KR100298644B1 - 불포화기를함유하는폴리(3-히드록시알카노에이트),그의제조방법및그의용도 - Google Patents

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Abstract

슈도모나스 속의 폴리-베타-히드록시알카노에이트 생산균주를 알칸산, 이중결합을 포함하는 카르복실산 및 삼중결합을 포함하는 카르복실산 혼합물을 포함하는 배지에서 배양하여 생산한 폴리(3-히드록시알카노에이트)는 분자 내에 탄소-탄소 단일결합, 이중결합 및 삼중결합을 임의의 비율로 포함하고, 실리콘 화합물과 반응하거나 가열, 자외선 조사 등의 방법에 의하여 쉽게 가교된 생성물을 제조하므로 일반적인 접착제 또는 아교로 사용할 수 있고, 생분해성 및 생체적합성이 우수하여 의료용으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

불포화기를 함유하는 폴리(3-히드록시알카노에이트), 그의 제조방법 및 그의용도
[산업상 이용분야]
본 발명은 폴리 (3-히드록시알카노에이트)(Poly(3-hydroxyalkanoate)s)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 분자 내에 탄소-탄소 단일결합, 이중결합 및 삼중결합을 임의의 비율로 함유하고, 생체적합성 및 생분해성이 우수하여 의료 분야에서 유용하게 사용할 수 있는 폴리(3-히드록시알카노에이트), 그를 합성하는 방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
[종래기술]
내구성이 뛰어난 장점 때문에 일상생활에 널리 사용되어 왔던 합성플라스틱및 합성섬유 제품들은 사용 후 폐기되어 수십 년이 지나도 자연계에서 분해되지 않으므로 토양과 하천을 오염시키고 식물의 성장을 저해하는 등의 심각한 환경오염 문제를 일으키고 있다. 이와 같은 플라스틱에 의한 환경오염은 플라스틱이 미생물의 분해작용에 잘 견디는 뛰어난 내구성을 가진다는 것에 기인하고 있다.
따라서, 이와 같은 플라스틱에 의한 환경오염 문제를 해결하기 위하여 미생물에 의해 분해되는 생분해성 플라스틱이 개발되었고, 이러한 생분해성 플라스틱은 기존의 합성플라스틱에 전분이나 금속 착물을 첨가하여 미생물의 분해작용 및 광산화 등의 작용에 의하여 분해가 쉽게 일어날 수 있도록 제조되었다. 그러나, 이와 같은 생분해성 플라스틱은 플라스틱 성분 중에서 전분질의 분해는 쉽게 일어나지만 합성플라스틱 부분은 여전히 분해되지 않고 남아있어 환경을 오염시키고, 플라스틱 제조시 사용된 금속 착물 부분이 또 다른 환경 오염원이 될 수 있어 플라스틱에 의한 환경오염 문제를 근본적으로 해결하는 데는 한계가 있다.
최근에는 이와 같은 합성플라스틱에 의한 환경오염 문제를 보다 근본적으로 해결하기 위하여, 생물 자체로부터 생성되는 바이오플라스틱(bioplastic)에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 바이오폴리머(biopolymer)라고도 불리는 이들 바이오플라스틱은 미생물, 동물 및 식물로부터 직접 얻어지는 천연 고분자 물질로서 기존의 합성플라스틱과 같은 우수한 기계적 내구성을 갖고 있어 일반소재, 포장재, 농업용 필름 등의 재료로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 매우 우수한 생분해성을 갖고 있어 자연계에서 일정한 시간이 경과하면 물과 이산화탄소로 완전히 분해되고, 인체에 무해함과 동시에 우수한 생체 적합성을 갖고 있어 생체에 사용되는 접착제, 밴드, 봉합사 등의 재료로 사용된다. 즉, 이들 바이오플라스틱은 자연계에서 미생물에 의하여 완전히 분해되며, 생체 내에 사용할 때 생체 내에서 자연적으로 흡수 분해되는 등의 특성을 갖고 있어, 환경오염 문제를 완전히 해결할 수 있는 생물열 가소성 플라스틱 (biothermoplastics)이다.
지금까지 공지된 바이오플라스틱으로는 풀루탄(pullutan), 치토산(chitosan), 크산탄(xanthan), 겔란(gellan), 람산(rhamsan), 폴리-베타-히드록시뷰티레이트(poly-β-hydroxybutyrate, 이하 PHB라 함) 등이 있으며, 이들 중 폴리-베타-히드록시알카네이트(poly-β-hydroxyalkanates, 이하 PHAs라 함)의 일종으로 폴리에스터와 폴리프로필렌의 중간적 성질을 갖는 PHB가 산업상 응용 가능성이 가장 큰 것으로 알려져 있다.
