DE2835096A1

DE2835096A1 - Natuerliches hexuronylhexosaminglycansulfat, verfahren zu seiner herstellung und die betreffenden therapeutischen verwendungen

Info

Publication number: DE2835096A1
Application number: DE19782835096
Authority: DE
Inventors: Gianfranco Fedeli; Fernando Fussi
Original assignee: Hepar Chimie SA
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1977-08-10
Filing date: 1978-08-10
Publication date: 1979-03-01
Also published as: DE2835096C2; IT7826282A0; GB2007693A; JPS6341921B2; JPS5432609A; US4264733A; GB2007693B; CH639670A5; IT1158896B; US4230699A

Description

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Die vorliegende Erfindung· betrifft ein natürliches Heteropolysaccharid, speziell ein natürliches Tlexuronylhexosaminglycansulfat, das durch Extraktion von tierischen Organen gewonnen wird, welches anticoa/rulierende, anti thrombo ti sehe und klärende Aktivitäten zuigt.

Thrombose verursacht häufig· dauernde Invalidität und ist einer der häufigsten Faktoren für den Tod bei kardiovaskulären Erkrankungen.

Der allgemeine Betriff Thrombose umfaßt Zustände von Ilyperkoagulierbarkeit, deren Ursache zurückgeführt werden kann aufs

— "Risikofaktoren", welche zu einem "thrombogenen Zustand" führen wie z.B. Rauchen, Streß, Anwendung· von Kontrazeptiva des Gestagen-Types über eine längere Zeit usw.

— Erbfaktoren wie z.B. das Fehlen oder den Mangel an Inhibitoren (speziell von Antithrombin III).

— Ätiologische Faktoren mit verschiedenen und manchmal nicht völlig geklärten Ursachen, wie z.B. Veränderungen der Aggregation der Blutplättchen.

— Faktoren im Zusammenhang mit einer zeitweiligen Ver— langsamung der Blutzirlculation, wie sie z.B. nach chirurgischen Eingriffen unter Narkose auftreten.

Die pathologischen Folgen eines "thrombogenen Zustands", wie er durch einen oder mehrere der oben erwähnten Faktoren bestimmt wird, können die folgenden sein:

— pulmonale, cerebrale, coronare Thromboembolie und In— farktbildung.

— Thrombophlebitis, variköse Syndrome

— intravaskulär disseminierta Coagulation.

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Gegenüber solch wichtigen Erscheinungsformen kann heute auf zwei Strategien zurückgegriffen werden:

1. Verwendung thrombolytischer Mittel

2. Prävention thrombogoner Zustände und ihrer Folgen.

Wegen der Schw-ore und der hohen Geschwindigkeit des möglichen Verlaufs der Thrombose ist es einleuchtend, daß die zweite Strategie bei weitem die bessere wäre.

Um im Sinne einer Prävention, da s Thromboseproblem anzupacken, gibt es zur Zeit zwei Typen von Medikamenten: die oralen Anticoagulantien (iiumarin und dessen Derivate) und Heparin. Die oralen Anticoagulantien (Kumarin und dessen Derivate) wirken über die Leber indem sie zwei Faktoren der Coagulation blockieren: Proconvertin und Prothrombin. Diese Anticoagulantien sind jedoch für eine längere Therapie ungeeignet und zeigen darüber hinaus eine ungenügende antithrombotische Aktivität, da ihre Wirkung keine anderen Faktoren der Hämcoagulation betrifft, die besonders bei der Genese der Thrombose eine Rolle spielen, insbesondere die XA- und die Blutplättchen-Faktoren»

Unter diesem Gesichtspunkt erscheint Heparin vorteilhafterj da es auf verschiedene Plasma-Faktoren der Hämcoagulation wirkt, insbesondere auf Thrombin, den XA-Faktor, und auch auf die Faktoren XII, XI und IX zusätzlich zu seiner Wirkung auf den sogenannten PF^-Blutplättchen-Faktor. Alle diese Wirkungen können auf die spezifische Fähigkeit des Ifeparins zurückgeführt werden, den Inhibitor und die obengenannten Coagulierungsfaktoren zu aktivieren. Dieser Inhibitor, der im Plasma vorhanden ist, wird Antithrombin III genannt und benötigt die Anwesenheit von Heparin als Cofaktor zur Entfaltung seiner Aktivität.

