JPS5991881A - 銅・亜鉛ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの精製法 - Google Patents
銅・亜鉛ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの精製法Info
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- JPS5991881A JPS5991881A JP20205282A JP20205282A JPS5991881A JP S5991881 A JPS5991881 A JP S5991881A JP 20205282 A JP20205282 A JP 20205282A JP 20205282 A JP20205282 A JP 20205282A JP S5991881 A JPS5991881 A JP S5991881A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（
以下Ｃｕ−Ｚｎ−８０Ｄと略称する）の新規な精製方法
に関するものである。
以下Ｃｕ−Ｚｎ−８０Ｄと略称する）の新規な精製方法
に関するものである。
ＳＯＤは、細菌から哺乳動物ならびにヒトなどの生体組
織や血液中に存在し、生体内で酸素毒性を示す活性酸素
分子種の１つであるスーパーオキシドイオン（０：）を
分１する酵素で、キレートしている金属の相違によりＦ
ｅ −Ｓ ＯＤ、 Ｍｎ −８ＯＤ、 Ｃｕ −Ｚｎ−
８ＯＤの３種に分類されている。
織や血液中に存在し、生体内で酸素毒性を示す活性酸素
分子種の１つであるスーパーオキシドイオン（０：）を
分１する酵素で、キレートしている金属の相違によりＦ
ｅ −Ｓ ＯＤ、 Ｍｎ −８ＯＤ、 Ｃｕ −Ｚｎ−
８ＯＤの３種に分類されている。
そして、ＳＯＤは生体内で酸素分子から発生したスーパ
ーオキシドイオンによる組織障害から起こると考えられ
そいる炎症、たとえば、変形性関節症、および慢性関節
リウマチ、または放射線照射による障害は対する有効な
治療剤として注目されてい名。
ーオキシドイオンによる組織障害から起こると考えられ
そいる炎症、たとえば、変形性関節症、および慢性関節
リウマチ、または放射線照射による障害は対する有効な
治療剤として注目されてい名。
ＳＯＤを生体組織や血液から精製単離する方法として硫
安塩析法、加熱処理法（特開昭５７−１２９９３）、有
機塩素化合物処理法（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｔｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｊ、Ｂ−Ｃ９） ２
４４ ６０５１（１９６９））、イオン交換樹脂処理法
（特公昭５３−２２１３７）など、種々の方゛法が知ら
れている。しかし、これらの方法は、精製効率が悪くて
高比活性の製品な高収率で得ることが困難であったり、
脱塩処理や、夾雑タンパク質除去などの繁雑な前処理を
要するなど工業的精製法としそ必ずしも優れた方法では
ない。
安塩析法、加熱処理法（特開昭５７−１２９９３）、有
機塩素化合物処理法（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｔｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｊ、Ｂ−Ｃ９） ２
４４ ６０５１（１９６９））、イオン交換樹脂処理法
（特公昭５３−２２１３７）など、種々の方゛法が知ら
れている。しかし、これらの方法は、精製効率が悪くて
高比活性の製品な高収率で得ることが困難であったり、
脱塩処理や、夾雑タンパク質除去などの繁雑な前処理を
要するなど工業的精製法としそ必ずしも優れた方法では
ない。
そこで、本発明者らはＳＯＤの簡便な精製法について種
々検討した結果、生体組織及び血液からＣｕ−Ｚｎ−８
ＯＤを抽出した粗抽出液を非極性ハイポーラスポリマー
系樹脂に接触させるとＳＯＤは選択的かつ効率よく非極
性ハイポーラスポリマー系樹脂に吸着すること及び該樹
脂からはＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤのみが選択的に溶出され、
Ｆｅ−８ＯＤやＭｎ −Ｓ ＯＤは溶出されないことを
見い出した。
々検討した結果、生体組織及び血液からＣｕ−Ｚｎ−８
ＯＤを抽出した粗抽出液を非極性ハイポーラスポリマー
系樹脂に接触させるとＳＯＤは選択的かつ効率よく非極
性ハイポーラスポリマー系樹脂に吸着すること及び該樹
脂からはＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤのみが選択的に溶出され、
Ｆｅ−８ＯＤやＭｎ −Ｓ ＯＤは溶出されないことを
見い出した。
本発明は上記知見に基づき完成されたものである。即ち
、本発明は非極性ノ・イボ−ラスポリマー系樹脂に不純
なＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含有する溶液を接触させた後、
該樹脂を洗浄し、次いで該樹脂に吸着したＣｕ−Ｚｎ−
８ＯＤを溶出することを特徴とするＣｕ−Ｚｎ −Ｓ
ＯＤの精製法に関する。
、本発明は非極性ノ・イボ−ラスポリマー系樹脂に不純
なＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含有する溶液を接触させた後、
