JPS63226291A - 酵素によるポリエステルの製造方法，光学活性カルボン酸およびエステルの製造方法，およびポリエステルを含む製品 - Google Patents

酵素によるポリエステルの製造方法，光学活性カルボン酸およびエステルの製造方法，およびポリエステルを含む製品

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JPS63226291A
JPS63226291A JP62305516A JP30551687A JPS63226291A JP S63226291 A JPS63226291 A JP S63226291A JP 62305516 A JP62305516 A JP 62305516A JP 30551687 A JP30551687 A JP 30551687A JP S63226291 A JPS63226291 A JP S63226291A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、栄養源制限下における微生物の好気的培養に
よるポリエステルの製造方法に関する。
（従来の技術） このタイプの方法はヨーロッパ特許公開公報第００１５
６６９号に開示されている。そこでは、Ｐ貼と呼ばれる
ポリ（３−ヒドロキシ醋酸）の調製が述べられている。
この調製は、あるメチロバクテリウムオルカノフィラム
（助ぷ犯■徂は町力担　肛計吠−画旦堕し株の栄養源制
限、特に窒素および／またはリンの制限下における好気
培養による。使用し得る炭素源は、安価なメタノールで
ある。他の微生物もまたＰＨＢの製造を目的として提案
されている。それには例えば、ヨーロッパ特許公開公報
第００４６３４４号に開示されているアルカリゲネス（
＾１ｃａｌｉ−＝脛匝ｓ　）種および八ｐｐ１．　Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　２３（１
９８６）　３２２−３２９に記述のあるシュードモナス
μ迫里Ｌｄｏｍｏｎａｓ）株がある。
微生物学的手段により生産されるＰ貼は、生分解性であ
り２式−ＣＯ−ＣＨｇ−Ｃｌｌ（Ｃ１１３）−０−を有
する単位から構成される光学活性のポリエステルである
。
このバイオポリマーは非常に興味深い性質を有しており
、そして、多くの用途に用いられ得る。このポリマーは
他の熱可塑性プラスチングと同様に型に入れ成型でき、
無機充填剤で補強でき、繊維に紡ぐことができ、そして
良好な気体遮断特性を有するフィルムの調製に使用でき
る。この生分解性のＰＩＩＢは、非生分解性のポリマー
とともに混合ポリマー形に変換できる。具体的な利用に
は、　ＰＩＩＢによる外科用糸および人工皮膚または人
工骨の調製がある。また、光学活性ＰＩＩＢは、光学活
性モノマーに変換され得（それは化学的手段によっては
光学的に純粋な形には容易に製造することができない）
、有機化学的変換２例えば薬剤の合成、の適当な出発材
料となる。
しかし、　Ｐ貼の欠点は、このポリマーの化学構造の変
更が容易ではないということである。この欠点は、米国
特許第４，４７７．６５４号によれば、アルカリゲネス
種の好気培養を、少なくとも一部においては、カルボン
酸（例えばプロピオン酸）、またはアルカリ金属塩また
はその低級アルキルエステルの存在下で１行うことによ
り回避できる。このようにして形成されたバイオポリマ
ーは、構造式−Ｃｏ−ＣＩ□−ＣＩｌ　（Ｃｌｌ：＋）
−０−を有する３−ヒドロキシ醋酸エステル残基と、構
造式−ＧＯ−ＣＩｌｇ−（Ｊｌ（Ｃｚｌｌｓ）−０−を
有する残基のような他のヒドロキシ酸残基（５０モル％
を下回る）から形成される。しかし、この既知の方法に
おいても、変更の可能性は極めて制限されている。
（発明の構成） 本発明者が属している研究グループは、シュードモナス
　オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏ印几特ｏ１ｅｏｖｏｒ
ａｎｓ）種の微生物の研究を行っている。種々のシュー
ドモナス種は炭素源として直鎖または芳香族炭化水素を
用いることにより生育でき、資化は酸素付加で始まる。
この酸素付加はオキシゲナーゼにより触媒され、その遺
伝情報は大部分プラスミドに関係している。そのプラス
ミドとは、既知のＯＣＴ、　ＣＡＭ。
ＴＯＬ、　ＸＹＩｌ、　Ｓ’ＡＬ、およびＮ＾１■プラ
スミドであり、それぞれ６〜１２個の炭素原子を含むｎ
−アルカン；カンファー；トルエン、ｍ−キシレンおよ
びｐ−キシレン；サリチル酸塩；およびナフタレンの分
解の第１段階を行うことができる。モノオキシゲナーゼ
ω−ヒドロキシラーゼをコードするＯＣＴプラスミドを
含むシュードモナス　オレオボランス株は、６〜１２個
の炭素原子を含むｎ−アルカンで生育し得る。なぜなら
、末端のメチル基はヒドロキシメチル基に変換され、そ
の後、そのアルデヒドおよびそのカルボン酸を経て変換
され、正常な代謝に適合する産物を生じる。これらの株
はまた。
■−オクテンおよび１．７−オクタジエンのような種々
の不飽和炭化水素に生育できることが見出されており、
その第１の段階は、しばしば１．２−エポキサイドの形
成である。
Ｄｅ　Ｓｍｅｔ　らがＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５
４　（１９８３）　８７０−８７８で述べているように
、シュードモナス　オレオボラｙスＴＦ４−ＩＬ（ＡＴ
ＣＣ２９３４７）（７）、　２０〜５０％（Ｖ／Ｖ）　
（７）ｎ−オクタンを含む栄養培地での培養において。
細胞中には封入体が存在した。この封入体は１例えばバ
チルス　セレウス（Ｂ　ａ　ｃ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｕ　ｓ　
　印匹叩）　（７）既知のポリ−β−ヒドロキシ醋酸エ
ステル封入体に似た封入体である。さらに、これらの封
入体は少なくとも一部は構造式−Ｃｏ−ＣＨ２−ＣＩｌ
（Ｃ５ＩＩ＋　＋）−０−を有するβ−ヒドロキシオク
タン酸エステルの単位から構成されるポリマー物質を含
んでいることが示された。
広範囲のポリエステル型のバイオポリマーがシュードモ
ナス　オレオボランス細菌の好気培養で製造され得るこ
とが、現在では見出されている。
そして、これが本発明の本質である。この方法において
は、このバイオポリマーの化学構造または組成が基質を
選ぶことにより容易に制御され得る。
本発明においては、側鎖の長さが調節され得、そして、
所望の位置に末端二重結合を有するポリエステル型バイ
オポリマーの生産が可能となる。
本発明方法は、シュードモナス　オレオボランス細菌を
、過剰の炭素源と生育に必須の他の栄養源の少なくとも
１種の制限量とを含有する栄養培地で、好気条件下にて
培養することを特徴とする。
上記炭素源は、少なくとも１種の資化可能な非環式脂肪
族炭化水素化合物を含み、そして必要に応じて形成され
