BR102013010818A2 - Sulfated branches with anticoagulant agent - Google Patents

Abstract

ramnanas sulfatadas como agente anticoagulante. a presente invenção diz respeito aos polissacarídeos sulfatados, especialmente ramnanas sulfatadas obtidas de espécies de macroalgas verdes marinhas (gayralia brcislliensis e gayralia oxysperma) com capacidade de atuar na cascata de coagulação1 tendo efeito anticoagulante. concentrações entre 0,1-100 pg/ml dos polissacarideos de ambas as espécies, demonstram atividade de inibição da coagulação para os testes clássicos de tempo de tromboplastina parcial ativada (ttpa), tempo de trombina (u) e tempo de protrombina (tp). esses polissacarideos foram extraídos nas temperaturas entre 1-1000c, são sulfcitados (1-60%) e contêm ácidos urônicos (0-30%). são constituídos por ramnose (1-95%), glucose (0-40%) xilose (0-40%), manose (0-30%) e galactose (1 -30%).

Description

RAMNANAS SULFATADAS COMO AGENTE ANTICOAGULANTE Campo da Invenção A presente invenção diz respeito aos polissacarídeos sulfatados, preferencialmente ramnanas sulfatadas, obtidas das clorófitas do gênero Gayralia, particularmente as espécies Gayralia brosiliensis e Gayralia oxysperma, dotadas de atividade anticoagulante. Especificamente, o invento trata da utilização desses polissacarídeos sulfatados como constituinte de composições farmacêuticas, empregadas na terapia anticoagulante.

Fundamentos da Invenção e Estado da Técnica As doenças cardiovasculares estão intimamente relacionadas à trombose. Nos Estados Unidos, as doenças cardiovasculares apresentam uma incidência duas vezes maior do que a segunda causa de morte, o câncer. Mesmo quando as doenças cardiovasculares não são mortais, essas levam, com grande frequência, à invalidez parcial ou total com graves repercussões para o paciente, sua família e a sociedade. A incidência de doenças cardiovasculares vem aumentando consideravelmente nos últimos anos, não só nos países desenvolvidos, mas principalmente nos países em desenvolvimento, como o Brasil. Sua ocorrência está, na maioria dos casos, relacionada com características do estilo de vida dos habitantes de países desenvolvidos, como: sedentarismo, hábitos alimentares, estresse, dentre outros. -------O avanço tecnológico no diagnóstico, tratamento e prevenção----- das doenças cardiovasculares tornou disponível o uso de novas técnicas, tais como ultrassonografia, cineangiocoronariografia, revascularização miocárdica, tomografia computadorizada e outras. Novos compostos, dotados de atividade anticoagulante, têm sido também avaliados tanto na prevenção, como no tratamento de patologias cardiovasculares.

No início da década de 90, eram conhecidos apenas três fármacos anticoagulantes: heparina, aspirina e varfarina. Atualmente, há três novos compostos aprovados como anticoagulantes pelo FDA (U.S. Food and Drug Administrafion) e mais cinco em estudo clínico -fase III. Entretanto, devido aos seus mecanismos de ação, esses fármacos apresentam uso restrito a poucas patologias, e em muitos casos, não substituem o mais antigo anticoagulante em uso: a heparina. A heparina é um polissacarídeo sulfatado de origem animal. Foi o primeiro fármaco utilizado como anticoagulante e, depois de 60 anos, ainda é o anticoagulante mais utilizado devido ao fato de possuir vários sítios de ação, modulando a cascata de coagulação. Ela é, principalmente, usada na prevenção de trombose venosa profunda em pós-cirurgias e pós-parto, em pacientes com estado de hipercoagulopatia, ou sujeitos a tromboses de diferentes etiologias.

Apesar da sua efetividade, a heparina pode apresentar algumas reações adversas indesejáveis. A exemplo disso, pode-se observar em alguns pacientes o aparecimento de trombocitópenia, doença causada pela redução de plaquetas no sangue. Outro problema observado foi o efeito hemorrágico residual da heparina, apresentado por fragmentos de heparina que não possuem atividade anticoagulante. Ademais, a heparina é obtida principalmente de intestino de suínos ou do pulmão de bovinos, o que pode trazer risco de como príons causadores da encefalopatia espongiforme (mais conhecida como mal da vaca louca).

