JP4579502B2 - 構造体及びその製造方法、該構造体を含むトナー並びにそれを用いた画像形成方法及び装置 - Google Patents

構造体及びその製造方法、該構造体を含むトナー並びにそれを用いた画像形成方法及び装置 Download PDF

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートと粒状の磁性体からなる基材とを備え、該ポリヒドロキシアルカノエートが該基材の少なくとも一部を被覆した構造を有していることを特徴とする構造体及びその製造方法、ならびに該構造体を含むトナー及びそれを用いた画像形成方法及び装置に関するものである。
【０００２】
【背景技術】
高分子材料は現代の産業や生活に不可欠のものであり、安価軽量であること、成形性が良いこと等から、家電品の筐体をはじめ包装材や緩衝材、あるいは繊維材料等、多岐に渡って利用されている。一方、これら高分子材料の安定な性質を利用して、高分子の分子鎖に様々な機能を発現する置換基を配して、液晶材料やコート剤等の各種機能材料も得られている。これら機能材料は構造材料としての高分子よりも付加価値が高いため、少量生産でも大きな市場ニーズが期待できる。このような高分子機能材料は、これまで高分子の合成プロセスの中で、あるいは合成した高分子を置換基で修飾することにより、有機合成化学的手法により得られている。高分子機能材料の基本骨格となる高分子はほとんどの場合、石油系原料から有機合成化学的手法によって得られている。ポリエチレン,ポリエチレンテレフタレート,ポリエステル,ポリスチレン,ポリ塩化ビニル,ポリアクリルアミド等がその典型的な例である。
【０００３】
[重層構造体]
ところで、本願発明者らは高分子化合物に大きな付加価値を与えるための一つの要素技術として、高分子化合物により基材を被覆した重層構造体に着目してきた。このように高分子化合物で特定の基材を被覆することによって、極めて有用な機能性を有する複合構造体を得ることができる。このような構造体の具体的な用途としては、例えば高分子化合物にトナー成分を内包させたマイクロカプセル構造体からなる電子写真用カプセルトナー、高分子化合物に磁性体を内包させたマイクロカプセル構造体からなる生体物質の分離精製あるいはスクリーニング用担体、高分子化合物でシート状の基材を被覆したインクジェット記録方式用記録媒体、高分子化合物でシート状の磁性体を被覆した磁気記録媒体等が考えられる。
【０００４】
一般に、電子写真法は光導電性物質を利用し、種々の手段により感光体上に電気的潜像を形成し、次いで該潜像をトナーを用いて現像し、必要に応じて紙等の転写材にトナー画像を転写した後、加熱,圧力,加熱圧力,あるいは溶剤蒸気等により定着し複写画像を得るものである。この目的に用いるトナーとして、従来、熱可塑性樹脂中に染・顔料からなる着色剤を溶融混合し、均一に分散した後、微粉砕装置および分級機により所望の粒径とする「粉砕トナー」が用いられてきた。該トナーは優れた能力を有するものではあるが、その製造工程上、脆性が要求されるため、材料の選択範囲等に一定の制限がある等の課題があった。このような課題を克服するため、特公昭36-10231号公報(特許文献)により懸濁重合法による「重合トナー」の製造が提案されている。懸濁重合法においては、重合性単量体、着色剤、重合開始剤、さらに必要に応じて架橋剤、荷電制御剤等を均一に溶解または分散せしめた後、分散安定剤を含有する連続相(例えば水相)に攪拌機で分散し、同時に重合反応を行わせ、所望のトナーを得る。この方法は、粉砕工程が含まれないため、トナーに脆性が必要でなく、軟質の材料を使用できる等の利点がある。しかし、このような微小粒径の重合トナーでは、着色剤や電荷制御剤がトナー表層へ露出し易いため、着色剤の影響が生じ易くなり、また、帯電の均一性の低下が懸念された。これらの課題を解決するため、重合体粒子表面を高分子化合物からなる一層あるいは複数層の外被で被覆した、いわゆる「カプセルトナー」が提案されている。
【０００５】
[カプセル構造体]
このようなカプセルトナーとしては、特開平８-286416号公報(特許文献１)において、極性樹脂を含有する外被で重合粒子を被覆した静電荷現像用カプセルトナー及びその製造方法が開示されている。この方法は、トナー成分を含む重合粒子からなるコアのまわりに、有機合成化学的手法により外被を形成させたものであり、上記の課題を改善し、画質耐久性の向上、帯電の均一化及び安定化を実現させた優れた静電荷現像用カプセルトナーが供給できる。また、特開平９-292735号公報(特許文献２)では、強固な外被樹脂によって、離型剤材料および熱膨張の大きな材料からなるコアを被覆した画像形成用カプセルトナーが開示されている。前記トナーは、定着時の過熱によってコア内の熱膨張性材料が膨張して、外被を破壊することによって、内包する離型剤材料を外部に押し出すように構成された機能性マイクロカプセルであり、フィルム加熱型の定着装置を用いる場合にはオフセットを生じることがなく、また、ローラー定着器を使用した場合には低加圧での定着を可能としかつ紙シワを低減することができる等の効果が期待できる。同様に、高分子化合物を外被とするカプセルトナーとその製造方法としては、特開平５-119531号公報,特開平５-249725号公報,特開平６-332225号公報,特開平９-43896号公報,特開平10-78676号公報,特開平11-7163号公報,特開2000-66444号公報,特開2000-112174号公報,特開2000-330321号公報(以上、特許文献３〜11)が開示されており、いずれも懸濁重合法,乳化重合法,沈殿重合法,分散重合法,ソープフリー乳化重合法,シード重合法等の有機合成化学的手法により所望のカプセル構造体を製造している。
【０００６】
しかしながら、これらカプセルトナーの製造方法においては、その製造工程が極めて複雑となる、製造工程において大量の溶媒類や界面活性剤を使用する等の課題もあった。
【０００７】
基材に磁性体を用いた磁性体含有カプセル構造体は、磁力により容易に捕集される点から、主に生化学分野において、医療診断薬担体、細菌あるいは細胞分離担体、核酸あるいは蛋白分離精製担体、ドラッグデリバリー担体、酵素反応担体、細胞培養担体等としての優れた効果が期待されている。磁性体含有カプセル構造体の合成法については、親油化処理した磁性体を重合性モノマー中に分散し、これを懸濁重合する方法(特開昭59-221302号公報(特許文献12))、同じく親油化処理した磁性体を重合性モノマー中に分散し、ホモジナイザーで水中に均質化して重合することにより、比較的小粒子径の磁性粒子を得る方法(特公平４-3088号公報(特許文献13))、あるいは特定の官能基を有する多孔性ポリマー粒子の存在下で、鉄化合物を析出させたのち酸化することにより、多孔性ポリマー粒子内部に磁性体を導入し、大粒径かつ均一径の磁性粒子を得る方法(特公平５-10808号公報(特許文献14))が挙げられる。
【０００８】
しかしながら、これらの合成法により得られた磁性体含有カプセル構造体を医療診断薬担体等に用いると、磁性体の多くがカプセル構造体内部に存在する場合でも、感度が大幅に低下したり、非特異的反応を示したりして、十分な実用性能が得られない場合が多い。これは、磁性体含有カプセル構造体表面に磁性体が部分的に露出し、あるいは構造体表面と内部の磁性体の間にミクロパスが形成されるため、磁性体成分が溶出し、実用性能を損なうためであると考えられる。一般に、磁性体はポリマー粒子よりも親水性が高く、従来の合成法では、磁性体がカプセル構造体の表面あるいは表面近傍へ局在することが、実用性能を損なう大きな原因の１つであると考えられる。このように、従来の磁性体含有カプセル構造体においては、含まれる磁性体成分の表面への露出、ミクロパスの形成、等による磁性体成分の溶出を抑えることが困難であり、その溶出が問題とならない分野に限定して使用せざるをえないのが実状であった。
【０００９】
[磁性体表面改質]
また、磁性体の表面特性を改質し、重合トナー中の磁性体の分散性向上を図る試みが数多く報告されている。特開昭59-200254号公報、特開昭59-200256号公報、特開昭59-200257号公報、(以上、特許文献15〜18)に磁性体の各種シランカップリング剤処理技術が提案されており、特開昭63-250660号公報(特許文献19)、特開平10-239897号公報(特許文献20)では、ケイ素元素含有磁性体粒子をシランカップリング剤で処理する技術が開示されている。
【００１０】
しかしながら、これらの処理により磁性体の分散性はある程度向上するものの、磁性体表面の疎水化を均一に行うことが困難であるという問題があり、したがって、磁性体同士の合一や疎水化されていない磁性体粒子の発生を避けることができず、磁性体の分散性を良好なレベルにまで向上させるには不十分である。
【００１１】
また、疎水化磁性酸化鉄を用いる例として特公昭60-3181号公報(特許文献21)にアルキルトリアルコキシシランで処理した磁性酸化鉄を含有するトナーが提案されている。この磁性酸化鉄の添加により、確かにトナーの電子写真諸特性は向上しているものの、磁性酸化鉄の表面活性は元来小さく、処理の段階で合一粒子が生じたり、疎水化が不均一であったりで、必ずしも満足のいくものではなかった。
【００１２】
[記録媒体]
一方、高分子化合物でシート状の基材を被覆した積層構造体からなる記録媒体としては、例えばインクジェット記録方式における記録媒体が挙げられる。インクジェット記録方式は、種々の作動原理によりインクの微小液滴を飛翔させて紙等の記録媒体に付着させ、画像、文字等の記録を行うものである。該記録方式では、インク中に水,水と有機溶剤の混合液といった多量の溶媒を含んでいるので、高色濃度を得るためには大量のインクを用いる必要がある。また、インク液滴は連続的に射出されるので、最初の液滴が射出されると、インク液滴が融合してインクのドットが接合するビーディング現象が生じて画像が乱れる。このため、インクジェット記録用媒体には、インク吸収量が大きく吸収速度が高いことが要求される。
【００１３】
このため、基材上にインク受容層を形成してインク吸収性を高めた記録媒体が提案されている。特開昭55-146786号公報(特許文献22)では、基材をポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン等の水溶性樹脂で被覆した記録媒体が提案されている。また、特開平５-221112号公報(特許文献23)では、耐水性樹脂を用いた記録媒体が提案されている。さらに、イオン性樹脂をインク受容層として用いた記録媒体が提唱されており(特開平11-78221号公報(特許文献24)、特開2000-190631号公報(特許文献25))、水に対する濡れ性や耐水性,染料定着性等に優れ、インクの吸収乾燥性や画像鮮明性に優れた記録媒体が得られている。
【００１４】
インク吸収層を基材上に形成させる方法としては、従来は塗沫による方法が一般的であり、例えば、ブレードコート方式,エアナイフコート方式,ロールコート方式,フラッシュコート方式,グラビアコート方式,キスコート方式,ダイコート方式,エクストルージョン方式,スライドホッパー方式,カーテンコート方式,スプレー方式等を用いた方法により行われてきた。
【００１５】
なお、以上に例示したいずれの方法においても、基材の被覆のために用いる高分子化合物は有機合成的手法により合成・構造体化され、これに種々の機能が付加されている。
【００１６】
[ＰＨＡ]
ところで、近年、生物工学的手法によって高分子化合物を製造する研究が活発に行われてきており、また、一部で実用化されている。例えば、微生物由来の高分子化合物として、ポリ-３-ヒドロキシ-n-酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合もある)や３-ヒドロキシ-n-酪酸と３-ヒドロキシ-n-吉草酸との共重合体(以下、ＰＨＢ/Ｖと略す場合もある)等のポリヒドロキシアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す場合がある)、バクテリアセルロースやプルラン等の多糖類、ポリ-γ-グルタミン酸やポリリジン等のポリアミノ酸等が知られている。特にＰＨＡは、従来のプラスチックと同様に、溶融加工等により各種製品に利用することができるうえ、生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待されている。
【００１７】
これまで、多くの微生物がＰＨＡを生産し菌体内に蓄積することが報告されてきた。アルカリゲネス・ユウトロファス・Ｈ16株(Ａlcaligenes eutrophus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)、メチロバクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍ sp.)、パラコッカス属(Ｐaracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligenes sp.)、シュードモナス属(Ｐseudoｍonas sp.)の微生物によるＰＨＢ/Ｖの生産が報告されている(特開平５-74492号公報、特公平６-15604号公報、特公平７-14352号公報、特公平８-19227号公報(以上、特許文献26〜29)。また、コマモナス・アシドボランス・ＩＦＯ13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans ＩＦＯ13852)が、３-ヒドロキシ-n-酪酸と４-ヒドロキシ-n-酪酸とをモノマーユニットに持つＰＨＡを生産することが開示されている(特開平９-191893号公報(特許文献30))。さらに、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas caviae)により、３-ヒドロキシ-n-酪酸と３-ヒドロキシヘキサン酸との共重合体を生産することが開示されている。
【００１８】
これらＰＨＢやＰＨＢ/Ｖの生合成は、種々の炭素源から、生体内の様々な代謝経路を経て生成された(Ｒ)-３-ヒドロキシブチリルＣoＡまたは(Ｒ)-３-ヒドロキシバレリルＣoＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＢ合成酵素(ＰＨＢポリメラーゼ、ＰＨＢシンターゼともいう)である。なお、ＣoＡとは補酵素Ａ(coenzyｍe Ａ)の略称であり、その化学構造は下記化学式の通りである。
【００１９】
【化２５】
Figure 0004579502
【００２０】
また、近年、炭素数が３から12程度までの中鎖長(ｍediuｍ-chain-length)の３-ヒドロキシアルカン酸ユニットからなるポリヒドロキシアルカノエート(以下、ｍcl-ＰＨＡと略す場合がある)についての研究が精力的に行われている。
【００２１】
特許第2642937号公報(特許文献33)では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ29347株(Ｐseudoｍonas oleovorans ＡＴＣＣ 29347)に非環状脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から12までの３-ヒドロキシアルカン酸のモノマーユニットを有するＰＨＡが生産されることが開示されている。また、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,58，746(1992)(非特許文献１)には、シュードモナス・レジノボランス(Ｐseudoｍonas resinovorans)が、オクタン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ-n-酪酸,３-ヒドロキシヘキサン酸,３-ヒドロキシオクタン酸,３-ヒドロキシデカン酸をモノマーユニットとするＰＨＡを生産し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３-ヒドロキシ-n-酪酸,３-ヒドロキシヘキサン酸,３-ヒドロキシオクタン酸,３-ヒドロキシデカン酸をユニットとするＰＨＡを生産することが報告されている。ここで、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３-ヒドロキシアルカン酸モノマーユニットの導入は、後述の脂肪酸合成経路を経由していると考えられる。
【００２２】
Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,16(３),119(1994)(非特許文献２)には、シュードモナスsp.61-３株(Ｐseudoｍonas sp.strain61-３)が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素源として、３-ヒドロキシ-n-酪酸,３-ヒドロキシヘキサン酸,３-ヒドロキシオクタン酸,３-ヒドロキシデカン酸,３-ヒドロキシドデカン酸といった３-ヒドロキシアルカン酸、および、３-ヒドロキシ-５-cis-デセン酸,３-ヒドロキシ-５-cis-ドデセン酸といった３-ヒドロキシアルケン酸をユニットとするＰＨＡを生産することが報告されている。
【００２３】
上記のＰＨＡは側鎖にアルキル基を有するモノマーユニットからなるＰＨＡ(以下、usual-ＰＨＡと略す場合がある)、あるいはそれに準じるもの(例えば他に末端部以外に二重結合をもつアルケニル基を側鎖にもつもの)である。しかし、より広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基(例えば、フェニル基,不飽和炭化水素,エステル基,アリル基,シアノ基,ハロゲン化炭化水素,エポキシド等)を側鎖に導入したＰＨＡ(以下、unusual-ＰＨＡと略す場合がある)が極めて有用である。
【００２４】
フェニル基を有するunusual-ＰＨＡの生合成の例としては、Ｍacroｍolecules,24，5256-5260(1991),Ｍacroｍol.Ｃheｍ.,191,1957-1965(1990),Ｃhirality,３，492-494(1991) (以上、非特許文献３〜５)で、シュードモナス・オレオボランスが、５-フェニル吉草酸から、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。また、Ｍacroｍolecules,29，1762-1766(1996)(非特許文献６)で、シュードモナス・オレオボランスが、５-(４-トリル)吉草酸(５-(４-メチルフェニル)吉草酸)から、３-ヒドロキシ-５-(４-トリル)吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。さらに、Ｍacroｍolecules,32，2889-2895(1999)(非特許文献７)には、シュードモナス・オレオボランスが、５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸から、３-ヒドロキシ-５-(２,４-ジニトロフェニル)吉草酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-５-(４-ニトロフェニル)吉草酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。
【００２５】
また、フェノキシ基を有するunusual-ＰＨＡの例としては、Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,195，1665-1672(1994)(非特許文献８)で、シュードモナス・オレオボランスが、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告されている。また、Ｍacroｍolecules,29，3432-3435(1996)(非特許文献９)には、シュードモナス・オレオボランスが、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡを、８-フェノキシオクタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸ユニット,３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-８-フェノキシオクタン酸ユニットを含むＰＨＡを、11-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸ユニットおよび３-ヒドロキシ-７-フェノキシヘプタン酸ユニットを含むＰＨＡを生産することが報告されている。さらに、Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,41，32-43(1995)(非特許文献10)では、シュードモナス・オレオボランス・ＡＴＣＣ 29347株及びシュードモナス・プチダ・ＫＴ2442株(Ｐseudoｍonas putida ＫＴ2442)が、p-シアノフェノキシヘキサン酸または p-ニトロフェノキシヘキサン酸から、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキシヘキサン酸ユニットまたは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノキシヘキサン酸ユニットを含むＰＨＡを生産すると報告している。特許第2989175号公報(特許文献34)には、３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)吉草酸ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)吉草酸ユニットからなるホモポリマー、少なくとも３-ヒドロキシ-５-(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエートユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロフェノキシ)ペンタノエートユニットを含有するコポリマーとその製造方法が記載されており、その効果として、融点が高く良好な加工性を保ちつつ、立体規則性、撥水性を付与することができるとしている。
【００２６】
また、シクロヘキシル基を有するunusual-ＰＨＡの例としては、Ｍacroｍolecules,30，1611-1615(1997)(非特許文献11)に、シュードモナス・オレオボランスが、シクロヘキシル酪酸またはシクロヘキシル吉草酸から該ＰＨＡを生産するとの報告がある。
【００２７】
[ＰＨＡ合成のメカニズム]
これらｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡの生合成は、原料となる各種アルカン酸から、生体内の様々な代謝経路(例えば、β酸化系や脂肪酸合成経路)を経て生成された(Ｒ)-３-ヒドロキシアシルＣoＡを基質とした、酵素による重合反応によって行われる。この重合反応を触媒する酵素がＰＨＡ合成酵素(ＰＨＡポリメラーゼ、ＰＨＡシンターゼともいう)である。以下に、β酸化系およびＰＨＡ合成酵素による重合反応を経て、アルカン酸がＰＨＡとなるまでの反応を示す。
【００２８】
【化２６】
Figure 0004579502
【００２９】
一方、脂肪酸合成経路を経る場合は、該経路中に生じた(Ｒ)-３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ(ＡＣＰとはアシルキャリアプロテインのことである)から変換された(Ｒ)-３-ヒドロキシアシルＣoＡを基質として、同様にＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されると考えられる。
【００３０】
[酵素を利用した無細胞系ＰＨＡ合成]
近年、上記のＰＨＢ合成酵素やＰＨＡ合成酵素を菌体外に取り出して、無細胞系(in vitro)でＰＨＡを合成しようとする試みが始まっている。
【００３１】
Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,92，6279-6283(1995)(非特許文献12)では、アルカリゲネス・ユウトロファス(Ａlcaligenes eutrophus)由来のＰＨＢ合成酵素に３-ヒドロキシブチリルＣoＡを作用させることにより、３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。また、Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,25，55-60(1999)(非特許文献13)では、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素に、３-ヒドロキシブチリルＣoＡや３-ヒドロキシバレリルＣoＡを作用させることにより、３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニットや３-ヒドロキシ-n-吉草酸ユニットからなるＰＨＡの合成に成功している。さらにこの報告では、ラセミ体の３-ヒドロキシブチリルＣoＡを作用させたところ、酵素の立体選択性によって、Ｒ体の３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニットのみからなるＰＨＢが合成されたとしている。Ｍacroｍol.Ｒapid Ｃoｍｍun.,21，77-84(2000)(非特許文献14)においても、アルカリゲネス・ユウトロファス由来のＰＨＢ合成酵素を用いた細胞外でのＰＨＢ合成が報告されている。
【００３２】
また、ＦＥＭＳ Ｍicrobiol.Ｌett.,168，319-324(1998)(非特許文献15)では、クロマチウム・ビノサム(Ｃhroｍatiuｍ vinosuｍ)由来のＰＨＢ合成酵素に３-ヒドロキシブチリルＣoＡを作用させることにより、３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニットからなるＰＨＢを合成することに成功している。
【００３３】
Ａppl.Ｍicrobiol.Ｂiotechnol.,54，37-43(2000)(非特許文献16)では、シュードモナス・アエルギノーサ(Ｐseudoｍonas aeruginosa)のＰＨＡ合成酵素に３-ヒドロキシデカノイルＣoＡを作用させることにより、３-ヒドロキシデカン酸ユニットからなるＰＨＡを合成している。
【００３４】
[他の先行文献等]
上記のほか、本願発明では下記特許文献35〜36、非特許文献17〜26の記載が援用されている。
【００３５】
【特許文献１】
特開平８-286416号公報
【特許文献２】
特開平９-292735号公報
【特許文献３】
特開平５-119531号公報
【特許文献４】
特開平５-249725号公報
【特許文献５】
特開平６-332225号公報
【特許文献６】
特開平９-43896号公報
【特許文献７】
特開平10-78676号公報
【特許文献８】
特開平11-7163号公報
【特許文献９】
特開2000-66444号公報
【特許文献１０】
特開2000-112174号公報
【特許文献１１】
特開2000-330321号公報
【特許文献１２】
特開昭59-221302号公報
【特許文献１３】
特公平４-3088号公報
【特許文献１４】
特公平５-10808号公報
【特許文献１５】
特開昭59-200254号公報
【特許文献１６】
特開昭59-200256号公報
【特許文献１７】
特開昭59-200257号公報
【特許文献１８】
特開昭59-224102号公報
【特許文献１９】
特開昭63-250660号公報
【特許文献２０】
特開平10-239897号公報
【特許文献２１】
特公昭60-3181号公報
【特許文献２２】
特開昭55-146786号公報
【特許文献２３】
特開平５-221112号公報
【特許文献２４】
特開平11-78221号公報
【特許文献２５】
特開2000-190631号公報
【特許文献２６】
特開平５-74492号公報
【特許文献２７】
特公平６-15604号公報
