CN109007649A - 一种海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及促进骨健康复配物制备技术领域，提供了一种海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，包括采用酶解海参和牡蛎肉，得到海参牡蛎糖肽溶液并酶解得到的海参牡蛎糖肽溶液，然后利用牡蛎壳制备醋酸钙与海参牡蛎糖肽螯合得海参牡蛎糖肽钙络合物。本发明还提供一种海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，将海参牡蛎糖肽钙络合物与氨基葡萄糖、药食同源提取物以及促钙吸收剂复配得海参牡蛎糖肽钙络合复配物。借此，本发明所提供海参牡蛎糖肽钙络合复配物可以作为天然促骨健康的保健品改善中老年人或绝经妇女所易患的骨质疏松和骨关节炎症状。

Description

一种海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及促进骨健康复配物制备技术领域，尤其涉及一种海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法及其应用。
背景技术
骨关节炎和骨质疏松是一种常见于中老年人、绝经妇女和佝偻病患者中的慢性骨健康疾病。骨关节炎和骨质疏松会导致关节性疼痛肿胀、关节软骨破坏，骨脆性增加，最终易使患者丧失自由活动能力甚至引起死亡，已经被列为影响老年人的五大疾病之列。目前全世界至少有3亿多骨质疏松症患者，在全球常见病、多发病中排名已经上升到第6位。面对如此庞大的骨类疾病人群，现阶段的治疗方法却仍不完善，长期服用药物会增加高钙血症、乳腺癌、冠心病、胃肠溃疡等疾病患病几率，且在停药后具有反弹，甚至症状加重的风险。因此，研究具有促骨和骨关节健康的食源性成分，开发天然，安全、高效的食源性产品具有重要意义。
海参是重要的生物资源，包含海参胶原蛋白、海参硫酸多糖、海参皂苷等多种活性物质。海参多糖中的海参硫酸软骨素，不仅具有硫酸软骨素的亲骨性，可优先进入软骨组织，保护软骨，促进骨关节健康，还富含特殊的硫酸酯化岩藻糖支链结构，相比于普通硫酸软骨素具有更广泛的生物学活性。实验表明氨基葡萄糖联合硫酸软骨素对骨健康的促进作用更为显著。
牡蛎是我国营养价值极高的海洋贝类。牡蛎肉中的微量元素能促进骨细胞增殖，增强成骨细胞活性，加速新骨钙化，改善骨质疏松症状，是一种预防骨质疏松优良原料.。牡蛎壳含有80％～95％碳酸钙，是一种良好的天然钙源，在骨类疾病中常常使用牡蛎壳作为补钙原料。在牡蛎壳制备的补钙剂中，醋酸牡蛎钙具有补钙性能优越，价格低廉，吸收效果好无毒.副作用等显著优点，被广泛使用，是牡蛎钙活化的最佳方法之一。
目前，多篇专利公开的利用海参、牡蛎为原料制备骨和骨关节改善制剂的方法仅对海参牡蛎蛋白进行酶解，并未有效解决天然多糖分子量大、粘性高，在人体内消化吸收率较低的问题。而降解海参多糖得到的低分子量硫酸软骨素相比于大分子硫酸软骨素具有更好的生物利用率和治疗Ⅱ型胶原诱导的风湿性关节炎效果。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，包括采用酶解海参和牡蛎肉，得到海参牡蛎糖肽溶液并酶解得到的海参牡蛎糖肽溶液。利用牡蛎壳作为钙源制备醋酸钙与海参牡蛎糖肽络合得海参牡蛎糖肽钙络合物。本发明还提供一种海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，海参牡蛎糖肽钙络合物与氨基葡萄糖、药食同源提取物以及促钙吸收剂复配得海参牡蛎糖肽钙络合复配物。
为了实现上述目的，本发明提供一种海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将鲜海参洗净，去内脏，牡蛎壳肉分离洗净；然后将得到的海参体壁和牡蛎肉剪碎成小块，并置于95％乙醇中浸泡24h脱脂后室温下晾干；