該樹脂を洗浄し、次いで該樹脂に吸着したＣｕ−Ｚｎ−
８ＯＤを溶出することを特徴とするＣｕ−Ｚｎ −Ｓ
ＯＤの精製法に関する。
本発明で使用する非極性ハイポーラスポリマー系樹脂と
してはＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤ吸着能を有するものなら特に
制限はないが、樹脂基材′として、例工ば、スチレンと
ジビニルベンゼンを、又、それらを主成分とし、他に少
量の成分、例えば２−ビニルピリジンを添加して共重合
したポリスチレン系の樹脂が望ましく、例えば、アンバ
ーライトＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４，ＸＡＤ−９（商標、
ローム・アンド０ハース社製）、タイヤイオンＴ−ＩＰ
−１０，Ｉ−ＩＰ−２０，Ｉ−ＩＰ −２１、Ｉ（Ｐ
−３０、ＵＰ−４０，Ｉ−ＩＰ−５０（商標、三菱化
成工業株式会社製）、ジュオライ）Ｓ−８６１，Ｓ−８
６２、ＥＳ−８６３，ＥＳ−８６５，ＥＳ−８６６（商
標、ダイヤモンド拳ジャムロック社ｍ＞、レバチッ）Ｑ
Ｃ−１０３１（商標、バイエル社製）などが有る。より
好ましくは、１５０Ｘより高＜１５００Ｘ以下の最多頻
度細孔径と０．４〜１．１ｍｌ！／９−の細孔容積をも
つポリスチレン系の非極性ハイポーラスポリマーであり
、アンバーライ）ＸＡＤ−２，ダイヤイオンＨＰ−１０
，Ｉ−ＩＰ −２０、Ｉ−ＩＰ−２１，ｒ−ＩＰ−３０
，Ｔ−ＩＰ−４，０，シュオライドＳ−８６１，Ｅｓ−
８６３，ＥＳ−８６５゜レバチッ）ＱＣ−１０３１が収
率及び精製効率の面ですぐれている。
してはＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤ吸着能を有するものなら特に
制限はないが、樹脂基材′として、例工ば、スチレンと
ジビニルベンゼンを、又、それらを主成分とし、他に少
量の成分、例えば２−ビニルピリジンを添加して共重合
したポリスチレン系の樹脂が望ましく、例えば、アンバ
ーライトＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４，ＸＡＤ−９（商標、
ローム・アンド０ハース社製）、タイヤイオンＴ−ＩＰ
−１０，Ｉ−ＩＰ−２０，Ｉ−ＩＰ −２１、Ｉ（Ｐ
−３０、ＵＰ−４０，Ｉ−ＩＰ−５０（商標、三菱化
成工業株式会社製）、ジュオライ）Ｓ−８６１，Ｓ−８
６２、ＥＳ−８６３，ＥＳ−８６５，ＥＳ−８６６（商
標、ダイヤモンド拳ジャムロック社ｍ＞、レバチッ）Ｑ
Ｃ−１０３１（商標、バイエル社製）などが有る。より
好ましくは、１５０Ｘより高＜１５００Ｘ以下の最多頻
度細孔径と０．４〜１．１ｍｌ！／９−の細孔容積をも
つポリスチレン系の非極性ハイポーラスポリマーであり
、アンバーライ）ＸＡＤ−２，ダイヤイオンＨＰ−１０
，Ｉ−ＩＰ −２０、Ｉ−ＩＰ−２１，ｒ−ＩＰ−３０
，Ｔ−ＩＰ−４，０，シュオライドＳ−８６１，Ｅｓ−
８６３，ＥＳ−８６５゜レバチッ）ＱＣ−１０３１が収
率及び精製効率の面ですぐれている。
本発明において原料として使用する不純なＣｕ−Ｚｎ−
８ＯＤを含有する溶液はＣｕ−Ｚｎ −Ｓ ＯＤ含有溶
液なら特に制限なく、例えば生体組織からＣｕ−Ｚｎ
−ＳＯＤを抽出した粗抽出液精製途中のＣｕ−Ｚｎ−８
ＯＤ含有溶液などがあげられるが、粗抽出液が好ましい
。
８ＯＤを含有する溶液はＣｕ−Ｚｎ −Ｓ ＯＤ含有溶
液なら特に制限なく、例えば生体組織からＣｕ−Ｚｎ
−ＳＯＤを抽出した粗抽出液精製途中のＣｕ−Ｚｎ−８
ＯＤ含有溶液などがあげられるが、粗抽出液が好ましい
。
本発明で使用し得る、ＣｕＺｎ−８ＯＤを抽出した液又
は含有する溶液を得るための材料としては、Ｃｕ−Ｚｎ
−８ＯＤを含有するものであれば良くその範囲には、酵
母、植物、動物及びバクテリア由来のものが含まれる。
は含有する溶液を得るための材料としては、Ｃｕ−Ｚｎ
−８ＯＤを含有するものであれば良くその範囲には、酵
母、植物、動物及びバクテリア由来のものが含まれる。
これらのうちでも特に重要なものは、酵母および哺乳動
物性のものである。哺乳動物の場合には、血液および組
織のいづれであっても良く、人、牛、馬、豚、羊等その
種は問わない。また組織としては肝臓、腎臓、胎盤等Ｃ
ｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含有するものであれば、いづれにつ
いても使用し得る。
物性のものである。哺乳動物の場合には、血液および組
織のいづれであっても良く、人、牛、馬、豚、羊等その
種は問わない。また組織としては肝臓、腎臓、胎盤等Ｃ
ｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含有するものであれば、いづれにつ
いても使用し得る。
血液の場合は、血液をそのまま使用しても良いが、より
好ましくは、血しよう部分を洗浄除去した赤血球部分を
用いるのが良い。赤血球を溶血するためには、たとえば
、赤血球容積に対５− して１〜４倍容の水を添加する等の方法がとられる。
好ましくは、血しよう部分を洗浄除去した赤血球部分を
用いるのが良い。赤血球を溶血するためには、たとえば
、赤血球容積に対５− して１〜４倍容の水を添加する等の方法がとられる。
組織の場合は、何倍でも良いが、１〜１０倍容、好まし
くは、２．５〜５倍容の水又は０１〜０．３Ｍの無機中
性の塩水溶液を添加し、通常の細胞破砕機を用いて組繊
