DK159278B - Fremgangsmaade til fremstilling af depolymeriseret heparin - Google Patents

Description

i

DK 159278 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et depolymeriseret heparin af den i kravets indledning angivne art, hvilket heparin egnet til terapeutisk anvendelse, især til forebyggelse af thromboser.

5 Thrombosis er en af de hyppigste cardiovaskulære sygdomme, som ofte giver anledning til permanent invaliditet.

Begrebet "thrombosis" kan omfatte tilstande, som bevirker en udstrakt tendens til bl od-klumpning, hvis forekomst kan henføres til: "risikofaktorer" hidrørende fra en thrombogen tilstand, såsom 10 tobaksrygning, stress, langtids-brug af kontraceptiva af progesto-gentypen og andre, arvelighedsfaktorer, såsom manglen på blodstørknings-hæmmende faktorer, mere specielt antithrombin III, årsagsfaktorer af forskellig oprindelse, der i et vist omfang 15 endnu ikke er udforsket, såsom modifikation af blodplade-adhæsion og andet, faktorer afledt af en midlertidig sænkning i blodcirkulationen, såsom efter kirurgiske indgreb under narkose.

De patologiske eftervirkninger, som skyldes en "thrombogen" til -20 stand forårsaget af en eller flere af de ovennævnte faktorer, kan være: pulmonar, cerebral, coronarisk og anden thrombo-embolisme, thrombose af dybtliggende vener, thrombophlebitis, varikøse syndromer, diffus spredning af intravaskulær mikrothrombi.

25 For at hindre forekomsten af sådanne tilstande har man idag to muligheder: 1. Brug af thrombolytiske midler, 2. Forebyggende terapi af thrombogene tilstande og deres eftervirkninger. Som følge af alvorligheden og den hastighed, hvorved 30 thromboser kan udvikle sig, er det indlysende, at den anden mulighed er langt den foretrukne.

Med henblik på at angribe thrombosisproblemet fra den forebyggende side er der idag to klasser af lægemidler tilgængelige, nemlig de orale antikoagulationsmidler, såsom coumarin og derivater deraf, samt heparin 35 Orale antikoagulationsmidler, såsom coumarin og derivater deraf, virker på leverniveauet og blokerer de to blodstørkningsfaktorer, proconvertin og prothrombin, men giver anledning til kumulative fænomener og er derfor dårligt egnede til forlænget behandling, ligesom de,

DK 159278B

2 på trods af at de er angikoagulationsmidler.kun har en ringe antithrom-botisk aktivitet, da de ikke har nogen virkning på andre blodstørknings faktorer, som hænger snævert sammen med thrombogenesis, fremfor alt Xa-faktoren og blodpiadefaktorerne.

5 I denne henseende frembyder heparin fordele ved,at det virker på adskillige plasmafaktorer for blodstørkning og især på thrombin, faktor Xa og endvidere på XII-faktoren, XI-faktoren og IX-faktoren, foruden blodpiadefaktoren kaldet PF4. Alle disse virkninger kan tilskrives thrombins specifikke evne til at afbiokere inhibitoren for de ovennævnte 10 blodstørkningsfaktorer, hvilken inhibitor er til stede i plasmae Denne inhibitor er antithrombin III og kræver ligesom en co-faktor for at udøve sin virkning,tilstedeværelsen af heparin.

* Desværre har heparin to ulemper, idet det for det første kun er aktivt parenteralt, og virkningen varer i højst 8-12 timer, således at 15 det er vanskeligt at tilvejebringe en forlænget profylaksis, hvor der daglig kræves 2 heparin-injektioner. For det andet har heparin ikke blot en antithrombotisk virkning, men også en antibl odstørkningsvirkning i almindelighed. Selv om denne sidstnævnte virkning er en fordel i visse tilfælde, kan i andre tilfælde blødningsn si koen blive et alvorligt 20 problem, dersom terapien ikke tilpasses den individuelle patient, uanset at profylaksen af thrombosis utvivlsomt frembyder fordele.

Heparinfraktioner med lav molekylvægt forekommer i to tilfælde: a) når man depolymeri serer heparin ved hjælp af kemiske eller enzymatiske metoder (jfr. A. Horner, i "HEPARIN", Kakkar, Thomas, 1976 25 og Perhin et al., Carb. Res., 18, 185 (1971)).

b) i modervæskerne fra ekstraktion af heparin til terapeutisk brug.

Sådanne fraktioner med en molekylvægt på 5000 og indeholdende varierende mængder svovlsyregrupper, i almindelighed færre end i heparin, har ikke tidligere fundet nogen nyttig terapeutisk anvendelse.

30 Det har nu vist sig, at sådanne fraktioner, såfremt de indeholder svovlsyregrupper i de mængder og stillinger, som er karakteristiske for heparinmolekylet, besidder farmakologiske egenskaber, som ligner egenskaberne af heparin, og at de har terapeutiske egenskaber, som endog er bedre end for heparin.