【特許文献２８】
特公平７-14352号公報
【特許文献２９】
特公平８-19227号公報
【特許文献３０】
特開平９-191893号公報
【特許文献３１】
特開平５-93049号公報
【特許文献３２】
特開平７-265065号公報
【特許文献３３】
特許第2642937号公報
【特許文献３４】
特許第2989175号公報
【特許文献３５】
特開2001-78753号公報
【特許文献３６】
特開2001-69968号公報
【非特許文献１】
Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,58，746(1992)
【非特許文献２】
Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,16(３),119(1994)
【非特許文献３】
Ｍacroｍolecules,24，5256-5260(1991)
【非特許文献４】
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.,191,1957-1965(1990)
【非特許文献５】
Ｃhirality,３，492-494(1991)
【非特許文献６】
Ｍacroｍolecules,29，1762-1766(1996)
【非特許文献７】
Ｍacroｍolecules,32，2889-2895(1999)
【非特許文献８】
Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,195，1665-1672(1994)
【非特許文献９】
Ｍacroｍolecules,29，3432-3435(1996)
【非特許文献１０】
Ｃan.Ｊ.Ｍicrobiol.,41，32-43(1995)
【非特許文献１１】
Ｍacroｍolecules,30，1611-1615(1997)
【非特許文献１２】
Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,92，6279-6283(1995)
【非特許文献１３】
Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,25，55-60(1999)
【非特許文献１４】
Ｍacroｍol.Ｒapid Ｃoｍｍun.,21，77-84(2000)
【非特許文献１５】
ＦＥＭＳ Ｍicrobiol.Ｌett.,168，319-324(1998)
【非特許文献１６】
Ａppl.Ｍicrobiol.Ｂiotechnol.,54，37-43(2000)
【非特許文献１７】
Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250,432-439(1997)
【非特許文献１８】
Ｊ.Ｂiol.Ｃheｍ.,218，97-106(1956)
【非特許文献１９】
Ｊ.Ｃheｍ.Ｓoc.,Ｐerkin.Ｔrans.1，806(1973)
【非特許文献２０】
Ｏrg.Ｓynth.,４，698(1963)
【非特許文献２１】
Ｊ.Ｏrg.Ｃheｍ.,46，19(1981)
【非特許文献２２】
Ｊ.Ａｍ.Ｃheｍ.Ｓoc.,81，4273(1959)
【非特許文献２３】
Ｍacroｍolecular cheｍistry,４，289-293(2001)
【非特許文献２４】
Ｊ.Ａｍer.Ｃheｍ.Ｓoc.,78，2278(1956)
【非特許文献２５】
Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,44，238-241(1982)
【非特許文献２６】
Ｍolecular Ｃloning,１，572,(1989); Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory出版
【００３６】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、生物工学的手法を高分子化合物の合成に適用することによって、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の合成や、新たな機能・構造の付与が可能になると期待されている。また、従来の有機合成化学的手法では多段階に渡る反応を要していた製造工程を、１段階の工程のみで実現できる場合も多くあり、製造プロセスの簡略化やコストダウン、所要時間の短縮等の効果も期待されている。さらに、有機溶剤や酸・アルカリ、界面活性剤等の使用削減、温和な反応条件の設定、非石油系原料や低純度原料のからの合成等が可能となり、より環境低負荷かつ資源循環型の合成プロセスの実現が可能となる。なお、低純度原料からの合成についてさらに詳しく説明すれば、生物工学的合成プロセスでは一般に、触媒である酵素の基質特異性が高いため、低純度の原料を用いても所望の反応を選択的に進めることが可能であり、よって、廃棄物やリサイクル原料等の使用も期待できる。
【００３７】
一方、前記の通り、本願発明者らは高分子化合物に大きな付加価値を与えるための要素技術として、高分子化合物で基材を被覆した構造体に着目してきた。このように高分子化合物で特定の基材を被覆することによって、極めて有用な機能性を有する複合構造体を得ることができる。前記の如き構造体を作出する試みは従来、有機合成的手法によって多くなされてきたが、該手法には一定の限界があった。
【００３８】
仮に、かかる構造体を前述のような生物工学的手法により製造することができれば、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の利用や、新たな機能・構造の付与が可能になると期待できるうえ、より環境低負荷かつ資源循環型の製造プロセスを低コストで実現できるものと考えられる。例えば、生物の触媒作用に特有の極めて厳密な分子認識能や立体選択性を利用して、従来の有機合成化学的手法では実現が困難であった新たな機能性高分子化合物や、極めてキラリティーの高い高分子化合物により被覆されたカプセル構造体や積層構造体を、極めて簡便かつ環境低負荷なプロセスで製造することが可能になる。
【００３９】
従って、本発明は、生物工学的手法により製造することのできる高機能な高分子化合物構造体を提供するものである。また本発明は、機能性複合構造体として広範囲に利用可能な、高分子化合物により基材を被覆した構造体の効率的な製造方法を提供するものである。
【００４０】
さらには、基材が磁性体である場合については、磁性を有する金属および金属化合物に親油化処理を施すことなく、均一分散性に優れる、磁性体を被覆した構造体ならびにその製造方法を提供するものである。
【００４１】
また、前述のように、従来の合成法により得られる磁性体含有カプセル構造体は、金属イオンの外部への溶出という課題を有するために、金属イオンの溶出による影響を受けない用途・分野にしか適用することができないのが現状である。本発明は、磁性体の分散性および磁気応答性に優れ、金属イオンが外部に溶出されにくく、種々の用途・分野に幅広く適用することのできる、磁性体を被覆したカプセル構造体ならびにその製造方法を提供するものである。
【００４２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、ＰＨＡ合成酵素を基材表面に固定化し、ここに３-ヒドロキシアシルＣoＡを加えて反応させることにより、基材表面に所望のＰＨＡを合成させ、基材をＰＨＡで被覆した構造体を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。また、該ＰＨＡに化学修飾を施すことにより、各種の特性等を改良した構造体を得ることができることを見出した。さらに詳しくは、例えば、該ＰＨＡにグラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたＰＨＡが、基材の少なくとも一部を被覆した構造体を得ることができることを見出した。また、該ＰＨＡを架橋化せしめることにより、所望の物理化学的性質(例えば、機械的強度、耐薬品性、耐熱性等)を備えたＰＨＡが、基材の少なくとも一部を被覆した構造体を得ることができることを見出した。なお、本発明における化学修飾(Ｃheｍical ｍodification)とは、高分子材料の分子内または分子間、あるいは高分子材料と他の化学物質との間で化学反応を行わせることにより、該高分子材料の分子構造を改変することを言う。また、架橋(crosslinking)とは、高分子材料の分子内または分子間を化学的にあるいは物理化学的に結合せしめて網状構造をつくることを言い、架橋剤(crosslinking agent)とは、前記架橋反応を行うために添加する、前記高分子材料と一定の反応性を有する物質を言う。
【００４３】
即ち本発明は、３−ヒドロキシアルカン酸ユニットを含有するポリヒドロキシアルカノエートが粒状の磁性体からなる基材の少なくとも一部を被覆していることを特徴とする構造体に関する。
【００４４】
また本発明は中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を粒状の磁性体からなる基材表面に固定し、該酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することにより、前記基材の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆することを特徴とする構造体の製造方法に関する。
【００４５】
また本発明は、粒状の磁性体からなる基材をコア（芯材料）とし、ｍｃｌ−ＰＨＡやｕｎｕｓｕａｌ−ＰＨＡを外被とするカプセル構造体に関し、さらに詳しくは、コアに着色剤を少なくとも含有していることを特徴とするカプセル構造体、該着色剤が顔料を少なくとも含有しているカプセル構造体、または、コアが顔料であるカプセル構造体に関する。
【００４６】
また本発明は、前記カプセル構造体からなる電子写真用カプセルトナーに関する。
【００４７】
さらに本発明は前記トナーを用いた画像形成方法、画像形成装置に関する。
【００４８】
より詳細には、
後述する化学式［１］から化学式［８］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートが粒状の磁性体からなる基材の少なくとも一部を被覆していることを特徴とする構造体に関する。
【００６４】
好ましくは、
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、化学修飾された構造体に関し、さらに、
前記の化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートが、少なくともグラフト鎖を有する構造体に関し、加えて、
前記グラフト鎖が、ハロゲン原子、ビニル基、エポキシ基あるいはカルボキシル基を有するモノマーユニットの少なくとも何れかを含むポリヒドロキシアルカノエートの化学修飾によるグラフト鎖である構造体に関する。
【００６５】
また好ましくは、
前記グラフト鎖が、チオール基、水酸基あるいはアミノ基の少なくとも何れかを有する化合物のグラフト鎖である構造体に関する。
【００６６】
別の好ましい形態としては、
前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートである構造体に関し、さらに、
前記の架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、ビニル基あるいはエポキシ基を有するモノマーユニットの少なくとも何れかを含むポリヒドロキシアルカノエートが架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートである構造体に関する。
【００６７】
さらに、好ましくは、
前記基材が着色剤を含有している構造体に関し、加えて、
前記着色剤が顔料である構造体に関し、または、
前記着色剤が染料である構造体に関する。
【００６８】
あるいは、前記磁性体が磁性を有する金属または金属化合物からなる構造体に関する。
【００７０】
さらに、好ましくは、
前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成が前記構造体の内側から外側に向かう方向において変化している構造体に関する。
【００７１】
さらに、好ましくは、
前記基材にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が固定されている構造体に関する。
【００７２】
加えて、
前記ポリヒドロキシアルカノエートの分子量が１，０００から１０，０００，０００である構造体に関する。
【００７３】
また、本発明は、
中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を基材表面に固定し、該酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することにより、前記基材の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆することを特徴とする構造体の製造方法において、前記ポリヒドロキシアルカノエートが、後述する化学式［１］から化学式［８］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートであり、前記ユニットのそれぞれに対して対応する３−ヒドロキシアシル補酵素Ａが順に後述する化学式［９］から化学式［１５］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａであり、前記ポリヒドロキシアルカノエートが、化学式［２］の構造においてＲ２がエポキシ基、ＣＯＯＲ２１（Ｒ２１：Ｈ原子、Ｎａ原子、Ｋ原子のいずれかを表す）からなる群から選ばれたいずれかのユニットを少なくとも含む場合は、化学式［２］の構造においてＲ２がビニル基であるユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートにより被覆された構造体の該ビニル基の酸化反応により、また、前記ポリヒドロキシアルカノエートが、化学式［７］および［８］の構造からなる群から選ばれたいずれかのユニットを少なくとも含む場合は、化学式［１５］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを少なくとも含んだ系での重合により得られる、後述する化学式［１６］に示すフェニルスルファニル基を有するユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートにより被覆された構造体の該フェニルスルファニル基の酸化反応による、構造体の製造方法に関する。
【０１０５】
好ましくは、
前記基材を被覆する前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部に化学修飾を施す工程をさらに有する構造体の製造方法に関し、さらに、
前記化学修飾を施す工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部にグラフト鎖を付加する工程である構造体の製造方法に関し、加えて、
前記グラフト鎖を付加する工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と、末端に反応性官能基を有する化合物とを反応させる工程である構造体の製造方法に関し、その上さらに、
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ハロゲン原子、ビニル基、エポキシ基あるいはカルボキシル基を有するモノマーユニットの少なくとも何れかを含むポリヒドロキシアルカノエートである構造体の製造方法に関する。
【０１０６】
また好ましくは、
前記末端に反応性官能基を有する化合物が、チオール基、水酸基あるいはアミノ基の少なくとも何れかを有する化合物である構造体の製造方法に関する。
【０１０７】
別の好ましい形態としては、
前記化学修飾を施す工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部を架橋化する工程である構造体の製造方法に関し、さらに、
前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ビニル基あるいはエポキシ基を有するモノマーユニットの少なくとも何れかを含むポリヒドロキシアルカノエートである構造体の製造方法に関する。
【０１０８】
また好ましくは、
前記架橋化工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と架橋剤とを反応させる工程である構造体の製造方法、または、
前記架橋化工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートに電子線を照射する工程である構造体の製造方法に関する。
【０１０９】
さらに、好ましくは、
前記基材は着色剤を含有する構造体の製造方法に関し、加えて、
前記着色剤は顔料を含有する構造体の製造方法、または、
前記着色剤は染料を含有する構造体の製造方法に関する。
【０１１０】
あるいは、
前記磁性体が磁性を有する金属または金属化合物からなる構造体の製造方法に関する。
【０１１２】
さらに、好ましくは、
前記３−ヒドロキシアシル補酵素Ａの組成を経時的に変化させることにより、前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成を前記構造体の内側から外側に向かう方向において変化させる構造体の製造方法に関する。
【０１１３】
また、好ましくは、
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該酵素の生産能を有する微生物を使って生産する構造体の製造方法に関し、または；
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該酵素の生産能に関与する遺伝子を導入した形質転換体により生産する構造体の製造方法に関し、さらに、
前記遺伝子はポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物から得られた遺伝子である構造体の製造方法に関する。
【０１１４】
さらに、好ましくは、
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物である構造体の製造方法に関し、さらに、
前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物が、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７３）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５、ＦＥＲＭＢＰ−７３７４）、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である構造体の製造方法に関する。
【０１１５】
あるいは、
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）に属する微生物である構造体の製造方法に関し、さらに、
前記バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＯＫ３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７０）、バークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＯＫ４、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７１）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である構造体の製造方法に関する。
【０１１６】
さらに、好ましくは、
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する形質転換体の宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である構造体の製造方法に関する。
【０１１７】
また、本発明は、
前記構造体を含むトナー、あるいは、
前記構造体からなるトナーに関する。
【０１１８】
さらに、本発明は、
前記粒状の構造体を製造する工程を含む、トナーの製造方法に関する。
【０１１９】
またさらに、本発明は、
前記トナーを被記録媒体に付与することで画像を形成する画像形成方法、並びに、
前記トナーを被記録媒体に付与することで画像を形成する画像形成装置に関する。
【０１２０】
【発明の実施の形態】
本発明の構造体は、置換基を側鎖に有する多様な構造のモノマーユニットを含むＰＨＡにより基材が被覆された形態を有する構造体であり、電子写真用カプセルトナーや記録媒体等の高機能性構造体として極めて有用である。また、基材が磁性体の場合は、磁性体が被覆された形態を有する構造体であり、細菌、細胞、核酸、蛋白質、その他生体物質の分離精製あるいはスクリーニング用担体、生体中での移動を制御できる医療診断薬担体、薬剤を患者の疾患部に移動させるドラックデリバリー担体、固定化酵素担体、磁性トナー、磁性インク、磁性塗料、磁気記録媒体等の各種機能性構造体として極めて有用である。
【０１２１】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【０１２２】
＜ＰＨＡ＞ 本発明に利用可能なＰＨＡとしては、ｍcl-ＰＨＡの合成反応に関与するＰＨＡ合成酵素によって合成され得るＰＨＡ(即ち、各種のｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡ等)である。前述の通り、ＰＨＡ合成酵素は、生物体内でのＰＨＡ合成反応系における最終段階を触媒する酵素であり、従って、生物体内において合成され得ることが知られているＰＨＡであれば、いずれも該酵素による触媒作用を受けて合成されていることになる。よって、所望のＰＨＡに対応する３-ヒドロキシアシルＣoＡを、本発明における基材に固定化された該酵素に作用させることによって、生物体内において合成され得ることが知られているＰＨＡで基材を被覆した構造体を作成することが可能である。
【０１２３】
このようなＰＨＡとして、具体的には、下記化学式[１]から[８]で表されるモノマーユニットを少なくとも含むＰＨＡを例示することができる。
【０１２４】
【化５１】
Figure 0004579502
【０１２５】
(ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびaの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。Ｒ１がビニル基でありaが１から10の整数のいずれかであるモノマーユニットである。)
【０１２６】
【化５２】
Figure 0004579502
【０１２７】
(ただし、式中bは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ビニル基、エポキシ基、ＣＯＯＲ21(Ｒ21:Ｈ原子、Ｎa原子、Ｋ原子のいずれかを表す)からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。)
【０１２８】
【化５３】
Figure 0004579502
【０１２９】
(ただし、式中cは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。)
【０１３０】
【化５４】
Figure 0004579502
【０１３１】
(ただし、式中dは０から８の整数のいずれかを表し、Ｒ４は、dが０の場合、Ｈ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基からなる群から選ばれ、dが１-８の場合、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。)
【０１３２】
【化５５】
Figure 0004579502
【０１３３】
(ただし、式中eは１から８の整数のいずれかを表す。)
【０１３４】
【化５６】
Figure 0004579502
【０１３５】
(ただし、式中fは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ６はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。)
【０１３６】
【化５７】
Figure 0004579502
【０１３７】
(ただし、式中gは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ71、ＳＯ2Ｒ72(Ｒ71:Ｈ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ72:ＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。)
【０１３８】
【化５８】
Figure 0004579502
【０１３９】
(ただし、式中gは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ71、ＳＯ2Ｒ72(Ｒ71:Ｈ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ72:ＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合、ユニット毎に独立して上記の意味を表す。)
本発明において用いられるＰＨＡとしては上記モノマーユニットを複数含むランダム共重合体やブロック共重合体を用いることも可能であり、各モノマーユニットや含まれる官能基の特性を利用したＰＨＡの物性制御や複数の機能の付与、官能基間の相互作用を利用した新たな機能の発現等が可能となる。
【０１４０】
さらに、基質である３-ヒドロキシアシルＣoＡの種類や濃度等の組成を経時的に変化させることによって、構造体の形状が粒状であれば内側から外側に向かう方向に、構造体の形状が平面状であれば垂直方向に、ＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることも可能である。
【０１４１】
これによって、例えばカプセルトナーの場合、ガラス転移温度の高いＰＨＡをトナー表層に、ガラス転移温度の低いＰＨＡをそれより内側の層に形成させることで、保存時には耐ブロッキング性に優れ、定着時には低温定着性に優れる等の複数の機能を同時に保有させることが可能となる。
【０１４２】
また例えば、基材と親和性の低いＰＨＡで被覆構造体を形成する必要がある場合、まず基材を基材と親和性の高いＰＨＡで被覆し、その基材と親和性の高いＰＨＡのモノマーユニット組成を、目的とするＰＨＡのモノマーユニット組成に、内側から外側に向かう方向もしくは垂直方向に変化、例えば多層構造あるいはグラディエント構造とすることで、基材との結合を強固にしたＰＨＡ被膜を形成することが可能となる。
【０１４３】
また、３-ヒドロキシプロピオン酸ユニット,３-ヒドロキシ-n-酪酸ユニット,３-ヒドロキシ-n-吉草酸ユニット,４-ヒドロキシ-n-酪酸ユニット等は、それらのみからなるＰＨＡとしてはｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡには該当しないが、これらのモノマーユニットが先に例示したようなモノマーユニット中に混在しているＰＨＡについては、本発明において利用可能である。また必要に応じて、ＰＨＡを合成したのち、あるいは、合成中に、さらに化学修飾等を施しても良い。ＰＨＡの分子量は、数平均分子量で1,000から1,000万程度、仮に該構造体を電子写真用カプセルトナーとして使用する場合は3,000から100万程度とするのが望ましい。
【０１４４】
なお、本発明の構造体に用いる、ＰＨＡ合成酵素により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【０１４５】
