JP2008507267A - 生体高分子産生の制御因子を使用した組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)請求項2〜4のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含み、かつ前記細菌が、
(ii)エキソポリサッカリド産生が抑制されるように(i)のポリペプチドを発現する工程と、
エキソポリサッカリド産生を抑制することができるポリサッカリドの存在下で粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌をこれらの細菌から同定する工程とを含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法を提供する。
ある実施形態では、変異誘発物質(a)と、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる細菌(b)とを接触させる工程であって、前記細菌が、
(i)少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含み、前記核酸分子が上記ヌクレオチド配列のいずれかであり、かつ前記細菌が、
(ii)変異誘発された細菌を産生する条件下で産生に充分な時間エキソポリサッカリド産生が抑制されるように(i)の少なくとも1つのポリペプチドを発現する工程(A)と、前記変異誘発された細菌の間で、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる1つまたは複数の細菌を同定する工程(B)とを含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法を提供する。1つの実施形態では、この方法で使用される変異誘発物質はスルホン酸エチルメタンであり、細菌はスフィンゴモナス細菌、例えば、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、S7、S88、S198、およびNW11から選択されるエキソポリサッカリドを産生することができるものなど(スフィンゴモナスα027株を含む)である。
本明細書中で使用される、用語「スフィンガン」および句「スフィンガンエキソポリサッカリド」は、スフィンゴモナス属のメンバーによって分泌された関連するが異なるポリサッカリド群をいう(Pollock,J.Gen.Microbiol.139:1939−1945,1993)。スフィンゴモナス属の代表的なメンバーおよびこれらが産生するスフィンガンには、エキソポリサッカリドS−60(ゲラン)を産生するスフィンゴモナス・パウチモビリス(ATCC 31461、以前はシュードモナス・エロデア)(例えば、U.S.Patent Nos.4,377,636;4,326,053;4,326,052、および4,385,123を参照のこと);エキソポリサッカリドS−7を産生するスフィンゴモナス種ATCC 21423(例えば、U.S.Patent No.3,960,832を参照のこと);エキソポリサッカリドS−88を産生するスフィンゴモナス種ATCC 31554(例えば、U.S.Patent Nos.4,331,440および4,535,153を参照のこと);エキソポリサッカリドS−88を産生するS−130(ウェラン)を産生するスフィンゴモナス種ATCC 31555(例えば、U.S.Patent No.4,342,866を参照のこと);エキソポリサッカリドS−194(ラムサン)を産生するスフィンゴモナス種ATCC 31961(例えば、U.S.Patent No.4,401,760を参照のこと);エキソポリサッカリドS−198を産生するスフィンゴモナス種ATCC 31853(例えば、U.S.Patent No.4,529,797を参照のこと);エキソポリサッカリドS−657(ジウタン)を産生するスフィンゴモナス種ATCC 53159(例えば、U.S.Patent No.5,175,278を参照のこと);エキソポリサッカリドNW11を産生するスフィンゴモナス種ATCC 53272(例えば、U.S.Patent No.4,874,044を参照のこと);および生体高分子B−16(アルカラン)を産生するスフィンゴモナス種FERM BP−2015(以前はアルカリゲネス・ラタスB−16)(例えば、U.S.Patent No.5,175,279を参照のこと)などが含まれる。
例えば、ゲラン(S−60)の主鎖は、糖であるD−グルコース、D−グルクロン酸、およびL−マンノースを2:1:1のモル比で含み、これらが互いに結合して以下のサブユニットの順序のテトラサッカリド繰り返し単位を形成する:グルコース、グルクロン酸、グルコース、ラムノース。
別のスフィンガン(ジウタン(S−657))の主鎖は、ヘキサポリサッカリド繰り返し単位を形成するグルコース残基2に結合したL−ラムノースのさらなるジサッカリド側鎖を有するという点でゲランと異なる。
さらに別のスフィンガン(ウェラン(S−130))は、ゲランと同一の一次構造を有するが、ペンタポリサッカリド繰り返し単位を形成するグルコース残基2に結合した1つのL−マンノースまたは1つのL−ラムノースの側鎖を有する。
