KR100786174B1 - 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 식품 조성물 및 이의 추출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돈족유래 추출물을 포함하는 생리활성 조성물에 관한 것이고, 더 상세하게는 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하고, 면역조절, 유즙분비 촉진, 항혈전 작용이 있는 생리활성 조성물, 건강보조 식품 및 의약품과, 그 추출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 사용하여, 임산부, 면역력이 약화된 노약자 및 혈전에 의한 혈액순환 장애가 우려되는 일반성인에게 유익한 효과가 있는 건강보조 식품, 건강보조 음료 또는 의약품의 제공이 가능하다.
돈족유래 추출물, 글리코스아미노글리칸, 면역조절, 유즙분비 촉진, 항혈전 작용
Description
도 1은 SAX 칼럼으로부터 글리코스아미노글리칸의 용출을 나타낸다.
도 2는 1% 아가로스 겔 상에서 글리코스아미노글리칸의 동정을 나타낸다.
도 3은 출산경과에 따른 혈중 프로락틴의 수치변화를 나타낸다.
도 4는 돈족유래 추출물을 투여한 경우의 혈중 프로락틴의 수치변화를 나타낸다.
도 5는 대조군의 유선조직의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 6은 돈족유래 추출물을 돈족식이의 형태로 투여한 경우의 유선조직의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 7은 돈족유래 추출물을 돈족탕 식이의 형태로 투여한 경우의 유선조직의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 8은 돈족 및 돈족탕의 급이에 의한 면역기능의 상승효과를 나타낸다.
도 9는 돈족 및 돈족탕의 급이에 의한 T세포로부터 IL-2분비 증가 효과를 나타낸다.
도 10은 돈족유래 글리코스아미노글리칸 성분의 대식세포 활성화 조절효과 를 나타낸다.
도 11은 돈족유래 글리코스아미노글리칸 성분의 비장세포 기능 조절효과를 나타낸다.
도 12는 돈족유래 글리코스아미노글리칸 성분의 항 혈전효과를 나타낸다.
도 13은 돈족유래 글리코스아미노글리칸 성분의 항 혈전효과에 있어서의 용량-반응곡선을 나타낸다.
본 발명은 돈족유래 추출물을 포함하는 생리활성 조성물, 건강보조 식품 및 의약품과 그 추출방법에 관한 것이고, 더 상세하게는, 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하고, 유즙분비 촉진, 항혈전에 유효한 생리활성 조성물, 건강보조 식품 및 의약품과 그 추출방법에 관한 것이다.
돈족은 동서양을 막론하고 오랜 기간 동안 사용되어온 식재료에 속하지만, 그 구성성분 중 생리활성이 있는 물질 및 생리활성에 대하여 알려진 바가 없었다.
글리코스아미노글리칸(GAG)은 연골 등의 결체조직에 풍부한 복합당류를 총칭하는 물질명으로 사용되고 있는데, 돈족 등 그 기원에 따라서 효능의 차이가 있거나, 같은 범주의 효능을 가진다고 하더라도 효력에 차이가 있는 경우가 빈번하다.
글리코스아미노글리칸은 수많은 당류가 결합되어 있는 형태로 존재하기 때문에, 그 기원에 따라 효과가 전혀 나타나지 않거나, 또는 같은 기원이라도 추출방법 에 따라 얻어지는 물질의 분자량, 입체 구조 등의 차이에 기인하여 생리활성에도 큰 차이를 보이는 것으로 알려져 있다. 예컨대, 서울대 천연물과학연구소 김영식 교수에 의하여 아프리카 거대 달팽이류(the African Giant Snail Achatina fulica)로부터 추출된 새로운 글리코스아미노글리칸은, 글리코스아미노글리칸류로서는 특이적으로 항종양작용이 있는 것으로 알려졌고, 또한 면역체계에 대한 작용, 항바이러스 특성, 분자간의 인식 등에 유효한 다른 종류의 글리코스아미노글리칸도 알려지고 있다. 이러한 특성은 글리코스아미노글리칸과 근접한 물질류에 속하는 헤파린, 글루코사민, 히아루론산 등의 경우에도 마찬가지이다. 따라서 글리코스아미노글리칸의 생리활성을 밝히는 것에 있어서는, 기원, 추출방법, 분석방법 등을 특정하는 것이 무엇보다도 중요한 것으로 판단된다.
