NL1011431C2 - Werkwijze voor het produceren van polyhydroxyalkanoaat. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het produceren van polyhydroxyalkanoaat

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het produceren van polyhydroxyalkanoaat, waarbij i) in een eerste stap raicro-organismen in een kweek-medium in aanwezigheid van substraat worden vermeerderd; en 5 ii) in een tweede stap de micro-organismen onder toevoer van een zuurstofomvattend gas en substraat polyhydroxyalkanoaat ophopen.

Een dergelijke werkwijze is in het vak algemeen bekend. Zo beschrijft Haase-Aschoff, I. (Stuttg. Ber. Sied-10 lungswasserwirtsch. 91, blz. 232 (1985)) een werkwijze waarbij micro-organismen groeien op afvalwater, onder oplevering van actief slib, waarbij toevoer van een overmaat substraat leidt tot de vorming van polybetahydroxyboterzuur, een bacte-rieel reservelipide.

15 De onderhavige uitvinding heeft tot doel een meer doelmatige werkwijze te verschaffen voor het produceren van polyhydroxyalkanoaat. De werkwijze kan daarbij onder niet-steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Ook wordt beoogd een werkwijze te verschaffen welke gebruik kan maken van een 20 afvalstroom of een substraat van technische zuiverheid onder oplevering van een waardevol polyhydroxyalkanoaat.

Hiertoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat in de eerste stap de micro-organismen onder toevoer van zuurstofomvattend gas aan een selectie 25 worden onderworpen, welke selectie afwisselend een eerste fase omvat waarin substraat wordt toegevoerd en een tweede fase waarin substraat wordt onthouden, waarbij de eerste fase een periode omvat gedurende welke in het kweekmedium een overmaat substraat aanwezig is, en de tweede fase een periode 30 omvat waarin de substraatconcentratie minder is dan 0,20 g substraat betrokken op het koolstofgehalte per liter, waarbij na ten minste twee selectiecycli geselecteerde micro-organismen in de tweede stap worden gebruikt voor het ophopen van polyhydroxyalkanoaat.

35 Actief slib bevat organismen met een lage conversie- *1011431 2 snelheid, aangezien bij waterzuivering wordt beoogt de hoeveelheid slib zo beperkt mogelijk te houden. Verrassenderwij-ze is gevonden dat onder de condities van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, waarbij wordt geselecteerd op 5 organismen met een hoge groeisnelheid, die organismen die naast polyhydroxyalkanoaat ook polyfosfaat of glycogeen als reserve opslaan slecht met de polyhydroxyalkanoaat producerende organismen kunnen concurreren. Aldus kan met de werkwijze volgens de uitvinding een verhoogde opbrengst aan 10 polyhydroxyalkanoaat worden bereikt. Bij voorkeur is de substraatconcentratie tijdens een deel van de tweede fase minder dan 0,1 g/1, met meer voorkeur minder dan 0,03 g/1 en met de meeste voorkeur minder dan 0,01 g/1. Een dergelijke substraatarme fase is eenvoudig te bereiken door het stoppen 15 van de toevoer van substraat na de eerste fase. Binnen het kader van de uitvinding de term 'onthouden' van substraat valt eveneens het toevoeren van substraat in zodanig kleine hoeveelheden dat aan de hiervoor gestelde voorwaarde wordt voldaan. Het substraat is geschikt beschikbaar in een afval-20 stroom, zoals substraatrijk percolaatwater van een afval-stort, of procesvloeistof.

Volgens een geschikte uitvoeringsvorm wordt een deel van de geselecteerde micro-organismen in de tweede stap gebruikt en worden niet-gebruikte micro-organismen in de 25 eerste stap onder de selectie-omstandigheden verder gekweekt.

Aldus wordt, doordat niet telkens van actief slib als bron voor geschikte micro-organismen wordt uitgegaan, de eerdere selectie van geschikte micro-organismen uitgebaat.

Bij voorkeur is het substraat in de tweede stap een 30 vetzuren-houdende stroom.

Vetzuren zijn zeer geschikte uitgangsmaterialen voor de vorming van polyhydroxyalkanoaat.

Volgens een voorkeursuitvoering is het substraat in de eerste stap eveneens een vetzuren-houdende stroom.

35 In een dergelijk geval is het metabolisme van de in de tweede stap te gebruiken micro-organismen reeds optimaal voor de vorming van polyhydroxyalkanoaat.

Volgens een gunstige uitvoeringsvorm wordt de vetzuren-houdende stroom verkregen door het onder gecontroleerde «*1011431 3 omstandigheden fermenteren van een koolhydraat substraat.

Dit verruimt de mogelijkheden om de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding toe te passen. Het koolhydraat is geschikt van technische kwaliteit, of kan beschikbaar zijn 5 in de vorm van proceswater afkomstig van bijvoorbeeld de suikerindustrie.

Met voordeel wordt de eerste stap in een eerste reactor en de tweede stap in een tweede reactor uitgevoerd.

Een dergelijke opzet vereenvoudigt de processturing. 10 Volgens een voorkeursuitvoering wordt de tweede stap uitgevoerd onder 1imitatie van ten minste een element gekozen uit N, P, en S.

Door een dergelijke 1imitatie wordt de groei van de organismen in de tweede stap beperkt en wordt de opbrengst 15 aan polyhydroxyalkanoaat verder verhoogd.

De onderhavige uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van een uitvoeringsvoorbeeld en onder verwijzing naar de tekening waarin fig. 1 een grafische weergave is van twee substraatconcentraties, de ammoniumcon-20 centratie en de gevormde biomassa tijdens een selectiecyclus van 6 uur; fig. 2 een grafische weergave is van de concentratie polyhydroxybutyraat en polyhydroxyvaleraat tijdens een selec-tiecyclus; 25 fig. 3 de concentratie en het gehalte aan polyhy droxybutyraat weergeven in een ophopingsreactor; en fig. 4 een elektronen microscopische foto voorstelt van een selectiereactor geselecteerde bacteriën met daarin PHB-granules.