細胞を破砕し、Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含む水可溶性タン
パク質を抽出することにより粗抽出液を得ることができ
る。
くは、２．５〜５倍容の水又は０１〜０．３Ｍの無機中
性の塩水溶液を添加し、通常の細胞破砕機を用いて組繊
細胞を破砕し、Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含む水可溶性タン
パク質を抽出することにより粗抽出液を得ることができ
る。
樹脂に吸着したＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤ以外の夾雑物を除去
する洗浄剤としては、水でもよいが、好ましくは酸性で
緩衝作用を有するものであればいづれの塩でも良く、イ
オン強度をもたせる塩の種類は重要ではない。たとえば
、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、カコジル酸、
マレイン酸等の塩類が使用される。
する洗浄剤としては、水でもよいが、好ましくは酸性で
緩衝作用を有するものであればいづれの塩でも良く、イ
オン強度をもたせる塩の種類は重要ではない。たとえば
、酢酸、クエン酸、コハク酸、フタル酸、カコジル酸、
マレイン酸等の塩類が使用される。
洗浄剤のイオン強度およびｐＴ（は、１Ｍ以下でｐＨ４
〜６が良く、さらに好ましくは、０．２Ｍ以下のイオン
強度でｐＨ４，５〜５．５の酸性バッファーが良い。
〜６が良く、さらに好ましくは、０．２Ｍ以下のイオン
強度でｐＨ４，５〜５．５の酸性バッファーが良い。
ＣＬＩ・７．ｎ−８ＯＤを選択的に溶出する溶出剤とし
６一 ては水可溶性有機溶媒及び塩溶液が挙げられる。
６一 ては水可溶性有機溶媒及び塩溶液が挙げられる。
水可溶性有機溶媒としては、低級アルコール系のメタノ
ール、エタノール、プロピルアルコール、ブタノール等
が、またケトン系の水可溶性有機溶媒としてはアセトン
等が利用できるが、これらのうち、特に好ましくは、メ
タノールとアセトンである。
ール、エタノール、プロピルアルコール、ブタノール等
が、またケトン系の水可溶性有機溶媒としてはアセトン
等が利用できるが、これらのうち、特に好ましくは、メ
タノールとアセトンである。
塩溶液としては、中性塩そのものでも、又ｐＨ６〜１１
に緩衝能を保持するバッファーであっても良く、イオン
強度を持たせる塩の種類は、かならずしも重要ではない
。たとえば、食塩、塩化カリウムなどの中性塩やカコジ
ル酸、マレイン酸、リン酸、イミダゾール２．４．６−
）リメチルピリジン、トリエタノールアミン、ベロナー
ル、Ｎ−エチルモルホリン、トリス、クリシン、２−ア
ミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、ジェタ
ノールアミン、ホウ酸、グリシルグリシン、炭酸等の塩
類が使用される。
に緩衝能を保持するバッファーであっても良く、イオン
強度を持たせる塩の種類は、かならずしも重要ではない
。たとえば、食塩、塩化カリウムなどの中性塩やカコジ
ル酸、マレイン酸、リン酸、イミダゾール２．４．６−
）リメチルピリジン、トリエタノールアミン、ベロナー
ル、Ｎ−エチルモルホリン、トリス、クリシン、２−ア
ミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、ジェタ
ノールアミン、ホウ酸、グリシルグリシン、炭酸等の塩
類が使用される。
塩溶液のイオン強度およびｐＨは、イオン強度２Ｍ以下
でｐＨは６〜１１が良く、さらに好ましくは、溶出後の
処理等を考え、イオン強度０．５Ｍ以下、ｐＴ−Ｔ ９
〜１０．５が使用される。
でｐＨは６〜１１が良く、さらに好ましくは、溶出後の
処理等を考え、イオン強度０．５Ｍ以下、ｐＴ−Ｔ ９
〜１０．５が使用される。
溶出剤の水可溶性有機溶媒とバッファーの組成比は、水
可溶性有機溶媒の種類により異なるが、水可溶性有機溶
媒の割合は５〜８０％の範囲であればいづれでもよいが
、メタノールの場合４０〜６０％、アセトンの場合２０
〜４０％が好捷しい結果を与える。
可溶性有機溶媒の種類により異なるが、水可溶性有機溶
媒の割合は５〜８０％の範囲であればいづれでもよいが
、メタノールの場合４０〜６０％、アセトンの場合２０
〜４０％が好捷しい結果を与える。
本発明の方法により採取、精製されたＣｕ−Ｚｎ−８Ｏ
Ｄ含有溶出液は、塩酸、硫酸、酢酸等の無機及び有機酸
を用いてｐＨを中性付近に調整後、通常の方法により、
常温下に減圧脱溶媒され、脱イオン水又は緩衝液に対し
て透析を行い、残存する塩類を除去し、ＤＥＡＥ−担体
クロマト、ゲル済過等の精製操作をへて、高度に純化さ
れたＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤを得ることができる。
Ｄ含有溶出液は、塩酸、硫酸、酢酸等の無機及び有機酸
を用いてｐＨを中性付近に調整後、通常の方法により、
常温下に減圧脱溶媒され、脱イオン水又は緩衝液に対し
て透析を行い、残存する塩類を除去し、ＤＥＡＥ−担体
クロマト、ゲル済過等の精製操作をへて、高度に純化さ
れたＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤを得ることができる。
次に本発明方法がすぐれた効果を発揮することを実験例
により説明する。
により説明する。
実験例 ＳＯＤ活性の回収率及び比活性（１） 試
料の調整 ヒト赤血球１５０ｍＡ！に脱イオン水３００ ｍ１（ｑ