本明細書中で使用される、「粘液」は、産生される細菌細胞に付着しないポリサッカリドをいう。すなわち、粘液形態のエキソポリサッカリドを、例えば、発酵培養液または培養液の水希釈物の遠心分離によって(熱処理または他の物理的または化学的処理の非存在下でさえも)細菌細胞から実質的に分離することができる。当分野で公知のように、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生する細菌を、光学顕微鏡での観察によってカプセルポリサッカリドを産生する細菌と区別することができる:カプセル化スフィンゴモナスが多細胞凝集体を形成する一方で、粘液形成細菌は均一に分散される。さらに、例えば、U.S.Patent No.6,605,461に記載の変異誘発によって、カプセル化スフィンゴモナスを、粘液性のスフィンゴモナスに変換することができる。
本明細書中で使用される、「親株」は、親株の遺伝子の中身(例えば、ゲノム配列内またはゲノム外配列の置換、挿入、または欠失)または表現型を修飾する化学的変異誘発、生物学的変異誘発、または他の型の変異誘発などの任意の処理の前の細菌群または各細菌をいう。当業者は、変異スフィンゴモナスといえども、その後の一連の変異処理にて、カプセル形態ではなく粘液形態のエキソポリサッカリドを産生するスフィンゴモナス誘導株などの「親株」になり得ることを理解している。本明細書中で使用される、用語「誘導体」は、スフィンゴモナスの種、株、または細菌をいう場合、本明細書中に記載されるように、スフィンガンエキソポリサッカリドを産生する能力が本質的に同一なままであるか増強される任意のスフィンゴモナスの種、株、または細菌を意味する。
多数の細菌種は、グルコースなどの容易に変換可能な炭素源および適量の酸素を供給した場合に酸性ポリサッカリドを合成および分泌する。細菌スフィンゴモナス属のいくつかのメンバーは、まとめてスフィンガンとして知られる種々の酸性ポリサッカリドを産生する。一定の環境状況下で、細菌は、負の制御因子系を介したエキソポリサッカリド産生の最小化によってエネルギーを保存する。本発明は、一般に、スフィンゴモナスにおけるエキソポリサッカリド産生を変化させる(例えば、統計的に有意な様式で増減する)ことができる1つまたは複数のポリペプチドをコードする核酸配列に関する。本発明はまた、もはやエキソポリサッカリド生合成の制御因子に応答しない細菌のスクリーニングによって粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法に関する。したがって、本発明の一定の好ましい実施形態では、スフィンゴモナス属におけるエキソポリサッカリド産生を調整することができる1つまたは複数のポリペプチドをコードする単離核酸分子を使用して、例えば、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する(すなわち、統計的に有意な様式で親株よりも大量に産生する)ことができる変異細菌を作製する。
「精製ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質」または「精製核酸分子」は、事実上核酸分子またはポリペプチドに会合する炭水化物、核酸(DNAまたはRNA)、または他のタンパク性夾雑物などの夾雑細胞成分を個別に本質的に含まない配列である。好ましくは、精製核酸およびポリペプチドは、本発明の化学的カップリング反応での使用または必要に応じて他の用途に充分に夾雑物を含まない。「単離ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質」または「単離核酸分子」は、その元の環境から取り出されている(天然の環境下で(例えば、天然環境は変化していない細胞であり得る)共存している物質のいくつかまたは全部から分離されているなど)配列である。
本明細書中で使用される、「調整因子」は、典型的には、本明細書中に記載のアッセイまたはスクリーニングにおける生物学的過程でのインヒビターまたはアクチベーター(または両方)(例えば、リプレッサー、アクチベーター、σ因子、抗菌薬、アンチセンス分子、干渉分子、および酵素など)としての活性を(直接的または間接的に)有する生体高分子(例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、または有機分子)などの化合物(天然に存在するか天然に存在しない)をいう。「調整」は、統計的に有意な様式で生物活性または過程の機能的性質(例えば、遺伝子発現、酵素活性、または受容体結合)を増強または阻害する(またはその両方)化合物の能力をいう。例えば、当分野で周知の方法(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989を参照のこと)を使用して、スフィンゴモナスS−88種(ATCC 31554)由来のゲノム発現ライブラリーを構築し、カプセル形態または粘液形態(好ましくは、粘液形態)のエキソポリサッカリドを発現する細菌(例えば、スフィンゴモナスX031株)に形質転換し、もはやエキソポリサッカリドを発現しない組換え細菌をスクリーニングすることができる。