たバイオポリマーを細胞から回収する。
飽和側鎖を含むバイオポリマーのみを生ずる本発明の方
法は、構造式（１）を有する単位から構成されるポリエ
ステルの生産によって特徴づけられる。
０　　　　（ＣＩｌｚ）　−Ｃｔｌ＋ −ＣＣ１（ｚ　　Ｃｌｌ　　Ｏ，（１）（ここで１ｍは
２〜８の整数である。）この生産は、６〜１２個の炭素
原子を含む１種またはそれ以上のパラフィン、またはパ
ラフィン酸化物を含む炭素源を用いて行われる。ここで
使用される“パラフィン酸化物°゛という用語は５アル
カノール、アルカナール、およびアルカン酸を意味し、
それらはパラフィン分解の中間体として生じる。これら
他の基質は、シュードモナス　オレオボランス株をＯＣ
Ｔプラスミドが存在しない状態で。
そして少なくとも活性パラフィンヒドロキシラーゼが存
在しない状態で用いられる場合に、特に好適である。パ
ラフィン酸化物の炭素原子数は、あるいは、６〜１２個
の範囲を外れる範囲（例えば４個または１４個の炭素原
子）であり得る。なぜなら。
パラフィンの６〜１２個という炭素原子の制限は。
パラフィン−ヒドロキシラーゼ系の制限に関係するため
である。
パラフィン（またはパラフィン酸化物）は、好ましくは
、側鎖のない化合物であるが、側鎖のある化合物も同様
に用いられ得、ポリマーになり得る。
飽和および不飽和側鎖の両方を含むポリマーを生産する
本発明の方法は、構造式（１）を有する単位と構造式（
２）を有する単位とで構成されるポリエステルの生産に
よって特徴づけられる。
（Ｃｌｌ２）ｌＩＣ１１３ ＋１　　　１ −Ｃ−Ｃ１ｌｚ　　Ｃｌｌ　　Ｏ（１）０　　　　（Ｃ
１１２）−−ＩＣＩＩ＝ＣＨ２−Ｃ−ＣＨ２ＣＨＯ（２
） （ここで１ｍは２〜８の整数である。）この生産は、６
〜１２個の炭素原子を含み１側鎖を持たない１種または
それ以上の１−アルケン、および必要に応じて６〜１２
個の炭素原子を含み、側鎖を持たない１種またはそれ以
上のパラフィンまたはパラフィン酸化物を含む炭素源を
用いて行われる。１−アルケンを唯一の炭素源として用
いる場合においても、生成するバイオポリマーの側鎖の
一部は飽和している。しかし、飽和および不飽和側鎖の
比率は、基質の混合物（例えばオクタンおよびオクテン
）を用いることにより変化させ得る。
本発明のこの変法は、特に利点を有している。
末端の二重結合のために、得られるバイオポリマーは側
鎖の割合を制御して化学的に容易に修飾または他のポリ
マー鎖と架橋し得る。
本発明の好適な実施態様は、６個の炭素原子を有する１
種またはそれ以上の基質を用いて、側鎖が３個の原子を
有する（ｍ＝２）ポリエステルを生産することにより特
徴づけられる。ヘキセン。
またはヘキセンおよびヘキサンを含む基質を用いる場合
には、バイオポリマーの側鎖の一部は末端二重結合を含
む。
本発明の他の好適な実施態様は、７個の炭素原子を有す
る１種またはそれ以上の基質を用い、側鎖が４個の炭素
原子を有する（ｍ＝３）ポリエステルを調製することに
より特徴づけられる。側鎖の一部に末端二重結合を有す
るポリエステルは。
用いられる基質がヘプテン、またはヘプテンおよびヘプ
タンである場合に得られる。
上記の好適な実施態様は両者とも２本質的に。
全ての側鎖が同数の炭素原子を有するポリエステ　・ル
の生産である。以下に述べる好適な実施態様は。
そのような例ではない。
本発明のそのような好適な実施態様は、６個の炭素原子
を有する１種またはそれ以上の基質と７個の炭素原子を
有する１種またはそれ以上の基質を用い、側鎖が３個お
よび４個の炭素原子を有する（ｍ−２および３）共重合
ポリエステルの生産により特徴づけられる。これらおよ
び全ての他の実施態様において、基質の選択およびその
お互いの比率の両者において多くの変更が可能であり。
そして、これらの変更は、バイオポリマーにおける種々
の側鎖の比率を事実上無限に変えることができる。従っ
てこの実施態様においては１次の組合せが用いられ得る
：ヘキサンおよびヘプタン；ヘキセンおよびヘフ゛テン
；へ４−サンおよびヘプタン；ヘキセンおよびヘプタン
；ヘキサン、ヘキセンおよびヘプタン；ヘキサン、ヘキ
センおよびヘプテン；ヘキサン、ヘプタンおよびヘプテ
ン；ヘキセン、ヘプタンおよびヘプテン；そしてヘキサ
ン、ヘキセン、ヘプタンおよびヘプテン。そして。
これらの組合せのそれぞれにおいて、数種の基質間の比
率は所望の値に選択することができる。
他の実施態様は、８個の炭素原子を有する１種またはそ
れ以上の基質、そして、必要に応じて６個の炭素原子を
有する１種またはそれ以上の基質と組合せて用いて、側
鎖が３個および５個の炭素原子を有する（ｍ−２および
４）共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけ
られる。好適な基質は１−オクテンであり、必要に応じ
てオクタン、ヘキサンおよび／またはヘキセンが組合せ
て用いられる。
次に、好適な実施態様は、７個の炭素原子を有する１種
またはそれ以上の基質と８個の炭素原子を有する１種ま
たはそれ以上の基質を、必要に応じて６個の炭素原子を
有する１種またはそれ以上の基質と組合せて用い、側鎖
が３個、４個および５個の炭素原子を有する（ｍ＝２．
３．および４）共重合ポリエステルを生産することによ
り特徴づけられる。
さらに好適な実施態様は、９個の炭素原子を有する１種
またはそれ以」−の基質を、必要に応じて７個の炭素原
子を有する１種またはそれ以上の基質と組合せて用い、
側鎖が４個および６個の炭素原子を有する（ｍ−３およ
び５）共重合ポリエステルを生産することにより特徴づ
けられる。
さらに他の好適な実施態様は、８個の炭素原子を有する
１種またはそれ以上の基質と９個の炭素原子を有する１
種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて、６個およ
び／または７個の炭素原子を有する１種またはそれ以上
の基質と組合せて用い、側鎖が３個、４個、５個および
６個の炭素原子を有する（ｍ＝２．３．４および５）共
重合ポリエステルを生産することにより特徴づけられる
。
次の好適な実施態様は、　１０個の炭素原子を有する１
種またはそれ以上の基質を、必要に応じて６個および／
または８個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基
質と組合せて用い、側鎖が３個。
５個および７個の炭素原子を有する（ｍ＝２．４および
６）共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけ
られる。
さらに好適な実施態様は、９個の炭素原子を有する１種
またはそれ以上の基質と、　１０個の炭素原子を有する
１種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて、６個、
７個および／または８個の炭素原子を有する１種または