일반적으로 PHAs는 일부 박테리아가 탄소원 및 에너지원으로 저장하는 저장물질(storage material)로서 1926년에 M. Lemoigne에 의해 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 처음으로 PHAs 중의 하나인 PHB가 발견된 이래(Poivier등, 1995) 많은 연구가 진행되고 있다. PHAs는 세포 내에 봉입체(inclusion body) 형태로 존재하며, 질소, 인 및 황 등이 한정된 불균형 조건(unbalanced condition) 하에서는 그 축적률이 증가하는 것으로 알려져 있다. PHAs는 PHAs를 구성하는 모노머인 3-히드록시알카노에이트(3-hydroxyalkanoates)의 탄소수에 따라 크게 단쇄길이(Short-Chain-Length, C3~C5) PHAs와 중쇄길이 (Medium-Chain-Length, C6~C14)PHAs의 두 그룹으로 나뉘어지고, 이외에도 탄소수 15 내지 18의 모노머를 갖는 장쇄길이(Long-Chain-Length) PHAs가 보고되었다(Song 등, 1993).
현재까지 발견된 PHAs를 생합성하는 박테리아는 90속 이상이고, 약 90종류의 PHA 모노머가 발견되었다(Song 등, 1993). 그 중에서 단쇄길이 PHAs를 생합성하는 대표적인 박테리아는 알칼리게네스(Alcaligenses) 속 및 바실러스(Bacillus) 속 등이 있는데, 특히 알칼리게네스 속은 단쇄길이 PHAs의 하나인 PHB 호모폴리머(homopolymer)를 생합성하는 대표적인 박테리아로 알려져 있고, 중쇄길이 PHAs의 생합성에 관한 연구는 현재 주로 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스 속에서 광범위하게 이루어지고 있다.
그러나 상기한 것과 같은 생합성된 분해성 PHAs는 분자 내에 단일결합과 이중결합만을 포함하고 있을 뿐이고, 분자 내에 탄소-탄소 삼중결합이 함유된 고분자의 예는 없다. 분자 내에 삼중결합을 포함하는 고분자는 특별히 요구될 경우에 화 학적으로 합성된 예가 드물게 있을 뿐이고, 분해성 고분자 중에서 분자 내에 삼중 결합을 포함하는 고분자는 보고되어 있지 않다. 특히, 탄소-탄소 삼중결합과 이중 결합을 모두 포함하는 고분자와 탄소-탄소 삼중결합, 이중결합 및 단일결합을 모두 포함하는 고분자에 대해서는 보고된 전례가 없다.
분자 내에 삼중결합을 포함하는 고분자의 화학적 합성은 서로 공명하는 불포 화기를 가지는 고분자가 전도성을 가진다는 면에서 연구되었고, 그 예로는 일본공 개특허 9176254호 및 일본특허 95-334648호에 기재된 스틸벤을 함유한 고분자와 삼중결합이 반복되어 존재하는 고분자가 있다. 다른 예로는 유럽 공개특허 641819호, 유럽특허 94-l13792호, 일본특허 93-243843호 등에 기재된 곁가지에 삼중결합을 함유한 실록산(siloxane) 계열의 고분자 합성과 Morozova 등에 의한 프로파길(propargyl) 계열의 단량체로부터 분자량이 낮은 올리고머 합성(Ser. B., 35(5), 272-274, 1993) 등이 있다. 이외에도 곁가지에 삼중결합을 함유한 고분자를 합성하기 위하여 시도된 실험들이 있으나 쉽게 가교된 경우가 많고, 고분자 주사슬에 삼중결합을 함유시켜 가교에 이용한 예도 있다(Patil 등, Polymer, 22(4), 434-435, 1981). 그러나 상기한 것과 같이 화학적으로 합성한 고분자는 생성된 후 용해성이 없거나 매우 낮다는 문제점이 있다.
또한, 일반적으로 실리콘이 함유된 고분자는 생체적합성이 우수하여 일반적인 용도는 물론 의료용으로 유용하게 사용될 수 있지만, 지금까지 보고된 실리콘 함유 고분자는 분해성이 낮아 환경오염 등의 문제를 일으킨다는 단점이 있었다.
본 발명의 목적은 분자 내에 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 분해성 고분자 인 폴리(3-히드록시알카노에이트), 그의 제조방법 및 실리콘을 함유하는 분해성 고분자를 제공하는 것이다.
제1도는 슈도모나스 올레오보란스 및 슈도모나스 푸티다에 의해 제조된 PHA내의 불포화 반복기의 총 분율을 탄소 기질 혼합물 중의 10-UND( ≡)의 몰 퍼센트에 대해 도시한 그래프.
제2도는 NA 및 10-UND( ≡)를 다양한 비율로 혼합한 혼합물에서 배양된 슈도모나스 푸티다의 배양시간에 따른 광학 밀도 그래프.
제3도는 10-UND( ≡)에서 배양된 슈도모나스 푸티다로부터 제조된 PHA의 IR 스펙트럼.
제4도는 10-UND( ≡)에서 배양된 슈도모나스 푸티다로부터 제조된 PHA의13C NMR 스펙트럼.