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Unglücklicherweise ist die Heparin—Therapie aus zwei Gründen nicht empfehlenswert: erstens ist es nur parenteral wirksam und seine Wirkung hält nicht länger als 8 bis 12 Stunden an, wodurch eino längere Prophylaxe, die täglich zwei Injektionen Heparin erfordern würde, nur schwierig zu erzielen ist. Zweitens hub IIiipur i π iii.chf. nut· υ Liu.· im Li Lliroinbo tisclio Wirkung, sondern bowirkt auch totale Anticoagulation. Obwohl diese zweite Wirkung manchmal vorteilhaft ist, kann in manchen Fällen, wenn die Therapie für den betreffenden Patienten nicht geeignet ist, das Risiko oiner Blutung oln ernstes Problem sein bei allen unbestreitbaren Vorteilen der Prophylaxe einer Thrombose,

Es ist gefunden worden und Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung, daß ein Ileteropolysaccharid, insbesondere ein Hexuronylhexosamint; Lycansulfat, wie es durch Extraktion tierischer Organe erhalten wird, nicht nur anticoagulierende, antithrombotisch^ und klärende Wirkung hat, sondern auch oral und parenteral verabreicht werden kann; es kann über den Darm oder durch, äußerliche Anwendung absorbiert werden und zeigt ein Verhältnis von antithrombotischer zu anticoagulierender Aktivität, die gegenüber Heparin Vorzüge aufweist.

Zur Charakterisierung des erfindungsgemäßen Produkts wird auf folgende Daten verwiesen:

Hexosamin nach Hydrolyse (Reaktion mit p-Dimethylaminobenzaldehyd) : 27-3 ^c/o.

Organisches SOi{~" nach Hydrolyse (Titration mit Naphtharson) : 27 - h ^c/o.

Acetylgruppen nach Hydrolyse : 7 - 1 '/<>· Natx"ium (Atomabsorption) : 10 - 2 ^c/o.

Molverhältnis Huronsäuren: Höxosamin: Sulfat : Acetyl: Natrium = etwa 1 : 1,2:2: 1,2:3.

Molekulargewichtsbereich. (Gelchromatographie): 8000 _ 16000.

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Spezifische Drehung H^⁰ = ~ 15/-3O°.

Elektrophorese auf Celluloseacetat (Puffer: Pyridin, Essigsäure, 1/asser im Verhältnis 1 : IO : 229, pTI = Ί , 5 und lOntwicklung mit Toluidinblau): Eine Hauptbande mit einer Elektrophoretischen Beweglichkeit U = 1,90 - 1,95 χ 1O~^/! Cm²V-¹S-¹ .

TR-.S pole trum: cliarak tori ati soho Tiandon boi 17''o, Ι6Ί7, 1555, 1375, 1235 und I050 cm "¹. Löslichkeit: Das erfindungsgemäße Polysaccharid ist löslich in Wasser, verdünnten Mineralsäuren und verdünnten Alkalien, aber unlöslich in Ethanol.

Zur Identifizierung ist veiter der folgende Test nützlich: ml einer 2 böigen wäßrigen Lösung des erfindungsgemäßen Produkts wird mit 3 ml einer 2 $igen wäßrigen Lösung von Cetylpyridiniumchlorid, erwärmt auf hO C, versetzt: es bildet sich ein voluminöses weißes Präzipitat. Das Präzipitat wird abzentrifugiert und in 3 ml einer 0,7 molaren KCL-Lösung suspendiert: man beobachtet eine vollständige Auflösung des Präzipitats.