それ以上の基質と組合せて用い、側鎖が３個、４個、５
個、６個および７個の炭素原子を有する（ｍ＝２．３，
４．５および６）共重合ポリエステルを生産することに
より特徴づけられる。
さらに他の好適な実施態様は、１１個の炭素原子を有す
る１種またはそれ以上の基質を、必要に応じて７個およ
び／または９個の炭素原子を有する１種またはそれ以上
の基質と組合せて、側鎖が４個、６個および８個の炭素
原子を有する（ｍ＝３゜５および７）共重合ポリエステ
ルを生産することにより特徴づけられる。しかし、他の
好適な実施態様は、　１０個の炭素原子を有する１種ま
たはそれ以上の基質を、必要に応じて６個、７個、８個
。
および／または９個の炭素原子を有する１種またはそれ
以上の基質と組合せて用い、側鎖が３個。
４個、５個、６個、７個および８個の炭素原子を有する
（ｍ＝２．３，４，５．６および７）共重合ポリエステ
ルを生産することにより特徴づけられる。
次の好適な実施態様は、１２個の炭素原子を有する１種
またはそれ以上の基質を、必要に応じて６個、８個およ
び／または１０個の炭素原子を有する１種またはそれ以
上の基質と組合せて用い、側鎖が３個、５個、７個およ
び９個の炭素原子を有する（ｍ＝２．４．６および８）
共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけられ
る。さらに好適な実施態様は、１１個の炭素原子を有す
る１種またはそれ以上の基質と、１２個の炭素原子を有
する１種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて６個
、７個、８個、９個および／または１０個の炭素原子を
有する１種またはそれ以上の基質と組合せて用い、側鎖
が３個、４個、５個、６個、７個。
８個および９個の炭素原子を有する（ｍ＝２．３゜４．
５，６．７および８）共重合ポリエステルを生産するこ
とにより特徴づけられる。
本発明によれば、好ましくは７〜１１個の炭素原子を有
する１種またはそれ以上の基質、最も好ましくは８〜１
０個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質が用
いられる。このようにして、最大量のポリマーが細胞内
に得られる。
シュードモナス　オレオポランス細菌の好気培養が達成
される様式および条件は当業者には既知である。培養は
３回分法または連続法が有効であり得る。この好気培養
は、ｐＨ５〜９．好ましくは約７において３７℃以下の
温度、好ましくは約３０℃において行われ、そしてこの
好気培養は、溶存酸素圧が好ましくは空気飽和の約５０
％を越える値であり、十分な撹拌を行うことにより行わ
れることが推奨される。
この好気培養は２液系で行うことができ、そして、それ
が望ましい。２液系の相のうちのひとつは、水溶性栄養
源および上記細菌を含む水相であり、そして他方は基質
の炭化水素を含む非極性相である。
上に述べたＰＩＩＢ生産微生物の場合のように、このシ
ュードモナス　オレオボランスは生育に必須の栄養源の
１つが枯渇するまでは、有意な量のポリマーを生産しな
い。適当な栄養源の制限は１例えば、窒素、リン酸、イ
オウおよびマグネシウムの制限であるが、これらのうち
、Ｎの制限およびＰの制限が高ポリマー収量という観点
からは好ましい。これらのうち、Ｎの制限が実際に容易
に行われ、その理由から最も好適である。
実際にはこの方法は２通常、細胞密度が少なくとも２　
ｇ／　１に達するまで栄養源制限なしで対数増殖を行い
１次に栄養源を制限した好気培養を行うような方法であ
る。
バイオポリマー中に封入体が形成される定常期はあまり
長く続けてはならない。なぜならば最大値に達した後、
このポリマーの濃度は再び減少するからである。従って
、好ましくは、栄養源制限で定常期に形成されたバイオ
ポリマー含有細胞は。
細胞中のバイオポリマー含量の有意な低下が起こる前に
、集菌される。
細胞に含まれているバイオポリマーは必ずしも単離する
必要がない。なぜならば、バイオポリマー封入体を有す
る細菌細胞を５例えば米国特許第３、１０７．１７２号
に開示されているように、直接用いることができるため
である。しかし、大部分の用途には、このポリマーの単
離精製することが望ましいか、もしくは必要である。こ
の目的のために。
多くの既知方法が採用され得る。この細菌細胞は。
当業者に既知の多くの方法で破砕され得る。例えば、剪
断力を用いること（ホモジナイザー、グラインダー、い
わゆる゛フレンチプレス゛°など）、浸透圧ショック処
理を用いること、音波または超音波振動を用いること、
酵素的細胞壁分解を行うこと、または細胞懸濁液をスプ
レードライすることが採用され得る。ついで、ポリマー
は、多くの既知方法により他の成分から分離され得る。
それには３例えば、溶剤抽出および遠心分離による方法
がある。適当な分離方法の１つは上述のＤｅ　Ｓｍｅｔ
らの報告に述べられており、それによれば等密度遠心分
離が用いられる。大規模スケールでバイオポリマーを単
離するには９次の方法が好適である。
まず、集菌した細胞をスフェロプラストにし、音波振動
処理で破砕し、そして遠心後上層を分離し３さらに必要
に応じて洗浄と乾燥を行う。好ましくは、スフェロプラ
ストへの変換は、蔗糖の存在下において行うことが有効
である。遠心分離は、　１０，０００ｇで約３０分間行
えば充分である。ポリマーはそこで上清に白い最上層を
形成し、容易に分離できる。
混入物は洗浄により除去でき、そして１洗浄されたポリ
マーを適当な方法で乾燥、好ましくは凍結乾燥にイ」ず
。
非常に好適な他の単離法は次のとおりである。
まず、細胞を連結遠心分離により集菌し、つぎに凍結乾
燥する。乾燥細胞を１例えばクロロホルムに懸濁し１次
に還流条件下で１例えば４時間にわたり抽出を行う。冷
却後、懸濁液を浄過し１例えば５０から１００　ｍｌの
容量までエバボレートする。得られたポリマー溶液は、
このポリエステル以外に大量の脂質および脂肪酸を含有
する。これらを。
例えば１１０倍量のエタノール中でポリマーを沈澱させ
ることにより除去する。ポリマーが沈澱後。
上澄をデカンテーションで除き、ポリマーの沈澱を圧縮
空気を上に流すことにより乾燥させる。ポリマーを次に
、好ましくは、できるだけ少量のクロロホルムに溶解さ
せ、ついで濾過後、１０倍量のエタノールで再沈澱させ
る。得られた沈澱を再び最小容量のクロロホルムに熔解
させ、その後、上記溶液を鋳型に注ぎ、蒸発させること
により１合成プラスチック材が得られる。蒸発はこの材
料を真空下でしばらくの間５０゛Ｃに保持することによ
り促進され得る。
このようにして得られるポリエステルは、該ポリエステ
ルから、その全体または一部が構成される。縫糸３フイ
ルム、皮膚、または骨移植材などの製品に利用され得る
。
上記ＰＩＩＢについて記載した利用はまた１本発明によ
り生産されたポリエステルにも適用される。
特に注目されるのは、得られたバイオポリマーを化学的
