CN114213525B - 一种生长激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生长激素的纯化方法，属于生物医药领域。所述纯化方法包括：取表达生长激素的工程菌的发酵液，离心，收集沉淀物，破碎沉淀物中的工程菌，加提取液混合，微滤，收集滤液，再将滤液超滤，取截留液，将截留液用疏水层析柱层析，收集生长激素。所述纯化方法操作简单，成本低，所得生长激素纯度高，具有良好的产业化前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种生长激素的纯化方法。
背景技术
生长激素(human growth hormone，GH)是由脑垂体前叶特异性细胞分泌的一种单链、非糖基化蛋白激素，它是由191个氨基酸组成，分子量为22kDa，等电点为5.1，链内含有四个半胱氨酸，组成两对二硫键。生长激素是通过血液运输到靶组织，影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统。其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调节蛋白质、糖及脂肪的代谢等，临床上主要用于治疗侏儒症，近年来研究发现生长激素还可治疗烧伤、创伤、骨折、骨质疏松等多种疾病。
现有的人生长激素下游工艺路线是从大肠杆菌中提取出生长激素，经过离子交换层析、疏水层析、分子筛从而获得生长激素。但该纯化方法存在操作复杂，成本高，操作时间长等问题。
因此，仍亟需一种纯化操作简单，纯度高的生长激素纯化方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供以下技术方案。
第一方面，本发明提供一种生长激素的纯化方法。
一种生长激素的纯化方法，其包括：取表达生长激素的工程菌的发酵液，离心，收集沉淀物，破碎沉淀物中的工程菌，加提取液混合，微滤，收集滤液，再将滤液超滤，取截留液，将截留液用疏水层析柱层析，收集生长激素。
所述破碎包括采用冻融或超声进行破碎。在一些实施例中，所述破碎包括采用冻融进行破碎。
所述疏水层析柱的填料为Phenyl HP。在一些实施例中，所述疏水层析柱的填料为GE Phenyl HP。
所述用疏水层析柱层析的洗脱程序包括：平衡层析柱，上样，再用含5mM-20mM磷酸盐和1mol/L-3mol/L钠盐的水溶液冲洗8-10个柱体积，然后分别用不同浓度的钠盐溶液分别进行洗脱；所述不同浓度的钠盐溶液的稀释剂为5mM-20mM磷酸盐水溶液。在一些实施例中，所述用疏水层析柱层析的洗脱程序包括：平衡层析柱，上样，再用含10mM磷酸盐和2.0mol/L钠盐的水溶液冲洗8-10个柱体积，然后分别用不同浓度的钠盐溶液进行洗脱；所述不同浓度的钠盐溶液的稀释剂为10mM磷酸盐水溶液。
所述平衡层析柱为用平衡液平衡8-10个柱体积，流速为5min/CV-20min/CV，所述平衡液为含5mM-20mM磷酸盐和1mol/L-3mol/L钠盐的水溶液。在一些实施例中，所述平衡层析柱为用平衡液平衡8-10个柱体积，流速为5min/CV-20min/CV，所述平衡液为含10mM磷酸盐和2mol/L钠盐的水溶液。
在一些实施例中，所述平衡液中磷酸盐的浓度为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。
在一些实施例中，所述平衡液中钠盐的浓度为1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L或3mol/L。
在一些实施例中，所述流速为8min/CV-12min/CV。在一些实施例中，所述流速为9min/CV、10min/CV、11min/CV或12min/CV。在一些实施例中，所述流速为10min/CV。
所述钠盐包括氯化钠、硫酸钠、碳酸钠中的至少一种。在一些实施例中，所述钠盐为氯化钠。
所述磷酸盐包括磷酸二氢钠，磷酸氢二钠或它们的混合物。
所述不同浓度的钠盐溶液包括0.1mol/L-3.0mol/L浓度范围内的不同浓度的钠盐溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括1.0mol/L-3.0mol/L浓度范围内的不同浓度的钠盐溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括2.0mol/L-3.0mol/L的钠盐溶液，1.5mol/L-1.9mol/L的钠盐溶液和1.0mol/L-1.4mol/L的钠盐溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括2.0mol/L-2.5mol/L的钠盐溶液，1.5mol/L-1.7mol/L的钠盐溶液和1.2