KR20230078748A

KR20230078748A - 항체 정제 공정에서의 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법 및 감소된 숙주 세포 단백질 함량을 가지는 항체 조성물

Info

Publication number: KR20230078748A
Application number: KR1020237014350A
Authority: KR
Inventors: 브라이언 데이비드 보우즈; 라라 엘렌 크렙스; 사라 엠. 리처; 리후아 후앙; 스티븐 에이. 플리치타
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2020-10-02
Filing date: 2021-10-04
Publication date: 2023-06-02
Also published as: EP4222159A1; CL2023000961A1; WO2022072934A1; JP2023545019A; BR112023004871A2; ECSP23024034A; CN116348486A; AU2021355521A1; AU2021355518A1; CA3193722A1; MX2023003863A; US20230406914A1; CO2023004265A2; AU2021355518A9; KR20230061462A; PE20231507A1; AR123688A1; MX2023003836A; EP4222160A1; CN116547292A

Abstract

본 개시내용은 환자에 대한 투여가 의도되는 항체의 제조 공정에서 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 개시된 방법은 감소된 숙주 세포 단백질을 가지는 치료 항체 조제물을 제조하기 위해 수행될 수 있다.

Description

항체 정제 공정에서의 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법 및 감소된 숙주 세포 단백질 함량을 가지는 항체 조성물

본 발명은 재조합 단백질 제조 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 치료 또는 진단용 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 같이 환자에 대한 투여가 의도되는 단백질 제조 공정에서 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 개시된 방법은 감소된 숙주 세포 단백질 함량을 가지는 항체 조성물을 제조하기 위해 수행될 수 있다.

숙주 세포 단백질 (HCP)은 세포 유지 및 성장, 그리고 단백질 합성 및 프로세싱과 연관되어 있는 숙주 세포의 단백질들이다. 그러나, 치료 또는 진단용 단백질의 범주에서, HCP의 존재는 응집, 촉매활성에 의한 생성물 단편화 및/또는 면역원성과 같은 우려를 낳음으로써, 생성물 품질 및 환자 안전성을 위협한다. 이에 따라, HCP는 단백질 제제의 중요 품질 속성 (CQA)으로 취급되고 있다. 원치않는 응집물의 형성 및 생성물 단편화는 HCP를 감소/제거하기 위한 추가적인 정제 단계를 요구하고, 이러한 추가적인 정제 단계는 종종 원하는 단백질의 수율 감소 및 전체적인 제조 비용의 증가를 발생시킨다.

제조 공정에서 HCP를 제거한다는 과제 및 HCP의 감소 과정을 개선하기 위한 시도에 대해서는 예를 들면 문헌 [Gilgunn et al.]; [Goey et al., Biotechnology Advances 36 (2018) 1223-1237]; 및 [Current Opinion in Chemical Engineering 2018, 22:98-106]에 제시되어 있는 바와 같이 개시되어 있다. 그러나, HCP를 제거하기 위한 이러한 과정들은 한계를 가지고 있다. 예를 들어 일부 경우에서, 이들 개시내용은 HCP의 불완전한 제거, 응집물로 이어지는 HCP 제거 과정에서의 모순, 원하는 단백질과 HCP의 공동-정제, 생성물 기능의 손상, 환자에서의 면역원성 우려, 및/또는 반감기와 같은 약동학적 특성의 감소 중 1종 이상을 나타내고 있다. 또한, HCP를 제거하기 위해 개발된 과정들은 종종 예를 들면 증가된 부피 및 추가적인 정제 단계를 사용하여 작업할 필요성을 요구함으로써, 종종 제조 비용의 증가 및 수율 감소를 발생시킨다. 일부 경우에서는, 특정 분자 및/또는 체계로 방법의 적용성이 제한된다. 이에 따라, 치료 또는 진단용 단백질의 정제 공정에서 HCP를 감소시키는 대안적인 방법에 대한 필요성이 남아 있다. 그와 같은 대안적인 방법은 바람직하게는 생성물 안정성, 수율 또는 비용에 영향을 주지 않으면서 HCP를 감소시킴으로써, 궁극적으로 생성물 품질을 유지하고, 대규모 제조에 적합하고, 환자의 안전성을 보장한다.

이에 따라, 본 발명은 치료 또는 진단용 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조에서 HCP를 감소시키는 대안적인 방법을 제공하는 것에 의해 상기 문제점들 중 1종 이상을 해소한다. 본 발명의 방법은 항체 안정성을 보존하고 응집을 감소시키며 생성물 수율을 유지하면서 HCP를 제거하는 데에 있어서 고도로 효과적이고, 면역원성의 위험성을 낮추는 잠재력을 가지고 있는 재현가능한 방법을 제공한다. 그와 같은 방법은 증가된 항체 조제물 부피를 필요로 하지 않으면서도 HCP를 효과적으로 제거할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 방법은 < 100 ppm인 산업상 허용가능한 표준 훨씬 아래의 HCP 계수를 달성하였다. 놀랍게도, 본 발명의 다른 실시양태는 단백질 안정성을 보존하고 응집을 감소시키며 생성물 수율을 유지하면서도 < 50 ppm의 HCP 계수를 달성하였다. 더욱 놀랍게도, 본 발명의 다른 실시양태는 단백질 안정성을 보존하고 응집을 감소시키며 생성물 수율을 유지하면서도 < 20 ppm, < 10 ppm, < 5 ppm, < 1 ppm 또는 ~0 ppm의 HCP 계수를 달성하였다. 또한, 본 발명의 실시양태는 광범위한 분자에 적용가능한 HCP 제거 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 추가적인 정제 단계의 배제를 가능하게 함으로써, 배치 처리 시간의 감소 및 제조 비용의 감소를 발생시킨다. 개시되는 방법은 항체 조성물의 숙주 세포 함량이 < 100 ppm, < 50 ppm, < 10 ppm, < 5 ppm, < 1 ppm 미만 또는 ~0 ppm인, 감소된 숙주 세포 함량을 가지는 항체 조성물을 제조하기 위해 수행될 수 있다.

이에 따라, 항-N3pGlu Aβ 항체 ("항-N3pG 항체") 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 항-N3pG 항체는 중국 햄스터 난소 세포 숙주 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된다.

이에 따라, 특정 실시양태에서, 제공되는 것은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터(depth filter)에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법이다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 이상으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 20 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

이에 따라, 특정 실시양태에서, 제공되는 것은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계, 바이러스 불활성화를 수행하는 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계, 단백질을 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법이다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 이상으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 20 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

이에 따라, 특정 실시양태에서, 제공되는 것은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법이다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 이상으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 20 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 인산이고 아세트산의 농도는 약 20 mM이고 인산의 농도는 약 5 mM 내지 약 10 mM인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 이상으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 20 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 락트산이고 아세트산의 농도는 약 20 mM이고 락트산의 농도는 약 5 mM인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 이상으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 20 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계가 약 20 mM HCl을 용리액에 첨가하는 것을 포함하며 여기서 용리액의 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 조정되고, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 이상으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계가 약 20 mM HCl을 용리액에 첨가하는 것을 포함하며 여기서 용리액의 pH는 약 pH 3.5로 조정되고, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.5로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 이상으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM의 트리스(Tris) 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 것은 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 초과 내지 약 pH 7.5로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 7.0으로 상승시키는 단계, 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5 (예컨대 약 pH 7.0)로 상승시키는 것은 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5 (예컨대 약 pH 7.0)로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 심층 필터에 적용되는 용리액은 약 10 mM 내지 약 45 mM의 이온 강도를 가지는 것인, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며 여기서 상기 약산은 아세트산이고 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되고, 바이러스 불활성화가 달성되는 것인 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며, 여기서 상기 약산은 약 20 mM의 농도로 아세트산을 포함하고 상기 강산은 인산, 포름산 또는 락트산 중 임의의 1종으로 구성되고 여기서 강산의 농도는 약 5 mM 내지 약 10 mM인 단계, 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계가 HCl, 인산, 시트르산, 아세트산 또는 이들의 조합 (예컨대 아세트산 더하기 인산의 조합 또는 아세트산과 시트르산의 조합) 중 임의의 1종을 용리액에 첨가하는 것을 포함하며 여기서 pH는 약 pH 4.0 미만으로 조정되고, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 단계, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계를 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 약 pH 5.0 내지 약 7.5로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다.

바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 감소된다. 더욱 바람직하게는, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm 미만, 약 10 ppm 미만, 약 5 ppm 미만 또는 약 1 ppm 미만으로 감소된다.

다른 실시양태에서, 상기 용리 단계는 아세트산과 인산, 아세트산과 락트산, 또는 아세트산과 포름산 중 임의 1종의 조합으로 구성되는 용리 완충제를 포함하고, 약 pH 4.0 미만으로 pH를 조정하는 단계는 HCl, 인산, 시트르산, 아세트산 또는 이들의 조합 (예컨대 아세트산 더하기 인산의 조합 또는 아세트산과 시트르산의 조합) 중 임의의 1종을 첨가하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 용리 단계는 약 20 mM의 아세트산과 약 10 mM의 인산, 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 인산, 또는 약 20 mM의 아세트산과 약 5 mM의 포름산 중 임의 1종 조합을 포함하는 용리 완충제를 포함하고, 약 pH 4.0 미만으로 pH를 조정하는 단계는 약 20 mM의 HCl, 약 15 mM 내지 약 200 mM의 인산, 약 1000 mM의 시트르산, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 10 mM 인산의 조합 중 임의의 1종을 첨가하는 것을 포함한다. 그와 같은 실시양태들에서, 약 6.0의 pH 초과로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도는 약 10 mM 내지 약 45 mM이다.

본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다:

포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;

약산과 강산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 단계이며, 상기 약산은 아세트산이며 상기 강산은 인산 또는 락트산인 단계;

크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시키는 상기 단계로부터의 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 단계이며, 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 단계;

용리액의 pH를 약 pH 5.0 이상 (예컨대 약 pH 6.0 이상 또는 약 pH 7.0 이상)으로 상승시키는 단계;

항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계; 및

항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계.

본 발명의 다른 실시양태에서는, 하기의 단계들을 포함하는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법이 제공된다:

a) 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;

b) 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시킴으로써 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;

c) 필요한 경우, 용리액의 pH를 pH 5.0 내지 pH 7.5 사이로 조정하고, 용리액을 심층 필터에 적용하고, 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계이며, 여기서 심층 필터는 완전 합성 심층 필터인 단계.

바람직하게는, 상기 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 친화성 크로마토그래피 컬럼을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 심층 필터 세공 크기는 적어도 약 9 μ (마이크로미터) 내지 약 0.1 μ이다. 더욱 더 바람직하게는, 심층 필터 세공 크기는 적어도 약 2 μ 내지 약 0.1 μ이다. 더욱 더 바람직하게는, 심층 필터 세공 크기는 약 0.1 μ이다. 더욱 더 바람직하게는, 심층 필터는 X0SP 필터이다. 본 발명의 대안적인 실시양태에서, 심층 필터 상의 용리액의 pH는 약 5.0이다. 본 발명의 다른 대안적인 실시양태에서, 심층 필터 상의 용리액의 pH는 약 6.0이다. 본 발명의 다른 대안적인 실시양태에서, 심층 필터 상의 용리액의 pH는 약 7.0이다.

이와 같은 특정 실시양태는 비제한적으로 아세트산, 시트르산, 인산, 염산, 포름산 및 락트산을 포함한 임의의 통상적으로 사용되는 약산 또는 강산을 사용하여 항-N3pG 항체가 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리되는 방법을 포괄한다.

5.0 내지 7.0인 필터에서의 용액 pH로의 완전 합성 필터의 사용은 더 통상적인 셀룰로스/규조토-기반 필터와 비교하였을 때 HCP를 감소시키고/거나 제거하는 데에 상당히 효과적인 것으로 밝혀졌다.

개시되는 방법은 항-N3pGlu Aβ 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조제물에서 숙주 세포 단백질 (HCP)을 감소시킴으로써 감소된 HCP 함량을 가지는 항체 조성물을 수득하기 위해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-N3pGlu Aβ 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-N3pGlu Aβ 항체는 IgG1 항체이거나, 또는 IgG1 항체의 Fc 부분을 포함한다. 본원에서 개시되는 것은 항-SARS-COV-2 항체이다.