に修飾する可能性であり、この可能性はこのポリエステ
ルが末端に二重結合を有する側鎖を含む場合に、特にう
まく実現される。他のポリマー鎖との架橋もまた可能で
ある。
本発明はまた。光学的に活性なカルボン酸またはエステ
ルを生産する方法を提供し、それは２本発明により生産
されたポリエステルの加水分解。
および必要に応じて行われる生じたモノマーのエステル
化により特徴づけられる。上述のように。
そのような光学的活性化合物は、化学的手段を用いた場
合には、光学的に純粋な形では容易に得られない。本発
明は従って、そのような光学的に純粋な化合物の製造を
容易に達成する方法を提供する。それには例えば、薬剤
の製造における中間体。
または純粋に科学的なおよび／または応用を指向した研
究への利用性があり得る。使用した基質の相異により、
このプロセスにより異なったモノマーが生じた場合には
、必要に応じてこれらは既知方法（モノマーの鎖長およ
び／または飽和度の違いを利用した方法）により分離さ
れ得る。
本発明は１次の実験により詳述される。
（以下余白） １、バイオポリマーの　１ オクタンによる生育の間のシュードモナス　オレオボラ
ンスによる重合物質の生合成は、　１９８３年にＤｅ　
Ｓｍｅｔらにより初めて示された。このポリマーは、メ
タツリシスされた千ツマ−の元素分析。
赤外吸収スペクトル、およびガスクロマトグラフィーに
より、ポリ−３−ヒドロキシブチレート様（ＰＨ八）ポ
リエステル、おそらくポリ−３−ヒドロキシオクタノエ
ートと同定された。その後、３つの同定化合物が、有機
化学的な経路で合成され（Ｋｅｔｅｌａａｒら、　Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２６（１９８５
Ｌ　４６６５−４６６８）　、その後このポリマーの絶
対構造の決定が可能となった。
メタツリシスされたモノマーと２合成された（Ｓ）−３
−ヒドロキシヘキサノエート　メチルエステル。
（Ｓ）　−３−ヒドロキシオクタノエート　メチルエ　
　　′ステル、および（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレ−
ト　メチルエステルとを比較することによって。
シュードモナス　オレオボランスによりオクタンで生育
後に形成されるポリマーは、（Ｒ）−３−ヒドロキシヘ
キサノエートおよび（Ｒ）　−３−ヒドロキシオクタノ
エートから成ることが確立された。
オクタンでの生育後に形成されるポリマーの一般的な構
造式を第１図に示す。第１図において、Ｒはアルキル基
−（ＣＩ＋□）、ＣＨ３，またはアルケニル基−（ＣＩ
＋２）ｌＩ−Ｉ　　Ｃｌ−Ｃｌ１２．を示し、ここでｍ
は２〜８の整数である。基質としてオクタンを用いる場
合には、バイオポリマーは、モノマー（Ｒ）　−３−ヒ
ドロキシヘキサン酸エステル（Ｒ＝Ｃ３１１，）と、（
Ｒ）−３−ヒドロキシオクタン酸エステル（Ｒ＝Ｃ５旧
、）との共重合体である。
形成される他のポリマーにおけるモノマーの同定（以下
参照）は、そのポリマーの酸メタツリシスが有効であり
、その後生成したモノマーのメチルエステルを、ガスク
ロマトグラフィーと連結したマススペクトロメトリーで
分析した。
２、分析 細胞内に貯蔵されるポリマーの形成に関する反応動力学
を分析するために、ポリマーの量を短時間で少量の培養
試料（バイオマス）で測定し得る手段を用いて、再現性
のある方法を開発した。この方法は、微生物バイオマス
中のポリ−３−ヒドロキシブチレートの測定に対するＢ
ｒａｕｎｅｇｇら（Ｅｕｒ。
Ｊ、Ｍｉｃ、ｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　
６（１９７Ｂ）２９−３７）の方法に基づいて開発した
。
その方法によると、細胞培養の全試料を同時に加水分解
とメタツリシスを行い、その後ポリマーから形成された
七ツマ−のメチルエステルを、ガスクロマトグラフィー
で分析する。２つのピークの典型的なガスクロマトグラ
ムとマススペクトルを第２図に示す。第２図Ａはオクタ
ンで培養した細胞の分析後のＧＬＣパターンを示す。矢
印で示すピークは重合物質に由来する。ｔ＝５分のピー
クは内部標準（安息香酸メチルエステル）である。
第２図Ｂは最も重要なＧＬＣピークのＭＳパターンを示
す。１７５におけるピークは３−ヒドロキシオクタン酸
メチルエステルモノマーのプロトン化型であり、１９２
におけるピークはＮ）１４−３−ヒドロキシオクタン酸
メチルエステルを示す。第２図Ｃは。
より小さいＧＬＣピークのＭＳパターンを示す。　１４
７および１６４におけるピークはそれぞれ３−ヒドロキ
シヘキサン酸メチルエステルのプロトン化誘導体および
アンモニウム誘導体を示す。
この方法をシュードモナスのポリマーに対して開発する
ために、ｎ−オクタンによるシュードモナス　オレオボ
ランスの定常期培養の同一細胞試料を、１００℃にて様
々な時間により、そしてメタノール中における種々の濃
度の硫酸で加水分解を行った（第３図）。第３図は、オ
クタンで生産されたバイオポリマーの加水分解時および
メタツリシス時におけるインキュベーションの時間およ
び硫酸濃度の、バイオポリマー量に対する効果を示すグ
ラフである。測定には同一の細胞ペレットが用いられた
。抽出時間をさらに最適化し、　　Ｇｌ、Ｃ試料の乾燥
操作を導入した後９分析を以下のようにプログラムした
： ０．１〜４　、０　ｍｌ容量の細胞試料をエッペンドル
フ遠心管で３分間遠心分離し２次いで上清を除去し。
ペレットを凍結乾燥する。つい、で、この凍結乾燥ペレ
ットを１５％（Ｖ／Ｖ）の硫酸を含むメタノール溶液２
成に再懸濁し、２ｍｌのクロロホルムを加える。
ネジ蓋のある試験管で、これら試料を１００℃で１４０
分間、マグ不ティクスターラーで撹拌しながら。
インキュベートする。試料を氷上で冷却後、１．０ｍｌ
の水を加え、モノマー化したメチルエステルを。
試験管の内容物を２０秒間ポルテックスミキサーにかけ
て抽出する。遠心分Ｎ１（５分間、４０００Ｘｇ）で層
分離を促進させた後、水層を除き、有機層を無水Ｎａ２
５ｏ４上で乾燥する。次いて、これら試料を。
内部標準として安息香酸メチルエステルを用いてガスク
ロマトグラフィーにかける。
この分析の直線性を第４図に示す。この分析によると、
試料あたり９ｍｇのバイオポリマーまで、この反応は一
次反応である。
第９項を除く全ての実験は、シュードモナスオレオボラ
ンスＴＦ４−ＩＬ（ＡＴＣＣ２９３４７）を用いて行っ
た。
醗酵には、シュードモナス　オレオボランスを。
２５０ｍβのエーレンマイヤーフラスコ中で、２％オク
タンを含む５０ｍ（ｌのＥ培地により、　３０″Ｃにて
振盪プレート（２０Ｏｒｐｍ）上で１６時間（−晩）前
培養した。
Ｅ培地は、以下の組成である： ＦＩｇＳＯ，・７）１２０　　　　　　　　０．２ｇ／
　ｊ２クエン酸三ナトリウム　　　　　２．０ｇ／　Ｉ
Ｉ！ＮａＮ１１４・ＨＰ（ｈ　・４１１２０　　　　　
