FI101152B - Menetelmä sulfatoidun, antitromboottisesti vaikuttavan glykosaminoglyk uronaanin valmistamiseksi - Google Patents

Description

101152

Menetelmä sulfatoidun, antitromboottisesti vaikuttavan glykosaminoglykuronaanin valmistamiseksi Käsiteltävänä oleva keksintö koskee menetelmää sul-5 fatoidun, antitromboottisesti vaikuttavan glykosaminogly kuronaanin valmistamiseksi.

Sulfatoituja, antitromboottisesti vaikuttavia gly-kosaminoglykuronaaneja tunnetaan US-patentista 4 438 108. Mainitussa patentissa patenttivaatimusten kohteena olevil-10 la tuotteilla otaksutaan olevan minimaalinen verenvuotoa aiheuttava vaikutus, mikä on äärimmäisen tärkeää, koska tällaiset tuotteet, jotka aiheuttavat verenvuotoa, eivät sovi ihmiskäyttöön.

Näiden tuotteiden verenvuotoa aiheuttava vaikutus 15 on määritetty lihasten verenvuototestillä ja kapillaari suonten verenvuototestillä rotassa.

Olemme kuitenkin havainneet, etteivät nämä testit ole tarpeeksi herkkiä verenvuotoa aiheuttavan vaikutuksen ennustamiseksi ihmisessä, ja kliinisissä turvallisuustut-20 kimuksissa useimmat US-patentin 4 438 108 tuotteista li säsivät verenvuotoa ja erityisesti pidensivät vuotoaikoja, mikä on kyllin vakavaa estämään kliinisen jatkokehittelyn. Olemme nyt havainneet, että uudella menetelmällä sulfatoi-tujen glykosaminoglykuronaanien valmistamiseksi, jossa 25 ensin erotetaan hepariini ja tämän keksinnön mukaisesti saatu tuote toisistaan ultrasuodatuksella ja puhdistetaan sitten jälkimmäistä tuotetta edelleen fraktioeluoimalla ioninvaihtimesta tuleva eluaatti ja metanolifraktioimalla, saadaan uusi tuote, jonka kemiallinen koostumus on muuttu-30 nut ja jolla on huomattavasti parantunut farmakologinen ja kliininen profiili etenkin verenvuotoa lisäävien ominaisuuksien suhteen.

Verrattaessa tätä uutta tuotetta tekniikan tason tuotteeseen suurimpana fysikaalis-kemiallisena erona on 35 rikkipitoisuus, joka on 7,5 - 9,5 % ja edullisesti 8,0 - 101152 2 8,5 %, mikä on olennaisesti suurempi kuin tekniikan tason tuotteen.

Suureen rikkipitoisuuteen liittyy yllättäen ja odotusten vastaisesti vähentynyt verenvuotoriski. Yleisenä 5 olettamuksena on ollut, että suurempi rikkipitoisuus lisää tämäntyyppisten yhdisteiden aiheuttamaa verenvuotoriskiä [ks. esim. J. van Ryn-McKenna ja muut, Antithrombotic and bleeding effects of glysosaminoglycans with different (degrees of sulphation, Br. J. Haem. 71 (1989) 265 - 269].

10 Lisäksi on todettu, että uudella tuotteella on vähemmän systeemisiä sivuvaikutuksia kuin tekniikan tason yhdisteellä .