步骤二：将所述步骤一脱脂后的海参碎肉和牡蛎碎肉按1:1～3混合，然后置于沸水中处理3～5min；所述海参碎肉与牡蛎碎肉混合物与沸水的质量体积比为1:10～20；然后在匀浆功率1500～3500r/min条件下均质5～10min，得到海参牡蛎肉均质液；
步骤三：在所述海参牡蛎肉均质液中加入蛋白酶进行酶解；所述蛋白酶的加入量为1500～2000U/g底物，酶解温度为55℃，酶解时间为3～6h；
酶解之后升温至100℃保持10min钝酶；然后4000r/min离心20min，取上清液并过滤去除不溶性成分，得到海参牡蛎糖肽溶液；
步骤四：向所述海参牡蛎糖肽溶液中加入1～6％的食品级H2O2，水浴加热至60℃，超声降解所述海参牡蛎糖肽溶液中大分子多糖；超声频率40HZ，超声功率为100W～400W，超声时间为1～6h；
反应完成后将pH值调至7.0，得解聚海参牡蛎糖肽溶液；
步骤五：将牡蛎壳粉与水按1:10～25混合并搅拌均匀，再加入冰醋酸搅拌反应2h；之后调节溶液pH值至8.0～14，继续搅拌反应30min后抽滤；然后将滤液回调至中性，得牡蛎醋酸钙溶液；所述牡蛎壳粉与冰醋酸的重量比为0.7～1.1：1；
步骤六：将所述牡蛎醋酸钙溶液与解聚海参牡蛎糖肽溶液按体积比2～1:1混合并调节混合液pH值至6-7，在35-45℃条件下搅拌40min后旋转蒸发浓缩；然后向浓缩液中加入10倍体积的无水乙醇沉淀，4℃下静置6h后抽滤取沉淀并冷冻干燥得海参牡蛎糖肽钙络合物。
根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，所述蛋白酶为风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或复合蛋白酶中的任意一种。
根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，所述牡蛎壳粉制备方法为：将牡蛎壳洗净，在电热干燥箱中80℃烘干6h，将烘干的牡蛎壳粉碎、过筛得牡蛎壳粉。
根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，所制备的海参牡蛎糖肽钙络合物。
一种根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，包括将所述海参牡蛎糖肽钙络合物与D-氨基葡萄糖硫酸盐、药食同源提取物按重量比100:15～30:20进行复配，得海参牡蛎糖肽络合复配物。
根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，所述药食同源提取物的制备方法为：将黄芪50-100份、淫羊藿54-100份、骨碎补30-55份以及怀牛膝48-90份，混合后加8～12倍60％乙醇回流提取，然后过滤浓缩，喷雾干燥，粉碎过60目筛制备而得。
根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，所述海参牡蛎糖肽络合复配物中还包括促钙吸收剂。
根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，所述促钙吸收剂为维生素D3、酪蛋白磷酸肽及Ⅱ型胶原蛋白中的一种或任意两种混合或者三种混合。
根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，以所述海参牡蛎糖肽钙络合物为基准，所述维生素D3、酪蛋白磷酸肽以及Ⅱ型胶原蛋白的加入量分别为0.0001-0.0008％、2％-10％、5％-20％。
根据本发明的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，所制备的海参牡蛎糖肽钙络合复配物。
