NL1011431C2

NL1011431C2 - Process for producing polyhydroxyalkanoate.

Info

Publication number: NL1011431C2
Application number: NL1011431A
Authority: NL
Inventors: Marinus Cornelis Ma Loosdrecht
Original assignee: Univ Delft Tech
Priority date: 1999-03-03
Filing date: 1999-03-03
Publication date: 2000-09-05
Also published as: AU2949800A; WO2000052189A1

Description

Werkwijze voor het produceren van polyhydroxyalkanoaatProcess for producing polyhydroxyalkanoate

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het produceren van polyhydroxyalkanoaat, waarbij i) in een eerste stap raicro-organismen in een kweek-medium in aanwezigheid van substraat worden vermeerderd; en 5 ii) in een tweede stap de micro-organismen onder toevoer van een zuurstofomvattend gas en substraat polyhydroxyalkanoaat ophopen.The present invention relates to a process for producing polyhydroxyalkanoate, wherein i) in a first step, propagate microorganisms in a culture medium in the presence of substrate; and ii) in a second step, the microorganisms accumulate polyhydroxyalkanoate while supplying an oxygen-containing gas and substrate.

Een dergelijke werkwijze is in het vak algemeen bekend. Zo beschrijft Haase-Aschoff, I. (Stuttg. Ber. Sied-10 lungswasserwirtsch. 91, blz. 232 (1985)) een werkwijze waarbij micro-organismen groeien op afvalwater, onder oplevering van actief slib, waarbij toevoer van een overmaat substraat leidt tot de vorming van polybetahydroxyboterzuur, een bacte-rieel reservelipide.Such a method is generally known in the art. For example, Haase-Aschoff, I. (Stuttg. Ber. Sied-10 lungswasserwirtsch. 91, p. 232 (1985)) describes a method in which microorganisms grow on waste water, yielding activated sludge, whereby supply of an excess of substrate results to form polybetahydroxybutyric acid, a bacterial reserve lipid.

15 De onderhavige uitvinding heeft tot doel een meer doelmatige werkwijze te verschaffen voor het produceren van polyhydroxyalkanoaat. De werkwijze kan daarbij onder niet-steriele omstandigheden worden uitgevoerd. Ook wordt beoogd een werkwijze te verschaffen welke gebruik kan maken van een 20 afvalstroom of een substraat van technische zuiverheid onder oplevering van een waardevol polyhydroxyalkanoaat.The present invention aims to provide a more efficient method for producing polyhydroxyalkanoate. The process can be carried out under non-sterile conditions. It is also contemplated to provide a method which can utilize a waste stream or a substrate of technical purity to yield a valuable polyhydroxyalkanoate.

Hiertoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat in de eerste stap de micro-organismen onder toevoer van zuurstofomvattend gas aan een selectie 25 worden onderworpen, welke selectie afwisselend een eerste fase omvat waarin substraat wordt toegevoerd en een tweede fase waarin substraat wordt onthouden, waarbij de eerste fase een periode omvat gedurende welke in het kweekmedium een overmaat substraat aanwezig is, en de tweede fase een periode 30 omvat waarin de substraatconcentratie minder is dan 0,20 g substraat betrokken op het koolstofgehalte per liter, waarbij na ten minste twee selectiecycli geselecteerde micro-organismen in de tweede stap worden gebruikt voor het ophopen van polyhydroxyalkanoaat.To this end, the method according to the invention is characterized in that in the first step the microorganisms are subjected to a selection under the supply of oxygen-containing gas, which selection alternately comprises a first phase in which substrate is supplied and a second phase in which substrate is withheld. the first phase comprises a period during which an excess of substrate is present in the culture medium, and the second phase comprises a period in which the substrate concentration is less than 0.20 g substrate based on the carbon content per liter, whereby after at least two selection cycles microorganisms in the second step are used for the accumulation of polyhydroxyalkanoate.

