenstoffquelle vorsieht, ausgewählt aus der Gruppe von Fettsäuren mit jeweils 10 bis 22 Kohlenstoffatomen und deren Derivaten;

(2) einen Stamm der Art Alcaligenes lipolytica in dem flüssigen Medium kultiviert und dadurch eine Kulturbrühe mit einem Gehalt an einem mikrobischen Polyester mit D-(-)-3-Hydroxybutyrat- Monomereinheiten erhält; und

(3) den mikrobischen Polyester von der Kulturbrühe isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der mikrobische Polyester ein Homopolymeres eines D-(-)-3-Hydroxybutyrat-Monomeren oder ein Copolymeres eines D-(-)-3-Hydroxybutyrat-Monomeren und eines D-(-)-3-Hydroxyvalerat-Monomeren ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem jede der Fettsäuren 11 bis 18 Kohlenstoffatome aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Anzahl der Kohlenstoffatome jeder Fettsäure ungerade ist und man ein Copolymeres eines D-(-)-3-Hydroxybutyrat-Monomeren und eines D-(-)-3-Hydroxyvalerat-Monomeren herstellt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Anzahl der Kohlenstoffatome jeder Fettsäure gerade ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das flüssige Medium ferner mindestens eine zusätzliche Kohlenstoffquelle aus der Gruppe von Verbindungen der folgenden Formel enthält:

CH&sub3;(CH&sub2;)2n-1X (I)

worin X eine Gruppe der Formel

-C(O)-R worin R eine Hydroxylgruppe, eine Methoxygruppe oder eine Ethoxygruppe bedeutet, oder eine Gruppe der Formel -CH&sub2;-OR' darstellt, worin R' ein Wasserstoffatom, eine Acetylgruppe oder eine Propionylgruppe bedeutet, und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Stamm die Fähigkeit besitzt, von mindestens einem Stoff der Gruppe Gebrauch zu machen, die aus Fettsäuren, Fetten und Ölen mit jeweils mindestens 10 Kohlenstoffatomen besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem es sich bei dem Stamm um den Alcaligenes lipolytica-Stamm FERM BP-3819 (Fermentation Research Institute Accession) handelt.

9. Alcaligenes lipolytica-Stamm FERM BP-3819 (Fermentation Research Institute Accession) mit der Fähigkeit, von mindestens einem Stoff aus der Gruppe von Fettsäuren, Fetten und Ölen mit jeweils mindestens 10 Kohlenstoffatomen Gebrauch zu machen und dadurch einen mikrobischen Polyester mit D-(-)-3-Hydroxybutyrat- Monomereinheiten zu bilden, wobei der Stamm sich sowohl zu einer Nitratreduktion als auch zu einer Denitrifizierungsreaktion negativ verhält.