本发明的目的在于提供一种海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法及其应用，通过采用酶解海参和牡蛎肉，得到海参牡蛎糖肽溶液，提高海参和牡蛎肉的生物利用率；保留海参牡蛎中的多肽和多糖成分，充分发挥其改善肝、肾、骨的生物学作用；酶解得到的海参牡蛎糖肽采用超声波辅助过氧化氢脱色脱腥，降解多糖，可以获得具有良好色泽，分子量小的海参、牡蛎糖肽溶液。得到的海参、牡蛎多糖结构不变且分子质量变小，具有良好的消化吸收性和生物学活性，同时与氨基葡萄糖一起可以促进体内硫酸软骨素的合成改善关节炎和骨质疏松等症状，促进骨质健康。利用牡蛎壳作为钙源，制备醋酸钙，来源为天然物质，安全性较强，同时还富含多种人体所需矿物质。其与海参牡蛎糖肽络合，提高了牡蛎钙的消化吸收率，对骨质疏松患者具有较好的补钙效果。制备的海参牡蛎糖肽络合物进一步与钙吸收促进剂和中国传统的保健药材进行复配，进一步保证了本发明物对骨质疏松患者的补钙作用及对骨健康的促进作用。本发明所提供海参牡蛎糖肽钙络合复配物可以作为天然促骨健康的保健品改善中老年人或绝经妇女所易患的骨质疏松和骨关节炎症状。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将鲜海参洗净，去内脏，牡蛎壳肉分离洗净；然后将得到的海参体壁和牡蛎肉剪碎成小块，并置于95％乙醇中浸泡24h脱脂后室温下晾干；
步骤二：将所述步骤一脱脂后的海参碎肉和牡蛎碎肉按1:1～3混合，然后置于沸水中处理3～5min；所述海参碎肉与牡蛎碎肉混合物与沸水的质量体积比为1:10～20；然后在匀浆功率1500～3500r/min条件下均质5～10min，得到海参牡蛎肉均质液；
步骤三：在所述海参牡蛎肉均质液中加入蛋白酶进行酶解；所述蛋白酶的加入量为1500～2000U/g底物，酶解温度为55℃，酶解时间为3～6h；
酶解之后升温至100℃保持10min钝酶；然后4000r/min离心20min，取上清液并过滤去除不溶性成分，得到海参牡蛎糖肽溶液；
本发明的所述蛋白酶为风味蛋白酶(pH 7.0)、木瓜蛋白酶(pH 7.0)、碱性蛋白酶(pH 8.5)、或复合蛋白酶(pH 7.0)中的任意一种。
步骤四：向所述海参牡蛎糖肽溶液中加入1～6％的食品级H2O2，水浴加热至60℃，超声降解所述海参牡蛎糖肽溶液中大分子多糖；超声频率40HZ，超声功率为100W～400W，超声时间为1～6h；
反应完成后用2mol/L的NaOH溶液将pH值调至7.0，得解聚海参牡蛎糖肽溶液；
步骤五：将牡蛎壳粉与水按重量比1:10～25混合并搅拌均匀，再加入冰醋酸搅拌反应2h；之后采用0.1mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值至8.0～14，继续搅拌反应30min后抽滤；然后用0.1mol/L的HCl溶液将滤液回调至中性，得牡蛎醋酸钙溶液；所述牡蛎壳粉与冰醋酸的重量比为0.7～1.1：1；
牡蛎壳粉制备方法为：将牡蛎壳洗净，在电热干燥箱中80℃烘干6h，将烘干的牡蛎壳粉碎、过筛得牡蛎壳粉。
步骤六：将所述牡蛎醋酸钙溶液与解聚海参牡蛎糖肽溶液按体积比2～1:1混合并调节混合液pH值至6-7，在35-45℃条件下搅拌40min后旋转蒸发浓缩；然后向浓缩液中加入10倍体积的无水乙醇沉淀，4℃下静置6h后抽滤取沉淀并冷冻干燥得到海参牡蛎糖肽钙络合物。
本发明还提供一种海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，包括如下步骤：
将按照前述步骤一到步骤六制得的海参牡蛎糖肽钙络合物与D-氨基葡萄糖硫酸盐、药食同源提取物按重量比100:15～30:20进行复配，得海参牡蛎糖肽络合复配物；
所述药食同源提取物的制备方法为：将黄芪50-100份、淫羊藿54-100份、骨碎补30-55份以及怀牛膝48-90份，混合后加8～12倍60％乙醇回流提取，然后过滤浓缩，喷雾干燥，粉碎过60目筛制备而得。
更好的，本发明的所述海参牡蛎糖肽络合复配物中还包括促钙吸收剂；
所述促钙吸收剂为：维生素D3，加入量为0.0001-0.0008％；酪蛋白磷酸肽，加入量为2％-10％；Ⅱ型胶原蛋白，加入量为5％-20％；各组分的加入量的百分比是以海参牡蛎糖肽钙络合物为基准计算得来。
作为促钙吸收剂，以上三种成分和加入量可单独使用。也可以任意两种混合，或三种一起做为促钙吸收剂使用。
