Verfahren zur Herstellung von zytostatisch wirkenden Heparinsalzen
Es ist bekannt, dass die in neuerer Zeit zur Behandlung von malignen Tumoren vielfach angewendeten sogenannten zytostatischen Stoffe den allgemeinen Nachteil einer unspezifischen Wirkung zeigen; diese Stoffe beeinflussen nicht nur die Lebensfunktionen der Tumorzellen, sondern üben ihre Wirkung auch gegenüber der übrigen Zellen des behandelten Organismus aus. Diese Mittel sind deshalb in sehr hohem Grade toxisch, wodurch ihre therapeutische Anwendung ausserordentlich erschwert wird.
Es ist ferner bekannt, dass bei Tumorerkrankungen die Menge des im Organismus anwesenden Heparins erheblich abnimmt und gleichzeitig vermehren sich in der Umgebung der Tumoren und anderer wuchernder Gewebe erheblich die heparinhaitigen sogenannten Ehrlichschen Mastzellen, deshalb benötigen die Tumorzellen zu ihrer Vermehrung auch Heparin.
Wir haben nun ein Verfahren zur Herstellung von neuen, erhöhte bzw. spezifische tumorhemmende Wirkung zeigenden Heparinsalzen gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man an sich schon zytostatisch wirkende oder an sich nicht zytostatische, aber die im Stoffwechsel der Zellen mitwirkenden Enzyme hemmende basische Verbindungen mit Heparin in Form der freien Säure umsetzt. Diese Eigenschaft der genannten neuen Heparinvernindüngen kann dadurch erklärt werden, dass diese Stoffe biologisch einen heparinoiden Charakter zeigen, und infolgedessen sich vorwiegend in den heparinaffinen Zellen des Organismus, also in den Tumorzellen anhäufen.
So beschädligen diese Stoffe spezifisch die Tumorzellen, und zwar in praktisch sehr erheblichem Grad auch bei so niedrigen Konzentrationen, bei welchen sie noch überhaupt keine oder nur kaum merkbare zellenschädigende Wirkung auf die gesunden Gewebe ausüben. Diese Eigenschaft der genannten Heparinverbindungen ist desto überraschender, da die bekannten Bausteine der Heparinsäure, die D-Glukuronsäure und das D-Glhkosamid die Entwicklung der experimentellen Tumore sogar begünstigen.
Diese neuen Heparinverbindungen können aus Heparin in Form der freien Säure (welche nicht unbedingt eine blutgerinnungshemmende Wirkung zeigen muss) und aus zytostatischen Stoffen oder aus zur Hemmung der im Stoffwechsel der Zellen eine Rolle spielenden Enzyme geeigneten basischen Stoffen hergestellt werden.
Die saure Komponente der erfindungsgemäss hergestellten neuen salzartigen Verbindungen ist also das stark sauer reagierende Heparin in Form der freien Säure; diese Verbindung wird in der Therapie vorwiegend in der Form ihres Natriumsalzes, und zwar zur Regulierung der Blutgerinnungsdauer, ferner bei Bluttransfusionen und zur Behandlung von Trombosen verwendet. Die verschiedenen natürlichen Heparine bestehen aus Makromolekülgemischen, wei- che sich voneinander nicht nur in ihren durchschnittlichen Molekulargewichten, sondern auch hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung unterscheiden.
Die am meisten vorkommende Art des Heparins in Form der freien Säure kann mit der folgenden, als erwiesen zu betrachtenden Zusammensetzung charakterisiert werden: sie besteht aus äquivalenten Mengen von D-Glukosamin-N-Schwefelsäure und D-Glukuronsäure, wobei jede zweite D-Glukuronsäure Komponente an der C2-Hydroxylgruppe und jede D Glukosamid-Komponente an der C4-Hydroxyllgruppe ebenfalls mit Schwefelsäure verestert ist und auch an die Stickstoffatome der letzteren je eine -SO3H- Gruppe gebunden ist.