개시되는 방법 및 개시되는 방법에서 제조되는 조성물의 일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는 도나네맙(donanemab)이다. 일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는

의 아미노산 서열에 존재하는 LH 상보성 결정 영역 1 (LCDR1), LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LH)을 포함하며; 항-N3pG 항체는

의 아미노산 서열에 존재하는 VH 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열식별번호:17)의 LCDR1, AVSKLDS (서열식별번호:18)의 LCDR2, VQGTHYPFT (서열식별번호:19)의 LCDR3, GYDFTRYYIN (서열식별번호:20)의 HCDR1, WINPGSGNTKYNEKFKG (서열식별번호:21)의 HCDR2 및 EGITVY (서열식별번호:22)의 HCDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는

의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (LC) 및

의 아미노산 서열로 구성되는 가변 중쇄 (HC)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는

의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 (LC) 및

의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 (HC)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는

의 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 (LC) 및

의 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 (HC)를 포함한다.

개시되는 방법 및 개시되는 방법에 의해 제조되는 조성물의 일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는 그의 내용이 전체적으로 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 제10,647,759호에서 "항체 201c"로 지칭되는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는 RASQSLGNWLA (서열식별번호: 27)의 LCDR1, YQASTLES (서열식별번호: 28)의 LCDR2, QHYKGSFWT (서열식별번호: 29)의 LCDR3, AASGFTFSSYPMS (서열식별번호: 30)의 HCDR1, AISGSGGSTYYADSVKG (서열식별번호: 31)의 HCDR2 및 AREGGSGSYYNGFDY (서열식별번호: 32)의 HCDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는

아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (VL) 및

의 아미노산 서열로 구성되는 가변 중쇄 (VH)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는

의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 (LC) 및

의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 (HC)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체는

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하고, 심층 여과 후 항-N3pG 항체 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량이 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소되고, 항-N3pG 항체가 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다:

숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼, 예컨대 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;

아세트산과 인산의 조합 또는 아세트산과 락트산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 항-N3pG 항체를 용리시키는 단계;

약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 조정되고 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 유지되는 것인 단계;

약 250 mM 트리스 완충제의 첨가에 의해 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.5로 상승되는 것인 단계;

항-N3pG 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하고, 여과된 항-N3pG 항체 조제물을 수득하는 단계.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 10 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 락트산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pG 항체를 용리시키는 단계, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 저하되고 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM 트리스 완충제의 첨가에 의해 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.5로 상승되는 것인 단계, 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항-N3pG 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 여과된 항-N3pG 항체 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만이고, 항-N3pG 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 것은 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 10 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 락트산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pG 항체를 용리시키는 단계, 약 20 mM의 HCl을 사용하여 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.5로 조정되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.5로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM의 트리스 완충제를 사용하여 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.5로 상승되는 것인 단계, 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항-N3pG 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 여과된 항-N3pG 항체에서의 숙주 세포 단백질 함량은 대략 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만이고, 항-N3pG 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 것은 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 10 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 락트산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pG 항체를 용리시키는 단계, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.5로 저하되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.5로 유지되고, 바이러스 불활성화가 달성되는 것인 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 10 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 락트산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pG 항체를 용리시키는 단계, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 저하되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM의 트리스 완충제를 사용하여 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 7.25로 상승되는 것인 단계, 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항-N3pG 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 항-N3pG 항체 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만이 되고, 항-N3pG 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 7.25로 상승시키는 것은 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물을 단백질 A 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계, 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 인산의 조합을 포함하는 완충제, 또는 약 20 mM 아세트산과 약 5 mM 락트산의 조합을 포함하는 완충제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pG 항체를 용리시키는 단계, 약 20 mM HCl의 첨가에 의해 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 조정하는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 3.5로 저하되고, 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 3.5로 유지되는 것인 단계, 약 250 mM 트리스 완충제의 첨가에 의해 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH를 상승시키는 단계이며, 여기서 pH는 약 pH 7.25로 상승되는 것인 단계, 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액을 심층 필터에 적용하는 단계, 및 여과된 항-N3pG 항체 조제물을 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 항-N3pG 항체 조제물에서의 숙주 세포 단백질 함량은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만이 되고, 항-N3pG 항체는 IgG1 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용리액의 pH를 약 pH 7.25로 상승시키는 것은 약 100 mM 내지 약 1000 mM의 트리스 완충제를 용리액에 첨가하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.

개시되는 방법 및 개시되는 방법에 의해 제조되는 항체 조성물의 일부 실시양태에서, 항체는 갑작스런 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질에 대한 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-SARS-CoV-2 항체는 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된다. 적합한 항-SARS-CoV-2 항체에는 밤라니비맙(bamlanivimab), 에테세비맙(etesevimab) 및 벱텔로비맙(bebtelovimab)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 항-SARS-CoV-2 항체는 밤라니비맙이다. 일부 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 구성되는 가변 중쇄 (VH) 및 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 4의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 (LC)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 에테세비맙(etesevimab)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 5의 아미노산 서열로 구성되는 가변 중쇄 (VH) 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 8의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 (LC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 벱텔로비맙(bebtelovimab)이다. 또 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열로 구성되는 가변 중쇄 (VH) 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열로 구성되는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-SARS-COV-2 항체는 서열식별번호: 11의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 (HC) 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 (LC)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 치료 또는 진단용 항체는 포유동물 세포에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 햄스터 새끼 신장 (BHK) 세포, 뮤린 하이브리도마 세포, 또는 뮤린 골수종 세포이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항체 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량의 상기 감소 방법이 심층 필터에의 적용 후 약물 물질 조제물을 수득하기 위한 추가적인 정제 및/또는 폴리싱(polishing) 단계에 추가로 적용되는 방법을 제공한다. FDA에 의하면, 약물 물질은 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방에 약학적 활성 또는 다른 직접적인 효과를 제공하거나 인간 신체의 구조 또는 임의 기능에 영향을 주도록 예정되는 활성 성분으로 정의되지만, 그와 같은 성분의 합성에 사용되는 중간물은 포함하지 않는다. 약물 제품은 인간 환자에의 투여에 적합한 마감된 투약 형태, 예컨대 반드시는 아니지만 일반적으로 1종 이상의 다른 성분과 함께 약물 물질을 함유하는 정제, 캡슐 또는 용액이다. 일부 실시양태에서, 상기 추가적인 정제 및/또는 폴리싱 단계는 하기 중 1종 이상을 포함한다: 바이러스 불활성화를 수행하는 단계, 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계, 바이러스 여과를 수행하는 단계, 및/또는 접선 유동 여과를 수행하는 단계.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 PLBL2로 구성되며, PLBL2 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, PLBL2 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, PLBL2 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 라이소좀 보호 단백질로 구성되며, 라이소좀 보호 단백질 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 라이소좀 보호 단백질 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 라이소좀 보호 단백질 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 라이소좀 보호 단백질 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 라이소좀 보호 단백질 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 단백질 S100-A6로 구성되며, 단백질 S100-A6 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 단백질 S100-A6 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 S100-A6 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 S100-A6 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 S100-A6 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 단백질 S100-A11로 구성되며, 단백질 S100-A11 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 단백질 S100-A11 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 S100-A11 단백질 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 S100-A11 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 단백질 S100-A11 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a로 구성되며, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 칼리크레인(kallikrein)-11로 구성되며, 칼리크레인-11 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 칼리크레인-11 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 칼리크레인-11 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 칼리크레인-11 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 칼리크레인-11 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 세린 프로테아제 HTRA1 동형(isoform) X1으로 구성되며, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 보체 C1r 하위구성요소로 구성되며, 보체 C1r 하위구성요소 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 보체 C1r 하위구성요소 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 보체 C1r 하위구성요소 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 보체 C1r 하위구성요소 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 보체 C1r 하위구성요소 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1으로 구성되며, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 열 충격 동계 71 kDa 단백질로 구성되며, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 폴리유비퀴틴으로 구성되며, 폴리유비퀴틴 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 폴리유비퀴틴 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 폴리유비퀴틴 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 폴리유비퀴틴 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 폴리유비퀴틴 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 퍼옥시레독신-1으로 구성되며, 퍼옥시레독신-1 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 퍼옥시레독신-1 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 퍼옥시레독신-1 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 퍼옥시레독신-1 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 퍼옥시레독신-1 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1으로 구성되며, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 40S 리보솜 단백질 S28로 구성되며, 40S 리보솜 단백질 S28 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 40S 리보솜 단백질 S28 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 40S 리보솜 단백질 S28 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 40S 리보솜 단백질 S28 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 40S 리보솜 단백질 S28 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 티오레독신 동형 X1으로 구성되며, 티오레독신 동형 X1 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 티오레독신 동형 X1 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 티오레독신 동형 X1 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 티오레독신 동형 X1 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 티오레독신 동형 X1 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1으로 구성되며, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질로 구성되며, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 갈렉틴-1으로 구성되며, 갈렉틴-1 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 갈렉틴-1 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 갈렉틴-1 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 갈렉틴-1 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 갈렉틴-1 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 코르니핀 알파로 구성되며, 코르니핀 알파 함량이 약 100 ppm 미만으로 감소되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 코르니핀 알파 함량은 약 50 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 코르니핀 알파 함량은 약 20 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 코르니핀 알파 함량은 약 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만으로 감소된다. 다른 실시양태에서, 코르니핀 알파 함량은 약 0 ppm으로 감소된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 단백질 조제물이 심층 여과에 적용되는, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체를 포함하는 상기 단백질 조제물은 심층 필터에 적용되며, 여기서 상기 심층 필터는 B1HC 필터, X0SP 필터, C0SP 필터, X0HC 필터, 엠파즈(Emphaze)™ AEX 하이브리드 정제기 필터 또는 제타 플러스(Zeta Plus) (ZB 미디어(Media) 사) 필터 (예컨대, 제타 플러스 (60ZB05A) 필터, 제타 플러스 (90ZB05A) 필터 또는 제타 플러스 (90ZB08A) 필터), 또는 B1HC 필터, X0SP 필터, C0SP 필터, X0HC 필터, 엠파즈™ AEX 하이브리드 정제기 필터 또는 제타 플러스 (ZB 미디어) 필터 (예컨대, 제타 플러스 (60ZB05A) 필터, 제타 플러스 (90ZB05A) 필터 또는 제타 플러스 (90ZB08A) 필터) 중 어느 것과 동일한 성능 특징을 가지는 심층 필터 중 1종 이상이다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물은 심층 필터에 적용되며, 여기서 상기 심층 필터는 B1HC 필터, X0HC 필터 또는 제타 플러스 (ZB 미디어) 필터 (예컨대, 제타 플러스 (60ZB05A) 필터, 제타 플러스 (90ZB05A) 필터 또는 제타 플러스 (90ZB08A) 필터), 또는 B1HC 필터, X0HC 필터 또는 제타 플러스 (ZB 미디어) 필터 (예컨대, 제타 플러스 (60ZB05A) 필터, 제타 플러스 (90ZB05A) 필터 또는 제타 플러스 (90ZB08A) 필터) 중 어느 것과 동일한 성능 특징을 가지는 심층 필터 중 1종 이상이다.

일부 실시양태에서, 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물은 심층 필터에 적용되며, 여기서 상기 심층 필터는 X0SP 필터, C0SP 필터, X0HC 필터 또는 엠파즈™ AEX 하이브리드 정제기 필터, 또는 X0SP 필터, C0SP 필터 또는 엠파즈™ AEX 하이브리드 정제기 필터 중 어느 것과 동일한 성능 특징을 가지는 심층 필터 중 1종 이상이다.

개시되는 방법의 일부 실시양태에서, 방법에 이용되는 심층 필터는 완전히 합성인 필터 매체를 포함하는 완전 합성 심층 필터이다. 일부 실시양태에서, 심층 필터 세공 크기는 약 9 마이크로미터 내지 약 0.1 마이크로미터이다. 일부 실시양태에서, 심층 필터 세공 크기는 약 2 마이크로미터 내지 약 0.1 마이크로미터이다. 일부 실시양태에서, 심층 필터 세공 크기는 약 0.1 마이크로미터이다.