제5도는 같은 몰로 혼합된 NA 및 10-UND( ≡)에서 배양된 슈도모나스 푸티다로 부터의 PHA 생성과정.
제6도는 같은 몰로 혼합된 NA 및 10-UND( ≡)에서 배양된 슈도모나스 푸티다로 부터 제조된 PHA의 배양시간에 따른 조성.
제7도는 같은 몰로 혼합된 NA 및 10-UND( ≡)에서 배양된 슈도모나스 푸티다로 부터 제조된 PHA의 가메탄올 분해된 샘플의 가스크로마토그램.
제8도는 같은 몰로 혼합된 NA 및 10-UND( ≡)에서 배양된 슈도모나스 푸티다로 부터 제조된 PHA의1H NMR 스펙트럼.
제9도는 같은 몰로 혼합된 NA, 10-UND(=) 및 10-UND( ≡)에서 배양된 슈도모나스 푸티다로부터 제조된 PHA의 가메탄올 분해된 샘플의 가스크로마토그램.
제10도는 같은 몰로 혼합된 NA 및 10-UND(=)에서 배양된 슈도모나스 푸티다 로부터 제조된 PHA의 IR 스펙트럼.
제11도는 같은 몰로 혼합된 NA 및 10-UND(=)에서 배양된 슈도모나스 푸티다 로부터 제조된 PHA를 디메틸에톡시실란과 반응시켜 생성된 PHA 실록산 하이브리드 고분자의 IR 스펙트럼.
제12도는 콩기름을 탄소원으로 사용하여 배양된 슈도모나스 푸티다로부터 제조된 PHA 샘플의 가스크로마토그램.
[과제를 해결하기 위한 수단]
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 탄소-탄소 삼중결합을 함유하는 폴리(3-히드록시알카노에이트)(poly(3-hydroxyalkanoate, 이하 PHA라 함)를 제공한 다. 상기 PHA는 탄소-탄소 단일결합 및/또는 이중결합을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 PHA 생산균주를 삼중결합을 포함하는 카르복실산을 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는 삼중결합을 함유하는 PHA의 제조방법을 제공한 다. 상기 PHA 생산 균주는 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 아우레오파시엔스 (Pseudomonas aureofaciens), 슈도모나스 시린자에(Pseudomonas syringaee), 슈도모나스 스투쩨리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 멘도시나(Pseudomonas mendocina), 슈도모나스 클로라피스(Pseudomonas chloraphis), 슈도모나스 시코리이(Pseudomonas cichorii), 슈도모나스 슈도알칼리제네스(Pseudomonas pseudoalcaligenes), 슈도모나스 알칼리제네스(Pseudomonas alcaligenes) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하고, 상기 삼중결합을 포함하는 카르복실산은 10-운데킨산, 화학식 1 또는 화학식 2로 나타내어지는 화합물인 것이 바람직하다.
상기 화학식에서 a는 3,5,7 또는 10이고, R1은 -CH2C≡CH, -CH2CH2≡CH,-CH2C≡CCH3, -CH2CH2CH2C≡CH, -CH2CH2C≡CCH3, -CH2C≡CCH2CH3,, -CH2CH2C≡CCH2CH3또는 -CH2CH2CH2CH2C≡CH3이다.
상기 배지는 알칸산 및/또는 이중결합을 포함하는 카르복실산을 더욱 포함하는 것이 바람직하다. 상기 알칸산은 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산 및 도데칸산으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하고, 상기 이중결합을 포함하는 카르복실산은 화학식 3, 화학식 4 또는 화학식 5로 나타내어지는 화합물인 것이 바람직하다.
상기 화학식에서 b는 3,5,7 또는 10이고, R2는 -CH2CH2CH=CH2,, -CH2CH=CHCH3,,, -CH2CH2CH2CH=CH2,,, -CH2CH2CH=CHCH2CH3,, -CH2CH=CHCH2CH2CH3, -CH2CH2CH=CHCH2CH3, -CH2CH2CH2CH=CHCH3또는 -CH2CH2CH2CH2CH=CH2이다.
상기 화학식에서 c는 3,4,5 또는 8이다.
상기 화학식에서 R3는 -CH2CH2CH=CH2, -CH2CH=CH2, -CH2CH2CH2CH2CH=CH2또는 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH=CH2이다.
또한 본 발명은 상기한 PHA 화합물 및 실리콘 화합물을 반응시켜 제조되는 PHA 실록산 하이브리드(poly(3-hydroxyalkanoate) siloxane hybrid) 및 상기한 PHA화합물 및 실리콘 화합물을 반응시키는 공정을 포함하는 PHA 실록산 하이브리드의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기한 방법에 따라 제조한 PHA 실록산 하이브리드를 이용하여 제조한 접착제를 제공한다.
또한 본 발명은 폴리-베타-히드록시알카노에이트 생산균주를 식용유를 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는 다중결합을 함유하는 폴리(3-히드록시알카노에이트)의 제조방법을 제공한다.