Theoretisch ist also die Heparinmolekülkette aus solchen sich wiederholenden Tetrasaccharid-Einhei ten aufgebaut, die eine D-Glukosamin-N-schwefel säure-2-schwofelsäure-ester, eine D-Glukonsäure, eine
D-Glukosamin-N-schwefelsäure-2-schwefelsäure-ester und eine D-Glukonsäure-4-schwefels äure-ester-Ein heit in der angegebenen Reihenfolge enthalten. Das
Molekulargewicht dieser im Makromolekül sich mehr mals wiederhdlenden Tetrasaccharid-Einheiten be trägt 1002,8; sie enthalten je 5 SO3H- und 2 COOH
Gruppen.
Die starke Neigung des Heparins sich an Pro teine zu binden, kann durch seine grosse Azidität, welche vorwiegend von den SO3H-Gruppen hervor gerufen wird, erklärt werden. Die Wirkung des Hepa rins auf die Blutgerinnung wird durch sein Molekulargewicht und seinen Schwefelsäuregehalb beeinflusst. Das durchschnittliche Molekulargewicht eines eine gute blutgerinnungshemmende Wirkung zeigen den Heparins ist etwa 20,000. In den verschiedenen natürlichen Heparinen kommen aber in dem oben angeführten 4 Ringeinheiten umfassenden Molekülteil nicht immer 5 SO3H-Gruppen vor, sondern die Zahl dieser Gruppen schwankt im allgemeinen zwi schen 2 und 5.
Diese natürlichen Heparine sind zwar in alkalischem Medium ziemlich stabil, sie neigen aber in saueren Medien zur hydrolytischen Depolymerisation, wodurch ihre blutgerinnungshemmende Aktivität abnimmt oder völlig verlorengeht. Da aber die Heparin-Affinität der Tumorzellen auch gegen über solchen, therapeutisch sonst minderwertigen bzw. wertlosen Heparinen besteht, können als Ausgangsstoffe des erfindungsgemässen Verfahrens auch solche verwendet werden. Unter Heparinsäure ist also in dieser Beschreibung jede oben erwähnte Art des natürlichen Heparins, in Form von freier Säure, zu verstehen.
Als basische Komponente können bei der Herstellung der neuen Verbindungen solche basische Verbindungen von zellenbeschädigender Wirkung verwendet werden, welche als Zytostatica oder als zur Hemmung der im Stoffwechsel der Zellen eine Rolle spielenden Enzyme verwendbare Mittel bekannt sind.
Unter den therapeutisch verwendbaren, unmittelbar auf die Zellenteilung wirkenden Stoffen sind am meisten die N-Loste, und die Äthylenimin-Derivate als Ausgangsstoffe des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet; als Beispiele solcher Verbindungen können das 1 ,6-Bis-(ss-chloräthylariino)-1 ,6-desoxy-D-man nit und das 2-[Bis-(sswhloräthyl)-aminomethyl0-ben- zimidazol erwähnte werden.
Die zur Hemmung der im Stoffwechsel ! der Zel- len eine Rolle spielenden Enzyme verwendbaren basischen Stoffe gehören zu verschiedenen Klassen der organischen Verbindungen. Diese Verbindungen zeigen in freier Form oder in Form von anderen Salzen in den praktisch verwendbaren Konzentrationen überhaupt keine tumorhemmende Wirkung, nur ihre Heparinsalze zeigen eine tumorhemmende Aktivität ; dieser Umstand ist ein klarer Beweis des spezifischen Charakters der erfindungsgemäss hergestellten neuen Verbindungen.
Unter diesen enzymhemmenden Verbindungen zeigen die Sulfonamide, z. B. das p-Aminobenzolsulfonamid, das p-Aminobenzolsulfaguanidin oder das 2-(4 - Aminobenzolsulfamido) -4- methylthiazol eine hemmende Wirkung gegenüber den Glukose-6-phosphat-dehydrogenase, Milchsäure-dehydrogenase, Glukose-dehydrogenase, Zytochrom-reductase, Brenztraubensäure-carboxylase, Zytochromoxydase, Suk- zino-dehydrogenase usw. Enzymen eine hemmende Wirkung. Einige Aikaloide, wie z. B. das Chinin und die dem Chinin ähnliche synthetische Malariamittel, wie z.