＜３-ヒドロキシアシルＣoＡ＞ 本発明のＰＨＡ合成酵素の基質として用いる３-ヒドロキシアシルＣoＡとして、具体的には、下記化学式[９]から[15]で表される３-ヒドロキシアシルＣoＡを例示することができる。
【０１４６】
【化５９】
Figure 0004579502
【０１４７】
(ただし、前記化学式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、aは前記化学式[１]で表されるモノマーユニットにおけるaと対応する１から10の整数のいずれかを表し、Ｒ１はビニル基である。)
【０１４８】
【化６０】
Figure 0004579502
【０１４９】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、bは前記化学式[２]で表されるモノマーユニットにおけるbと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は前記化学式[２]で表されるモノマーユニットにおけるＲ２と対応する、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ビニル基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【０１５０】
【化６１】
Figure 0004579502
【０１５１】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、cは前記化学式[３]で表されるモノマーユニットにおけるcと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は前記化学式[３]で表されるモノマーユニットにおけるＲ３と対応する、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【０１５２】
【化６２】
Figure 0004579502
【０１５３】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、dは前記化学式[４]で表されるモノマーユニットにおけるdと対応する０から８の整数のいずれかを表し、Ｒ４は前記化学式[４]で表されるモノマーユニットにおけるＲ４と対応し、dが０の場合、Ｈ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基からなる群から選ばれ、dが１-８の場合、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【０１５４】
【化６３】
Figure 0004579502
【０１５５】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、eは前記化学式[５]で表されるモノマーユニットにおけるeと対応する１から８の整数のいずれかを表す。)
【０１５６】
【化６４】
Figure 0004579502
【０１５７】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、fは前記化学式[６]で表されるモノマーユニットにおけるfと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ６は前記化学式[６]で表されるモノマーユニットにおけるＲ６と対応する、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
【０１５８】
【化６５】
Figure 0004579502
【０１５９】
(ただし、式中-ＳＣoＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、gは前記化学式[７]および[８]で表されるモノマーユニットにおけるgと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７は前記化学式[７]および[８]で表されるモノマーユニットにおけるＲ７と対応する、Ｈ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ71、ＳＯ2Ｒ72(Ｒ71:Ｈ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ72:ＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。)
これらの３-ヒドロキシアシルＣoＡは、例えば、酵素を用いたin vitro合成法、微生物や植物等の生物体を用いたin vivo合成法、化学合成法等の中から適宜選択した方法で合成して用いることができる。特に、酵素合成法は該基質の合成に一般に用いられている方法であり、市販のアシルＣoＡシンセターゼ(アシルＣoＡリガーゼ、Ｅ.Ｃ.6.2.1.3)を用いた下記反応、
Figure 0004579502
を用いた方法等が知られている(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (非特許文献17)、Ａppl.Ｍicrobiol.Ｂiotechnol.,54,37-43(2000) (前記・非特許文献16)等)。酵素や生物体を用いた合成工程には、バッチ式の合成方法を用いても良く、また、固定化酵素や固定化細胞を用いて連続生産してもよい。
【０１６０】
＜酸化反応によるＰＨＡ構造の変換＞ また、本発明のＰＨＡが、化学式[２]の構造においてＲ２がエポキシ基、ＣＯＯＲ21(Ｒ21:Ｈ原子、Ｎa原子、Ｋ原子のいずれかを表す)からなる群から選ばれたいずれかのユニットを少なくとも含む場合は、化学式[２]の構造においてＲ２がビニル基であるユニットを少なくとも含むＰＨＡにより被覆された構造体の該ビニル基の酸化反応により、該ＰＨＡで被覆された構造体を得ることができる。
【０１６１】
また、本発明のＰＨＡが、化学式[７]および[８]の構造からなる群から選ばれたいずれかのユニットを少なくとも含む場合は、化学式[15]に示す３-ヒドロキシアシル補酵素Ａを少なくとも含んだ系での重合により得られる、下記化学式[16]に示すフェニルスルファニル基を有するユニットを少なくとも含むＰＨＡにより被覆された構造体の該フェニルスルファニル基の酸化反応により、該ＰＨＡで被覆された構造体を得ることができる。
【０１６２】
【化６６】
Figure 0004579502
【０１６３】
(ただし、式中gは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ71、ＳＯ2Ｒ72(Ｒ71:Ｈ、Ｎa、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ72:ＯＨ、ＯＮa、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す)、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、(ＣＨ3)2-ＣＨ基または(ＣＨ3)3-Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。)
＜ＰＨＡ合成酵素およびその生産菌＞ 本発明に用いるＰＨＡ合成酵素は、該酵素を生産する微生物から適宜選択された微生物、あるいは、それら微生物のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体により生産されたものを用いることができる。
【０１６４】
ＰＨＡ合成酵素を生産する微生物としては、例えば、ｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡの生産菌を用いることができ、このような微生物として、前述のシュードモナス・オレオボランス,シュードモナス・レジノボランス,シュードモナス属61-３株,シュードモナス・プチダ・ＫＴ2442株,シュードモナス・アエルギノーサ等のほかに、本発明者らにより分離された、シュードモナス・プチダ・Ｐ91株(Ｐseudoｍonas putida Ｐ91),シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株(Ｐseudoｍonas cichorii Ｈ45),シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株(Ｐseudoｍonas cichorii ＹＮ２),シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株(Ｐseudoｍonas jessenii Ｐ161)等のシュードモナス属微生物や、特開2001-78753号公報(特許文献35)に記載のバークホルデリア属・ＯＫ３株(Ｂurkholderia sp.ＯＫ３、ＦＥＲＭ Ｐ-17370),特開2001-69968号公報(特許文献36)に記載のバークホルデリア属・ＯＫ４株(Ｂurkholderia sp.ＯＫ４、ＦＥＲＭＰ-17371)等のバークホルデリア属微生物を用いることができる。また、これら微生物に加えて、アエロモナス属(Ａeroｍonas sp.),コマモナス属(Ｃoｍaｍonas sp.)等に属し、ｍcl-ＰＨＡやunusual-ＰＨＡを生産する微生物を用いることも可能である。
【０１６５】
なお、Ｐ91株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7373として、Ｈ45株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7374として、ＹＮ２株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7375として、Ｐ161株は寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-7376として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(経済産業省産業技術総合研究所(旧通商産業省工業技術院)生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター)に国際寄託されている。
【０１６６】
なお、前記のＰ91株,Ｈ45株,ＹＮ２株およびＰ161株の菌学的性質を列挙すれば以下の通りである。また、Ｐ161株については、16Ｓ rＲＮＡの塩基配列を配列番号:１に示す。
【０１６７】
(シュードモナス・プチダ・Ｐ91株の菌学的性質)
(１)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.6μｍ×1.5μｍ
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、
表層なめらか、光沢、クリーム色
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing's Ｂ寒天での蛍光色素産生 :陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性。
【０１６８】
(シュードモナス・チコリアイ・Ｈ45株の菌学的性質)
(１)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.0〜1.2μｍ
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、
表層なめらか、光沢、クリーム色
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陰性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生 :陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陰性
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陰性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性。
【０１６９】
(シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株の菌学的性質)
(１)形態学的性質
細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ
細胞の多形性 :なし
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、
表層なめらか、光沢、半透明
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陰性
インドールの生成 :陽性
ブドウ糖酸性化 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing's Ｂ寒天での蛍光色素産生 :陽性
４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育)
ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性
Ｔｗeen 80の加水分解 :陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陰性
Ｄ-マンニトール :陰性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性。
【０１７０】
(シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ161株の菌学的性質)
(１)形態学的性質
細胞の形と大きさ :球状 φ0.6μｍ、
桿状 0.6μｍ×1.5〜2.0μｍ
細胞の多形性 :あり(伸長型)
運動性 :あり
胞子形成 :なし
グラム染色性 :陰性
コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、
表層なめらか、淡黄色
(２)生理学的性質
カタラーゼ :陽性
オキシダーゼ :陽性
Ｏ/Ｆ試験 :酸化型
硝酸塩の還元 :陽性
インドールの生成 :陰性
アルギニンジヒドロラーゼ :陽性
ウレアーゼ :陰性
エスクリン加水分解 :陰性
ゼラチン加水分解 :陰性
β-ガラクトシダーゼ :陰性
Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生 :陽性
(３)基質資化能
ブドウ糖 :陽性
Ｌ-アラビノース :陽性
Ｄ-マンノース :陽性
Ｄ-マンニトール :陽性
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性
マルトース :陰性
グルコン酸カリウム :陽性
n-カプリン酸 :陽性
アジピン酸 :陰性
dl-リンゴ酸 :陽性
クエン酸ナトリウム :陽性
酢酸フェニル :陽性。
【０１７１】
本発明にかかるＰＨＡ合成酵素の生産に用いる微生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡ合成酵素の生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増殖等には、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有する培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培地(肉汁培地,酵母エキス等)や、栄養源を添加した合成培地等、いかなる種類の培地をも用いることができる。
【０１７２】
培養は液体培養や固体培養等、該微生物が増殖する方法であればいかなる方法をも用いることができる。さらに、バッチ培養,フェドバッチ培養,半連続培養,連続培養等の種類も問わない。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコによって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファーメンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。また、これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよい。
【０１７３】
前記したようなＰＨＡ生産微生物を用いて、ＰＨＡ合成酵素を生産する場合は、例えば、オクタン酸やノナン酸等のアルカン酸を含む無機培地で該微生物を増殖させ、対数増殖期から定常期初期にかけての微生物を遠心分離等で回収して所望の酵素を抽出する方法等を用いることができる。なお、上記のような条件で培養を行うと、添加したアルカン酸に由来するｍcl-ＰＨＡが菌体内に合成されることになるが、この場合、一般に、ＰＨＡ合成酵素は菌体内に形成されるＰＨＡの微粒子に結合して存在するとされている。しかし、本発明者らの検討によると、上記の方法で培養した菌体の破砕液を遠心分離した上清液にも、相当程度の酵素活性が存在していることがわかっている。これは、前記の如き対数増殖期から定常期初期にかけての比較的培養初期には、菌体内で該酵素が活発に生産され続けているため、遊離状態のＰＨＡ合成酵素も相当程度存在するためと推定される。
【０１７４】
上記の培養方法に用いる無機培地としては、リン源(例えば、リン酸塩等)、窒素源(例えば、アンモニウム塩,硝酸塩等)など、微生物が増殖し得る成分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地,Ｅ培地(Ｊ.Ｂiol.Ｃheｍ.,218，97-106(1956)(非特許文献18)),Ｍ９培地等を挙げることができる。なお、本発明における実施例で用いるＭ９培地の組成は以下の通りである。
[Ｍ９培地]
Ｎa2ＨＰＯ4 ： 6.2 g
ＫＨ2ＰＯ4 ： 3.0 g
ＮaＣl ： 0.5 g
ＮＨ4Ｃl ： 1.0 g
(培地１リットル中、pＨ 7.0)。
【０１７５】
さらに、良好な増殖及びＰＨＡ合成酵素の生産のためには、上記の無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を0.3％(v/v)程度添加するのが好ましい。
(微量成分溶液)
ニトリロ三酢酸: 1.5 g
ＭgＳＯ4 ： 3.0 g
ＭnＳＯ4 ： 0.5 g
ＮaＣl ： 1.0 g
ＦeＳＯ4 ： 0.1 g
ＣaＣl2 ： 0.1 g
ＣoＣl2 ： 0.1 g
ＺnＳＯ4 ： 0.1 g
ＣuＳＯ4 ： 0.1 g
ＡlＫ(ＳＯ4)2 ： 0.1 g
Ｈ3ＢＯ3 ： 0.1 g
Ｎa2ＭoＯ4 ： 0.1 g
ＮiＣl2 ： 0.1 g
(１リットル中)。
【０１７６】
培養温度としては上記の菌株が良好に増殖可能な温度であれば良く、例えば 14〜40℃、好ましくは 20〜35℃程度が適当である。
【０１７７】
また、前述のＰＨＡ生産菌の持つＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入した形質転換体を用いて、所望のＰＨＡ合成酵素を生産することも可能である。ＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニング、発現ベクターの作製、および、形質転換体の作製は、定法に従って行うことができる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換体においては、培養に用いる培地として、天然培地あるいは合成培地、例えば、ＬＢ培地,Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は25から37℃の範囲で、好気的に８〜27時間培養することにより、微生物の増殖を図る。その後集菌し、菌体内に蓄積されたＰＨＡ合成酵素の回収を行うことができる。培地には、必要に応じて、カナマイシン,アンピシリン,テトラサイクリン,クロラムフェニコール,ストレプトマイシン等の抗生物質を添加しても良い。また、発現ベクターにおいて、誘導性のプロモーターを用いている場合は、形質転換体を培養する際に、該プロモーターの対応する誘導物質を培地に添加して発現を促しても良い。例えば、イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ),テトラサイクリン,インドールアクリル酸(ＩＡＡ)等が誘導物質として挙げられる。
【０１７８】
ＰＨＡ合成酵素としては、微生物の菌体破砕液や、硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を沈殿・回収した硫安塩析物等の粗酵素を用いても良く、また、各種方法で精製した精製酵素を用いても良い。該酵素には必要に応じて、金属塩,グリセリン,ジチオスレイトール,ＥＤＴＡ,ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)等の安定化剤,付活剤を適宜添加して用いることができる。
【０１７９】
ＰＨＡ合成酵素の分離・精製方法は、ＰＨＡ合成酵素の酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。例えば、得られた微生物菌体を、フレンチプレス,超音波破砕機,リゾチームや各種界面活性剤等を用いて破砕したのち、遠心分離して得られた粗酵素液、またはここから調製した硫安塩析物について、アフィニティクロマトグラフィー,陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー,ゲルろ過等の手段を単独または適宜組み合わせることによって精製酵素を得ることができる。特に、遺伝子組換えタンパク質は、Ｎ末端やＣ末端にヒスチジン残基等の「タグ」を結合した融合タンパク質の形で発現させ、このタグを介して親和性樹脂に結合させることによって、より簡便に精製することができる。融合タンパク質から目的のタンパク質を分離するには、トロンビン,血液凝固因子Ｘa等のプロテアーゼで切断する、pＨ を低下せしめる、結合競合剤として高濃度のイミダゾールを添加する等の方法を用いると良い。あるいは、発現ベクターとしてpＴＹＢ１(Ｎeｗ Ｅngland Ｂiolab社製)を用いた場合のようにタグがインテインを含む場合はdithiothreitol等で還元条件として切断する。アフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とする融合タンパク質には、ヒスチジンタグの他にグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ),キチン結合ドメイン(ＣＢＤ),マルトース結合タンパク(ＭＢＰ),あるいはチオレドキシン(ＴＲＸ)等も公知である。ＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ親和性レジンによって精製することができる。
【０１８０】
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、既報の各種方法を用いることができるが、例えば、３-ヒドロキシアシルＣoＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣoＡを、５,５’-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定することができる。試薬１:ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)を0.1ｍol/L トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に3.0 ｍg/ｍl溶解、試薬２:３-ヒドロキシオクタノイルＣoＡを0.1ｍol/L トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に3.0ｍｍol/L溶解、試薬３:トリクロロ酢酸を0.1ｍol/L トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に10 ｍg/ｍl溶解、試薬４:５,５’-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)を0.1ｍol/L トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)に2.0ｍｍol/L溶解。第１反応(ＰＨＡ合成反応):試料(酵素)溶液100μlに試薬１を100μl添加して混合し、30℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を100μl添加して混合し、30℃で１〜30分間インキュベートしたのち、試薬３を添加して反応を停止させる。第２反応(遊離ＣoＡの発色反応):反応停止した第１反応液を遠心分離(15,000×g、10分間)し、この上清500μlに試薬４を500μl添加し、30℃で10分間インキュベートしたのち、412nｍの吸光度を測定する。酵素活性の算出:１分間に１μｍolのＣoＡを放出させる酵素量を１単位(Ｕ)とする。
【０１８１】
なお、該酵素により合成されるＰＨＡは、一般にＲ体のみから構成されるアイソタクチックなポリマーである。
【０１８２】
＜基材＞
基材としては、ＰＨＡ合成酵素を固定化することのできるものであれば、一般的な高分子化合物や無機系固形物、例えば、樹脂，ガラス，金属等から適宜選択して用いることができる。また、ＰＨＡ合成酵素の固定化方法や、作製した構造体の応用の形態等に応じて、基材の種類や構造を適宜選択して用いることができる。基材用の各種材料を以下に例示するが、本発明では、基材として粒状の磁性体が用いられる。
【０１８３】