35 Actief slib bevat organismen met een lage conversie- *1011431 2 snelheid, aangezien bij waterzuivering wordt beoogt de hoeveelheid slib zo beperkt mogelijk te houden. Verrassenderwij-ze is gevonden dat onder de condities van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, waarbij wordt geselecteerd op 5 organismen met een hoge groeisnelheid, die organismen die naast polyhydroxyalkanoaat ook polyfosfaat of glycogeen als reserve opslaan slecht met de polyhydroxyalkanoaat producerende organismen kunnen concurreren. Aldus kan met de werkwijze volgens de uitvinding een verhoogde opbrengst aan 10 polyhydroxyalkanoaat worden bereikt. Bij voorkeur is de substraatconcentratie tijdens een deel van de tweede fase minder dan 0,1 g/1, met meer voorkeur minder dan 0,03 g/1 en met de meeste voorkeur minder dan 0,01 g/1. Een dergelijke substraatarme fase is eenvoudig te bereiken door het stoppen 15 van de toevoer van substraat na de eerste fase. Binnen het kader van de uitvinding de term 'onthouden' van substraat valt eveneens het toevoeren van substraat in zodanig kleine hoeveelheden dat aan de hiervoor gestelde voorwaarde wordt voldaan. Het substraat is geschikt beschikbaar in een afval-20 stroom, zoals substraatrijk percolaatwater van een afval-stort, of procesvloeistof.Activated sludge contains organisms with a low conversion rate * 1011431 2, since water purification aims to keep the amount of sludge as limited as possible. Surprisingly, it has been found that under the conditions of the method of the present invention, selecting for high growth rate organisms, those organisms which store in addition to polyhydroxyalkanoate also polyphosphate or glycogen in reserve can compete poorly with the polyhydroxyalkanoate producing organisms. Thus, an increased yield of polyhydroxyalkanoate can be achieved with the process according to the invention. Preferably, the substrate concentration during part of the second phase is less than 0.1 g / l, more preferably less than 0.03 g / l, and most preferably less than 0.01 g / l. Such a low-substrate phase is easily achieved by stopping the supply of substrate after the first phase. Within the scope of the invention the term "depriving" of substrate also includes supplying substrate in such small amounts that the above condition is met. The substrate is conveniently available in a waste stream, such as substrate-rich leachate water from a waste landfill, or process liquid.

Volgens een geschikte uitvoeringsvorm wordt een deel van de geselecteerde micro-organismen in de tweede stap gebruikt en worden niet-gebruikte micro-organismen in de 25 eerste stap onder de selectie-omstandigheden verder gekweekt.According to a suitable embodiment, a part of the selected microorganisms are used in the second step and unused microorganisms in the first step are further cultivated under the selection conditions.

Aldus wordt, doordat niet telkens van actief slib als bron voor geschikte micro-organismen wordt uitgegaan, de eerdere selectie van geschikte micro-organismen uitgebaat.Thus, because active sludge is not always used as a source of suitable microorganisms, the earlier selection of suitable microorganisms is exploited.

Bij voorkeur is het substraat in de tweede stap een 30 vetzuren-houdende stroom.Preferably, the substrate in the second step is a fatty acid-containing stream.

Vetzuren zijn zeer geschikte uitgangsmaterialen voor de vorming van polyhydroxyalkanoaat.Fatty acids are very suitable starting materials for the formation of polyhydroxyalkanoate.

Volgens een voorkeursuitvoering is het substraat in de eerste stap eveneens een vetzuren-houdende stroom.According to a preferred embodiment, the substrate in the first step is also a fatty acid-containing stream.

35 In een dergelijk geval is het metabolisme van de in de tweede stap te gebruiken micro-organismen reeds optimaal voor de vorming van polyhydroxyalkanoaat.In such a case, the metabolism of the microorganisms to be used in the second step is already optimal for the formation of polyhydroxyalkanoate.

Volgens een gunstige uitvoeringsvorm wordt de vetzuren-houdende stroom verkregen door het onder gecontroleerde «*1011431 3 omstandigheden fermenteren van een koolhydraat substraat.According to a favorable embodiment, the fatty acid-containing stream is obtained by fermenting a carbohydrate substrate under controlled conditions.

Dit verruimt de mogelijkheden om de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding toe te passen. Het koolhydraat is geschikt van technische kwaliteit, of kan beschikbaar zijn 5 in de vorm van proceswater afkomstig van bijvoorbeeld de suikerindustrie.This broadens the possibilities of applying the method according to the present invention. The carbohydrate is suitably of technical quality, or it may be available in the form of process water from, for example, the sugar industry.

Met voordeel wordt de eerste stap in een eerste reactor en de tweede stap in een tweede reactor uitgevoerd.The first step is advantageously carried out in a first reactor and the second step in a second reactor.

Een dergelijke opzet vereenvoudigt de processturing. 10 Volgens een voorkeursuitvoering wordt de tweede stap uitgevoerd onder 1imitatie van ten minste een element gekozen uit N, P, en S.Such an arrangement simplifies process control. According to a preferred embodiment, the second step is performed imitating at least one element selected from N, P, and S.