돈족의 연골내에는 글리코스아미노글리칸이 다량 함유되어 있을 것으로 예측되기는 하지만, 돈족 유래의 글리코스아미노글리칸에 대하여는 생리활성이 알려진 바가 없고, 글리코스아미노글리칸을 포함하는, 추출물의 분리·정제방법이 확립된 바도 없으므로, 돈족 유래의 글리코스아미노글리칸의 생리활성을 구체적으로 확인하여 특정 기능을 가지는 식품 또는 의약품으로의 개발에 발판을 마련할 수 있는 근거가 없었다.
따라서 본 발명의 발명자들은 식재료로서 사용되어 왔고, 우리 주변에서 흔히 구할 수 있는 돈족유래의 추출물로부터 그 구체적인 생리활성과, 활성물질의 분리·정제 방법을 확립한다면, 유용하고도 안전한 기능성 건강보조 식음료품 또는 의약품을 경제적으로 제공할 수 있을 것으로 판단하고 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명은 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 생리활성 조성물을 제공한다.
본 발명은 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 면역기능 조절용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 제조되는 환자 및 병후회복자의 면역증강용 건강보조 식품, 건강보조 음료 또는 의약품을 제공한다.
본 발명은 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 유즙분비 촉진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 제조되는 수유부의 유즙분비 촉진용 건강보조 식품, 건강보조 음료 또는 의약품을 제공한다.
본 발명은 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 혈전 예방용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 식품 조성물을 이용하여 제조되는 혈전 예방용 건강보조 식품, 건강보조 음료 또는 의약품을 제공한다.
본 발명에서는 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 식품 조성물에 식품학적 또는 약제학적으로 허용가능한 첨가물을 부가하여 액상, 분말상, 캡슐 및 정제를 포함한 고상으로 하여 제조되는 건강보조 식품, 건강보조 음료 또는 의약품을 제공한다.
본 발명에서는 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 추출하는 하기의 방법을 제공한다:
1) 돈족의 연골을 균질화 하는 단계;
2) 균질화된 연골을 염기성 pH 조건하에서 프로테아제로 처리하여 단백질을 분해시키는 단계;
3) 단백질 분해종료후 원심분리, 세척하는 단계; 및
4) SAX 칼럼을 이용하여 3% 및 16% 염화나트륨 용출분획으로 GAG를 분리하는 단계.
본 발명에 따른 추출방법에 있어서, 상기 연골 균질화단계인 1)단계는 돈족으로부터 연골을 분리해내어 얇게 슬라이스한 후 균질화하는 단계로서, 균질화 방법에는 특별한 제한이 없고, 통상의 균질기(homogenizer)를 사용하여 수행할 수 있다.
상기 단백질분해 단계인 2)단계에서는, 우선 상기 1)단계에서 균질화된 연골을 염기성 pH, 바람직하게는 pH9~10으로 조정한다. pH의 조정은, 단백질 분해를 위해 사용되는 프로테아제의 적정 pH로 맞추기 위한 것으로, 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 소듐카보네이트를 첨가하여 조정할 수 있다. pH조정 후, 프로테아제를 첨가하여 단백질을 분해시키는데, 단백질의 분해처리는, 충분한 단백질 분해를 이루기위하여, 40~55℃에서 10~15시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.
상기 원심분리 및 세척단계인 3)단계에서는, 단백질 분해가 종료된 시료를 원심분리한 후 세척하는 단계이다. 이때, 원심분리하기 전에, 단백질 분해가 종료된 시료중의 프로테아제를 불활성화시키는 것이 바람직하며, 이를 위하여, 예를 들어 단백질 분해가 종료된 시료를 끓는 물에 20~40분간 담구어 놓는 방법을 이용할 수 있다. 원심분리는, 바람직하게는 4~5℃에서 35~50분간 1400~1600g에서 수행한다. 원심분리후, 세척은 메탄올, 물, 염화나트륨 등으로 수회 세척할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 물, 염화나트륨, 물의 순서로 세척한다.
