CH414583A - Process for the production of cytostatic heparin salts - Google Patents

Process for the production of cytostatic heparin salts

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CH414583A
CH414583A CH1174861A CH1174861A CH414583A CH 414583 A CH414583 A CH 414583A CH 1174861 A CH1174861 A CH 1174861A CH 1174861 A CH1174861 A CH 1174861A CH 414583 A CH414583 A CH 414583A
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heparin
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cytostatic
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CH1174861A
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Gyorgy Dr Med Csaba
Jeno Dr Korosi
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Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar
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Description

  

  
 



  Verfahren zur Herstellung von zytostatisch wirkenden Heparinsalzen
Es ist bekannt, dass die in neuerer Zeit zur Behandlung von malignen Tumoren vielfach angewendeten sogenannten zytostatischen Stoffe den allgemeinen Nachteil einer unspezifischen Wirkung zeigen; diese Stoffe beeinflussen nicht nur die Lebensfunktionen der Tumorzellen, sondern üben ihre Wirkung auch gegenüber der übrigen Zellen des behandelten Organismus aus. Diese Mittel sind deshalb in sehr hohem Grade toxisch, wodurch ihre therapeutische Anwendung ausserordentlich erschwert wird.



   Es ist ferner bekannt, dass bei Tumorerkrankungen die Menge des im Organismus anwesenden Heparins erheblich abnimmt und gleichzeitig vermehren sich in der Umgebung der Tumoren und anderer wuchernder Gewebe erheblich die   heparinhaitigen    sogenannten Ehrlichschen   Mastzellen,    deshalb benötigen die Tumorzellen zu ihrer Vermehrung auch Heparin.



   Wir haben nun ein Verfahren zur Herstellung von neuen, erhöhte bzw. spezifische tumorhemmende Wirkung zeigenden Heparinsalzen gefunden, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man an sich schon zytostatisch wirkende oder an sich nicht zytostatische, aber die im Stoffwechsel der Zellen   mitwirkenden    Enzyme hemmende basische Verbindungen mit Heparin in Form der freien Säure umsetzt. Diese Eigenschaft der genannten neuen   Heparinvernindüngen    kann dadurch erklärt werden, dass diese Stoffe biologisch einen heparinoiden Charakter zeigen, und infolgedessen sich vorwiegend in den heparinaffinen Zellen des Organismus, also in den Tumorzellen anhäufen.

   So beschädligen diese Stoffe spezifisch die Tumorzellen, und zwar in praktisch sehr erheblichem Grad auch bei so niedrigen Konzentrationen, bei welchen sie noch überhaupt keine oder nur kaum merkbare zellenschädigende Wirkung auf die gesunden Gewebe ausüben. Diese Eigenschaft der genannten   Heparinverbindungen    ist desto überraschender, da die bekannten   Bausteine    der Heparinsäure, die D-Glukuronsäure und das   D-Glhkosamid    die Entwicklung der experimentellen Tumore sogar begünstigen.



   Diese neuen Heparinverbindungen können aus Heparin in Form der freien Säure (welche nicht unbedingt eine blutgerinnungshemmende Wirkung zeigen muss) und aus zytostatischen Stoffen oder aus zur Hemmung der im Stoffwechsel der Zellen eine Rolle spielenden Enzyme geeigneten basischen Stoffen hergestellt werden.



   Die saure Komponente der erfindungsgemäss hergestellten neuen salzartigen Verbindungen ist also das stark sauer reagierende Heparin in Form der freien Säure; diese Verbindung wird in der Therapie vorwiegend in der Form ihres Natriumsalzes, und zwar zur Regulierung der Blutgerinnungsdauer, ferner bei Bluttransfusionen und zur Behandlung von Trombosen verwendet. Die verschiedenen natürlichen Heparine bestehen aus Makromolekülgemischen,   wei-    che sich voneinander nicht nur in ihren durchschnittlichen Molekulargewichten, sondern auch hinsichtlich der chemischen Zusammensetzung unterscheiden.



  Die am meisten vorkommende Art des Heparins in Form der freien Säure kann mit der folgenden, als erwiesen zu betrachtenden Zusammensetzung charakterisiert werden: sie besteht aus äquivalenten Mengen von   D-Glukosamin-N-Schwefelsäure    und D-Glukuronsäure, wobei jede zweite D-Glukuronsäure Komponente an der   C2-Hydroxylgruppe    und jede D Glukosamid-Komponente an der   C4-Hydroxyllgruppe    ebenfalls mit Schwefelsäure verestert ist und auch an die Stickstoffatome der letzteren je   eine -SO3H-    Gruppe gebunden ist.



   Theoretisch ist also die Heparinmolekülkette aus solchen sich wiederholenden Tetrasaccharid-Einhei  ten aufgebaut, die eine D-Glukosamin-N-schwefel    säure-2-schwofelsäure-ester,    eine   D-Glukonsäure,    eine
D-Glukosamin-N-schwefelsäure-2-schwefelsäure-ester und eine D-Glukonsäure-4-schwefels äure-ester-Ein heit in der angegebenen Reihenfolge enthalten. Das
Molekulargewicht dieser im Makromolekül sich mehr mals   wiederhdlenden    Tetrasaccharid-Einheiten be trägt   1002,8;    sie enthalten je 5   SO3H- und    2 COOH
Gruppen.



   Die starke Neigung des Heparins sich an Pro teine zu binden, kann durch seine grosse Azidität, welche vorwiegend von den   SO3H-Gruppen    hervor gerufen wird, erklärt werden. Die Wirkung des Hepa rins auf die Blutgerinnung wird durch sein Molekulargewicht und seinen Schwefelsäuregehalb beeinflusst. Das durchschnittliche Molekulargewicht eines eine gute blutgerinnungshemmende Wirkung zeigen den Heparins ist etwa   20,000.    In den verschiedenen natürlichen Heparinen kommen aber in dem oben angeführten 4 Ringeinheiten umfassenden Molekülteil nicht immer 5   SO3H-Gruppen    vor, sondern die Zahl dieser Gruppen schwankt im allgemeinen zwi schen 2 und 5.

   Diese natürlichen Heparine sind zwar in alkalischem Medium ziemlich stabil, sie neigen aber in saueren Medien zur hydrolytischen Depolymerisation, wodurch ihre blutgerinnungshemmende Aktivität abnimmt oder völlig verlorengeht. Da aber die Heparin-Affinität der Tumorzellen auch gegen über solchen, therapeutisch sonst minderwertigen bzw. wertlosen Heparinen besteht, können als Ausgangsstoffe des erfindungsgemässen Verfahrens auch solche verwendet werden. Unter  Heparinsäure  ist also in dieser Beschreibung jede oben erwähnte Art des natürlichen Heparins, in Form von freier Säure, zu verstehen.



   Als basische Komponente können bei der Herstellung der neuen Verbindungen solche basische Verbindungen von zellenbeschädigender Wirkung verwendet werden, welche als Zytostatica oder als zur Hemmung der im Stoffwechsel der Zellen eine Rolle spielenden Enzyme verwendbare Mittel bekannt sind.



  Unter den therapeutisch verwendbaren, unmittelbar auf die Zellenteilung wirkenden Stoffen sind am meisten die N-Loste, und die   Äthylenimin-Derivate    als Ausgangsstoffe des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet; als Beispiele solcher Verbindungen können das   1 ,6-Bis-(ss-chloräthylariino)-1 ,6-desoxy-D-man    nit und das   2-[Bis-(sswhloräthyl)-aminomethyl0-ben-    zimidazol erwähnte werden.



