SU1055769A1 - Способ выделени оксидазы @ -аминокислот из да гюрзы - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗУ L-АМИНОКИСЛОТ ИЗ ЯДА ГЮРЗЫ, предусматривающий растворение  да в буферном растворе с последующим центрифугированием , гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе G-100 и зфоматографию ферментсод ержащего раствора на с ионообменной смолой с элюацией фермента солевым раствором, от л и ч а ю щ и и с  , тем, что, с целью повьшени  выхода и степени очистки целевого, продукта, растворение  да и гель-фильтрацию осуществл ют с иСпсльзоваки 4 в качестве буфера 0,19-0,21 М раствора уксуснокислого аммоний рН б,4-6,6,полученный после гель-фильтрации ферментсодержащий раствор подвергают перед хроматографией обессоливанию диализом до уп&пъпоК электропроводности ,

Description

im П50 1550 то 1950 «50 2Ш

СП Сл

о: со 2S50 fu, g5WC4WJff//« Изобретение относитс  к выделению оксидазы L-аМинокислот - фермента , катализирующего реакции окислительного дезаминировани  L-аминокислот с образованием оС-кетокислоты . Оксидаза ь-аминокислот исполь зуетс  как дл  препаративного получени  тироксина, чистых с-изомеров аминокислот it ci-кетокислот, так и дл  различных аналитических целей при изучении процессов транспорта аминокислот в процессе синтеза белка Оксидаза L-аминокиелот содержитс  во многих ткан х животных (печень птиц), в микробах и в биологических жидкост х животных (змеиные  ды). . Получение оксидазы ь-аминокислот из тканей животных и из микробов не обеспечивает чистоту фермента, так как источники фермента представл ют многокомпонентную смесь различных ;белков, разделение которых  вл етс  сложной задачей. Наиболее эффективны источником фермента  вл ютс  змеиные  ды, так как стабильность структуры  да обеспечивает четкое разделение. Активность оксидазы L-аминокислот в  дах различных змей варьируетс . Это св зано с видовой специфи ностью  дов, а также зависит от места обитани  и условий существовани  змей. Исследование  дов среднеазиатских змей показало, что наибольшей активностью оксидазы L-аминокислот облада ет  д гюрзы. Это и определ ет выбор  да гюрзы в качестве источника дл  н|ыделени  фермента.. Известен способ выделени  оксидазы L-аминокислот из  да гюрзы путем растворени   да в воде, осаждени  белков сульфатом ,гельфильтрации на сефадексе G-100 в присутствии фосфатного буфера с рН 7,8 и обессоливани  ферментной фракции на сефадексе G-25. Достигаема  степень очистки фермента 5,4-7,0 Cl Наиболее близким по достигаемому результату и технической сущности  вл етс  способ вьщелени  оксидазы L-аминокислот из  да гюрзы, предусматриваюсдий растворение  да в 0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,8 с последующим центрифугированием- , гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе G-100. Затем фракцию, содержащую ферментативную активность, обессоливаит, высушивают лиофильно и раствор ют в 0,0025 М фосфатном бу фере, после чего осуществл ют хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе с элюацией фермента 4-ступенчатым градиентом NaCl (0,1-0,4 М) В 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,8 С2. Однако слабоосновной анионит ДЭАЭ-целлюлоза - не  вл етс  селективным ионообменником при очистке оксидазы Ь аминокислот. Фермент элюируетс . совместно с основным количеством белка после первой ступени ионной силы (0,1 М NaCl).Достигаетс  только 3-кратна  очистка, причем потери активности доход т до 31%. Степень очистки - 15,3 раза . Выход оксидазы L-аминокислот 65 ,4%. Таким образом, недостатком способа  вл етс  низкий выход оксидазы L-аминокислот и невысока  степень очистки. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода и степени очистки оксидазы L-i:lMИHOKИCЛOT. Поставленна  цель достигаетс  предлагаемым способом выделени  оксидазы L-аминокислот из  да гюрзы, предусматривающим растворение  да в буферном растворе с последующим центрифугированием, гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе 0-100 и хроматографию ферментсодержащего раствора на колонке с ионообменной смолой с элюацией фермента солевым раствором,причем растворение  да и гель-фильтрацию осуществл ют с использованием в качестве буфера 0,19-0,21 М раствора уксуснокислого аммони , рН 6,4-6,6, получейнйй гГбсле гельфильтрации ферментсодержащий раствор подвергают перед.хроматографией обессолинанию диализом до удельной электропроводности (1,6-1,8) х . X 10-3S см- (0,019-0,21 М)и устанавливают в нем рН 5,3-5,5,в качестве ионообменной смолы используют карбоксиметилцеллюлозу а в.