RU2003688C1 - "Способ получени препарата "протолизин" из коммерческого препарата "протосубтилин" - Google Patents

Abstract

Использование, в офтальмологии дл  лечени  внутриглазных кровоизли ний различной этиологии и локализации и помутнений стекловидного тепа, а также в биохимической практике в качестве аналитического реагента Сущность изобретени  способ заключаетс  в экстракции ферментов из коммерческого препарата Протосубтилин. отделений балластных веществ обессоливании ферментного раствора , ионообменной хроматографии на карбокси- метилцеплюлозе, ультрафильтрации, осаждений протеиназы ацетоном и лиофилизации Разработаны оптимальные услови  проведени  процесса очистки, позвол ющие на стадии ионообменной хроматографии получить протеолитическую фракцию , свободную от примеси посторонних ферментов , с выходом по активности 49 - 50% Конечный продукт Протолизин представл ет собой белый или светло-бежевый амфорный порошок, растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натри  Протеолитическа  активность протолизина при действии на казеинат натри  (температура 30 °С) составл ет 2,7 - 32 ед/мг белка Зона наибольшей стабильности протеиназы рН 7,0 - 8,0, температура 5-10°С Оптимальные услови  действи  температура 50°С, рН 7,0 - 7,5 Ингибиторы - ионы т желых металлов, металлохелатные агенты Изоэлектрическа  точка 83, молм 30,5 - 34,о «Да Препарат катализирует гидролиз пептидных св зей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот , и не действует на пептидные св зи образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот, активно расщепл ет белки и пептиды, содержащие ароматические аминокислоты 1 зп ф-лы е

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к ферментной отрасли микробиологических производств, и может быть использовано при получении очищенных ферментных препаратов дл  медицины или дл  применени  в качестве биохимических реактивов в научно-исследовательской практике. Данное изобретение решает задачу получени  препарата Протолизин, представл ющего собой высокоочищенную металлопротеинэзу, свободную от примеси сопутствующих ферментов. Протолизин мо- жег бь:ть использован в офтальмологии дл  лечени  внутриглазных кровоизли ний раз- личной этиологии и локализации и помутне- ний стекловидного тела, а также в биохимической практике в качестве анали- 1ического реагента дл  изучени  структуры белков и пептидов.

Приведенные способы получени  высокоочищенной протеиназы многостадийны и характеризуютс  невысокими выходами конечного продукта.

Предлагаетс  способ получени  высокоочищенного препарата металлопротеина- зы (проголизина) из коммерческого препарата Протосубтилин, содержащего металлопротеиназу а-амилазу , /3-1,3-1,4- глю.каназу и другие белковые примеси. Способ состоит в экстракции ферментативного комплекса из протосубтилина, отделении балластного осадка, гель-фильтрации ферментного раствора ионообменной хроматографии , концентрировании методом ультрафильтрации протеолитической фракции , осаждении протеиназы ацетоном и ли- офилизации.

Дл  экстракции ферментов из протосубтилина используют дистиллированную воду или 0,002-0,01 М буферный раствор рН 6,2- 7,5, содержащие 0,1-0,5% CaCl2, необходимого дл  стабилизации металлопротеиназы и коагул ции балластных белков, Балластные вещества отдел ют центрифугированием .

Затем с целью подготовки ферментного раствора к хроматографии провод т его обессоливание методом гель-фильтрации. Дл  этого используют колонки с мелкопористыми сорбентами, имеющими крупные гранулы (например, сефадекс G-25, молселект G-25, биогель Р-6).

Гель-фильтрацию осуществл ют в среде 0,002-0,01 М буферного раствора при рН 6,2-7,5, причем скорость протока ферментного раствора через колонку с гель-сорбентом должна быть в пределах 0,60-0,85 мл/см2 мин, что позвол ет получить белковую фракцию с наименьшим разбавлением, свободную от солей и пигмента.

Ионообменную хроматографию на кар- боксиметилцеллюлозе провод т в среде того же буфера, что и гель-фильтрацию. С целью максимальной очистки протеиназы

от сопутствукж(их белков, пигментов и других примесей, а также повышени  выхода целевого продукта в процессе хроматографии сорбцию фермента необходимо вести со скоростью протока 0,10-0,15 мл/см2 мин,

0 а элюцию протеиназы следует проводить 0,18-0,22 М раствором NaCI в 0,002-0,01 М буфере со скоростью протока 0,15-0,35 мл/см мин. Проведение сорбции с меньшей скоростью удлин ет процесс хроматогра5 фии и приводит к увеличению потерь фермента за счет инактивации. Увеличение скорости сорбции выше оптимальной величины снижает сорбционную емкость ионо- обменника по отношению к протеиназе.