      Die zur Hemmung der im Stoffwechsel ! der Zel-    len eine Rolle spielenden Enzyme verwendbaren basischen Stoffe gehören zu verschiedenen Klassen der organischen Verbindungen. Diese Verbindungen zeigen in freier Form   oder    in Form von anderen Salzen in den praktisch verwendbaren Konzentrationen überhaupt keine tumorhemmende Wirkung, nur ihre Heparinsalze zeigen eine tumorhemmende Aktivität ; dieser Umstand ist ein klarer Beweis des spezifischen Charakters der erfindungsgemäss hergestellten neuen Verbindungen.



   Unter diesen enzymhemmenden Verbindungen zeigen die Sulfonamide, z. B. das p-Aminobenzolsulfonamid, das   p-Aminobenzolsulfaguanidin    oder das   2-(4 - Aminobenzolsulfamido) -4- methylthiazol    eine hemmende Wirkung gegenüber den Glukose-6-phosphat-dehydrogenase, Milchsäure-dehydrogenase, Glukose-dehydrogenase, Zytochrom-reductase, Brenztraubensäure-carboxylase, Zytochromoxydase,   Suk-    zino-dehydrogenase usw. Enzymen eine hemmende Wirkung. Einige   Aikaloide,    wie z. B. das Chinin und die dem Chinin ähnliche synthetische Malariamittel, wie z.

   B. das   3-Chlor-7-methoxy-9-(a-methyl-    diäthylamino-butylamino)-acridin, das 6-Methoxy-8  (8-ditäthylamino-a-methylbutyl)-aminochinolin    und das   7-Chlor-(4-diäthylamino-1 -methyl-butylamino)    chinolin zeigen eine hemmende Wirkung gegenüber   Zytochrom-reductase,    Phosphoglycerinaldehyd-dehydrogenase, Phosphorylase, Hexochinase, Zytochromoxydase,   Brenztraubensäuredehydrogenase,    Phosphoglukomutase, Milchsäure-dehydrogenase, usw. Ver  schliedene    organische Arsenverbindungen, wie z. B. p-Amino-phenyldichlorarsin und 3-Amino-4-hydroxyphenyl-arsinoxyd hemmen ebenfalls die Funktion der Redox-enzymsysteme.



   Die verschiedenen Chinone zeigen bekannterweise ebenfalls eine enzymhemmende Wirkung, z. B. gegenüber der   Brenztraubensäure- dehydrogenase,      Sukzino-dehydrogenase, Brenztraubensäure-carboxyl    ase und Katalase. Bei den sogenannten Chinon-stick  stofflosten    und bei den Chinonäthylenimin-Derivaten, zum Beispiel:    2,5-Bis-fl-chloräthylamino-benzochinon-(l 4), 2,5-Bis-di-ss-chloräthylamino-benzochinon-(1 4),      2,5-Bis-äthylenimino-benzochinon-(    1,4) und   2, 5-Bis-n-propoxy-3, 6-bis-äthylenimino- benzocbinon-(1,4)    kann das gleichzeitige Bestehen beider erwähnter Wirkungen (der zytostatischen und enzymhemmenden) angenommen werden (vgl. S. Peteren, W. Gauss und E. Urbschat, Angew. Chem. 67, 217 [1955]; W. Gauss und   5.

   Petersen,    op. cit. 69, 252 [1957].



  Als verwandte Verbindung kann auch das 2,5-Bis äthylenimino-hydrochinon, bei welchem ebenfalls eine tumorhemmende Wirkung festgestellt wurde, (vgl. A. Marxer, Experimentia, 11, 186 [1955]), zu diesem Typ gerechnet werden. Da aus derartigen Verbindungen keine Salze mit Heparin gebildet werden können, haben wir ihre basisch substituierten Derivate, wie zum Beispiel:   2,5-Bis-P-climethylamino-äthoxy-3,6-bis-  äthylenimino-benzochinon-(l, 1,4), 2, 5-Dichlor-3, 6-bis-ss-piperidino-äthylamino-       benzochinon-(1, 4)    und   2,5-Di-n-methylpiperazino-benzochinon(1 4)    zur   SalzbÅaldung    verwendet.



   Bei dem Heparin-natriumsalz sowie bei der freien Heparinsäure kann überhaupt keine wachstumhemmende Aktivität gegen Tumoren in Tierversuchen festgestellt werden; diese Stoffe haben sogar eine  gerade gegengesetzte Wirkung, sie beschleunigen das Wachstum der Tumoren und verursachen zugleich eine Abnahme des Körpergewichtes. Das ist ebenfalls ein Beweis dafür, dass es sich im Falle der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen um eine neue, ganz spezifische und unerwartete Wirkung handelt.



   In der Literatur wurden schon einige, mit organischen Basen gebildete Salze der Heparinsäure be  schri'eben,    welche aber keine zytostatische oder zur Hemmung des im Stoffwechsel der Tumorzellen eine Rolle spielenden Enzyme fähige Verbindungen als basische Komponente enthielten. Diese bekannten   Heparinsalze    haben auch überhaupt keine tumorhemmende Eigenschaften; sie zeigen höchstens hepa  rinähnliche,    blutgerinnungshemmende Wirkungen. So wurde z. B. eine aus 20 Teilen Heparin und 1 Teil Histamin hergestellte wässrige Lösung (R. K. Sanyal und G. B. West, Nature 178, 1293 [1956] und die mit   N,N'-Bis-(a-methylbenzyi)äthyiendiamin    (A.   Can-    tone, Minerva Med.

   I. 230 [1953]) und mit Aminoakridinen gebildeten Heparinsalze   (K. 5.    Dodgson,   F. A. Rose    und B. Spencer, Biochem. J. 60, 346 [1955]) beschrieben, die aber keinerlei tumorhemmende Wirkung zeigen.



   Die neuen, mit zytostatischen bzw. enzymhemmenden basischen Verbindungen gebildeten Heparinsalze werden im Sinne der vorliegenden Erfindung derart hergestellt, dass Heparin in Form der freien Säure mit an sich schon zytostatischen oder an sich nicht zytostatischen, aber die im Stoffwechsel der Zellen mitwirkenden Enzyme hemmenden basischen Verbindungen umgesetzt wird. Es ist dabei nicht erforderlich, dass die als Ausgangsstoff verwendete Heparinsäure eine blutgerinnungshemmende Aktivität zeigen soll. Die beiden Komponenten können z. B. in äquivalenten Mengen oder in einem solchen Mengenverhältnis verwendet werden, dass   diF    Menge der basischen Verbindung geringer als die aus der Zahl der   anwesenden -NHO3H und -O-SO-    Gruppen berechnete äquivalente Menge ist. In letzerem Falle werden saure Heparinsalze als Produkte gewonnen.

   Beide Arten der als Produkt erhaltenen Heparinsalze zeigen die erwähnte vorteilhafte tumorhemmende Wirkung.



   Die Reaktion kann in einem anorganischen oder organischen Lösungsmittel, zweckmässig in Wasser, in niederen primären Alkoholen oder in einer Mischung der gesamten Lösungsmittel, vorteilhaft in einem Temperaturberelch   zwischen -10    und   + 300    C vorgenommen werden.



   Bei der Herstellung der erfindungsgemässen neuen Heparinsalze ist es nicht   nötig,    dass festes, isoliertes Heparin in Form der freien Säure als Ausgangsstoff verwendet werden soll; die bei der Heparinherstellung als Rohpodukt gewonnene wässerige oder organische saure Heparinlösung kann ebenfalls als Ausgangsstoff verwendet werden.



   Die erfindungsgemäss hergestellten neuen Heparinsalze sind im Wasser meistens gut löslich; der pH-Wert der Lösung hängt von der Zahl der im Heparin anwesenden SO3H-Gruppen und von der Menge der verwendeten basischen Komponente ab.



  Zweckmässigerweise wird das Verhältnis dieser Faktoren derart gewählt, dass der pH-Wert der wässerigen Lösung des Produktes zwischen 1,5 und 7 sein soll.