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
일반적으로 PHA를 생산한다고 알려진 균주를 알칸산, 이중결합을 포함하는 카르복실산 및 삼중결합을 포함하는 카르복실산을 임의의 비율로 혼합한 혼합물을 탄소원으로 하여 배양하면 탄소원의 조성에 따라 변화된 조성을 갖는 PHA를 얻을 수 있다. PHA를 생산하는 균주는 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 아우레오파시엔스, 슈도모나스 시린자에, 슈도모나스 스투쩨리, 슈도모나스 멘도시나, 슈도모나스 클로라피스, 슈도모나스 시코리이, 슈도모나스 슈도알칼리제네스, 슈도모나스 알칼리제네스 및 슈도모나스 아에루기노사로 이루어진 군에서 선택되고, 알칸산은 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산 및 도데칸산으로 이루어진 군에서 선택되며, 이중결합을 가지는카르복실산은 화학식 3, 화학식 4 또는 화학식 5로 나타내어지는 화합물이고, 삼중결합을 가지는 카르복실산은 10-운데킨산, 화학식 1 또는 화학식 2로 나타내어지는 화합물이다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식에서 a 및 R1은 상기에서 정의한 바와 동일하다.
[화학식 3]
R2O(CH2)bCOOH
상기 화학식에서 b 및 R2는 상기에서 정의한 바와 동일하다.
[화학식 4]
H2C=CH(CH2)cCOOH
상기 화학식에서 c는 상기에서 정의한 바와 동일하다.
[화학식 5]
상기 화학식에서 R3는 상기에서 정의한 바와 동일하다.
이때, 알칸산으로부터는 화학식 6으로 나타내어지는 포화된 반복기 3-히드록시알카노에이트(3-hydroxyalkanoate)가 생성되고, 이중결합을 포함하는 카르복실산 중 화학식 3으로 나타내어 지는 화합물은 화학식 7로 나타내어지는 반복기를, 화학식 4 및 5로 나타내어지는 화합물은 화학식 8로 나타내어지는 반복기를 각각 생성한다. 또한 삼중결합을 가지는 카르복실산 중 화학식 1로 나타내어지는 화합물 및 10-운데실산은 화학식 9로 나타내어지는 반복기를, 화학식 2로 나타내어지는 화합물은 화학식 7로 나타내어지는 반복기를 각각 생성한다.
상기 화학식에서 k는 1 내지 7의 정수이다.
상기 화학식에서 R은 R1또는 R2로서 상기에서 정의된 바와 동일하고, 1은 탄소원에 따라 1,2,3,4,5,6 또는 8이다.
상기 화학식에서 m은 탄소원에 따라 1,2,3,4 또는 6이다.
상기 화학식에서 n은 탄소원에 따라 1,3,4 또는 6이다.
본 발명에 사용한 탄소원에 따라 생성되는 반복기의 몇 가지 예를 표 1에 나타내었다.
13HHx: 3-히드록시헥사노에이트(3-hydroxyhexanoate)
3HHp: 3-히드록시 헵타노에이트(3-hydroxyheptanoate)
3HO: 3-히드록시옥타노에이트(3-hydroxyoctanoate)
3HN: 3-히드록시노나노에이트(3-hydroxynonanoate)
3HD: 3-히드록시데카노에이트(3-hydroxydecanoate)
3HUD: 3-히드록시운데카노에이트(3-hydroxyundecanoate)
3HDO: 3-히드록시도데카노에이트(3-hydroxydodecanoate)
3HN(=): 3-히드록시-8-노네노에이트(3-hydroxy-8-nonenoate)
3HUD(=): 3-히드록시-10-운데케노에이트(3-hydroxy-10-undecenoate)
3HN( ≡): 3-히드록시-8-노니노에이트(3-hydroxy-8-nonynoate)
3HUD( ≡): 3-히드록시-10-운데키노에이트(3-hydroxy-10-undecynoate)
상기한 것과 같이 기질의 종류에 따라 생성되는 고분자 내에 존재하는 반복기의 종류가 다르므로 기질을 선택함으로써 원하는 비율의 탄소-탄소 단일결합, 이중결합 및 삼중결합의 조성을 함유하는 고분자를 제조할 수 있다. 또한, 동일한 탄소원으로부터는 동일한 반복기가 생성되지만, 균주의 종류에 따라서 생성되는 반복기의 상대적인 양이 다르므로 균주를 선택함으로써 분자 내에 단일결합, 이중결합 및 삼중결합을 임의의 비율로 함유하는 고분자를 제조할 수 있다. 상기 고분자는 실리콘 화합물과 반응시키거나 가열, 자외선 조사 등의 방법을 적용하여 쉽게 가교시킬 수 있으므로 접착제(pressure sensitive adhesive) 또는 아교(glue) 등으로 사용할 수 있다.