mol/L-1.4mol/L的钠盐溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括2.0mol/L-2.2mol/L的钠盐溶液，1.5mol/L-1.7mol/L的钠盐溶液和1.2mol/L-1.4mol/L的钠盐溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括2.0mol/L-3.0mol/L的氯化钠溶液，1.5mol/L-1.9mol/L的氯化钠溶液和1.0mol/L-1.4mol/L的氯化钠溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括2.0mol/L-2.5mol/L的氯化钠溶液，1.5mol/L-1.7mol/L的氯化钠溶液和1.2mol/L-1.4mol/L的氯化钠溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括2.0mol/L-2.2mol/L的氯化钠溶液，1.5mol/L-1.7mol/L的氯化钠溶液和1.2mol/L-1.4mol/L的氯化钠溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括2.0mol/L的钠盐溶液，1.6mol/L的钠盐溶液和1.3mol/L的钠盐溶液。在一些实施例中，所述不同浓度的钠盐溶液包括2.0mol/L的氯化钠溶液，1.6mol/L的氯化钠溶液和1.3mol/L的氯化钠溶液。
所述纯化方法还包括截留液在用疏水层析柱层析前，先在截留液中加入钠盐，调节pH为6.0-8.0，再用0.2μm-0.5μm的滤膜过滤。在一些实施例中，所述纯化方法还包括截留液在用疏水层析柱层析前，先在截留液中按1.0mol/L-3.0mol/L的浓度加入钠盐，调节pH为6.0-8.0，再用0.2μm-0.5μm的滤膜过滤。在一些实施例中，所述纯化方法还包括截留液在用疏水层析柱层析前，先在截留液中按2.0mol/L-3.0mol/L的浓度加入钠盐，调节pH为6.0-8.0，再用0.2μm-0.5μm的滤膜过滤。
在一些实施例中，所述调节pH为调节pH至6.0-7.0。在一些实施例中，所述调节pH为调节pH至6.0-6.5。在一些实施例中，所述调节pH为调节pH至6.0、6.5或7.0。
在一些实施例中，所述滤膜为0.22μm-0.45μm的滤膜。
所述提取液包括缓冲盐溶液或含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液。在一些实施例中，所述提取液为缓冲盐溶液。在一些实施例中，所述提取液为含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液。
所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，甘氨酸的含量可以为10mmol/L-200mmol/L。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，甘氨酸的含量为50mmol/L-150mmol/L。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，甘氨酸的含量为80mmol/L-120mmol/L。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，甘氨酸的含量为50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、95mmol/L、100mmol/L、105mmol/L、110mmol/L或120mmol/L。
所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，依地酸二钠的含量可以为0.1mmol/L-5mmol/L。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，依地酸二钠的含量为0.5mmol/L-3mmol/L。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，依地酸二钠的含量为0.5mmol/L-2mmol/L。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，依地酸二钠的含量为0.8mmol/L-1.5mmol/L。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液中，依地酸二钠的含量为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L或1.5mmol/L。