   Die im Sinne der vorliegenden Erfindung hergestellten neuen Heparinsalze zeigen eine zytostatische Aktivität, welche die ähnliche Wirkung der bisher bekannten zytostatischen Mittel wesentlich übertrifft, da diese neuen Verbindungen auf Grund ihrer spezifischen Wirkungsweise hauptsächlich auf die Tumorgewebe wirken. Das wird auch dadurch bewiesen, dass während z. B. 8 mg/kg   1,6-Bis-(ss-chlor-      äthylamino)-1, 6-desoxy-D-mannit-dihydrochlorid    wegen seiner allgemeinen zellenschädigenden Wirkung einen 20-25 % igen Gewichtsverlust bei den Tieren verursacht, das mit Heparin gebildete Salz derselben Verbindung in derselben Dose überhaupt keinen Gewichtsverlust herbeiführt, anderseits aber bei viel kleineren Dosen, z.

   B. 2,5 mg/kg, das Hydrochlorid der genannten zytostatischen Verbindung überhaupt keine tumorhemmende Wirkung zeigt, während das mit Heparinsäure gebildete Salz eine sehr merkliche tumorhemmende Wirkung aufweist.



   Beispiel I
4,55 g (0,012 Mol)   1,6-Bis-(p-chloräthylamino)-      1, 6-desoxy-D-mannit-dihydrochlorid    werden in 20   ml    Wasser gelöst und unter Eiskühlung mit einer Lösung von 1,34 g (0,024 Mol) Kaliumhydroxyd in 5 ml Wasser versetzt, dann wird dem Gemisch eine Lösung von 8,75 g Heparin in Form der freien Säure in 20   ml    Wasser zugesetzt. Die klare Lösung wird bei einer Temperatur unter 300 C zur sirupartigen Dichte eingedampft und mit 75   ml    abs.



     Äthanol    versetzt. Das ausscheidende Heparinsalz wird filtriert, mit 20 mi abs. Äthanol und dann mit 20 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 14,10 g   1 ,6-Bis-(ss-chluräthyiamin)-1 6-      desoxy-D-mannit-hep arinsaures    Salz erhalten (theoretische Ausbeute 14,21 g) in Form eines hell kremfarbigen, amorphen, wasserlöslichen   12,6%    KC1 enthaltenden, keinen charakteristischen Schmelzpunkt zeigenden Produktes.



   Das als Ausgangsprodukt verwendete   1,6-Bis-(ss-       chloräthylamino)- 1, 6-desoxy-D-mannit-dihydrochlorid      ( Degranol; ,    Mannomustin) ist ein bekanntes zytostatisches Mittel, dessen Herstellung in der Mitteilung von L. Vargha etc. (J. Chem. Soc. 1957, Seite 805) beschrieben ist.



   Das zur obigen Reaktion verwendete Heparin in Form der freien Säure, zeigt eine blutgerinnungshemmende Aktivität von 3,2   IE/mg;    es hat keinen charakteristischen Schmelzpunkt, wird über 1800 C langsam braun verfärbt und über 2050 C verkohlt.



  Analyse: N=   3,0%,    S   =      13,15%.    Dieses Heparin enthält also je Tetrasaccharidgruppe anstatt der maxi malen 5 im Durchschnitt nur 3,7 SO3H-Gruppen.  



  Demgemäss ist das Molekulargewicht dieser sich wiederholenden   Tetrasaccharidgrappen    anstatt 1002,8 nur 898.



   Im EndprodUkt sind   80%    der im Heparin ursprünglich anwesenden SOsH-Gruppen durch die Basizität des Mannomustins gebunden. Die Anwesenheit dieser freien   SOsH-Gruppen    wird auch durch den pH-Wert der wässerigen Lösung des Produktes   (3-3,5)    gezeigt.



   Das auf obige Weise hergestellte Mannomustin  Heparfuat    hat in Tierversuchen folgende Resultate gezeigt:
Crocker S. 180 Tumor an Mäusen: tägliche Dosen von 25 mg/kg haben bei einer 10tägigen Behandlung das Wachstum der Tumoren um   42 %    retardiert. Bei mit   Mannomustin.dihydrochlorid    gleichzeitig durchgeführten vergleichenden Versuchen hat die Behandlung mit die gleiche Menge Mannomustin enthaltenden Dosen nur eine   25 % ige    Hemmung des Tumorwachstums verursacht.



   Solider   Ehrlich-Tumor:    bei einer 10tägigen Behandlung mit täglichen Dosen von 25 mg/kg hat das   Mannomustin-Heparinat    um   63, 6 %    die Gewichtszunahme der Tumoren retardiert. Die gleichzeitig mit   Mannomustin-dihydrochlorid    durchgeführten vergleichenden Versuche haben eine   24%lage    Beschleunigung (!) des Tumorwachstums ergeben.



     Nemet-Kellnersches    Ascites-Lymphoma: 100 mg/kg Mannomustin-Heparinat wurden nach 24 und nach 48 Stunden nach Einimpfen des Tumors ver  abreicht; nach 6 Tagen war eine 76 ige Hemmung    des Tumorwachstums festzustellen.



     Beispiel    2
Es wird in ähnlicher Weise gearbeitet, wie im Beispiel 1 beschrieben, nur wird anstatt von 0,012 Mol Mannomustin die mit dem anwesenden   SO3H-    Gruppen des Heparin äquivalente Menge, also im Falte des im Beispiel 1 verwendeten Heparins 0,016 Mol Mannomustin mit Heparin in Form der freien Säure in Reaktion gebracht. Dadurch wird als Produkt ein   KClhaltiges    neutrales Salz erhalten, welches in wässeriger Lösung einen pH-Wert von 5,5-6 zeigt.



  Dieses Produkt gab in Tierversuchen denjenigen der im Beispiel 1 beschriebenen gleichwertige Ergebnisse.



   Beispiel 3
0,55 g reine Mannomustin-Base (Zersetzungspunkt 2780 C, Herstellung vgl. Vargha etc. loc. cit.) werden mit 1,31 g Heparin in Form der freien Säure (Qualität wie im Beispiel 1) in 15   ml!    Wasser gelöst und die erhaltene klare Lösung unter Ventilation oder Vakuum bei einer Temperatur unter 300 C zur sirupartigen Dichte eingedampft. Durch Zugabe von 20 ml   abs-    Äthanol wird das schwach saure   KCl-    freie Mannomustin-Heparinat gefällt, filtriert und mit 10   ml abs. Äthanol,    dann mit 10   mi. wasser-    freiem Äther gewaschen. Es werden 1,81 g KC1freies Mannomustin-Heparinat erhalten, welches bei der Analyse 4,26 % Stickstoffgehalt zeigt. Dieses Produkt zeigt infolge seiner grösseren Reinheit eine entsprechend gesteigerte Wirkung.



   Solider   Ehrlich-Tumor:    bei einer 10tägigen Behandlung mit täglichen Dosen von 150 mg/kg wurde das Wachstum des Tumors um 55 %   retardlert.   



     Benevolenskaja-Sarkom:    bei einer 21tägigen Behandlung von mit Benevolenskaja-Sarkom eingeimpten Ratten mit täglichen Dosen von 60   mglkg    wurde eine 64 % ige Wachstumhemmung des Tumors erreicht.



   Yoshida-Sarkom an Ratten: bei 7tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 50 mg/kg wurde eine   99,2 % ige    Hemmung erreicht.