B. das 3-Chlor-7-methoxy-9-(a-methyl- diäthylamino-butylamino)-acridin, das 6-Methoxy-8 (8-ditäthylamino-a-methylbutyl)-aminochinolin und das 7-Chlor-(4-diäthylamino-1 -methyl-butylamino) chinolin zeigen eine hemmende Wirkung gegenüber Zytochrom-reductase, Phosphoglycerinaldehyd-dehydrogenase, Phosphorylase, Hexochinase, Zytochromoxydase, Brenztraubensäuredehydrogenase, Phosphoglukomutase, Milchsäure-dehydrogenase, usw. Ver schliedene organische Arsenverbindungen, wie z. B. p-Amino-phenyldichlorarsin und 3-Amino-4-hydroxyphenyl-arsinoxyd hemmen ebenfalls die Funktion der Redox-enzymsysteme.
Die verschiedenen Chinone zeigen bekannterweise ebenfalls eine enzymhemmende Wirkung, z. B. gegenüber der Brenztraubensäure- dehydrogenase, Sukzino-dehydrogenase, Brenztraubensäure-carboxyl ase und Katalase. Bei den sogenannten Chinon-stick stofflosten und bei den Chinonäthylenimin-Derivaten, zum Beispiel: 2,5-Bis-fl-chloräthylamino-benzochinon-(l 4), 2,5-Bis-di-ss-chloräthylamino-benzochinon-(1 4), 2,5-Bis-äthylenimino-benzochinon-( 1,4) und 2, 5-Bis-n-propoxy-3, 6-bis-äthylenimino- benzocbinon-(1,4) kann das gleichzeitige Bestehen beider erwähnter Wirkungen (der zytostatischen und enzymhemmenden) angenommen werden (vgl. S. Peteren, W. Gauss und E. Urbschat, Angew. Chem. 67, 217 [1955]; W. Gauss und 5.
Petersen, op. cit. 69, 252 [1957].
Als verwandte Verbindung kann auch das 2,5-Bis äthylenimino-hydrochinon, bei welchem ebenfalls eine tumorhemmende Wirkung festgestellt wurde, (vgl. A. Marxer, Experimentia, 11, 186 [1955]), zu diesem Typ gerechnet werden. Da aus derartigen Verbindungen keine Salze mit Heparin gebildet werden können, haben wir ihre basisch substituierten Derivate, wie zum Beispiel: 2,5-Bis-P-climethylamino-äthoxy-3,6-bis- äthylenimino-benzochinon-(l, 1,4), 2, 5-Dichlor-3, 6-bis-ss-piperidino-äthylamino- benzochinon-(1, 4) und 2,5-Di-n-methylpiperazino-benzochinon(1 4) zur SalzbÅaldung verwendet.
Bei dem Heparin-natriumsalz sowie bei der freien Heparinsäure kann überhaupt keine wachstumhemmende Aktivität gegen Tumoren in Tierversuchen festgestellt werden; diese Stoffe haben sogar eine gerade gegengesetzte Wirkung, sie beschleunigen das Wachstum der Tumoren und verursachen zugleich eine Abnahme des Körpergewichtes. Das ist ebenfalls ein Beweis dafür, dass es sich im Falle der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen um eine neue, ganz spezifische und unerwartete Wirkung handelt.
In der Literatur wurden schon einige, mit organischen Basen gebildete Salze der Heparinsäure be schri'eben, welche aber keine zytostatische oder zur Hemmung des im Stoffwechsel der Tumorzellen eine Rolle spielenden Enzyme fähige Verbindungen als basische Komponente enthielten. Diese bekannten Heparinsalze haben auch überhaupt keine tumorhemmende Eigenschaften; sie zeigen höchstens hepa rinähnliche, blutgerinnungshemmende Wirkungen. So wurde z. B. eine aus 20 Teilen Heparin und 1 Teil Histamin hergestellte wässrige Lösung (R. K. Sanyal und G. B. West, Nature 178, 1293 [1956] und die mit N,N'-Bis-(a-methylbenzyi)äthyiendiamin (A. Can- tone, Minerva Med.