例えば、本発明のカプセル構造体における基材(コア)として、スチレン,α-メチルスチレン,β-メチルスチレン,o-メチルスチレン,ｍ-メチルスチレン,p-メチルスチレン,２,４-ジメチルスチレン,p-n-ブチルスチレン,p-tert-ブチルスチレン,p-n-ヘキシルスチレン,p-n-オクチルスチレン,p-n-ノニルスチレン,p-n-デシルスチレン,p-n-ドデシルスチレン,p-メトキシスチレン,p-フェニルスチレン等のスチレン系重合性モノマー、メチルアクリレート,エチルアクリレート,n-プロピルアクリレート,iso-プロピルアクリレート,n-ブチルアクリレート,iso-ブチルアクリレート,tert-ブチルアクリレート,n-アミルアクリレート,n-ヘキシルアクリレート,２-エチルヘキシルアクリレート,n-オクチルアクリレート,n-ノニルアクリレート,シクロヘキシルアクリレート,ベンジルアクリレート,ジメチルフォスフェートエチルアクリレート,ジエチルフォスフェートエチルアクリレート,ジブチルフォスフェートエチルアクリレート,２-ベンゾイルオキシエチルアクリレート等のアクリル系重合性モノマー、メチルメタクリレート,エチルメタクリレート,n-プロピルメタクリレート,iso-プロピルメタクリレート,n-ブチルメタクリレート,iso-ブチルメタクリレート,tert-ブチルメタクリレート,n-アミルメタクリレート,n-ヘキシルメタクリレート,２-エチルヘキシルメタクリレート,n-オクチルメタクリレート,n-ノニルメタクリレート,ジエチルフォスフェートエチルメタクリレート,ジブチルフォスフェートエチルメタクリレート等のメタクリル系重合性モノマー、メチレン脂肪族モノカルボン酸エステル類,酢酸ビニル,プロピオン酸ビニル,ベンゾエ酸ビニル,酪酸ビニル,安息香酸ビニル,ギ酸ビニル等のビニルエステル類、ビニルメチルエーテル,ビニルエチルエーテル,ビニルイソブチルエーテル等のビニルエーテル類、ビニルメチルケトン,ビニルヘキシルケトン,ビニルイソプロピルケトン等のビニルケトン類等のビニル系重合性モノマー、からなる群より選択された重合性モノマーを重合させて製造された樹脂微粒子、あるいは、上記モノマー系に極性基重合体や着色剤等の各種添加剤を添加して製造された樹脂微粒子、パラフィンワックス,ポリオレフィンワックス,フィッシャートロピッシュワックス,アミドワックス,高級脂肪酸,エステルワックス及びこれらの誘導体又はこれらのグラフトまたはブロック化合物等を含有する微粒子、カオリナイト,ベントナイト,タルク,雲母等の粘土鉱物、アルミナ,二酸化チタン等の金属酸化物、シリカゲル,ヒドロキシアパタイト,リン酸カルシウムゲル等の不溶性無機塩、カーボンブラック,酸化銅,二酸化マンガン,アニリンブラック,活性炭,非磁性フェライト,マグネタイト等の黒色顔料、黄鉛,亜鉛黄,黄色酸化鉄,カドミウムイエロー,ミネラルファストイエロー,ニッケルチタンイエロー,ネーブルスイエロー,ナフトールイエローＳ,ハンザイエローＧ,ハンザイエロー10Ｇ,ベンジジンイエローＧ,ベンジジンイエローＧＲ,キノリンイエローレーキ,パーマネントイエローＮＣＧ,タートラジンレーキ等の黄色顔料、赤色黄鉛,モリブデンオレンジ,パーマネントオレンジＧＴＲ,ピラゾロンオレンジ,バルカンオレンジ,ベンジジンオレンジＧ,インダスレンブリリアントオレンジＲＫ,インダスレンブリリアントオレンジＧＫ等の橙色顔料、ベンカラ,カドミウムレッド鉛丹,硫化水銀,カドミウム,パーマネントレッド４Ｒ,リソールレッド,ピラゾロンレッド,ウォッチングレッド,カルシウム塩,レーキレッドＣ,レーキレッドＤ,ブリリアントカーミン６Ｂ,ブリリアントカーミン３Ｂ,エオキシンレーキ,ローダミンレーキＢ,アリザリンレーキ等の赤色顔料、紺青,コバルトブルー,アルカリブルーレーキ,ビクトリアブルーレーキ,フタロシアニンブルー,無金属フタロシアニンブルー,フタロシアニンブルー一部分塩素化合物,ファーストスカイブルー,インダスレンブルーＢＣ等の青色顔料、マンガン紫,ファストバイオレットＢ,メチルバイオレットレーキ等の紫色顔料、酸化クロム,クロムグリーン,ピグメントグリーンＢ,マラカイトグリーンレーキ,ファイナルイエローグリーンＧ等の緑色顔料、亜鉛華,酸化チタン,アンチモン白,硫化亜鉛等の白色顔料、バライト粉,炭酸バリウム,クレー,シリカ,ホワイトカーボン,タルク,アルミナホワイト等の体質顔料等を用いることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。コアの形状は、その用途に応じて適宜選択可能であるが、例えば、粒径1.0nｍから1.0ｍｍ の範囲内の粒径を有する粒子を用いると良い。さらに、該構造体を電子写真用のカプセルトナーとして用いる場合には、その粒径を3.0μｍから10μｍの範囲内で選択するとよい。
【０１８４】
また、本発明の基材に用いる磁性体としては、ＰＨＡ合成酵素を固定化することのできるものであれば、何れについても適宜選択して用いることができる。また、ＰＨＡ合成酵素の固定化方法や、作製した構造体の応用の形態等に応じて、磁性体の種類や構造を適宜選択して用いることができる。
【０１８５】
本発明の構造体を構成する磁性体としては、例えば、磁性を有する金属または金属化合物が挙げられ、さらに具体的には、四三酸化鉄(Ｆe3Ｏ4)、γ-重三二酸化鉄(γ-Ｆe2Ｏ3)、ＭnＺnフェライト、ＮiＺnフェライト、ＹＦeガーネット、ＧaＦeガーネット、Ｂaフェライト、Ｓrフェライト等各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル、クロム等の金属、鉄、マンガン、コバルト、ニッケル等の合金を挙げることができ、これらに限定されるものではない。ここで、例えば生体物質を固定する場合、あるいは生体内に投与する場合等については、生体に対する適合性の良好なマグネタイト(Ｆe3Ｏ4)のほか、必要に応じてマグネタイトの金属元素の一部を少なくとも１種類の他の金属元素で置換した各種フェライト組成等が好適に適用可能である。これら磁性体の形状は、生成条件によって変化し、多面体、８面体、６面体、球状、棒状、燐片状等等があるが、異方性の少ない構造が機能の安定発現のためにはより好ましい。本発明の構造体を構成する磁性体の一次粒子の粒子径は、その用途に応じて適宜選択可能であるが、例えば、0.001〜10μｍの範囲内の粒径を有する粒子を用いると良い。
【０１８６】
また、本発明の磁性体としては、超常磁性を有するものについても好ましく用いることができる。例えば、フェライトの粒子径が20nｍ程度以下と小さい場合には、フェライトは熱擾乱影響を受け超常磁性を示すようになり、残留磁化や保磁力を持たなくなる。超常磁性であっても磁界を印加することにより磁気的操作が可能であり、また超常磁性であれば残留磁化や保磁力を持たないので、磁界のないときに磁気的な凝集の生じるおそれがない。
【０１８７】
また、磁性体は金属または金属化合物を含むマトリックス等のような複合材料であってもよく、マトリックスは有機または無機の各種材料から構成されるものである。
【０１８８】
その他、粒子表面を脂肪酸で被覆する方法、シランカップリング剤処理に代表される各種カップリング剤処理を行う方法等、各種手法により疎水化処理を行った磁性体についても、本発明の磁性体として利用することができる。
【０１８９】
なお、参考までに、基材としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ），ジアセテート，トリアセテート，セロハン，セルロイド，ポリカーボネート，ポリイミド，ポリビニルクロライド，ポリビニリデンクロライド，ポリアクリレート，ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリエステル等のプラスチックからなるフィルム、ポリビニルクロライド，ポリビニルアルコール，アセチルセルロース，ポリカーボネート，ナイロン，ポリプロピレン，ポリエチレン，テフロン（登録商標）等からなる多孔性高分子膜、木板、ガラス板、木綿，レーヨン，アクリル，絹，ポリエステル等の布、上質紙，中質紙，アート紙，ボンド紙，再生紙，バライタ紙，キャストコート紙，ダンボール紙，レジンコート紙等の紙を用いることができる。なお、前記基材の表面が滑らかなものであっても、凹凸のついたものであっても良いし、透明、半透明、不透明のいずれであっても良い。また、これら前記基材の中より２種類以上を互いに張り合わせたものであっても良い。
【０１９０】
また、積層構造体の基材として上に挙げた磁性体を利用することが可能であり、磁性体は金属または金属化合物を含むマトリックス等のような複合材料であってもよく、マトリックスは有機または無機の各種材料から構成されるものである。
【０１９１】
＜構造体の作製＞ 本発明の構造体の製造方法には、基材にＰＨＡ合成酵素を固定化する工程と、該固定化ＰＨＡ合成酵素に３-ヒドロキシアシルＣoＡを反応させてＰＨＡを合成させる工程とを含むものである。
【０１９２】
基材にＰＨＡ合成酵素を固定化する方法としては、該酵素の活性が保持され得るものであり、かつ、所望の基材において適用可能なものであれば、通常行われている酵素固定化方法の中から任意に選択して用いることができる。例えば、共有結合法,イオン吸着法,疎水吸着法,物理的吸着法,アフィニティ吸着法,架橋法,格子型包括法等を例示することができるが、特にイオン吸着や疎水吸着を利用した固定化方法が簡便である。
【０１９３】
ＰＨＡ合成酵素等の酵素タンパク質は、アミノ酸が多数結合したポリペプチドであり、リシン,ヒスチジン,アルギニン,アスパラギン酸,グルタミン酸等の遊離のイオン性基を有するアミノ酸によってイオン吸着体としての性質を示し、またアラニン,バリン,ロイシン,イソロイシン,メチオニン,トリプトファン,フェニルアラニン,プロリン等の遊離の疎水性基を有するアミノ酸によって、また有機高分子であるという点で疎水吸着体としての性質を有している。従って、程度の差はあるが、イオン性や疎水性、もしくはイオン性と疎水性の両方の性質を有する固体表面に吸着させることが可能である。
【０１９４】
主にイオン吸着法によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法では、イオン性官能基を表面に発現しているコアを用いれば良く、例えば、カオリナイト,ベントナイト,タルク,雲母等の粘土鉱物、アルミナ,二酸化チタン等の金属酸化物、シリカゲル,ヒドロキシアパタイト,リン酸カルシウムゲル等の不溶性無機塩等をコアとして用いることができる。また、これらを主要な成分とする無機顔料,イオン交換樹脂,キトサン,ポリアミノポリスチレン等の、イオン性官能基を有する重合体もイオン吸着性コアとして用いることができる。
【０１９５】
本発明において基材が磁性体の場合、例えばフェライト等の金属酸化物においては表面に水酸基が存在しており、ＰＨＡ合成酵素表面のカルボキシル基との水素結合による固定化法等が好適に用いうる。
【０１９６】
また、主に疎水吸着によってＰＨＡ合成酵素を固定化する方法では、表面が非極性であるコアを用いればよく、例えば、スチレン系ポリマー,アクリル系ポリマー,メタクリル系ポリマー,ビニルエステル類,ビニル系ポリマー等、イオン性官能基を表面に発現していない、もしくは疎水性官能基を表面に発現している多くの重合体をコアとして用いることができる。芳香環を複数有するアゾ顔料や縮合多環のフタロシアニン系顔料,アントラキノン系顔料等の有機顔料,カーボンブラック等は疎水吸着性である。また、親油化処理を施した磁性体にも用いることが可能である。
【０１９７】
イオン吸着法または疎水吸着法によるＰＨＡ合成酵素のコアへの固定化は、該酵素とコアとを所定の反応液中で混合することによって達成される。このとき、該酵素がコアの表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【０１９８】
反応液のpＨ や塩濃度、温度によってコアおよびＰＨＡ合成酵素の表面電荷の正負や電荷量、疎水性が変化するので、用いるコアの性質に合わせて、酵素活性上許容される範囲内で溶液の調整を行うことが望ましい。例えば、コアが主にイオン吸着性である場合には、塩濃度を下げることにより、コアとＰＨＡ合成酵素との吸着に寄与する電荷量を増やすことができる。また、pＨ を変える事により、両者の反対電荷を増やすことができる。コアが主に疎水吸着性である場合には、塩濃度を上げることによって両者の疎水性を増やすことができる。また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、コアやＰＨＡ合成酵素の荷電状態や疎水性を調べることで、吸着に適した溶液条件を設定をすることもできる。さらに、コアとＰＨＡ合成酵素との吸着量を直接測定して条件を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、コアが分散された溶液に濃度既知のＰＨＡ合成酵素溶液を添加し、吸着処理を行った後、溶液中のＰＨＡ合成酵素濃度を測定し、差し引き法により吸着酵素量を求める等の方法を用いればよい。
【０１９９】
イオン吸着法や疎水吸着法によって酵素を固定化し難いコア材質の場合は、操作の煩雑さや酵素の失活の可能性を考慮すれば共有結合法によってもかまわない。例えば、芳香族アミノ基を有する固体粒子をジアゾ化し、これに酵素をジアゾカップリングする方法や、カルボキシル基,アミノ基を有する固体粒子と酵素の間にペプチド結合を形成させる方法、ハロゲン基を有する固体粒子と酵素のアミノ基等との間でアルキル化する方法、臭化シアンで活性化した多糖類粒子と酵素のアミノ基を反応させる方法、固体粒子のアミノ基と酵素のアミノ基との間を架橋する方法、アルデヒド基またはケトン基を有する化合物とイソシアニド化合物の存在下、カルボキシル基,アミノ基を有する固体粒子と酵素を反応させる方法、ジスルフィド基を有する固体粒子と酵素のチオール基との間で交換反応させる方法等がある。
【０２００】
また、アフィニティ吸着によって固体粒子に吸着してもよい。アフィニティ吸着とは、生体高分子とそれに特異的な親和力を示す、リガンドと呼ばれる特定物質との間の生物学的吸着で、例えば、酵素と基質、抗体と抗原、レセプターとアセチルコリン等の情報物質、ｍＲＮＡとtＲＮＡ等がある。一般に、アフィニティ吸着を利用して酵素を固定化する方法として、酵素の基質や反応生成物、拮抗阻害剤、補酵素、アロステリックエフェクター等をリガンドとして固体に結合させ、この固体に酵素を添加してアフィニティ吸着させる方法をとる。しかしながら、ＰＨＡ合成酵素においては、例えば基質である３-ヒドロキシアシルＣoＡをリガンドとして用いた場合、該酵素のＰＨＡ合成を触媒する活性部位がリガンドとの結合により塞がれてしまうため、ＰＨＡを合成できなくなるという問題を生じる。しかしながら、他の生体高分子をＰＨＡ合成酵素に融合させ、該生体高分子のリガンドをアフィニティ吸着に用いることによって固定化後もＰＨＡ合成酵素のＰＨＡ合成活性を維持することができる。ＰＨＡ合成酵素と生体高分子との融合は遺伝子工学的手法によって行っても良く、またＰＨＡ合成酵素に化学的に結合させてもよい。用いる生体高分子としては、対応するリガンドが入手容易で、そのリガンドがコアに容易に結合できるものであればいかなるものでも構わないが、遺伝子組換えによって融合物を発現させる場合には、タンパク質であることが好ましい。具体的には、形質転換によってＧＳＴを発現する遺伝子配列にＰＨＡ合成酵素の遺伝子配列を繋げた大腸菌を用いて、ＧＳＴとＰＨＡ合成酵素との融合タンパク質を生産し、これをＧＳＴのリガンドであるグルタチオンを結合したＳepharoseに添加することで、ＰＨＡ合成酵素をＳepharoseにアフィニティ吸着させることができる。
【０２０１】
また、基材に対して結合能を有するアミノ酸配列を含むペプチドをＰＨＡ合成酵素に融合して提示させ、該基材に対して結合能を有するアミノ酸配列のペプチド部分と、基材との結合性に基づいて、該基材表面にＰＨＡ合成酵素を固定化することもできる。
【０２０２】
基材に対する結合能を有するアミノ酸配列は、例えばランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定することができる。特に例えばＭ13 系ファージの表面蛋白質(例えばgene III 蛋白質)のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファージディスプレイペプチドライブラリーを好適に用いることが出来るが、この場合基材に対する結合能を有するアミノ酸配列を決定するには、次のような手順をとる。すなわち、基材あるいは該基材を構成する少なくとも一成分に対してファージディスプレイペプチドライブラリーを添加することによって接触させ、その後洗浄により結合ファージと非結合ファージを分離する。基材結合ファージを酸等により溶出し緩衝液で中和した後大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと目的の基材に結合能のある複数のクローンが濃縮される。ここで単一なクローンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。
【０２０３】
上記方法により得られた基材に対する結合能を有するペプチドのアミノ酸配列は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素に融合して利用される。基材に対する結合能を有するペプチドはＰＨＡ合成酵素のＮ末端あるいはＣ末端に連結して発現することができる。また適当なスペーサー配列を挿入して発現することもできる。スペーサー配列としては、約３〜約400アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、ＰＨＡ合成酵素が機能するのを妨害せず、また、ＰＨＡ合成酵素が基材に結合するのを妨害しないものである。
【０２０４】
上記方法により作製された固定化酵素は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。
【０２０５】
３-ヒドロキシアシルＣoＡの重合によりＰＨＡが合成される反応において放出されるＣoＡ量が１分間に１μｍolとなるＰＨＡ合成酵素量を１単位(Ｕ)としたとき、基材に固定する酵素の量は、例えば基材がカプセル構造体のコアである場合、基材１gあたり10単位(Ｕ)から1,000単位(Ｕ)、望ましくは50 単位(Ｕ)から500単位(Ｕ)の範囲内に設定すると良い。
【０２０６】
前記の固定化酵素は所望のＰＨＡの原料となる３-ヒドロキシアシルＣoＡを含む水系反応液中に投入され、基材表面のＰＨＡ合成酵素によりＰＨＡが合成されることにより、基材がＰＨＡにより被覆された構造体を形成する。上記水系反応液は、ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る条件に調整された反応系として構成されるべきであり、例えば通常、pＨ 5.5からpＨ 9.0、好ましくはpＨ 7.0からpＨ 8.5となるよう、緩衝液により調製する。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適pＨやpＨ安定性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。緩衝液の種類は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば、設定するpＨ 領域等に応じて適宜選択して用いることができるが、例えば、一般の生化学反応に用いられる緩衝液、具体的には、酢酸バッファー,リン酸バッファー,リン酸カリウムバッファー,３-(Ｎ-モルフォリノ)プロパンスルフォン酸(ＭＯＰＳ)バッファー,Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-３-アミノプロパンスルフォン酸(ＴＡＰＳ)バッファー,トリス塩酸バッファー,グリシンバッファー,２-(シクロヘキシルアミノ)エタンスルフォン酸(ＣＨＥＳ)バッファー等を用いると良い。緩衝液の濃度も、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得るものであれば特に限定はされないが、通常5.0ｍｍol/Lから1.0ｍol/L、好ましくは0.1ｍol/Lから0.2ｍol/Lの濃度のものを使用すると良い。反応温度は、使用するＰＨＡ合成酵素の特性に応じて適宜設定するものであるが、通常、４℃から50℃、好ましくは20℃から40℃に設定すると良い。ただし、使用するＰＨＡ合成酵素の至適温度や耐熱性によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。反応時間は、使用するＰＨＡ合成酵素の安定性等にもよるが、通常、１分間から24時間、好ましくは30分間から３時間の範囲内で適宜選択して設定する。反応液中の３-ヒドロキシアシルＣoＡ濃度は、使用するＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る範囲内で適宜設定するものであるが、通常、0.1ｍｍol/Lから1.0ｍol/L、好ましくは0.2ｍｍol/Lから0.2ｍol/Lの範囲内で設定すると良い。なお、反応液中における３-ヒドロキシアシルＣoＡ濃度が高い場合、一般に、反応系のpＨ が低下する傾向にあるため、３-ヒドロキシアシルＣoＡ濃度を高く設定する場合は、前記の緩衝液濃度も高めに設定することが好ましい。
【０２０７】
また、上記工程において、水系反応液中の３-ヒドロキシアシルＣoＡの種類や濃度等の組成を経時的に変化させることによって、構造体の形状が粒状であれば内側から外側に向かう方向に、構造体の形状が平面状であれば垂直方向に、基材を被覆するＰＨＡのモノマーユニット組成を変化させることができる。
【０２０８】
このモノマーユニット組成の変化した構造体の形態として、例えば、ＰＨＡ被膜の組成変化が連続的で、内側から外側に向かう方向もしくは垂直方向に組成の勾配を形成した１層のＰＨＡが基材を被覆した形態を挙げることができる。製造方法としては、例えば、ＰＨＡを合成しながら反応液中に別組成の３-ヒドロキシアシルＣoＡを添加する等の方法によればよい。
【０２０９】
また別の形態として、ＰＨＡ被膜の組成変化が段階的で、組成の異なるＰＨＡが基材を多層に被覆した形態を挙げることができる。この製造方法としては、ある３-ヒドロキシアシルＣoＡの組成でＰＨＡを合成した後、遠心分離等によって調製中の構造体を反応液からいったん回収し、これに異なる３-ヒドロキシアシルＣoＡの組成からなる反応液を再度添加する等の方法によればよい。
【０２１０】
また、ＰＨＡの分子量制御、及びＰＨＡ被覆膜の親水性向上という観点から、反応溶液中に水酸基を有する化合物を適宜添加してもよい。
【０２１１】
本発明の方法で用いる水酸基を有する化合物は、アルコール類、ジオール類、トリオール類、アルキレングリコール類、ポリエチレングリコール類、ポリエチレンオキサイド類、アルキレングリコールモノエステル類、ポリエチレングリコールモノエステル類、ポリエチレンオキサイドモノエステル類化合物から選ばれる少なくとも１種類であるが、更に詳しく述べると以下の通りである。即ち、アルコール類、ジオール類及びトリオール類化合物が、炭素数３から14の直鎖状及び分岐アルコール、ジオール、トリオールである。アルキレングリコール類及びアルキレングリコールモノエステル類化合物の炭素鎖が、炭素数２から10の直鎖状及び分岐状構造を有している化合物である。ポリエチレングリコール類、ポリエチレンオキサイド類、ポリエチレングリコールモノエステル類、ポリエチレンオキサイドモノエステル類化合物の数平均分子量が100から20,000の範囲である。
【０２１２】
この様な、水酸基を有する化合物の濃度は、ＰＨＡ合成酵素による３-ヒドロキシアシルＣoＡ の重合反応が阻害されない濃度であれば特に制限はないが、好ましくはＰＨＡ合成酵素と３-ヒドロキシアシルＣoＡとの反応溶液に対して0.01％から10％(ｗ/v)、更に好ましくは0.02％から５％(ｗ/v)を添加することがよく、添加方法については反応初期に一括して添加する方法、反応時間内に数回に分けて反応溶液中に添加する方法のいずれでも良い。
【０２１３】
上記反応により得られた構造体は、必要に応じて、洗浄工程に供する。構造体の洗浄方法は、該構造体製造の目的上好ましくない変化を、該構造体に及ぼすものでない限り、特に限定はされない。構造体が、基材をコアとしＰＨＡを外被とするカプセル構造体である場合は、例えば、遠心分離によって該構造体を沈殿させ、上清を除去することによって、反応液に含まれる不要成分を除去することができる。ここに水,緩衝液,メタノール等の該ＰＨＡが不溶である洗浄剤を添加し、遠心分離をする操作を行うことにより、さらに洗浄することもできる。また、遠心分離の替わりに、ろ過等の手法を用いても良い。一方、構造体が、平板状の基材をＰＨＡで被覆した構造体である場合は、例えば、上記洗浄剤に浸漬する等して洗浄することができる。さらに、上記構造体は、必要に応じて、乾燥工程に供することができる。さらに該構造体に各種二次加工や化学修飾等の処理を施して使用することもできる。
【０２１４】
例えば、基材を被覆したＰＨＡに化学修飾を施すことにより、さらに有用な機能・特性を備えた構造体を得ることができる。
【０２１５】
＜酸化反応による本発明のＰＨＡの合成 -カルボキシル基-＞
化学式(２)で示すユニットにおいてカルボキシル基を含むユニットは、この化学式(２)で示される、側鎖末端にビニルフェニル基を有するユニットの二重結合部分を選択的に酸化開裂することで製造することができ、化学式(２)で示す側鎖末端にカルボキシフェニル基を有するユニットを含むＰＨＡが得られる。
【０２１６】
このように、炭素-炭素の二重結合を酸化剤を用いて、酸化開裂してカルボン酸を得る方法としては、例えば、過マンガン酸塩を用いる方法(Ｊ.Ｃheｍ.Ｓoc.,Ｐerkin.Ｔrans.1，806(1973)(非特許文献19))、重クロム酸塩を用いる方法(Ｏrg.Ｓynth.,４，698(1963)(非特許文献20))、過ヨウ素酸塩を用いる方法(Ｊ.Ｏrg.Ｃheｍ.,46，19(1981)(非特許文献21))硝酸を用いる方法(特開昭59-190945号公報(特許文献37))、オゾンを用いる方法(Ｊ.Ａｍ.Ｃheｍ.Ｓoc.,81,4273(1959)(非特許文献22))等が知られており、更にＰＨＡに関しては、Ｍacroｍolecular cheｍistry,４，289-293(2001)(非特許文献23)に、ＰＨＡの側鎖末端の炭素-炭素二重結合を酸化剤として過マンガン酸カリウムを用い、反応を酸性条件下で行うことで、カルボン酸を得る方法が報告されており、本発明においてもこれらの方法を参考とすることができる。
【０２１７】
酸化剤として用いる前記過マンガン酸塩としては、過マンガン酸カリウムが一般的である。過マンガン酸塩の使用量は、酸化開裂反応が化学量論的反応であるため、ビニル基を有する化学式(２)で示すユニット１モルに対して、通常１モル当量以上、好ましくは、２〜４モル当量使用するのがよい。
【０２１８】
反応系を酸性条件下にするためには通常、硫酸、塩酸、酢酸、硝酸等の各種の無機酸や有機酸が用いられる。しかしながら、硫酸、硝酸、塩酸等の酸を用いた場合、ＰＨＡの主鎖のエステル結合が切断され、分子量低下を引き起こす恐れがある。そのため酢酸を用いることが好ましい。酸の使用量は、ビニル基を有する化学式(２)で示すユニット１モルに対して、通常、0.2〜200モル当量、好ましくは0.4〜100モル当量の範囲で用いられる。0.2モル当量に満たない場合には低収率となり、200モル当量を越える場合には酸による分解物が副生するため、いずれの場合も好ましくない。また、反応を促進する目的でクラウン-エーテルを用いることができる。この場合、クラウン-エーテルと過マンガン酸塩とは、錯体を形成し、反応活性が増大する効果が得られる。クラウン-エーテルとしては、ジベンゾ-18-クラウン-６-エーテル、ジシクロ-18-クラウン-６-エーテル、18-クラウン-６-エーテルが一般的に用いられる。クラウン-エーテルの使用量は、過マンガン塩１モルに対して、通常1.0〜2.0モル当量、好ましくは、1.0〜1.5モル当量の範囲で用いることが望ましい。
【０２１９】
本発明の前記酸化反応において、ビニル基を有する化学式(２)で示すユニットを含むＰＨＡで被覆された構造体と、過マンガン酸塩及び酸は一括して最初からともに仕込んで反応させてもよく、それぞれを連続的若しくは断続的に系内に加えながら反応させてもよい。また、過マンガン酸塩のみを先に反応系に溶解若しくは懸濁させておき、続いて、構造体及び酸を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよく、構造体のみを先に反応系に懸濁させておき、続いて、過マンガン酸塩及び酸を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよい。さらには、構造体及び酸を先に仕込んでおき、続いて、過マンガン酸塩を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよく、過マンガン酸塩及び酸を先に仕込んでおき、続いて、構造体を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよく、構造体及び過マンガン酸塩を先に仕込んでおき、続いて、酸を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよい。
【０２２０】
反応温度は、通常-20〜40℃、好ましくは０〜30℃とするのがよい。反応時間は、ビニル基を有する化学式(２)で示すユニットと過マンガン酸塩の量論比及び反応温度に依存するが、通常２〜48時間とするのがよい。
【０２２１】
同様の方法で、化学式(１)のω-アルケン構造についても、ビニル基からカルボキシル基への変換が可能である。
【０２２２】
＜酸化反応による本発明のＰＨＡの合成 -フェニルスルフィニル/スルホニル基-＞
化学式(７)に示す３-ヒドロキシ-(フェニルスルフィニル)アルカン酸ユニット、あるいは、化学式(８)に示す３-ヒドロキシ-(フェニルスルホニル)アルカン酸ユニットのうち、少なくとも１種類のユニットを含むポリヒドロキシアルカノエートは、化学式(16)で示される、側鎖末端にフェニルスルファニル基または置換フェニルスルファニル基として、スルファニル基(-Ｓ-)を有するユニットの硫黄部分、スルファニル基(-Ｓ-)を選択的に酸化することで製造することができ、化学式(７)で示すユニットあるいは化学式(８)で示すユニットの少なくとも１種類を含むＰＨＡが得られる。