   Beispiel 4
Ein im Durchschnitt 3,5 SO3H-Gruppen pro Tetrasaccharid-Einheiten enthaltendes Heparin wird in Wasser gelöst und die Lösung mit der berechneten Menge von   2 - [Bis - (fl - chloräthyl) - aminomethyl] -    benzimidazol-Base neutralisiert. Die erhaltene klare Lösung wird unter Ventilation zur sirup artigen Dichte eingeengt, mit 25 ml wasserfreiem Aceton versetzt, das gefällte Salz filtriert, mit wasserfreiem Aceton und wasserfreiem Äther gewaschen. Das auf diese Weise erhaltene Benzimidazolheparinat zeigt in Tierversuchen eine dem Mannomustin-Heparinat ähnliche tumorhemmende Wirkung. Das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors wurde bei   10tägiger    Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg um 42% retardiert.



   Die als Ausgangsstoff verwendete   2-[Bis-(, B-chlor-      äthyl)-aminomethyi]-benzimidazo1B    ase kann aus dem Dihydrochlorid in üblicher Weise bei einer Temperatur von   0     C hergestellt werden; die Herstellung des Dihydrochlorids wurde von E. Hirschberg etc.



  Cancer Research 17, 904, und W. S. Gump und E. J.



  Nikawitz, J. Org. Chem. 24, 712, beschrieben.



   Beispiel 5
0,90 g Heparin (je Tetrasaccharid-Einheiten im Durchschnitt 3,5   SO3H-Gruppen    enthaltend, ohne blutgerinnungshemmende Wirkung) und 0,80 g Sulfaguanidin werden in 20   mi    Wasser gelöst, die   Lö-    sung filtriert und bei Zimmertemperatur in Vakuum zur Trockne verdampft. Das als Rückstand gewonnene Salz wird mit 20 ml wasserfreiem Äthanol auf einen Filter gebracht und mit 20 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Es werden 1,62 g Sulfaguanidin Heparinat erhalten; das Produkt zeigt keinen Schmelzpunkt, wird oberhalb von 1800 C langsam verkohlt. Die 5 % ige wässerige Lösung des Produktes zeigt einen pH-Wert 2.   Analyse :    N = 13,3 %.



   Auf ähnliche Weise können auch die mit Heparin in Form der freien Säure gebildeten Salze von den folgenden Sulfamiden hergestellt werden: p-Aminobenzolsulfonamid,   2-(4-Aminobenzol sulfamido)-4-methyl-thiazoi    und   2-SuWanilamido-4, 6-dimethyl-pyrimidin.   



   In Tierversuchen haben diese Produkte ebenfalls gute tumorhemmende Wirkung gezeigt. Das p-Amino    benzolsulfamid-heparinat    hat bei lOtägiger Behandlung in täglich 40 mg/kg Dosen das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors um 24 % retardiert. Bei dem 2-(4-Aminobenzolsulfamido)-4-methyl-thiazol wurde unter   ähnlichen    Bedingungen 40 % ige Retardation ge funden, bei dem Sulfaguanidin-heparinat war die Retardation 49,8 % ig und bei dem 2-Sulfanilamido  4,6 -dimethyl-pyrimldin-hep arinat    unter den gleichen Bedingungen 25 %.



   Beispiel 6
1,31 g Heparin (welches im Durchschnitt 3,7 SOsH-Gruppen pro   Tetrasaccharid-Einheiten    enthält und eine blutgerinnungshemmende Aktivität von 3 IE/mg zeigt) werden in 25   ml    Wasser gelöst und bei   0     C mit 0,58 g Chininbase versetzt. Die erhaltene Lösung wird filtriert und unter 10 Torr Vakuum bei 300 C zur sirup artigen Dichte eingeengt. Durch Zugabe von 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wird das schwach saure Salz gefällt, filtriert, mit 5 ml Tetrahydrofuran, dann zweimal mit je 5   ml    Äther gewaschen.



   Es werden 1,84 g Chinin-heparat erhalten, dessen wässerige Lösung einen pH-Wert von 4,3 zeigt. Analyse: N = 4,8 % (entspricht dem theoretischen Stick  stoffgehalt).    Das Produkt hat keinen   charakteristi-    schen Schmelzpunkt, wird oberhalb von 1900 C verkohlt.



   Dieses Produkt zeigt gegenüber dem soliden Ehrlich-Tumor bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg eine 26% ige   retardie    rende Wirkung.



   Beispiel 7   
0,655 g Heparin (mit 13,15 % Schwefelgehalt,    enthält also pro Tetrasaccharid-Einheiten im Durchschnitt 3,7   SO3H-Gruppen ;    zeigt eine blutgerinnungshemmende Wirkung von 3 IE/mg) werden in Wasser gelöst und die Lösung unter Eiskühlung mit 0,358 g   3-Amino-4-hydroxy-phenylarsinoxyd    versetzt. Die Lösung wird bei einer Temperatur unter 300 C beinahe zur Trockne verdampft und der Rückstand mit 10 ml abs. Äthanol auf Filter gebracht. Das erhaltene Salz wird zweimal mit je 10 ml wasserfreiem   Äther    gewaschen. Es werden 0,93 g 3-Amino  4-hydroxy-phenylarsinoxyd-hep arinat    erhalten; Analyse: As =   13,5%,    N =   4,3%.   



   Beispiel 8
1,31 g Heparin (Qualität wie bei Beispiel 7) werden in feingepulvertem Zustand in 50 ml wasserfreiem Äther suspendiert und bei einer Temperatur von   -100C    mit 0,92 g   3-Amino-4-hydroxy-phenyl-di-    chlorarsin versetzt, dann wird das Gemisch in trokkenem Stickstoffstrom bei   0     C 5 Stunden lang gerührt. Dann wird das Gemisch unter schwachem Vakuum bei Zimmertemperatur zur Trockne verdampft und der Rückstand in Stickstoffatmosphäre durch Verreiben homogenisiert.



   Analyse der erhaltenen   Arsenverbindung :      As =    12,0%-   = 11, 2%,      N=4,0%.    Dieses Produkt zeigt in Tierversuchen dieselbe Wirkung wie das nach Beispiel 7 erhaltene Produkt, da es bei der Einwirkung von Wasser zu derselben Verbindung hydrolisiert.



   Beispiel 9
0,655 g Heparin (Qualität wie im Beispiel 7 und 8) werden in 15 ml Wasser gelöst, mit 0,144 g 2,5 Bis-äthylenimino-hydrochinon versetzt, dann wird die Lösung in Vakuum bel Zimmertemperatur zur Trockne verdampft und das als Rückstand erhaltene schwach saure Salz mit 10   ml abs.      Äthanol    auf einen Filter gebracht, mit 10 ml wasserfreiem Äther gewaschen. Ausbeute: 0,75 g; Analyse: N =   5, 05 %.   



  Das Produkt ist in Wasser löslich, pH-Wert der Lösung:   5,5.   



   Beispiel 10    0,850    g Heparin (Schwefelgehalt   11,75;    enthält also je   Tetrasaccharid-Einheiten    im Durchschnitt 3,1 SO3H-Gruppen, zeigt keine blutgerinnungshemmende Wirkung) werden in 25 ml Wasser gelöst, dann wird die Lösung mit 0,636 g D(-)-Threo  l-p-nitrophenyl-2-amino-1, 3-propandiol    vensetzt. Die erhaltene klare Lösung, welche einen pH-Wert von 6   zeigt,    wird wie im Beispiel 5 weiterverarbeitet. Ausbeute 1,40 g. Dieses im Wasser gut lösliche Produkt hat das Wachstum des soliden Ehrlich-Tumors bei 10tägiger Behandlung mit täglichen Dosen von 100 mg/kg um 34 % retardiert.



   Beispiel 11
0,830 g Heparin (Schwefelgehalt   11,0%,    enthält also im Durchschnitt 2,85   SOgH-Gruppen    je Tetra  saccharild-Einheitea;    zeigt keine blutgerinnungshemmende Wirkung) werden in 25 ml Wasser gelöst und mit 0,60 g 3-Amino-4-oxyphenyl-arsonsäure versetzt.