本明細書中で使用されるように、ヌクレオチド配列は、
(a)ヌクレオチド配列がスフィンゴモナスまたはザントモナスから単離した配列番号3または1のコード領域に由来する場合(例えば、上記で考察した配列の配列または対立遺伝子異形(variation)の一部が含まれる)、
(b)ヌクレオチド配列が中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシー下で本発明のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる場合、
(c)ヌクレオチド配列が、(a)または(b)で定義したヌクレオチド配列の遺伝コード中の「ゆらぎ」の結果として縮重する場合(すなわち、配列が、異なるコドン配列を使用して同一のアミノ酸をコードする配列)、または
(d)(a)、(b)、または(c)に記載の任意の配列の相補物である場合、「実質的に類似している」と考えられる。本明細書中に記載のように、ポリヌクレオチド変種は、コードされたポリペプチドの活性が好ましくは実質的に減少するような1つまたは複数の置換、付加、欠失、および/または挿入を含み得る。
5’−GACGGATCCTTGCCGAGGTGCG−3’(配列番号5)、
5’−CGACGGCCACTACTAGCGTTCGAACG−3’(配列番号6)、
5’−GTCCGTCGGTATCTACGGCTTCGAACG−3’(配列番号7)。
配列番号5は順方向プライマーであり、配列番号6および配列番号7は逆方向プライマーである。
本発明の別の態様によれば、エキソポリサッカリドを過剰産生することができる細菌を同定および単離する方法を提供する。特に、エキソポリサッカリド生合成の調整因子を使用して、エキソポリサッカリド生合成の調整因子にもはや応答しないエキソポリサッカリド産生細菌を同定することができる。例えば、エキソポリサッカリドを産生する細菌のコロニーは、寒天プレート上に粘液性の外見を有する一方で、非産生細菌は非粘液性の外見を有する。エキソポリサッカリド産生細菌へのエキソポリサッカリド生合成の調整因子をコードする組換え発現ベクターの移入により、エキソポリサッカリド発現が抑制され、これは、細菌が寒天プレート上に非粘液性の外見を有することを意味する。これらの抑制された株を、エキソポリサッカリド生合成の調整因子の存在下でさえもエキソポリサッカリドを発現することができる自発的変異体または誘導性変異体についてスクリーニングすることができる。
前記細菌が、
(i)エキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含み、かつ前記細菌が、
(ii)エキソポリサッカリド産生が抑制されるように(i)のポリペプチドを発現する
工程と、
エキソポリサッカリド産生を抑制することができるポリサッカリドの存在下で粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌をこれらの細菌から同定する工程とを含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法を提供する。
前記細菌が、
(i)少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含み、前記核酸分子がエキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも1つのポリペプチドをコードし、ならびに、
前記細菌が、
(ii)変異誘発された細菌を産生する条件下で産生に充分な時間エキソポリサッカリド産生が抑制されるように(i)の前記少なくとも1つのポリペプチドを発現する工程(A)と、
前記変異誘発された細菌の間で、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる1つまたは複数の細菌を同定する工程(B)とを含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法を提供する。
一定の好ましい実施形態では、細菌は、S−60、S−7、S130、S−7、S−194、S−198、およびNW11などのスフィンゴモナスであり、変異誘発物質は、例えば、スルホン酸エチルメタン(EMS)、N−メチル−N’−ニトロ−ニトロソグアニジン(MNNG)または当分野で公知の別の適切な変異誘発物質である。別の好ましい実施形態では、エキソポリサッカリド生合成の調整因子は、配列番号1または3によってコードされ、好ましくは、配列番号2または4のアミノ酸配列をコードする配列を含む核酸分子によってコードされる。1つの特に好ましい実施形態では、親細菌はスフィンゴモナスα027であり、もはやエキソポリサッカリド生合成の調整因子に応答しないα027の変異体はスフィンゴモナスα062(ATCC PTA−4426)である(より詳細には、実施例を参照のこと)。別の実施形態では、親細菌はザントモナス・キャンペストリスX59であり、もはやエキソポリサッカリド生合成の調整因子に応答しないX59の変異体はザントモナス・キャンペストリスα449(ATCC PTA−5064)である。好ましくは、変異株は、(統計的に有意な様式で)親株よりも多くのエキソポリサッカリドを産生する(少なくとも約10%〜約20%多い、好ましくは少なくとも約20%〜約30%多い、より好ましくは少なくとも約30%〜約40%多いなど)。