【０２２３】
このような酸化処理については、例えば、過酸化化合物を利用することができ、本発明の目的、すなわち、フェニルスルファニル基または置換フェニルスルファニル基として存在するスルファニル基(-Ｓ-)の酸化に寄与し得るものであれば、いかなる種類の過酸化化合物をも用いることが可能である。その際、酸化効率、ＰＨＡ(およびそれを含む共重合体)主鎖骨格への影響、処理の簡便さ等を考慮した場合、特に、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、メタクロロ過安息香酸、過蟻酸、過酢酸からなる群から選択される過酸化化合物を用いることが好ましい。
【０２２４】
まず、その中でも処理方法が容易な過酸化水素を利用する処理について述べる。最も簡便な過酸化水素による処理方法は、本発明のＰＨＡの前駆体である、化学式(16)で示されるユニットを含むＰＨＡにより被覆された構造体をそのまま過酸化水素水に懸濁、場合によっては一定時間加熱、攪拌する方法である。
【０２２５】
本発明の構造体の製造方法で、酸化剤として利用する過酸化水素は、本発明の目的、すなわち、フェニルスルファニル基または置換フェニルスルファニル基として存在するスルファニル基(-Ｓ-)の酸化を行える限り、いかなる形態のものをも用いることが可能である。なお、製造工程の制御という観点からは、その濃度等が、安定した性状の過酸化水素の溶液、例えば、過酸化水素水等、水系溶媒中に溶解したものを用いることが望ましい。一例として、工業的に多量に安定生産可能な、ＪＩＳ Ｋ-8230 に則った過酸化水素水は推奨されるべきものであり、例えば、三菱瓦斯化学(株)製 過酸化水素水(31％過酸化水素含有)は、本発明の方法において、好適な過酸化水素の溶液である。
【０２２６】
本発明の構造体の製造方法において、この過酸化水素を用いる酸化処理の条件は、処理される構造体の形状、粒状体の場合はその粒径(比表面積)、被覆しているＰＨＡの分子構造、等により異なるが、前記、ＪＩＳ Ｋ-8230規格品の過酸化水素水(31％過酸化水素含有)を利用する際、その希釈条件(濃度)、使用量、処理温度、時間等は、下記する範囲に選択することができる。
【０２２７】
処理液中の過酸化水素濃度については、反応温度にもよるが、８％(約４倍希釈)〜31％(原液)、より好ましい濃度範囲としては、16％(約２倍希釈)〜31％(原液)反応量であり、前駆体ＰＨＡに含まれる化学式(16)のユニットの比率にも依存するものの、構造体を被覆するＰＨＡ１gに対して、原液過酸化水素水(31％過酸化水素含有)換算で１ｍl〜1000ｍl、より好ましい反応量は、５ｍl〜500ｍlの範囲である。
【０２２８】
反応温度については、処理液中の濃度にもよるが、30℃〜100℃、より好ましい温度としては、50℃〜100℃の範囲に選択する。反応時間については、その反応温度にもよるが、10分〜180分、より好ましい時間としては、30分〜120分の範囲である。
【０２２９】
前記する条件の範囲で、過酸化水素処理を施すことにより、化学式(16)で示されるユニットを含む前駆体ＰＨＡから、化学式(７)ならびに化学式(８)で示されるユニットのうち、少なくとも１種類をポリマー分子中に含むＰＨＡ、あるいは、化学式(７)ならびに化学式(８)で示されるユニットに加えて、中間原料のＰＨＡに由来する化学式(16)で表されるユニットをなお残すＰＨＡへと変換できる。その場合、過酸化水素処理の反応条件を選択して、酸化の進行速度、反応量を制御することにより、前記三種の各ユニットの存在比を制御することが可能となる。
【０２３０】
次に、過酸化化合物として、メタクロロ過安息香酸(ＭＣＰＢＡ)を用いる方法について述べる。
【０２３１】
ＭＣＰＢＡを用いると、フェニルスルファニル基または置換フェニルスルファニル基として存在するスルファニル基(-Ｓ-)の酸化は、化学量論的に進行するため、化学式(７)ならびに化学式(８)で示されるユニットの含有比率の制御が行い易い。また、その反応条件が温和であるため、ＰＨＡ主鎖骨格の切断や活性部位の架橋反応等、不要な副次反応が起こり難い。従って、本発明のＰＨＡの製造方法において、高い選択性で目的とするＰＨＡを製造する上では、メタクロロ過安息香酸(ＭＣＰＢＡ)は、非常に好適な過酸化化合物の一つである。
【０２３２】
さらに、過酸化化合物として他の化合物を用いる例として、過マンガン酸塩を用いる方法について述べる。酸化剤として用いる前記過マンガン酸塩としては、過マンガン酸カリウムが一般的である。過マンガン酸塩の使用量は、化学式(16)で示すフェニルスルファニル基を含むユニット１モルに対して、通常１モル当量以上、好ましくは、２〜４モル当量使用するのがよい。
【０２３３】
反応系を酸性条件下にするためには通常、硫酸、塩酸、酢酸、硝酸等の各種の無機酸や有機酸が用いられる。しかしながら、硫酸、硝酸、塩酸等の酸を用いた場合、ポリヒドロキシアルカノエートの主鎖のエステル結合が切断され、分子量低下を引き起こす恐れがある。そのため酢酸を用いることが好ましい。酸の使用量は、化学式(16)で示すフェニルスルファニル基を含むユニット１モルに対して、通常、0.2〜200モル当量、好ましくは0.4〜100モル当量の範囲で用いられる。0.2モル当量に満たない場合には低収率となり、200モル当量を越える場合には酸による分解物が副生するため、いずれの場合も好ましくない。また、反応を促進する目的でクラウン-エーテルを用いることができる。この場合、クラウン-エーテルと過マンガン酸塩とは、錯体を形成し、反応活性が増大する効果が得られる。クラウン-エーテルとしては、ジベンゾ-18-クラウン-６-エーテル、ジシクロ-18-クラウン-６-エーテル、18-クラウン-６-エーテルが一般的に用いられる。クラウン-エーテルの使用量は、過マンガン塩１モルに対して、通常1.0〜2.0モル当量、好ましくは、1.0〜1.5モル当量の範囲で用いることが望ましい。
【０２３４】
本発明の前記酸化反応において、化学式(16)で示すユニットを含むＰＨＡで被覆された構造体と、過マンガン酸塩及び酸は一括して最初からともに仕込んで反応させてもよく、それぞれを連続的若しくは断続的に系内に加えながら反応させてもよい。また、過マンガン酸塩のみを先に反応系に溶解若しくは懸濁させておき、続いて、構造体及び酸を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよく、構造体のみを先に反応系に懸濁させておき、続いて、過マンガン酸塩及び酸を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよい。さらには、構造体及び酸を先に仕込んでおき、続いて、過マンガン酸塩を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよく、過マンガン酸塩及び酸を先に仕込んでおき、続いて、構造体を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよく、構造体及び過マンガン酸塩を先に仕込んでおき、続いて、酸を連続的若しくは断続的に系内に加えて反応させてもよい。
【０２３５】
反応温度は、通常-20〜40℃、好ましくは０〜30℃とするのがよい。反応時間は、化学式(16)で示すユニットと過マンガン酸塩の量論比及び反応温度に依存するが、通常２〜48時間とするのがよい。
【０２３６】
化学式(16)で示すフェニルスルファニル基の酸化剤処理により、化学式(16)で示されるユニットを含む前駆体ＰＨＡから、化学式(７)ならびに化学式(８)で示されるユニットのうち、少なくとも１種類をポリマー分子中に含むＰＨＡへの変換が可能である。
【０２３７】
スルフィニル構造(-ＳＯ-)あるいはスルホニル構造(-ＳＯ2-)は、かかるユニット末端における、分子中の電子の局在化を強力に促し、その物性は、従来のＰＨＡと比べ著しく異なっている可能性がある。特には、ガラス転移温度の上昇が顕著であり、広範な用途への応用が可能となる。
【０２３８】
＜酸化反応による本発明のＰＨＡの合成 -エポキシ基-＞
化学式(２)で示すユニットにおいてエポキシ基を含むユニットは、この化学式(２)で示される、側鎖末端にビニルフェニル基を有するユニットの二重結合部分を選択的に酸化することで製造することができ、化学式(２)で示す側鎖末端にエポキシフェニル基を有するユニットを含むＰＨＡが得られる。
【０２３９】
このような酸化処理については、例えば、過酸化化合物を利用することができ、本発明の目的、すなわち、ビニル基の酸化に寄与し得るものであれば、いかなる種類の過酸化化合物をも用いることが可能である。その際、酸化効率、ＰＨＡ(およびそれを含む共重合体)主鎖骨格への影響、処理の簡便さ等を考慮した場合、特に、過酸化水素、過炭酸ナトリウム、メタクロロ過安息香酸、過蟻酸、過酢酸からなる群から選択される過酸化化合物を用いることが好ましい。
【０２４０】
過酸化化合物を用いる場合の反応条件は、前記したスルファニル基の酸化条件を参考とすることができる。
【０２４１】
＜構造体の修飾＞ 例えば、該ＰＨＡにグラフト鎖を導入することにより、該グラフト鎖に起因する各種の特性を備えたＰＨＡが、基材の少なくとも一部を被覆した構造体を得ることができる。また、該ＰＨＡを架橋化せしめることにより、構造体の機械的強度、耐薬品性、耐熱性等を制御することが可能である。
【０２４２】
化学修飾の方法は、所望の機能・構造を得る目的を満たす方法であれば特に限定はされないが、例えば、反応性官能基を側鎖に有するＰＨＡを合成し、該官能基の化学反応を利用して化学修飾する方法を、好適な方法として用いることができる。
【０２４３】
前記の反応性官能基の種類は、所望の機能・構造を得る目的を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、前記したエポキシ基を例示することができる。エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡは、通常のエポキシ基を有するポリマーと同様の化学的変換を行うことができる。具体的には、例えば水酸基に変換したり、スルホン基を導入したりすることが可能である。また、チオールやアミンを有する化合物を付加することもでき、例えば、末端に反応性官能基を有する化合物、具体的には、エポキシ基との反応性が高いアミノ基を末端に有する化合物等を添加して反応させることにより、ポリマーのグラフト鎖が形成される。
【０２４４】
アミノ基を末端に有する化合物としては、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、アミノ変性ポリシロキサン(アミノ変性シリコーンオイル)等のアミノ変性ポリマーを例示することができる。このうち、アミノ変性ポリシロキサンとしては、市販の変性シリコーンオイルを使用しても良く、また、Ｊ.Ａｍer.Ｃheｍ.Ｓoc.,78，2278(1956)(非特許文献24)等に記載の方法で合成して使用することもでき、該ポリマーのグラフト鎖の付加による耐熱性の向上等の効果が期待できる。
【０２４５】
また、近年、リガンド-レセプター反応が高感度の反応技術として広範囲に用いられている。ここで、リガンド-レセプター反応には抗原-抗体反応、核酸の相補性、ホルモン-受容体、酵素-基質、ビオチン-アビジン等の生理活性物質とその受容体等様々な特異的結合を利用する反応が含まれる。これらは一般にリガントまたはレセプターを担体に結合させ、リガンド-レセプター反応後、相対するレセプターまたはリガンドをその媒体中から分離する方法が用いられる。特にこれらの反応を利用して媒体中に存在する極微量の抗原、ホルモンや特定配列の核酸を分離精製する精製法やそれらを検出するリガンド-レセプターアッセイが広く実施されている。
【０２４６】
これらのリガンド-レセプター反応に用いられるリガンドあるいはレセプターの担持に、本発明のＰＨＡにおける反応性官能基を好適に用いることが可能であり、グラフト化による有用な機能・特性の発現が可能となる。さらには基材に磁性体を用いた場合、分離精製が簡便かつ容易となり、さらに効果的である。
【０２４７】
また、エポキシ基を有するポリマーの化学的変換の他の例として、ヘキサメチレンジアミン等のジアミン化合物,無水コハク酸,２-エチル-４-メチルイミダゾール,電子線照射等による架橋反応が挙げられる。このうち、エポキシ基を側鎖に有するＰＨＡとヘキサメチレンジアミンとの反応は、下記のスキームに示すような形で進行し、架橋ポリマーが生成する。
【０２４８】
【化６７】
Figure 0004579502
【０２４９】
本発明における構造体の含有する基材の量は、その用途、必要な機能を考慮し適宜選択すれば良い。例えば、基材に磁性体を用いた場合、本発明における構造体の含有する磁性体の量は１〜80質量％、好ましくは５〜70質量％、さらに好ましくは10〜60質量％である。磁性体の量が１質量％より少ないと磁気性能が不足して磁性体含有構造体としての性能が不十分となるおそれがあり、また、磁性体含量が80質量％を越えると磁性体が多すぎるため、構造体本来の機能が損なわれ、実用性能の面で満足できなくなるおそれがある。
【０２５０】
本発明におけるカプセル構造体の粒子径は、例えば、基材に磁性体を用いた場合、用途等に応じて適宜選定されるが、通常、0.02〜100μｍ、好ましくは0.05〜20μｍである。
【０２５１】
また、本発明における一般的なカプセル構造体および積層構造体の被覆膜の厚みは、用途等に応じて適宜選定されるが、通常、0.02〜100μｍ、好ましくは0.05〜20μｍである。
【０２５２】
また、本発明の構造体を、生体関連物質の担持あるいは生体内への投与等に供する場合は、基材が磁性体を含む場合は、磁性体の溶出、生体関連物質の相互作用の阻害等を最小限とするためにも、磁性体がＰＨＡにより完全に被覆される形態がより好ましいものである。
【０２５３】
得られた構造体において、基材がＰＨＡで被覆されていることを確認する方法としては、一般には、例えば、ガスクロマトグラフィー等による組成分析と電子顕微鏡等による形態観察とを組み合わせた方法や、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ)とイオンスパッタリング技術を用いて、各構成層のマススペクトルから構造を判定する方法等を用いることができる。しかし、さらに直接的かつ簡便な確認方法として、本発明者らによって新たに開発された、ナイルブルーＡ染色と蛍光顕微鏡観察とを組み合わせた方法を用いることもできる。本発明者らは、ＰＨＡ合成酵素を用いた無細胞系(in vitro)でのＰＨＡ合成を簡便に判定できる方法について鋭意検討を続けてきた結果、ＰＨＡに特異的に結合して蛍光を発する性質を有する薬剤であり、Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.,44，238-241(1982)(非特許文献25)において微生物細胞(in vivo)でのＰＨＡ生産の簡易的判別に用いることができると報告されているナイルブルーＡが、適切な使用方法および使用条件の設定によって、無細胞系でのＰＨＡ合成の判定にも用いることができることを見出し、上記の方法を完成させた。即ち、本方法では、所定濃度のナイルブルーＡ溶液を濾過したのち、ＰＨＡを含む反応液に混合し、蛍光顕微鏡で一定の波長の励起光を照射しながら観察することにより、合成されたＰＨＡのみから蛍光を発せしめ、これを観察することによって、無細胞系でのＰＨＡ合成を簡易に判定することができる。使用した基材が上記条件下で蛍光を発する性質を有するものでない限り、上記方法を本発明の構造体の製造に応用することにより、基材の表面を被覆したＰＨＡを直接的に観察し、評価することができる。
【０２５４】
また、基材を被覆しているＰＨＡの内側から外側に向かう方向もしくは垂直方向の組成分布は、イオンスパッタリング技術と飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ)を組み合わせて評価することができる。
【０２５５】
＜構造体の利用＞本発明の特徴の一つは、通常の有機合成化学的手法では製造が困難であった構造体の製造を可能にしたことであり、従って、従来の有機合成化学的手法で製造されたカプセル構造体や積層構造体にはない優れた特性を付与した構造体を得ることが可能である。例えば、従来の有機合成的手法では実現が困難であった新たな高分子化合物の利用や、新たな機能・構造の付与が可能になる。さらに具体的には、生物の触媒作用に特有の極めて厳密な分子認識能や立体選択性を利用して、従来の有機合成化学的手法では実現が困難であった新たな機能性高分子化合物や、極めてキラリティーの高い高分子化合物により被覆されたカプセル構造体や積層構造体等を、極めて簡便なプロセスで製造することが可能になる。
【０２５６】
上記の如き構造体の応用の一例としては、電子写真用高機能カプセルトナーが挙げられる。前述の通り、電子写真用カプセルトナーにおいては、その製造工程が極めて複雑となり、また、製造工程において大量の溶媒類や界面活性剤を使用する等の課題があった。本発明の方法により、上記の如き課題を解決し、カプセルトナーを簡便に製造できる方法が提供される。さらに、その外被の厚さやモノマーユニット組成等も比較的容易に制御できる。また、特開平８-286416号公報によれば、カプセルトナーの外被にポリエステル等の極性樹脂を含有させることにより、画質耐久性の向上、帯電の均一化および安定化等の効果が得られるとされているが、本発明の方法により得られるカプセルトナーにおけるＰＨＡからなる外被にも、上記の如き効果が期待できる。さらに、本発明の方法では、様々な官能基を有するＰＨＡを外被として用いることができるため、これら官能基によるトナーの表面物性の制御や、新たな機能性の付与等も可能となる。また、コア部分の製造工程を除けば、その製造において有機溶媒や界面活性剤等をほとんど、あるいは、全く使用せず、かつ、反応条件も極めて温和であるため、製造上の環境負荷を大幅に低減することが可能である。
【０２５７】
また、基材に磁性体を含む場合については、磁性を有する金属および金属化合物に親油化処理を施すことなく、均一分散性に優れる磁性体を被覆した構造体を、極めて簡便なプロセスで製造することが可能になる。
【０２５８】
また、磁性体の分散性および磁気応答性に優れ、金属イオンが外部に溶出されにくく、種々の用途・分野に幅広く適用することのできる、磁性体を被覆したカプセル構造体を、極めて簡便なプロセスで製造することが可能になる。
【０２５９】
本発明の構造体は、粒子の表面および/または表面近傍に磁性体が実質的に存在しないか、存在しても極めて少ないため、使用時の磁性体の溶出による影響が実質上問題となることがない。したがって、本発明の構造体は、金属成分を嫌うことの多い生化学用途においても従来の非磁性粒子と同様の目的に使用することができ、例えば一般の診断薬用担体および副作用の少ないドラッグデリバリー担体として、広範な抗原、抗体、蛋白、核酸等の担持に適用することが可能である。また、酵素免疫法の診断薬用担体として、磁性体の溶出による非特異的酵素発色が抑えられる等、多様な検出手法に適用できるものであり、極めて実用性能の高いものである。さらに、本発明の構造体は、例えば、粒子表面に特定の核酸を捕捉するための特異的核酸あるいは蛋白プローブを担持し、核酸捕捉担体として使用することも可能である。これらの場合、従来の磁性体含有ポリマー粒子では、金属、特には鉄成分がＰＣＲ反応を阻害するため、粒子をＰＣＲ法に供することができなかった。これに対して、本発明の構造体は、表面に露出した磁性体が実質上存在しないため、ＰＣＲ反応に対する阻害作用がなくなり、捕捉された核酸を結合したままでＰＣＲ法に供することが可能になった。このため、本発明の構造体は、核酸を用いる研究分野、核酸による検査・診断・治療分野、核酸を利用する産業分野等を含む幅広い技術分野において、極めて好適に使用できるものである。
【０２６０】
本発明の構造体の応用の参考例として、例えばインクジェット記録方式における記録媒体が挙げられる。前述の通り、該記録媒体においてインク吸収層を基材上に形成させる方法としては、従来は塗抹による方法が一般的であった。本発明の方法によって、上記方法を用いることなく、新たに記録媒体を製造することが可能となる。即ち、酵素を固定化した基材と、例えば、下記化学式［１０］においてＲ２がビニル基である３−ヒドロキシビニルフェニルアシルＣｏＡとを反応させることによって、
【０２６１】
【化６８】
Figure 0004579502
【０２６２】
下記化学式[２]においてＲ２がビニル基であるようなユニットを含むＰＨＡを合成し、
【０２６３】
【化６９】
Figure 0004579502
【０２６４】
さらにビニル基の酸化開裂を行うことにより、上記化学式[２]においてＲ２がカルボキシ基であるようなユニットを含むＰＨＡ、即ち、アニオン性官能基であるカルボキシル基を側鎖に有するＰＨＡをインク受容層として重層した記録媒体を製造することができる。本発明の方法により、従来の手法では製造が困難であった、上記の如き新規機能性記録媒体の製造が可能となる。
【０２６５】
なお、本発明の構造体およびその利用方法およびその製造方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０２６６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明の最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下における「％」は特に標記した以外は質量基準である。
【０２６７】
(参考例１) ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製
ＹＮ２株を100ｍlのＬＢ培地(１％ポリペプトン(日本製薬(株)製)、0.5％酵母エキス(Ｄifco社製)、0.5％塩化ナトリウム、pＨ 7.4)で30℃、一晩培養後、マーマーらの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈind IIIで完全分解した。ベクターにはpＵＣ18を使用し、制限酵素Ｈind IIIで切断した。末端の脱リン酸処理(Ｍolecular Ｃloning,１，572,(1989); Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory出版(非特許文献26))ののち、ＤＮＡライゲーションキットＶer.II(宝酒造(株)製)を用いて、ベクターの切断部位(クローニングサイト)と染色体ＤＮＡのＨind III完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクターを用いて、大腸菌(Ｅscherichia coli)ＨＢ101株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリーを作製した。次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニー・ハイブリダイズ用のプローブ調製を行った。配列番号:２および配列番号:３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し(アマシャムファルマシア・バイオテク(株))、このオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプローブとして用いた。プローブの標識化は、市販の標識酵素系ＡlkＰhosＤirect(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製)を利用して行った。得られた標識化プローブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイブリダイゼーション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グループであるIncＰ、IncＱ、あるいはIncＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクターpＢＢＲ122(Ｍo ＢiＴec)に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍ１株(ＰＨＡ合成能欠損株)にエレクトロポレーション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍ１株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュードモナス・チコリアイＹＮ２ｍ１株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【０２６８】
このＤＮＡ断片について、サンガー法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコードする、配列番号:４および配列番号:５で示される塩基配列が存在することが確認された。これらのＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。即ち、配列番号:４で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー(配列番号:６)および下流側プライマー(配列番号:７)、配列番号:５で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子に対する、上流側プライマー(配列番号:８)および下流側プライマー(配列番号:９)をそれぞれ合成した(アマシャムファルマシア・バイオテク(株))。
【０２６９】
これらのプライマーを用いて、配列番号:４および配列番号:５で示される塩基配列それぞれについてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した(ＬＡ-ＰＣＲキット；宝酒造(株)製)。次に、得られたＰＣＲ増幅断片および発現ベクターpＴrc99Ａを制限酵素Ｈind IIIで切断し、脱リン酸化処理(Ｍolecular Ｃloning,１巻,572頁,1989年；Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory出版(前記・非特許文献26))したのち、この発現ベクターpＴrc99Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキットＶer.II(宝酒造(株)製)を用いて連結した。
【０２７０】
得られた組換えプラスミドで大腸菌(Ｅscherichia coli ＨＢ101:宝酒造)を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号:４の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをpＹＮ２-Ｃ１、配列番号:５の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをpＹＮ２-Ｃ２とした。pＹＮ２-Ｃ１、pＹＮ２-Ｃ２で大腸菌(Ｅscherichia coli ＨＢ101fＢ fadＢ欠損株)を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、pＹＮ２-Ｃ１組換え株、pＹＮ２-Ｃ２組換え株を得た。
【０２７１】
(参考例２) ＰＨＡ合成酵素の生産１
pＹＮ２-Ｃ１に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号:10)および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号:11)をそれぞれ設計・合成した(アマシャムファルマシア・バイオテク(株))。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pＹＮ２-Ｃ１をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢaｍＨＩ制限部位、下流にＸhoＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した(ＬＡ-ＰＣＲキット；宝酒造(株)製)。