상기한 방법에 따라 생성된 단일결합, 이중결합 및 삼중결합을 임의의 비율로 함유하는 PHA 화합물을 실리콘 화합물과 반응시키면 PHA 실록산 하이브리드를 제조할 수 있다. 상기한 실리콘 화합물은 예를 들면 하기의 화학식 10a 내지 10e 로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있고, 상기 반응은 프로판-2-올(propan-2-ol) 용매의 헥사클로로플라티닉산(hexachloroplatinic acid)또는 백금 디비닐 착물(platinum divinyl complex)과 같은 촉매 존재 하에서 진행될 수 있다.
상기 화학식에서 R4는 CH3, OCH3또는 OCH2CH3이고, R4가 CH3일 때, R5는 OCH2CH3, N(CH3)2또는 C ≡C-C6H5이고, R4가 OCH3일 때, R5는 CH3또는 OCH3이며, R4가 OCH2CH3일 때, R5는 CH3, OCH2CH3또는 벤질기이고, R6는 N(CH3)2또는 CH=CH2이고, R7은 CH3또는 CH2CH3이고, p 및 q는 각각 0 또는 1이다.
불포화기를 함유하는 PHA와 실리콘 화합물의 반응의 몇 가지 예를 하기의 반응식 1 내지 8에 나타내었다.
상기 반응식 1 내지 8에서 R4, R5, R6, m, n 및 P는 각각 상기에서 정의한 바와 동일하다.
상기한 방법에 따라 제조한 실리콘이 함유된 분해성 고분자는 생체 적합성이 우수하므로 의료용으로 사용하기에 적합하다. 상기한 화학식 10a, lOb 또는 10d에서 R6가 N(CH3)2인 실리콘 화합물을 사용하여 제조된 PHA 실록산 하이브리드 고분자는 수분에 노출되면 쉽게 반응하여 가교된 생성물을 만들어내는 특성을 가지므로, 수분경화형 접착제에 효과적으로 사용될 수 있다.
화학식 lOc 또는 화학식 10d에서 R6가 CH=CH2인 경우에는 생성된 PHA 실록산 하이브리드 고분자 말단에 이중결합이 존재하므로 이 고분자를 다시 실리콘 화합물과 반응시킬 수 있다. 특히, 화학식 10d에서 R6가 CH=CH2인 경우에는 생성된 고분자에 포함된 Si 원자 하나 당 3개의 이중결합이 존재하고, 이들은 각각 상기한 반응식 1 내지 8에서 나타낸 것과 같은 방법에 따라 실리콘 화합물과 반응할 수 있다.이때 반응하는 실리콘 화합물이 화학식 10a에서 R4및 R5가 모두 OCH3인 경우나 모두 OCH2CH3인 경우에는 생성된 화합물 말단에 Si-OR(R은 CH3또는 CH2CH3) 결합이 최대 9개까지 존재하게 된다. 이와 같은 반응에서 생성된 실리콘 화합물의 말단이 Si-OR(R은 CH3또는 CH2CH3)인 경우 및 Si-N(CH3)2인 경우에는 실리콘 화합물이 수분과반응하여 가교되는 특성을 가진다. 이와 같이 생성된 고분자 내에 Si-OR 결합이 많이 존재하게 되면 경화 속도가 빨라지며, 생성된 고분자 내의 Si-OR 결합의 수를 조절함으로써 경화 속도를 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 알칸산, 이중결합을 포함하는 카르복실산 또는 삼중결합을 포함하는 카르복실산 대신 식용유(oil)를 탄소원으로 사용하여 다중결합을 함유하는 PHA 고분자를 제조할 수 있다. 식용유는 그 내에 다중결합을 함유하는 카르복실산을 포함하고 있으므로, 본 발명에서 탄소원으로 사용될 수 있고, 이 경우 폐식용유를 사용할 수 있으므로 폐자원을 유용하게 활용할 수 있다는 장점이 있다.
[실시예]
다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[종균배양 및 본배양]
실시예에서 사용하는 균주의 종균배양 및 본배양은 다음과 같은 조건에 따라 실행하였다.
실시예에서 사용한 균주는 10mM의 노나노에이트(nonanoate)를 탄소원으로 사용하여 30℃의 온도 및 pH 7.0에서 250rpm의 속도로 교반하면서 18시간 동안 종균배양(seed culture)하여 사용하였다.
종균배양하여 얻은 균주를 본 배양인 회분배양(batch fermentor culture)할 때, 슈도모나스 올레오보란스 균주의 경우에는 1ℓ당 (NH4)2HP041.1g, K2HP045.8g 및 KH2P043.7g를 첨가한 E* 배지에 표 2에 나타낸 것과 같은 조성의 미량원소 (microelement) 1㎖ 및 100mM의 MgS04수용액 100㎖를 첨가하고, 탄소원으로 사용되는 산을 농도가 30mM 이하가 되도록 혼합하여 투입한 후, 10M NaOH 수용액과 진한 염산 수용액으로 pH를 7로 조절한 배지를 사용하여 배양하였다.