本発明の別の態様は、エキソポリサッカリド産生の増強に関する。例えば、スフィンガンエキソポリサッカリドを産生するために、遺伝子操作したスフィンゴモナス細菌を、一般にU.S.Patent No.5,854,034に記載の当分野で周知の適切な発酵条件下で培養する。簡単に述べれば、遺伝子操作したスフィンゴモナスの培養に適切な培地は、一般に、例えば、炭水化物(グルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、またはマルトデキストリンが含まれる)などの炭素源;例えば、無機アンモニウム、無機硝酸塩、有機アミノ酸、または加水分解酵母、ダイズ粉、もしくはカゼインなどのタンパク性材料;蒸留可溶性成分(distiller’s solubles)またはコーンスティープリカー;無機塩およびビタミンを含む水性培地である。広範な種々の発酵培地が、本発明のスフィンガンの細菌産生を支える。炭水化物は、発酵培養液中に種々の量で含まれるが、通常、発酵培地の約1重量%と約5重量%との間である。炭水化物を、発酵前または発酵中に同時に添加することができる。窒素量は、水性培地の約0.01重量%〜約0.2重量%の範囲であり得る。単一の炭素源または窒素源ならびにこれらの供給源の混合物を使用することができる。無機塩のうち、スフィンゴモナス発酵で使用されるものは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、硝酸イオン、カルシウムイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン、および類似のイオンを含む塩である。マグネシウム、マンガン、コバルト、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、ヨウ化物、およびホウ酸塩などの微量金属も有利に含み得る。ビオチン、葉酸塩、リポ酸塩、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、およびビタミンB12、およびその混合物などのビタミンも有利に使用することができる。
スフィンゴモナスX287(ATCC PTA−3487)を使用して、125mlのバッフル付きフラスコ中の1%または5%グルコースを含む1/4YM−に震盪することなく30℃で2週間接種した。このような拡大インキュベーション後に培養物を1/4YM+プレートに塗布した場合、エキソポリサッカリド陰性変異体は認められなかった。同一の培養物を、10%グルコースを有する1/4YMのプレート上に塗布した。単離コロニー(83)を選択し、これを使用して3%グルコースを有する2ml 1/4YMに接種し、300rpmで震盪しながら30℃で40時間インキュベートした。これらの培養物を、高グルコースプレート上に塗布し、12コロニーを選択し、X729〜X741として保存した。これら12の変異体のうちの6つは、視覚的に白色の変異体であった。
本実施例は、以下の工程によってスフィンガンおよびキサンタンの生合成を抑制するDNA配列の同定を記載する:(1)スフィンゴモナスS−88ゲノムDNAの発現ライブラリーの作製、(2)発現ライブラリーのスフィンゴモナスS−7への形質転換、および(3)スフィンゴモナスS−7におけるエキソポリサッカリドS−7産生の抑制についてのスクリーニング(すなわち、プレート上に細菌培養物を塗布し、コロニーについて非粘液性の外見を観察する)。プライマー(配列番号5(22量体)ならびに配列番号6および7(それぞれ、26量体および27量体))を作製し、テンプレートZ964(Z939(pRK311−s88nc2、2.7Kb)由来のフラグメントであるpBluescriptKS−BH,716bp)と共に使用して、特に機能的spsNをコードする573塩基対のフラグメントを産生した。573塩基対のPCRフラグメント(配列番号1)を、プラスミドpRK311にクローン化し、2つの独立したクローン(X026およびX029)を以下のようにさらに試験した。
元の粘液株であるX287株およびα016株を、いくつかの42L発酵試験下で変異α062と比較した。これらの実験のための1%出発培養液として400mlの24時間フラスコ培養物を調製した。ATCC31464株(X287の親)を、カプセル形成ゲラン野生型株として使用した。
X029(ATCC PTA−5127)中に生体高分子抑制因子を含むDNA配列を、交配によってザントモナス・キャンペストリスX55(ATCC13951)およびX59(ATCC55298)にトランス抱合(transconjugated)した。ポリマー産生抑制コロニーを、テトラサイクリン含有選択プレート上で、α287、α300、およびα301として単離した。
Claims (53)