상기 4)단계에서는, 순차적으로 3% 염화나트륨과 16% 염화나트륨을 이용하여 2단계로 용출시키는 것이 바람직하다. 용출분획은 동결건조한 후 보관할 수 있다. 용출분획중의 GAG의 존재는 아가로스겔상에서 통상의 방법으로 확인할 수 있다.
본 발명의 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 생리활성 조성물은 1~1000mg/kg을 하루 수회 투여하는 것이 바람직하고, 식품 유래의 생체물질인 점을 고려하여 가감할 수 있다. 본 발명의 추출물을 포함하는, 건강보조 식품 및 건강보조 음료는 일반적으로 식품으로서 사용되는 범위로 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
실험재료의 제조
A. 돈족탕 및 돈족 식이 제품
돈족탕 및 돈족 식이 제품은 일반적으로 식품으로서 판매되는 것이면 어느 것이나 좋으며, 본 실험에서도 시판되는 돈족식이 제품 및 돈족탕을 사용하였다.
B. 돈족유래 글리코스아미노글리칸
돈족으로부터 연골을 얇게 자르고 균질화한 후, 이 균질화 된 시료에 0.05M 탄산나트륨을 첨가하여 pH 9.0으로 맞추고, 프로테아제를 첨가하여 50℃로 하여 단백질을 분해한다. 12시간 후 단백질 분해효소를 불활성화하기 위하여 끓는 물에 30분간 넣고, -4℃에서 45분간 1500g으로 원심 분리한다. 원심분리한 상층액을 메탄올, 2M의 염화나트륨 용액으로 세척한 삭스 도벡스 마이크로포러스(SAX Dowex macroporous) 수지에 올리고, 차례로 3중량%의 염화나트륨 및 16중량%의 염화나트륨으로 세척한 MWCO 1000을 이용하여 DW로 4℃에서 하룻밤 방치한 후, 동결 건조한다. 이 방법을 통해 3% 염화나트륨 용출분획으로부터 342mg, 16% 염화나트륨 용출분획으로부터 20mg의 글리코스아미노글리칸을 분리하였다(도 1).
상기의 방법으로 분리한 글리코스아미노글리칸을 아가로스 겔상에서 확인하기 위하여, 1% 아가로스 겔을 이용하여 75V에서, 40분간 흘려주고 아주레 A(Azure A)를 이용하여 염색하였다(도 2).
상기에서 얻어진 분획을 이용하여 각종 생리활성의 테스트를 행하였다.
실험동물
ICR 마우스를 3일 예비 사육하여 환경에 적응시킨 후, 실험에 사용하였다. 사 육실 온도는 섭씨 24±2℃로 유지하였고, 명암주기는 12시간(7:00 - 19:00)으로 조정하였다. 조제된 돈족의 추출물 및/또는 글리코스아미노글리칸 분획은 사료에 배합하여 무제한 자유 식이를 시켰다.
실시예 1
돈족유래 추출물에 의한 유즙분비 촉진효과 확인
예비실험
상기 실험동물의 조건에 만족하는 마우스 중에서 임신한 12주령의 정상식이를 제공한 ICR 마우스 12마리에 대하여, 출산 전후의 프로락틴의 농도변화를 확인하기 위한 예비실험을 실시하였다.
그 결과, 출산전 혈중 프로락틴의 수치는 0.6±0.1ng/ml이었으나, 출산 후 1일 째에서 증가하여 3일째에는 가장 높은 수치인 1.4±0.2ng/ml로 상승한 뒤, 출산 후 4일 째에는 오히려 감소되는 것을 알 수 있었다(도 3).
이러한 실험 결과로 볼때 임신 마우스의 출산 전후의 프로락틴의 수치는 출산 후 3일째에 가장 높았음이 확인되었으므로, 이후의 실험은 출산 후 3일째의 수치를 기준으로 정하였다.