Devido α esses fatores, a busca por compostos que possam agir como anticoagulantes tem se intensificado. Uma das principais frentes de pesquisa é a identificação de polissacarídeos sulfatados que possuam atividade anticoagulante. Nesse grupo de compostos há uma grande possibilidade de se encontrar moléculas que possam substituir o polissacarídeo heparina e, dentre essas moléculas, destacam-se os polissacarídeos sulfatados obtidos de algas marinhas.

As algas marinhas são organismos filogeneticamente distantes dos mamíferos, portanto, o risco por contaminação por partículas virais é mínimo. Elas podem ser divididas em três grandes grupos: as algas verdes, marrons e vermelhas. Estudos químicos com polissacarídeos sulfatados de algas têm demonstrado que suas estruturas variam de espécie para espécie e, às vezes, podem variar em diferentes partes da mesma planta. A complexidade na estrutura desses compostos é devido, por exemplo, às muitas possibilidades de ligações entre os monossacarídeos e a disposição dos grupamentos sulfato na molécula.

Desta forma, cada polissacarídeo pode possuir conformação estrutural única e portanto, apresentar atividades anticoagulantes diferentes e/ou mais potentes que outros polissacarídeos ou outros compostos já descritos. Assim, a identificação de um novo polissacarídeo sulfatado é acompanhada de perspectivas para descobertas de um novo fármaco a ser explorado industrialmente. Vários polissacarídeos ativos como anticoagulantes, especialmente os obtidos de algas vermelhas e marrons, têm sido isolados e caracterizados. Estes são representados, principalmente, por galactanas sulfatadas e fucanas sulfatadas que exibem atividade -anticoagulante.—...........-.-....-.-.-..-....--·.—....—...—...--------- A relação entre a estrutura e a atividade biológica destes polissacarídeos sulfatados, obtidos de algas marinhas, ainda não está bem estabelecida. No entanto, é provável que algumas características estruturais sejam essenciais para as atividades biológicas, especialmente a presença e a distribuição de grupamentos sulfato em diferentes posições nestas moléculas, assegurando dessa forma, interações com proteínas catiônicas. A importância da massa molar e das unidades monossacarídicas destes polímeros também é relevante.

Até recentemente, poucos estudos da bioatividade foram realizados com polissacarídeos obtidos de macroalgas verdes marinhas, quando comparados as galactanas e fucanas obtidas de algas vermelhas e marrons, respectivamente. Portanto, polissacarídeos sulfatados obtidos de macroalgas verdes marinhas, representam fonte potencial, como compostos anticoagulantes, a ser explorada.

Espécies do gênero Monostroma, especialmente Monostroma nitidum e Monostroma latissimum, são descritas por sintetizarem polissacarídeos sulfatados, que apresentam atividade anticoagulante. Esses polímeros são constituídos principalmente por unidades de ramnose e teores de sulfato entre 20-35%. O mecanismo de ação proposto para estes compostos é, frequentemente relatado como, inibição in vitro dos fatores Xa e lia, mediada pela antitrombina e cofator II da heparina na cascata de coagulação. No entanto, para polissacarídeos sulfatados obtidos de espécies do gênero Gayralia não foram encontrados registros de atividade anticoagulante.

Heparinas não fracionadas e heparinas de baixa massa molar são os principais polissacarídeos sulfatados utilizados há mais de 60 anos como fármacos anticoagulantes. Contudo, a administração terapêutica continuada dessas heparinas, na prevenção e tratamento Uv Ulv I UI UI vi II vl I IUUCII IUUIICv/5/ I v I I wl vJI I I I" I 11U I II IUUU vários fatores adversos, citando-se, por exemplo, a hemorragia, a trombocitopenia, a síndrome da trombocipotenia induzida por heparinas com complicações trombóticas e o risco de contaminação viral, já que é obtida de animais. Ademais, no Brasil, o uso de heparinas comerciais de baixa qualidade em cirurgias cardíacas com circulação extracorpórea, foi acompanhado de indução à hipotensão e aumento significativo dos efeitos colaterais aos pacientes.