  Nach üblicher Verarbeitung der Lösung werden 1,35 g   hellbraunes    Salz erhalten, der pH-Wert des Produktes ist wegen der Anwesenheit von freien Arsonsäure-Gruppen 1,7.



   Das Produkt zeigt in physiologischer Salzlösung   gel'öst,    bei intraperitonealer Verabreichung, 10 Tage lang in 150 ml/kg täglichen Dosen verwendet, eine 41 % ige Retardierung des soliden Ehrlich-Tumors.



   Beispiel 12
0,850 g Heparin (Qualität wie im Beispiel 10) werden in 25 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 0,465 g   7-Chlor-4-(4-diäthylamino-1-methylbutyl-    amino)-chinolin versetzt und die Lösung in üblicher Weise verarbeitet. Das erhaltene Salz zeigt einen pH-Wert von 4,2; seine Analyse entspricht den berechneten Werten. Das Produkt zeigt bei   10tägiger    Anwendung in täglichen Dosen von 150 mg/kg eine 25   Sige    Retardierung des soliden Ehrlich-Tumors.



   Beispiel 13
1,7 g Heparin (Qualität wie im Beispiel 10) werden in 40 ml Wasser gelöst, mit 1,07   g 2,5-Bis-fl-       dimethyl-aminoäthoxy-3,6-bis - äthylenimino - benzo -      chinon-(1,4)    (Schmelzpunkt   60-610    C) versetzt.  

 

   Die Lösung   (pH =    6) wird filtriert und unter Ventilation in einer Schale von grosser Oberfläche innerhalb von 3 Stunden zur   sBupartigen    Dichte eingeengt. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit 30 ml Aceton versetzt, das ausgefällte hellbraune Salz filtriert und mit 3 X 10 ml Azeton gewaschen.



  Ausbeute: 2,62 g (97 % der theoretischen Menge).



   Beispiel 14
Es wird wie im Beispiel 10 gearbeitet, aber als basische Komponente werden 0,91 g 2,5-Di-N  methyl-piperazino-benzochinon-(    1,4) (Schmelzpunkt   188-190  C)    verwendet. Es werden 2,37 g hellbraunes   Heparinsalz    erhalten (95 % der theoretischen Menge). Das Produkt ist in Wasser gut löslich; pH Wert der wässerigen Lösung = 6.   



  
 



  Process for the production of cytostatic heparin salts
It is known that the so-called cytostatic substances, which have recently been widely used for the treatment of malignant tumors, show the general disadvantage of an unspecific effect; These substances not only influence the vital functions of the tumor cells, but also exert their effect on the other cells of the organism being treated. These agents are therefore extremely toxic, which makes their therapeutic application extremely difficult.



   It is also known that the amount of heparin present in the organism decreases considerably in the case of tumor diseases and at the same time the heparin-containing so-called Ehrlich mast cells multiply considerably in the vicinity of the tumors and other proliferating tissues, which is why the tumor cells also need heparin to multiply.



   We have now found a method for the production of new, increased or specific tumor-inhibiting effects showing heparin salts, which is characterized in that one already cytostatic or not cytostatic, but inhibiting the enzymes involved in the metabolism of the cells Heparin converts in the form of the free acid. This property of the above-mentioned new heparin fertilizers can be explained by the fact that these substances show a biological heparinoid character and consequently accumulate mainly in the heparin-affine cells of the organism, i.e. in the tumor cells.

   These substances specifically damage the tumor cells, to a practically very considerable degree, even at such low concentrations at which they have no or hardly any cell-damaging effect on healthy tissues. This property of the heparin compounds mentioned is all the more surprising since the known building blocks of heparic acid, D-glucuronic acid and D-glycosamide even promote the development of experimental tumors.



   These new heparin compounds can be produced from heparin in the form of the free acid (which does not necessarily have to show an anti-coagulant effect) and from cytostatic substances or from basic substances suitable for inhibiting the enzymes that play a role in the metabolism of the cells.



   The acidic component of the new salt-like compounds prepared according to the invention is therefore the strongly acidic heparin in the form of the free acid; This compound is used in therapy mainly in the form of its sodium salt, specifically to regulate the duration of blood clotting, also in blood transfusions and for the treatment of thrombosis. The various natural heparins consist of macromolecule mixtures which differ from one another not only in their average molecular weights, but also in terms of their chemical composition.



  The most common type of heparin in the form of the free acid can be characterized by the following composition, which must be regarded as proven: it consists of equivalent amounts of D-glucosamine-N-sulfuric acid and D-glucuronic acid, with every other D-glucuronic acid component on the C2 hydroxyl group and each D glucosamide component on the C4 hydroxyl group is also esterified with sulfuric acid and an -SO3H group is also bonded to the nitrogen atoms of the latter.



   Theoretically, the heparin molecule chain is composed of such repeating tetrasaccharide units, which are a D-glucosamine-N-sulfuric acid-2-sulfuric acid ester, a D-gluconic acid, a
D-glucosamine-N-sulfuric acid-2-sulfuric acid ester and a D-gluconic acid-4-sulfuric acid ester unit in the order given. The
The molecular weight of these tetrasaccharide units, which are repeated several times in the macromolecule, is 1002.8; they each contain 5 SO3H- and 2 COOH
Groups.



   The strong tendency of heparin to bind to proteins can be explained by its great acidity, which is mainly caused by the SO3H groups. The effect of heparin on blood clotting is influenced by its molecular weight and its sulfuric acid content. The average molecular weight of one of the heparins showing a good anticoagulant effect is about 20,000. In the various natural heparins, however, there are not always 5 SO3H groups in the above-mentioned part of the molecule comprising 4 ring units, but the number of these groups generally fluctuates between 2 and 5.

   These natural heparins are quite stable in an alkaline medium, but they tend to hydrolytically depolymerize in acidic media, as a result of which their anticoagulant activity decreases or is completely lost. Since, however, the heparin affinity of the tumor cells also exists in relation to such heparins which are otherwise therapeutically inferior or worthless, these can also be used as starting materials for the method according to the invention. In this description, heparic acid is to be understood as meaning any type of natural heparin mentioned above, in the form of free acid.



   The basic components used in the preparation of the new compounds are those basic compounds which have a cell-damaging effect and which are known as cytostatic agents or as agents which can be used to inhibit the enzymes which play a role in the metabolism of cells.



  Of the substances that can be used therapeutically and have a direct effect on cell division, the nitrogen mustards and the ethyleneimine derivatives are most suitable as starting materials for the process according to the invention; Examples of such compounds are 1,6-bis- (ss-chloroethylariino) -1,6-deoxy-D-manite and 2- [bis- (sswhloroethyl) aminomethyl0-benzimidazole.



      The one to inhibit in metabolism! The basic substances that can be used in the cells that play a role belong to different classes of organic compounds. In free form or in the form of other salts, these compounds show no tumor-inhibiting effect at all in the concentrations that can be used in practice, only their heparin salts show tumor-inhibiting activity; this fact is clear evidence of the specific character of the new compounds prepared according to the invention.



   Among these enzyme inhibiting compounds, the sulfonamides, e.g. B. p-aminobenzenesulfonamide, p-aminobenzenesulfaguanidine or 2- (4-aminobenzenesulfamido) -4- methylthiazole have an inhibitory effect on glucose-6-phosphate dehydrogenase, lactic acid dehydrogenase, glucose dehydrogenase, cytochrome reductase, pyruvic acid -carboxylase, cytochrome oxidase, succino-dehydrogenase etc. enzymes have an inhibitory effect. Some aicaloids, such as B. quinine and the synthetic antimalarials similar to quinine, such as.