0 Указанные пределы скорости элюции также оптимальны, так как обеспечивают минимальное разбавление протеолитической фракции.

Концентрирование элюата протеиназы

5 осуществл етс  методом ультрафильтрации через полупроницаемые мембраны или полые волокна с размером пор, обеспечивающим задержание в концентрате белков с мол.м. выше 15 кДа (например, мембрана

0 УПМ-20, волокно ВПУ-15-ПА). С целью снижени  потерь фермента в процессе концен- трировани  и улучшени  качества конечного продукта ультрафильтрацию необходимо проводить при рН 7,2-7,5, что со5 ответствует зоне наибольшей стабильности протеиназы, до величины протеолитической активности концентрата 8-11 ед/мл. Увеличение степени концентрировани  приводит к инактивации фермента, а уменьшение сте0 пени концентрировани  затрудн ет процесс последующего осаждени  протеиназы. В обоих случа х это приводит к снижению выхода целевого продукта. Дл  стабилизации протеиназы в процессе ультрафильтра5 ции в концентрат при достижении величины его активности 3,5-4,0 ед/мл можно ввести хлористый кальций из расчета 1,3-1,5 мг на единицу активности.

Осаждение протеиназы из концентрата

0 проводитс  ацетоном при рН 8,2-8,4, т.е. вблизи изоэлектрической точки металлопротеиназы .

Полученный осадок лиофилизируют. Протеолитическа  активность препзра5 та Протолизин при действии на казеинат натри  (температура 30°С) составл ет 2,7- 3,2 ед/мг белка. Препарат не содержит примеси посторонних ферментов. Это белый или светло-бежевый аморфный порошок, растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натри . Зона наибольшей стабильности металлопротеиназы: рН 7,0- 8,0, температура 5-10°С. Оптимальные услови  действи : температура 50°С, рН 7,0-7,5. Ингибиторы - ионы т желых металлов , металлохелатные агенты. Изоэлектри- ческа  точка 8,3, мол.масса 30,5-34,0 кДа. Препарат катализирует гидролиз пептидных св зей, образованных аминогруппами гидрофобных аминокислот, и не действует на пептидные св зи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислот , активно расщепл ет белки и пептиды, содержащие ароматические аминокислоты .

П р и м е р 1. Дл  получени  препарата Протолизин 120 г коммерческого препарата Протосубтилин с протеолитической активностью 70 ед/г и содержанием белка 35 мг/г раствор ли в 500 мл дистиллированной воды, добавл ли к полученному раствору 0,66 г хлористого кальци . Величину рН ферментного раствора устанавливали равной 7,2. Общий объем полученной смеси доводили до 600 мл. Нерастворившийс  осадок отдел ли центрифугированием. Ферментный раствор с протеолитической активностью 12,8 ед/мл направл ли на гель-фильтрацию через сефадекс G-25. Се- фадекс, загруженный в колонку объемом 5 л, уравновешивали 0,0025 М фосфатным буфером рН 7,2. На колонку наносили 598 мл ферментного раствора со скоростью 0,75 мл/см2 в 1 мин и после гель-фильтрации получали обессоленную ферментную фракцию объемом 2000 мл с протеолитической активностью 3,0 ед/мл. Полученный ферментный раствор направл ли на ионообменную хроматографию, котора  проводитс  на карбоксиметилцеллюлозе (КМ-целлюлозе), загруженной в колонку объемом 1,2 л. Ионообменник уравновешивали 0,0025 М фосфатным буфером рН 7,2. Скорость нанесени  обессоленного ферментного раствора на КМ-целлюлозу равна 01, мл/см мин. Затем колонку промывали исходным буфером, содержащим 0,2 М NaCi, со скоростью 0,2 мл/см2мин. При этом элюируетс  металлопротеиназа. Фракци  металлопротеиназы объемом 2500 мл имела активность 1,2 ед/мл. Концентрирование протеолитической фракции проводили методом ультрафильтрации через полисульфо- намидную мембрану типа УПМ-20 при рН раствора 7,2. В результате получен концентрат объемом 180 мл с активностью 10,8 ед/мл. Далее протеиназу осаждали ацетоном при рН 8,2 и осадок лиофилизировали. Получено 0,52 г высокоочищенного препарата протолизин с активностью 2200 ед/г и содержанием белка 700 мг/г.