の場合（５０ｍＪ）を添加して溶血し次いでこの溶血液
に次の（Ａ）、（ハ）又は（ｑの処理を施す。
料の調整 ヒト赤血球１５０ｍＡ！に脱イオン水３００ ｍ１（ｑ
の場合（５０ｍＪ）を添加して溶血し次いでこの溶血液
に次の（Ａ）、（ハ）又は（ｑの処理を施す。
その後得られた溶液を０．００５ＭＩＪン酸バッファー
（ｐＨ７，５’）で十分透析し、試料とした。
（ｐＨ７，５’）で十分透析し、試料とした。
（Ａ） 本発明方法
溶血液を、ダイヤイオンＨＰ−２０カラム（２，３ｘ２
５ ｃｍ、 １００ｍｌ ）に通し、溶血液中に含まれ
るＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤのほぼ全てを吸着させた。カラム
は０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッフｙ−（ｐＨ５，ｏ
） ２００ｍｌで洗浄し、さらに水１００ ｍｌで洗浄
後、メタノール５０％（ｖ／ｖ ）を含有する０、 １
Ｍグリシン・ナトリウムバッファー（ｐＨ１０，０）
の溶出液により溶出した。
５ ｃｍ、 １００ｍｌ ）に通し、溶血液中に含まれ
るＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤのほぼ全てを吸着させた。カラム
は０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッフｙ−（ｐＨ５，ｏ
） ２００ｍｌで洗浄し、さらに水１００ ｍｌで洗浄
後、メタノール５０％（ｖ／ｖ ）を含有する０、 １
Ｍグリシン・ナトリウムバッファー（ｐＨ１０，０）
の溶出液により溶出した。
Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤは１つのピークとなって溶出され、
溶出開始から５０〜２５０ ｍｌの溶出液の中にほぼ全
ての活性が見い出された。（この活性画分に回収される
ＳＯＤの活性は７００８４単位で、溶血液からの回収率
は９２％であった。）さらにこのメタノールを含む溶出
［−９− ｐＴ（７，０とし、３０℃に加熱した浴中でエバポレー
ターにより４０ｍ１まで濃縮する。
溶出開始から５０〜２５０ ｍｌの溶出液の中にほぼ全
ての活性が見い出された。（この活性画分に回収される
ＳＯＤの活性は７００８４単位で、溶血液からの回収率
は９２％であった。）さらにこのメタノールを含む溶出
［−９− ｐＴ（７，０とし、３０℃に加熱した浴中でエバポレー
ターにより４０ｍ１まで濃縮する。
（Ｂｌ 熱処理法（特開昭５７−１２９９３）溶血液
に塩化ナトリウム１５１、塩化第二銅１５〜を加え、７
０℃６０分間加熱処理を行った。室温まで冷却後、遠心
分離により生じた沈殿物を除去し、さらに塩化第二銅２
１５Ｉｎ９を加え、ｐ）（５，６とし、再度６５℃１５
分間熱処理を行った。冷却後、生じた洗去 殿を濾過により除却し、微青色の炉液４５０ｍ１を得た
。
に塩化ナトリウム１５１、塩化第二銅１５〜を加え、７
０℃６０分間加熱処理を行った。室温まで冷却後、遠心
分離により生じた沈殿物を除去し、さらに塩化第二銅２
１５Ｉｎ９を加え、ｐ）（５，６とし、再度６５℃１５
分間熱処理を行った。冷却後、生じた洗去 殿を濾過により除却し、微青色の炉液４５０ｍ１を得た
。
（Ｑ 有機塩素化合物処理法（Ｊ、Ｂ、Ｃ，２４４６０
５１（１９６９）） 溶血液を攪拌しながらその液に７５ｍ１のエタノールと
４５ｍ１のクロロホルムを添加してヘモグロビンを沈殿
させた。この沈殿含有溶液を３０ ｍｌの水で希釈し、
遠心分離により沈殿物を除去後、得られた上澄液にリン
酸第二カリウム塩７０ｐ（：ｊＯ％（ｗ／ｖ）に相当）
を加えて２相に相分離させた。Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤ−１
〇− を含有する上層部（エタノール−水相）を採取し、浮遊
物を遠心分離により除去後、０．７５倍容のアセトンを
加えてＣｕ−Ｚｎ −Ｓ ＯＤを沈殿させ、次いでその
沈殿を脱イオン水１０ｍ１に溶解した。
５１（１９６９）） 溶血液を攪拌しながらその液に７５ｍ１のエタノールと
４５ｍ１のクロロホルムを添加してヘモグロビンを沈殿
させた。この沈殿含有溶液を３０ ｍｌの水で希釈し、
遠心分離により沈殿物を除去後、得られた上澄液にリン
酸第二カリウム塩７０ｐ（：ｊＯ％（ｗ／ｖ）に相当）
を加えて２相に相分離させた。Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤ−１
〇− を含有する上層部（エタノール−水相）を採取し、浮遊
物を遠心分離により除去後、０．７５倍容のアセトンを
加えてＣｕ−Ｚｎ −Ｓ ＯＤを沈殿させ、次いでその
沈殿を脱イオン水１０ｍ１に溶解した。
（２）実験方法
試料中のＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤのＳＯＤ活性の測定は、Ｍ
ｃ ＣｏｒｄとＦｒｒｄｏｖｒｃｈの方法（ＪＢＣ２４
，４６０４９（１９６９））に準じて行った。即ち、キ
サンチンオキシダーゼのキサンチンを基質とした酵素反
応により生じたスーパーオキシドイオン（０″２）の酸
化型チトクロームＣの還元作用をＳＯＤ が阻害するこ
とを利用する方法で波長５５０ｎｍに於ける時間的変化
によりＳＯＤ活性を測定した。
ｃ ＣｏｒｄとＦｒｒｄｏｖｒｃｈの方法（ＪＢＣ２４
，４６０４９（１９６９））に準じて行った。即ち、キ