I. 230 [1953]) und mit Aminoakridinen gebildeten Heparinsalze (K. 5. Dodgson, F. A. Rose und B. Spencer, Biochem. J. 60, 346 [1955]) beschrieben, die aber keinerlei tumorhemmende Wirkung zeigen.
Die neuen, mit zytostatischen bzw. enzymhemmenden basischen Verbindungen gebildeten Heparinsalze werden im Sinne der vorliegenden Erfindung derart hergestellt, dass Heparin in Form der freien Säure mit an sich schon zytostatischen oder an sich nicht zytostatischen, aber die im Stoffwechsel der Zellen mitwirkenden Enzyme hemmenden basischen Verbindungen umgesetzt wird. Es ist dabei nicht erforderlich, dass die als Ausgangsstoff verwendete Heparinsäure eine blutgerinnungshemmende Aktivität zeigen soll. Die beiden Komponenten können z. B. in äquivalenten Mengen oder in einem solchen Mengenverhältnis verwendet werden, dass diF Menge der basischen Verbindung geringer als die aus der Zahl der anwesenden -NHO3H und -O-SO- Gruppen berechnete äquivalente Menge ist. In letzerem Falle werden saure Heparinsalze als Produkte gewonnen.
Beide Arten der als Produkt erhaltenen Heparinsalze zeigen die erwähnte vorteilhafte tumorhemmende Wirkung.
Die Reaktion kann in einem anorganischen oder organischen Lösungsmittel, zweckmässig in Wasser, in niederen primären Alkoholen oder in einer Mischung der gesamten Lösungsmittel, vorteilhaft in einem Temperaturberelch zwischen -10 und + 300 C vorgenommen werden.
Bei der Herstellung der erfindungsgemässen neuen Heparinsalze ist es nicht nötig, dass festes, isoliertes Heparin in Form der freien Säure als Ausgangsstoff verwendet werden soll; die bei der Heparinherstellung als Rohpodukt gewonnene wässerige oder organische saure Heparinlösung kann ebenfalls als Ausgangsstoff verwendet werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten neuen Heparinsalze sind im Wasser meistens gut löslich; der pH-Wert der Lösung hängt von der Zahl der im Heparin anwesenden SO3H-Gruppen und von der Menge der verwendeten basischen Komponente ab.
Zweckmässigerweise wird das Verhältnis dieser Faktoren derart gewählt, dass der pH-Wert der wässerigen Lösung des Produktes zwischen 1,5 und 7 sein soll.
Die im Sinne der vorliegenden Erfindung hergestellten neuen Heparinsalze zeigen eine zytostatische Aktivität, welche die ähnliche Wirkung der bisher bekannten zytostatischen Mittel wesentlich übertrifft, da diese neuen Verbindungen auf Grund ihrer spezifischen Wirkungsweise hauptsächlich auf die Tumorgewebe wirken. Das wird auch dadurch bewiesen, dass während z. B. 8 mg/kg 1,6-Bis-(ss-chlor- äthylamino)-1, 6-desoxy-D-mannit-dihydrochlorid wegen seiner allgemeinen zellenschädigenden Wirkung einen 20-25 % igen Gewichtsverlust bei den Tieren verursacht, das mit Heparin gebildete Salz derselben Verbindung in derselben Dose überhaupt keinen Gewichtsverlust herbeiführt, anderseits aber bei viel kleineren Dosen, z.
B. 2,5 mg/kg, das Hydrochlorid der genannten zytostatischen Verbindung überhaupt keine tumorhemmende Wirkung zeigt, während das mit Heparinsäure gebildete Salz eine sehr merkliche tumorhemmende Wirkung aufweist.