３．５ｇ／Ｉ。
Ｋ２１１ＰＯ４１０，Ｏｇ／　１ ３０００”　ＭＴ　　　　　　　　　　　　１ｍＲ／１
１０００”　ＭＴは、　ＩＮ　ＩＩｃＩ中の胞子成分の
溶液であり。
他の成分を殺菌した後に加える。１０００”　ＭＴは、
以下の組成である： ＦｅＳＯ４・　７Ｈ２０２，１８８）１ＭｎＣＩｚ　・
４８２０　　　　　　　　１．９８ｇ／　Ｉ。
Ｃ０５Ｏ，、７１１２０２，８１ｇ＃２ＣａＣ１ｚ　・
２１１２０　　　　　　　　１．４７ｇ／ρＣｕＣ１２
・２Ｈ２００，１７ｇ／　ｌＺｎ５Ｏａ　・７Ｈｚ０　
　　　　　　　０．２９ｇ／　ｊ２をＩＮ　ＩＣ＋に溶
解する。
本培養は、１／２の醗酵槽（連結撹拌タンク反応容器、
　Ｃ３Ｔ１１）に５００雌のＥ”培地を入れ２生育の最
適値であるｐＨ６，９に維持して、コンピューター制御
で５％ＮＩ＋３とＩＮ　１１２ｓＯ４を加えて行った。
醗酵の間、酵素分圧（溶存酵素分圧［１，Ｏ，Ｔ、）を
６０％空気飽和に、空気流入管のコンピューター制御バ
ルブを用いて維持した。培地は、　６００ｒｐｍの速度
で撹拌した。
Ｅ“培地は、以下の組成を有する： に２１１Ｐ０４・３１１２０　　　　　　　　７．５ｇ
／　ｌＮａＮＨ４１１ＰＯ４・４１１２０　　　　　　
３．５８／　ｊ２ＫＩＩ２ＰＯ４３，７ｇ／　ｌ１ １０００”　ＭＴ　　　　　　　　　　　　１ｍＱ／ｌ
。
１００　ｍＭ　ＭｇＳＯ４’　　　　　１０ｍ１Ｎ。
１０００“ＭＴと殺菌ＭｇＳＯ４溶液のみを、他の成分
を殺菌した後に加えた。単一炭素源およびエネルギー源
として、１０〜２０％（Ｖ／Ｖ）のオクタンを加えた。
この培地をアンモニアによるｐｌ＋滴定と組合せて用い
ると、６．５■／　ｍｆｌの細胞密度を得るのが可能で
あった。
全醗酵を通して、細胞密度’（Ｗｉｔｈｏｌｔ、Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ。
１０９　（１９７２）　３５０−３６４　）とポリマー
形成量（第２項による）を、試料を取ることによってモ
ニターした。
第５図Ａは、対数増殖期（μｍａｘ　＝０．４８）の間
に、事実上バイオポリマーの生産がないことを示す。し
かし、生育速度が、栄養源の１つ（この場合は窒素）の
制限により低下すると、ポリマー形成が始まる（最大で
細胞乾燥重量の１５％）。
この窒素制限は、以下のように行った：ｌ旧限、Ｅｉｉ
培地は、　２Ｎ　ＫＯＪＩおよびＩＮＩＩ。ＳＯａを添
加することによって、培養ｐＨを調整して用いた。
このようにすると、　　２　ｍｇ　／　ｍｆｌの細胞密
度が達成され得る。
４、也の　　によるバイオポリマー−塵詐戊シュードモ
ナス　オレオボランスを第３項に記載のように前培養し
た。本培養には、制限する栄養源に依存して、改変Ｅ″
培地を用いた：を皿扱：　Ｅ”培地を４０倍に希釈し、
窒素をＮｌｌ、ＣＩの形で１７ｍＭまで加えて、用いた
。培養ｐｌ＋は、　２Ｎ　ＫＯＪＩおよび２Ｎ　Ｈ２Ｓ
Ｏ，で一定に維持した。この培地に存在するリン酸は、
２ｍｇ　／　７まで、細胞増殖を可能にする。
Ｍ：Ｅ”培地に、　１００ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４に代えて、
ある量のＭｇ５Ｏ，を加えて最終濃度を０．４ｍＭとし
、そしである量のＭｇＣ１，を加えて最終濃度を０．６
ｍＭとした。ｐｏは、５％アンモニアを用いて調整した
。この培地では。
２　ｍｇ　／　ｍｌの細胞密度が可能である。
、ｈ［！ＩＬ　：　Ｅ　”培地に、　１００ｍＭ　Ｍｇ
ＳＯ４に代えて、ある量のＭｇＳＯ４を加えて最終濃度
を０．１ｍＭとし、そしである量のＮａ２ＳＯ４を加え
て最終濃度を０．９＋ｎＭとした。ｐＨは、５％アンモ
ニアを用いて調整した。この培地で。
は、　　１　ｍｇ　／　ｍｌの細胞密度を達成し得る。
全醗酵の間、培養の細胞密度および生成ポリマーの量を
、上の第３項に示したように測定した。
これらの培地を用いることにより、ポリマーの生成が主
に定常期に起こることが再び見られる。
上記の制限に依存して、細胞乾燥重量当りのバイオポリ
マーの百分率は、第５図に示すように変動する。第５図
Ａは窒素の制限、第５図Ｂはマグネシウムの制限、第５
図Ｃはリン酸塩の制限、そして第５図りはイオウの制限
を行った場合のものである。黒丸は細胞密度、そして白
丸はバイオポリマーの量を示す。以下の表１は、これら
栄養源制限の生成ポリマー量に対する効果を示し、細胞
乾燥重量の百分率で示した。
表土：ポリマー生成に対する制限の効果一般に、ポリマ
ーの生成は、窒素とリン酸制限下で最良であると結論し
得る。
５．４ｊｊ３のパラフィンによるポリマーのり”上の第
４項で述べたように決定した。ポリ−３−ヒドロキシ−
アルカノエート生成の最適条件を用いて、他のパラフィ
ンを、ポリマー形成のための基質としての可能性を調べ
た。シュードモナスオレオボランスが０６〜ＣＩ２のｎ
−パラフィンで生育し得ることを示す文献があるので、
これらの化合物をます調べた。
前培養を上の第３項のように行い、そして本培養を上の
第４項の窒素制限条件で行った。細胞密度およびポリマ
ーの百分率は、上の第３項に示すように測定した。
増殖およびポリマー形成の結果を第６図に要約する。第
６図において、使用されたパラフィンは。
ｎ−ヘキサン（第６図Ａ）、ｎ−ヘプタン（第６図Ｂ）
、ｎ〜ノナン（第６図Ｃ）、、ｎ−デカン（第６図Ｄ）
、ｎ−ウンデカン（第６図Ｅ）、およびｎ〜ドデカン（
第６図Ｆ）である。黒丸は細胞密度を、そして白丸はバ
イオポリマーの量を示す表２は、ポリマーの最大生成量
、この最大値に達する時間、および生成ポリマーのモノ
マー組成を示す。
シュードモナス　オレオボランスが全てのこれらパラフ
ィンに対してポリマーを生成し得ることがわかる。最良
の増殖基質であることが知られている基質、すなわちオ
クタンおよびノナンは、ポリマー形成に最良の基質でも
ある。ポリマーの組成は、用いた基質に依有する。炭素
数が偶数のパラフィンで生育後、炭素数が偶数のモノマ
ーが金側で形成され、そして炭素数が奇数のパラフィン
は、常に炭素数が奇数のモノマーとなる。これらモノマ
ーは、常に３−ヒドロキシ−アルカノエートであり、鎖
長が基質の長さから０６に変動する。
ＣＢおよびＣ，モノマーに対して、ポリマー生成酵素は
最大の特異性を有するようである。
６、オレフィンによるバイオポリマーのターシュードモ
ナス　オレオボランスは、またｎ　−オレフィンを唯一
の炭素源およびエネルギー源として利用できるので、バ
イオポリマーがこれらの基質でもまた形成されるかどう
かを検討した。この研究のための醗酵は、上の第５項に
従って行った。細胞密度およびポリマーの百分率は、第
３項に示すように定量した。
これら不飽和パラフィンによって生育した後に生成した
ポリマーは、パラフィンポリマーとは異なった組成を有
するようになる。該生成ポリマーは、モノマーの一部が
末端二重結合を含むという点において異なる。