35 Mere specielt har man fundet, at: i) oligopolysaccharidfraktioner hidrørende fra depolymeriseri ngen af heparin eller svarende til depolymeriserede hepariner med en molekylvægt mellem 2000 og 5000 besidder biofarmakologiske egen-

DK 159278 B

3 skaber, som er bedre end hos heparin, forudsat at de behandles på passende måde, således at de aktive grupper genopbygges; ii) de således behandlede fraktioner er i modsætning til heparin som sådan også oralt aktive; 5 iii) de således behandlede fraktioner absorberes lettere af huden end heparin; iv) især besidder depolymeriserede og rekonstituerede hepariner et forhold mellem antithrombotisk aktivitet og antibl odstørkningsaktivitet, som er mere gunstigtend for kommerciel heparin.

10 Sammenfattende tilvejebringes ifølge den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte, til fremstilling af det ønskede depolymeriserede heparin.

Fra opløsningen opnås produktet ved udfældning med vand-blandbare opløsningsmidler eller ved frysetørring.

15 Det således opnåede produkt har følgende egenskaber:

Identifikation: et elfenbensfarvet pulver, som er let hygroskopisk, en vandig opløsning, som er klar eller let opal iserende, 20 - pH-værdien af en 5% vandig opløsning er 6 - 8, identifikation ved metakromatisk reaktion: 1 ml af en 2% opløsning af produktet sat til 1 ml af en 0,0025% toluidin-blå opløsning, der er gjort sur med 0,1 ml IN sal tsyre,skifter farven fra blå til rødlig-blå, 20 25 - specifik drejningsevne af den vandige opløsning [ar] = -40°/+50°

D

elektroforese på celluloseacetat (pyridin/eddikesyre/vand 1/10/229, pH-værdi 4,5 og udvikling med toluidinblå) giver et enkelt bånd med -4 2 -1 -1 en anodemobilitet U = 2,1 x 10 cm v sek. .

30

Andre kemiske specifikationer:

Gennemsnitlig molekylvægt (bestemt ved hjælp af Somogy-metoden sammenlignet med kommerciel heparin): mellem 2600 og 5500 dalton, hexosaminer efter hydrolyse (reaktion med p-dimethylaminobenz-35 aldehyd): 28 ± 2%, uronsyrer efter hydrolyse (reaktion med carbazol): 31 ± 4%, organisk S04“" efter hydrolyse (titrering med naphtharson): 30 ± 4%,

DK 159278B

4 molært forhold uronsyrer/hexosanriner/S04‘" = 1/1/2.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

5 Eksempel 1 500 g af et oligopolysaccharid med følgende analysedata: pH-værdi af 5% opløsning: 5,8, organisk S0."“: 13,6%, * 20 drejningsevne [a] = -48°,

10 D

molekylvægt (bestemt ved Somogy-metoden sammenlignet med kommerciel heparin) = 4850 + 300 dalton, - hexosaminer: 33,5%, uronsyrer: 31,8%, 15 - antikoagulationsaktivitet: praktisk taget nul, blandes på pulverform med 500 g pyridinsulfotrioxid og 500 g vandfri natriumcarbonat.

Blandingen opslæmmes i 10 liter destilleret vand og holdes omrørt i 2 timer ved stuetemperatur.

20 Efter forløbet af dette tidsrum behandles væsken med 20 liter methanol. Der dannes et hvidt bundfald, som, fraskilt ved centrifugering, genopløses i 5 liter destilleret vand og ledes gennem en kolonne (diameter 16 cm, højde 110 cm) indeholdende 20 liter Dowex®

Retardion 11 A 8.

25 Eluatet indstilles på pH-værdi 6 med 20% natriumhydroxid og behandles med 2 volumendele methanol. Efter dekantering, dehydratiseres det hvide bundfald med methanol og tørres i vakuum ved 40oC. Udbytte: 365 g. Produktet udviste følgende egenskaber ved analyse: pH-værdi af 5% opløsning: 6,5, 30 - organisk SO."": 31%, ^ 20 drejningsevne [a] = +47°,

D

molekylvægt (bestemt ved Somogy-metoden sammenlignet med kommerciel heparin) = 5300 ± 350 dalton, 35 - hexosaminer: 28,5%, uronsyrer: 30%, antikoagulationsaktivitet: 36 U/mg (USP).

5

DK 159278 B

Eksempel 2 250 g trimethylaminsulfotrioxid og 250 g vandfri natriumcarbonat blandes på pulverform med 250 g af et oligopolysaccharid med følgende analytiske basisegenskaber: 5 - pH-værdi af 5% vandig opløsning: 6,4, molekylvægt (bestemt ved Somogy-metoden sammenlignet med kommerciel heparin): 3400 ± 400 dalton, organisk SP^"": 11,8%, hexosaminer: 34,2%, 10 - uronsyrer: 36%, antikoagulerende aktivitet (USP): 0,5 U/mg

Blandingen dispergeres i 5 liter destilleres vand og omrøres 12 timer ved 55°C. Efter dette tidsrum ledes opløsningen gennem et leje af 10 liter Dowex® Retardion 11 A 8. Eluatet indstilles på pH-værdi 6 15 med 20% natriumhydroxid og behandles med 3 volumendele acetone. Der dannes et hvidt bundfald, som efter dekantering dehydratiseres med acetone og tørres i vakuum ved 40°C. Udbytte: 165 g.