Keksinnön kohteena on menetelmä sulfatoitujen, an-tiromboottisesti vaikuttavien glykosaminoglykuronaattien 15 valmistamiseksi, jotka olennaisesti muodostuvat dermataa- nisulfaatin, kondroitiinisulfaatin ja heparaanisulfaatin suoloista, joista edullisia ovat natriumsuolat, ja joiden a) keskimääräinen molekyylipaino on 4 000 - 8 000 dalto-nia, 20 b) typpipitoisuus on 2,4 - 3,0 %, c) rikkipitoisuus on 7,5 - 9,5 %, d) natriumpitoisuus on 9 - 11 %, e) dermataanisulfaattipitoisuus on 5 - 25 %, f) kondroitiinisulfaattipitoisuus on alle 9 %, 25 g) anti-Xa-aktiivisuus on 11 - 20 U/mg ja h) antitrombiini Illrsta riippuva antitrombiiniaktiivi-suus on alle 1 U/mg. Menetelmälle on tunnusomaista, että nisäkäskudosta autolysoidaan tai annetaan proteolyyttisten entsyymien vaikuttaa siihen, minkä jälkeen kudosta käsi-30 tellään ioninvaihtimella, jota eluoidaan suolan vesiliuok silla, eluaatti diasuodatetaan sitten suolan vesiliuoksia vastaan, saatu tuote sidotaan tämän jälkeen ioninvaihti-meen, eluoidaan suolan vesiliuoksilla ja saostetaan orgaanisilla liuottimilla ja puhdistetaan tarvittaessa edel-35 leen poistamalla nukleiinihapot, minkä jälkeen se mahdol lisesti käsitellään kaliumpermanganaattiliuoksella.

3 101Ί52

Tuotteen heparaanisulfaattikomponenttina voi olla heparaanisulfaatti, jolla on tai ei ole affiniteettia an-titrombiini III:een, sekä pienen ja suuren affiniteetin omaavan hepraanisulfaatin seokset. Mukana voi olla pieniä 5 määriä sulfatoituja glykosaminoglykuronaaneja, joiden mo- lekyylipaino on suurempi kuin 10 000 daltonia. Uuden tuotteen ja tekniikan tason yhdisteen aiheuttamaa verenvuotoriskiä verrattiin erilaisissa tutkimuksissa nuorille, terveille, vapaaehtoisille miehille kerta-annoksena laski-10 moon annettujen bolusruiskeiden jälkeen. Tutkimuksen tär keimpänä turvallisuusparametrinä oli aineiden aiheuttama verenvuotoajan pidentyminen (ΔΒΤ) mitattuna SimplateR-lait-teella mutta käyttäen hieman modifioitua tekniikkaa siten, että laitetta puristettiin kyynärvartta vasten maksimaa-15 lisen iho/leikkausteräkosketuksen aikaansaamiseksi. Taulu kosta I ilmenevät tulokset mahdollistavat erojen havaitsemisen tekniikan tason tuote-erien ja uuden tuotteen erien välillä. Erot vaikuttivat samansuuntaisilta kuin vaihtelut glykosaminoglykuronaanin suhteellisissa koostumuksissa, 20 jotka johtuivat eristysmenetelmän vaihteluista.

Taulukko I

Käsittely, Vapaaehtoisten Anti-Xa-annos Anti-Xa-aktiivi- ΔΒΤ:n omaavien vapaaehtorSten 25 1 as k i morui ske lukumäärä U suuden keskiarvo naara, % >5 min >10 min >15 min

Hepariini 10 S 000 80 80 40

Tekniikan taso 6 1 600 10 U/mg 50 17 17 (US-patentti 4 438 108> 16 3 200 10 U/mg 44 31 7 2Q 13 eraa* 13 6 400 10 U/mg 85 62 56 Tämä keksintö 8 1 600 14,2 U/mg 13 0 0 64 3 200 14,2 U/mg 25 9 3 <6 eräa> 28 6 400 14,2 U/mg 36 25 8 35 101152 4

Taulukosta I ilmenevät kliiniset erot voidaan myös osoittaa farmakologisesti herkän ihonalaisen verenvuodon testin avulla. Verenvuoto mitataan määrittämällä hemoglo-biinikonsentraatio käyttämällä satunnaislohkomallia ja il-5 moittamalla tulokset hemoglobiinikonsentraation prosentu aalisena geometrisenä konsentraatiokeskiarvona yhdisteen annon jälkeen jaettuna hemoglobiinikonsentraation geometrisellä keskiarvolla vehikkelin annon jälkeen x 100. Hemo-globiinikonsentraatio on mitta verenhukalle, ja se määri-10 tettiin ruiskuttamalla rottien laskimoon 100, 200, 400 ja 800 U/kg yhdistettä. Tulokset on ilmaistu käyrän avulla, joka esittää tätä prosentuaalista osuutta annoksen funktiona. Tämän jälkeen voidaan laskea käyrän alapuolella oleva pinta-ala (AUC). AUC-arvot ilmenevät taulukosta II 15 hepariinille USP (vertailu), tekniikan tason viidelle erälle (A - E) ja uuden tuotteen neljälle erälle (I - IV) (ks. esimerkit).