所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液的pH可以为6.0-8.0。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液的pH为6.5-7.5。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液的pH为6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。在一些实施例中，所述含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液的pH为7.0。
所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度可以为5mmol/L-50mmol/L。在一些实施例中，所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为5mmol/L-40mmol/L。在一些实施例中，所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为10mmol/L-30mmol/L。在一些实施例中，所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为10mmol/L-20mmol/L。在一些实施例中，所述缓冲盐溶液中缓冲盐的浓度为10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L或50mmol/L。
所述缓冲盐溶液包括磷酸盐缓冲水溶液、柠檬酸盐缓冲水溶液、Tris-base缓冲液中的至少一种。
所述磷酸盐缓冲水溶液中的磷酸盐包括选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种。
所述柠檬酸盐缓冲水溶液包含柠檬酸和柠檬酸钠。
所述沉淀物与提取液的质量比为1∶5～1∶20。在一些实施例中，所述沉淀物与提取液的质量比为1∶10～1∶15。
所述冻融包括冷冻和解冻。
所述冷冻所采用的温度为-80℃～-20℃。在一些实施例中，所述冷冻所采用的温度为-60℃～-20℃。在一些实施例中，所述冷冻所采用的温度为-50℃～-20℃。在一些实施例中，所述冷冻所采用的温度为-40℃～-20℃。在一些实施例中，所述冷冻所采用的温度为-30℃～-20℃。
所述冷冻的时间为20h～40h。在一些实施例中，所述冷冻的时间为24h～36h。
所述解冻所采用的温度为10℃～30℃。在一些实施例中，所述解冻所采用的温度为20℃～25℃。
所述解冻的时间为10h～40h。在一些实施例中，所述解冻的时间为10h～30h。在一些实施例中，所述解冻的时间为10h～20h。在一些实施例中，所述解冻的时间为10h～15h。在一些实施例中，所述解冻的时间为10h～12h。
所述微滤采用500kDa～2000kDa中空纤维膜进行微滤。在一些实施例中，所述微滤采用1000kDa～2000kDa中空纤维膜进行微滤。
所述超滤选用5kDa～10kDa的中空纤维膜或者5kDa～10kDa的膜包进行超滤。在一些实施例中，所述超滤选用7kDa～10kDa的中空纤维膜或者7kDa～10kDa的膜包进行超滤。在一些实施例中，所述超滤选用7kDa、8kDa、9kDa或10kDa的中空纤维膜或者7kDa、8kDa、9kDa或10kDa的膜包进行超滤。
所述收集生长激素包括在生长激素峰吸收值达到0.5AU时开始收集，降低至0.5AU时停止收集。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述纯化方法所得的生长激素。
一种第一方面所述纯化方法所得的生长激素。所述生长激素的纯度可达95％以上。
有益效果
相比现有技术，本发明至少具有包括以下有益技术效果中的一种：
(1)本发明通过采用疏水层析，尤其是采用phenyl HP填料的疏水层析柱，使得生长激素的纯化方法的层析方法只需要一次层析便可得到高纯度的生长激素，大大简化了操作步骤，大大降低了操作时间和纯化成本，有利于产业化生产。
(2)本发明通过采用疏水层析，尤其是采用phenyl HP填料的疏水层析柱，在简化操作步骤的基础上，相比其他一步层析或多步层析的方法，还能得到更高纯度的生长激素。
(3)本发明工艺稳定，有利于产业化的大规模生产。
(4)本发明大大简化了操作步骤，大大减少由于操作步骤多而引起的收率降低的情况，大大提高所得生长激素的收率。