Considerando as características das heparinas comerciais, citadas anteriormente, a busca de novas fontes de polissacarídeos anticoagulantes, particularmente os obtidos de macroalgas verdes, representa uma importante alternativa de agentes com propriedades anticoagulantes.

Descricão da Abordagem do Problema Técnico Ramnanas sulfatadas isoladas das ciorofíceas Gayralia brasiliensis e Gayralia oxysperma são polissacarídeos polianiônicos capazes de interagir com proteínas catiônicas, como os co-fatores da cascata de coagulação, durante o processo de inibição da coagulação. Por serem obtidos de fontes vegetais renováveis e não apresentarem efeito citotóxico nos estudos utilizando modelos animais, essas moléculas são fonte potencial a serem exploradas na terapia anticoagulante.

Na contínua busca por alternativas à heparina, a presente invenção objetiva, principalmente, proporcionar um novo composto anticoagulante, que não apresente os inconvenientes descritos para a terapia anticoagulante feita com a heparina. Que forneça ainda, aplicação útil para as ramnanas sulfatadas extraídas dessas duas espécies de macroalgas verdes marinhas.

Descricâo breve dos desenhos FIGURA - 1: Análise da atividade anticoagulante pelo TTPA das frações GB, GBH e GBHS de Gayralia brasiliensis e GO de Gayralia oxysperma versus heparina (HP). FIGURA - 2: Análise da atividade anticoagulante pelo TT das frações GB, GBH e GBHS de Gayralia brasiliensis e GO de Gayralia oxysperma versus heparina (HP). FIGURA - 3: Análise da atividade anticoagulante pelo TP das frações GB, GBH e GBHS de Gayralia brasiliensis e GO de Gayralia oxysperma versus heparina (HP).

Descricâo detalhada da invenção (I) - Processamento das algas Algas Gayralia brasiliensis e Gayralia oxysperma são coletadas . em ambiente marinho. As algas primeiramente passam por um pré-tratamento onde são lavadas em água doce para remoção de sais e impurezas residuais, e posteriormente são encaminhadas para retirada do excesso de água. São então congeladas e secas até peso constante. As algas seguem para o processo de moagem, até granulometria final entre 0,1-5 mm. —f/Jf- Extração dos polissacaríde-os------------------------------------- A primeira etapa de extração dos polissacarídeos é realizada a partir da solubilização das algas secas e moídas em água purificada na concentração de 0,1-100 g/L, preferencialmente entre 10 e 40 g/L. Este processo é conduzido sob agitação a temperatura de 10-30 °C, preferencialmente entre 20 e 25 °C, por 2-24 h, preferencialmente entre 10 e 14 h. Após esta etapa o material é centrifugado, ou filtrado, obtendo-se um sobrenadante, ou filtrado, contendo polissacarídeos e um precipitado, ou não-filtrado, contendo a biomassa algal residual. O sobrenadante ou o filtrado devem ter seu