【０２７２】
同様にpＹＮ２-Ｃ２に対して、上流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号:12)および下流側プライマーとなる、オリゴヌクレオチド(配列番号:13)をそれぞれ設計・合成した(アマシャムファルマシア・バイオテク(株))。このオリゴヌクレオチドをプライマーとして、pＹＮ２-Ｃ２をテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢaｍＨＩ制限部位、下流にＸhoＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した(ＬＡ-ＰＣＲキット；宝酒造(株)製)。
【０２７３】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢaｍＨＩおよびＸhoＩにより消化し、プラスミドpＧＥＸ-６Ｐ-１(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製)の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて大腸菌(ＪＭ109)を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍiniprep(Ｗizard Ｍinipreps ＤＮＡ Ｐurification Ｓysteｍs、ＰＲＯＭＥＧＡ社製)を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢaｍＨＩ、ＸhoＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。得られた菌株をＬＢ-Ａｍp培地10ｍlで一晩プレ・カルチャーした後、その0.1ｍlを、10ｍlのＬＢ-Ａｍp培地に添加し、37℃、170 rpｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加(終濃度 １ｍｍol/L)し、37℃で４から12時間培養を続けた。
【０２７４】
ＩＰＴＧ 誘導した大腸菌を遠心分離により集菌(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、２分、４℃)し、１/10 量の ４℃リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ；８g ＮaＣl, 1.44 g Ｎa2ＨＰＯ4, 0.24 g ＫＨ2ＰＯ4, 0.2 g ＫＣl, 1,000ｍl精製水)に再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心分離(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、10分、４℃)して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製)で精製した。使用するグルタチオン・セファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオン・セファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄(遠心分離(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、１分、４℃)した後、４％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１/２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオン・セファロース 40μlを、無細胞抽出液１ｍl に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ-ＹＮ２-Ｃ１およびＧＳＴ-ＹＮ２-Ｃ２をグルタチオン・セファロースに吸着させた。吸着後、遠心分離(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、１分、４℃)してグルタチオン・セファロースを回収し、400μlのＰＢＳで３回洗浄した。その後、10ｍｍol/Lグルタチオン40μlを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心分離(78000ｍ/s2(=8000Ｇ)、２分、４℃)して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、シングルバンドを確認した。
【０２７５】
各ＧＳＴ融合タンパク質500μgをＰreＳcissionプロテアーゼ(アマシャムファルマシア・バイオテク(株)製、５Ｕ)で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴとを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ200カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２-Ｃ１およびＹＮ２-Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりそれぞれ60.8kＤa、および61.5kＤaのシングルバンドを確認した。
【０２７６】
該酵素を生体溶液試料濃縮剤(みずぶとりくんＡＢ-1100、アトー(株)製)を用いて濃縮し、10 Ｕ/ｍlの精製酵素溶液を得た。
【０２７７】
各精製酵素活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット(ピアスケミカル社製)によって測定した。各精製酵素の活性測定の結果を表１に示した。
【０２７８】
【表１】
Figure 0004579502
【０２７９】
(参考例３) ＰＨＡ合成酵素の生産２
Ｐ91株、Ｈ45株、ＹＮ２株またはＰ161株を、酵母エキス(Ｄifco社製)0.5％、オクタン酸0.1％とを含むＭ９培地200ｍlに植菌して、30℃、125ストローク/分で振盪培養した。24時間後、菌体を遠心分離(、４℃、10分間)によって回収し、0.1ｍol/L トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)200ｍlに再懸濁して再度遠心分離することによって洗浄した。菌体を0.1ｍol/L トリス塩酸バッファー(pＨ 8.0)2.0ｍlに再懸濁し、超音波破砕機にて破砕したのち、遠心分離(118000ｍ/s2(=12000Ｇ)、４℃、10分間)して上清を回収して粗酵素を得た。
【０２８０】
各精製酵素活性は前述の方法で測定し、その結果を表２に示した。
【０２８１】
【表２】
Figure 0004579502
【０２８２】
(参考例４) 磁性体の調製
硫酸第一鉄水溶液中に、鉄イオンに対してl.0〜1.1当量の苛性ソーダ溶液を混合し、水酸化第一鉄を含む水溶液を調製した。この水溶液のpＨ を８前後に維持しながら、空気を吹き込み、80〜90℃で酸化反応を行い、種晶を生成させるスラリー液を調製した。
【０２８３】
次いで、このスラリー液に当初のアルカリ量(苛性ソーダのナトリウム成分)に対し0.9〜1.2当量となるよう硫酸第一鉄水溶液を加えた後、スラリー液をpＨ ８前後に維持して、空気を吹き込みながら酸化反応をすすめ、酸化反応後に生成した磁性酸化鉄粒子を洗浄、濾過、乾燥し、凝集している粒子を解砕し、平均粒径が0.1μｍの粒状の磁性体１を得た。
【０２８４】
以下、本発明にかかる実施例について説明するが、以下の実施例１〜６は参考例である。
（実施例１） カプセル構造体の作製１
ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液（１０ Ｕ／ｍｌ）１０質量部にアルミナ粒子（粒径０．１２μｍ〜１３５μｍ）１質量部、ＰＢＳ ３９質量部を添加し３０℃にて３０分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離（９８０００ｍ／ｓ2（＝１００００Ｇ）、４℃、１０分間）し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離（９８０００ｍ／ｓ2（＝１００００Ｇ）、４℃、１０分間）して固定化酵素を得た。
【０２８５】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-ω-オクテノイルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０２８６】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。
【０２８７】
対照として、0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)49質量部にアルミナ粒子１質量部を添加し、30℃で2.5時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０２８８】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、該ＰＨＡは(Ｒ)-３-ヒドロキシ-ω-オクテン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０２８９】
さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭＩＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝25,000、Ｍｗ＝50,000であった。
【０２９０】
(実施例２) カプセル構造体の作製２
pＹＮ２-Ｃ２組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部にアルミナ粒子(粒径0.12μｍ〜135μｍ)１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０２９１】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-３-シクロヘキシルプロパノイルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０２９２】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。
【０２９３】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、該ＰＨＡは(Ｒ)-３-ヒドロキシ-３-シクロヘキシルプロピオン酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０２９４】
(実施例３) カプセル構造体の作製３
ＹＮ２,Ｈ45株,Ｐ91株またはＰ161株由来のＰＨＡ合成酵素の粗酵素99質量部にアルミナ粒子(粒径0.12μｍ〜135μｍ)１質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてＰＨＡ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０２９５】
上記の各固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルメチルオキシバレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、それぞれ30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０２９６】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、いずれの固定化酵素の反応液においても、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はいずれも、ＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。
【０２９７】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、該ＰＨＡは(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルメチルオキシ吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０２９８】
(実施例４) カプセル構造体の作製４
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部にアルミナ粒子(粒径0.12μｍ〜135μｍ)１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてＰＨＡ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０２９９】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３００】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。
【０３０１】
さらに、該粒子の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥＩ法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０３０２】
さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭＩＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝15,000、Ｍｗ＝28,000であった。
【０３０３】
(実施例５) カプセル構造体の作製５
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部にアルミナ粒子(粒径0.12μｍ〜135μｍ)１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてＰＨＡ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０３０４】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェノキシ)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３０５】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。
【０３０６】
さらに、該粒子の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。抽出液を孔径 0.45μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮したのち、常法に従ってメタノリシスを行い、ガスクロマトグラフィー-質量分析装置(ＧＣ-ＭＳ,島津ＱＰ-5050、ＥＩ法)で分析し、ＰＨＡモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。その結果、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェノキシ)吉草酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。
【０３０７】
(実施例６)カプセル構造体の作製６
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部に沈降法によって粒径をそろえたアルミナ粒子(体積平均粒子径1.45μｍ)１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素をアルミナ表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(10,000×g、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０３０８】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)メチルスルファニルバレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３０９】
反応後、上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、アルミナ粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該アルミナ粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。
【０３１０】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、該ＰＨＡは(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)メチルスルファニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０３１１】
(実施例７)カプセル構造体の作製７
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部に磁性体１を１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を磁性体１表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０３１２】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３１３】
反応後、上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、磁性体１粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該磁性体１粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。これを磁性カプセル構造体１とした。
【０３１４】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、該ＰＨＡは(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０３１５】
ここで、該ＰＨＡの平均分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭＩＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝21,000、Ｍｗ＝39,000であった。
【０３１６】
(実施例８) カプセル構造体の作製８
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部に気相法で合成した磁性を有する金属として１次粒子径0.02μｍニッケル粉末「Ｎi(200)ＵＦＭＰ」〔真空冶金(株)製〕(磁性体２とする)を１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を磁性体２表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０３１７】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェノキシ)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で10分間緩やかに振盪した。次いで、30℃で緩やかに振盪しながらこの反応液に(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を含む0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)をマイクロチューブポンプ(東京理化器械社製ＭＰ-３Ｎ)を用いて１分間に１質量部の割合で添加した。さらに１時間30分後、生成した粒状体を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、上清を除いた後、この粒状体に(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を含む0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)を25質量部添加し、30℃で20分間緩やかに振盪した。
【０３１８】
反応後、上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、磁性体２粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該磁性体２粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。これを磁性カプセル構造体２とした。
【０３１９】
また、このカプセル構造体を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、乾燥処理後、この粒状体の表面に形成されたポリマーの質量を、飛行時間型二次イオン質量分析装置(ＴＯＦ-ＳＩＭＳ IV、ＣＡＭＥＣＡ製)により測定した。得られたマススペクトルから、カプセル構造体表面はポリヒドロキシ(４-メチルフェニル)吉草酸のホモポリマーで構成されていることがわかった。また、イオンスパッタリングによりカプセル構造体表面を少しずつ削りながら同様にＴＯＦ-ＳＩＭＳによりマススペクトルを測定していったところ、３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)吉草酸と３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェノキシ)吉草酸の共重合体が現れ、粒状体内部にいくにつれて前記共重合体における３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)吉草酸の組成比率が次第に減少し、逆に３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェノキシ)吉草酸の組成比率が増加して最終的にポリヒドロキシ(４-メチルフェノキシ)吉草酸のホモポリマーに変化することが確認された。これより、本実施例のカプセル構造体は、基材表面を極性の高いポリヒドロキシ(４-メチルフェノキシ)吉草酸で被覆し、その上を３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェノキシ)吉草酸と３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)吉草酸の共重合体によって、表層に至るにつれて３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)吉草酸の組成比率を高めながら被覆し、さらに最表層を極性の低いポリヒドロキシ(４-メチルフェニル)吉草酸のホモポリマーで被覆したカプセル構造体であることがわかった。
【０３２０】
ここで、該ＰＨＡの平均分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭＩＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝17,000、Ｍｗ＝36,000であった。
【０３２１】
(実施例９)カプセル構造体の作製９
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部に気相法で合成した１次粒子径0.02μｍのγ-Ｆe２Ｏ３微粉「ＮanoＴek」〔シーアイ化成(株)製〕(磁性体３とする)を１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を磁性体３表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０３２２】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルスルファニルバレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３２３】
反応後、上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、磁性体３粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該磁性体３粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。これを磁性カプセル構造体３とした。
【０３２４】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、該ＰＨＡは(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルスルファニル吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。
【０３２５】
(実施例10) カプセル構造体の作製10
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部に湿式法で合成した粒子径0.3μｍのマグネタイト微粒子「マグネタイトＥＰＴ500」〔戸田工業(株)製〕(磁性体４とする)を１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を磁性体４表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０３２６】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)0.8質量部、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)0.2質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪して試料１を得た。
【０３２７】
比較対照として、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)バレリルＣoＡを、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)に変更する以外は、上記と同様の方法で試料２を得た。
【０３２８】
上記の試料10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、いずれの試料においても、磁性体４粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該磁性体４粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。それぞれを磁性カプセル構造体４および５とした。
【０３２９】
対照として、0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)49質量部に磁性体４粒子１質量部を添加し、30℃で2.5時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、磁性体４粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０３３０】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％を表３に示す。