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist der Extraktionsprozeß mit dem das oben charakterisierte Produkt erhalten wird. Dieser Prozeß ist durch die folgenden Stufen gekennzeichnet:

a) Hydrolyse eines tierischen Organs, gemahlen und in Wasser suspendiert, mit einem proteolytischen Enzym,

b) Fällung aus der klaren Flüssigkeit mit einem wassermischbaren Lösungsmittel,

c) Solubilisation des Präzipitats in einer Lösung eines Salzes einer starken Mineralsäure und eines ein- oder zweiwertigen Kations (z.B. Natrium, Ammonium, Calzium), wobei diese Salzlösung eine Ionenkonzentration entsprechend einer 0,8 molaren

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NaC 1—Lb"sunp; hat,

d) Zugabe hoi einer Temperatur von nicht höher als HC)⁰C eines Überschusses eines quaternären Ammoniumhalogenide aus der Gruppe derer, dio im Molekül mindestens eine aliphatischo Gruppe mit mehr als 12 Kohlenstoffatomen hat, wobei ein Komplex ge-, bildet wird, dor in Lösung bleibt, vährend das gleichzeitig gebildete Präzipitat abgetrennt wird,

o) Fällung des Komplexes durch Verdünnen mit Wasser bis eine Ionenkonzentration nicht höher als die einer 0,'l· molaren Na Cl-Lösung erreicht wird,

f) Isolierung des gefällten Komplexes und Solubilisation in einer Salzlösung mit den gleichen Merkmalen wie in Stufe c).

g) Ausfällen des gewünschten Produkts mit einem wassermischbaren Lösungsmittel und Trocknen«

Bei spezieller Betrachtung der einzelnen Schritte des oben beschriebenen Prozesses sollen die folgenden Besonderheiten herausgestellt werden. Das tierische Organ, das hydrolysiert wird, ist vorzugsweise frisch oder tiefgefroren. Von den verwendbaren tierischen Organen werden Lungen und Duodenum bevorzugt. Das proteolytische Enzym wird vorzugsweise aus der frTiippo dor pflanzlichen (Papain, I⁷¹OIgOnPrOtOfInO, Tlromolin) oder der Bakterienendopeptidasen ausgewählt, wobei die Bedingungen unter denen die Hydrolyse durchgeführt wird, vom Typ dos Enzyms abhängen. Es wird besonders bevorzugt^ die Hydrolyse in einem Zeitraum -von nicht weniger als 3 Stunden unter mildem Erhitzen durchzuführen, bis der ¥ert des ·£— Aminostickstoffs (bestimmt nach Soerensen) sich nicht mehr ändert.

Zur Fällung aus der klaren Flüssigle it nach der Hydrolyse wird als Lösungsmittel Aceton, Dioxan, Methanol, Ethanol und ähnliches ausgesucht.

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Das quarternäre Arnmoniumhalogenid der Stufe d) wird vorzugsweise aus der Gruppe der Chloride und Bromide des Cetylpyri-&in>iums und Cetyltrimethylammoniums gewählt. Der erwähnte Überschuß beträgt mindestens 0,5 g quarternäres Ammoniumsalz pro kg tierischem Organ, von dem man ausgeht. Schließlich wird für die Fällung des Endprodukts (Schritt g) die Verwendung von Aceton bevorzugt und das Präzipitat wird im Vakuum getrocknet oder lyophilisiert»

Die folgenden beiden Beispiele sollen den erfindungsgemäßen Extraktionsprozeß erläutern ohne ihn einzuschränken.

Beispiel 1

100 kg Schweineduodenum werden gemahlen und in 50 1 Wasser suspendiert. Nach Erwärmen auf 40°C werden 200 g Papain, in 25 1 Wasser suspendiert, zugegeben. Nach Erwärmen der gesamten Mischung auf 60°C wird die Auflösung drei Stunden fortgeführt.

Gegen Ende wird die Mischung 15 Min auf 90°C erhitzt. Die gesamte Menge wird nut U kg Filterhilfe in einer Filterpresse filtriert.

Das klare Filtrat wird auf 50 1 konzentriert, dann 150 1 Ethanol zugegeben und über Nacht stehen gelassen.

Nach Entfernen der überstehenden wässrigalkoholischen Phase wird das Präzepitat sorgfältig getrocknet und in 25 1 Wasser, das 1200 g NaCl enthält, suspendiert und dann filtriert. In das Filtrat werden unter Rühren 25 1 einer 0,8 molaren Lösung von NaCl mit 50 g Cetyltrimethylammoniumchlorid zugegeben. Die Mischung x/ird auf ^O C erwärmt. Die Mischung wird mit 2 kg Filterhilfe über eine Filterprosse filtriert. Das klare Filtrat wird mit 2 kg Filterhilfe versetzt und unter Rühren mit

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50 1 Wasser verdünnt. Nach. Erwärmen auf ^O C wird das Produkt durch. Vakuumfiltration gesammelt.