volume reduzido, opcionalmente podendo suprimir esta etapa. Os polissacarídeos são então precipitados pela adição de solvente orgânico polar (etanol, metanol, acetona, isopropanol, n-propanol, entre outros), preferencialmente etanol, em proporção 1:2-5 (v/v), seguido de agitação, repouso sob refrigeração por pelo menos 3 h e centrifugação. Após centrifugação, o precipitado contendo polissacarídeos é ressolubilizado em água purificada. Os polissacarídeos obtidos são então secos (liofilização, estufa a vácuo, spray dryer, entre outros). A biomassa algal residual é ressolubilizada com o mesmo volume de água purificada utilizada na primeira etapa de extração dos polissacarídeos, mantida sob agitação preferencialmente à temperatura de 60-100 °C, preferencialmente entre 70 e 90 °C, por um período de 1-10 h, preferencialmente entre 3 e 6 h. Após esta etapa o material é centrifugado, ou filtrado, obtendo-se um sobrenadante, ou filtrado, contendo polissacarídeos e um precipitado, ou não-filtrado, contendo a biomassa algal residual. Os polissacarídeos são então precipitados pela adição de solvente orgânico polar (etanol, metanol, acetona, isopropanol, n-propanol, entre outros) preferencialmente etanol em proporção 1:2-5 (v/v) seguido de agitação, repouso sob —refrigeração por pelo menos-3 h e centrÍfugação.-Após centrifugação -Q--- precipitado contendo polissacarídeos é ressolubilizado em água purificada. Os polissacarídeos obtidos são então secos (liofilização, estufa a vácuo, spray dryer, entre outros). A etapa de extração dos polissacarídeos à temperatura de 60-100 °C pode ser repetida outras vezes para a obtenção de outras frações polissacarídicas semelhantes e consequentemente, um maior rendimento final. O produto obtido são polissacarídeos sulfatados, compostos principalmente por ramnose, xilose, glucose e ácidos urônicos, além de menores proporções de manose e galactose. Estes polissacarídeos apresentam capacidade de prolongar o tempo de coagulação nos testes in vitro de TTPA, TT e TP. (III) - Caracterização dos polissacarídeos Para determinar as características estruturais dos polissacarídeos extraídos de Gayralia brasiliensis e Gayralia oxysperma, os métodos a seguir são utilizados: - Quantificação de carboidratos totais pelo método de fenol-ácido sulfúrico (Dubois et al., 1956); - Quantificação de proteínas (Lowry et al., 1951); - Quantificação de ácidos urônicos pelo método de m-hidroxibifenila (Filisetti-Cozzi e Carpita, 1991); - Quantificação de grupos sulfato pelo método gelatina-bário (Dogson e Price, 1962); - Determinação da rotação óptica específica ([a]D25°); - Determinação da composição monossacarídica através de acetato de alditol por CG-SM; - Avaliação do perfil de ressonância nuclear magnética de carbono 13 (RMN - ,3C).