为了更好的理解本发明，发明人按前述步骤一到步骤六的操作设置了若干海参牡蛎糖肽钙络合物的实施例，并分别测定了海参牡蛎肉酶解液的水解度以及海参牡蛎糖肽钙络合物的络合率。
水解度的测定：采用TCA法(海参肽的酶法制备工艺及抗疲劳活性研究)：TCA是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉淀蛋白质和肽段。随着反应的进行，蛋白质肽链被切成大小不等的片断，TCA溶解指数提高。可以被TCA沉淀的肽段所含的最少氨基酸残基数与底物的种类有关，就特定的底物而言，TCA溶解指数可以定性的反应蛋白的分解情况，溶解指数越高，表明较短肽段的含量越高。
测定方法：取5mL酶解液加入5mL10％的TCA，混合振荡，4000r/min离心20min。取上清液做适当稀释，总蛋白含量和上清液可溶性蛋白的含量分别用微量凯氏定氮法和福林酚法测定。
然后按公式DH％＝(N2-N1)/(N0-N1)计算得到；
式中，N0为海参/牡蛎总蛋白含量，N1为酶解反应前海参/牡蛎蛋白中的TCA可溶性蛋白，N2为酶解液中的TCA可溶性蛋白。
络合率的测定：
称取一定量的海参糖肽钙络合物样品，采用25mL蒸馏水溶解，得反应液。取一定体积反应液于消化瓶内，加入20mL硝酸高氯酸混合酸消化后按GB/T5009.92-2003食品中钙的测定中EDTA滴定法测钙含量记为m1。取相同体积反应液加入8倍体积无水乙醇8000r/min离心10min，静置20min后将沉淀溶于20mL混合酸，消化后测钙含量记为m2。然后按公式，(m2/m1)*100％计算络合率。
为了方便叙述，海参牡蛎糖肽钙络合物配制过程的相关步骤中变化的配比、参数以及测定结果见表1；而与前述步骤中重复的部分不在赘述。
采用如表一所示的海参牡蛎糖肽钙络合物各实施例，按照前述海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，还设置了若干海参牡蛎糖肽钙络合复配物的实施例，具体组成见表二；表二中药食同源提取物的组成配比见表三。
为了测定本发明的海参牡蛎糖肽钙络合物及海参牡蛎糖肽钙络合复配物的改善骨健康的效果，发明人还做了如下实验。
一、实验目的
研究表明，对SD大鼠进行卵巢切除+弱驱赶，可以成功建立起骨质疏松兼骨关节炎模型。用此模型来测定本发明对骨质疏松和骨关节炎的改善作用。
骨质疏松症诊断一般以骨量减少、骨密度下降等为依据。骨密度和骨矿物质含量被认为是目前评估骨骼强度最直接的指标。骨质疏松症患者其骨密度会下降，且血清中的钙和磷含量也会发生下降。血清碱性磷酸酶是一个由成骨细胞分泌的非溶胶蛋白，它对于骨矿化必不可少，可较好的反映出成骨细胞的活性和状态。骨质快速流失过程中血清磷酸酶的水平也会明显升高。所以本发明通过对血清钙、磷、碱性磷酸酶和骨密度的检测，可以间接反映发生骨质疏松的程度，来判断海参牡蛎糖肽钙络合物是否具有改善骨质疏松的功效。
在骨关节炎的起始阶段常会伴随滑膜炎症，在滑膜炎症病灶处，有大量巨噬细胞浸润并受TLR4信号而激活，释放细胞因子如TNF-α、IL-1β等。软骨细胞在关节受损和TNF-α、IL-1β诱导的双重作用下，会促进MMP-3的表达，进一步导致软骨组织受损、细胞外基质降解，导致更多产物产生。所以在发生骨关节炎时，TNF-α、IL-1β和MMP-3都会发生相应的变化，可以作为测定骨关节炎的相关指标。在OA疾病中，MMP-3就高达于软骨组织中，并且与关节软骨退变程度呈正相关。所以发明通过TNF-α、IL-1β和MMP-3水平来反应骨关节炎的程度，来判断本发明的海参牡蛎糖肽钙络合物及海参牡蛎糖肽钙络合复配物是否具有改善骨关节炎的功效。
二、实验材料
实验所用海参牡蛎糖肽钙络合物及海参牡蛎糖肽钙络合复配物为表一、表二所示的各实施例，下面以实施例1为例叙述实验过程及效果。
实验动物采用清洁级6月龄的Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，体重(305±39g)，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。