Taulukko II

20 Erä AUC x 103 Keskiarvo

Hepariini USP - >210

Tekniikan taso A 252 (US-patentti B 131 9[. 4 438 108) C 196 205 D 256 E 189 Tämä keksintö I 125 II 91 30 III 151 IV 166 133

Voimakkaasti pienentyneen verenvuotoriskin ansiosta 35 uusi tuote sopii erinomaisen hyvin laskimotromboosin, tromboembolian ja syvälaskimotromboosin ennaltaehkäisyyn 101152 5 ja hoitoon. Tuotteella on lisäksi antiallerginen, antian-flammatorinen ja antiateroskleroottinen vaikutus.

Kuten edellä on mainittu, uusi tuote voidaan saada keksinnön mukaisesti autolysoimalla ja proteolysoimalla 5 (esim. sian haimasta saatavilla entsyymeillä tai baktee- rientyymeillä, kuten Bacillus substiliksesta saatavilla proteaaseilla) nisäkäskudoksia, kuten keuhkoja, haimaa, maksaa tai suolia. Erityisen käyttökelpoisia ovat porsaan suolenlimakalvot, joita käsitellään proteolyysin jälkeen 10 ioninvaihtimella, minkä jälkeen ioninvaihdin eluoidaan suolan vesiliuoksilla, jotka ovat edullisesti natriumklo-ridiliuoksia. Tuotteen erottamiseksi alustavasti hepa-riinista eluaatti diasuodatetaan suolan vesiliuoksia vastaan laitteessa, jossa suhteellisen moolimassan nimellis-15 rajana on 10 000 ja edullisesti noin 5 500 daltonia, minkä jälkeen saatu tuote sidotaan ioninvaihtimeen, ioninvaihdin eluoidaan suolan vesiliuoksilla ja seostetaan orgaanisilla liuottimilla, tavallisesti veteen sekoittuvilla liuottimilla, kuten alkoholeilla ja edullisesti metanolilla, ja 20 puhdistetaan tarvittaessa edelleen poistamalla nukleiini hapot esim. valkaisemalla, natriumhydroksidikäsittelyllä, RNaasikäsittelyllä, mangaanidikloridikäsittelyllä ja/tai saostamalla, minkä jälkeen käsitellään kaliumpermanganaatti-liuoksella. Saostus suoritetaan edullisesti fraktioi-25 vasti lisäämällä asteittain metanolin pitoisuutta vedessä.

Uusi tuote, vaikkakaan se ei sisällä hepariinia tai hepariinifraktioita, voidaan työstää farmaseuttiseen an-nostusmuotoon samalla tavoin kuin on tapana työstää hepa-riini esim. liuottamalla steriiliin veteen, johon on tar-30 peen mukaan lisätty muita farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuaineita.

Tuotetta käytetään kliinisesti ruiskeena tai in-fuusiona ihon alle tai laskimoon. Muutkin antotavat ovat mahdollisia, kuten anto keuhkoihin hengitettävän suihkeen 35 välityksellä tai anto peräpuikkojen muodossa.

6 101162

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki I

Ensimmäisen erän valmistus 1. Epäpuhtaan tuotteen eristäminen 5 Stabiloitua limakalvoa pilkottiin proteolyyttisen entsyymin avulla kohotetussa lämpötilassa ja alkalisessa pH-arvossa. Pilkottua seosta käsiteltiin 12 - 16 tuntia anioninvaihtimella, johon aktiiviaine sitoutuu. Ioninvaih-din ja siihen sidottu aktiiviaine eluoitiin vesijohtove-10 teen valmistetulla NaCl-liuoksella.