【０３３１】
【表３】
Figure 0004579502
【０３３２】
(実施例11) カプセル構造体の作製11
実施例10で製造した磁性カプセル構造体４についてエポキシ化反応を行った。磁性カプセル構造体４の１質量部を四つ口丸底フラスコに加え、蒸留水６質量部を加えて攪拌した。フラスコ内を40℃に加温し、これに過酢酸30％のヘキサン溶液１質量部を連続的に滴下し、攪拌下40℃で５時間反応させた。反応は磁性カプセル構造体同士が凝集することなく進行した。反応終了後、室温まで冷却し、反応液をろ過することで、磁性カプセル構造体を回収した。この回収した磁性カプセル構造体は蒸留水に再懸濁した後、遠心分離(29400ｍ/s2(=3000Ｇ)、４℃、30分間)した。分離した後、磁性カプセル構造体を蒸留水に再懸濁し、再度遠心分離を行って洗浄した。更に、この洗浄操作を３回繰り返した。その後、真空乾燥することで、所望する磁性カプセル構造体６を得た。
【０３３３】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸85％、３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)吉草酸11％、３-ヒドロキシ-５-(４-エポキシフェニル)吉草酸４％であった。
【０３３４】
この反応系が不均一反応であるため、カプセル構造体の表面はエポキシ化され、被覆内部は未反応のままであると考えられる。
【０３３５】
(実施例12) カプセル構造体の架橋反応
実施例11において製造した磁性カプセル構造体６を50質量部、遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)してカプセル構造体を回収し、精製水50質量部に懸濁する操作を３回繰り返したのち、該懸濁液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン0.5質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去した(これを磁性カプセル構造体７とする)。さらに、磁性カプセル構造体７を70℃で12時間反応させた(これを磁性カプセル構造体８とする)。
【０３３６】
上記磁性カプセル構造体７及び磁性カプセル構造体８をクロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出し、真空乾燥によりクロロホルムを除去し、示差走査熱量計(ＤＳＣ；パーキンエルマー社製、Ｐyris １、昇温:10℃/分)装置で測定を行った。その結果、磁性カプセル構造体７では90℃付近に明確な発熱ピークがみられ、ポリマー中のエポキシ基とヘキサメチレンジアミンとの反応が起こり、ポリマー同士の架橋が進行していることが示される。一方、磁性カプセル構造体８では明確なヒートフローは見られず、架橋反応がほぼ完了していることが示される。
【０３３７】
さらに、同様のサンプルにつき、赤外吸収を測定した(ＦＴ-ＩＲ；パーキンエルマー社製、1720Ｘ)。その結果、磁性カプセル構造体７で見られたアミン(3340 cｍ-1付近)及びエポキシ(822 cｍ-1付近)のピークが磁性カプセル構造体８では消失している。
【０３３８】
以上の結果より、側鎖にエポキシユニットをもつＰＨＡとヘキサメチレンジアミンを反応させることにより、架橋ポリマーが得られることが明らかとなった。
【０３３９】
一方、比較対照として磁性カプセル構造体５について同様の評価を行ったが、前記の如き、ポリマー同士の架橋を明確に示す評価結果は得られなかった。
【０３４０】
(実施例13) カプセル構造体のグラフト化
実施例11において製造した磁性カプセル構造体６を50質量部、遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)してカプセル構造体を回収し、精製水50質量部に懸濁する操作を３回繰り返したのち、凍結乾燥により水を除去した。ここに、末端アミノ変性ポリシロキサン(変性シリコーンオイルＴＳＦ4700、ＧＥ東芝シリコーン(株)製)を10質量部添加し、70℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、20分間)する操作を繰り返すことにより洗浄し乾燥することで、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する磁性カプセル構造体９を得た。
【０３４１】
(実施例14) カプセル構造体の作製12
実施例10で製造した磁性カプセル構造体４についてビニル基の酸化開裂反応を行った。磁性カプセル構造体４の10質量部を三つ口フラスコに移して、過酸化水素50ppｍを添加した300質量部の蒸留水を加えた。オゾンを１質量部/時間の割りで吹き込み、３時間室温で攪拌した。反応は磁性カプセル構造体同士が凝集することなく進行した。反応終了後、反応液をろ過することで、磁性カプセル構造体を回収した。磁性カプセル構造体は、蒸留水に再懸濁した後、遠心分離(29400ｍ/s2(=3000Ｇ)、４℃、30分間)を行って残余する過酸化水素水を洗浄した。更に、この洗浄操作を２回繰り返した。その後、真空乾燥することで、磁性カプセル構造体10を得た。
【０３４２】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸84％、３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)吉草酸11％、３-ヒドロキシ-５-(４-カルボキシフェニル)吉草酸５％であった。
【０３４３】
この反応系が不均一反応であるため、カプセル構造体の表面は酸化開裂され、被覆内部は未反応のままであると考えられる。
【０３４４】
(実施例15) カプセル構造体の作製13
実施例９において製造した磁性カプセル構造体３の１質量部を、市販の過酸化水素水(三菱瓦斯化学(株)製、31％過酸化水素含有、ＪＩＳ Ｋ‐8230規格品)150質量部及び脱イオン水30質量部に添加し、なす形フラスコに移して、オイルバス上、100℃、１時間反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、磁性カプセル構造体を遠心分離(29400ｍ/s2(=3000Ｇ)、４℃、30分間)した。分離した後、磁性カプセル構造体を蒸留水に再懸濁し、再度遠心分離を行って、残余する過酸化水素水を洗浄した。更に、この洗浄操作を２回繰り返した。その後、真空乾燥することで、磁性カプセル構造体11を得た。
【０３４５】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルファニル吉草酸64％、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルフィニル吉草酸16％、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルホニル吉草酸20％であった。
【０３４６】
この反応系が不均一反応であるため、カプセル構造体の表面は酸化され、被覆内部は未反応のままであると考えられる。
【０３４７】
(実施例16) カプセル構造体の作製14
実施例９において製造した磁性カプセル構造体３の１質量部を市販の過酸化水素水(三菱瓦斯化学(株)製、31％過酸化水素含有、ＪＩＳ Ｋ-8230規格品)90質量部及び脱イオン水30質量部に添加し、なす形フラスコに移して、オイルバス上、100℃、１時間反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、磁性カプセル構造体を遠心分離(29400ｍ/s2(=3000Ｇ)、４℃、30分間)した。分離した後、磁性カプセル構造体を蒸留水に再懸濁し、再度遠心分離を行って、残余する過酸化水素水を洗浄した。更に、この洗浄操作を２回繰り返した。その後、真空乾燥することで、磁性カプセル構造体12を得た。
【０３４８】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルファニル吉草酸61％、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルフィニル吉草酸31％、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルホニル吉草酸８％であった。
【０３４９】
この反応系が不均一反応であるため、カプセル構造体の表面は酸化され、被覆内部は未反応のままであると考えられる。
【０３５０】
(実施例17) カプセル構造体の作製15
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)10質量部に磁性体１を１質量部、ＰＢＳ 39質量部を添加し30℃にて30分間緩やかに振盪してＰＨＡ合成酵素を磁性体１表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０３５１】
上記固定化酵素を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)48質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250,432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)１質量部、ポリエチレングリコール200(ＰＥＧ200:平均分子量190-210；キシダ化学)１質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)0.1質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３５２】
上記反応液10μlをスライドグラス上に採取し、１％ナイルブルーＡ水溶液10μlを添加し、スライドグラス上で混合した後、カバーグラスを載せ、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、磁性体１粒子表面が蛍光を発していることが確認された。従って、該磁性体１粒子はＰＨＡにより表面を被覆されていることがわかった。これを磁性カプセル構造体13とした。
【０３５３】
対照として、0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)49質量部に磁性体１粒子１質量部を添加し、30℃で2.5時間緩やかに振盪した後、同様にナイルブルーＡで染色して蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、磁性体１粒子表面は全く蛍光を発しなかった。
【０３５４】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、該ＰＨＡは(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)吉草酸ユニットからなるＰＨＡであることが確認された。また、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)吉草酸ユニットに由来するピーク以外に、3.5-3.8ppｍ、及び4.2ppｍ付近にＰＥＧに由来するピークが確認された。
【０３５５】
さらに、該ＰＨＡの分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ；東ソーＨＬＣ-8020、カラム；ポリマーラボラトリーＰＬgel ＭＩＸＥＤ-Ｃ(５μｍ)、溶媒；クロロホルム、カラム温度；40℃、ポリスチレン換算)により評価した結果、Ｍn＝７,700、Ｍｗ＝14,000であり、分子量低下効果が得られた。
【０３５６】
(実施例18) 積層構造体の作製
縦30ｍｍ×横30ｍｍ×厚さ３ｍｍのフェライトシート(ＮＰ-Ｓ01、日本ペイント(株)製、フェライト粒子の樹脂分散体)を１％グルタルアルデヒドに１時間浸漬し、純水洗浄後、pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)に30℃で30分間浸漬して、該酵素を固定化した。未反応のＰＨＡ合成酵素をＰＢＳで洗浄して除去し、固定化酵素を得た。
【０３５７】
30ｍｍol/L(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-メチルチオ(フェノキシ))バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250,432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)、0.1％ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)を含む0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)に上記固定化酵素を浸漬し、30℃で２時間緩やかに振盪した。反応終了後、0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)で洗浄して、未反応物等を除去した。
【０３５８】
反応後のガラスシートを１％ナイルブルーＡ水溶液で染色し、蛍光顕微鏡(330〜380nｍ励起フィルタ、420nｍロングパス吸収フィルタ、(株)ニコン製)観察を行った。その結果、フェライトシートの表面に蛍光が認められたことから、該シートはフェライトシートからなる基材がＰＨＡからなる膜で被覆された積層構造体であることがわかった。
【０３５９】
さらに、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-５-(４-メチルチオ(フェノキシ))吉草酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。
【０３６０】
(実施例19)カプセル構造体の被覆性評価
磁性体微粒子が完全にポリマーで保護被覆されているかどうかを確認するため、得られた磁性カプセル構造体１〜13、それぞれ、0.1gを、70℃に加熱した純水100ミリリットル中に２時間浸漬した後、溶出液中の金属含有率を測定したところ、金属含有率は全ての磁性カプセル構造体において３ppｍ以下であった。これより、これらの磁性カプセル構造体は「金属イオンを溶出しない」と判定することができる。
【０３６１】
(実施例20)カプセル構造体の磁性体の分散性評価
磁性体の磁性カプセル構造体における分散状態を確認するため、得られた磁性カプセル構造体１〜13、それぞれを、酢酸ウラニルで染色した後、透過型電子顕微鏡により磁性カプセル構造体における磁性体の分散状態を観察したところ、粒子内部に均一に分散しており、粒子表面近傍の一部、または表面近傍の全部への局在化は観察されなかった。
【０３６２】
(実施例21) カプセルトナーの製造１
まず、コアとして、下記の方法で重合体微粒子を製造した。イオン交換水710質量部に0.1ｍol/L Ｎa3ＰＯ4水溶液450質量部を投入し、60℃に加温した後、ＴＫ式ホモミキサー(特殊機化工(株)製)を用いて、12,000 rpｍにて攪拌した。これに1.0ｍol/L ＣaＣl2水溶液68質量部を徐々に添加し、Ｃa3(ＰＯ4)2を含む水系媒体を得た。次に、スチレンモノマー165質量部、n-ブチルアクリレート35質量部、銅フタロシアニン顔料12質量部、不飽和ポリエステル(フマル酸-プロピレンオキサイド変性ビスフェノールＡ)10質量部、エステルワックス60質量部。これに重合開始剤２,２’-アゾビス(２,４-ジメチルバレロニトリル)10質量部を溶解し、重合性単量体組成物を調製し、これを60℃に加温し、ＴＫ式ホモミキサー(特殊機化工(株)製)を用いて、12,000 rpｍで均一に溶解、分散した。前記水系媒体中に上記重合性単量体組成物を投入し、60℃,Ｎ２雰囲気下においてＴＫ式ホモミキサーにて10,000 rpｍで10分間攪拌し造粒した。その後、パドル攪拌翼で攪拌しつつ、80℃に昇温し、10時間反応させた。重合反応終了後、該重合体の懸濁液を冷却し、3.6質量部のＮa2ＣＯ3を添加してpＨ 11とした。次いで、スチレンモノマー82質量部、n-ブチルアクリレート12質量部、不飽和ポリエステル(フマル酸-プロピレンオキサイド変性ビスフェノールＡ)0.05質量部からなる重合性単量体系に重合開始剤として過硫酸カリウム0.3質量部を添加溶解させた溶液を滴下したのち、80℃に昇温し更に６時間重合させた。次いで、これを常温まで冷却し、塩酸を加えてリン酸カルシウム溶解除去させたのち、ろ過、乾燥の各工程を経てトナーのコア成分微粒子を得た。
【０３６３】
pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素溶液(10 Ｕ/ｍl)100質量部に対し、上記微粒子10質量部、ＰＢＳ 390質量部を添加し、30℃にて30分間緩やかに振とうしてＰＨＡ合成酵素を該微粒子表面に吸着させた。これを遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)し、沈殿をＰＢＳ溶液に懸濁し、再度遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)して固定化酵素を得た。
【０３６４】
上記固定化酵素10質量部を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)480質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルスルファニルバレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)10質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)１質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３６５】
反応終了後、98000ｍ/s2(=10000Ｇ)で10分間遠心分離し、沈殿を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)1000質量部に懸濁し、再び遠心分離する操作を３回繰り返し、沈殿を回収した。ここから、ろ過、乾燥の各工程を経てカプセル構造体Ａを得た。
【０３６６】
ここで、カプセル構造体Ａの一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。その結果、当該ＰＨＡは３-ヒドロキシ-５-フェニルスルファニル吉草酸をモノマーユニットとするＰＨＡであることが確認された。
【０３６７】
上記のカプセル構造体10質量部を、市販の過酸化水素水(三菱瓦斯化学(株)製、31％過酸化水素含有、ＪＩＳ Ｋ‐8230規格品)500質量部及び脱イオン水100質量部に添加し、なす形フラスコに移して、オイルバス上、100℃、３時間反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、カプセル構造体を遠心分離(29400ｍ/s2(=3000Ｇ)、４℃、30分間)した。分離した後、カプセル構造体を蒸留水に再懸濁し、再度遠心分離を行って、残余する過酸化水素水を洗浄した。更に、この洗浄操作を２回繰り返した。その後、真空乾燥することで、カプセル構造体Ｂを得た。
【０３６８】
ここで、カプセル構造体Ｂの一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルホニル吉草酸61％、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルフィニル吉草酸13％、３-ヒドロキシ-５-フェニルスルホニル吉草酸26％であった。
【０３６９】
得られたカプセル構造体ＡおよびＢそれぞれについて、10質量部に対して、疎水性酸化チタン微粉末0.12質量部を外添し、カプセル構造体表面に酸化チタン微粉末を有するカプセルトナーＡおよびＢを得た。
【０３７０】
一方、対照として、前記コア成分微粒子10質量部に対して、疎水性酸化チタン微粉末0.12質量部を外添し、トナー表面に酸化チタン微粉末を有するトナーＣを得た。
【０３７１】
それぞれのトナー６質量部に対して、アクリル樹脂で被覆したフェライトキャリア144質量部を混合して二成分現像剤とした。
【０３７２】
上記の現像剤を用いて、市販の複写機ＮＰ6000(キヤノン(株)製)にて23℃、60％ＲＨ環境下、画像を複写し、その画像耐久性、トナー飛散、かぶり等について評価した。その結果を表４に示す。カプセルトナーＡおよびＢを使用して調製した現像剤では、100,000枚の耐久においても画像濃度低下、トナー飛散、かぶり等の画像欠陥の発生は認められず良好な画質耐久性を示した。また、帯電性についてトリボ値を測定したところ、初期-33 ｍＣ/kg、耐久後-31 ｍＣ/kgと安定していた。さらに、定着に関しても問題は認められなかった。一方、トナーＣを使用して調製した現像剤では、200枚の耐久においても画像濃度低下、トナー飛散、かぶり等の画像欠陥の発生が認められ、オリジナル原稿に忠実な高精細な画質は得られなかった。また、トリボ値を測定したところ、初期-24 ｍＣ/kg、耐久後-18 ｍＣ/kgと不均一で、安定のない帯電性を示していた。さらに、定着性試験においては、耐高温オフセット性に劣るものであった。
【０３７３】
【表４】
Figure 0004579502
【０３７４】
備考 表中の記号；○:良好、△:やや不良、×:不良。
【０３７５】
また、カプセルトナーＡおよびＢの低温定着性の評価を行うために、ＮＰ6000と同じ定着器構成を有する外部定着器による定着試験を行った。定着試験の方法としては、幅２cｍ、長さ10cｍの短冊を作り、その上の未定着画像を、外部定着器の上部ローラーの温度をモニターしながら短冊の長さ方向にそってローラーを通過させることによって定着させ、得られた定着画像について、短冊の後部にオフセットが見られるか否かで定着性を判断した。その結果、カプセルトナーＡ、トナーＢともに定着開始温度が95℃と低く、低温定着性に優れることがわかった。
【０３７６】
さらに、カプセルトナーＡおよびトナーＢの耐ブロッキング性の評価を行うために、50〜70℃まで１℃おきに設定した温度下に、上記トナーをそれぞれ３日間放置した後の凝集性を観察し、各トナーを前述同様に現像化して画像評価を行った。そして、ハイライト領域のガサツキ具合の変化する点を耐ブロッキング温度とした。その結果、カプセルトナーＢの耐ブロッキング温度は68℃、カプセルトナーＡの耐ブロッキング温度は57℃と、カプセルトナーＢは耐ブロッキング性においてより優れることがわかった。
【０３７７】
以上から、ガラス転移温度の低いＰＨＡによってトナーをカプセル化することで低温定着性を実現することができ、さらにガラス転移温度の低いＰＨＡで被覆されたカプセルをガラス転移温度の高いＰＨＡで被覆すること(この場合、酸化反応により表面のＰＨＡの分子構造を変換すること)で、低温定着性と耐ブロッキング性を同時に実現できることがわかった。
【０３７８】
(実施例22) カプセルトナーの製造２
３リットルの四つ口セパラブルフラスコに、還流冷却管、温度計、窒素導入管、撹拌機を取り付け、このフラスコ中に、イオン交換水1200部、ポリビニルアルコール15部、ドデシル硫酸ナトリウム0.1部、スチレンモノマー75部、アクリル酸-n-ブチル25部、ジ-tert-ブチルサリチル酸クロム錯塩５部、銅フタロシアニン５部、２,２-アゾビス(２,４-ジメチルバレロニトリル)６部からなる混合物を投入し、高速攪拌装置ＴＫ-ホモミキサーで10,000 rpｍ、10分間攪拌して造粒した後、回転数を1,000 rpｍに減速し、窒素ガスによるバブリングを十分に行った。次に、攪拌装置を三日月形状の攪拌羽根に変更し、緩やかな攪拌と共に、80℃に加熱したオイルバス中で16時間重合した。
【０３７９】
重合反応終了後、反応容器を室温まで冷却した後、分散液を５回のデカンテーションにより洗浄し、濾過、水洗、乾燥して青色の粉体であるコア粒子を得た。前記コア粒子に実施例21と同様の方法でpＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素を固定化し固定化酵素を得た。
【０３８０】
上記固定化酵素10質量部を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)480質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)８質量部、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)バレリルＣoＡ(Ｅur.Ｊ.Ｂiocheｍ.,250，432-439(1997) (前記・非特許文献17)に記載の方法で調製)２質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)１質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３８１】
反応終了後、上記反応液を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)してカプセル構造体を回収し、精製水100質量部に懸濁する操作を３回繰返し、沈殿を回収し、カプセル構造体Ｃとした。
【０３８２】
カプセル構造体Ｃの10質量部を四つ口丸底フラスコに加え、蒸留水60質量部を加えて攪拌した。フラスコ内を40℃に加温し、これに過酢酸30％のヘキサン溶液10質量部を連続的に滴下し、攪拌下40℃で５時間反応させた。反応はカプセル構造体同士が凝集することなく進行した。反応終了後、室温まで冷却し、反応液をろ過することで、カプセル構造体を回収した。この回収したカプセル構造体は蒸留水に再懸濁した後、遠心分離(29400ｍ/s2(=3000Ｇ)、４℃、30分間)した。分離した後、カプセル構造体を蒸留水に再懸濁し、再度遠心分離を行って洗浄した。更に、この洗浄操作を３回繰り返した。その後、真空乾燥することで、所望するカプセル構造体Ｄを得た。
【０３８３】
ここで、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸86％、３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)吉草酸10％、３-ヒドロキシ-５-(４-エポキシフェニル)吉草酸４％であった。
【０３８４】
カプセル構造体Ｄ 10質量部に対し、解砕処理したＢＥＴ値360ｍ2/gの疎水性シリカ0.2質量部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してカプセルトナーＤとした。
【０３８５】
さらに、前記カプセル構造体Ｄ 10質量部を精製水に懸濁し、架橋剤としてヘキサメチレンジアミン５質量部を溶解させた。溶解を確認後、凍結乾燥により水を除去し、70℃で12時間反応させた。反応終了後、98000ｍ/s2(=10000Ｇ)で10分間遠心分離し、沈殿を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)1000質量部に懸濁し、再び遠心分離する操作を３回繰り返し、沈殿を回収した。ここから、ろ過、乾燥の各工程を経て青色のカプセル構造体Ｅを得た。カプセル構造体Ｅ 10質量部に対し、解砕処理したＢＥＴ値360 ｍ2/gの疎水性シリカ0.2質量部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してカプセルトナーＥとした。
【０３８６】
作製したトナーの画像評価を行うため、上記で得たトナー６部に対して、平均粒径が35μｍのフェライトコアにシリコーン樹脂をコートしたキャリア94部をポリ瓶に入れ、ターブラーミキサーで混合撹拌して二成分現像剤を作製した。そして、この現像剤をカラーレーザー複写機ＣＬＣ-500(キヤノン(株)製)改造機に搭載し、23℃,60％ＲＨ環境下、初期及び１万枚複写後の画像についてＳＥＭで観察し、画質の評価及び現像剤の劣化状態の評価を行った。