개시되는 방법의 일부 실시양태에서, 심층 여과에 적용되는 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물의 pH는 약 5.0이고/거나, 심층 여과 후 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH는 약 5.0이다. 다른 실시양태에서, 심층 여과에 적용되는 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물의 pH는 약 6.0이고/거나, 심층 여과 후 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH는 약 6.0이다. 다른 실시양태에서, 심층 여과에 적용되는 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물의 pH는 약 7.0이고/거나, 심층 여과 후 항-N3pG 항체를 포함하는 용리액의 pH는 약 7.0이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 약 5.0 이상 (예컨대 약 6.0 또는 약 7.0)으로 pH를 상승시키는 단계로부터의 용리액의 이온 강도가 약 10 mM 내지 약 45 mM인, 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 이온 강도는 약 30 mM 미만이다. 일부 실시양태에서, 이온 강도는 약 20 mM 미만이다. 다른 실시양태에서, 이온 강도는 약 15 mM 미만이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물이 크로마토그래피 컬럼에 적용되는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 크로마토그래피 컬럼은 친화성 컬럼, 이온 교환 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼, 히드록시아파타이트 컬럼 또는 혼합 양식 컬럼 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에서, 상기 친화성 크로마토그래피 컬럼은 단백질 A 컬럼, 단백질 G 컬럼 또는 단백질 L 컬럼이다. 다른 실시양태에서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 음이온 교환 컬럼 또는 양이온 교환 컬럼이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 최종 생성물로부터 HCP가 충분히 제거되는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 항-N3pG 항체가 치료 또는 진단용 항체인, 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 상기 치료 또는 진단용 항-N3pG 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다.

또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 것은 항-N3pG 항체를 포함하는 단백질 조제물을 포함하는 제약 조성물이다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에서 기술되는 바와 같은 방법에 의해 제조되는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 조성물 중 숙주 세포 단백질 함량이 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm 또는 1 ppm 미만인, 본원에서 기술되는 바와 같은 방법에 의해 제조되는 조성물을 제공한다.

"숙주 세포 단백질" (HCP)이라는 용어는 세포 유지 및 성장, 그리고 단백질 합성 및 프로세싱과 연관되어 있는 숙주 세포의 단백질들이다. 특정 HCP들은 환자에서의 면역원성 우려와 연관되어 있어서, 면역원성 우려를 최소화하기 위해 HCP를 감소시키도록 하는 규제당국에 의한 요구가 존재한다. 면역원성 분석을 위한 한 가지 강력한 기술은 면역정보공학(immunoinformatics) 도구에 의존하는 것으로, 생물치료제 및 백신 둘 모두의 설계에 유용하며 거기에서 검증되어 있는 신뢰성 있는 예측을 창출하는 것으로 알려져 있다. HCP-유도 면역원성과 특히 관련되는 것은 항원-제시 세포가 외래 단백질을 구성 펩티드로 처리하고, 그 중 일부 ("항원결정인자")는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex) (MHC) 클래스 II 단백질에 의해 인식되어 T 세포에 의한 검사를 위해 세포 표면으로 안내되는 T 세포 경로이다. 삼원인 MHC:항원결정인자:T 세포 수용체 복합체의 형성은 최초 미접촉 반응을 추진하고, 이어지는 B 세포 활성화 및 성숙을 자극할 수 있다. 이에 따라, 많은 면역정보공학 연구가 추정 T 세포 항원결정인자의 고도로-신뢰성 있는 예측에 관한 것이었는데 (그 전체가 의거 참조로 포함되는 문헌 [De Groot and Martin, Clin Immunol. 2009 May; 131(2):189-201]), 에피매트릭스(EpiMatrix) 시스템이 펩티드:MHC 결합 프로파일을 바탕으로 하는 한 가지 집중적으로 검증된 방법이다. 단백질 내 개별 항원결정인자들을 식별하는 것 이외에, 에피매트릭스는 나아가 기준 단백질에 대비한 그의 항원결정인자 밀도에 따라 단백질의 전체적인 면역원성 위험성도 평가할 수 있다 (문헌 [De Groot and Martin, 2009]). 에피매트릭스 도구를 사용하여 면역원성을 예측할 때의 일반적인 제1 규칙은 +20 이상의 점수를 가지는 것들이 상승된 면역원성 위험성을 보유하고, 그에 따라 그와 같은 HCP는 최종 조제물로부터 감소시키거나 제거하는 것이 바람직하다는 것이다.

그와 같은 HCP에는 예를 들면 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터의 것들, 예컨대 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (PLBL2) (진뱅크(GenBank) 등재 번호 354497505), S100-A6 (진뱅크 등재 번호 354478978), 단백질 S100-A11 (진뱅크 등재 번호 354490016), 라이소좀 보호 단백질 (진뱅크 등재 번호 354476738), 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a (진뱅크 등재 번호 354483686), 칼리크레인-11 (진뱅크 등재 번호 625217455), 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 (진뱅크 등재 번호 625222219), 보체 C1r 하위구성요소 (진뱅크 등재 번호 625183025), 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (진뱅크 등재 번호 625206860), 열 충격 동계 71 kDa 단백질 (진뱅크 등재 번호 350539823), 퍼옥시레독신-1 (진뱅크 등재 번호 350537945), 폴리유비퀴틴 (진뱅크 등재 번호 346986309), 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (진뱅크 등재 번호 354505868), 40S 리보솜 단백질 S28 (진뱅크 등재 번호 625218224), 티오레독신 동형 X1 (진뱅크 등재 번호 625209431), 기저막-특이적 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 (진뱅크 등재 번호 625201352), 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 (진뱅크 등재 번호 625188472), 액틴, 부분적 세포질 2 동형 X2 (진뱅크 등재 번호 354497282), 갈렉틴-1 (진뱅크 등재 번호 354496408), 코르니핀 알파 (진뱅크 등재 번호 354504887)가 포함된다. 개시되는 방법의 일부 실시양태에서, 항체 조제물 중에서 감소되는 HCP의 함량은 S100-A6, 단백질 S100-A11, 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 라이소좀 보호 단백질, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a, 칼리크레인-11, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1, 보체 C1r 하위구성요소, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 및 퍼옥시레독신-1, 및 이들의 조합에서 선택되는 HCP의 함량이다. 개시되는 방법은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 2 ppm 및 1 ppm 미만인 S100-A6, 단백질 S100-A11, 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 라이소좀 보호 단백질, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a, 칼리크레인-11, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1, 보체 C1r 하위구성요소, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 및 퍼옥시레독신-1 중 1종 이상의 함량을 가지는 항체 조성물을 제조하는 데에 이용될 수 있다.

상승된 면역원성 위험성으로 인하여, 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (PLBL2) (진뱅크 등재 번호 354497505), S100-A6 (진뱅크 등재 번호 354478978), 단백질 S100-A11 (진뱅크 등재 번호 354490016), 라이소좀 보호 단백질 (진뱅크 등재 번호 354476738)과 같이 +20의 에피매트릭스 점수를 가지는 HCP를 제거하는 것이 특히 바람직하다. 페리레독신-1과 같은 다른 HCP는 상당히 지속성이고, 대상 단백질 또는 항체와 공동-용리되는 그의 경향으로 인하여 제거하기가 어렵다.

"약산"이라는 용어는 > ~4의 최저 pKa를 가지는 산을 지칭한다. 약산의 예에는 아세트산, 숙신산 및 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"강산"이라는 용어는 < ~4의 최저 pKa를 가지는 산을 지칭한다. 강산의 예에는 인산, 락트산, 포름산, 말산, 말론산, 글리콜산, 시트르산, 타르타르산 및 염산이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"원자가"라는 용어는 원자의 조합 용량을 지칭한다. 화합물의 일부로서 원자가 형성할 수 있는 결합의 수가 원소의 원자가에 의해 표현된다. "일가"라는 용어는 1의 원자가를 가지며 그에 따라 1개의 공유 결합을 형성할 수 있는 원자, 이온 또는 화학 기를 지칭한다.

"심층 필터"라는 용어는 단순히 매체 표면상이라기보다는 매체 전체에 걸쳐 (매체 내 및 매체상에) 입자를 보유하는 다공성 여과 매체를 사용하는 필터 요소를 지칭한다. 심층 필터는 또한 그것이 구성되는 재료의 화학적 특성에 기인하는 흡착 능력을 가질 수 있다. 시중에서 구입가능한 심층 필터의 예에는 B1HC 필터, X0SP 필터, C0SP 필터, X0HC 필터, 엠파즈™ AEX 하이브리드 정제기, 제타 플러스 (60ZB05A) 필터, 제타 플러스 (90ZB05A) 필터 및 제타 플러스 (90ZB08A) 필터가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 심층 필터는 완전 합성 필터 매체를 포함하는 완전 합성 심층 필터일 수 있다. 심층 필터는 약 9 마이크로미터 내지 약 0.1 마이크로미터, 약 2 마이크로미터 내지 약 0.1 마이크로미터, 또는 약 0.1 마이크로미터의 세공 크기를 가질 수 있다. "심층 여과"라는 용어는 비균질하거나 균질할 수 있는 액체 재료를 심층 필터로 통과시키는 작업을 지칭한다.

용액을 언급할 때의 "이온 강도"라는 용어는 그 용액 중 이온 농도의 척도이다. 이온 강도 (I)는 모든 종에 있어서의 종 농도 c _i 및 순 전하 z _i 의 함수이다. 이온 강도를 측정하는 데에는, 수학식 I이 사용된다.

"항체 조제물"은 대상 치료 또는 진단용 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하며 다양한 불순물들을 함유할 수도 있는, 정제 공정 또는 방법용으로 제공되는 재료 또는 용액이다. 비-제한적인 예로는 예를 들면 수확된 세포 배양액 (HCCF), 수확된 세포 배양 재료, 정화된 세포 배양액, 정화된 세포 배양 재료, 포획 풀, 회수된 풀, 및/또는 1회 이상의 원심분리 단계 및/또는 여과 단계 후 치료 또는 진단용 대상 항체를 함유하는 수집된 풀, 포획 풀, 회수된 풀, 및/또는 1회 이상의 정제 단계 후 치료 또는 진단용 대상 항체를 함유하는 수집된 풀이 포함될 수 있다.

"불순물"이라는 용어는 원하는 항-N3pG 항체 생성물과 다른 재료를 지칭한다. 불순물에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 숙주 세포 재료, 예컨대 숙주 세포 단백질, CHOP; 침출된 단백질 A; 핵산; 원하는 항체의 변이체, 크기 변이체, 단편, 응집물 또는 유도체; 내독소; 바이러스 오염물; 세포 배양 배지 성분 등.

"단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어들은 본원에서 임의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는 데에 호환가능하게 사용된다. 상기 중합체는 선형이거나 분지형일 수 있으며, 그것이 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 거기에 개재될 수 있다. 상기 용어는 자연적으로, 또는 개재; 예를 들면 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체도 포괄한다. 역시 정의 내에 포함되는 것은 예를 들면 1종 이상의 아미노산 유사체 (예를 들면 비자연 아미노산 등 포함)는 물론 관련 기술분야에 알려져 있는 기타 변형들을 포함하는 단백질이다. 단백질의 예로는 항체, 펩티드, 효소, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제, 시토카인, Fc 융합 단백질, 면역부착소 분자 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, "항체"라는 용어는 항원에 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 항체의 구현예에는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 항체 또는 접합 항체가 포함된다. 항체는 임의 클래스 (예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA) 및 임의 하위클래스 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 것일 수 있다.

본 개시내용의 대표적인 항체는 하기 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성되는 이뮤노글로불린 G (IgG) 유형 항체이다: 쇄-간 디술피드 결합을 통하여 가교-결합되어 있는 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC). 상기 4개 폴리펩티드 쇄 각각의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100-125개 이상 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 4개 폴리펩티드 쇄 각각의 카르복실-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG 동형은 또한 하위클래스 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로 나누어질 수 있다.

VH 및 VL 영역은 또한 프레임워크 영역 (FR)로 지칭되는 더 보존되어 있는 영역이 산재하는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 초-가변성의 영역들로 하위분할될 수 있다. CDR은 단백질의 표면상에 노출되며, 항원 결합 특이성을 위한 항체의 중요한 영역이다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복실-말단으로 하기 순서로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 여기에서, 중쇄의 3개 CDR은 "HCDR1, HCDR2 및 HCDR3"로 지칭되며, 경쇄의 3개 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적인 상호작용을 형성하는 대부분의 잔기들을 포함한다. CDR에의 아미노산 잔기들의 할당은 문헌 [Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))], [Chothia (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)]; [Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))], [North (North et al., "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))], 또는 IMGT (www.imgt.org에서 입수가능한 국제 면역유전학(ImMunoGeneTics) 데이터베이스; 문헌 [Lefranc et al., Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212)] 참조)에 기술되어 있는 것들을 포함하여, 잘-알려져 있는 체계에 따라 수행될 수 있다.

본 개시내용의 실시양태들은 본원에서 사용될 때 항원 또는 항원의 항원결정인자와 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 일부를 포함하는 항체 단편 또는 항원-결합 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, scFab, 디술피드-연결 Fvs (sdFv), Fd 단편도 포함한다.