본실험
상기 실험동물의 조건에 만족하는 마우스 중에서 임신한 12주령의 ICR 마우스를 네 마리씩 세 그룹으로 나누어 각각, 대조군, 돈족 식이 투여군, 돈족탕 투여군으로 하였다.
대조군은 정상 사료식이만을, 돈족 식이 투여군 및 돈족탕 투여군은 각각 돈 족 5% 또는 돈족탕 5%를 사료에 섞어 무제한 식이를 시켰다. 물은 무제한으로 공급받을 수 있도록 하였다. 3일간의 정해진 사료식이가 완료된 후, 실험 동물을 케타민(20mg/kg, 복강주사)으로 마취하여 개복한 후, 복대정맥에 23게이지 주사기를 이용하여 1~2ml의 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 1시간 동안 실온에서 방치한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리 하고, 그 상층액을 취하여 프로락틴 값을 측정하였다.
마우스의 혈중에 존재하는 프로락틴의 값은, hPRL 항체가 피복된 튜브에 항원(프로락틴)을 반응시킨 후 표지항체(125I PRL)를 결합시켜, 결합된 125I 농도를 감마카운터(Packard, USA)를 이용하여 측정하는, RIA법(Radio immuno assay)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 대조군 그룹의 혈중 프로락틴 수치는 1.4±0.1ng/ml 이었으나, 돈족 식이 그룹은 2.3±0.2ng/ml, 돈족탕 그룹은 2.4±0.2ng/ml으로 나타났다(도 4). 따라서 돈족 그룹과 돈족탕 그룹의 혈중 프로락틴 수치는 대조군에 비해 유의성있게 증가되었음을 알 수 있었다. 돈족 그룹과 돈족탕 그룹간의 혈중 프로락틴 수치에는 통계학적으로 유의할 만한 차이는 없는 것으로 나타났다(도 4).
또한 각각의 투여군 각 1마리로부터 유선 조직을 채취하여 H&E 염색을 한 후 전자현미경으로 관찰하여, 대조군과 비교하여 돈족유래 추출물에 의한 임신 마우스에 대한 유선조직의 변화를 확인하였다. 그 결과 대조군에 비하여 돈족 그룹과 돈족탕 그룹은 모두 유방실질조직의 크기와 분비물의 생성이 증가되었음을 알 수 있 었고, 특히 돈족탕 그룹의 경우에는 더 현저한 효과가 나타난 것을 확인할 수 있었다(도 5, 도 6, 도 7).
실시예 2
면역조절 효과 확인
돈족유래 추출물에 의한 면역기능 조절효과를 검토하기 위하여 각 12마리의 마우스에 대하여, 대조군, 돈족탕 투여군 및 글리코스아미노글리칸 분획 투여군으로 하여, 돈족탕 또는 글리코스아미노글리칸 분획을 마우스의 사료에 10%(w/w)의 농도로 섞어 7일간 급이시킨 후, 도살하고 비장을 적출하여 돈족유래 추출물이 면역세포 기능에 미치는 효과를 조사하였다.
이 실험에서는 음성대조군으로서 돼지의 후지육을 돈족탕과 동일한 조건으로 처리하여 만든 시료를 급이하였다. 그 결과 돈족탕을 급이한 마우스에 있어서, 비장세포의 증식이 높게 나타났으며(도 8-A), 또한 비장세포에 T세포와 B세포의 유사분열을 유도하는 ConA 혹은 LPS를 첨가(5 mg/ml)한 경우에 있어서도 돈족탕 투여군 및 글리코스아미노글리칸 분획 투여군의 마우스에서 T세포와 B세포의 증식이 증가하였다(도 8-B 및 8-C).