(IV) - Purificação e modificação química da fração GB A fração bruta e heterogênea GB, extraída de Gayraiia brasiiiensis é submetida à ultrafiltração em membrana obtendo-se a fração purificada GBH. Para estimar a massa molar da fração GBH foi determinada a variação do índice de retração com relação à concentração (dn/dc), através de cromatografia de exclusão estérica de alta pressão (HPSEC-RI) WATERS. A fração GBH, de massa molar conhecida, é submetida à degradação controlada de Smith (Goldstein et ai., 1965) seguida da etapa de hidrólise branda (Furneaux, Stevenson, 1990) e então, se obtém uma fração de massa molar relativamente menor do que a fração de origem (GBH), nomeada de GBHS. (V) - Ensaios de coagulação Os ensaios anticoagulantes (TTPA, TT e PT), das frações polissacarídicas GO de Gayraiia oxysperma e GB, GBH e GBHS obtidas de Gayraiia brasiiiensis da presente invenção, são realizados em coagulômetro. Para estes ensaios, utiliza-se plasma humano normal citratado e Kits comerciais HemosIL®. A presente invenção é melhor concretizada através dos exemplos descritos a seguir, mas não se limita aos mesmos.

Exemplos Exemplo 1 - Extração e Caracterização auímica dos polissacarídeos de —Gavralia brasiiiensis e Gavralia oxvsDomna --------------------------------- As algas Gayraiia brasiiiensis e Gayraiia oxysperma são coletadas em ambiente marinho na Baía de Guaratuba, Paraná, Brasil. As algas passam por um pré-tratamento onde são lavadas uma a uma em água doce para remoção de sais e impurezas residuais, e posteriormente é retirado o excesso de água. Então as algas são congeladas e secas sob sol até peso constante. As algas seguem para o processo de moagem, até atingir granulometria de ± 0,5 mm. A primeira etapa de extração dos polissacarídeos é realizada a partir das algas secas e moídas, com água purificada por destilação preferencialmente na concentração de 20 g/L. Este processo é conduzido sob agitação mecânica na temperatura de 20 °C por 12 h. Após esta etapa o material é centrifugado a 5.000 rpm, 5 °C por 30 min obtendo-se um sobrenadante que contém os polissacarídeos e um precipitado que contém a biomassa algal residual. O sobrenadante é concentrado em rotaevaporador até aproximadamente 1/5 do volume inicial. Os polissacarídeos são então precipitados pela adição de solvente orgânico polar, etanol, em proporção 1:3 (v/v) seguido de agitação, repouso sob refrigeração por pelo menos 12 horas e centrifugação a 5.000 rpm, 5 °C por 30 minutos. Após centrifugação o precipitado contendo polissacarídeos é ressolubilizado em água purificada. Após os polissacarídeos são congelados e secos por liofilização. A biomassa algal residual é ressolubilizada com o mesmo volume de água purificada utilizada na primeira etapa de extração dos polissacarídeos, mantida sob agitação mecânica na temperatura de 80 °C por um período de 4 horas. Após esta etapa o material é centrifugado a 5.000 rpm, 5 °C por 30 minutos obtendo-se um sobrenadante que contém os polissacarídeos e um precipitado que contém a biomassa algal residual. O sobrenadante é concentrado em —rotaevaporador -até-oproximadamente—U5--do- ^oiume inicial. Os polissacarídeos são então precipitados pela adição de solvente orgânico polar, etanol, em proporção 1:3 (v/v) seguido de agitação, repouso sob refrigeração por pelo menos 12 h e centrifugação a 5.000 rpm, 5 °C por 30 minutos. Após centrifugação o precipitado contendo polissacarídeos é ressolubilizado em água purificada. Após, os polissacarídeos são congelados e secos por liofilização. A etapa de extração dos polissacarídeos a temperatura de 80 °C é repetida por mais duas vezes para a obtenção de outras frações polissacarídicas semelhantes, e consequentemente, um aumento do rendimento.

Os polissacarídeos resultantes da extração a quente, frações GO e GB são apresentados na Tabela 1 de caracterização química.

Análises de RMN de 13C das frações GB e GO resultam em espectros similares e complexos. Caracterizados por sinais alargados e sobrepostos, devido a diferentes ligações glicosídicas, grupos sulfatos ligados a unidades de ramnose e variedade de unidades monossacarídicas presentes na composição desses polissacarídeos.

De forma geral, os espectros de RMN de ,3C dos polissacarídeos sulfatados presentes nas frações GB e GO, apresentam três principais regiões. A região de 17,8-18,2 ppm com sinal intenso, e bastante característico, referente ao C-6 de unidades de ramnose. A região anomérica com sinais em 97,5-106,0 ppm, referente aos carbonos anoméricos das unidades monossacarídicas presentes no polissacarídeo, principalmente de ramnose. Uma região bastante complexa em 60,0-85,0 ppm correspondente ao sinais dos demais carbonos do anel das unidades monossacarídicas.

Tabela 1 - Composição química dos polissacarídeos sulfatados presentes nas frações GB e GO, isoladas das macroalgas verdes marinhas Goyralia brosiliensis e Gayralia oxysperma, respectivamente.

Exemplo 2: Purificação e modificação auímica da fracâo GB

Para obter uma fração polissacarídica purificàda, a fração GB é submetida à ultrafiltração em membrana de celulose regenerada, com limite de exclusão de 300 kDa (Millipore). A ultrafiltração é realizada por um sistema de filtração modelo 16249, SARTORIUS, acoplado a um cilindro de ar comprimido.

Neste método, os polissacarídeos da fração GB são solubilizados em água, na concentração de 0,1-2,0 g/L, e então filtrados em cilindro, sob pressão, sendo obtido um material retido na membrana e um material eluído.