개시되는 방법은 약물 물질 조제물을 제조하기 위해 수행될 수 있다.

개시되는 방법 및 조성물은 Np3Glu 아밀로이드 베타 펩티드 ("항-Np3G 항체")에 대한 항체를 이용하거나 포함할 수 있다. 상기 항-Np3G 항체는 아밀로이드 베타 (Aβ) 펩티드 응집과 관련된 질환을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 절단은 크기가 38 내지 43개 아미노산 범위인 Aβ 펩티드로 이어진다. 가용성으로부터 높은 β-시트 함량을 가지는 불용성 형태로의 Aβ의 전환, 그리고 뇌에서의 신경염 및 뇌혈관 플라크로서의 이러한 불용성 형태의 침착은 알츠하이머병 (AD), 다운 증후군 및 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA)을 포함한 수많은 이상 및 질환들과 연관되어 있다. 플라크에서 발견되는 침착물은 불균질한 Aβ 펩티드 혼합물로 구성된다. N3pE, pE3-X 또는 Aβ_p3 _-X로도 지칭되는 N3pGlu Aβ는 Aβ 펩티드의 N-말단 감축 형태로서, 주로 플라크에서 발견된다. N3pGlu Aβ는 인간 Aβ N-말단의 처음 2개 아미노산 잔기가 결핍되어 있으며, 세 번째 아미노산 위치에 글루탐산으로부터 유래하는 피로글루타메이트를 가지고 있다. N3pGlu Aβ 펩티드가 뇌에서 침착되는 Aβ의 부차적인 성분이기는 하지만, N3pGlu Aβ 펩티드가 공격적인 응집 특성을 가지며, 침착 연속단계의 초기에 축적된다는 것이 연구상 입증되어 있다. N3pGlu Aβ에 대한 항체는 관련 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, U.S. 특허 제8,679,498호는 인간 N3pGlu Aβ 항체 (예컨대 B12L; LY3002813로도 알려져 있음), 그리고 상기 항체를 사용한 알츠하이머병과 같은 질환의 치료 방법을 개시하고 있다. U.S. 특허 제10,647,759호는 "항체 201c"를 포함한 N3pG Ab 항체, 그리고 상기 항체를 사용한 알츠하이머병과 같은 질환의 치료 방법을 개시하고 있다. 개시되는 방법 및 조성물의 항-Np3Glu 항체는 Pyr-EFRHDSGYEVHHQK (즉 pE3-16)인 Ab 내에 존재하는 항원결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다.

개시되는 방법 및 조성물은 갑작스런 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질에 대한 항체를 이용하거나 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 때의 "항-SARS-CoV2 항체"라는 용어는 SARS-CoV-2의 스파이크 (S) 단백질에 결합하는 항체를 지칭한다. SARS-CoV-2 스파이크 (S) 단백질의 아미노산 서열은 예를 들면 진뱅크 등재 번호: YP_009724390.1로 이미 기술되어 있다.

"한외여과" 또는 "여과"라는 용어는 정수 압력이 반투과성 멤브레인에 대하여 액체를 가압하는 형태의 멤브레인 여과이다. 높은 분자량을 가지는 현탁된 고체 및 용질은 보유되는 반면, 물 및 저분자량 용질은 멤브레인을 통과한다. 일부 예에서, 한외여과 멤브레인은 1 μm 내지 100 μm 범위의 세공 크기를 가진다. "한외여과 멤브레인", "한외여과 필터", "여과 멤브레인" 및 "여과 필터"라는 용어들은 호환가능하게 사용될 수 있다. 여과 멤브레인의 예에는 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 멤브레인, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 니트레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE, 테플론(Teflon)), 폴리비닐 클로라이드, 폴리에테르술폰, 유리 섬유, 또는 cGMP 제조 환경에서 사용하기에 적합한 기타 필터 재료들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 사용될 때, 숫자 범위는 그 범위를 한정하는 숫자들을 포괄하는 것이다.

관련 기술분야에 알려져 있는 "EU 번호지정"이라는 용어는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 잔기들을 번호지정하는 시스템을 지칭한다. EU 번호지정에 대해서는 예를 들면 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]; [Edelman, G.M, et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)]; 및 http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs에 기술되어 있다. "카바트(Kabat) 번호지정"이라는 용어는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기들에 비해 더 가변적인 (즉 초가변성인) 아미노산 잔기들을 번호지정하는 시스템을 지칭하는 것으로 관련 기술분야에 알려져 있다 (예를 들면 문헌 [Kabat, et al., Ann. NY Acad . Sci . 190:382-93 (1971)]; [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)] 참조). "노스(North) 번호지정"이라는 용어는 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기들에 비해 더 가변적인 (즉 초가변성인) 아미노산 잔기들을 번호지정하는 시스템을 지칭하고, 적어도 부분적으로 문헌 [North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)]에 기술되어 있는 바와 같이 많은 수의 결정 구조와의 친화성 전파 클러스터화(affinity propagation clustering)를 바탕으로 한다.

본원에서 사용될 때, "친화성 크로마토그래피"라는 용어는 생체분자들 사이의 특이적인 가역적 상호작용을 바탕으로 생화학적 혼합물 (예컨대 단백질과 원치않는 생체분자 종들)을 분리하기 위한 크로마토그래피법을 지칭한다. 친화성 크로마토그래피의 대표적인 구현예에는 단백질 A 친화성, 단백질 G 친화성, 단백질 L 친화성, 카파 친화성 리간드 크로마토그래피 (예컨대 캡쳐셀렉트(CaptureSelect)™, 카파(Kappa)XL™, 카파셀렉트(KappaSelect)™, 카파XP™) 또는 람다 친화성 리간드 크로마토그래피가 포함된다.

본 개시내용의 단백질은 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있으며 본 개시내용의 단백질 및 1종 이상의 제약상 허용되는 캐리어(들) 및/또는 희석제(들)를 포함하는 제약 조성물에 도입될 수 있다 (예컨대 개업의에게 일반적으로 알려져 있는 바와 같은 제제화 기술들의 개요를 제공하는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd Edition, Loyd V., Ed., Pharmaceutical Press, 2012]). 제약 조성물용으로 적합한 캐리어에는 단백질과 조합되었을 때 분자의 활성을 유지하며 환자의 면역 시스템과 비-반응성인 임의의 재료가 포함된다.

그것이 작용가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 발현 벡터에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 폴리펩티드(들)의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종유래 신호 펩티드일 수 있다. 발현되는 폴리펩티드 각각은 하나의 벡터에서 그것이 작용가능하게 연결되어 있는 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 또는 대안적으로 다수의 벡터에서 그것이 작용가능하게 연결되어 있는 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 발현 벡터는 통상적으로 에피솜 또는 숙주 염색체 DNA의 통합된 일부 중 어느 하나로서 숙주 생물체에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열에 의해 형질전환된 세포의 검출을 가능하게 하는 선택 마커, 예컨대 테트라사이클린, 네오마이신 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 포함하게 된다.

숙주 세포는 1종 이상의 본 개시내용의 단백질을 발현하는 1종 이상의 발현 벡터에 의해 안정하거나 일시적으로 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염된 세포를 지칭한다. 본 개시내용의 단백질을 생성시키는 숙주 세포주의 생성 및 단리는 관련 기술분야에 알려져 있는 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 개시내용의 단백질의 발현에 있어서, 포유동물 세포는 바람직한 숙주 세포이다. 구체적인 포유동물 세포에는 HEK 293, NS0, DG-44 및 CHO가 포함된다. 바람직하게는, 단백질은 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되며, 그로부터 예를 들면 통상적인 기술을 사용하여 단백질이 회수되거나 정제될 수 있다. 예를 들면, 배지는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼 및/또는 카파 친화성 리간드 또는 람다 친화성 리간드 크로마토그래피 컬럼에 적용되고, 그로부터 용리될 수 있다. 가용성 응집물 및 다량체들을 포함한 원치않는 생체분자 종들은 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한 통상적인 기술에 의해 효과적으로 제거될 수 있다. 생성물은 즉시 예를 들면 -70 ℃에서 냉동되거나, 냉장되거나, 또는 동결건조될 수 있다. 다양한 단백질 정제 방법들이 사용될 수 있으며, 그와 같은 방법들에 대해서는 관련 기술분야에 알려져 있는 바, 예를 들면 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)] 및 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994)]에 기술되어 있다.

역시 본원에서 개시되는 것은 포유동물 숙주 세포로부터 항체를 정제하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물이다. 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물 중 숙주 세포 단백질 (HCP)의 총 함량은 통상적으로 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)이다. 개시되는 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 개시되는 제약 조성물의 항체는 인간 N3pGlu Aβ에 결합된다 (항-N3pGlu Aβ 항체). 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.

개시되는 제약 조성물은 통상적으로 항-N3pGlu Aβ 항체일 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다.

개시되는 제약 조성물은 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-N3pGlu Aβ 항체는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, LCVR은 아미노산 서열 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 아미노산 서열 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, LCDR1은 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열식별번호:17)이고, LCDR2는 AVSKLDS (서열식별번호:18)이고, LCDR3은 VQGTHYPFT (서열식별번호:19)이고, HCDR1은 GYDFTRYYIN (서열식별번호:20)이고, HCDR2는 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열식별번호:21)이고, HCDR3은 EGITVY (서열식별번호:22)이다.

개시되는 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 조성물은 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하고, 상기 항체는 LCVR 및 HCVR을 포함하고, 여기서 LCVR은

이고, HCVR은

이다.

개시되는 제약 조성물의 일부 실시양태에서, 조성물은 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하고, 여기서 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC는

이고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC는

이다.

개시되는 조성물의 일부 실시양태에서, 조성물은 도나네맙을 포함한다.

일부 실시양태에서, 개시되는 조성물은 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하는 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, LCVR은 아미노산 서열 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 아미노산 서열 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, LCDR1은 RASQSLGNWLA (서열식별번호: 27)이고, LCDR2는 YQASTLES (서열식별번호: 28)이고, LCDR3은 QHYKGSFWT (서열식별번호: 29)이고, HCDR1은 AASGFTFSSYPMS (서열식별번호: 30)이고, HCDR2는 AISGSGGSTYYADSVKG (서열식별번호: 31)이고, HCDR3은 AREGGSGSYYNGFDY (서열식별번호: 32)이다.

이고, HCVR은

이다.

이고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC는

이다.

개시되는 조성물의 일부 실시양태에서, 조성물은 U.S. 특허 제10,647,759호에 언급되어 있는 바와 같은 항체 201c를 포함한다.

도나네맙과 같은 항-N3pGlu 항체를 포함할 수 있는 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 제약 조성물은 감소된 총 숙주 세포 단백질 (HCP) 함량을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 HCP (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의, 하기의 HCP 및 이들의 조합에서 선택되는 HCP를 포함한다: 단백질 S100-A6, 단백질 S100-A11, 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 라이소좀 보호 단백질, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a, 칼리크레인-11, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1, 보체 C1r 하위구성요소, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1, 열 충격 동계 71 kDa 단백질, 퍼옥시레독신-1.

항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 단백질 S100-A6 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 단백질 S100-A11 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)를 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 칼리크레인-11 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 보체 C1r 하위구성요소 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)를 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 열 충격 동계 71 kDa 단백질 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다.

항체 201c와 같은 항-N3pGlu 항체를 포함할 수 있는 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 제약 조성물은 감소된 총 숙주 세포 단백질 (HCP) 함량을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 HCP (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의, 하기의 HCP 및 이들의 조합에서 선택되는 HCP를 포함한다: 폴리유비퀴틴, 라이소좀 보호 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1, 40S 리보솜 단백질 S28, 티오레독신 동형 X1, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질, 액틴-부분적 세포질 2 동형 X2, 갈렉틴-1, 퍼옥시레독신-1 및 코르니핀 알파.

항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 폴리유비퀴틴 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 40S 리보솜 단백질 S28 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 티오레독신 동형 X1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 액틴-부분적 세포질 2 동형 X2 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)를 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 갈렉틴-1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)을 포함할 수 있다. 항-N3pG 항체를 포함하는 개시되는 제약 조성물에서, 조성물은 약 100 ppm, 50 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 또는 1 ppm 미만의 코르니핀 알파 (예컨대 LCMS에 의해 측정 시)를 포함할 수 있다.