Der Filterkuchen wird in 10 1 einer 0,8 molaren NaCl-Lösung suspendiert und auf «t-O C erwärmt. Nach Filtration werden der klaren Flüssigkeit unter Rühren das 1,5 fache Volumen Aceton zugefügt. Die Mischung wird übοr Nacht stehengelassen. Die flüssige obere Wasser/Acetonphase wird entfernt, und das Präcipitat wird mit 2x51 7° 'oigem Aceton gewaschen und dann mit wasserfreiem Aceton entwässert. Dann wird pulverisiert und vakuumgetrocknet.

Ausbeute: 8 g elfenbeinweißes, leicht hygroskopisches Pulver mit folgenden Eigenschaften:

Löslichkeit in Wasser : vollständig

Γ .7 2o .1«°

ι jt/ : - Io

!!uronsäuren : 28 Co

Hexosamine : 30 ^{.Ό

Organisches S0_i{"" : 26,5 $ Anticoagulierende Aktivität: 25 U/mg (USP). Verhältnis der antithrombotischen ZU37 anticoagulierender Aktivität (Yin's Test/KCCT-Test) = 2.

Klärende Aktivität : 125 ILU/mg (international

Lipasemic Unit),

Was die klärende Aktivität betrifft, so ist sie verwandt mit der Lipase—Aktivität, nämlich dem Minimumwert der International Lipasemic Units (!LU), die in 1 Liter Plasma gefunden werden, wenn die zu prüfende Substanz Ratten in einer Dosis von 1 mg/kg Körpergewicht intravenös verabreicht wird. Andererseits ist die Lipase-Aktivität in International Lipasemic Units ausgedrückt die Aktivität, die 1 Mikromol Oleinsäure pro Minute hydrolysiert.

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Beispiel 2

50 kg Rinderlunge werden gemahlen und in 75 1 Wasser suspendiert. Nach Erwärmen auf 40 C werden 200 g Papain in 25 1 Wasser suspendiert zugegeben, und die Mischung 3 Stunden auf 65 C erhitzt. Danach wird die Mischung 30 min auf 90 C erhitzt.

Die Flüssigkeit wird filtriert und das Filtrat auf 50 1 konzentriert und nochmals gefiltert. Zum Filtrat werden 100 1 Aceton zugegeben und über Nacht stehen gelassen. Nach Entfernen der überstehenden flüssigen Phase wird das Präzipitat mit 50 1 einer 0,8 molaren NaCl-Lösung, die 50g Cetylpyridiniumchlorid enthält, aufgenommen. Die Mischung wird dann auf kO C erwärmt und dann mit 2 kg Standard Supercell (Filterhilfe) filtriert.

Das Filtrat wird mit 50 1 Wasser, das 5OO g Standard Supeiöell suspendiert enthält, verdünnt. Der Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt, in 10 1 einer 0,8 molaren NaCl-Lösung suspendiert und filtriert. Das klare Filtrat wird durch Rühren mit 2 1 Chloroform gewaschen. Nach Abtrennen der Chloroform-Phase wird die wäßrige Phase wieder filtriert und mit dem 1,5 fachen Volumen Ethanol gefällt. Das Präzipitat wird gewaschen und mit Alkohol entwässert und dann in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Membran filtriert und lyophilisiert.

Ausbeute: 6,9 g eines elfenbeinweißen Pulvers mit folgenden Eigenschaften:

Löslichkeit in Wasser: vollständig

Drehwert : f<*J ^° = ■- 2h°

Uronsäuren ; 31,2" $

Hoxosamin : 33,1 $

"♦ Organisches S0.~~ : 22,8 $

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gerinnungshemmende Aktivität: 28 u/mg- (USP) klärende Aktivität : 115 ILTj/mg

Antithrombotische zu gerinnungs— hemmender Aktivität : 2

Das erfindungsgemäße Heteropolysaccharid, wie es im oben beschriebenen ProzoO erhalten wird, wurde geprüft, um die pharmakologischen Eigenschaften und Aktivitäten festzustellen.