(5)相比其他类型的层析柱(如Q离子交换柱或CaptureSelect Human GrowthHormone Affinity Matrix(Thermo)柱)，本发明所提供的phenyl HP填料的疏水层析柱，具有成本低，使用寿命长等优点；而Q离子交换柱容易吸附色素，其使用寿命比phenyl HP填料的疏水层析柱短。
(6)采用微滤步骤，相比离心，可降低操作难度，降低成本(离心机价格高昂)。
(7)相比采用其他的层析洗脱程序(例如：1)先用200mM NaCl的Tris·HCl(pH9.0，20mM)洗涤2-3倍柱体积，再用2倍柱体积的500mM NaCl的Tris·HCI(pH9.0，20mM)进行洗脱；或者2)采用0.1M甘氨酸溶液(pH3.0)洗脱5CV)，采用本发明所提供的洗脱程序能提高生长激素的纯度。
附图说明
图1为实施例1纯化后的人生长激素的纯度检测结果图。
图2为实施例2纯化后的人生长激素的纯度检测结果图。
图3为实施例3纯化后的人生长激素的纯度检测结果图。
图4为对比例1纯化后的人生长激素的纯度检测结果图。
术语定义：
在本发明的上文中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字，每一个数字的数值有可能会出现+10％以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异，如+1％、±2％、±3％、±4％或±5％的差异。
术语“CV”表示柱体积。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例以对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本发明中，术语“mM”表示毫摩尔每升；“W：W”表示质量比，“h”表示小时，“μm”表示微米；“mol/L”表示摩尔每升；“kDa”表示分子量单位千道尔顿。“PB”表示“phosphatebuffer solution(磷酸缓冲液)”；“PBS”表示“phosphate buffered saline(磷酸缓冲盐溶液)”
实施例1：
人生长激素重组大肠杆菌发酵结束后，通过离心的方式收集沉淀物(即菌泥)，放在-20℃冰箱中24h，然后放在20～25℃下12h进行解冻。按照菌泥∶提取液＝1∶14(W∶W)加入提取液，提取液为pH7.0的含100mM甘氨酸和1mM依地酸二钠的水溶液。经过1000kDa中空纤维膜进行微滤，然后将微滤所得滤液通过10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得截留液。截留液中按2.0mol/L的浓度加入氯化钠，调节pH为6.0～6.5，0.45μm滤膜过滤。将填料为PhenylHP的疏水层析柱先用平衡液(含10mM磷酸二氢钠和2.0mol/L氯化钠的水溶液)冲洗8～10个CV，流速10min/cv，然后上样，上样结束后，用平衡液(含10mM磷酸二氢钠和2mol/L氯化钠的水溶液)冲洗8～10个CV，用含10mM磷酸二氢钠和1.8mol/L氯化钠的水溶液冲洗5个CV(用于洗脱杂质)，再用含10mM磷酸二氢钠和1.6mol/L氯化钠的水溶液冲洗5个CV(用于洗脱杂质)，用洗脱液含10mM磷酸二氢钠和1.3mol/L氯化钠的水溶液洗脱(用于洗脱人生长激素)，人生长激素峰吸收值达到0.5AU时开始收集，降低至0.5AU时停止收集。通过反相高效液相色谱法的检测方法得出，所得人生长激素的纯度为95％以上。
实施例2
人生长激素重组大肠杆菌发酵结束后，通过离心的方式收集沉淀物(即菌泥)，放在-50℃冰箱中36h，然后放在20～25℃下14h进行解冻。按照菌泥∶提取液＝1∶10(W∶W)加入提取液，提取液为5mmol/L的磷酸二氢钠水溶液。经过1000kDa中空纤维膜进行微滤，然后将微滤所得滤液通过10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得截留液。截留液中按2.5mol/L的浓度加入氯化钠，调节pH为6.0～6.5，0.45μm滤膜过滤。将填料为Phenyl HP的疏水层析柱先用平衡液(含10mM磷酸氢二钠和2.0mol/L氯化钠的水溶液)冲洗8～10个CV，流速10min/cv，然后上样，上样结束后，用平衡液10mM PB+2.5mol/L氯化钠冲洗8～10个CV，用含10mM磷酸氢二钠和1.8mol/L氯化钠的水溶液冲洗5个CV(用于洗脱杂质)，再用含10mM磷磷酸氢二钠和1.6mol/L氯化钠的水溶液冲洗5个CV(用于洗脱杂质)，用含10mM磷酸氢二钠和1.3mol/L氯化钠的水溶液洗脱(用于洗脱人生长激素)，人生长激素峰吸收值达到0.5AU时开始收集，降低至0.5AU时停止收集。通过反相高效液相色谱法的检测方法得出，所得人生长激素的纯度为95％以上。
实施例3