[ 실시예 ]

LCMS에 의한 숙주 세포 단백질 ( HCP ) 측정: 하기하는 실시예에서는, 숙주 세포 단백질 (HCP) 농도에 대한 정제 영향을 평가하기 위해, 예컨대 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 질량 분광계와 연계된 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 통한 펩티드 맵핑(mapping)/LC-MS/MS HCP 프로파일링에 의해 샘플을 분석한다. HCP를 검출하기 위한 방법에 대해서는 관련 기술분야에 개시되어 있다 (예컨대 문헌 [Huang et al., "A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies," Anal. Chem. 2017, 89, 5436-5444.] 참조). 이와 같은 분석에서는, 샘플을 트립신에 의한 분해에 적용하고, 디티오트레이톨 (DTT)을 사용하여 환원/침전시킨 후, 이어서 LC-MS/MS 분석용 HPLC 바이알로 상청액을 옮기고 산성화한다. LC-MS/MS 데이터는 첨가 항체, 첨입 및 대조 단백질 서열을 동반하는 CHO-K1 단백질 데이터베이스에 대비하여 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer)에 의해 분석한다. HCP 농도는 총 HCP 함량에 대하여 샘플 당 HCP 백만 당 총 부 (ppm) (예컨대 생성물 mg 당 HCP의 ng)로 기록한다. 또한, 특정 HCP (예컨대 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (PLBL2) 및 라이소좀 보호 단백질)의 농도도 제공한다.

ELISA에 의한 HCP 측정: 하기하는 실시예에서는, 지로랩(Gyrolab)^® CHO-HCP 키트 1 (시그너스 테크놀로지스(Cygnus Technologies) 사, 제조자의 지침에 따라 수행)을 사용한 ELISA 검정에 의해서도 샘플 중 HCP 농도 수준을 평가한다. 총 HCP 함량에 대하여 샘플 당 HCP 백만 당 총 부 (ppm)로 HCP 결과 농도를 기록한다.

실시예 1 - mAb1 (에테세비맙) 정제 공정에서의 HCP 감소

단백질 포획 단계: 살균된 단백질 A 컬럼 (맵셀렉트 수레(MabSelect SuRe) 단백질 A 매체)을 평형화하고, mAb1 (에테세비맙) 무-세포 생물반응기 수확물을 단백질 A 컬럼상에 적재한 후, 최종 세척으로서 20 mM 트리스 (pH 7.0)를 사용하여 단백질 A 컬럼의 3회 세척을 수행한다. 5 컬럼 부피 (CV)의 20 mM 아세트산 + 5 mM 인산을 사용하여, mAb1을 컬럼으로부터 용리한다. 전면 및 후면에서의 흡광도-기반 피크 절단을 사용하여, 주 생성물 분획을 단일 포괄 분획으로 모은다.

저 pH 바이러스 불활성화 단계 및 중화 단계: 저 pH 바이러스 불활성화를 위해, 20 mM HCl의 첨가에 의해 3.30 내지 3.60 사이의 pH로 mAb1을 함유하는 주 생성물 분획 (단백질 포획 용리액 포괄 분획)의 pH를 조정한다. 혼합물을 18 ℃ 내지 25 ℃에서 180분 동안 인큐베이션한다. 다음에, 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여, 7.0의 pH로 혼합물을 중화한다.

심층 여과 단계: 주사용수 (WFI)를 사용하여 심층 필터 (X0SP, 밀리포어(Millipore) 사)를 플러싱한다. 저 pH 바이러스 불활성화 단계 및 중화 단계로부터 수득된 mAb1 혼합물을 1200 g/m² (심층 필터 멤브레인 면적 m² 당 mAb 그램)의 적재량으로 심층 필터에 적용한다. WFI를 사용하여 적재된 심층 필터를 플러싱한다. 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여, 임의적으로 적재-후 WFI 플러싱물을 포함하는 심층 필터로부터의 여과액을 pH 8.0으로 중화한다.

음이온 교환 ( AEX ) 크로마토그래피 단계: 2 CV의 20 mM 트리스 (pH 8.0)를 사용하여, 살균된 컬럼 (Q 세파로스 고유량(Sepharose Fast Flow) 음이온 교환 크로마토그래피 매체, 또는 QFF)을 평형화한다. 심층 여과 단계로부터 수득된 mAb1 용액을 수지 리터 당 25 내지 100 g의 적재량으로 컬럼상에 적재하고, 평형화 완충제를 사용하여 추가적인 세척을 수행한다. 비결합 분획에 의해 형성되는 피크 영역의 전면 및 후면에서의 흡광도-기반 피크 절단 더하기 추가적인 세척에 의해 mAb1을 수집한다.

결과: 기술한 정제 공정을 사용할 경우, LC-MS에 의해 측정하였을 때의 총 HCP 농도는 하기이다:

단백질 A 용리 후 23299 ppm;

X0SP 심층 여과 후 13 ppm;

AEX 크로마토그래피 후 2 ppm.

mAb1에 대한 심층 필터 세트 1 평가: 본질적으로 상기한 바와 같이 단백질 A, 저 pH 바이러스 불활성화, 중화 및 심층 여과 단계를 통하여 mAb1을 처리한다. 표 1에 나타낸 바와 같이 2000 g/m²의 적재량에서 하기 4종의 상이한 심층 필터들을 시험한다: 엠파즈™ AEX 하이브리드 정제기, 제타 플러스 BC25 - 60ZB05A, 제타 플러스 BC25 - 90ZB05A 및 제타 플러스 BC25 - 90ZB08A (3M). 표 1의 결과는 단백질 A 용리 후 관찰되는 총 HCP 함량과 비교하였을 때의 시험된 4종 심층 필터에 있어서의 LCMS 및/또는 ELISA에 의한 심층 여과 후 총 HCP 함량의 상당한 감소를 보여준다.

실시예 2 - mAb2 ( 밤라니비맙 ) 정제 공정에서의 HCP 감소

단백질 A 용리 완충제 비교: 하기의 예외를 동반하여, 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 mAb2를 제조한다: 1) 저 pH 바이러스 불활성화 후 및 심층 여과 전에, 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여 7.0 대신 7.25의 pH로 용액을 중화함, 2) 표 2에 열거되어 있는 완충제 조합들을 사용하여 단백질 A 포획 컬럼으로부터 mAb2를 용리함, 및 3) 포로스(Poros) XQ 수지를 사용하여 AEX 크로마토그래피를 수행함. 표 2 및 3에 열거되어 있는 바와 같은 정제 장치 가동 후 LCMS를 통하여 HCP 함량 (총 HCP 농도 및 PLBL2 농도 둘 모두)을 평가한다. 표 2 및 3의 결과는 총 HCP 및 PLBL2 함량이 심층 여과 단계 후 시험된 3종 완충제 조합 모두에서 감소된다는 것을 보여준다. 구체적으로, 20 mM 아세트산 + 5 mM 인산 및 20 mM 아세트산 + 5 mM L-락트산이 심층 여과 후 20 mM 아세트산 + 5 mM 시트르산 조합과 비교하였을 때 20 ppm 미만까지의 더 큰 총 HCP 및 PLBL2 감소를 나타내었다.

심층 필터 세트 2 평가: 하기의 예외를 동반하여, 본질적으로 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 mAb2를 제조한다: 1) 저 pH 바이러스 불활성화 후 및 심층 여과 전에, 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여 7.0 대신 7.25의 pH로 용액의 pH를 중화함, 및 2) 표 4에 나타낸 심층 필터들을 사용하여 심층 여과를 수행함. 표 4는 1500 g/m² 적재량에서의 다양한 심층 필터들을 사용한 심층 여과 후의 총 HCP 및 PLBL2 함량을 보여준다. 시험된 3종의 세트 2 심층 필터 모두 (X0SP, C0SP, X0HC (밀리포어 사))가 심층 여과 후 20 ppm 미만까지의 상당한 총 HCP 및 PLBL2 함량 감소를 나타낸다.

실시예 3 - mAb3 ( 벱텔로비맙 ) 정제 공정에서의 HCP 감소

900 g/m²의 적재량으로 X0SP 심층 필터를 사용하는 것 이외에는 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 단백질 포획, 저 pH 바이러스 불활성화, 중화 및 심층 여과 단계를 사용하여 mAb3을 제조한다. 기술한 정제 공정을 사용할 경우, LCMS에 의해 측정하였을 때의 총 HCP 농도는 하기이다:

단백질 A 용리 후 179964 ppm,

X0SP (밀리포어 사) 심층 여과 후 77 ppm.

실시예 4 - 이중특이적 항체 ( mAb4 ) 정제 공정에서의 HCP 감소

단백질 L 친화성 포획 컬럼 (시티바(Cytiva) 사)을 사용하는 것 및 표 5에 나타낸 완충제 시스템을 사용하여 용리하는 것 이외에는 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 단백질 포획 단계를 사용하여 이중특이적 항체 mAb4를 제조한다. 약 1300 내지 약 2500 ppm의 범위를 제공하는 ELISA에 의해 총 HCP 함량을 측정한다. 단백질 포획 후, 표 5에 열거되어 있는 적정액을 사용하는 것 이외에는 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 저 pH 바이러스 불활성화를 수행한 후, 이어서 500 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여 pH 7.0까지 중화한다. 다음에, 1200 g/m²의 적재량으로 X0SP 심층 필터를 사용하여 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 심층 여과 단계를 수행한다. 심층 여과 후 ELISA에 의해 HCP 함량을 측정한다.

표 5의 결과는 심층 여과 후 참가물 1 내지 7에 있어서의 ≤ 50 ppm 미만까지의 상당한 총 HCP 함량 감소를 보여주는데, 여기서 심층 필터에 적용된 혼합물의 이온 강도는 45 mM 미만이었다. 또한, 심층 필터에 적용된 혼합물의 이온 강도와 심층 여과 후 총 HCP 함량 사이의 상관관계. 또한, 참가물 2는 완충제를 희석하는 것에 의해 이온 강도가 감소됨으로써 심층 여과 후 낮은 HCP 함량을 제공할 수 있기는 하지만, 희석으로부터의 부피 증가는 제조 공정에 불리할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 5 - mAb5 ( 도나네맙 ) 정제 공정에서의 HCP 감소

본질적으로 하기에 기술되어 있는 바와 같은 단계들을 사용하여 mAb5 조제물을 제조한다: 단백질 포획, 저 pH 바이러스 불활성화 및 중화, 심층 여과, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 바이러스 여과 및 접선 유동 여과 (TFF).

단백질 포획 단계:

잔류 HCP 및 잔류 DNA와 같은 공정-관련 불순물들을 감소시키는 것에 의해 항체를 포획 및 정제한다. 살균된 단백질 A 컬럼 (맵셀렉트 단백질 A 매체)을 평형화하고, 모노클로날 항체 (CHO 세포로부터 발현된 mAb5 (도나네맙)) 무-세포 생물반응기 수확물을 단백질 A 컬럼상에 적재한 후, 최종 세척으로서 20 mM 트리스 (pH 7.0)를 사용하여 단백질 A 컬럼의 3회 세척을 수행한다. 5 컬럼 부피 (CV)의 20 mM 아세트산 + 5 mM 시트르산을 사용하여, 항체를 컬럼으로부터 용리한다. 전면 및 후면에서의 흡광도-기반 피크 절단을 사용하여, 주 생성물 분획을 단일 포괄 분획으로 모은다.

저 pH 바이러스 불활성화 단계 및 중화 단계:

저 pH 민감성 바이러스를 불활성화하고, 잔류 HCP, 잔류 단백질 A, 잔류 DNA 및 총 응집물을 감소시킨다. 20 mM 아세트산, 5 mM 시트르산의 첨가에 의해 3.30 내지 3.60 사이의 pH로 mAb를 함유하는 수집된 주 생성물 분획 (단백질 포획 용리액 포괄 분획)의 pH를 조정하는 것에 의해 바이러스 불활성화를 수행한다. 혼합물을 18 ℃ 내지 25 ℃에서 약 180분 동안 인큐베이션한다. 다음에, 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여, 5 내지 7.0의 pH, 바람직하게는 pH 5.0으로 혼합물을 중화한다.

심층 여과 단계:

각 시험 조건 (B1HC의 경우 pH 5)에서, 주사용수 (WFI)를 사용하여 별도의 심층 필터 (B1HC, 밀리포어 사)를 플러싱한다. 저 pH 바이러스 불활성화 단계 및 중화 단계로부터 수득된 mAb 혼합물을 대략 500-1500 g/m² (심층 필터 멤브레인 면적 m² 당 mAb 그램)의 목표 적재량으로 심층 필터에 적용한다. WFI를 사용하여 적재된 심층 필터를 플러싱한다. 250 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여, 임의적으로 적재-후 WFI 플러싱물을 포함하는 심층 필터로부터의 여과액을 pH 7.25로 중화한다. 계산된 부피의 20 mM 트리스, 1 M NaCl, pH 7.0 완충제를 50 mM의 최종 NaCl 농도로 첨가한다.