サンチンオキシダーゼのキサンチンを基質とした酵素反
応により生じたスーパーオキシドイオン（０″２）の酸
化型チトクロームＣの還元作用をＳＯＤ が阻害するこ
とを利用する方法で波長５５０ｎｍに於ける時間的変化
によりＳＯＤ活性を測定した。
この方法では、ＳＯＤ活性が強いと吸収変化が弱くなる
。
。
また、試料中のタンパク質の定量には、牛の血清アルブ
ミンを標準としてＬｏｗｒｙらの方法（ＪＢＣよヱ３
２６５（１９５１））に準じて行った。
ミンを標準としてＬｏｗｒｙらの方法（ＪＢＣよヱ３
２６５（１９５１））に準じて行った。
即ち、リンモリブデン酸とリンタングステン酸よりなる
フェノール試薬によりタンパク質巾のチロシン、トリプ
トファンおよびシスティンを還元呈色させる反応と、ア
ルカリ性でＣｕ がプロトンを失なったタンパク質鎖
中の窒素原子と結合して錯体を形成して発色するビユレ
ット反応ヲ組み合せてタンパク質の含量を定量する方法
である。定量に当っては、牛の血清アルブミンを標準と
して検量線を作成し、これとの比としてタンパク量を表
示する。
フェノール試薬によりタンパク質巾のチロシン、トリプ
トファンおよびシスティンを還元呈色させる反応と、ア
ルカリ性でＣｕ がプロトンを失なったタンパク質鎖
中の窒素原子と結合して錯体を形成して発色するビユレ
ット反応ヲ組み合せてタンパク質の含量を定量する方法
である。定量に当っては、牛の血清アルブミンを標準と
して検量線を作成し、これとの比としてタンパク量を表
示する。
（３）実験結果
結果を第−表に示す。
この表から明らかなように対照法であるＢ、Ｃでは回収
率７０％前後、比活性４００単位／ ｍｑタンパク程度
であるのに対し、本発明方法であるＡでは回収率８７％
、比活性８００単位／ ｍｇタンパクと回収率で２割匁
上、比活性でほぼ２倍もの改善がみられた。
率７０％前後、比活性４００単位／ ｍｑタンパク程度
であるのに対し、本発明方法であるＡでは回収率８７％
、比活性８００単位／ ｍｇタンパクと回収率で２割匁
上、比活性でほぼ２倍もの改善がみられた。
このように本発明方法は高品位のＣｕ −Ｚｎ −性ハ
イボーラスポリマー系樹脂は通常の方法により再生され
、しかも再生されたものは新品と同等のＣｕ−Ｚｎ−８
ＯＤ吸着能を有しているので、半永久的に再生使用でき
、極めて経済的である。
イボーラスポリマー系樹脂は通常の方法により再生され
、しかも再生されたものは新品と同等のＣｕ−Ｚｎ−８
ＯＤ吸着能を有しているので、半永久的に再生使用でき
、極めて経済的である。
次に本発明方法を実施例によりさらに具体的に説明する
。
。
実施例Ｉ。
新鮮なヒト胎盤３０個を、血液を除去することなしに、
胎盤の重量の２．５倍容の１．１５％塩化カリウム溶液
又は０９％塩化ナトリウム溶液を加えホモゲナイガーを
使用し十分に組織を破砕した。
胎盤の重量の２．５倍容の１．１５％塩化カリウム溶液
又は０９％塩化ナトリウム溶液を加えホモゲナイガーを
使用し十分に組織を破砕した。
この破砕液を遠心して、固形分を除き、Ｃｕ−Ｚｎ−８
ＯＤを含有する粗抽出液を得た。これを、何ら前処理す
ることなしに直接ダイヤイオン）（Ｐ−２０カラム（１
２ｘ７０ｃｒｎ、 ８−６）を通過させＣｕ−Ｚｎ−１
３− ８ＯＤを吸着させた。０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッフ
ァ −（ｐ！−１５，０） １．６沼でカラムを洗浄後
、さらに水８でで洗浄し、樹脂に吸着している赤色夾雑
物を除去した。溶出は、０．１Ｍグリシン・ナトリウム
バッファーに５０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含むｐＴ
ｌｏ、０の溶出剤により行った。Ｃ［ｌ−Ｚｎ−８ＯＤ
の活性を示す両分は溶出開始後、溶出液の４〜２０１の
間に現われ、溶出液中に回収されるＳＯＤの活性は、こ
の段階で９１％であった。
ＯＤを含有する粗抽出液を得た。これを、何ら前処理す
ることなしに直接ダイヤイオン）（Ｐ−２０カラム（１
２ｘ７０ｃｒｎ、 ８−６）を通過させＣｕ−Ｚｎ−１
３− ８ＯＤを吸着させた。０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッフ
ァ −（ｐ！−１５，０） １．６沼でカラムを洗浄後
、さらに水８でで洗浄し、樹脂に吸着している赤色夾雑
物を除去した。溶出は、０．１Ｍグリシン・ナトリウム
バッファーに５０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含むｐＴ
ｌｏ、０の溶出剤により行った。Ｃ［ｌ−Ｚｎ−８ＯＤ
の活性を示す両分は溶出開始後、溶出液の４〜２０１の
間に現われ、溶出液中に回収されるＳＯＤの活性は、こ
の段階で９１％であった。
さらにこの溶出液をｐＨ７，０に中和し、３０℃に加熱
した浴中で、エバポレーターによりメタノールを除き、
さらに２１まで濃縮した。濃縮液は０．００５Ｍリン酸
バッファー（ｐｌ−１７，５）で十分に透析し平衡化し
た。透析液中に含まれるＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤは２７９６
６００単位有り、抽出液からの回収率は８８％、この工
程による比活性の上昇は約５００倍の６０８単位／ ｍ
ｙ （タンパク質）であった。
した浴中で、エバポレーターによりメタノールを除き、
さらに２１まで濃縮した。濃縮液は０．００５Ｍリン酸
バッファー（ｐｌ−１７，５）で十分に透析し平衡化し