Beispiel I
4,55 g (0,012 Mol) 1,6-Bis-(p-chloräthylamino)- 1, 6-desoxy-D-mannit-dihydrochlorid werden in 20 ml Wasser gelöst und unter Eiskühlung mit einer Lösung von 1,34 g (0,024 Mol) Kaliumhydroxyd in 5 ml Wasser versetzt, dann wird dem Gemisch eine Lösung von 8,75 g Heparin in Form der freien Säure in 20 ml Wasser zugesetzt. Die klare Lösung wird bei einer Temperatur unter 300 C zur sirupartigen Dichte eingedampft und mit 75 ml abs.
Äthanol versetzt. Das ausscheidende Heparinsalz wird filtriert, mit 20 mi abs. Äthanol und dann mit 20 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 14,10 g 1 ,6-Bis-(ss-chluräthyiamin)-1 6- desoxy-D-mannit-hep arinsaures Salz erhalten (theoretische Ausbeute 14,21 g) in Form eines hell kremfarbigen, amorphen, wasserlöslichen 12,6% KC1 enthaltenden, keinen charakteristischen Schmelzpunkt zeigenden Produktes.
Das als Ausgangsprodukt verwendete 1,6-Bis-(ss- chloräthylamino)- 1, 6-desoxy-D-mannit-dihydrochlorid ( Degranol; , Mannomustin) ist ein bekanntes zytostatisches Mittel, dessen Herstellung in der Mitteilung von L. Vargha etc. (J. Chem. Soc. 1957, Seite 805) beschrieben ist.
Das zur obigen Reaktion verwendete Heparin in Form der freien Säure, zeigt eine blutgerinnungshemmende Aktivität von 3,2 IE/mg; es hat keinen charakteristischen Schmelzpunkt, wird über 1800 C langsam braun verfärbt und über 2050 C verkohlt.
Analyse: N= 3,0%, S = 13,15%. Dieses Heparin enthält also je Tetrasaccharidgruppe anstatt der maxi malen 5 im Durchschnitt nur 3,7 SO3H-Gruppen.
Demgemäss ist das Molekulargewicht dieser sich wiederholenden Tetrasaccharidgrappen anstatt 1002,8 nur 898.
Im EndprodUkt sind 80% der im Heparin ursprünglich anwesenden SOsH-Gruppen durch die Basizität des Mannomustins gebunden. Die Anwesenheit dieser freien SOsH-Gruppen wird auch durch den pH-Wert der wässerigen Lösung des Produktes (3-3,5) gezeigt.
Das auf obige Weise hergestellte Mannomustin Heparfuat hat in Tierversuchen folgende Resultate gezeigt:
Crocker S. 180 Tumor an Mäusen: tägliche Dosen von 25 mg/kg haben bei einer 10tägigen Behandlung das Wachstum der Tumoren um 42 % retardiert. Bei mit Mannomustin.dihydrochlorid gleichzeitig durchgeführten vergleichenden Versuchen hat die Behandlung mit die gleiche Menge Mannomustin enthaltenden Dosen nur eine 25 % ige Hemmung des Tumorwachstums verursacht.
Solider Ehrlich-Tumor: bei einer 10tägigen Behandlung mit täglichen Dosen von 25 mg/kg hat das Mannomustin-Heparinat um 63, 6 % die Gewichtszunahme der Tumoren retardiert. Die gleichzeitig mit Mannomustin-dihydrochlorid durchgeführten vergleichenden Versuche haben eine 24%lage Beschleunigung (!) des Tumorwachstums ergeben.
Nemet-Kellnersches Ascites-Lymphoma: 100 mg/kg Mannomustin-Heparinat wurden nach 24 und nach 48 Stunden nach Einimpfen des Tumors ver abreicht; nach 6 Tagen war eine 76 ige Hemmung des Tumorwachstums festzustellen.