음이온 교환 ( AEX ) 크로마토그래피 단계:

잠재적 바이러스 오염물을 감소시킨다. 2 CV의 20 mM 트리스, 1 M NaCl, pH 7.0 완충제 후 이어지는 3 CV의 평형화 완충제 20 mM 트리스 50 mM NaCl (pH 7.25)을 사용하여, 살균된 포로스 XQ (또는 사르토바인드(Sartobind) Q 또는 포로스 HQ) 음이온 교환 (AEX) 컬럼을 사전-평형화한다. 각 심층 필터 조건으로부터의 mAb 용액을 심층 필터 조건을 기준으로 별도의 전개로 AEX 컬럼으로 유통시켰는데, 심층 여과 단계로부터 수득된 것을 수지 리터 당 대략 100 g - 200 g (예컨대 수지 리터 당 대략 150 g)의 적재량으로 컬럼상에 적재하고, 평형화 완충제를 사용하여 추가적인 세척을 수행한다. 적재 개시로부터 세척 완료시까지 mAb를 수집한다.

양이온 교환 ( CEX ) 크로마토그래피 단계:

총 응집물을 감소시키고, 잔류 HCP를 감소시키며, 잔류 단백질 A를 감소시킨다. 평형화된 (20 % 이동상 B 또는 20 mM 소듐 아세테이트, 200 mM 소듐 클로라이드, pH 5.0의 등가물) CEX 크로마토그래피 수지 (포로스™ HS 또는 UNO스피어(sphere) S)상에의 적재 전의 0.1 N 아세트산의 첨가를 사용하여, 대략 7.25로부터 5.0으로 상이한 AEX 중간물들을 pH 조정하였다. pH 5.0의 AEX 공정 중간물들을 CEX 컬럼상에의 적재 시점에 15 % 이동상 B (193 mM 소듐 클로라이드에 상당)와 블렌딩한다. 컬럼 적재물은 수지 리터 당 mAb 대략 25 그램이었다. 적재 후, 비결합 불순물의 제거를 촉진하기 위해, 20 % 이동상 B (20 mM 소듐 아세테이트, 200 mM 소듐 클로라이드, pH 5.0에 상당)를 사용하여 컬럼을 세척한다. 다음에, 10 컬럼 부피에 걸친 이동상 B 20 % - 55 %의 선형 구배 (20 mM 소듐 아세테이트, pH 5.0 완충제 중 200 내지 550 mM 소듐 클로라이드 구배)를 사용하여, 컬럼으로부터 mAb를 용리한다. 생성물의 완전한 용리를 보장하기 위해, 55 % 이동상 B (20 mM 소듐 아세테이트, 550 mM 소듐 클로라이드, pH 5.0에 상당)에서의 등용매 유지에 의한 선형 구배가 후속할 수 있다. 용리 동안, NLT 4.8 AU/cm에서의 전-면상 UV-기반 절단으로 CEX 용리액 수집을 개시하고, NLT 2.4 AU/cm에서 후-면 절단이 이루어질 때까지 피크 정점을 계속 유지한다. 컬럼을 재생하고, 1 N 소듐 히드록시드 용액을 사용하여 살균한다. 컬럼은 0.01 N 소듐 히드록시드 중에서 저장될 수 있다. 다음에, LCMS를 사용하여 HCP 함량에 대해 조제물을 분석한다.

바이러스 여과:

잠재적 바이러스 오염물을 제거한다. 비레솔브 프로(Viresolve Pro), 플라노바(Planova) 20N 또는 플라노바 바이오(Bio)EX 멤브레인을 통하여 바이러스 여과를 수행한다.

접선 유동 여과 ( TFF ):

바이러스 여과액 공정 중간물을 적절한 최종 약물 물질 (DS) 조제물용 매트릭스로 교체하고, 최종 DS 조제물용으로 항체를 적절한 범위까지 농축한다. 30 kDa PES 또는 30 kDa 재생 셀룰로스 멤브레인상에서 TFF를 수행한다.

약물 물질 분배:

TFF 후, 계면활성제를 첨가하여 약물 물질 제제화를 완료하고, 약물 제품 제조 전에 적절한 온도에서 저장 및 수송을 위한 적절한 용기 봉입 시스템에 분배한다.

LC-MS에 의한 HCP 함량의 측정:

하기하는 바와 같이 LC-MS에 의해 HCP 함량을 측정하였다. mAb5 배치 1 및 mAb5 배치 2의 경우, 단백질 포획 단계 후, 저 pH 바이러스 불활성화 후, AEX 후 및 CEX 후에 HCP 함량을 측정하였다. mAb5 배치 3-5의 경우, 약물 물질 분배 전에 HCP 함량을 측정하였다. 결과는 하기 표 6a 및 6b, 및 표 7에 나타내었다.

샘플 제조

각 샘플 또는 대조의 단백질 ~1 mg을 함유하는 분취량을 193 mL까지 순수(pure water)에 첨가하였다. 용액을 5.0 mL의 1 M 트리스-HCl 완충제, pH 8, 1.0 mL 분취량의 4종 단백질 혼합물과 혼합한 다음, 37 ℃에서 1 mL의 2.5 mg/mL r-트립신을 사용하여 밤새 처리하였다. 각 분해물을 2.0 mL의 50 mg/mL DTT 용액과 혼합하고, 90 ℃에서 15분 동안 가열하였다. 침전물이 관찰되었다. 2x30초 동안 강하게 샘플을 보르텍싱한다. 각 샘플을 13200 rpm으로 3분 동안 원심분리하고; 120 mL의 상청액을 HPLC 바이알로 옮겼다. 다음에, LC/MS 분석을 위해, HPLC 바이알 중 샘플을 H₂O 중 20 % TFA 5.0 μL와 혼합하였다.

LC/MS/MS 방법

UPLC-MS/MS를 사용하여, 제조된 트립신 펩티드를 분석하였다. 샘플을 50 μL의 부피로 바로 워터스 액큐이티(Waters Acquity) UPLC CSH C18 (밀포드(Milford) 사, 미국 매사추세츠 소재) (2.1 x 50 mm, 1.7 μm 입자 크기)상에 주사하였다. 분석 동안, 컬럼을 60 ℃로 가열하였다. 수중 0.1 % 포름산으로 구성되는 이동상 A, 및 아세토니트릴 중 0.1 % 포름산으로 구성되는 이동상 B를 사용하여, 200 μL/분으로 2분 동안 0 % 이동상 B에서 평형화하는 것, 50 μL/분의 유량으로 0 %로부터 23분에 걸쳐 10 %로, 57분에 걸쳐 20 % B로, 30분에 걸쳐 30 %로 선형 증가시키는 것, 이후 400 μL/분 유량으로의 다수의 지그재그 세척 주기에 의해, 워터스 액큐이티 UPLC 시스템상에서 분리를 수행하였다. 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) Q 엑스액티브 플러스(Exactive Plus) 질량 분광계 (독일 브레멘 소재)상에서 질량 분광측정 분석을 수행하였다. 하기와 같이 데이터-의존성 MS/MS를 수행하였다: 처음 작업은 조사 양성 질량 스캔 (230-1500의 m/z 범위)이었으며, 처음 작업으로부터의 10종의 가장 풍부한 이온에 대한 10회의 HCD 작업 (28 % NCE)이 이어졌음. 15의 외피 기체 유량, 5의 보조 기체 유량, 4 kV의 분무 전압, 320 ℃의 모세관 온도 및 50의 S-렌즈 RF 수준을 사용하여 이온을 생성시켰다. 조사 스캔 및 MS/MS 작업에 대하여 각각 35 000 (5E6의 AGC 표적) 및 17 500 (5E4의 AGC 표적)으로 해상도를 설정하였다. 최대 이온 주사 시간은 조사 스캔의 경우 250 ms, 기타 스캔의 경우 300 ms이었다. 단일 반복 계수로 60초의 동적 배제 기간을 사용하였다.

HCP 식별 및 정량

MS/MS 데이터로부터 HCP의 정체를 예측하기 위해, CHO-K1_refseq_2014 Protein.fasta 데이터베이스 (http://www.chogenome.org로부터 08/23/2014에 다운로드)로부터 입수된 서열들로 구성되는 맞춤식 단백질 데이터베이스를 개발하였다. 시퀘스트(Sequest) HT 탐색을 사용하는 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer) 소프트웨어 패키지, 버전 1.4 또는 2.3 (써모 사이언티픽 사, 독일 브레멘 소재)을 사용하여 10 ppm 및 0.02 Da의 질량 관용(mass tolerance) 및 이와 같은 데이터베이스에 대한 ≤ 1 %의 절대 오류 발견율 (FDR)로 MS/MS 데이터를 탐색하였다. 점수 0 및 단일 스펙트럼 히트, 또는 단일 스펙트럼 히트를 나타내는 단백질, 및 ≥ 10 ppm의 오염된 인간 단백질을 제거하는 것에 의해, 추가적인 펩티드/단백질 여과를 수행하였다. 각 HCP에 대한 상위 3종 펩티드로부터의 단백질 면적 (가능할 경우), 및 3종의 첨입 단백질인 r-트립신, PCSK9 및 ADH1의 면적을 사용하여 개별 HCP 농도 (ppm 또는 ng HCP/mg mAb)를 계산하였다.

실시예 6. mAb7 ( U.S . 특허 제10,647,759호에서의 "항체 201c") 정제 공정에서의 HCP 감소

하기의 부차적인 차이를 동반하여 본질적으로 mAb5와 관련하여 상기한 바와 같은 단계들을 사용함으로써, mAb7 (U.S. 특허 제10,647,759호의 "항체 201c") (LC는 서열식별번호: 25이며; HC는 서열식별번호: 26임) 조제물을 제조한다:

단백질 포획:

단백질 A 컬럼: 맵셀렉트 수레

적재량: 20-40 g/L

용리: 20 mM 아세트산/5 mM 시트르산

저 pH 바이러스 불활성화 및 중화:

적정액: 20 mM 아세트산/5 mM 시트르산, pH 3.45

시간: 180분

중화: pH 5.0, 500 mM 트리스 염기

AEX 크로마토그래피:

수지: 포로스 50 XQ;

적재량: 100-200 g/L 적재량

pH: 7.0

CEX 크로마토그래피:

수지: 포로스 50 HS

적재량: 20-40 g/L

실시예 5에서 기술된 바와 같이 LC-MS에 의해 HCP 함량을 측정하였다. mAb7 배치 1 및 mAb7 배치 2에 대하여, 단백질 포획 단계 후, 저 pH 바이러스 불활성화 후, AEX 후, CEX 후 및 TFF 후에 HCP 함량을 측정하였다. 결과를 표 8a 및 8b에 나타내었다.

실시예 7. 심층 여과 동안의 HCP 감소에 대한 심층 필터 유형 및 pH의 영향 - mAb5 (도나네맙) 및 mAb6

부문 A - HCP 감소에 대한 pH의 영향

표 9에 나타낸 완충제 시스템들을 사용하여 용리 단계를 수행한다는 것 이외에는 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 단백질 포획 단계를 사용하여 2종의 항체 (mAb5 및 mAb6)를 제조한다. 약 2800 내지 약 3200 ppm의 범위를 제공하는 ELISA에 의해 총 HCP 함량을 측정한다. 단백질 포획 후, 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 저 pH 바이러스 불활성화 단계를 수행한 후, 이어서 500 mM 트리스 염기 pH 비조정 완충제를 사용하여 pH 5.0 또는 pH 7.0 중 어느 하나로 중화 단계를 수행한다. 1000 g/m²의 적재량으로 X0SP 심층 필터를 사용하여 본질적으로 실시예 1에서 mAb1에 대하여 기술된 바와 같이 심층 여과 단계를 수행한다. ELISA에 의해, 심층 여과 단계 후 HCP 함량을 측정한다.

표 9의 결과는 심층 필터에 적용되는 혼합물의 pH가 pH 7.0인 경우에서의 심층 여과 후 두 항체에 있어서의 ≤ 50 ppm 미만으로의 상당한 총 HCP 함량 감소를 보여준다. 심층 필터에 적용되는 혼합물의 pH가 pH 5.0인 경우, 총 HCP 함량은 더 적은 정도로 감소된다.