主要试剂：血清碱性磷酸酶试剂盒，血清IL-1β试剂盒，血清TNF-α试剂盒和血清MMP-3试剂盒(购买自南京建成)，XR-36型双能X线骨密度仪(美国Nodand公司产品)，7170A型全自动生化分析仪。
三、实验方法
3.1骨质疏松兼骨关节炎模型的建立
用戊巴比妥钠对48只SD大鼠做腹腔注射麻醉。其中40只大鼠切除双侧卵巢，8只SD大鼠切除双侧卵巢旁各一块脂肪组织作对照组(假手术组)。术后大鼠置于检疫箱中观察一天，后移至20℃恒温动物房中。切除手术3天后，所有老鼠每天进行30min的跑轮运动，6周后将去卵巢SD大鼠随机分成四组，按复配高剂量组(0.4g/Kg)，高剂量组(0.4g/Kg)、中剂量组(0.2g/Kg)、低剂量组(0.1g/Kg)和模型组(等量生理盐水)进行灌胃给药，假手术组作为对照组(等量生理盐水)灌胃给药，每日一次，连续90天。之后测定小鼠血清中钙、磷、TNF-α、IL-6和MMP-3水平，处死小鼠，取小鼠腰椎和股骨，测定骨密度。
3.2饲养方式
每组8只SD大鼠，分为两只鼠笼饲养，8组实验同时进行，根据表四设计分别灌胃不同药剂，正常给水。
3.3给药方式
每天观察大鼠进食、饮水、活动情况等并记录，每周称体重1次，根据体重变化调整药量。
3.4指标测定
实验结束后，用3％戊巴比妥钠(1.5ml/kg)进行腹腔注射麻醉后右心室彻底抽血处死。将血液进行3500r/min离心，分离血清，测定血清中的钙，磷、碱性磷酸酶、IL-1β、TNF-α和MMP-3含量，取出大鼠左后肢股骨，剔除附着的肌肉和结缔组织后测定股骨湿重，然后在用XR-36型双能X线骨密度仪测定离体左后肢股骨骨密度和腰椎骨密度。
四、结果分析及结论
4.1实验结果与分析
不同处理组SD大鼠股骨重量及骨密度变化见表五，各组大鼠血清各指标水平见表六，各组大鼠血清炎症因子的表达见表七。
实验前，模型组的腰椎和股骨骨密度、磷和钙水平均显著低于对照组，而碱性磷酸酶的水平显著增加，同时血清中的TNF-α、IL-6和MMP-3的水平显著增加，说明切除卵巢得到的骨质疏松及骨关节炎模型建立成功。实验后给小鼠灌胃不同剂量海参牡蛎糖肽钙络合物及海参牡蛎糖肽络合复配物，各剂量组小鼠的股骨重量、股骨密度和磷水平显著上升(p<0.05)，碱性磷酸酶水平显著下降(p<0.05)，而且成剂量依赖效应；各剂量组中血清TNF-α、IL-6和MMP-3的水平显著下降(p<0.05)，钙、磷含量显著上升(p<0.05)，且成剂量依赖效应，且复配高剂量组的改善效果都更优于高剂量组。
4.2实验结论
200mg/kg b.w.剂量的海参牡蛎糖肽钙络合物，能够有效增加骨质疏松小鼠的腰椎和股骨骨密度，增加血液中磷和钙的含量，并降低其碱性磷酸酶的水平。将海参牡蛎糖肽络合物与促钙吸收剂和中药成分复配得到的海参牡蛎糖肽络合复配物其改善效果进一步加强，优于海参牡蛎糖肽钙络合物。所以服用本发明所述的海参牡蛎糖肽钙络合复配物对骨质疏松症状具有一定的辅助疗效。同时海参牡蛎糖肽络合复配物能显著降低血清中的炎症因子TNF-α、IL-6水平，减轻软骨基质破坏，抑制MMP-3在软骨细胞中的表达，说明海参牡蛎糖肽络合复配物具有改善关节炎，促进关节健康的作用。
以上是采用以实施例1的海参牡蛎糖肽钙络合物及海参牡蛎糖肽钙络合复配物进行的实验结果，采用其他实施例也可以得到相同的效果，在此不再赘述。
表一：各海参牡蛎糖肽钙络合物实施例的配比、参数以及测定结果
注1：表一中步骤二，碎肉比例为海参碎肉与牡蛎碎肉的比例；处理时间为碎肉在沸水中的处理时间；
注2：表一中步骤五，加水比例为牡蛎壳粉与水的比例，加冰醋酸比例为牡蛎壳粉与冰醋酸的比例；
注3：表一中水解度为海参牡蛎肉酶解液的水解度；络合率为海参牡蛎糖肽钙络合物的络合率；
注4：表一中a为风味蛋白酶、b为木瓜蛋白酶、c为碱性蛋白酶、d为复合蛋白酶、e为复合蛋白酶；
表二：各海参牡蛎糖肽钙络合复配物实施例的配比
注：表二中所有配比均为质量比
表三：各海参牡蛎糖肽钙络合复配物实施例中的药食同源提取物配比
注：表三中所有配比均为质量比
表四实验动物分组和给药剂量
组别 灌胃药物 剂量(mg/kgb.w.)