【０３８７】
画質の評価としては、１画素内でのレーザーのパルス幅変調(ＰＷＭ)による多値記録により、極小スポットの再現性を顕微鏡観察により評価した。また、１万枚複写後の現像剤を走査電子顕微鏡で観察した。
【０３８８】
また、トナーの耐ブロッキング性の評価を行うために、各種温度条件下に、上記で得たトナーを３日間放置した後の凝集性を観察し、各トナー組成物を前述のキャリアを用いて同様に現像化して画像評価を行った。
【０３８９】
また、定着性の評価としては、ＣＬＣ-500と同じ定着器構成を有する外部定着器による定着試験を行った。定着試験の方法としては、幅２cｍ、長さ10cｍの短冊を作り、その上の未定着画像を、外部定着器の上部ローラーの温度をモニターしながら短冊の長さ方向にそってローラーを通過させることによって定着させ、得られた定着画像について、短冊の後部にオフセットが見られるか否かで定着性を判断した。
【０３９０】
さらに、前記カプセル構造体の代わりに、前記コア粒子をカプセル化せずにそのまま用いたトナーＦを使用して、前記と同様の評価を行った。その結果を表５に示す。
【０３９１】
【表５】
Figure 0004579502
【０３９２】
備考 表中の記号；◎:非常に良好、○:良好、△:やや不良、×:不良
(ただし、上記の○、△、×は、前記実施例21における○、△、×とは対応しない)。
【０３９３】
(実施例23) カプセルトナーの製造３
実施例14と同様の方法でコア粒子を製造し、pＹＮ２-Ｃ１組換え株由来のＰＨＡ合成酵素を固定化し固定化酵素を得た。この固定化酵素10質量部を0.1ｍol/Lリン酸バッファー(pＨ 7.0)480質量部に懸濁し、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-フェニルバレリルＣoＡ(実施例22と同様の方法で調製)８質量部、(Ｒ)-３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)バレリルＣoＡ(実施例14と同様の方法で調製)２質量部、ウシ血清アルブミン(Ｓigｍa社製)１質量部を添加し、30℃で２時間緩やかに振盪した。
【０３９４】
反応終了後、上記反応液を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)してカプセル構造体を回収し、精製水100質量部に懸濁する操作を３回繰返し、沈殿を回収し、カプセル構造体Ｆとした。
【０３９５】
カプセル構造体Ｆの10質量部を四つ口丸底フラスコに加え、蒸留水60質量部を加えて攪拌した。フラスコ内を40℃に加温し、これに過酢酸30％のヘキサン溶液10質量部を連続的に滴下し、攪拌下40℃で５時間反応させた。反応はカプセル構造体同士が凝集することなく進行した。反応終了後、室温まで冷却し、反応液をろ過することで、カプセル構造体を回収した。この回収したカプセル構造体は蒸留水に再懸濁した後、遠心分離(29400ｍ/s2(=3000Ｇ)、４℃、30分間)した。分離した後、カプセル構造体を蒸留水に再懸濁し、再度遠心分離を行って洗浄した。更に、この洗浄操作を３回繰り返した。その後、真空乾燥することで、所望するカプセル構造体Ｇを得た。
【０３９６】
ここで、試料の一部を遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、10分間)により回収し、真空乾燥したのち、クロロホルムに懸濁し、60℃で20時間攪拌して外被を成すＰＨＡを抽出した。この抽出液について1Ｈ-ＮＭＲ分析を行った(使用機器:ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400、測定核種:1Ｈ,使用溶媒:重クロロホルム(ＴＭＳ入り))。ここから計算した各側鎖ユニットのユニット％は、３-ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸85％、３-ヒドロキシ-５-(４-ビニルフェニル)吉草酸10％、３-ヒドロキシ-５-(４-エポキシフェニル)吉草酸５％であった。
【０３９７】
カプセル構造体Ｇ 10質量部に対し、解砕処理したＢＥＴ値360ｍ2/gの疎水性シリカ0.2質量部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してカプセルトナーＧとした。
【０３９８】
さらに、カプセル構造体Ｇ 10質量部に末端アミノ変性ポリシロキサン(変性シリコーンオイルＴＳＦ4700、ＧＥ東芝シリコーン(株)製)100質量部を添加し、70℃で２時間反応させた。これをメタノールに懸濁し、遠心分離(98000ｍ/s2(=10000Ｇ)、４℃、20分間)する操作を繰り返すことにより洗浄し乾燥することで、ポリシロキサンのグラフト鎖を有する青色のカプセル構造体Ｈを得た。カプセル構造体Ｈ 10質量部に対し、解砕処理したＢＥＴ値360ｍ2/gの疎水性シリカ0.2質量部をヘンシェルミキサーで混合し、外添してカプセルトナーＨとした。
【０３９９】
前記トナーは、実施例22と同様の方法で画質の評価及び現像剤の劣化状態の評価を行った。
【０４００】
また、前記カプセル構造体の代わりに、前記コア粒子をカプセル化せずにそのまま用いたトナーIを使用して、前記と同様の評価を行った。その結果を表６に示す。
【０４０１】
【表６】
Figure 0004579502
【０４０２】
備考 表中の記号；◎:非常に良好、○:良好、△:やや不良、×:不良
(ただし、上記の○、△、×は、前記実施例21における○、△、×とは対応しない。)
【０４０３】
【発明の効果】
本発明における構造体は、磁性体の分散性および磁気応答性に優れ、金属イオンが外部に溶出されにくく、更に生体適合性に優れるため、種々の用途・分野に幅広く適用することが可能である。
【０４０４】
また、本発明における製造方法は、基材を被覆したカプセル構造体や積層構造体を、極めて簡便かつ環境低負荷なプロセスで製造することが可能である。
【０４０５】
【配列表】
Figure 0004579502
Figure 0004579502
Figure 0004579502
Figure 0004579502
Figure 0004579502
Figure 0004579502
Figure 0004579502

Claims (42)

  1. 化学式［１］から化学式［８］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートが基材の少なくとも一部を被覆しており、前記基材が粒状の磁性体であることを特徴とする構造体。
    Figure 0004579502
    （ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。Ｒ１がビニル基でありａが１から１０の整数のいずれかであるモノマーユニットである。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ビニル基、エポキシ基、ＣＯＯＲ２１（Ｒ２１：Ｈ原子、Ｎａ原子、Ｋ原子のいずれかを表す）からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｄは０から８の整数のいずれかを表し、Ｒ４は、ｄが０の場合、Ｈ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基からなる群から選ばれ、ｄが１−８の場合、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｆは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ６はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ７１、ＳＯ2Ｒ７２（Ｒ７１：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ７２：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ７１、ＳＯ2Ｒ７２（Ｒ７１：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ７２：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
  2. 前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項１に記載の構造体。
  3. 前記の化学修飾されたポリヒドロキシアルカノエートが、少なくともグラフト鎖を有するポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項２に記載の構造体。
  4. 前記グラフト鎖が、ハロゲン原子、ビニル基、エポキシ基あるいはカルボキシル基を有するモノマーユニットの少なくとも何れかを含むポリヒドロキシアルカノエートの化学修飾によるグラフト鎖であることを特徴とする、請求項３に記載の構造体。
  5. 前記グラフト鎖が、チオール基、水酸基あるいはアミノ基の少なくとも何れかを有する化合物のグラフト鎖であることを特徴とする、請求項３または請求項４に記載の構造体。
  6. 前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部が、架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項２に記載の構造体。
  7. 前記の架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートが、ビニル基あるいはエポキシ基を有するモノマーユニットの少なくとも何れかを含むポリヒドロキシアルカノエートが架橋化されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項６に記載の構造体。
  8. 前記基材が着色剤を含有していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の構造体。
  9. 前記着色剤が顔料であることを特徴とする、請求項８に記載の構造体。
  10. 前記着色剤が染料であることを特徴とする、請求項８に記載の構造体。
  11. 前記磁性体が磁性を有する金属または金属化合物からなることを特徴とする、請求項１に記載の構造体。
  12. 前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成が前記構造体の内側から外側に向かう方向において変化していることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の構造体。
  13. 前記基材にポリヒドロキシアルカノエート合成酵素が固定されていることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の構造体。
  14. 前記ポリヒドロキシアルカノエートの分子量が１，０００から１０，０００，０００であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の構造体。
  15. 中鎖長ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を粒状の磁性体からなる基材表面に固定し、該酵素により３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを重合させてポリヒドロキシアルカノエートを合成することにより、前記基材の少なくとも一部をポリヒドロキシアルカノエートで被覆することを特徴とする構造体の製造方法において、前記ポリヒドロキシアルカノエートが、化学式［１］から化学式［８］に示すモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つを含有するポリヒドロキシアルカノエートであり、前記ユニットのそれぞれに対して対応する３−ヒドロキシアシル補酵素Ａが順に化学式［９］から化学式［１５］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａであり、前記ポリヒドロキシアルカノエートが、化学式［２］の構造においてＲ２がエポキシ基、ＣＯＯＲ２１（Ｒ２１：Ｈ原子、Ｎａ原子、Ｋ原子のいずれかを表す）からなる群から選ばれたいずれかのユニットを少なくとも含む場合は、化学式［２］の構造においてＲ２がビニル基であるユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートにより被覆された構造体の該ビニル基の酸化反応により、また、前記ポリヒドロキシアルカノエートが、化学式［７］および［８］の構造からなる群から選ばれたいずれかのユニットを少なくとも含む場合は、化学式［１５］に示す３−ヒドロキシアシル補酵素Ａを少なくとも含んだ系での重合により得られる、化学式［１６］に示すフェニルスルファニル基を有するユニットを少なくとも含むポリヒドロキシアルカノエートにより被覆された構造体の該フェニルスルファニル基の酸化反応による、構造体の製造方法。
    Figure 0004579502
    （ただし、該モノマーユニットは、式中Ｒ１およびａの組合せが下記のいずれかであるモノマーユニットからなる群より選択される少なくとも一つである。Ｒ１がビニル基でありａが１から１０の整数のいずれかであるモノマーユニットである。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｂは０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ビニル基、エポキシ基、ＣＯＯＲ２１（Ｒ２１：Ｈ原子、Ｎａ原子、Ｋ原子のいずれかを表す）からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｃは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｄは０から８の整数のいずれかを表し、Ｒ４は、ｄが０の場合、Ｈ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基からなる群から選ばれ、ｄが１−８の場合、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｅは１から８の整数のいずれかを表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｆは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ６はＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基からなる群から選ばれたいずれか１つを表し、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ７１、ＳＯ2Ｒ７２（Ｒ７１：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ７２：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ７１、ＳＯ2Ｒ７２（Ｒ７１：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ７２：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、前記化学式中−ＳＣｏＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ａは前記化学式［１］で表されるモノマーユニットにおけるａと対応する１から１０の整数のいずれかを表し、Ｒ１はビニル基である。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中−ＳＣｏＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｂは前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるｂと対応する０から７の整数のいずれかを表し、Ｒ２は前記化学式［２］で表されるモノマーユニットにおけるＲ２と対応する、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ビニル基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中−ＳＣｏＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｃは前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるｃと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ３は前記化学式［３］で表されるモノマーユニットにおけるＲ３と対応する、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＳＣＨ3基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中−ＳＣｏＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｄは前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるｄと対応する０から８の整数のいずれかを表し、Ｒ４は前記化学式［４］で表されるモノマーユニットにおけるＲ４と対応し、ｄが０の場合、Ｈ原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ハロゲン原子、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、ＣＦ3基、Ｃ2Ｆ5基またはＣ3Ｆ7基からなる群から選ばれ、ｄが１−８の場合、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中−ＳＣｏＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｅは前記化学式［５］で表されるモノマーユニットにおけるｅと対応する１から８の整数のいずれかを表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中−ＳＣｏＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｆは前記化学式［６］で表されるモノマーユニットにおけるｆと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ６は前記化学式［６］で表されるモノマーユニットにおけるＲ６と対応する、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中−ＳＣｏＡ はアルカン酸に結合した補酵素Ａを表し、ｇは前記化学式［７］および［８］で表されるモノマーユニットにおけるｇと対応する１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７は前記化学式［７］および［８］で表されるモノマーユニットにおけるＲ７と対応する、Ｈ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ７１、ＳＯ2Ｒ７２（Ｒ７１：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ７２：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基からなる群から選ばれたいずれか１つを表す。）
    Figure 0004579502
    （ただし、式中ｇは１から８の整数のいずれかを表し、Ｒ７はＨ原子、ハロゲン原子、ＣＮ基、ＮＯ2基、ＣＯＯＲ７１、ＳＯ2Ｒ７２（Ｒ７１：Ｈ、Ｎａ、Ｋ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかを表し、Ｒ７２：ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、ハロゲン原子、ＯＣＨ3、ＯＣ2Ｈ5のいずれかを表す）、ＣＨ3基、Ｃ2Ｈ5基、Ｃ3Ｈ7基、（ＣＨ3）2−ＣＨ基または（ＣＨ3）3−Ｃ基であり、複数のユニットが存在する場合、各ユニット毎に独立して上記の意味を表す。）
  16. 前記基材を被覆する前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部に化学修飾を施す工程をさらに有する、請求項１５に記載の構造体の製造方法。
  17. 前記化学修飾を施す工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部にグラフト鎖を付加する工程であることを特徴とする、請求項１６に記載の構造体の製造方法。
  18. 前記グラフト鎖を付加する工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と、末端に反応性官能基を有する化合物とを反応させる工程であることを特徴とする、請求項１７に記載の構造体の製造方法。
  19. 前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ハロゲン原子、ビニル基、エポキシ基あるいはカルボキシル基を有するモノマーユニットの少なくとも何れかを含むポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項１８に記載の構造体の製造方法。
  20. 前記末端に反応性官能基を有する化合物が、チオール基、水酸基あるいはアミノ基の少なくとも何れかを有する化合物であることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の構造体の製造方法。
  21. 前記化学修飾を施す工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部を架橋化する工程であることを特徴とする、請求項１６に記載の構造体の製造方法。
  22. 前記ポリヒドロキシアルカノエートが、ビニル基あるいはエポキシ基を有するモノマーユニットの少なくとも何れかを含むポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする、請求項２１に記載の構造体の製造方法。
  23. 前記架橋化工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートの少なくとも一部と架橋剤とを反応させる工程であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の構造体の製造方法。
  24. 前記架橋化工程が、前記ポリヒドロキシアルカノエートに電子線を照射する工程であることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の構造体の製造方法。
  25. 前記基材は着色剤を含有する、請求項１５に記載の構造体の製造方法。
  26. 前記着色剤は顔料を含有する、請求項２５に記載の構造体の製造方法。
  27. 前記着色剤は染料を含有する、請求項２５に記載の構造体の製造方法。
  28. 前記磁性体が磁性を有する金属または金属化合物からなる、請求項１５に記載の構造体の製造方法。
  29. 前記３−ヒドロキシアシル補酵素Ａの組成を経時的に変化させることにより、前記ポリヒドロキシアルカノエートのモノマーユニット組成を前記構造体の内側から外側に向かう方向において変化させることを特徴とする請求項１５〜２８のいずれかに記載の構造体の製造方法。
  30. 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該酵素の生産能を有する微生物を使って生産する、請求項１５〜２９のいずれかに記載の構造体の製造方法。
  31. 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を該酵素の生産能に関与する遺伝子を導入した形質転換体により生産する、請求項１５〜２９のいずれかに記載の構造体の製造方法。
  32. 前記遺伝子はポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物から得られた遺伝子であることを特徴とする請求項３１に記載の構造体の製造方法。
  33. 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物である、請求項３０または３２に記載の構造体の製造方法。
  34. 前記シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属する微生物が、シュードモナス・プチダ・Ｐ９１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｐ９１、ＦＥＲＭＢＰ−７３７３）、シュードモナス・チコリアイ・Ｈ４５株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ Ｈ４５、ＦＥＲＭＢＰ−７３７４）、シュードモナス・チコリアイ・ＹＮ２株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＹＮ２、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７５）、シュードモナス・ジェッセニイ・Ｐ１６１株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ Ｐ１６１、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３７６）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項３３に記載の構造体の製造方法。
  35. 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する微生物が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．）に属する微生物である、請求項３０または３２に記載の構造体の製造方法。
  36. 前記バークホルデリア属に属する微生物が、バークホルデリア属・ＯＫ３株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＯＫ３、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７０）、バークホルデリア属・ＯＫ４株（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ． ＯＫ４、ＦＥＲＭ Ｐ−１７３７１）からなる群から選択される少なくとも１つの微生物である、請求項３５に記載の構造体の製造方法。
  37. 前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の生産能を有する形質転換体の宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項３２または３３に記載の構造体の製造方法。
  38. 請求項１から１４のいずれかに記載の構造体を含むトナー。
  39. 請求項１から１４のいずれかに記載の構造体からなるトナー。
  40. 請求項１５から２８のいずれかに記載の粒状の構造体を製造する工程を含む、トナーの製造方法。
  41. 請求項３８または３９に記載のトナーを被記録媒体に付与することで画像を形成する画像形成方法。
  42. 請求項３８または３９に記載のトナーを被記録媒体に付与することで画像を形成する画像形成装置。
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