П р и м е р 2. Способ получени  препарата Протолизин из протосубтилина ана- 5 логичен способу, описанному в примере 1, до стадии гель-фильтрации. Дл  этого использовали колонку с биогелем Р-6, уравновешенным 0,01 М ацетатным буфером рН

6.2.На колонку наносили 598 мл фермент- 0 ного раствора со скоростью 0,85

мл/см мин. После гель-фильтрации получали 1880 мл обессоленного раствора С протеолитической активностью 3,2 ед/мл. Этот раствор наносили на колонкус КМ-целлюло5 зой, уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером рН 6,2. Скорость протока составл ет 0,12 мл/см мин. Элюцию протеиназы проводили исходным буфером, содержащим 0,22 М NaCI со скоростью 0,35 мл/см мин.

0 В результате получали протеолитическую фракцию объемом 2750 мл с активностью 1,1 ед/мл. Концентрирование элюата протеиназы проводили ультрафильтрацией через мембрану УПМ-20 при рН раствора 7,5. Кон5 центра фермента объемом 207 мл и активностью 9,5 ед/мл направл ли на осаждение ацетоном. Осаждение проводили при рН

8.3.Осадок л .-юфилизмровали. В результате получено 0,5 г высокоочищенного препара0 та с активностью 2100 ед/г и содержанием белка 660 мг/г.

П р и м е р 3. 350 г протосубтилина с протеолитической активностью 70 ед/г и содержанием белка 36 мг/г раствор ли в 1500

5 мл 0,0025 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному раствору добавл ли 8,7 г хлористого кальци . Общий объем полученного раствора довели до 1750 мл. Нерастворившиес  частицы удалили центрифугировани0 ем. Фугат объемом J700 мл с активностью 13 ед/мл подвергали обессиливанию методом гель-фильтрации на молселекте G-25. Дл  этого использовали 2 колонки объемом 5л кажда . Обессоливание проводили всре5 де 0,0025 М фосфатного буфера рН 7,5. На каждую колонку с сорбентом наносили по 850 мл ферментного раствора со скоростью 0,6 мл/см мин. Обессоленный раствор объемом 5400 мл с активностью 3,3 ед/мл по0 давали на ионообменную хроматографию. Колонку объемом 4 л с КМ-целлюлозой уравновешивали 0,0025 М фосфатным буфером рН 7,5. На колонку наносили обессоленный ферментный раствор со скоростью 0,15

5 мл/см мин. Элюцию протеиназы проводили раствором 0,18 М NaCI в исходном буфере , пропуска  его через колонку с КМ-целлюлозой с той же скоростью Эпюат объемом 8,8 л с активностью 1,0 ед/мл концентрировали методом ультрафильтрации

720036888

через полое волокно м арки ВПУ-15-ПА доед/мл. Объем концентрата составл л 550

объема 1,76 л. Протеолитическа  актив-мл. Далее протеиназу осаждали ацетоном

ность концентрата составл ла 3,5 ед/мл. Впри рН 8,4 и осадок лиофилизировали, Препаконцентрат вносили 9,24 г СаСЬ и подвер-рат Протолизин имел активность 1920 ед/г

гали его дальнейшему концентрированию5 и содержание белка 670 мг/г. Из 350 г продо содержани  протеиназы в растворе 10,7тосубтилина получено 1.7 г протолизина.

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА 10 - 0.15 мл/см2 мин, при элюции - 0,15 - 0,35 «ПРОТОЛИЗИН ИЗ КОММЕРЧЕСКОГО мл/см мин. использу  в качестве элюента ПРЕПАРАТА «ПРОТОСУБТИЛИН, заклю- ° 18 ° 22 м Раствор NaCI. концентрирова- чающийс  в том, что провод т экстракцию ние методом ультрафильтрации через по- ферментов дистиллированной водой или лупроницаемые мембраны или полые буферным раствором 0,002 - 0.01 М при рН 15 волокна с диаметром rtop, обеспечиваю- 6,2 - 7,5 в присутствии 0,1 - 0,5% CaCta, от- Щим задержание белков с мол.м. выше 15 деление балластных веществ, обессолива- кДа- А° содержани  протеиназы в концен- ние ферментного раствора методом трате 8-11 ед/мл, осаждение ацетоном Гель-фильтрации в среде буферного рас- Ри Рн 82 8-4 и лиофилизацию. твора 0,002 - 0,01 М при рН 6,2 - 7,5 со ско- 20

2. Способ по п.1, заключающийс  в ростью протока 0,60 - 0,85 мл/см2 мин, том- что в концентрат по достижении вели- ионообменную хроматографию на карбок- чины его активности 3,5 - 4,0 ед/мл ввод т симетилцеллюлозе в том же буфере со ско- CaCIa из расчета 1,3 - 1,5 кг на единицу

протеолитической активности.

-О