качестве элюирующего солевого раствора 0 ,019-0,021 М раствор уксуснокислого аммони , рП 5,3-5,5. АММОНИЙ уксуснокислый  вл етс  очень ;гигроскопичным1 веществом и с целью приготовлени  хорошо воспроизводимых буферных растворов, необходим контроль удельной электропроводности раствора. Удельна  электропроводность рассчитываетс  по формуле УЭ |- (S - см-) m где К - константа  чейки кондуктометра} сопротивление раствора. Ом. Предлагаемый способ обеспечивает повышение степени очистки до 25 раз и повышение выхода до 85% оксидазы L-аминокислот. Использование уксуснокислого аммони  в качестве буфера на стадии растворени  обеспечивает создание среды дл  последующего разделени . Гель-фильтрации подвергают раствор  да гюрзы, разделение происходит на геле, причем в качестве гел  используетс  сефадекс G-100 сверхтонкий , раздел ющий белки в пределах молекул рного веса 4000-150000 Дальтонов. Яд гюрзы, содержащий мно гокомпонентную смесь, раздел етс  н 9 белковых пиков (см. чертеж;. I, III - IX пики исключаютс , поскольку в них присутствуют эндонуклеазы, протеазы, фосфолипазы А, токсины,  да и другие вацества; Степень очистки 5-6 раз, вькод 95%. Последующей ионообменной хроматографии подвергают фракции II пика гель-фильтрации, причем удельную электропроводность.раствора уменьшают с диализом до (1,6-1,8) х X . см-, (0,019-0,021 М) рН 6,4-6,6, одновременно концентриру  раствор до 40 мл. рН раствора довод т до 5,3-5,5 с помощью 20%-ной уксусной кислоты. В качестве ионита используют избирательно действующую карбоксиметилцеллюлозу и провод т селективное разделение. На ионит нанос т раствор фермента с удельной электропроводностью (1,6-1,8 ) 1(5% -с 0,019-0,021 М, рН 5,3-5,5. При этом оксидаза L-аминокислот проходит ион обменник, а остальные белки св зываютс  катионитом. Таким образом, предлагаемый способ заключаетс  в следующем. Яд гюрзы раствор ют в растворе уксуснокислого аммони , центрифугируют ,, осадок выбрасывают, надосадоч ную жидкость используют дл  гельфильтрации . Гель-фильтрацию провод  с раствором уксуснокислого аммони  0,19-0,21 М с удельной электропроводностью 14 ,5-15,5 ) - см-, рН 6,4-6,6. Пoлyчeннy э фракцию окси дазы L-аминокислот с приблизительно одинаковым молекул рным весом: обессоливают и концентрируют при по мс ди диализа с полиэтиленгликолём до удельной электропроводности ( 1,6-1,8) - см-, (0,019-0,021 Полученный раствор фермента, рН 5,3-5,5, нанос т на колонку с карбо симетилцеллюлозой. Оксидаза L-амино кислот проходит катионит, а остальные белки (фосфодиэстераза, щелочна  фосфатаза, 5-нуклеотидаза) св зываютс  катионитом при рН 5,3-5,5 и удельной электропроводности раствора (1,6-1,8) -lO-s см,-, (0,0190 ,021 М). Фракции оксидазы L-аминокис от собирают и концентрируют при помощи диализа с полиэтиленгликолём. Выход 853. Степень очистки - 25раз.60 АКТИВНОСТЬ оксидазы L-аминокислот 5 ед/мР белка.. Пример 1. К 4,9 г  да гюрзы добавл ют 40 мп 0,19 М раствора . 55 I уксуснокислого аммони  с удельнбй электропроводностью 14,5-10 S -см рН 6,4. Смесь медленно перемешиваюв течение 4 ч при . Растворенный  д центрифугируют при 5000 об/мин при 4с в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют дл  гель-фильтрации. На уравновешенную 0,19 М раствором уксуснокислого аммони  (удельна  электропроводность 14,5 ) колонку с сефадексом G-100 сверхтонг. КИМ (размеры колонки 4,2x140) нанос т раствор  да. Колонку элюйруют 0,19 М раствором уксуснокислого аммони  с удельной электропроводностью 14,5 - 10 SCMV рН 6,4, со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции до 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно спомощью Увикорд-11.Получают ;9 белковых пиков. Во II пике фракции, ко торые имеют активности оксидазы L-аминокислот , объедин ют (объем 200 мл) и подвергают диализу до выхода 40 мл желтого раствора белка с удельной электропроводностью 1,6 , 0,019 М; довод т рН 20%-ной уксусной жислотрй до рН 5,3. Раствор фермента нанос т на уравновешенную 0,019М растворсм уксуснокислого аммони  (удельнгш электропроводность 1,6 - , рН 5,3) колонку карбоксиметилцеллкшозы 1Ш-52. Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аммони , рН 5,3 (удельна  электропроводность раствора 1,5 .см). Скорость элюации 45 мл/ч, собираютс  фракции по 15 Mrt. Оптическую плотность элмата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда ; Во фракци х определ ют активность оксвдазы L-аминокислот (субстрат - L-лейцин). При ионообменной , хроматографии на КМ-целлюлозе оксидаза L-аминокислот проходит в данных услови х, а остальные белки, имеющие изоэлектрическую точку выие 5,3, св зываютс  катионитом . Фракции, содержащие активности оксидазы L-аминокислот, объеин ют (выход 140 мл) и концентрируют при помощи диализа. Характеристика препарата - 85,2%, степень очистки 25 ,0 раза, активность оксидазы Ь-аминокислот - 5,0 ед/мр белка. Пример 2. К$,0г  да -добавл ют 40 мл 0,2 М раствора уксуснокислого аммони  с удельной элект ропро одностью 15, , -„ , .. f «|- медленно перемешивают ч. Растворенный  д центрифугируют Р бОО оС/мин в течение 30 мин при 4 с. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют дл  гель (фильтрации. На уравновешенную 0,2 М