Após avaliação do perfil cromatográfico por HPSEC-MALLS-IR da fração GBH (retida na membrana), pode se observar que a mesma é eluída com um pico simétrico, o que indica sua homogeneidade quanto a sua massa. A massa molar dessa fração é estimada em 2.100 kDa. A fração GBH é submetida à modificação química por degradação controlada de Smith. Neste método, ocorre a oxidação das unidades monosscarídicas como terminais não redutores na molécula, que são susceptíveis ao metaperiodato de sódio. Então, o polissacarídeo original GBH é clivado, o que resulta em fragmentos polissacarídicos de massa molar menor. A fração polissacarídica GBH é solubilizada em água purificada, sendo então, adicionada uma solução de metaperiodato de sódio 0,1 M, para obtenção de uma solução contendo metaperiodato de sódio a 0,05 M. Essa solução é mantida em ambiente escuro e temperatura ambiente durante 72 h. Após esse período, essa solução é tratada com etilenoglicol e o excesso de metaperiodato de sódio é consumido. Os polissacarídeos, produtos da degradação controlada de Smíth, são reduzidos com borohidreto de sódio por 20 h, neutralizada com ácido acético, dialisada e liofilizada (Goldstein et a/.; 1965). Esses polissacarídeos são submetidos à hidrólise branda com TFA 1 M durante 20 horas a temperatura ambiente (Furneax e Stevenson, 1990). A fração polissacarídica obtida a partir de GBHS foi nomeada GBHS.

Os polissacarídeos resultantes da purificação (fração GBH), e os polissacarídeos obtidos por degradação controlada de Smith são apresentados na Tabela 2 de caracterização química. ----------Na Tabela 2 pode -se observar -que após a-degradação______________ controlada de Smith, a fração GBHS em relação à fração GBH, apresenta um aumento significativo nos teores de ramnose (51,0—>74,1 mol%), diminuição dos teores de xilose (12,0-+1,8 mol%), diminuição dos teores de glucose (22,3—+18,8 mol%) e de galactose (9,3—+0 mol%). Portanto, o processo de degradação controlada de Smith ocasiona a oxidação parcial das unidades de xilose, glucose e remove de maneira total as unidades de galactose. Ademais, é observado um aumento nos teores de grupos sulfato (29,1-+38,2%).

Tabela 2 - Composição química dos polissacarídeos sulfatados presentes nas frações GBH e GBHS, isoladas da macroalga verde marinha Gayrolio brosiliensis.

Exemplo 3: Ensaios de atividade ánticoaaulante O ensaio de TTPA é realizado com amostras de plasma humano normal citratado (90 μι.) misturadas com 10 yL dos polissacarídeos em diferentes concentrações (0,1-100 yg/mL), solubilizados em NaCI 0,9% e incubados a 37°C por 60 segundos. Após, são adicionados 100 yL de reagente comercial para ensaio de TTPA pré-aquecido e a mistura é Ihcubãdd^d^T^ por 2 mlnrCtõreto de cdtctü pré-nquecido (100~pt;~Q,25” --mol/L) é então adicionado e o TTPA é medido pelo tempo de formação do coágulo em coagulômetro.

Para realizar o ensaio de TT, plasma humano normal citratado (90 pL) é misturado com 10 pL de diferentes concentrações (0,1-100 pg/mL) dos polissacarídeos solubilizados em NaCI 0,9% e incubados por 60 segundos a 37°C. Então, 200 μί pré-aquecidos de reagente comercial para ensaio de TT são adicionados e o tempo de coagulação é medido em coagulômetro. O ensaio de TP é realizado com plasma humano normal citratado (90 μί) misturado com 10 μί de diferentes concentrações (0,1-100 μg/mL) dos polissacarídeos solubilizados em NaCI 0,9%, incubados por 60 segundos a 37°C. Em seguida, 200 μί pré-aquecidos de reagente comercial para ensaio de TP são adicionados e o tempo de coagulação é medido em coagulômetro.

Os resultados dos bioensaios TTPA, TT e TP foram expressos como médias ± desvio padrão da média. Todas as análises foram realizadas no programa GraphPad Prism 5.0. A inibição da coagulação pelas frações GB, GBH e GBHS obtidas de Gayralia brasiliensis estão listadas na Tabela 3 e da fração GO, obtida de Gayralia oxysperma na Tabela 4.

Mais claramente, a resposta aos ensaios de TTPA, TT e PT de todas as frações descritas na presente invenção estão evidenciados nas Figuras 1, 2 e 3 respectivamente. Todas as frações foram efetivas e prolongaram o tempo de coagulação em todos os bioensaios testados.