た。透析液中に含まれるＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤは２７９６
６００単位有り、抽出液からの回収率は８８％、この工
程による比活性の上昇は約５００倍の６０８単位／ ｍ
ｙ （タンパク質）であった。
透析された濃縮液は、通常用いられる精製手段によりさ
らに精製され、高度に純化される。即ち、１４− ０．００５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，５）で平衡化
されたＤＥ−５２（商標、ワットマン社製ＤＥＡＥ−セ
Ａ／ＣＩ−ｘ）カラム（２，６Ｘ ４５ｃｒｎ、 ２４
０ｍ１）に吸着し、０．００５Ｍリン酸バッファー（ｐ
Ｈ７，５）で洗浄後、０．０４Ｍの食塩を含有する０、
００５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，５）により溶出し
た。Ｃｕ −Ｚｎ −８ＯＤは大小２つのピークとなっ
て溶出された。
らに精製され、高度に純化される。即ち、１４− ０．００５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，５）で平衡化
されたＤＥ−５２（商標、ワットマン社製ＤＥＡＥ−セ
Ａ／ＣＩ−ｘ）カラム（２，６Ｘ ４５ｃｒｎ、 ２４
０ｍ１）に吸着し、０．００５Ｍリン酸バッファー（ｐ
Ｈ７，５）で洗浄後、０．０４Ｍの食塩を含有する０、
００５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，５）により溶出し
た。Ｃｕ −Ｚｎ −８ＯＤは大小２つのピークとなっ
て溶出された。
この活性ピーク部分を集め、限外瀘過膜により濃アルマ
シア社製）カラム（２，９ｘ １５０ｃｍ、 ｌｚ ）
でゲル沖過精製された。このようにして得られるＣｕ−
Ｚｎ−８ＯＤは極めて純度が高く、その比活性は３５０
０単位／ｒｖ（タンパク質）であった。また以上の全工
程を通して回収されたＣｕ−Ｚｎ −８ＯＤは１６２０
８００単位有り、回収率は５１％であった。
シア社製）カラム（２，９ｘ １５０ｃｍ、 ｌｚ ）
でゲル沖過精製された。このようにして得られるＣｕ−
Ｚｎ−８ＯＤは極めて純度が高く、その比活性は３５０
０単位／ｒｖ（タンパク質）であった。また以上の全工
程を通して回収されたＣｕ−Ｚｎ −８ＯＤは１６２０
８００単位有り、回収率は５１％であった。
実施例２゜
実施例２の操作に従い、カラム洗浄液、溶出溶液、非極
性ハイポーラスポリマー樹脂等を変えた実験を行った。
性ハイポーラスポリマー樹脂等を変えた実験を行った。
即ち、新鮮なヒト胎盤２４個を、血液の除去をすること
なしに、胎盤の重量の２．５倍容の１．１５％塩化カリ
ウム溶液を加え、ホモゲナイザーを使用して十分に組織
を破砕した。この破砕液を遠心して固形分を除き、３３
．６−ｅのＣｕ・Ｚｎ−８０Ｄを含有する粗抽出液を得
た。この粗抽出液２．８４（胎盤２個分に相当）を用い
、種々の非極性ハイポーラスポリマー樹脂５００ ｍｌ
をつめたカラム（４，Ｏｃｍ ｘ ４０ ｃｍ ）に吸
着し、実施例２の手法に従ってＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤの精
製を行った。カラム洗浄液および溶出溶液等の条件、得
られたＣｕ・７、ｎ−８ＯＤの活性、粗抽出液からの回
収率、比活性は、第２表のとおりである。
なしに、胎盤の重量の２．５倍容の１．１５％塩化カリ
ウム溶液を加え、ホモゲナイザーを使用して十分に組織
を破砕した。この破砕液を遠心して固形分を除き、３３
．６−ｅのＣｕ・Ｚｎ−８０Ｄを含有する粗抽出液を得
た。この粗抽出液２．８４（胎盤２個分に相当）を用い
、種々の非極性ハイポーラスポリマー樹脂５００ ｍｌ
をつめたカラム（４，Ｏｃｍ ｘ ４０ ｃｍ ）に吸
着し、実施例２の手法に従ってＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤの精
製を行った。カラム洗浄液および溶出溶液等の条件、得
られたＣｕ・７、ｎ−８ＯＤの活性、粗抽出液からの回
収率、比活性は、第２表のとおりである。
１７−
実施例３゜
新鮮なヒト胎盤２個を１．１５％塩化カリウム溶液で十
分に血液を洗浄除去後、胎盤の重量の２．５倍容の同上
溶液を加えてホモゲナイザーにより十分に組織を破砕し
、固形分を遠心除去した。上清液を何ら処理することな
しにその一１１ダイヤイオ７）（Ｐ−２０カラム（２，
７Ｘ ３５１：ｒｎ、 ２００ｍＡりに通導することに
よりＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤを吸着した。カラムは、０．０
５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５，０）４００
ｍｌで洗浄し、さらに水２００ ｍｌで洗浄後、０．１
Ｍグリシン−ナトリウムバッファーに５０％（Ｖ／Ｖ
）のメタノールを含むｐＨ１０，０の溶出剤により溶出
した。Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤは単１ピークとなって溶出さ
れ、溶出開始から１００ｍＩ！〜５００ ｍｌの中にほ
ぼ全てのＳＯＤ活性が含まれていた。回収されるＣｕ−
Ｚｎ−８ＯＤの活性は、９７５５０単位でありＣｕ−Ｚ
ｎ−８ＯＤ粗抽出液からの収率は８８％であった。溶出
液の本工程以降の精製法は、ＤＥ−５２樹脂の代わり、