Beispiel 2
Es wird in ähnlicher Weise gearbeitet, wie im Beispiel 1 beschrieben, nur wird anstatt von 0,012 Mol Mannomustin die mit dem anwesenden SO3H- Gruppen des Heparin äquivalente Menge, also im Falte des im Beispiel 1 verwendeten Heparins 0,016 Mol Mannomustin mit Heparin in Form der freien Säure in Reaktion gebracht. Dadurch wird als Produkt ein KClhaltiges neutrales Salz erhalten, welches in wässeriger Lösung einen pH-Wert von 5,5-6 zeigt.
Dieses Produkt gab in Tierversuchen denjenigen der im Beispiel 1 beschriebenen gleichwertige Ergebnisse.
Beispiel 3
0,55 g reine Mannomustin-Base (Zersetzungspunkt 2780 C, Herstellung vgl. Vargha etc. loc. cit.) werden mit 1,31 g Heparin in Form der freien Säure (Qualität wie im Beispiel 1) in 15 ml! Wasser gelöst und die erhaltene klare Lösung unter Ventilation oder Vakuum bei einer Temperatur unter 300 C zur sirupartigen Dichte eingedampft. Durch Zugabe von 20 ml abs- Äthanol wird das schwach saure KCl- freie Mannomustin-Heparinat gefällt, filtriert und mit 10 ml abs. Äthanol, dann mit 10 mi. wasser- freiem Äther gewaschen. Es werden 1,81 g KC1freies Mannomustin-Heparinat erhalten, welches bei der Analyse 4,26 % Stickstoffgehalt zeigt. Dieses Produkt zeigt infolge seiner grösseren Reinheit eine entsprechend gesteigerte Wirkung.
Solider Ehrlich-Tumor: bei einer 10tägigen Behandlung mit täglichen Dosen von 150 mg/kg wurde das Wachstum des Tumors um 55 % retardlert.
Benevolenskaja-Sarkom: bei einer 21tägigen Behandlung von mit Benevolenskaja-Sarkom eingeimpten Ratten mit täglichen Dosen von 60 mglkg wurde eine 64 % ige Wachstumhemmung des Tumors erreicht.
Yoshida-Sarkom an Ratten: bei 7tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 50 mg/kg wurde eine 99,2 % ige Hemmung erreicht.
Beispiel 4
Ein im Durchschnitt 3,5 SO3H-Gruppen pro Tetrasaccharid-Einheiten enthaltendes Heparin wird in Wasser gelöst und die Lösung mit der berechneten Menge von 2 - [Bis - (fl - chloräthyl) - aminomethyl] - benzimidazol-Base neutralisiert. Die erhaltene klare Lösung wird unter Ventilation zur sirup artigen Dichte eingeengt, mit 25 ml wasserfreiem Aceton versetzt, das gefällte Salz filtriert, mit wasserfreiem Aceton und wasserfreiem Äther gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene Benzimidazolheparinat zeigt in Tierversuchen eine dem Mannomustin-Heparinat ähnliche tumorhemmende Wirkung. Das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors wurde bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg um 42% retardiert.
Die als Ausgangsstoff verwendete 2-[Bis-(, B-chlor- äthyl)-aminomethyi]-benzimidazo1B ase kann aus dem Dihydrochlorid in üblicher Weise bei einer Temperatur von 0 C hergestellt werden; die Herstellung des Dihydrochlorids wurde von E. Hirschberg etc.
Cancer Research 17, 904, und W. S. Gump und E. J.
Nikawitz, J. Org. Chem. 24, 712, beschrieben.
Beispiel 5
0,90 g Heparin (je Tetrasaccharid-Einheiten im Durchschnitt 3,5 SO3H-Gruppen enthaltend, ohne blutgerinnungshemmende Wirkung) und 0,80 g Sulfaguanidin werden in 20 mi Wasser gelöst, die Lö- sung filtriert und bei Zimmertemperatur in Vakuum zur Trockne verdampft. Das als Rückstand gewonnene Salz wird mit 20 ml wasserfreiem Äthanol auf einen Filter gebracht und mit 20 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 1,62 g Sulfaguanidin Heparinat erhalten; das Produkt zeigt keinen Schmelzpunkt, wird oberhalb von 1800 C langsam verkohlt. Die 5 % ige wässerige Lösung des Produktes zeigt einen pH-Wert 2. Analyse : N = 13,3 %.