раствором уксуснокислого аммони  (удельна  электропроводность 15,0 X -см) колонку с сефадексом G-100 сверхтонким (размер колонки 4,2x140 см) нанос т раствор  да. Колонку элюируют 0,2 М раствором уксуснокислого аммойи  с; удельной электропроводностью 15,0 - -см рН 6,5, со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорд-11. Получают 9 белковых пиков. Во II пике фракции, которые име т активности оксидазы L-аминокислот, объедин ют (объем 205 мл) и концентрируют при помощи диализа до 40 ют. Удельна  электропроводность полученного раствора 1,7 , 0,02 М. рН раствора довод т до 5,4 с помощью 20%-ной уксусной кислоты. Раствор фермента нанос т на уравновешенную 0,02М pacTBopcffjj уксуснокислого ам 4они  (удельна  электропроводность 1,7 ) колонку КМ-целлюлозы. Через колонку пропускают 0,5 л 0,02 М раствора уксуснокислого аммони , рН 5,4 (удельна  электропроводность 1,7 х X . скорость элюации 45 мл/ч. Собираютс  фракции по 1&мп Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда . Во фракци х, содержащих белки, определ ют активность оксидазы L-аминокислот (субстрат - L-лейцин) объедин ют их (выход 145 мл) и концентрируют при помощи диализа.

Характеристика препарата: выход 85,7%, степень очистки - 25,6 раза активность оксидазы L-аминокислот 5 ,4 ед/мг белка.

Пример 3. К4,9г  да добал ют 40 t/in 0,21 М раствора .уксуснокислого аммони  с удельной электропроводностью 15,5 , рН 6,6. Смесь медленно перемааивают 4 ч при 4 С. Растворенный  д центрифугируют при 5000 об/мин при в течение 30 мин. Осадок выбрасывают , надосадочную жидкость используют дл  гель-фильтрации. На уравновешенную 0,21 М раствором уксуснокислого амгюни  (удельна  электропроводность 15,5 ) колонку с сефадексом G-100 сверхтонким (размеры колонки 4,2x140 см) нанос т раствор  да.