Ｄ Ｅ Ａ Ｅ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ （東洋ソーダ社
製）を使用する以外全〈実施例２と同様の操作であり、
１８− 全工程を通して回収される（５７−Ｚｎ−８ＯＤは５２
１．００単位、４７％、比活性は３４５０単位／ｍ９（
タンパク質）であった。なお本実施例で、胎盤を脱血せ
ずＣｕ・Ｚｎ−８ＯＤを抽出した実施例１より収量及び
収率が低下している原因は、脱血することにより胎盤に
含寸れる赤血球部分のＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤが失なわれる
ことによる。
分に血液を洗浄除去後、胎盤の重量の２．５倍容の同上
溶液を加えてホモゲナイザーにより十分に組織を破砕し
、固形分を遠心除去した。上清液を何ら処理することな
しにその一１１ダイヤイオ７）（Ｐ−２０カラム（２，
７Ｘ ３５１：ｒｎ、 ２００ｍＡりに通導することに
よりＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤを吸着した。カラムは、０．０
５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５，０）４００
ｍｌで洗浄し、さらに水２００ ｍｌで洗浄後、０．１
Ｍグリシン−ナトリウムバッファーに５０％（Ｖ／Ｖ
）のメタノールを含むｐＨ１０，０の溶出剤により溶出
した。Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤは単１ピークとなって溶出さ
れ、溶出開始から１００ｍＩ！〜５００ ｍｌの中にほ
ぼ全てのＳＯＤ活性が含まれていた。回収されるＣｕ−
Ｚｎ−８ＯＤの活性は、９７５５０単位でありＣｕ−Ｚ
ｎ−８ＯＤ粗抽出液からの収率は８８％であった。溶出
液の本工程以降の精製法は、ＤＥ−５２樹脂の代わり、
Ｄ Ｅ Ａ Ｅ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ （東洋ソーダ社
製）を使用する以外全〈実施例２と同様の操作であり、
１８− 全工程を通して回収される（５７−Ｚｎ−８ＯＤは５２
１．００単位、４７％、比活性は３４５０単位／ｍ９（
タンパク質）であった。なお本実施例で、胎盤を脱血せ
ずＣｕ・Ｚｎ−８ＯＤを抽出した実施例１より収量及び
収率が低下している原因は、脱血することにより胎盤に
含寸れる赤血球部分のＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤが失なわれる
ことによる。
実施例４゜
牛の肝臓ｌ ｋｙを１．１５％塩化カリウム溶液で洗浄
し、肝臓重量の５倍容の同上溶液を加え、ホモゲナイザ
ーを用いて十分に組織の細胞を破砕した。
し、肝臓重量の５倍容の同上溶液を加え、ホモゲナイザ
ーを用いて十分に組織の細胞を破砕した。
遠心により、破砕液中の不溶性の固形分は除去し、Ｃｕ
Ｚｎ−８ＯＤを含む粗抽出液を得た。この液は、さらに
°処理することなしに、ダイヤイオンＩ−Ｉ Ｐ −２
０カラム（６，５ｘ６０Ｃｒｎ、 ２Ｊ１３ ）に通導
され、０．０５Ｍ酢酸す） ＩＪウムバッファ−４，、
ｅ３で洗浄後さらに水１．８で洗浄した。この吸着・洗
浄工程を通じて、ＳＯＤ活性の１３係の洩れが見られた
。溶出は０．１ Ｍグリシン−ナトリウムバッファーの
５０％（ｖ／ｖ ）メタノール溶液（ｐＨ１０，０）に
より行った。ＳＯＤの活性は溶出開始後０４５〜４１の
溶出液中に集まり、回収されるＳＯＤの活性は１６８０
０００単位で、抽出液からの収率は８０％であった。Ｃ
ｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含有する溶出液は、実施例２のごと
くさらに精製操作を経て、純粋なＣｕ・Ｚｎ−８ＯＤと
なる。
Ｚｎ−８ＯＤを含む粗抽出液を得た。この液は、さらに
°処理することなしに、ダイヤイオンＩ−Ｉ Ｐ −２
０カラム（６，５ｘ６０Ｃｒｎ、 ２Ｊ１３ ）に通導
され、０．０５Ｍ酢酸す） ＩＪウムバッファ−４，、
ｅ３で洗浄後さらに水１．８で洗浄した。この吸着・洗
浄工程を通じて、ＳＯＤ活性の１３係の洩れが見られた
。溶出は０．１ Ｍグリシン−ナトリウムバッファーの
５０％（ｖ／ｖ ）メタノール溶液（ｐＨ１０，０）に
より行った。ＳＯＤの活性は溶出開始後０４５〜４１の
溶出液中に集まり、回収されるＳＯＤの活性は１６８０
０００単位で、抽出液からの収率は８０％であった。Ｃ
ｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含有する溶出液は、実施例２のごと
くさらに精製操作を経て、純粋なＣｕ・Ｚｎ−８ＯＤと
なる。
実施例５
パン酵母１ ｋｇを２倍容の０．０２ＭＩＪン酸バッフ
ァー（ｐｒ−１７，Ｏ）に懸濁し、冷却下フレンチプレ
スにより、菌体を破砕した。破砕液中の固形分は遠心し
て除去し、Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含有する粗抽出を得た
。この抽出液をさらに処理することなくダイヤイ、ｔ７
１−ＴＰ−２０カラム（２，８ｘ４’Ｏｃｍ、 ２５０
ｍ１３ ）に通導し、Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤを吸着した。
ァー（ｐｒ−１７，Ｏ）に懸濁し、冷却下フレンチプレ
スにより、菌体を破砕した。破砕液中の固形分は遠心し