Eluaatti konsentroitiin noin kymmenkertaisesti ja diasuodatettiin viittä tilavuusosaa vastaan NaClrn vesi-johtovesiliuosta (n. 2 %) ultrasuodatuslaitteessa, joka oli varustettu membraaneilla, joiden suhteellisen mooli-15 massan nimellinen painoraja oli noin 5 500 daltonia.

Tämä permeaatti ja diafiltraatti sisälsivät lopullisen tuotteen, ja ne muodostavat eristysmenettelyssä käytettävän lähtöaineen.

Permeaatti ja diafiltraatti sekoitettiin, ja seos 20 laimennettiin tämän jälkeen vesijohtovedellä tuotteen uudelleenadsorboimiseksi ioninvaihtimeen. Ioninvaihdin ja siihen sitoutunut aktiiviaine pestiin vesijohtovedellä. Ioninvaihdin eluotiin ll-%:isella NaCl-liuoksella.

Haluttu tuote saatiin fraktiosaostamalla metanolil-25 la, ja se saostui metanolipitoisuuden olleesa 60 - 75 %.

Pesty jäännös kuivattiin vakuumissa ja lämpötilassa 40 ± 5 °C.

Nukleiinihapot poistettiin valkaisemalla epäpuhdas tuote, minkä jälkeen fraktiosaostettiin metanolipitoisuu-30 den ollessa 60 - 75 %.

2. KMnO;-puhdistus

Saatu, osaksi puhdistettu tuote liuotettiin tislattuun veteen. Saatu vesiliuos kuumennettiin nopeasti 60 °C:seen ja pH säädettiin arvoon 9,5. Kuumaan liuokseen 35 lisättiin natriumpermanganaattiliuos (40 p/t-%), ja sitten liuosta pidettiin tunti 60 °C:ssa. Tämän jälkeen liuos 7 1011b2 jäähdytettiin 20 °C:seen. Muodostunut mangaanidioksidi poistettiin suodattamalla steriloidun suodattimen läpi, ja suodoksen pH säädettiin arvoon 6,0. Tuote saostettiin 2-%:isella (p/p) NaCl-liuoksella ja peräkkäin 75-%:isella 5 ja 90-%:isella metanolilla.

Materiaalia säilytettiin tiiviisti suljetuissa alumiini säiliöissä .

Spesifikaatio: keskimääräinen molekyylipaino 5 270 10 typpeä 2,6 % rikkiä 8,3 % natriumia 9,8 % dermataanisulfaattia 11,6 % kondroitiinisulfaattia 4,6 % 15 anti-Xa-aktiivisuus U/mg 16,7 antitrombiiniaktiivisuus U/mg 0,13

Esimerkki II

Porsaan suolen limakalvoa käsiteltiin porsaan hai-20 masta saaduilla proteolyyttisillä entsyymeillä. Viiden toista tunnin kuluttua pH:ssa 8,5 liuos suodatettiin ja saatettiin kosketukseen voimakkaasti alkalisen ioninvaih-timen kanssa 15 tunniksi. Sitten ioninvaihdin erotettiin nesteestä, ja absorboituneet glykosaminoglykaanit eluoi-25 tiin natriumkloridin vesiliuoksella (200 g(l).

Eluaatti konsentroitiin ja diasuodatettiin ultra-suodatussuodattimen läpi, jonka nimellinen molekyylipaino-raja oli 5 500 daltonia.

Permeaatti-diafiltraattifraktiot yhdistettiin, ja 30 epäpuhtaiden glykosaminoglykaanien seos adsorboitiin ' uudelleen voimakkaasti emäksiseen ioninvaihtimeen. Hartsin pesemisen jälkeen glykosaminoglykaanit eluoitiin ll-%:isella natriumkloridiliuoksella, ja epäpuhdas tuote saatiin fraktiosaostamalla metanolilla, jonka pitoisuus 35 oli 50 % ja 75 %. Puhdistettiin edelleen toistamalla frak- tiosaostus metanolilla, jonka jälkeen hapetettiin 101152 8 l-%:isella vetyperoksidilla pH:ssa 10 ja saostettiin 75-%:isella metanolilla.