ｎ−オクテンによって生成するポリマーの場合。
このような二重結合を有するモノマーの量は、全体の５
５％であった。オクテンによって生成したポリマーの加
水分解物の典型的なＧＣスペクトルを第７図に示す。ピ
ークの最初の集団は、３−ヒドロキシヘキセン酸エステ
ルと３−ヒドロキシヘキサン酸エステルとの存在を示す
。第２のピーク対は３−ヒドロキシオクテン酸エステル
と３−ヒドロキシオクタン酸エステルとの存在を示す。
不飽和化合物は、それぞれの場合において、　ＧＬＣ／
ＭＳで分析されるように、より短い保持時間を有する。
対応するピークを矢印で示す。オクタンおよびオクテン
によって生成したポリマーのＩＲスペクトルを第８図に
示す。二重結合によるピーク（矢印で示す）が明瞭に見
られる。
表３は１種々のオレフィンによって生育した後に生成し
たポリマーの最大量、この最大値に達するのに必要な時
間、およびポリマーを構成するモノマーを示す。
（以下余白） シュードモナス　オレオボランスは、■−オクテン、１
−ノネン、および１−デセンによってバイオポリマーを
生成する能力があることが示される。しかし３ヘキセン
によって生育させた場合は。
ポリマー形成が見られなかった。ポリマーがこれらのモ
ノマーから構成される様式は、ｎ−パラフィンによって
生成するポリマーの場合と類似している。しかし、１−
デセンによる生育の間に形成されるバイオポリマーが、
検出し得る量の０６モノマーを含んでいないことは驚き
である。
試験した１−オレフィンによって得られた結果によれば
、バイオポリマー形成が１−ヘプテン、　　、■−ウン
デセン、および１−ドデセンによっても起こることが期
待され得る。
１−オクテンによる生育の間、形成されたポリマーは５
飽和モノマーおよび不飽和モノマーの両方を含むことが
見出された。不飽和モノマーの量が、０（オクタンによ
る生育）と５５％（オクテンによる生育；第６項参照）
の間のポリマーを生産するために、シュードモナス　オ
レオボランスをこれら２つの基質の混合物で培養した。
醗酵は、ｌｆｆ１の撹拌タンク反応容器で、第３項のよ
うに行った。すべての場合に、全量２０％の有機層を加
えた。細胞密度およびポリマーの百分率は、第３項に示
したように定量した。
表４は、二重結合を有するモノマーの割合が。
用いた基質の組成に依存してどのように変化するかを、
モノマー組成と共に示す。示した値は、細胞のポリマー
含量が最大の時に測定した値である。
（以下余白） パラフィンおよびオレフィンの混合物から出発すると、
ポリマーにおける二重結合の百分率を変化させ得ると結
論される。従って、生育基質の組成がポリマーのモノマ
ー組成を決定する（部分的に）。
８、−他のｔｐヒノ　、によるボーリ□ア二二Φ」４成
ｎ−パラフィン（第５項参照）および１−オレフィン（
第６項参照）によるポリマー生成に加えて、他の置換炭
化水素または不飽和炭化水素を炭素源とした場合にも、
ポリマー生成が起こり得るか否かを検討した。シュード
モナス　オレオボランスは、全てのこれら基質に抵抗性
を有さないかも知れないので、これら基質はｎ−オクタ
ンとの１：１混合物で加えた。
醗酵は、第３項のように、１！の撹拌タンク反応容器で
、１０〜１５％の有機層を用いて行った。
表５は、このようにして試験した基質、およびこの場合
に１種々のモノマーを有するポリマーが実際生成するか
否かを示す。また、オクタン分解の第１中間体である１
−オクタツールが、生育およびポリマーの基質として用
い得るかどうかも調べた。これは、１−オクタツールを
唯一の炭素源およびエネルギー源として、シュードモナ
ス　オレオボランスを培養した場合に見出された。
ポリマー生成が、またさらに酸化されたパラフィン（オ
クタツール、オクタン酸）による生育の間にも起こるこ
とが期待される。
（以下余白） 表五二他の炭化水素による生育の間のシュードモナス　
オレオボランスによるバイオポリマーの形成 １“生育“で示した欄における記号は２次の意味である
ニ ー　　　生育しない。
十　　　最終ＯＤ値が１と５の間である中程度の生育。
＋十　　最終ＯＤ値が５と１０の間である適度の生育。
十＋十　最終ＯＤ値が１０を越えるオクタンによる生育
に匹敵する良好な生育。
９、ｔｈの菌朱によるポリマーのンハ 上に述べたすべての実験は、シュードモナスオレオボラ
ンスＴＦ４−ＩＬ　（ＡＴＣＣ２９３４７）を用いて行
った。この菌株は９時々ＧＰｏ−１と呼ばれる。この野
性型に加えて、数多くの関連菌株を、オクタンまたは１
−オクタツールによる生育後のポリマー形成について調
べた： ＧＰｏ−１２：　ＯＣＴプラスミドを保持しない」ハ」
。
並財し＝シュードモナス　プチダ、　Ｃｈａｋｒａｂａ
ｒむｙにより単離されたものでプラスミドを含まない。
血飢Ｌ：　ＯＣＴプラスミドを保持する」匹」。
ｈΣ−−１２４：　ＣＡＭ１０ＣＴ融合プラスミドを保
持する」飢」。
これらの菌株は、　　２５０ｍβのエーレンマイヤーフ
ラスコ中の５０ｍ１Ｅ”培地（第３項参照）で、４％オ
クタン、またはＯＣＴプラスミドがない場合には。
４％１−オクタツールを、唯一の炭素源およびエネルギ
ー源として用いて試験した。
表６は、オクタンまたは１−オクタツールによる生育の
後にポリマーを生成する菌株を示す。
（以下余白） プラスミドを保持しない株、すなわち−４汚」−が。
細胞内にポリ−３−ヒドロキシアルカノエートを蓄積す
る事実から、ポリマー合成に関与する酵素がプラスミド
ではなく、染色体にコードされていると結論し得る。
得られた結果は、またアルカノール、アルデヒド、カル
ボン酸、ジアルカノール、ジアルデヒドおよびジカルボ
ン酸を単一炭素源として用いる場合にも、ポリマー生成
が起こることを証明するか。
あるいは示唆する。
精製ポリ−３−ヒドロキシオクタノエート−３−ヒドロ
キシヘキサノニー）　（ＰＩＩＯＨ）および精製ポリ−
３−ヒドロキシオクタノエート−３−ヒドロキシオクタ
ノエート−３−ヒドロキシヘキサノエート−３−ヒドロ
キシヘキサノニー）　（ＰＨＯＩＩＬＩ）の分子量（Ｍ
Ｗ）　、融点（Ｔｍ）およびガラス転移温度（Ｔｇ）を
決定した。得られた値を表７に示す。比較のために、ポ
リ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨ８）の値も示す。
表１：ボリマーの特性 ９−は、この場合、ポリマー物質が完全に非結晶性なの
で、融点が存在しないことを意味する。
（発明の要約） 本発明は、シュードモナス　オレオポランス細菌を、あ
る栄養源を含む基質で培養することによってポリエステ
ルバイオポリマーを生産する方法に関する。該ポリエス
テルの性質は、用いる炭素源の性質を変化させることに
より変化させ得る。
このようにして、不飽和二重結合を有するポリエステル
をも生産し得る。該ポリエステルから光学活性なカルボ
ン酸またはエステルが生産される。
該ポリマーは、縫糸、フィルム、皮膚および骨移植材な
どの製品を製造するのに利用し得る。