슈도모나스 푸티다 균주의 경우에는 1ℓ당 (NH4)2SO40.66g, KH2P042.3g, Na2HP047.3g, MgS04ㆍ7H20 0.25g, NaHC030.3g 및 CaCl2ㆍH2O 0.1g를 첨가한 미네랄 배지에 표 2에 나타낸 것과 같은 조성의 미량원소 1㎖를 첨가하는 것을 제외하고는 상기의 슈도모나스 올레오보란스 균주의 경우와 같은 조건의 배지를 사용하였으며, 이후의 과정은 두 균주 모두 동일하게 진행하였다.
상기와 같은 조성을 가진 배양액 50㎖에 균주를 접종하고 30℃에서 하룻밤 동안 배양한 균을 접종액으로하여 하기의 표 3의 조건에 따라 회분배양하였다.
배양 시간에 따른 광학밀도(optical density, OD)를 측정하여 성장이 정지기에 도달하면 배양을 멈추고 원심분리하여 균을 분리하고, 분리된 균을 동결건조한 후 Soxhlet 추출기를 사용하여 클로로포름으로 고분자를 용출하였다. 얻어진 고분자는 다시 클로로포름에 녹이고 메탄올에 적하하여 침전시킴으로써 정제하였다.
[고분자 조성 분석]
상기의 방법에 따라 분리 정제된 고분자 3~5mg 또는 동결건조된 세포 10mg을 스크류 캡(screw cap)이 부착된 시험관에 넣고, 클로로포름 1㎖및 메탄올에 녹아있는 황산용액(부피비 1%) 1㎖를 첨가한 후 뚜껑을 닫고 100℃로 예열된 기름조에 넣어 4시간 동안 방치하였다. 4시간 후, 상온으로 냉각하고, 증류수 1㎖를 가하고 격렬히 교반하여 유기층을 분리하였다. 여기에 소량의 무수 마그네슘설페이트를 첨가하여 건조시키고, 상등액 1㎕를 GC에 투입하여 분석하였다. GC 분석 조건은 주입기 온도 270℃, 초기 오븐 온도 50℃, 초기 시간 3분, 온도 증가율 10℃/분, 최종 온도 230℃, 검출기 온도 300℃였고, 검출기로는 불꽃 이온화 검출기를 사용하였으며, 칼럼은 HP사의 HP-1을 사용하였다.
[실시예 1]
KCTC 2407로 기탁된 슈도모나스 푸티다 균주를 노난산(nonanoic acid, NA) 및 10-운데킨산(10-undecynoic acid, 10-UND( ≡))을 각각 하기의 표 4와 같은 비율로 혼합한 혼합물 기질에서 배양하여 PHA를 얻었고, 이때 얻어진 PHA를 가스크로마토그래피로 분석하여 그 내에 존재하는 각각의 반복기의 조성을 표 4에 나타내었다.
상기한 표 4에 나타낸 것과 같은 비율에 따른 혼합물 기질을 사용하여 생성된 PHA 내에서 불포화기의 총 분율을 10-UND( ≡)의 몰 퍼센트에 대해 도시한 그래프를 도 1에 나타내었다(●).
또한, 상기한 표 4에 나타낸 것과 같은 비율에 따른 혼합물 기질을 사용하여 배양하였을 때, 배양시간에 따른 660nm에서의 광학밀도(OD)값을 도 2에 나타내었다. 도 2에서 0는 100몰%의 10-UND( ≡)일 때, □는 75몰%의 10-UND( ≡)+25몰%의 NA일 때, △는 50몰%의 10-UND( ≡)+50몰%의 NA일 때, ▽는 25몰%의 10-UND( ≡)+75몰%의 NA일 때, ◇는 100몰%의 NA일 때의 경우를 각각 나타낸다. 도 2의 결과로부터 운데킨산의 비율이 높으면(100몰% 및 75몰%) 균주의 성장이 늦다는 것을 알 수 있다.
상기한 표 4에 나타낸 비율 중 10-UND( ≡)만을 사용하였을 때 생성된 PHA의 IR 스펙트럼 및13C NMR 스펙트럼을 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3의 결과로부터 탄소-탄소 삼중 결합의 존재를 확인할 수 있고, 도 4의 결과로부터 생성된 PHA의 구조를 확인할 수 있다.
상기한 표 4에 나타낸 비율 중 10-UND( ≡)와 NA를 같은 몰농도로 혼합한 혼합물을 기질로 사용하여 배양하였을 때 PHA의 생성과정을 도 5에 나타내었다. 도 5에서 ▲및 ▼는 각각 배지에 남아있는 NA 및 10-UND( ≡)의 분율이고, □는 PHA의 함량(무게%)이며, ●는 660nm에서의 OD 값을 나타낸다.
또한, 같은 조건에서 생성된 PHA의 조성을 배양시간에 따라 나타낸 그래프를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 □는 3HN, ▥는 3HHp, ▩는 3HN( ≡), ▨는 3HUD( ≡)의 조성을 각각 나타낸다.