부문 B: mAb5에서의 HCP 감소에 대한 심층 필터 및 pH의 영향

본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 단백질 포획 단계를 사용하여 mAb5를 제조한다. 용리액을 본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 저 pH 바이러스 불활성화 및 중화에 적용한다. 심층 여과 단계에 대하여, 하기 4종의 상이한 pH 및 심층 필터 설정을 평가하였다:

(i) B1HC 필터 + pH 5.1

(ii) X0SP 필터 + pH 5.1

(iii) X0SP 필터 + pH 6.2

(iv) X0SP 필터 + pH 7.3

(i) B1HC 필터 + pH 5.1

본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 단백질 포획 단계를 사용하여 mAb5를 제조한다. 500 ml를 유리 비커에 배치하고, 테플론 교반 막대를 사용하여 혼합한다. 단백질 A 용리액의 단백질 농도는 12.5 mg/ml이다. 비커 내 500 ml에서, 총 단백질 함량은 6250 mg (12.5 mg/ml x 500 ml = 6250 mg)이다.

비커 내 용액의 개시 pH는 3.98 (온도 = 18.1 C)이다. 20 mM 아세트산 / 5 mM 시트르산을 사용하여 3.45로 pH를 조정함으로써, 본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 저 pH 바이러스 불활성화 단계를 수행한다.

저 pH 바이러스 불활성화 단계가 계속되는 동안, B1HC 필터 (마이크로 포드(micro pod) 또는 23 sq cm, Lot CP7NA77798, 부문 MB1HC23CL3)를 설정한다. 펜도테크(PendoTech) 필터 스크리닝 연동 펌핑 시스템 (오하우스 스카웃(OHAUS Scout) 등급을 가지는 K434694, K434696 내지 K434699)이 구비된 크기 14 백금 경화 규소 배관을 사용한다. 모든 필터는 PWTR을 사용하여 23 ml/분 (약 600 LMH)에서 필터 당 230 ml 또는 100 L/sqm으로 플러싱한다.

0.25 M 트리스 염기 (EL19562-368, LB213, EXP 4/15/2020)를 사용하여 pH 5.0으로의 중화를 달성한다. pH가 5에 도달하면서 용액은 흐리게 전환되며, 최종 pH는 5.09 (5.1)로 측정된다. 농도는 7.27 mg/ml (pH 5에서 6250 mg / 860 ml)인 것으로 계산된다. pH 5 용액을 교반하는 동안, B1HC 필터를 통하여 997 g/sqm (309 ml x 7.27 mg/ml = 2.246 g / 0.0023 sqm = 997 g/sqm)의 적재량으로 여과를 개시한다. 45 ml의 PWTR을 사용하여 B1HC 필터를 회수 플러싱한다. 회수 플러싱 후, 필터는 반드시 펌핑 건조한다. B1HC의 최종 부피는 5.13 mg/ml로 375.5 ml이고, 1.926 g의 85.8 % 수율을 제공한다.

(ii) X0SP 필터 + pH 5.1 또는 pH 6.3 또는 pH 7.2

본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 단백질 포획 단계를 사용하여 mAb5를 제조한다. 500 ml를 유리 비커에 배치하고, 테플론 교반 막대를 사용하여 혼합한다. 단백질 A 용리액의 단백질 농도는 15.75 mg/ml이다. 비커 내 500 ml에서, 총 단백질 함량은 7875 mg (15.75 mg/ml x 500 ml = 7875 mg)이다.

비커 내 용액의 개시 pH는 4.05 (온도 = 18.1 C)이다. 20 mM 아세트산 / 5 mM 시트르산을 사용하여 3.45로 pH를 조정함으로써, 본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 저 pH 바이러스 불활성화 단계를 수행한다.

저 pH 바이러스 불활성화 단계가 계속되는 동안, 3종의 X0SP 필터 (마이크로 포드 또는 23 sq cm, Lot CP9AA93251, cat MX0SP23CL3)를 설정하고, 상기한 바와 같이 별도로 플러싱한다.

0.25 M 트리스 염기 (EL19562-368, LB213, EXP 4/15/2020)를 사용하여 중화 I을 달성하였다.

20 ml의 250 mM 트리스 염기를 사용하여, 제1 비커를 5.1로 pH 조정하였다. 계산된 농도는 9.04 mg/ml이다.

27 ml의 250 mM 트리스 염기를 사용하여, 제2 비커를 6.3으로 pH 조정하였다. 계산된 농도는 8.82 mg/ml이다.

32 ml의 250 mM 트리스 염기를 사용하여, 제3 비커를 7.2로 pH 조정하였다. 계산된 농도는 8.67 mg/ml이다.

pH 6.3 및 7.2의 침전물은 점착성으로 (여과 종료로 갈수록 그것이 유리 저부에 점착하게 되는 것으로) 보였으며, pH 5.1에 비해 크기가 더 클 가능성이 있었다.

3종의 용액을 교반하는 동안, X0SP 필터를 통한 여과를 개시한다.

pH 5.0 X0SP가 203 ml의 적재량에서 25 psi에 도달한 다음, 물 회수 플러싱으로 전환한다. 적재량은 798 g/sqm (9.04 mg/ml x 203 ml = 1.835 g / 0.0023 sqm = 798 g / sqm)으로 계산된다.

~45 ml의 PWTR을 사용하여, 필터를 회수 플러싱한다. 회수 플러싱 후, 필터를 반드시 펌핑 건조한다.

X0SP pH 5.1의 최종 부피 = 5.89 mg/ml에서 278 ml = 1.637 g 수율 = 1.637 g / 1.835 = 89.2 %

X0SP pH 6.3의 최종 부피 = 5.76 mg/ml에서 365 ml = 1. g 수율 = 2.102 g / 2.58 = 81.5 %

X0SP pH 7.2의 최종 부피 = 5.52 mg/ml에서 365 ml = 2.015 g / 2.58 = 78.1 %

(iii) AEX 크로마토그래피

각 심층 여과 조제물을 본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 AEX에 적용한다. 모든 AEX 충전물 제조에서, pH 5에서의 여과액 및 pH 6에서의 여과액 (pH 7.2에서의 여과액은 아님)을 250 mM 트리스 염기를 사용하여 7.25로 pH 조정한 다음 (개발 용도의 lot EL19562-368, LB213, exp 4-15-20), pH 7.25에서 0.0526 x 부피로 20 mM 트리스, 1 M NaCl, pH 7.0 (EL19562-862 LB198, exp 9-30-2020)을 사용하여 50 mM의 최종 농도까지 NaCl을 첨가하였다. 모든 충전물 제조는 교반 막대가 구비된 유리 비커에서 수행한다. 동일한 양으로 AEX를 적재하기 위해, 각 여과액 600 mg을 사용하였다. 모든 AEX 충전물 pH는 7.1 내지 7.3 사이였으며, 모든 전도도는 6.5 +/- 0.2 mS이었다.

최종 AEX MS (pH 5에서) 부피, mAb5 농도, 총 mg 및 수율은 하기였다:

1. B1HC 재료 - 3.91 mg/ml에서의 155 ml = 606.1 mg 또는 101 %

2. pH 5.1에서의 X0SP - 5.00 mg/ml에서의 120 ml = 600 mg 또는 100 %

3. pH 6.3에서의 X0SP - 4.96 mg/ml에서의 121 ml = 600.2 mg 또는 100 %

4. pH 7.2에서의 X0SP - 4.79 mg/ml에서의 126 ml = 603.5 mg 또는 100.6 %

(iii) CEX 크로마토그래피

각 AEX 조제물을 본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 CEX 크로마토그래피에 적용한다. CEX 수지상에서의 실제 적재량은 하기와 같다:

(i) 3.91 mg/ml에서의 B1HC 조제물 x 적재 부피 130 ml x 0.85 = 110.5 ml = 432.1 / 17.28 = 25.0 mg/ml

(ii) pH 5 5.00 mg/ml에서의 X0SP 적재 부피 101.7 ml x 0.85 % = 86.4 ml = 432 / 17.28 = 25.0 mg/ml

(iii) pH 6.3 4.96 mg/ml에서의 X0SP 적재 부피 = 102.5 x 0.85 = 87.1 ml = 432.0 / 17.28 ml = 25.0 mg/ml

(iv) pH 7.2 4.79 mg/ml에서의 X0SP 적재 부피 = 106.1 x 0.85 = 90.2 ml = 432.1 / 17.28 = 25.0 mg/ml

각 조건에서의 CEX 주류 부피, 농도 및 수율은 하기와 같다:

(i) pH 5.0 5.83 mg/ml에서의 B1HC x MS 부피 = 64.1 ml MS 부피 = 373 mg / 432.1 mg = 86.3 %

(ii) pH 5 5.83 mg/ml에서의 X0SP x 64.8 ml MS 부피 = 377.8 mg / 432 mg = 87.5 %

(iii) pH 6.3 5.80 mg/ml에서의 X0SP = 64.8 ml MS 부피 = 375.8 mg / 432.0 mg = 87.0 %

(iv) pH 7.2 5.80 mg/ml에서의 X0SP = 64.7 ml MS 부피 = 375.3 mg / 432.1 mg = 86.9 %

(v) LC-MS에 의한 HCP 함량의 분석

본질적으로 실시예 5에서 기술된 바와 같이 LCM을 사용하여 HCP 함량에 대해 CEX 조제물을 분석한다. LC-MS 데이터는 표 10에 제공하였다.

표 10의 데이터는 시험된 모든 pH에서의 X0SP 필터를 사용한 심층 여과 후의 ≤ 50 ppm 미만까지의 상당한 총 HCP 함량 감소를 보여준다. 이는 바람직하게도 B1HC 필터를 사용한 심층 여과 후의 HCP 함량 감소에 필적한다. 심층 여과 단계 후의 수율이 더 낮은 pH 5.1에 비해 pH 6.3 및 7.2에서 더 낮다는 것 또한 주목할만하다. 따라서, 높은 pH에서의 HCP 함량의 감소는 수율의 손실에 의해 상쇄될 수 있다. 최적의 성능은 pH 5.0에서의 X0SP 필터에서 나타났다.

실시예 8. 생체분자 정제 공정 동안의 이온 강도의 측정 방법

여기에서는, 생체분자 정제 장치 공정 동안 완충제 조성에 대해 알려져 있는 것을 바탕으로 하는 이온 강도의 추산 방법을 기술한다. 용액의 이온 강도 (I)는 그 용액 중 이온들의 농도의 척도로서, 모든 종에 있어서의 종 농도 c _i 및 순 전하 z _i 의 함수이다. 이온 강도를 측정하는 데에는, 수학식 I이 사용된다.

강 전해질: 낮은 농도 (예컨대 50 mM 미만)의 강 전해질의 경우, 완전한 해리를 가정한다. 완전한 해리에서는, 조성이 용이하게 계산됨으로써, 이온 강도 계산이 간단해진다. 예를 들어, 50 mM NaCl의 용액은 해리되어 0.5 × [50 mM × 1² + 50 mM × (-1)²] = 50 mM의 이온 강도를 동반하는 각각 50 mM의 Na⁺ 및 Cl^-를 산출한다. 또 다른 예로서, 50 mM의 Na₂SO₄는 해리되어 100 mM의 Na⁺ 및 50 mM의 SO₄ ^2-를 산출함으로써, 0.5 × [100 mM × 1² + 50 mM × (-2)²] = 150 mM의 이온 강도를 산출한다. 완충 종이 없는 경우, 이러한 계산에서는 거의-중성인 pH가 예상됨으로써, 물의 해리로부터의 이온 농도가 이온 강도에 대하여 의미있게 기여하지 않는다. 물의 해리 상수는 [H⁺] = 10^- ^pH인 K _w = [H⁺][OH^-] = 10^-14인 것으로 이해되며, 여기서 중괄호(square bracket)는 농도를 표시한다. 본원에서의 계산 목적상, H⁺ 이온의 물리적 해석 (예컨대 하이드로늄 이온과 대비하는 것)은 필요하지 않으며, H⁺ 농도와 활성 사이를 구별하는 것 역시 필요하지 않다.