Door een dergelijke 1imitatie wordt de groei van de organismen in de tweede stap beperkt en wordt de opbrengst 15 aan polyhydroxyalkanoaat verder verhoogd.Such an imitation limits the growth of the organisms in the second step and further increases the yield of polyhydroxyalkanoate.

De onderhavige uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van een uitvoeringsvoorbeeld en onder verwijzing naar de tekening waarin fig. 1 een grafische weergave is van twee substraatconcentraties, de ammoniumcon-20 centratie en de gevormde biomassa tijdens een selectiecyclus van 6 uur; fig. 2 een grafische weergave is van de concentratie polyhydroxybutyraat en polyhydroxyvaleraat tijdens een selec-tiecyclus; 25 fig. 3 de concentratie en het gehalte aan polyhy droxybutyraat weergeven in een ophopingsreactor; en fig. 4 een elektronen microscopische foto voorstelt van een selectiereactor geselecteerde bacteriën met daarin PHB-granules.The present invention will now be elucidated on the basis of an exemplary embodiment and with reference to the drawing in which Figure 1 is a graphical representation of two substrate concentrations, the ammonium concentration and the biomass formed during a selection cycle of 6 hours; Figure 2 is a graphical representation of the concentration of polyhydroxybutyrate and polyhydroxyvalerate during a selection cycle; Fig. 3 shows the concentration and the content of polyhydroxybutyrate in an accumulation reactor; and Figure 4 represents an electron microscopic photograph of a selection reactor of selected bacteria containing PHB granules.

30 VOORBEELD30 EXAMPLE

Een selectiereactor met een volume van 2 liter werd continu gemengd en belucht met 2,28 1/min. perslucht. Medium in de selectiereactor werd middels een thermostaatbad op 34°C gehouden. De pH van het medium werd met behulp van een kali-35 umhydroxide-oplossing op 7,0 gehouden.A 2 liter volume selection reactor was continuously mixed and aerated at 2.28 L / min. compressed air. Medium in the selection reactor was kept at 34 ° C by a thermostat bath. The pH of the medium was kept at 7.0 using a potassium 35 µm hydroxide solution.

De selectiereactor werd cyclisch bedreven waarbij de duur van 1 cyclus 6 uur bedroeg. Iedere cyclus startte met een bacteriën-houdend volume van 1 liter. Hieraan werd in 2 minuten 0,9 1 mineraal medium toegevoegd (1,4 g/1 ammonium- »1011431 4 chloride, 0,2 g/1 magnesiumsulfaat en 5 ral/1 van een standaard sporenelementenoplossing). Verder werd tijdens het eerste uur van de cyclus 100 ml geconcentreerde vetzuuroplos-sing toegevoegd (160 g/1 acetaat; 12,4 g/1 propionaat). Op 5 t=4 uur werd 6,4 g kaliumdiwaterstoffosfaat aan het systeem toegevoerd. Op t=5u45 werd 1 liter van de bacteriesuspensie in 15 minuten afgevoerd naar een ophopingsreactor. Aldus blijft l liter van bacteriehoudend medium over waarmee de volgende selectiecyclus wordt gestart. Bij aanvang werd het 10 medium geënt met actief slib. Het gehele bedrijf vindt niet-steriel plaats, dat wil zeggen dat medium en perslucht niet werden gesteriliseerd. Een dergelijke open microbiële kweek betekent een grote kosten besparing in vergelijking met andere, voor het beschermen van rein-cultures, steriel uitge-15 voerde productieprocessen. Er wordt zowel bespaard op investeringskosten (sterilisatie-apparatuur) als variable kosten (energie).The selection reactor was operated cyclically, the duration of 1 cycle being 6 hours. Each cycle started with a bacteria-containing volume of 1 liter. To this was added 0.9 l of mineral medium (1.4 g / l ammonium chloride, 0.2 g / l magnesium sulfate and 5 ral / l of a standard trace element solution) over 2 minutes. In addition, 100 ml of concentrated fatty acid solution (160 g / l acetate; 12.4 g / l propionate) was added during the first hour of the cycle. At 5 t = 4 hours, 6.4 g of potassium dihydrogen phosphate was added to the system. At t = 5u45, 1 liter of the bacterial suspension was drained over 15 minutes to an accumulation reactor. Thus, 1 liter of bacterial medium remains, with which the next selection cycle is started. At the beginning, the medium was inoculated with activated sludge. The entire operation takes place non-sterile, ie medium and compressed air were not sterilized. Such an open microbial culture means a great cost saving compared to other production processes for sterile clean cultures to be protected. Both investment costs (sterilization equipment) and variable costs (energy) are saved.