对照组 等量生理盐水 ——
模型组 等量生理盐水 ——
低剂量组 海参牡蛎糖肽钙络合物 50
中剂量组 海参牡蛎糖肽钙络合物 100
高剂量组 海参牡蛎糖肽钙络合物 200
复配高剂量组 海参牡蛎糖肽钙络合复配物 200
表五：各组大鼠离体股骨骨密度的比较
组别 n 腰椎骨密度g/cm2 股骨骨密度g/cm2
对照组 8 0.1252±0.0210 0.1277±0.0100
模型组 8 0.0975±0.0450* 0.1121±0.0074*
低剂量组 8 0.1106±0.0130# 0.1211±0.0064#
中剂量组 8 0.1205±0.0076# 0.1246±0.0076#
高剂量组 8 0.1243±0.0078# 0.1266±0.0015#
复配高剂量组 8 0.1321±0.0152# 0.1342±0.0052#
表六：各组大鼠血清各指标水平
组别 n 钙mmol 磷mmol 碱性磷酸酶U/L
对照组 8 2.81±0.02 3.3±0.3 308±36.86
模型组 8 2.73±0.08** 2.26±0.18** 517.4±58.97**
低剂量组 8 2.75±0.04** 2.30±0.15** 480±34.26#
中剂量组 8 2.79±0.05** 2.56±0.10# 412±33.56#
高剂量组 8 2.80±0.06** 3.0±0.12## 373±50.68##
复配高剂量组 8 2.85±0.07** 3.2±0.09## 351±43.22##
表七：各组大鼠血清炎症因子的表达
组别 N TNF-α(pg/mL) MMP-3(pg/mL) IL-1β(pg/mL)
对照组 8 22.86±3.85 71.86±3.23 67.58±3.88
模型组 8 47.59±4.56* 93.48±2.68* 108.7±10.25*
低剂量组 8 27.25±3.46# 78.98±3.51# 97.20±8.05
中剂量组 8 26.05±2.30# 78.72±2.98# 74.98±7.54#
高剂量组 8 26.06±2.64# 77.49±2.89# 65.86±5.25##
复配高剂量组 8 25.48±2.54# 75.46±2.76# 62.65±4.56##
注：表五、表六、表七中，数值以平均值±标准差的形式表示；*代表与对照组有显著性差异，p<0.05；#代表与模型组有显著性差异，p<0.05。
综上所述，本发明的目的在于提供一种海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法及其应用，通过采用酶解海参和牡蛎肉，得到海参牡蛎糖肽溶液，提高海参和牡蛎肉的生物利用率；保留海参牡蛎中的多肽和多糖成分，充分发挥其改善肝、肾、骨的生物学作用；酶解得到的海参牡蛎糖肽采用超声波辅助过氧化氢脱色脱腥，降解多糖，可以获得具有良好色泽，分子量小的海参、牡蛎糖肽溶液。得到的海参、牡蛎多糖结构不变且分子质量变小，具有良好的消化吸收性和生物学活性，同时与氨基葡萄糖一起可以促进体内硫酸软骨素的合成改善关节炎和骨质疏松等症状，促进骨质健康。利用牡蛎壳作为钙源，制备醋酸钙，来源为天然物质，安全性较强，同时还富含多种人体所需矿物质。其与海参牡蛎糖肽络合，提高了牡蛎钙的消化吸收率，对骨质疏松患者具有较好的补钙效果。制备的海参牡蛎糖肽络合物进一步与钙吸收促进剂和中国传统的保健药材进行复配，进一步保证了本发明物对骨质疏松患者的补钙作用及对骨健康的促进作用。本发明所提供海参牡蛎糖肽钙络合复配物可以作为天然促骨健康的保健品改善中老年人或绝经妇女所易患的骨质疏松和骨关节炎症状。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将鲜海参洗净，去内脏，牡蛎壳肉分离洗净；然后将得到的海参体壁和牡蛎肉剪碎成小块，并置于95％乙醇中浸泡24h脱脂后室温下晾干；