人生长激素重组大肠杆菌发酵结束后，通过离心的方式收集沉淀物(即菌泥)，放在-80℃冰箱中30h，然后放在20～25℃下16h进行解冻。按照菌泥：提取液＝1：20(W：W)加入提取液，提取液为50mmol/L的磷酸二氢钠水溶液。经过500kDa中空纤维膜进行微滤，然后将微滤所得滤液通过10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得截留液。截留液按3.0mol/L的浓度加入氯化钠，调节pH为6.0～6.5，0.22μm滤膜过滤。将填料为Phenyl HP的疏水层析柱先用平衡液(含10mM磷酸氢二钠和3.0mol/L氯化钠的水溶液)冲洗8～10个CV，流速10min/cv，然后上样，上样结束后，用平衡液(含10mM磷酸氢二钠和2.0mol/L氯化钠的水溶液)冲洗8～10个CV，用含10mM磷酸氢二钠和1.8mol/L氯化钠的水溶液冲洗5个CV(用于洗脱杂质)，再用含10mM磷酸氢二钠和1.6mol/L氯化钠的水溶液冲洗5个CV(用于洗脱杂质)，用含10mM磷酸氢二钠和1.3mol/L氯化钠的水溶液洗脱(用于洗脱人生长激素)，人生长激素峰吸收值达到0.5AU时开始收集，降低至0.5AU时停止收集。通过反相高效液相色谱法的检测方法得出，所得人生长激素的纯度为95％以上。
对比例1：采用“菌泥冻融-菌泥提取-微滤-超滤-Q30L-Butyl HP-DEAE”的纯化方法
菌泥冻融-菌泥提取-微滤-超滤-Q30L-Butyl HP--DEAE，反相测得出样品的纯度为84.44％。
人生长激素重组大肠杆菌发酵结束后，通过离心的方式收集沉淀物(即菌泥)，放在-20℃冰箱中30h，然后放在20～25℃下16h进行解冻。按照菌泥∶提取液＝1∶20(W∶W)加入提取液，提取液为pH7.0的含100mM甘氨酸和1mM依地酸二钠的水溶液。经过1000kDa中空纤维膜进行微滤，然后将微滤所得滤液通过10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得截留液。Q30L层析柱用pH6.0-7.0的10mM PB平衡10CV，然后上样，上样结束后用pH6.0-7.0的10mM PB冲洗5CV，用pH6.0-7.0的含10mM PB和0.3M氯化钠的水溶液洗脱，收集洗脱峰。把Q30L收集样品按3.0mol/L的浓度加入氯化钠，调节pH为6.0～6.5，0.22μm滤膜过滤。疏水层析柱Butyl HP先用平衡液含10mM磷酸氢二钠和3.0mol/L氯化钠的水溶液冲洗8～10个CV，流速10min/cv，然后上样，上样结束后，用含10mM磷酸氢二钠和2.0mol/L氯化钠的水溶液冲洗8～10个CV，用含10mM磷酸氢二钠和1.8mol/L氯化钠的水溶液冲洗5个CV(用于洗脱杂质)，用含10mM磷酸氢二钠和1.3mol/L氯化钠的水溶液洗脱(用于洗脱人生长激素)，人生长激素峰吸收值达到0.5AU时开始收集，降低至0.05AU时停止收集。通过反相高效液相色谱法的检测方法得出，所得人生长激素的纯度为84.44％。
对比例2：采用“菌泥冻融-菌泥提取-微滤-超滤-羟基磷硅石CHT层析”的纯化方法
人生长激素重组大肠杆菌发酵结束后，通过离心的方式收集沉淀物(即菌泥)，放在-20℃冰箱中24h，然后放在20～25℃下12h进行解冻。按照菌泥∶提取液＝1∶14(W∶W)加入提取液，提取液为pH7.0的含100mM甘氨酸和1mM依地酸二钠的水溶液。经过1000kDa中空纤维膜进行微滤，然后将微滤所得滤液通过10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得截留液。将截留液按以下层析方法进行层析：
羟基磷硅石CHT层析
层析介质：CHT Ceramic
缓冲液：溶液A：PB(PH7.4，2mM磷酸二氢钠)
溶液B：PB(PH7.4，100mM磷酸二氢钠)
上样：将截留液上样。
清洗：上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。
梯度：清洗后用20CV将溶液B从0％升至100％。
收集：收集人生长激素样品峰。
取所得人生长激素，通过反相高效液相色谱法的检测方法进行检测，所得人生长激素的纯度为88.91％。
对比例3：采用“菌泥冻融-菌泥提取-微滤-超滤-复合填料层析MMC”的纯化方法
人生长激素重组大肠杆菌发酵结束后，通过离心的方式收集沉淀物(即菌泥)，放在-20℃冰箱中24h，然后放在20～25℃℃下12h进行解冻。按照菌泥∶提取液＝1∶14(W∶W)加入提取液，提取液为pH7.0的含100mM甘氨酸和1mM依地酸二钠的水溶液。经过1000kDa中空纤维膜进行微滤，然后将微滤所得滤液通过10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得截留液。将截留液按以下层析方法进行层析：