４　　パ　　の　　　なｊ゛明− 第１図は本発明方法により生産されるバイオポリマーの
構造単位の一般式を示す。
第２図Ａは、オクタンで生産されたバイオポリマーのガ
スクロマトグラフィー（ＧＬＣ）　、　そして第２図Ｂ
およびＣは、マススペクトル（ＭＳ）の結果を示す。
第３図はシュードモナス　オレオボランス培養物の試料
中におけるバイオポリマーの定量分析の結果を表すグラ
フである。
第４図はポリ−３−ヒドロキシアルカン酸エステルの分
析において、用いた細胞量に対する相対ＧＬＣ応答のプ
ロットである。
第５図Ａ−Ｄは、培地中の栄養源制限と、　　ｎ　−オ
クタンを用いたときのバイオポリマー生産との関係を示
す。
第６図は、窒素制限下で種々のｎ−パラフィンにおいて
増殖したシュードモナス　オレオポランスによるポリ−
３−ヒドロキシアルカン酸エステルの生産を示す。
第７図は１−オクテンで増殖したシュードモナス　オレ
オポランスにより生成したバイオポリマーのＧＬＣ分析
の結果を示す。
第８図はオクタン（第８図Ａ）とオクテン（第８図Ｂ）
とで生成するバイオポリマーの赤夕←スペクトルを示す
。
以上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、微生物を栄養源制限下で好気的に培養することによ
    って、ポリエステルを製造する方法であって、 シュードモナス　オレオボランス細菌を好気条件下で、
    少なくとも１種の資化可能な非環状脂肪族炭化水素化合
    物を含有する炭素源の過剰量と、生育に必須の他の栄養
    源の少なくとも１種の制限量とを含有する栄養培地で培
    養すること；および必要に応じて、形成されたバイオポ
    リマーを該細胞から回収すること、 を包含する方法。 ２、次の構造式（１）を有する単位から構成されるポリ
    エステルを、６〜１２個の炭素原子を有するパラフィン
    またはパラフィン酸化物を１種またはそれ以上含有する
    炭素源を用いることによって、生産することを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項に記載の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼（１） ここで、ｍは２〜８の整数である。 ３、次の構造式（１）を有する単位と次の構造式（２）
    を有する単位とから構成されるポリエステルを、６〜１
    ２個の炭素原子を有する非分岐１−オレフィンの１種ま
    たはそれ以上と、必要に応じて、６〜１２個の炭素原子
    を有する非分岐パラフィンまたはパラフィン酸化物の１
    種またはそれ以上とを含有する炭素源を用いることによ
    って、生産することを特徴とする特許請求の範囲第１項
    に記載の方法：▲数式、化学式、表等があります▼（１
    ） ▲数式、化学式、表等があります▼（２） ここで、ｍは２〜８の整数である。 ４、６個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質
    を用いることによって、側鎖が３個の炭素原子を有する
    （ｍ＝２）ポリエステルを生産することを特徴とする特
    許請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。 ５、７個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質
    を用いることによって、側鎖が４個の炭素原子を有する
    （ｍ＝３）ポリエステルを生産することを特徴とする特
    許請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。 ６、６個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質
    と、７個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質
    とを用いることによって、側鎖が３個および４個の炭素
    原子を有する（ｍ＝２および３）共重合ポリエステルを
    生産することを特徴とする特許請求の範囲第２項または
    第３項に記載の方法。 ７、８個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質
    を、必要に応じて、６個の炭素原子を有する１種または
    それ以上の基質と組み合わせて用いることによって、側
    鎖が３個および５個の炭素原子を有する（ｍ＝２および
    ４）共重合ポリエステルを生産することを特徴とする特
    許請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。 ８、７個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質
    と、８個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質
    とを、必要に応じて、６個の炭素原子を有する１種また
    はそれ以上の基質と組み合わせて用いることによって、
    側鎖が３個、４個および５個の炭素原子を有する（ｍ＝
    ２、３および４）共重合ポリエステルを生産することを
    特徴とする特許請求の範囲第２項または第３項に記載の
    方法。 ９、９個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質
    を、必要に応じて、７個の炭素原子を有する１種または
    それ以上の基質と組み合わせて用いることによって、側
    鎖が４個および６個の炭素原子を有する（ｍ＝３および
    ５）共重合ポリエステルを生産することを特徴とする特
    許請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。 １０、８個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基
    質と、９個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基
    質とを、必要に応じて、６個および／または７個の炭素
    原子を有する１種またはそれ以上の基質と組み合わせて
    用いることによって、側鎖が３個、４個、５個および６
    個の炭素原子を有する（ｍ＝２、３、４および５）共重
    合ポリエステルを生産することを特徴とする特許請求の
    範囲第２項または第３項に記載の方法。 １１、１０個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の
    基質を、必要に応じて、６個および／または８個の炭素