또한 ConA를 첨가하여 T세포의 활성화를 유도하는 실험조건에서 T세포로부터 분비되는 사이토카인 IL-2의 유도활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 돈족탕 및 글리코스아미노글리칸 분획을 투여한 마우스의 T세포가 ConA에 의한 IL-2분비유도를 현저히 상승시키는 것으로 나타났다(도 9)
한편, 돈족에 다량으로 함유되어 있는 글리코스아미노글리칸성분이 면역기능 에 어떠한 영향을 미치는가를 확인하기 위하여, 3% 및 16% NaCl의 조건에서 용출된 글리코스아미노글리칸(각각 Gag-3% 및 Gag-16%로 기재)을 대식세포(macrophage)와 비장세포에 첨가하여 이들 돈족유래 글리코스아미노글리칸 성분이 면역담당세포의 활성화에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 Gag-3%와 Gag-16%는 공히 정상대식세포의 증식을 활성화하는 경향을 나타내었다(도 10). 그러나 LPS자극을 통해 활성화를 유도하는(일종의 염증작용 유도 조건) 조건에서, Gag-3%는 대식세포의 활성화를 억제(약 24% 억제)하는 결과를 보였다(도 10). 한편 LPS의 자극에 의해 대식세포로부터 TNF-a의 분비를 유도하는 실험에 있어서도 Gag-3%에 의한 사이토카인 분비억제 효과가 확인되었다.
한편, 이들 글리코스아미노글리칸성분이 림프구의 기능에 어떠한 영향을 미치는 가를 조사하기 위하여 마우스 비장세포에 각각의 돈족 글리코스아미노글리칸 성분을 첨가하여 배양한 후, 도 6의 실험과 동일한 방법으로 림프구 활성에 대한 기능조절효과를 검토하였다. 그 결과 Gag-3%와 Gag-16%는 정상 림프구에 대해서는 별다른 영향을 주지 않으나, ConA나 LPS와 같은 유사분열 촉진인자에 의해 활성화된 림프구에 대해서는 억제적인 효과를 나타내었다(도 11).
이상의 결과를 종합해 보면, 돈족유래 추출물은 경구적으로 급이한 경우 면역세포를 활성화시키는 효과를 나타내지만, 돈족에서 추출한 글리코스아미노글리칸성분은 활성화된 면역세포에 대해 억제적으로도 작용하는 것으로 나타났고, 이는 돈족유래 추출물이 단순히 면역증강제로서 기능하는 것이 아니라, 생체조건에 따라 면역기능을 억제/증강시키므로써 면역조절기능을 가지는 이상적인 면역조절제로서 의 가능성을 보여주는 것으로 판단된다.
실시예 3
항혈전 작용의 확인
돈족유래 추출물의 항혈전응고 효과를 검토하기 위하여, 일반사료만을 급이한 대조군 마우스 및 각각 Gag-3%와 Gag-16%가 혼합된 사료로 사육한 실험군의 마우스를 동일조건에서 00일간 사육한 후, 케타민(20mg/kg, 복강주사)으로 마취하여 개복하고, 복대정맥에 23게이지 주사기를 이용하여 1~2ml의 혈액을 채취하였다. 각각의 혈액샘플에 대하여 프로트롬빈 시간, 트롬빈 시간, 및 부분적인 트롬보플라스틴 시간을 측정하였다.
그 결과, Gag-3%군은 대조군과 차이를 보이지 않았지만, Gag-16%군에서는 항혈전 효과가 관찰되었으며, 특히 이 효과는 용량의존성이 있는 것으로 밝혀졌다(도 12, 도 13).
본 발명에 따르면, 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 식품 조성물을 사용하여, 임산부, 면역력이 약화된 노약자 및 혈전에 의한 혈액순환 장애가 우려되는 일반성인에게 유익한 효과가 있는 건강보조 식품, 건강보조 음료 또는 의약품의 제공이 가능하다.
Claims (13)
- 삭제
- 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역기능 조절용 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 돈족유래의 글리코스아미노글리칸을 추출하는 방법:1) 돈족의 연골을 균질화하는 단계;2) 균질화된 연골을 염기성 pH 조건하에서 프로테아제로 처리하여 분해시키는 단계;3) 단백질 분해종료후 원심분리, 세척하는 단계; 및4) SAX 칼럼을 이용하여 3% 및 16% 염화나트륨 용출분획으로 글리코스아미노글리칸을 분리하는 단계.
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-
2005
- 2005-07-06 KR KR1020050060642A patent/KR100786174B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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