   B. 3-chloro-7-methoxy-9- (a-methyl-diethylamino-butylamino) -acridine, 6-methoxy-8 (8-ditäthylamino-a-methylbutyl) -aminoquinoline and 7-chloro- (4 -Diethylamino-1-methyl-butylamino) quinoline show an inhibitory effect on cytochrome reductase, phosphoglyceraldehyde dehydrogenase, phosphorylase, hexoquinase, cytochrome oxidase, pyruvic acid dehydrogenase, phosphoglucomutase, lactic acid dehydrogenase, etc. Ver slied organic compounds. B. p-Amino-phenyldichlorarsine and 3-Amino-4-hydroxyphenyl-arsine oxide also inhibit the function of the redox enzyme systems.



   The various quinones are known to also show an enzyme-inhibiting effect, e.g. B. against pyruvic acid dehydrogenase, succino dehydrogenase, pyruvic acid carboxylase and catalase. In the so-called quinone-stick material-free and in the quinonethyleneimine derivatives, for example: 2,5-bis-fl-chloroethylamino-benzoquinone- (l 4), 2,5-bis-di-ss-chloroethylamino-benzoquinone- (1 4), 2,5-bis-äthylenimino-benzoquinone- (1,4) and 2, 5-bis-n-propoxy-3, 6-bis-äthylenimino-benzoquinone- (1,4) the simultaneous existence of both mentioned Effects (of the cytostatic and enzyme-inhibiting) are assumed (cf. S. Peteren, W. Gauss and E. Urbschat, Angew. Chem. 67, 217 [1955]; W. Gauss and 5.

   Petersen, op. Cit. 69, 252 [1957].



  As a related compound, 2,5-bis-ethyleneimino-hydroquinone, which has also been found to have a tumor-inhibiting effect (cf. A. Marxer, Experimentia, 11, 186 [1955]), can be counted as belonging to this type. Since no salts with heparin can be formed from such compounds, we have their basic substituted derivatives, such as: 2,5-bis-P-climethylamino-ethoxy-3,6-bis-äthylenimino-benzoquinone- (l, 1, 4), 2, 5-dichloro-3, 6-bis-ss-piperidino-ethylamino-benzoquinone (1, 4) and 2,5-di-n-methylpiperazino-benzoquinone (1 4) are used for salt formation.



   With the heparin sodium salt and with the free heparic acid, no growth-inhibiting activity against tumors at all can be found in animal experiments; these substances even have the opposite effect, they accelerate the growth of tumors and at the same time cause a decrease in body weight. This is also proof that in the case of the compounds prepared according to the invention there is a new, very specific and unexpected effect.



   Some salts of heparic acid formed with organic bases have already been described in the literature, but they did not contain any cytostatic compounds or compounds capable of inhibiting the enzymes that play a role in the metabolism of tumor cells as basic components. These known heparin salts also have absolutely no tumor-inhibiting properties; at most they show hepatic, anticoagulant effects. So was z. B. an aqueous solution prepared from 20 parts of heparin and 1 part of histamine (RK Sanyal and GB West, Nature 178, 1293 [1956]) and that with N, N'-bis- (a-methylbenzyi) ethyenediamine (A. Cantone , Minerva Med.

   I. 230 [1953]) and heparin salts formed with aminoacridines (K. 5. Dodgson, F. A. Rose and B. Spencer, Biochem. J. 60, 346 [1955]), which, however, show no tumor-inhibiting effect.



   The new heparin salts formed with cytostatic or enzyme-inhibiting basic compounds are produced in the sense of the present invention in such a way that heparin in the form of the free acid is already cytostatic or not cytostatic, but inhibiting the enzymes involved in the metabolism of the cells is implemented. It is not necessary that the heparic acid used as the starting material should show an anti-coagulant activity. The two components can e.g. B. be used in equivalent amounts or in such a proportion that the amount of the basic compound is less than the equivalent amount calculated from the number of -NHO3H and -O-SO- groups present. In the latter case, acidic heparin salts are obtained as products.

   Both types of the heparin salts obtained as a product show the aforementioned advantageous tumor-inhibiting effect.



   The reaction can be carried out in an inorganic or organic solvent, expediently in water, in lower primary alcohols or in a mixture of all the solvents, advantageously in a temperature range between -10 and + 300.degree.



   In the preparation of the new heparin salts according to the invention, it is not necessary that solid, isolated heparin in the form of the free acid should be used as the starting material; the aqueous or organic acidic heparin solution obtained as a raw product during heparin production can also be used as a starting material.



   The new heparin salts prepared according to the invention are mostly readily soluble in water; the pH of the solution depends on the number of SO3H groups present in the heparin and on the amount of the basic component used.



  The ratio of these factors is expediently chosen in such a way that the pH of the aqueous solution of the product should be between 1.5 and 7.



   The new heparin salts produced in the context of the present invention show a cytostatic activity which substantially exceeds the similar effect of the previously known cytostatic agents, since these new compounds act mainly on the tumor tissue due to their specific mode of action. This is also proven by the fact that during z. B. 8 mg / kg 1,6-bis (ss-chloro-äthylamino) -1, 6-deoxy-D-mannitol dihydrochloride caused a 20-25% weight loss in the animals because of its general cell-damaging effect, which with Heparin-formed salt of the same compound in the same dose does not cause any weight loss, but on the other hand in much smaller doses, e.g.

   B. 2.5 mg / kg, the hydrochloride of the cytostatic compound mentioned shows no tumor-inhibiting effect at all, while the salt formed with heparic acid has a very noticeable tumor-inhibiting effect.



   Example I.
4.55 g (0.012 mol) of 1,6-bis (p-chloroethylamino) -1, 6-deoxy-D-mannitol dihydrochloride are dissolved in 20 ml of water and with ice-cooling with a solution of 1.34 g (0.024 Mol) potassium hydroxide in 5 ml of water is added, then a solution of 8.75 g of heparin in the form of the free acid in 20 ml of water is added to the mixture. The clear solution is evaporated to a syrupy density at a temperature below 300 C and with 75 ml abs.



     Ethanol added. The precipitating heparin salt is filtered, with 20 ml abs. Ethanol and then washed with 20 ml of anhydrous ether. 14.10 g of 1,6-bis (ss-chluräthyiamin) -1 6- deoxy-D-mannit-hep arinic acid salt are obtained (theoretical yield 14.21 g) in the form of a light cream-colored, amorphous, water-soluble 12, 6% KC1 containing product showing no characteristic melting point.



   The 1,6-bis- (s-chloroethylamino) - 1,6-deoxy-D-mannitol dihydrochloride (Degranol;, mannomustine) used as the starting product is a known cytostatic agent, the preparation of which is described in the communication by L. Vargha etc. (J. Chem. Soc. 1957, page 805).



   The heparin used for the above reaction in the form of the free acid shows an anti-coagulant activity of 3.2 IU / mg; it has no characteristic melting point, slowly turns brown above 1800 C and charred above 2050 C.



  Analysis: N = 3.0%, S = 13.15%. This heparin thus contains on average only 3.7 SO3H groups per tetrasaccharide group instead of the maximum 5.



  Accordingly, the molecular weight of these repeating tetrasaccharide graves is only 898 instead of 1002.8.



   In the end product, 80% of the SOsH groups originally present in the heparin are bound by the basicity of mannomustine. The presence of these free SOsH groups is also shown by the pH of the aqueous solution of the product (3-3.5).



   The mannomustine heparfuat produced in the above manner has shown the following results in animal experiments:
Crocker S. 180 Tumor in mice: daily doses of 25 mg / kg have retarded the growth of the tumors by 42% over a 10-day treatment. In comparative experiments carried out simultaneously with mannomustine dihydrochloride, treatment with doses containing the same amount of mannomustine caused only a 25% inhibition of tumor growth.