Para o teste de TTPA, concentrações de 100 μg/mL das frações GO, GB e GBH foram eficientes como a HP. Para o ensaio de TT, concentrações mais baixas desses polissacarídeos, 60 μg/mL para a fração GO e 80 μg/mL para as frações GB e GBH foram efetivas como HP na inibição da formação do coágulo. Para o teste de TP, as frações —GO, GB e—GBHt—nas—concentrações—de—60^—80—e—100..............jjg/mL___ respectivamente, apresentaram atividade comparável à HP.

Para a fração obtida da degradação controlada de Smith, GBHS, concentrações de 40, 40 e 60 pg/mL foram necessárias para se ter atividade comparável a da HP, para os testes de TTPA, TT e PT, respectivamente. A fração GBHS contém maiores teores de sulfato (38,2%), maior concentração de unidades de ramnose (74,5 mol%) e polissacarídicos de massa molar menor. Estes fatores podem estar potencializando a atividade anticoagulante dessa fração, em relação às frações GB, GO e GBH, para os três ensaios anticoagulantes testados (TTPA, TT e PT). A prolongação do TTPA indica a inibição do sistema intrínseco e/ou da via final comum da coagulação, a prolongação de TT baseia-se na inibição da atividade da trombina ou da polimerização da fibrina e a prolongação de TP, demonstra a inibição da via extrínseca da cascata de coagulação. Portanto, os resultados de atividade anticoagulante das frações GB, GBH e GBHS obtidos de G. brasiliensis e da fração GO obtida de G. oxysperma, demonstram que esses polissacarídeos sulfatados são capazes de atuar no sistema intrínseco e/ou na via final comum e no sistema extrínseco da cascata de coagulação.

Tabela 3 - Atividade anticoagulante avaliada por TTPA, TT e PT das frações polissacarídicas GB, GBH e GBHS obtidas de Goyrolia brasiliensis. m GB = fração brufa, GBH = fração purificada, GBHS = fração purificada submetida à degradação controlada de Smith e HP = Heparina porcina (empregada para fins comparativos); μ TTPA = Tempo de tromboplastina parcial ativada em segundos; «=> TT = Tempo de trombina em segundos; w) TP = Tempo de protrombina em segundos.

Tabela 4 - Atividade anticoagulante avaliada por TTPA, TT e PT da fração polissacarídica GO obtida de Gayralia oxysperma. °> GO = fração bruta e HP = Heparina porcina (empregada para fins comparativos); bi TTPA = Tempo de tromboplastina parcial ativada em segundos; ci TT = Tempo de trombina em segundos; di TP = Tempo de protrombina em segundos.

Nos experimentos de TTPA, TT e TP do presente invento, a heparina apresentou uma ação anticoagulante muito alta, pois em baixas concentrações já inibiu completamente a coagulação do plasma. Estes resultados reforçam o grande risco de sangramento que a heparina pode causar, uma vez que o seu intervalo de segurança é muito pequeno.

REIVINDICAÇÕES

Claims (24)

1- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO POLISSACARÍDEOS SULFATADOS EXTRAÍDOS DE MACROALGAS VERDES MARINHAS COM AÇÃO ANTICOAGULANTE caracterizadas por compreender α utilização de macroalgas verdes para extração de compostos, compreendendo polissacarídeos sulfatados, especialmente ramnanas sulfatadas como agentes anticoagulantes.

2- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por as macroalgas verdes pertencerem à divisão Chlorophyta, à família Gayraliaceae, ao gênero Gayralia.

3- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por ser o gênero Gaylaria e compreender as espécies Gayralia brasiliensis e Gayralia oxysperma.

4- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizadas por compreender polissacarídeos sulfatados de Gayralia brasiliensis e de Gayralia oxysperma, obtidos a partir das seguintes etapas de extração: (i) coleta e lavagem com água; (ii) congelamento; (iii) secagem e moagem; (iv) extrações aquosas (frio e/ou a quente); (v) centrifugação/ filtração da biomassa algal; para a precipitação dos polissacarídeos; (vii) secagem.

5- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com as reivindicações 1-4, caracterizadas por compreender extratos de macroalgas verdes com teores de carboidratos totais entre 1-99% e proteínas totais entre 1-20%.

6- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com as reivindicações 1 -4, caracterizadas por compreender polissacarídeos sulfatados em sua forma bruta, após processo de purificação ou modificação bioquímica.

7- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS contendo polissacarídeos sulfatados purificados, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelos processos de purificação compreenderem: (i) purificação dos polissacarídeos por ultrafiltração; (ii) purificação dos polissacarídeos por cromatografia de troca iônica (DEAE-Sephacel); (iii) purificação dos polissacarídeos por cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-400-HR).

8- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS contendo polissacarídeos sulfatados modificados bioquimicamente, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelos processos de modificações bioquímicas compreenderem: (i) sulfatação; (ii) hidrólise (ácida e/ou enzimática) para obtenção de polissacarídeos com menores massas moleculares; (iii) hidrólise (ácida e/ou enzimática) para obtenção de -.-otigossacarídeos; (iv) carboxiredução para remoção de carboxilas.

9- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS contendo polissacarídeos sulfatados, de acordo com as reivindicações 4-8, caracterizados por compreender polissacarídeos com teores de grupamentos sulfatos entre 1-60%.

10- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS contendo polissacarídeos sulfatados, de acordo com as reivindicações 4-9, caracterizados por compreender polissacarídeos com teores de ácidos urônicos entre 1-30%.

11- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS contendo polissacarídeos sulfatados, de acordo com as reivindicações 4-10, caracterizados por compreender polissacarídeos com teores de ramnose entre 1-95%, glucose entre 0-40%, xilose entre 0-40%, manose entre 0-30% e galactose entre 0-30%.

12- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS contendo polissacarídeos sulfatados, de acordo com as reivindicações 7, caracterizado pelo polissacarídeo purificado ter entre 1500 e 2500 kDa.

13- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com a reivindicação 1-11, caracterizadas por ser como anticoagulantes.

14- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com a reivindicação 1-11, caracterizadas por sua aplicação no tratamento de doenças relacionadas com a coagulação sanguínea.

15- USO de polissacarídeos sulfatados, de acordo com as reivindicações 1-11, em produtos farmacêuticos.

16- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA com atividade anticoagulante, caracterizada por compreender polissacarídeos sulfatados obtidos do processo de extração de macroalgas verdes, incluindo as espécies Gayralia brasiliensis e Gayralia oxysperma, e veículo farmaceuticamente aceitável.

17- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS caracterizadas por compreender polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas verdes, incluindo as espécies Gayralia brasiliensis e Gayralia oxysperma, em suas formas brutas, purificadas ou modificadas bioquimicamente, ou quaisquer associação destes a um ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos.

18- COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS caracterizadas por compreender polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas verdes em concentrações entre 0,1 μg/mL a lOOOmg/mL.

19- USO de polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas verdes, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar doenças relacionadas com a coagulação sanguínea.

20- USO de polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas verdes, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo medicamento ser para uso como anticoagulante.

21. fSQ de polissacarídeos sulfatados extraídos-de-macroalgas-verdes,_ de acordo com as reivindicações 17-20 caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar doenças relacionadas com α coagulação sanguínea incluindo trombose venosa (incluindo trombose venosa profunda), trombose arterial (incluindo infarto do miocárdio), embolismo arterial periférico, embolismo pulmonar, coagulopatias agudas e crônicas, fibrilação atrial com embolização ou coagulação intravascular disseminada.

22- USO de polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas verdes, de acordo com as reivindicações 17-20, caracterizado pelo medicamento ser administrado sozinho ou em associação com outros medicamentos para promover a hemostasia.

23- MÉTODO para tratar ou prevenir uma desordem associada com coagulação, caracterizada por consistir essencialmente na administração de um medicamento, contendo, como princípio ativo, frações polissacarídicas brutas, purificadas ou modificadas bioquimicamente, ou quaisquer associação destas com veículos farmacêuticamente aceitáveis, compreendendo: (i) teores de grupos sulfato entre 1-60%; (ii) teores de ácidos urônicos entre 1-30%; (iii) teores de ramnose entre 1-95%; (iv) teores de glucose entre 0-40%; (v) teores de xilose entre 0-40%; (vi) teores de manose entre 0-30%; (vii) teores de galactose entre 0-30%.

24- MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, onde o medicamento