Produktet udviste følgende analytiske egenskaber: pH-værdi af 5% vandig opløsning: 7,1% 20 20 - drejningsevne: [or] = +42°,

D

molekylvægt (bestemt ved Somogy-metoden sammenlignet med kommerciel heparin) - 3900 ± 280 dalton, organisk S04"“: 28,5%, 25 - hexosaminer: 29%, uronsyrer: 30%, antikoagulerende aktivitet: 17 U/mg (USP).

Det ved hjælp af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde opnåede produkt har været underkastet forskellige undersøgelser til bestemmelse af 30 dets farmakobiologi ske egenskaber og "aktivitet.

Toxikologi ske tests:

Ingen toxiske virkninger ved oral administrering til rotter, mus, kaniner eller marsvin indtil en dosis på 1000 mg/kg legemsvægt.

35 LDgQ i.p. (mus) mere end 3000 mg/kg legemsvægt. LD5Q i.v. (mus) mere end 1000 mg/kg legemsvægt.

LDjjq i.p. (rotter) ca. 2000 mg/kg legemsvægt. LDg0 i.v. (rotter) 354 mg/kg legemsvægt.

DK 159278B

6

Test for klaringsaktivitet:

Produktet sænker serumindholdet af triglycerider væsentligt i dyr, som er angrebet af hyperlipaemia fra triton.

5 Antikoagulerende aktivitet: USP » eller mere end 50 U/mg Kaolin-cephalin-størkningstidstest (KCCT): 7-19 Forhold mellem antithrombotisk aktivitet og antikoagulerende aktivitet in vitro (Yin's/KCCT): 2,5.

10

In vivo (hunde) antithrombotisk og antikoagulerende aktivitet

Ved intravenøs administrering (i.v.) (25 IU/kg) og ved oral administrering (300 - 1500 U/kg) af produktet forlænges thrombin-tiden og KCCT-værdien, og der opnås beskyttelse mod thrombosis fremkaldt af 15 thromboplasti ner.

In vivo (kaniner) antithrombotisk aktivitet

Ved intravenøs administrering af produktet i en dosis på 20 Anti Xa ϋ/kg opnås beskyttelse mod thrombin-fremkaldt thrombosis.

20 De omhandlede forbindelser må herefter antages terapeutisk at kunne anvendes enten oralt eller parenteralt til: forebyggelse af post-operations thromboembolismer, forebyggelse af thrombotiske anfald som følge af en thrombogen tilstand som f.eks. hos kvinder, der behandles i lang tid med orale 25 kontraceptiver af progestogenisk type, forebyggelse af venøse thromboser, forebyggelse af hyperkoagulationstilstande, korrektion af hyperdislipaemiske tilstande (hyperdislipoproteinae-mias).

30

Claims (1)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af depolymeriseret heparin med en lav molekylvægt og følgende fysisk-kemiske egenskaber: gennemsnitlig molekylvægt: mellem 2600 og 5500 dalton, 5. hexosaminer efter hydrolyse: 28 ± 2%, uronsyrer efter hydrolyse: 31 ± 4%, organisk SO^’” efter hydrolyse: 30 ± 4%, molære forhold mellem uronsyrer/hexosaminer/S0A“~ = 1/1/2, H 20 specifik drejningsevne af den vandige opløsning [ar] = +40° til 10 50°, D elektrophorese på cel!uloseacetat (puffer: pyridin/eddieksyre/vand = 1/10/229, pH 4,5 og udvikling med toluidinblå) = et enkelt bånd -4 2 -1 -1 med en anodemobilitet U = 2,1 x 10 cm v sek. , amorft, let hygroskopisk, elfensbensfarvet pulver, 15. klar eller opaliserende vandig opløsning, pH-værdi af 5% vandig opløsning: 6-8, metakromatisk identifikationsreaktion, hvor 1 ml af en 2% opløsning af produktet sat til 1 ml af en 0,0025% opløsning af toluidinblå forsuret med 0,1 ml IN saltsyre, bevirker et farveskift fra blå til 20 rødlig blå, KENDETEGNET ved, AT produktet kan opnås ved at omsætte en heparinfraktion med en gennemsnitlig molekylvægt mellem 2000 og 5000 dalton med en lige så stor vægtmængde sulfotrioxid-pyridin- eller sulfotrioxid-trimethylamin-kompleks i et alkalisk miljø på i og for sig 25 kendt måde, udfælde reaktionsproduktet med methanol, ethanol, acetone eller dioxan, genopløse det udfældede produkt i vand og lede opløsningen over en ionbytterharpiks eller molekylsigte. 30 35