- 高ストリンジェント条件下でプローブとハイブリッド形成したままである配列を含む単離された核酸分子であって、前記プローブが、配列番号1または配列番号1の相補物からなる、単離核酸分子。
- 前記核酸分子が、スフィンゴモナス種でのエキソポリサッカリド産生を変化させることができる少なくとも1つのポリペプチドをコードする、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 前記少なくとも1つのコードされたポリペプチドが、配列番号2と少なくとも80%同一性のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離核酸分子。
- 前記少なくとも1つのコードされたポリペプチドが、アミノ酸が保存的に置換された配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離核酸分子。
- 前記少なくとも1つのポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の単離核酸分子。
- 前記少なくとも1つのポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項2に記載の単離核酸分子。
- 配列番号1または配列番号1の相補物に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 前記核酸分子がDNAまたはRNAである、請求項1から請求項7のいずれか一項に記載の単離核酸分子。
- 請求項2に記載の核酸分子に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現ベクター。
- 前記少なくとも1つのポリペプチドが、第2の核酸配列によってコードされたポリペプチド産物を含む融合タンパク質として発現される、請求項9に記載の組換え発現ベクター。
- 前記第2の核酸配列が、ポリペプチドタグまたは酵素をコードする、請求項10に記載の組換え発現ベクター。
- 前記プロモーターが調節されている、請求項9に記載の組換え発現ベクター。
- 前記ベクターがプラスミドである、請求項9に記載の組換え発現ベクター。
- 前記プラスミドがX029(ATCC PTA−5127)である、請求項13に記載の組換え発現ベクター。
- 配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現ベクター。
- 請求項9から請求項15のいずれか一項に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記原核細胞がスフィンゴモナス細胞である、請求項17に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がスフィンガン産生細菌である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記スフィンゴモナス細胞が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン(diutan)、アルカラン(alcalan)、S7、S88、S198、およびNW11からなる群から選択されるスフィンガンを産生することができる、請求項18に記載の宿主細胞。
- 前記スフィンガンが、カプセル形態または粘液形態で産生される、請求項19または請求項20に記載の宿主細胞。
- 前記スフィンガン産生細菌が、スフィンゴモナスα252株(ATCC PTA−5128)、X287株(ATCC PTA−3487)、X530株(ATCC PTA−3486)、Z473株(ATCC PTA−3485)、またはX031株(ATCC PTA−3488)である、請求項19に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がキサンタン産生細菌である、請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記キサンタン産生細菌がザントモナス細菌である、請求項23に記載の宿主細胞。
- 前記キサンタン産生細菌が、ザントモナスX59株(ATCC 55298)またはX55株(ATCC 13951)である、請求項23に記載の宿主細胞。
- 前記少なくとも1つの発現したポリペプチドまたは融合タンパク質が、前記宿主細胞中のエキソポリサッカリド産生レベルを変化させる、請求項16に記載の宿主細胞。
- 請求項2から請求項6のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを産生する単離細菌。
- 前記細菌がスフィンゴモナス細菌である、請求項27に記載の細菌。
- 前記スフィンゴモナス細菌が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、S7、S88、S198、およびNW11からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを産生することができる、請求項28に記載の細菌。
- 前記細菌が、スフィンゴモナスα062株(ATCC PTA−4426)である、請求項27に記載の細菌。