Akute Toxikologie:

Bei Meerschweinchen, Ratten, Mäusen und Kaninchen wurden

keine toxischen Symptome bis zu einer Dosis von 400 mg/kg festgestellt.

LD₅₀ i.p. (Maus) 1615 mg/kg

oral (Maus) 6OOO mg/kg

i.V. (Maus) 1000 mg/kg

LD i.p. (Ratte) T+63 mg/kg

oral (Ratte) 6OOO mg/kg

i.V. (Ratte) I50 mg/kg

Klärende Aktivität

1) Ediol Test : 100-50 ILTj/mg

2) Triton Test: Serum lipide sind durch verabreichtes HP-80 bei Triton-behandelten Ratten signifikant reduziert.

3) Atherogenic diet test: Wenn HP-80 in einer Dosis von 1£> zu einer halbgereinigten Nahrung ergänzt mit Cholesterol und Cholsäure gegeben wird, ist die Substanz in der Lage, die Serumlipide bei Kaninchen zu senken.

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In vitro - gerinnunp;sheinmende und antithrombotische Aktivitäten:

Gerinnungshemmende Aktivität (USP) : 25 - ^O u/mg Kaolin-Cephalin-Gerijinungszeit (kCCT) : 14 - 22 U/mg Yin's Test/KCCT : 1,8 - 2,5 (Heparin=1)

Antithrombotische Aktivität:

Ein statistisch signifikanter Effekt auf die Bewegung des Thrombus wird erreicht, bestimmt im Ratten*-Plasma durch die Chandler-Schleife. Angesichts 4er oben aufgeführten Aktivitäten wird ein therapeutischer Nutzen erwartet bei oraler und parenteraler Anwendung mit täglichen Dosen von 100 bis 200 mg in folgenden Fällen:

Prävention postoperativer Thromboembolien Prävention thrombotischer Erscheinungen infolge

eines thrombogenen Status, wie z.B. bei fertilen Frauen die einer längeren Behandlung mit oralen Kontrazeptiva ausgesetzt sind.

Prävention der Thrombose tief liegender Venen. Prävention von Zuständen von Hypercoagulierbarkeit, Korrektur der hyperdislipidemischen Zustände (ilyperdislipoproteinämie).

Perkutan sind die folgenden therapeutischen Anwendungen indiziert:

Thrombophlebitis, Phlebitis, Kontusionen, Hämatome.

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Claims

MANITZ, FINSTERWALD & QRÄMKOW

HEPAIl CIITMT13 S. A,
Grand Places, Ί^i

FRTBODIICt
Schweiz

DEUTSCHE PATENTANWÄLTE

DR. GERHART MANITZ ■ OIPL -PHYS.

MANFRED FINSTERWALD · DlPL-ING., DIPL.-WIRTSCH.-ING.

WERNER GRÄMKOW DIPL.-4NG.

DR. HELIANE HEYN · DiPL-CHEM.

BRITISH CHARTERED PATENT AGENT

JAMES G. MORGAN · B. SC. (PHYS.). D. M. S.

ZUGELASSENE VEFlTHETE R BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT REPRESENTATIVES BEFORE IHE EUROPEAN PATENTOFFICE MANDATAIRESAGREES PRES LOFFICE EUROPEEN DES BREVETS

Hn/cs - Π 21Ο1 10. August 1978

Natürliches Plexuronylhexosaminglycansulfat, Verfahren zu seiner Herstellung und die betreffenden therapeutischen Verwendungen.

Patentansprüche

1 / Hexuronylhexosaminglycansulfat gekennz-eiclinet durch, die folgenden Eigenschaften:

Hexosamine nach Hydrolyse Uronsäuren nach Hydrolyse (organisches) SOZj nach Hydrolyse Acetylgruppen nach Hydrolyse Natrium nach. Hydrolyse Molverhältnis Uronsäuren Sulfat : Acetyl j Natrium etwa

Molekulargewicht (Gelchromatographie) Spezifisches Drehvermögen

1,2

29 ^± 3 % -

27 ± 3 i>

27 ± h </σ

7 i 1 %

10 ί 2 ⁰Io Hexosamin :