이때 얻어진 PHA의 조성을 확인하기 위하여 가스크로마토그래피로부터 얻은 가스크로마토그램을 도 7에 나타내었고, 생성된 PHA의1H NMR 스펙트럼을 도 8에 나타내었다. 도 7의 결과로부터 PHA에 포함된 반복기의 조성 및 함량을 결정할 수 있고, 도 8의1H NMR 스펙트럼으로부터 반복기 중 삼중결합의 존재 및 구조를 확인할 수 있다.
[실시예 2]
슈도모나스 푸티다 대신 ATCC 29347로 기탁된 슈도모나스 올레오보란스를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 실험하였고, 이때 얻어진 결과를 표 5에 나타내었다.
상기한 표 5에 나타낸 비율에 따른 혼합물 기질을 사용하여 생성된 PHA에서 불포화기의 총 분율을 10-UND( ≡)의 몰 퍼센트에 대해 도시한 그래프를 도 1에 나타내었다( ■). 도 1에서 ●는 실시예 1에서 슈도모나스 푸티다를 균주로 사용하여 생성된 PHA에 대한 값을 나타내고, ■는 실시예 2에서 슈도모나스 올레오보란스를 균주로 사용하여 생성된 PHA에 대한 값을 나타낸다. 도 1의 결과로부터 동일한 탄소원으로부터는 동일한 반복기가 생성되지만, 균주의 종류에 따라서 생성되는 반복기의 상대적인 양이 다르다는 것을 알 수 있다.
[실시예 3]
KCTC 2407로 기탁된 슈도모나스 푸티다 균주를 NA, 10-UND(=) 및 10-UND( ≡)를 각각 5mM씩 포함하는 혼합물을 탄소원으로 하여 회분배양하여 0,68g/ℓ의 건조 세포 중량(dry cell weight)을 얻었고, 이때 PHA의 함량은 5.0중량%였다. 생성된 PHA를 가스크로마토그래피로 분석하여 얻어진 가스크로마토그램을 도 9에 나타내었고, 이 결과로부터 PHA에 포함된 반복기의 조성 및 함량을 계산하여 고분자 내에 존재하는 각각의 반복기의 조성을 표 6에 나타내었다.
a3HHp(=): 3-히드록시헵테노에이트(3-hydroxyheptenoate)
도 9에서 메틸 3HHp(=)는 8.679분, 메틸 3HHp는 9.014분, 메틸 3HN(=)은 12.340분, 메틸 3HN은 12.543분, 메틸 3HN(=)은 12.670분, 메틸 3HUD(=)는 15.314분, 3HUD(=)는 15.610분에 각각 피크가 검출되었다.
[실시예 4]
KCTC 2407로 기탁된 슈도모나스 푸티다 균주를 NA 및 10-UND(=)를 동일한 몰수로 포함하는 혼합물을 탄소원으로 하여 배양하여 얻어진 고분자 1g을 에틸아세테이트 1g에 녹이고 디메틸에톡시실란 0.5g과 백금 디비닐 착물 한 방울을 첨가하여 혼합한 후 18시간 동안 상온에서 교반하였다. 이 반응으로부터 PHA 실록산 하이브리드 고분자를 얻었고, 이로부터 얻어진 고분자를 유리판에 얇게 도포하여 두면 수시간 내에 가교가 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 이때, 디메틸에톡시실란과의 반응전 및 반응후의 IR 스펙트럼을 각각 도 10 및 도 11에 나타내었다. IR 스펙트럼으로부터 PHA 실록산 하이브리드 고분자가 생성되었음을 알 수 있다.
[실시예 5]
균주는 KCTC 2407로 기탁된 슈도모나스 푸티다를 사용하였고, 탄소원은 증류수 15㎖와 콩기름 100㎖를 혼합하여 끓이면서 필요에 따라 물을 첨가하여 잘 혼합 되도록 유지하면서 비누와 같이 엉길 때까지 NaOH를 가하고, 이로부터 얻어진 고체 를 여과하거나 그대로 건조하여 사용하였다. 배지 1ℓ당 상기와 같이 전처리한 탄소원 7g을 첨가하고, 산소공급비율이 Ivvm인 것을 제외하고는 다른 실시예와 동일 한 방법에 따라서 배양하였다. 114시간 동안 배양한 후, 1ℓ당 1.3g의 건체를 얻 었으며, 1ℓ당 약 0.4g의 고분자를 얻었다. 이로부터 얻어진 고분자의 가스크로마 토그램을 도 12에 나타내었다. 도 12의 결과로부터 생성된 고분자 내에는 탄소수 6, 8, 10 및 12개를 가진 반복기와 이중결합이 함유된 반복기가 포함되어 있음을 알 수 있다. 도 12에서 탄소수 8, 10, 12개를 포함한 반복기와 17분, 18분, 19분에각각 얻어진 이중결합을 함유하는 반복기의 비율은 약 1.4:1.1:0.4:1:1:2.3이었다. 도 12로부터 알 수 있듯이 얻어진 고분자는 이중 결합을 다량 함유하고 있으며, 공기 중에서 쉽게 가교되었다.