- 前記細菌がザントモナス細菌である、請求項27に記載の細菌。
- 前記細菌が、ザントモナスα449株(ATCC PTA−5064)である、請求項31に記載の細菌。
- スフィンゴモナスα062株(ATCC PTA−4426)およびその変異体または誘導体からなる群から選択される単離細菌であって、前記細菌が、請求項2から請求項6のいずれか一項に記載の核酸分子およびその混合物によってコードされたポリペプチドを発現する場合、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる、単離細菌。
- ザントモナスα449株(ATCC PTA−5064)およびその変異体または誘導体からなる群から選択される単離細菌であって、前記細菌が、請求項2から請求項6のいずれか一項に記載の核酸分子およびその混合物によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも、粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる、単離細菌。
- 細菌培養においてエキソポリサッカリドを産生する条件下で産生に充分な時間細菌を培養する工程であって、前記細菌が、請求項2から請求項6のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされたポリペプチドを発現する場合でさえも粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生する工程と、
前記培養物から粘液形態の前記エキソポリサッカリドを分離する工程と
を含む、エキソポリサッカリドを高産生する方法。 - 前記細菌がスフィンゴモナス細菌である、請求項35に記載の方法。
- 前記スフィンゴモナス細胞が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、S7、S88、S198、およびNW11からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを高産生することができる、請求項36に記載の方法。
- 前記細菌が、スフィンゴモナスα062株(ATCC PTA−4426)である、請求項35に記載の方法。
- 前記細菌が、ザントモナスα449株(ATCC PTA−5064)である、請求項35に記載の方法。
- 前記培養が発酵工程を含む、請求項35から請求項38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が、培養物1リットルあたり約20gから約60gのエキソポリサッカリドを産生する、請求項40に記載の方法。
- 前記発酵を、約25℃〜約35℃の範囲の温度で約48時間〜約96時間行う、請求項40に記載の方法。
- 前記エキソポリサッカリドの分離がアルコール沈殿を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記アルコール沈殿が、前記培養物に約1〜約1.5培養体積のアルコールを添加する工程を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記発酵培養物の粘度が、約15,000cp〜約40,000cpの範囲である、請求項44に記載の方法。
- 変異誘発物質(a)と粘液形態のエキソポリサッカリドを産生することができる細菌(b)とを接触させる工程(A)であって、前記細菌が、
(i)少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現ベクターを含むことと、前記核酸分子が請求項2から請求項6のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列であり、かつ前記細菌が、
(ii)変異誘発された細菌を産生する条件下で産生に充分な時間エキソポリサッカリド産生が抑制されるように(i)の少なくとも1つのポリペプチドを発現する工程(A)と、
前記変異誘発された細菌の間で、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる1つまたは複数の細菌を同定する工程(B)と
を含む、粘液形態のエキソポリサッカリドを高産生することができる細菌の作製方法。 - 前記変異誘発物質がスルホン酸エチルメタンである、請求項46に記載の方法。
- 前記細菌がスフィンゴモナス細菌である、請求項46に記載の方法。
- 前記スフィンゴモナス細胞が、ゲラン、ウェラン、ラムサン、ジウタン、アルカラン、S7、S88、S198、およびNW11からなる群から選択されるエキソポリサッカリドを産生することができる、請求項48に記載の方法。
- 前記細菌がザントモナス細菌である、請求項46に記載の方法。
- 請求項46から請求項49のいずれか一項に記載の方法によって産生された細菌。
- スフィンゴモナスα062株(ATCC PTA−4426)。
- ザントモナスα449株(ATCC PTA−5064)。
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