Auf ähnliche Weise können auch die mit Heparin in Form der freien Säure gebildeten Salze von den folgenden Sulfamiden hergestellt werden: p-Aminobenzolsulfonamid, 2-(4-Aminobenzol sulfamido)-4-methyl-thiazoi und 2-SuWanilamido-4, 6-dimethyl-pyrimidin.
In Tierversuchen haben diese Produkte ebenfalls gute tumorhemmende Wirkung gezeigt. Das p-Amino benzolsulfamid-heparinat hat bei lOtägiger Behandlung in täglich 40 mg/kg Dosen das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors um 24 % retardiert. Bei dem 2-(4-Aminobenzolsulfamido)-4-methyl-thiazol wurde unter ähnlichen Bedingungen 40 % ige Retardation ge funden, bei dem Sulfaguanidin-heparinat war die Retardation 49,8 % ig und bei dem 2-Sulfanilamido 4,6 -dimethyl-pyrimldin-hep arinat unter den gleichen Bedingungen 25 %.
Beispiel 6
1,31 g Heparin (welches im Durchschnitt 3,7 SOsH-Gruppen pro Tetrasaccharid-Einheiten enthält und eine blutgerinnungshemmende Aktivität von 3 IE/mg zeigt) werden in 25 ml Wasser gelöst und bei 0 C mit 0,58 g Chininbase versetzt. Die erhaltene Lösung wird filtriert und unter 10 Torr Vakuum bei 300 C zur sirup artigen Dichte eingeengt. Durch Zugabe von 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wird das schwach saure Salz gefällt, filtriert, mit 5 ml Tetrahydrofuran, dann zweimal mit je 5 ml Äther gewaschen.
Es werden 1,84 g Chinin-heparat erhalten, dessen wässerige Lösung einen pH-Wert von 4,3 zeigt. Analyse: N = 4,8 % (entspricht dem theoretischen Stick stoffgehalt). Das Produkt hat keinen charakteristi- schen Schmelzpunkt, wird oberhalb von 1900 C verkohlt.
Dieses Produkt zeigt gegenüber dem soliden Ehrlich-Tumor bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg eine 26% ige retardie rende Wirkung.
Beispiel 7
0,655 g Heparin (mit 13,15 % Schwefelgehalt, enthält also pro Tetrasaccharid-Einheiten im Durchschnitt 3,7 SO3H-Gruppen ; zeigt eine blutgerinnungshemmende Wirkung von 3 IE/mg) werden in Wasser gelöst und die Lösung unter Eiskühlung mit 0,358 g 3-Amino-4-hydroxy-phenylarsinoxyd versetzt. Die Lösung wird bei einer Temperatur unter 300 C beinahe zur Trockne verdampft und der Rückstand mit 10 ml abs. Äthanol auf Filter gebracht. Das erhaltene Salz wird zweimal mit je 10 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 0,93 g 3-Amino 4-hydroxy-phenylarsinoxyd-hep arinat erhalten; Analyse: As = 13,5%, N = 4,3%.
Beispiel 8
1,31 g Heparin (Qualität wie bei Beispiel 7) werden in feingepulvertem Zustand in 50 ml wasserfreiem Äther suspendiert und bei einer Temperatur von -100C mit 0,92 g 3-Amino-4-hydroxy-phenyl-di- chlorarsin versetzt, dann wird das Gemisch in trokkenem Stickstoffstrom bei 0 C 5 Stunden lang gerührt. Dann wird das Gemisch unter schwachem Vakuum bei Zimmertemperatur zur Trockne verdampft und der Rückstand in Stickstoffatmosphäre durch Verreiben homogenisiert.
Analyse der erhaltenen Arsenverbindung : As = 12,0%- = 11, 2%, N=4,0%. Dieses Produkt zeigt in Tierversuchen dieselbe Wirkung wie das nach Beispiel 7 erhaltene Produkt, da es bei der Einwirkung von Wasser zu derselben Verbindung hydrolisiert.