Esimerkki III

Porsaan suolen limakalvoa pilkottiin Bacillus sub-5 tiliksesta saaduilla proteolyyttisillä entsyymeillä 35 °C:ssa ja pH:ssa 8,2 24 tuntia. Suodattamisen jälkeen saatiin epäpuhdas jauhe adsorboimalla emäksiseen ionin-vaihtimeen, eluoimalla natriumkloridin 20-%:isella vesi-liuoksella ja f raktiosaostamalla 50 - 75 %:isella me- 10 tanolilla.

Aine liuotettiin uudelleen veteen, jossa oli 2 % natriumkloridia, ultrasuodatettiin ja diasuodatettiin suodattimen läpi, jonka nimellinen molekyylipainoraja oli 5 500 daltonia. Permeaatti ja diafiltraatti yhdistettiin, 15 ja glykosaminoglykaanit adsorboitiin anioninvaihtimeen.

Pesemisen jälkeen hartsi eluotiin ll-%:isella natriumklo-ridiliuoksella. Glykosaminoglykaanifraktio saostettiin tästä eluaatista 75-%:isella metanolilla ja jatkotyöstet- tiin esimerkissä I kuvatulla tavalla.

20 Esimerkki IV

Samalla tavoin kuin esimerkissä I valmistettiin erät II - VI eri lähteistä saadusta porsaan suolen limakalvosta .

Spesifikaatio Erä

II III IV V VI

Kesk im.molekyylipaino 5 610 4 940 6 100 5 130 5 320

Typpeä 2,6% 2,6% 2,6% 2,6% 2,6% |

Rikkiä 8,4 % 8,0 % 8,2 % 8,4 % 8,4 % 3Q Natriumia 9,8 % 9,5 % 9,9 % 9,9 % 9,8 %

Dermataanisulfaattia 10,3 % 8,4 % 11,2 % 11,1 % 10,3 % . Kondroitiinisulfaattia 7,0 % 6,8 % 4,7 % 6,6 % 3,5 %

Anti-Xa-aktiivisuus U/mg 16,2 14,0 16,4 15,1 16,1

Antrombiiniaktiivisuus U/mg <0,1 0,1 0,2 0,2 0,3

Claims (2)

101152

1. Menetelmä sulfatoidun, antitromboottisesti vaikuttavan glykosaminoglykuronaanin valmistamiseksi, joka 5 olennaisesti muodostuu dermataanisulfaatin, kondroitiini- sulfaatin ja heparaanisulfaatin suoloista ja jonka a) keskimääräinen molekyylipaino on 4 000 - 8 000 daltonia, b) typpipitoisuus on 2,4 - 3,0 %, 10 c) rikkipitoisuus on 7,5 - 9,5 %, d) natriumpitoisuus on 9 - 11 %, e) dermataanisulfaattipitoisuus on 5 - 25 %, f) kondroitiinisulfaattipitoisuus on alle 9 %, g) anti-Xa-aktiivisuus on 11 - 20 U/mg ja 15 h) antitrombiini III:sta riippuva antitrombiiniak- tiivisuus on alle 1 U/mg, tunnettu siitä, että nisäkäskudosta autolysoidaan tai annetaan proteolyyttisten entsyymien vaikuttaa siihen, minkä jälkeen kudosta käsitellään ioninvaihtimella, jota eluoidaan suolan vesiliuok-20 silla, eluaatti diasuodatetaan sitten suolan vesiliuoksia vastaan, saatu tuote sidotaan tämän jälkeen ioninvaihti-meen, eluoidaan suolan vesiliuoksilla ja saostetaan orgaanisilla liuottimilla ja puhdistetaan tarvittaessa edelleen poistamalla nukleiinihapot, minkä jälkeen se mahdol-25 lisesti käsitellään kaliumpermanganaattiliuoksella.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että porsaan suolen limakalvoa pilkotaan proteolyyttisillä entsyymeillä, suolan vesiliuokset ovat natriumkloridiliuoksia, diasuodatus suoritetaan laittees- 30 sa, jossa suhteellisen moolimassan nimellisraja on noin 5 500 daltonia, ja saostus suoritetaan lisäämällä asteittain metanolin pitoisuutta vedessä. 101152