Door de selectiereactor volgens de werkwijze volgens de uitvinding te bedrijven wordt een bacteriecultuur verkre-20 gen die in staat is snel veel vetzuren op te nemen en om te zetten in een copolymeer van β-hydroxybutyraat en β-hydroxy-valeraat. Na verloop van een aantal cycli (na opstarten met actief slib ca. 10 cycli) stelt zich een "steady state" in waarbij iedere cyclus in wezen identiek is aan de voorgaande. 25 Een dergelijke cyclus is in fig. 1 weergegeven. Hierbij is te zien dat gedurende de eerste 1,5 uur de concentratie biomassa toeneemt, en daarna nagenoeg constant blijft.By operating the selection reactor according to the method according to the invention, a bacterial culture is obtained which is capable of rapidly absorbing many fatty acids and converting them into a copolymer of β-hydroxybutyrate and β-hydroxy valerate. After a number of cycles (after starting up with activated sludge about 10 cycles) a "steady state" sets in which each cycle is essentially identical to the previous one. Such a cycle is shown in Fig. 1. It can be seen that during the first 1.5 hours the concentration of biomass increases and then remains almost constant.

De in de selectiereactor verkregen bacteriesuspensie wordt, zoals hierboven beschreven, aan het eind van de cyclus 30 naar een ophopingsreactor gevoerd. Deze reactor werd bij dezelfde pH en temperatuur bedreven als de selectiereactor, en evenzo continu belucht en gemengd. Na toevoer van de bacteriesuspensie werden ammonium, magnesiumsulfaat en sporenelementen gedoseerd tot een gehalte en in een hoeveelheid 35 (0,9 1) als aan het begin van de cyclus in de selectiereac tor. Daarna werd gedurende 12 uur acetaat aan de ophopingsreactor toegevoerd. Het acetaat werd deels gebruikt voor groei, maar voornamelijk gebruikt voor de vorming van poly-0-hy-droxybutyraat. Het verloop van de concentratie in het gehalte *1011431 5 aan PHB in de ophopingsreactor is weergegeven in fig. 3. Fig. 4 geeft een elektronenmicroscopische afbeelding van de verkregen bacteriën met daarin zichtbaar de PHB-granules.The bacterial suspension obtained in the selection reactor is fed to an accumulation reactor, as described above, at the end of cycle 30. This reactor was operated at the same pH and temperature as the selection reactor, and likewise continuously aerated and mixed. After addition of the bacterial suspension, ammonium, magnesium sulfate and trace elements were dosed to a content and in an amount of 35 (0.9 L) as at the beginning of the cycle in the selection reactor. Acetate was then added to the accumulation reactor for 12 hours. The acetate was used partly for growth, but mainly used for the formation of poly-0-hydroxybutyrate. The variation of the concentration in the content of * 1011431 5 of PHB in the accumulation reactor is shown in FIG. 3. FIG. 4 gives an electron microscopic image of the bacteria obtained, with the PHB granules visible therein.

p1 0 11 4 31p1 0 11 4 31

Claims

A method for producing polyhydroxyal canoate, wherein i) in a first step, microorganisms in a culture medium are propagated in the presence of substrate; and ii) in a second step, the microorganisms accumulate polyhydroxyalkanoate under the supply of an oxygen-containing gas and substrate, characterized in that in the first step the microorganisms are subjected to a selection under the supply of oxygen-containing gas. selection 10 alternately comprises a first phase in which substrate is supplied and a second phase in which substrate is withheld, the first phase comprising a period during which an excess of substrate is present in the culture medium, and the second phase comprising a period in which the substrate concentration is less is then 0.20 g of substrate based on the carbon content per liter, wherein after at least two selection cycles, selected microorganisms are used in the second step for the accumulation of polyhydroxyalkanoate.

2. Method according to claim 1, characterized in that a part of the selected microorganisms is used in the second step and unused microorganisms in the first step are further cultivated under the selection conditions.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the substrate in the second step is a fatty acid-containing stream.

Method according to claim 3, characterized in that the substrate in the first step is a stream containing fatty acids.

Process according to claim 4, characterized in that the fatty acid-containing stream is obtained by fermenting a carbohydrate substrate under controlled conditions.

6. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the first step is carried out in a first reactor and the second step in a second reactor.

A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the second step is carried out with limitation of at least one element selected from N, P, and S. pi 0 11 4 3 1