Beispiel 9
0,655 g Heparin (Qualität wie im Beispiel 7 und 8) werden in 15 ml Wasser gelöst, mit 0,144 g 2,5 Bis-äthylenimino-hydrochinon versetzt, dann wird die Lösung in Vakuum bel Zimmertemperatur zur Trockne verdampft und das als Rückstand erhaltene schwach saure Salz mit 10 ml abs. Äthanol auf einen Filter gebracht, mit 10 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Ausbeute: 0,75 g; Analyse: N = 5, 05 %.
Das Produkt ist in Wasser löslich, pH-Wert der Lösung: 5,5.
Beispiel 10 0,850 g Heparin (Schwefelgehalt 11,75; enthält also je Tetrasaccharid-Einheiten im Durchschnitt 3,1 SO3H-Gruppen, zeigt keine blutgerinnungshemmende Wirkung) werden in 25 ml Wasser gelöst, dann wird die Lösung mit 0,636 g D(-)-Threo l-p-nitrophenyl-2-amino-1, 3-propandiol vensetzt. Die erhaltene klare Lösung, welche einen pH-Wert von 6 zeigt, wird wie im Beispiel 5 weiterverarbeitet. Ausbeute 1,40 g. Dieses im Wasser gut lösliche Produkt hat das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg um 34 % retardiert.
Beispiel 11
0,830 g Heparin (Schwefelgehalt 11,0%, enthält also im Durchschnitt 2,85 SOgH-Gruppen je Tetra saccharild-Einheitea; zeigt keine blutgerinnungshemmende Wirkung) werden in 25 ml Wasser gelöst und mit 0,60 g 3-Amino-4-oxyphenyl-arsonsäure versetzt.
Nach üblicher Verarbeitung der Lösung werden 1,35 g hellbraunes Salz erhalten, der pH-Wert des Produktes ist wegen der Anwesenheit von freien Arsonsäure-Gruppen 1,7.
Das Produkt zeigt in physiologischer Salzlösung gel'öst, bei intraperitonealer Verabreichung, 10 Tage lang in 150 ml/kg täglichen Dosen verwendet, eine 41 % ige Retardierung des soliden Ehrlich-Tumors.
Beispiel 12
0,850 g Heparin (Qualität wie im Beispiel 10) werden in 25 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 0,465 g 7-Chlor-4-(4-diäthylamino-1-methylbutyl- amino)-chinolin versetzt und die Lösung in üblicher Weise verarbeitet. Das erhaltene Salz zeigt einen pH-Wert von 4,2; seine Analyse entspricht den berechneten Werten. Das Produkt zeigt bei 10tägiger Anwendung in täglichen Dosen von 150 mg/kg eine 25 Sige Retardierung des soliden Ehrlich-Tumors.
Beispiel 13
1,7 g Heparin (Qualität wie im Beispiel 10) werden in 40 ml Wasser gelöst, mit 1,07 g 2,5-Bis-fl- dimethyl-aminoäthoxy-3,6-bis - äthylenimino - benzo - chinon-(1,4) (Schmelzpunkt 60-610 C) versetzt.
Die Lösung (pH = 6) wird filtriert und unter Ventilation in einer Schale von grosser Oberfläche innerhalb von 3 Stunden zur sBupartigen Dichte eingeengt. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit 30 ml Aceton versetzt, das ausgefällte hellbraune Salz filtriert und mit 3 X 10 ml Azeton gewaschen.
Ausbeute: 2,62 g (97 % der theoretischen Menge).
Beispiel 14
Es wird wie im Beispiel 10 gearbeitet, aber als basische Komponente werden 0,91 g 2,5-Di-N methyl-piperazino-benzochinon-( 1,4) (Schmelzpunkt 188-190 C) verwendet. Es werden 2,37 g hellbraunes Heparinsalz erhalten (95 % der theoretischen Menge). Das Produkt ist in Wasser gut löslich; pH Wert der wässerigen Lösung = 6.