て除去し、Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤを含有する粗抽出を得た
。この抽出液をさらに処理することなくダイヤイ、ｔ７
１−ＴＰ−２０カラム（２，８ｘ４’Ｏｃｍ、 ２５０
ｍ１３ ）に通導し、Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤを吸着した。
カラムは０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐｒ−
＋ ５．０ ）５００ｍＡで洗浄し、さらに水１００ｍ
１で洗浄後、０．１Ｍグリシン−ナトリウムバッファー
に５０％（ｖ／ｖ ’）のメタノールを含有するｐＴ（
１０，０の溶出剤により溶出した。Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤ
は単一のピークとなって溶出され、溶出開始から１００
ｍ１〜５００ ｍｌの中にほぼ全てのＳＯＤ活−硅゛が
含まれていた。回収されたＣｕ ＃ Ｚｎ Ｓ ＯＤ
の活性は２６６９００単位で、抽出液からの収率は５１
％であった。また、この段階で得られたＣｕ−Ｚｎ−８
ＯＤの比活性は９８０単位／■（タンパク質）であった
。
＋ ５．０ ）５００ｍＡで洗浄し、さらに水１００ｍ
１で洗浄後、０．１Ｍグリシン−ナトリウムバッファー
に５０％（ｖ／ｖ ’）のメタノールを含有するｐＴ（
１０，０の溶出剤により溶出した。Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤ
は単一のピークとなって溶出され、溶出開始から１００
ｍ１〜５００ ｍｌの中にほぼ全てのＳＯＤ活−硅゛が
含まれていた。回収されたＣｕ ＃ Ｚｎ Ｓ ＯＤ
の活性は２６６９００単位で、抽出液からの収率は５１
％であった。また、この段階で得られたＣｕ−Ｚｎ−８
ＯＤの比活性は９８０単位／■（タンパク質）であった
。
特許出願人 日本化薬株式会社
２１−
Claims (1)
- （１）非極性ハイポーラスポリマー系樹脂に不純な銅・
亜鉛スーパーオキシドディスムターゼを含有する溶液を
・接触させた後、該樹脂を洗浄し、次いで該樹脂に吸着
した銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼを溶出す
ることを特徴とする銅・亜鉛スーパーオキシドディスム
ターゼの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20205282A JPS5991881A (ja) | 1982-11-19 | 1982-11-19 | 銅・亜鉛ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20205282A JPS5991881A (ja) | 1982-11-19 | 1982-11-19 | 銅・亜鉛ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5991881A true JPS5991881A (ja) | 1984-05-26 |
| JPH0134033B2 JPH0134033B2 (ja) | 1989-07-17 |
Family
ID=16451136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20205282A Granted JPS5991881A (ja) | 1982-11-19 | 1982-11-19 | 銅・亜鉛ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5991881A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6087300A (en) * | 1998-02-06 | 2000-07-11 | Renal Tech International Llc | Method of producing material for purification of physiological liquids of organism |
-
1982
- 1982-11-19 JP JP20205282A patent/JPS5991881A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6087300A (en) * | 1998-02-06 | 2000-07-11 | Renal Tech International Llc | Method of producing material for purification of physiological liquids of organism |
| US6114466A (en) * | 1998-02-06 | 2000-09-05 | Renal Tech International Llc | Material for purification of physiological liquids of organism |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0134033B2 (ja) | 1989-07-17 |
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