步骤二：将所述步骤一脱脂后的海参碎肉和牡蛎碎肉按1:1～3混合，然后置于沸水中处理3～5min；所述海参碎肉与牡蛎碎肉混合物与沸水的质量体积比为1:10～20；然后在匀浆功率1500～3500r/min条件下均质5～10min，得到海参牡蛎肉均质液；
步骤三：在所述海参牡蛎肉均质液中加入蛋白酶进行酶解；所述蛋白酶的加入量为1500～2000U/g底物，酶解温度为55℃，酶解时间为3～6h；
酶解之后升温至100℃保持10min钝酶；然后4000r/min离心20min，取上清液并过滤去除不溶性成分，得到海参牡蛎糖肽溶液；
步骤四：向所述海参牡蛎糖肽溶液中加入1～6％的食品级H2O2，水浴加热至60℃，超声降解所述海参牡蛎糖肽溶液中大分子多糖；超声频率40HZ，超声功率为100W～400W，超声时间为1～6h；
反应完成后将pH值调至7.0，得解聚海参牡蛎糖肽溶液；
步骤五：将牡蛎壳粉与水按1:10～25混合并搅拌均匀，再加入冰醋酸搅拌反应2h；之后调节溶液pH值至8.0～14，继续搅拌反应30min后抽滤；然后将滤液回调至中性，得牡蛎醋酸钙溶液；所述牡蛎壳粉与冰醋酸的重量比为0.7～1.1：1；
步骤六：将所述牡蛎醋酸钙溶液与解聚海参牡蛎糖肽溶液按体积比2～1:1混合并调节混合液pH值至6-7，在35-45℃条件下搅拌40min后旋转蒸发浓缩；然后向浓缩液中加入10倍体积的无水乙醇沉淀，4℃下静置6h后抽滤取沉淀并冷冻干燥得海参牡蛎糖肽钙络合物。
2.根据权利要求1所述的海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或复合蛋白酶中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，其特征在于，所述牡蛎壳粉制备方法为：将牡蛎壳洗净，在电热干燥箱中80℃烘干6h，将烘干的牡蛎壳粉碎、过筛得牡蛎壳粉。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法，所制备的海参牡蛎糖肽钙络合物。
5.一种利用权利要求4所述的海参牡蛎糖肽钙络合物的制备方法得到的海参牡蛎糖肽钙络合物的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，其特征在于，将所述海参牡蛎糖肽钙络合物与D-氨基葡萄糖硫酸盐、药食同源提取物按重量比100:15～30:20进行复配，得海参牡蛎糖肽络合复配物。
6.根据权利要求5所述的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，其特征在于，所述药食同源提取物的制备方法为：将黄芪50-100份、淫羊藿54-100份、骨碎补30-55份以及怀牛膝48-90份，混合后加8～12倍60％乙醇回流提取，然后过滤浓缩，喷雾干燥，粉碎过60目筛制备而得。
7.根据权利要求5所述的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，其特征在于，所述海参牡蛎糖肽络合复配物中还包括促钙吸收剂。
8.根据权利要求7所述的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，其特征在于，所述促钙吸收剂为维生素D3、酪蛋白磷酸肽及Ⅱ型胶原蛋白中的一种或任意两种混合或者三种混合。
9.根据权利要求8所述的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，其特征在于，以所述海参牡蛎糖肽钙络合物为基准，所述维生素D3、酪蛋白磷酸肽以及Ⅱ型胶原蛋白的加入量分别为0.0001-0.0008％、2％-10％、5％-20％。
10.根据权利要求5～9任意一项所述的海参牡蛎糖肽钙络合复配物的制备方法，所制备的海参牡蛎糖肽钙络合复配物。
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