30 VOORBEELD

Een selectiereactor met een volume van 2 liter werd continu gemengd en belucht met 2,28 1/min. perslucht. Medium in de selectiereactor werd middels een thermostaatbad op 34°C gehouden. De pH van het medium werd met behulp van een kali-35 umhydroxide-oplossing op 7,0 gehouden.

De selectiereactor werd cyclisch bedreven waarbij de duur van 1 cyclus 6 uur bedroeg. Iedere cyclus startte met een bacteriën-houdend volume van 1 liter. Hieraan werd in 2 minuten 0,9 1 mineraal medium toegevoegd (1,4 g/1 ammonium- »1011431 4 chloride, 0,2 g/1 magnesiumsulfaat en 5 ral/1 van een standaard sporenelementenoplossing). Verder werd tijdens het eerste uur van de cyclus 100 ml geconcentreerde vetzuuroplos-sing toegevoegd (160 g/1 acetaat; 12,4 g/1 propionaat). Op 5 t=4 uur werd 6,4 g kaliumdiwaterstoffosfaat aan het systeem toegevoerd. Op t=5u45 werd 1 liter van de bacteriesuspensie in 15 minuten afgevoerd naar een ophopingsreactor. Aldus blijft l liter van bacteriehoudend medium over waarmee de volgende selectiecyclus wordt gestart. Bij aanvang werd het 10 medium geënt met actief slib. Het gehele bedrijf vindt niet-steriel plaats, dat wil zeggen dat medium en perslucht niet werden gesteriliseerd. Een dergelijke open microbiële kweek betekent een grote kosten besparing in vergelijking met andere, voor het beschermen van rein-cultures, steriel uitge-15 voerde productieprocessen. Er wordt zowel bespaard op investeringskosten (sterilisatie-apparatuur) als variable kosten (energie).

Door de selectiereactor volgens de werkwijze volgens de uitvinding te bedrijven wordt een bacteriecultuur verkre-20 gen die in staat is snel veel vetzuren op te nemen en om te zetten in een copolymeer van β-hydroxybutyraat en β-hydroxy-valeraat. Na verloop van een aantal cycli (na opstarten met actief slib ca. 10 cycli) stelt zich een "steady state" in waarbij iedere cyclus in wezen identiek is aan de voorgaande. 25 Een dergelijke cyclus is in fig. 1 weergegeven. Hierbij is te zien dat gedurende de eerste 1,5 uur de concentratie biomassa toeneemt, en daarna nagenoeg constant blijft.

De in de selectiereactor verkregen bacteriesuspensie wordt, zoals hierboven beschreven, aan het eind van de cyclus 30 naar een ophopingsreactor gevoerd. Deze reactor werd bij dezelfde pH en temperatuur bedreven als de selectiereactor, en evenzo continu belucht en gemengd. Na toevoer van de bacteriesuspensie werden ammonium, magnesiumsulfaat en sporenelementen gedoseerd tot een gehalte en in een hoeveelheid 35 (0,9 1) als aan het begin van de cyclus in de selectiereac tor. Daarna werd gedurende 12 uur acetaat aan de ophopingsreactor toegevoerd. Het acetaat werd deels gebruikt voor groei, maar voornamelijk gebruikt voor de vorming van poly-0-hy-droxybutyraat. Het verloop van de concentratie in het gehalte *1011431 5 aan PHB in de ophopingsreactor is weergegeven in fig. 3. Fig. 4 geeft een elektronenmicroscopische afbeelding van de verkregen bacteriën met daarin zichtbaar de PHB-granules.

p1 0 11 4 31

Claims (7)

1. Werkwijze voor het produceren van polyhydroxyal-kanoaat, waarbij i) in een eerste stap micro-organismen in een kweek-medium in aanwezigheid van substraat worden vermeerderd; en 5 ii) in een tweede stap de micro-organismen onder toevoer van een zuurstofomvattend gas en substraat polyhy-droxyalkanoaat ophopen, met het kenmerk, dat in de eerste stap de micro-organismen onder toevoer van zuurstofomvattend gas aan een selectie worden onderworpen, welke selectie 10 afwisselend een eerste fase omvat waarin substraat wordt toegevoerd en een tweede fase waarin substraat wordt onthouden, waarbij de eerste fase een periode omvat gedurende welke in het kweekmedium een overmaat substraat aanwezig is, en de tweede fase een periode omvat waarin de substraatconcentratie 15 minder is dan 0,20 g substraat betrokken op het koolstofgehalte per liter, waarbij na ten minste twee selectiecycli geselecteerde micro-organismen in de tweede stap worden gebruikt voor het ophopen van polyhydroxyalkanoaat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 20 dat een deel van de geselecteerde micro-organismen in de tweede stap wordt gebruikt en niet-gebruikte micro-organismen in de eerste stap onder de selectie-omstandigheden verder worden gekweekt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het 25 kenmerk, dat het substraat in de tweede stap een vetzuren-houdende stroom is.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het substraat in de eerste stap een vetzuren-houdende stroom is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de vetzuren-houdende stroom wordt verkregen door het onder gecontroleerde omstandigheden fermenteren van een koolhydraat substraat.

6. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, »•1011431 met het kenmerk, dat de eerste stap in een eerste reactor en de tweede stap in een tweede reactor wordt uitgevoerd.

7. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de tweede stap wordt uitgevoerd onder 5 limitatie van ten minste een element gekozen uit N, P, en S. pi 0 11 4 3 1