: 2 : 1,2:3

8ΟΌΟ - 16000

= - 30° / - 1 5^C

« Elektrophorese auf Celluloseacetat(Puffer: Pyridin, Essigsäure, Wasser im Verhältnis 1 : Ii' : 229, PH ^,5 und Entwicklung mit Toluidinblau) : eine Hauptba.'ulo :.<it elektrophQretischer Beweglichkeit U= 1,9 - 1,95 x 10" Om²V""¹ s"

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MANlTZ · FINSTERWALD HEYN - MORGAN · 8000 MÜNCHEN 22 ■ ROBERT-KOCH-STRASSE 1 · TEL (099) 22 42 11 · TELEX 05-29672 PATMF

DIPL -ING. W GRAMKOW 7000 STUTTGART 50IBAD CANMSTATTJ SF.B.BERGSTR. 23/25 TEL (07 11) 56 72 61 ZENTRALKASSE H/'TER »emsßSMKFrt MUNfeHEM feMNiHfiriMMFrl Ή» FnarSGHEefc- MUHl¹HFN tms? Λ»

ORIGINAL INSPECTEQ

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IR - Spektrum : charakteristische Tianden bei 1, 16^7, 1555, 1375-, 1235 und IO5O cm ~¹

Löslichkeit : löslich in Wasser, verdünnten Mineralsäuron und verdünnten Alkalien, aber unlöslich in
Ethanol.
2. Verfahren zur Herstellung dos Produkts nach Anspruch 1,
gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Hydrolyse eines tierischen Organs, das gemahlen und in Wasser suspendiert worden ist, mit einem proteolytischen Enzym,

b) Fällung der klaren Flüssigkeit mit einem wassermischbaren Lösungsmittel,

c) Solubilisation des Präzipitats in einer'Lösung eines
Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalzes einer starken Mineralsäure, wobei diese Salzlösung eine Ionaistärke entsprechend einer 0,8 molaren NaC1-Lösung hat,

d) Zugabe bei einer Temperatur von nicht höher als 80 C
eines Überschusses eines quatemären Ammoniumhalogenids ausgewählt von denen, die im Molekül wenigstens eine aliphatische Gruppe mit mehr als 12 Kohlenstoffatomen haben, wobei ein Komplex gebildet wird, der in Lösung bleibt, während das gleichseitig gebildete Präzipitat abgetrennt wird,

e) Fällung des Komplexes durch Verdünnen mit ¥asser bis
eine Ionenstärke nicht höher als die einer 0,4 molaren Na Cl — Lösung erreicht wird,

f) Isolierung des gefällton Komplexes und Solubilisation in oiner Salzlösung mit don gleichen Merkmalen win in Stufe c) und

g) Fällung des gewünschten Produkts mit einem wassermischbaren Lösungsmittel und Trocknen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse mit einem proteolytischen Enzym an Lungen— oder Duodenumgewebe durchgeführt wird.

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4. Verfahren nach. Anspruch 2 oder 3 t dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym Papain, Bromelin, Feigenprotease, Alkalase oder Neutrase ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 'l dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch^ Hydrolyse unter iirh.it ζ en durchgeführt wird bis sich der Wort des iC -Aminostickstoffs nicht mehr ändert.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse mit dem proteolytischen Enzym wenigstens 3 Stunden durchgeführt wird.
7· Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das wassermischbare Lösungsmittel für die klare Flüssigkeit der Hydrolyse Aceton, Dioxan, Methanol oder Ethanol ist.
8, Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das quaternäre Aramoniumhalogenid aus den Chloriden und Bromiden des Cetylpyridiniums und Cetyltrimethylammoniums ausgewählt ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch g e lcennz e i chne t, daß der Überschuß des quaternären Ammoniurnha logenids wenigstens o,5 g je kg des Organs, von dem man ausgeht, beträgt«
•10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 >is 9 dadurch g e k e η η zeichnet, daß das wassermischbare Lösungsmittel in der letzten Fällungsstufe (Schritt g) Aceton ist.
11. Arzneimittel, insbesondere geeignet zur Verhütung von thrombotisehen Zuständen, dadurch gekennzeichnet, daß es als aktiven Bestandteil das Produkt von Anspruch 1 enthält und mit 1oo - 2oo mg/Tag dosiert wird.

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