Колонку элюируют 0,21 М раствором уксуснокислого аммони  с удельной электропроводностью 15,5 х X , рП 6,6, со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью

Увикорд-11. Получают 9 белковых пиков. Во. II пике фракции, которые имеют активности оксидазы L-аминокислот , объедин ют (объем 200 мл) и подвергают диализу до выхода 40 мл желтого раствора белка с удельной

электропроводностью 1,8. см- . 0,021 М. Довод т рН 20%-ной уксусной кислотой до 5,5..

Раствор фермента нанос т на уравновешенную 0,021 М раствором уксусно кислого амглони  (удельна  электропроводность1 ,8 ) колон ,ку карбоксиметилцеллюлозы . Через Колонку пропускают 0,5 л 0,021 М раствора уксуснокислого аммони  рН 5,5 (удельна  электропроводность раствора 1,8 ). Скорость элюации 45 мл/ч. Собирают фракции по 15 глл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью Увикорда. Во фракци х определ ют активность оксидазы .-аминокислот (субстрат - L-лейцин).. При ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе оксидаэа L-аминокислот проходит катионит в данных услови х, а остальные белки, имеющие изоэлект- ричегскую точку вьше 5,3, св зываютс  на катионит. Фракции, содержащие активности оксидазы L-аминокислот , объедин ют (выход 140 мл) и конденсируют при помощи диализа.

Характеристика препарата: выход 85 ,1%, степень очмстки - 25,2 раза,, активность оксидазы L-аминокислот 5 ,1 ед/мг белка.

Концентрированный раствор фермента полностью сохран ет активность в течение 24 мес при температуре хранени  .

Определение активности оксидазы Ь-аминокислот.

Активность фермента оксидазы L-аминокислот определ ют с L-лейцином , который окисл етс  под действием фермента до соответствующей (it-кетокислоты.

За единицу активности оксидазы L-аминокислот принимают количество фермента, которое окисл ют 1 мкмоль

L-лейцина до oL-кетокислоты в минуту при , рН 8,5. Активность окбидазы L-,aминoкиcлoт выражают по содержанию белка в препарате, которое определ етс  по методу Лоури.

Технико-эконоглический эффект предлагаемого изобретени  заключаетс  вэкономии змеиного  да за счет увеличени  Качества ферментного препарата (увеличение выхода, повышение

Степени очистки). Упрощаетс  процесс очис- ки оксидазы L-аминокислот из  да гюрзы, особенно этап ионообменной хроматографии.

Оксидаза L-гlминoкиcлoт может быть использована дл  различных аналити710557698

ческих целей при изучении процес- также дл  препаративных целей - npli (сов транспорта а1 1инокислот в процессе синтезе .тироксина, чистых О-нзомесинтеза белка (инженергенетика), а РОВ аминокислот и.L-кетокислот.

Claims (1)

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗЫ L-АМИНОКИСЛОТ ИЗ ЯДА ГЮРЗЫ, предусматривающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе G-100 и хроматографию ферментсодержащего раствора на колонке с ионообменной смолой с элюацией фермента солевым раствором, от л и ч а ю щ и й с я. тем, что, с целью повышения выхода и степени очистки целевого, продук’та, растворение яда и гель-фильтраЦию осуществляют с использованием в качестве буфера 0,19-0,21 К раствора уксуснокислого аммония, pH б,4-6,б,полученный после гель-фильтрации ферментсодержащий раствор подвергают перед хроматографией обессоливанию диализом до удельной электропроводности ,(1 ,β-1,8)·- 10-* S'CM-'’ (0,019 - g 0,021 И) и устанавливают в нем pH

   5.3- 5,5, в качестве ионообменной смолы используют карбоксиметилцеллюлозу, а в качестве элюирующего Солевого раствора - 0,019-0,021 М раствор уксуснокислого аммония, pH

   5.3- 5,5.