   Solid Ehrlich tumor: after a 10-day treatment with daily doses of 25 mg / kg, the mannomustine heparinate retarded the weight gain of the tumors by 63.6%. The comparative tests carried out simultaneously with mannomustine dihydrochloride showed a 24% acceleration (!) Of tumor growth.



     Nemet-Kellner's ascites lymphoma: 100 mg / kg mannomustine heparinate were administered after 24 and 48 hours after inoculating the tumor; after 6 days a 76 ige inhibition of tumor growth was observed.



     Example 2
The procedure is similar to that described in Example 1, except that instead of 0.012 mol of mannomustine, the amount equivalent to the SO3H groups present in the heparin, i.e. 0.016 mol of mannomustine with heparin in the form of the free heparin in the fold of the heparin used in Example 1 Acid reacted. As a result, the product obtained is a neutral salt containing KCl, which has a pH of 5.5-6 in aqueous solution.



  This product gave results equivalent to those described in Example 1 in animal tests.



   Example 3
0.55 g of pure mannomustine base (decomposition point 2780 C, preparation cf. Vargha etc. loc. Cit.) Are mixed with 1.31 g of heparin in the form of the free acid (quality as in Example 1) in 15 ml! Dissolved water and the resulting clear solution evaporated under ventilation or vacuum at a temperature below 300 C to a syrupy density. The weakly acidic, KCl-free mannomustine heparinate is precipitated by adding 20 ml of abs. Ethanol, filtered and treated with 10 ml of abs. Ethanol, then with 10 mi. washed with anhydrous ether. 1.81 g of KC1-free mannomustin heparinate are obtained, which in the analysis shows a nitrogen content of 4.26%. Due to its greater purity, this product has a correspondingly increased effect.



   Solid Ehrlich tumor: after 10 days of treatment with daily doses of 150 mg / kg, the growth of the tumor was retarded by 55%.



     Benevolenskaya sarcoma: after a 21-day treatment of rats inoculated with Benevolenskaya sarcoma at daily doses of 60 mg / kg, a 64% growth inhibition of the tumor was achieved.



   Yoshida sarcoma in rats: 99.2% inhibition was achieved after 7 days of treatment with daily doses of 50 mg / kg.



   Example 4
A heparin containing an average of 3.5 SO3H groups per tetrasaccharide units is dissolved in water and the solution is neutralized with the calculated amount of 2 - [bis - (fl - chloroethyl) - aminomethyl] - benzimidazole base. The clear solution obtained is concentrated to a syrupy density with ventilation, 25 ml of anhydrous acetone are added, the precipitated salt is filtered and washed with anhydrous acetone and anhydrous ether. The benzimidazole heparinate obtained in this way shows in animal experiments a tumor-inhibiting effect similar to mannomustine heparinate. The growth of the solid Ehrlich tumor was retarded by 42% after treatment with daily doses of 100 mg / kg for 10 days.



   The 2- [bis- (, B-chloro-ethyl) -aminomethyl] -benzimidazo1Base used as starting material can be prepared from the dihydrochloride in the usual way at a temperature of 0 C; the production of the dihydrochloride was carried out by E. Hirschberg etc.



  Cancer Research 17, 904, and W. S. Gump and E. J.



  Nikawitz, J. Org. Chem. 24, 712.



   Example 5
0.90 g of heparin (containing on average 3.5 SO3H groups per tetrasaccharide units, without anticoagulant effect) and 0.80 g of sulfaguanidine are dissolved in 20 ml of water, the solution is filtered and evaporated to dryness at room temperature in vacuo . The salt obtained as residue is placed on a filter with 20 ml of anhydrous ethanol and washed with 20 ml of anhydrous ether. 1.62 g of sulfaguanidine heparinate are obtained; the product shows no melting point and is slowly charred above 1800.degree. The 5% strength aqueous solution of the product has a pH value of 2. Analysis: N = 13.3%.



   In a similar manner, the salts formed with heparin in the form of the free acid can also be prepared from the following sulfamides: p-aminobenzenesulfonamide, 2- (4-aminobenzene sulfamido) -4-methyl-thiazoi and 2-suwanilamido-4,6-dimethyl -pyrimidine.



   These products have also shown good anti-tumor effects in animal experiments. After 10 days of treatment in 40 mg / kg daily doses, the p-amino benzenesulfamide heparinate retarded the growth of the solid Ehrlich tumor by 24%. With 2- (4-aminobenzenesulfamido) -4-methyl-thiazole, 40% retardation was found under similar conditions, with sulfaguanidine heparinate the retardation was 49.8% and with 2-sulfanilamido 4,6-dimethyl -pyrimldin-hep arinat under the same conditions 25%.



   Example 6
1.31 g of heparin (which contains an average of 3.7 SOsH groups per tetrasaccharide units and shows an anti-coagulation activity of 3 IU / mg) are dissolved in 25 ml of water and 0.58 g of quinine base is added at 0 ° C. The solution obtained is filtered and concentrated to a syrupy density under 10 torr vacuum at 300.degree. The weakly acidic salt is precipitated by adding 20 ml of anhydrous tetrahydrofuran, filtered, washed with 5 ml of tetrahydrofuran, then washed twice with 5 ml of ether each time.



   1.84 g of quinine heparat are obtained, the aqueous solution of which has a pH of 4.3. Analysis: N = 4.8% (corresponds to the theoretical nitrogen content). The product has no characteristic melting point and is charred above 1900 ° C.



   Compared to the solid Ehrlich tumor, this product shows a 26% retarding effect after 10 days of treatment with daily doses of 100 mg / kg.



   Example 7
0.655 g of heparin (with 13.15% sulfur content, i.e. contains on average 3.7 SO3H groups per tetrasaccharide units; shows an anti-coagulant effect of 3 IU / mg) are dissolved in water and the solution with 0.358 g of 3- Amino-4-hydroxyphenylarsine oxide added. The solution is evaporated almost to dryness at a temperature below 300 C and the residue with 10 ml abs. Put ethanol on filter. The salt obtained is washed twice with 10 ml of anhydrous ether each time. 0.93 g of 3-amino 4-hydroxyphenylarsinoxyd-hep arinate are obtained; Analysis: As = 13.5%, N = 4.3%.



   Example 8
1.31 g of heparin (quality as in Example 7) are suspended in a finely powdered state in 50 ml of anhydrous ether and 0.92 g of 3-amino-4-hydroxyphenyl-chlorarsine are added at a temperature of -100C the mixture is stirred in a stream of dry nitrogen at 0 C for 5 hours. The mixture is then evaporated to dryness under a weak vacuum at room temperature and the residue is homogenized by trituration in a nitrogen atmosphere.



   Analysis of the arsenic compound obtained: As = 12.0% - = 11.2%, N = 4.0%. In animal experiments, this product shows the same effect as the product obtained according to Example 7, since it hydrolyzes to the same compound on exposure to water.



   Example 9
0.655 g of heparin (quality as in Example 7 and 8) are dissolved in 15 ml of water, 0.144 g of 2.5 bis-ethyleneimino-hydroquinone are added, the solution is then evaporated to dryness in vacuo at room temperature and the slightly acidic residue obtained as a residue Salt with 10 ml abs. Put ethanol on a filter, wash with 10 ml of anhydrous ether. Yield: 0.75 g; Analysis: N = 5.05%.



  The product is soluble in water, pH value of the solution: 5.5.



   Example 10 0.850 g of heparin (sulfur content 11.75; therefore contains on average 3.1 SO3H groups per tetrasaccharide units, does not show any anti-coagulant effect) are dissolved in 25 ml of water, then the solution is made up with 0.636 g of D (-) - Threo lp-nitrophenyl-2-amino-1, 3-propanediol crosslinked. The clear solution obtained, which has a pH of 6, is processed further as in Example 5. Yield 1.40g. This product, which is readily soluble in water, retarded the growth of the solid Ehrlich tumor by 34% after treatment with daily doses of 100 mg / kg for 10 days.