PHA 생산균주 및 기질을 조절함으로써 제조된 탄소-탄소 단일결합, 이중결합 및 삼중결합을 임의의 비율로 함유하는 폴리(3-히드록시알카노에이트)는 실리콘 화합물과 쉽게 반응하여 가교된 생성물을 만들어내므로 농업, 일상용품, 식품포장 등의 일반적인 용도뿐만 아니라, 의료용 제품, 특히 접착제, 밴드 등의 용도로 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 9의 반복기를 가지는 것을 특징으로 하는, 삼중결합을 함유하는폴리(3-히드록시알카노에이트):
    [화학식 9]
    (상기 화학식에서 n은 1,3,4 또는 6이다)
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리(3-히드록시알카노에이트)는 단일결합, 이중결합또는 이들 모두를 더욱 포함하는 폴리(3-히드록시알카노에이트).
  3. 슈도모나스 푸티다 및 슈도모나스 올레오보란스 중에서 선택되는 폴리-베타-히드록시알카노에이트 생산균주를 10-운데킨산, 하기 화학식 1 및 화학식 2로 나타내어지는 화합물 중에서 선택되는 삼중결합을 포함하는 카르복실산을 포함하는 배지에서 배양하는 단계:
    [화학식 1]
    [화학식 2]
    R1O(CH2)aCOOH
    상기 화학식에서 a는 3,5,7 또는 10이고, R1은 -CH2C≡CH, -CH2CH2C≡CH, -CH2C≡CCH3, -CH2CH2CH2C≡CH, -CH2CH2C≡CCH3, -CH2C≡CCH2CH3,, -CH2CH2C≡CCH2CH3또는 -CH2CH2CH2CH2C≡CH3이다.
    를 포함하는 하기 화학식 9의 반복기를 가지는 것을 특징으로 하는 삼중결합을 함유하는 폴리(3-히드록시알카노에이트)의 제조방법:
    [화학식 9]
    (상기 화학식에서 n은 1,3,4 또는 6이다)
  4. 제3항에 있어서, 상기 배지는 알칸산, 이중결합을 포함하는 카르복실산 또는 이들 모두를 더욱 포함하는 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 알칸산은 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산 및 도데칸산으로 이루어진 군에서 선택되고, 싱기 이중결합을 포함하는 카르복실산은 화학식 3, 화학식 4 또는 화학식 5로 나타내어지는 화합물인 제조방법.
    [화학식 3]
    R2O(CH2)bCOOH
    상기 화학식에서 b는 3,5,7 또는 10이고, R2는또는 -CH2CH2CH2CH2CH=CH2이다.
    [화학식 4]
    H2C=CH(CH2)cCOOH
    상기 화학식에서 c는 3,4,5 또는 8이다.
    [화학식 5]
    상기 화학식에서 R3는 -CH2CH2CH=CH2, -CH2CH=CH2, -CH2CH2CH2CH2CH=CH2또는 -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH=CH2이다.
  6. 제1항의 폴리(3-히드록시알카노에이트) 화합물 및 실리콘 화합물을 반응시 키는 단계; 를 포함하는 폴리(3-히드록시알카노에이트) 실록산 하이브리드의 제조방법.
  7. 제1항의 폴리(3-히드록시알카노에이트) 화합물 및 실리콘 화합물을 반응시켜 제조되는 폴리(3-히드록시알카노에이트) 실록산 하이브리드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 실리콘 화합물은 화학식 10a 내지 10e로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인 폴리(3-히드록시알카노에이트) 실록산 하이브리드.
    [화학식 10a]
    [화학식 10b]
    [화학식 10c]
    [화학식 10d]
    HSi(R6)3
    [화학식 10e]
    H(SiO)qSi(R7)3
    상기 화학식에서 R4는 CH3, OCH3또는 OCH2CH3이고, R4가 CH3일 때, R5는 OCH2CH3, N(CH3)2또는 C≡C-C6H5이고, R4가 OCH3일 때, R5는 CH3또는 OCH3이며, R4가 CH2CH3일 때, R5는 CH3, OCH2CH3또는 벤질기이고, R5는 N(CH3)2또는 CH=CH2이고, R7은 CH3또는 CH2CH3이고, p 및 q는 각각 0 또는 1이다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리(3-히드록시알카노에이트) 실록산 하이브리드 중 상기 폴리(3-히드록시알카노에이트) 화합물과 화학식 lOc 또는 화학식 10d로 나타내어지는 실리콘 화합물을 반응시켜 제조된 폴리(3-히드록시알카노에이트) 실록산 하이브리드를 상기 화학식 10a 내지 10e로 나타내어지는 실리콘 화합물과 더욱 반응시켜 제조되는 폴리(3-히드록시알카노에이트) 실록산 하이브리드.
  10. 제7항의 폴리(3-히드록시알카노에이트) 실록산 하이브리드를 이용하여 제조한 접착제.
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