复合填料层析
层析介质Diamond MMC
缓冲液：溶液A：PBS(PH7.4，20mM)
溶液B：PBS(pH7.4，20mM)+1M NaCl
上样：将截留液上样。
清洗：上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。
梯度：清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。
收集：收集rhGH(人生长激素)样品峰。
取所得人生长激素，通过反相高效液相色谱法的检测方法进行检测，所得人生长激素的纯度为92.28％。
对比例4：采用“菌泥冻融-菌泥提取-微滤-超滤-阴离子层析”的纯化方法
人生长激素重组大肠杆菌发酵结束后，通过离心的方式收集沉淀物(即菌泥)，放在-20℃冰箱中24h，然后放在20～25℃下12h进行解冻。按照菌泥∶提取液＝1∶14(W∶W)加入提取液，提取液为pH7.0的含100mM甘氨酸和1mM依地酸二钠的水溶液。经过1000kDa中空纤维膜进行微滤，然后将微滤所得滤液通过10kDa的超滤膜进行超滤浓缩，得截留液。将截留液按以下层析方法进行层析并收集人生长激素：
阴离子层析
层析介质：QBestarose HP
缓冲液：溶液A：PB(PH7.4，20mM)
溶液B：PB(pH7.4，20mM)+1M NaCl
上样：将截留液上样。
清洗：上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。
梯度：清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。
收集：收集rhGH样品峰。
取所得人生长激素，通过反相高效液相色谱法的检测方法进行检测，所得人生长激素的纯度为92.28％。
结论：由上述实施例和对比例可知，相比其他多步层析或其他类型的单步层析方法，采用本发明所提供的纯化方法，尤其是采用填料为Phenyl HP的疏水层析柱进行层析的纯化方法，层析步骤只需要一步层析即可得到高纯度的生长激素，可大大减少操作步骤，提高所得生长激素的纯度，大大降低了操作时间和纯化成本，有利于产业化生产。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
Claims (7)
1.一种生长激素的纯化方法，其包括：取表达人生长激素的大肠杆菌的发酵液，离心，收集沉淀物，破碎沉淀物中的工程菌，加提取液混合，微滤，收集滤液，再将滤液超滤，取截留液，将截留液用疏水层析柱层析，收集生长激素；
所述疏水层析柱的填料为Phenyl HP；
所述用疏水层析柱层析的洗脱程序包括：平衡层析柱，上样，再用含10mM磷酸盐和2.0mol/L氯化钠的水溶液冲洗8-10个柱体积，然后分别用含10mM磷酸盐和1.8mol/L氯化钠的水溶液、含10mM磷酸盐和1.6mol/L氯化钠的水溶液、含10mM磷酸盐和1.3mol/L氯化钠的水溶液依次进行洗脱；
所述平衡层析柱为用平衡液平衡8-10个柱体积，流速为5-20分钟/柱体积，所述平衡液为含10mM磷酸盐和2mol/L氯化钠的水溶液；
所述磷酸盐为磷酸二氢钠或者磷酸氢二钠；
所述纯化方法还包括截留液在用疏水层析柱层析前，先在截留液中加入氯化钠，调节pH为6.0-6.5，再用0.2μm-0.5μm滤膜过滤；
所述微滤采用500kDa～1000kDa中空纤维膜进行微滤；
所述超滤采用7kDa-10kDa的中空纤维膜。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，所述破碎包括采用冻融或超声进行破碎。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，所述提取液包括缓冲盐溶液或含甘氨酸和依地酸二钠的水溶液。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，所述缓冲盐溶液包括磷酸盐缓冲水溶液、柠檬酸盐缓冲水溶液、Tris-base缓冲液中的至少一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的纯化方法，所述沉淀物与提取液的质量比为1∶5～1∶20。
6.根据权利要求2所述的纯化方法，所述冻融包括冷冻和解冻；冷冻所采用的温度为-80℃～-20℃；所述冷冻的时间为20h～40h；所述解冻所采用的温度为10℃～30℃；所述解冻的时间为10h～40h。
7.根据权利要求1-4、6任一项所述的纯化方法，所述收集生长激素包括在生长激素峰吸收值达到0.5AU时开始收集，降低至0.5AU时停止收集。
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| GR01 | Patent grant |