   Example 11
0.830 g of heparin (sulfur content 11.0%, i.e. contains on average 2.85 SOgH groups per Tetra saccharild unit; does not have any anti-coagulant effect) are dissolved in 25 ml of water and mixed with 0.60 g of 3-amino-4-oxyphenyl -arsonic acid added.



  After the usual processing of the solution, 1.35 g of light brown salt are obtained; the pH of the product is 1.7 because of the presence of free arsonic acid groups.



   When dissolved in physiological saline solution, when administered intraperitoneally and used in 150 ml / kg daily doses for 10 days, the product shows a 41% retardation of the solid Ehrlich tumor.



   Example 12
0.850 g of heparin (quality as in Example 10) are dissolved in 25 ml of water and 0.465 g of 7-chloro-4- (4-diethylamino-1-methylbutyl-amino) -quinoline are added to the solution and the solution is processed in the usual way. The salt obtained has a pH of 4.2; its analysis corresponds to the calculated values. When used for 10 days in daily doses of 150 mg / kg, the product shows a 25% retardation of the solid Ehrlich tumor.



   Example 13
1.7 g of heparin (quality as in Example 10) are dissolved in 40 ml of water, with 1.07 g of 2,5-bis-fl-dimethyl-aminoethoxy-3,6-bis-ethylenimino-benzo-quinone- (1 , 4) (melting point 60-610 C) added.

 

   The solution (pH = 6) is filtered and, with ventilation, concentrated to a cup-like density in a bowl with a large surface within 3 hours. The concentrated solution obtained is treated with 30 ml of acetone, the precipitated light brown salt is filtered and washed with 3 × 10 ml of acetone.



  Yield: 2.62 g (97% of the theoretical amount).



   Example 14
The procedure is as in Example 10, but 0.91 g of 2,5-di-N-methyl-piperazino-benzoquinone- (1,4) (melting point 188-190 ° C.) are used as the basic component. 2.37 g of light brown heparin salt are obtained (95% of the theoretical amount). The product is readily soluble in water; pH value of the aqueous solution = 6.

 

Claims (1)

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von neuen, erhöhte bzw. spezifische tumorhemmende Wirkung zeigenden Heparinsalzen, dadurch gekennzeichnet, dass man an sich schon zytostatisch wirkende oder an sich nicht zytostatische, aber die im Stoffwechsel der Zellen mitwirkenden Enzyme hemmende basische Verbindungen mit Heparin in Form der freien Säure umsetzt. PATENT CLAIM Process for the production of new heparin salts showing increased or specific tumor-inhibiting effect, characterized in that basic compounds which are already cytostatic or not cytostatic but which inhibit the enzymes involved in the metabolism of the cells are reacted with heparin in the form of the free acid . UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Heparin in Form der freien Säure ein die Blutgerinnung nicht hemmendes Heparin mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht unter 25,000 verwendet wird. SUBCLAIMS 1. The method according to claim, characterized in that a blood coagulation non-inhibiting heparin with an average molecular weight of less than 25,000 is used as the heparin in the form of the free acid. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Heparin in Form dier freien Säure ein pro Tetrasaccharid-Einheit dürchschnitflich 3-4 SOsH-Gruppen enthaltendes Heparin verwendet wird. 2. The method according to claim, characterized in that a heparin containing an average of 3-4 SOsH groups per tetrasaccharide unit is used as the heparin in the form of the free acid. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass 1, 6-Bis-(sschloräthyl-amino)-1, 6- didesoxy-D-mannit als zytostatische Verbindung verwendet wird. 3. The method according to claim, characterized in that 1, 6-bis (sschloräthyl-amino) -1, 6- dideoxy-D-mannitol is used as the cytostatic compound. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass 2-Bis-(Bchloräthyl)-aminomethyl] - benzimid'azol als zytostatische Verbindung verwendet wird. 4. The method according to claim, characterized in that 2-bis (chloroethyl) aminomethyl] - benzimid'azole is used as a cytostatic compound. 5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass 2, 5-Bis-ssdimethylamino-äthoxy 3, 6-bis-äthylenimino-benzochinon-(1, 4) als zytostatische Verbindung verwendet wird. 5. The method according to claim, characterized in that 2, 5-bis-ssdimethylamino-ethoxy 3, 6-bis-äthylenimino-benzoquinone- (1, 4) is used as the cytostatic compound. 6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass 3-Amino-4-hydroxy-phenylarsinoxyd als zellenstoffwechselhemmende Verbindung verwendet wird. 6. The method according to claim, characterized in that 3-amino-4-hydroxyphenylarsine oxide is used as a compound that inhibits cell metabolism. 7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass p-Amino-benzolsulfonamid als zellenstoffwechselhemmende Verbindung verwendet wird. 7. The method according to claim, characterized in that p-amino-benzenesulfonamide is used as a cell metabolism-inhibiting compound. 8. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass 2-Sulfanilamidb-4, 6-dimethyl-py- rimidin als zellenstoffwechselhemmende Verbindung verwendet wird. 8. The method according to claim, characterized in that 2-sulfanilamideb-4, 6-dimethyl-pyrimidine is used as a compound which inhibits cell metabolism. 9. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass 2,5-Di-N-methyl-piperazino-benzo- chinon-(1,4) als zellenstoffwechselhemmende Verbindung verwendet wird. 9. The method according to claim, characterized in that 2,5-di-N-methyl-piperazino-benzo-quinone (1,4) is used as a compound which inhibits cell metabolism. 10. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass Chinin als zellenstoffwechselhemmende Verbindung verwendet wird. 10. The method according to claim, characterized in that quinine is used as a cell metabolism-inhibiting compound. 11. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass 7-Chlor-4-(4-diäthylamino-1-me thylbutylamino)-chinolin als zellenstoffwechselhemmende Verbindung verwendet wird. 11. The method according to claim, characterized in that 7-chloro-4- (4-diethylamino-1-methylbutylamino) -quinoline is used as a compound which inhibits cell metabolism. 12. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass D (-)-Threo-l-p-nitrophenyl ; 2- amino - 1,3 - propandiol als zellenstoffwechselhemmende Verbindung verwendet wird. 12. The method according to claim, characterized in that D (-) - threo-l-p-nitrophenyl; 2-amino-1,3-propanediol is used as a compound that inhibits cell metabolism. 13. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die basische Verbindung und das Heparin in Form der freien Säure in einem solchen Mengenverhältnis verwendet werden, dass das er haltene Salz in 3% iger Lösung einen pH-Wert zwi- schen 1,5 und 7,5 zeigt. 13. The method according to claim, characterized in that the basic compound and the heparin are used in the form of the free acid in such a quantitative ratio that the salt obtained has a pH between 1.5 and 7 in 3% solution , 5 shows. 14. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die basische Verbindung und das Heparin in Form der freien Säure in einem solchen Mengenverhältnis verwendet werden, dass die basische Verbindung zur Bindung sämtlicher im Heparin anwesenden SOsH-Gruppen nicht ausreicht. 14. The method according to claim, characterized in that the basic compound and the heparin are used in the form of the free acid in such a quantitative ratio that the basic compound is insufficient to bind all the SOsH groups present in the heparin. 15. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in wässerigem oder alkoholischem, bzw. wässerig-alkoholischem Medium bei einer Temperatur zwischen -10 und + 300 C durchgeführt und das entstandene Heparinsalz vom Reaktionsgemisch isoliert wird. 15. The method according to claim, characterized in that the reaction is carried out in an aqueous or alcoholic or aqueous-alcoholic medium at a temperature between -10 and + 300 C and the heparin salt formed is isolated from the reaction mixture.
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