    原子を有する１種またはそれ以上の基質と組み合わせて
    用いることによって、側鎖が３個、５個および７個の炭
    素原子を有する（ｍ＝２、４および６）共重合ポリエス
    テルを生産することを特徴とする特許請求の範囲第２項
    または第３項に記載の方法。 １２、９個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基
    質と、１０個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の
    基質とを、必要に応じて、６個、７個および／または８
    個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基質と組み
    合わせて用いることによって、側鎖が３個、４個、５個
    、６個および７個の炭素原子を有する（ｍ＝２、３、４
    、５および６）共重合ポリエステルを生産することを特
    徴とする特許請求の範囲第２項または第３項に記載の方
    法。 １３、１１個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の
    基質を、必要に応じて、７個および／または９個の炭素
    原子を有する１種またはそれ以上の基質と組み合わせて
    用いることによって、側鎖が４個、６個および８個の炭
    素原子を有する（ｍ＝３、５および７）共重合ポリエス
    テルを生産することを特徴とする特許請求の範囲第２項
    または第３項に記載の方法。 １４、１０個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の
    基質と、１１個の炭素原子を有する１種またはそれ以上
    の基質とを、必要に応じて、６個、７個、８個および／
    または９個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の基
    質と組み合わせて用いることによって、側鎖が３個、４
    個、５個、６個、７個および８個の炭素原子を有する（
    ｍ＝２、３、４、５、６および７）共重合ポリエステル
    を生産することを特徴とする特許請求の範囲第２項また
    は第３項に記載の方法。 １５、１２個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の
    基質を、必要に応じて、６個、８個および／または１０
    個の炭素原子を有する基質と組み合わせて用いることに
    よって、側鎖が３個、５個、７個および／または９個の
    炭素原子を有する（ｍ＝２、４、６および８）共重合ポ
    リエステルを生産することを特徴とする特許請求の範囲
    第２項または第３項に記載の方法。 １６、１１個の炭素原子を有する１種またはそれ以上の
    基質と、１２個の炭素原子を有する１種またはそれ以上
    の基質とを、必要に応じて、６個、７個、８個、９個お
    よび／または１０個の炭素原子を有する１種またはそれ
    以上の基質と組み合わせて用いることによって、側鎖が
    ３個、４個、５個、６個、７個、８個および／または９
    個の炭素原子を有する（ｍ＝２、３、４、５、６、７お
    よび８）共重合ポリエステルを生産することを特徴とす
    る特許請求の範囲第２項または第３項に記載の方法。 １７、７〜１１個の炭素原子を有する１種またはそれ以
    上の基質を用いることを特徴とする特許請求の範囲第２
    項または第３項に記載の方法。 １８、８〜１０個の炭素原子を有する１種またはそれ以
    上の基質を用いることを特徴とする特許請求の範囲第２
    項または第３項に記載の方法。 １９、窒素またはリン制限で前記好気培養を行うことを
    特徴とする特許請求の範囲第１項から第１８項のいずれ
    か１つに記載の方法。 ２０、窒素制限で前記好気培養を行うことを特徴とする
    特許請求の範囲第１項から第１９項のいずれか１つに記
    載の方法。 ２１、前記好気培養が、ｐＨ５〜９、好ましくは約７に
    て、および３７℃を下まわる温度、好ましくは約３０℃
    で行われることを特徴とする特許請求の範囲第１項から
    第２０項のいずれか１つに記載の方法。 ２２、前記好気培養が、好ましくは空気による飽和の約
    ５０％の溶存酸素分圧で、十分に撹拌して行われること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項から第２１項のいず
    れか１つに記載の方法。 ２３、前記好気培養が、二液相系で行われることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項から第２２項のいずれか１
    つに記載の方法。 ２４、栄養源制限による前記好気培養が、細胞密度が少
    なくとも２ｇ／ｌに達する、栄養源制限なしの対数増殖
    期後に、行われることを特徴とする特許請求の範囲第１
    項から第２３項のいずれか１つに記載の方法。 ２５、栄養源制限による定常期に形成される前記バイオ
    ポリマー含有細胞が、該細胞のバイオポリマー含量の顕
    著な低下が起こる前に、採取されることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項から第２４項のいずれか１つに記載
    の方法。 ２６、前記バイオポリマーが、前記採取細胞をスフェロ
    プラストへ変換し、音波振動処理によってこれらを破砕
    し；そして遠心分離した後に形成される最上層を分離し
    ；さらに必要に応じて、洗浄と乾燥を行うこと、によっ
    て単離されることを特徴とする特許請求の範囲第１項か
    ら第２５項のいずれか１つに記載の方法。 ２７、前記バイオポリマーが、化学的に修飾されること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項から第２６項のいず
    れか１つに記載の方法。 ２８、光学的に活性なカルボン酸またはエステルを製造
    する方法であって、 特許請求の範囲第１項から第２７項のいずれか１つに記
    載の方法により生産されるポリエステルを加水分解する
    こと；および、 必要に応じて、得られたモノマーをエステル化すること
    を特徴とする方法。 ２９、特許請求の範囲第１項から第２７項のいずれかに
    記載の方法によって製造されるポリエステルから、その
    全体または一部が構成される、縫糸、フィルム、皮膚、
    または骨移植材などの製品。
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