완충된 시스템: 완충된 시스템의 경우, 완전한 해리를 가정할 수 없다. 산 및 염기 형태에서의 완충제의 비율을 측정하는 데에는 완충제의 산 해리 상수가 사용되어야 한다. H⁺ 및 A^-로 해리되는 일반적인 산 HA의 경우, 수학식 2가 산 해리 상수 K _a 및 종 농도와 관련된다:

산 해리 상수는 종종 pK _a = -log₁₀(K _a )의 대수 형태로 사용된다. pK _a,0 로 표시되는 열역학적 pK _a 는 많은 중요한 완충제들에 대한 문헌에서 찾아볼 수 있다. 그러나, 완충제의 유효 pK _a 는 활성 계수의 일관성으로부터의 이탈로 인하여 매우 묽은 용액에서 이외에는 열역학적 값에서 벗어난다. 본 개시내용에서 고려되는 중간정도로 희석된 용액의 경우, 연장된 데비 휴켈(Debye Huckel) 방정식 또는 데이비스(Davies) 방정식이 비-일관성 활성 계수를 설명하는 데에 사용되었다. 문헌에서 발견되는 상수들 중 일부의 값은 약간 상이할 수 있으나, 본 개시내용의 대상 이온 강도 값 범위 내에서 유사한 결과를 산출한다. 연장된 데비 휴켈 방정식은 수학식 3으로 제공된다:

데이비스 방정식은 수학식 4로 제공된다:

(식 중, n = 2z - 1이고, z는 n을 계산하기 위한 산성 완충제 형태의 순 전하임 (문헌 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practices, 2013])).

pK _a 가 이온 강도의 함수이기 때문에, 조성 및 이온 강도가 독립적으로 측정될 수는 없지만, 방정식 시스템의 일부가 된다. 상기 방정식 시스템은 상기언급된 이온 강도 방정식, 각 완충제의 산 해리 상수 및 각 완충제의 pK _a 방정식을 포함하고, 또한 각 완충제의 전기중성 조건 및 총 종 균형을 포함한다. 이와 같은 방정식 시스템을 사용하면, 몇 가지 값들이 추산될 수 있다. 예를 들면, 공지의 용액 pH를 사용하여 완충제 제제의 산-기반 비를 추산할 수 있거나, 또는 역으로 산-기반 비를 사용하여 용액 pH 및 상응하는 적정 부피를 추산할 수 있다. 이들 적용분야 중 어느 것에서도, 용리액 및 적정액 선택사항의 합리적인 선택을 안내하는 것을 돕기 위해 이온 강도가 추산될 수 있다.

심층 여과용 공급 재료의 것과 같은 본 개시내용의 완충된 시스템에 적격인 이온 강도를 계산하기 위해서는, 용액의 완충제 조성이 필요하다. 이와 같은 조성은 공정에 사용되는 완충제 및 적정액의 부피 및 조성에 기반하여 합리적으로 추산될 수 있다. 관련 기술분야에 알려져 있는 이온 측정 기술들을 사용하여 조성을 추산할 수도 있다.

용액 조성을 추산하기 위한 개시점으로 한 가지 가능한 방법론은 친화성 컬럼 용리액 풀이 측정된 용리액 풀의 pH에서 완충된다는 것을 예외로 하여 용리액의 것과 동일한 완충제 조성을 가진다고 가정하는 것이다. 예를 들어, 대상 단백질이 20 mM 아세트산을 사용하여 단백질 A 컬럼으로부터 용리되는 경우, 5 mM 락트산 및 용리액 풀은 4.2의 측정 pH를 가지며, 용리액 풀의 완충제 조성은 20 mM 아세테이트, 5 mM 락테이트, 및 pH가 4.2가 되게 하기에 충분한 NaOH라는 가정이 이루어지는데; 이는 약 ~8.2 mM의 NaOH와 일치하게 된다. 계산에는 총 소듐 양이온 Na⁺ 함량만이 중요하기 때문에, 용리액 소듐 함량이 소듐 아세테이트, 소듐 포스페이트, 소듐 히드록시드 또는 이들의 임의 조합으로부터 기원한다고 가정하는지 여부는 문제가 되지 않으며, 그에 따라 편리성을 위해 소듐을 NaOH로 전환하는 관습이 사용된다.

용리액 조성 및 용리액 pH를 사용하여 용리액의 완충제 조성을 추산하였으므로, 다음에는 용액 적정이 고려된다. 예를 들어, pH 4.2에서 20 mM 아세테이트, 5 mM 락테이트, ~8.2 mM NaOH의 추산된 용리액 조성에서, 바이러스 불활성화를 위해 3.45의 목표 값으로 pH를 낮추는 데에 필요한 20 mM HCl의 부피가 개시 부피의 0.305배에 상당하는 경우라면, 희석률로부터 pH 3.45에서의 그 공정 중간물의 조성이 알려지게 된다. 아세테이트, 락테이트 및 NaOH는 그의 각 개시 값의 1/1.305배로 존재하고 (즉 ~15.3 mM 아세테이트, ~3.8 mM 락테이트 및 ~6.2 mM NaOH), HCl은 적정액 중 그의 값의 0.305/1.305로 존재하게 된다 (~4.7 mM HCl). 유사하게, 250 mM 트리스 염기를 사용한 중화에 있어서, pH 7.0의 목표로 pH를 상승시키는 비가 pH 3.45 용액 부피의 0.0743배인 경우, 중화된 용액에서의 최종 농도를 찾기 위해서는 1/1.0743 및 0.0743/1.0743의 비가 적용되게 된다 (~14.3 mM 아세테이트, ~3.6 mM 락테이트, ~5.8 mM NaOH, ~4.4 mM HCl 및 ~17.3 mM 트리스). 모든 알려져 있는 값들을 방정식 시스템 (수학식 5 내지 15)에 투입하여 이온 강도를 계산한다:

(식 중, 트리스, 아세테이트 및 락테이트의 각 pK _a,o 값은 22 ℃에서 8.15, 4.76, 및 3.86인 것으로 밝혀졌음). 심층 여과 공급 재료 이온 강도의 최종 추산치는 22.1 mM이다.

본원에서 기술될 때, 단백질 생성물의 완충 용량은 직접적으로 모델링되지 않는다. 따라서, 강 산 또는 염기를 적정에 사용하는 경우, 계산치와 경험적 적정 결과 사이에 약간의 편차가 발생할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 불활성화를 위해 낮은 pH로 단백질 A 용리액을 적정하는 경우, 완충제 계산치는 통상적으로 필요한 20 mM HCl의 경험량을 하향추산하는데; 필요한 경험량은 계산된 추산치에 비해 50 % 수준으로 더 클 수 있다. 이와 같은 차이를 고려하는 한 가지 방식은 친화성 컬럼 용리액 재료를 더 높은 pH에서 모델링함으로써, 추산된 적정 부피가 실험 값과 일치할 때까지 값을 경험적으로 조정하는 것이다. 예를 들어, 상기 실시예에서, 20 mM HCl의 양이 처음에 추산된 것에 비해 0.305 비보다 50 % 더 높았던 경우, 단백질 A 용리액은 pH 4.2 대신 약 pH 4.45인 것으로 모델링되게 된다. 모델링에 대하여 이와 같은 경험적 변화를 줌으로써, 실시예의 추산 이온 강도는 지향성으로 감소되나, 소량만큼 만이다: 최초 22.1 mM 추산치로부터 아래로 21.9 mM. 이에 따라, 두 접근법이 본 개시내용의 바람직한 실시양태를 추론하기 위해 이온 강도를 추산하는 데에 충분하다는 결론이 내려진다.

대안적인 방법 : 이온 함량 측정법은 심층 여과 공급물 재료의 완충제 조성을 측정하여 이온 강도를 계산하는 데에 사용될 수 있다. 이는 측정치가 첨가되는 적정액의 양과 같은 임의의 알려져 있는 양과 자체-일치하는 결과를 산출한다는 확신을 필요로 한다. 친화성 컬럼 용리액의 완충제 조성은 용리액의 것과 일치하나 pH가 상이한 것으로 가정되기 때문에, 진정한 조성에 있어서의 차이는 이온 함량 측정에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 용리액 중 완충제 성분들의 이온 강도를 계산하는 데에는 용리액 조성 또는 측정된 값을 기반으로 하는 양 중 어느 하나가 사용될 수 있다.

[참조 개재]

본원에서 언급되는 모든 특허 및 공표물들은 그 전체가 의거 참조로 포함된다. 본원에서 논의되는 공표물들은 본 출원 출원일 전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명으로 인하여 그와 같은 공표물에 선행할 자격이 없다는 승인으로 해석되어서는 아니 된다.

[서열 목록]

하기의 핵산 및/또는 아미노산 서열들이 본 개시내용에서 언급되는 바, 참조용으로 하기에 제공한다.

서열식별번호: 1 - 밤라니비맙 가변 중쇄 ( VH )

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서열식별번호: 7 - 에테세비맙 중쇄 (HC)

서열식별번호: 8 - 에테세비맙 경쇄 (LC)

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서열식별번호: 11 - 벱텔로비맙 중쇄 (HC)

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서열식별번호:19 - 도나네맙의 LCDR3

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<220> <223> Synthetic Construct <400> 34 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggtta cgacttcact agatactata taaactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg attaatcctg gaagcggtaa tactaagtac 180 aatgagaaat tcaagggcag agtcaccatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaaggc 300 atcacggtct actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tcccgctagc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg acgagctgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcccc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gt 1332 <210> 35 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtcttggt aactggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatcag gcgtctactt tagaatctgg ggtcccatca 180 agattcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacat tataaaggtt ctttttggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acggaccgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642 <210> 36 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatccta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gagagagggg 300 ggctcaggga gttattataa cggctttgat tattggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagcct ccaccaaggg 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ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1260 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt 1353

Claims

포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법으로서,
a. 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;
b. 약산과 강산으로 구성되는 산 조합을 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시킴으로써 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
c. 용리액의 pH를 약 pH 5.0 초과로 상승시키는 단계; 및
d. 용리액을 심층 필터에 적용하고, 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼이 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 친화성 크로마토그래피 컬럼을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 약산 및 강산이 최대 약 pH 7.3의 일가 산인 방법.
제1항에 있어서, 약산이 아세트산이고, 강산이 인산 또는 락트산인 방법.
제4항에 있어서, 아세트산의 농도가 약 20 mM이고, 강산이 인산이고, 인산의 농도가 약 5 mM 내지 약 10 mM인 방법.
제4항에 있어서, 아세트산의 농도가 약 20 mM이고, 강산이 락트산이고, 락트산의 농도가 약 5 mM인 방법.
제1항에 있어서, 바이러스 불활성화를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼으로부터 단백질을 용리시키는 상기 단계로부터의 용리액의 pH를 약 pH 4.0 미만으로 조정하는 것을 포함하며 여기서 용리액은 약 0분 내지 약 180분 동안 약 pH 4.0 미만으로 유지되는 것인 바이러스 불활성화를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 용리액의 pH를 조정하는 상기 단계가 용리액의 pH를 약 pH 3.3 내지 약 pH 3.7로 조정하는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 용리액의 pH가 약 pH 3.5로 조정되는 것인 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용리액의 pH를 조정하는 것이 HCl, 인산, 또는 아세트산과 인산의 조합 중 임의의 1종을 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 용리액의 pH를 상승시키는 상기 단계가 pH를 약 pH 6.5 내지 약 pH 7.5로 상승시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 용리액의 pH가 약 pH 7.0으로 상승되는 것인 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 용리액의 pH를 상승시키는 단계가 트리스를 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 초과로 pH를 상승시키는 상기 단계에서의 용리액이 약 10 mM 내지 약 45 mM의 이온 강도를 가지는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 여과된 단백질 조제물을 하기 정제 및/또는 폴리싱 단계 중 하나 이상에 적용하여 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 약물 물질 조제물을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법: 바이러스 불활성화, 이온 교환 크로마토그래피, 바이러스 여과, 접선 유동 여과.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터가 셀룰로스/규조토-기반 필터인 방법.
제17항에 있어서, 심층 필터가 B1HC 필터, X0HC 필터 또는 제타 플러스 (ZB 미디어) 필터인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터가 합성 필터인 방법.
제19항에 있어서, 심층 필터가 C0SP 필터, X0SP 필터 또는 엠파즈 AEX 하이브리드 정제기 필터인 방법.
제20항에 있어서, 심층 필터가 X0SP 필터인 방법.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터 세공 크기가 적어도 약 9 μ 내지 약 0.1 μ인 방법.
제22항에 있어서, 심층 필터 세공 크기가 적어도 약 2 μ 내지 약 0.1 μ인 방법.
제23항에 있어서, 심층 필터 세공 크기가 약 0.1 μ인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터 상의 용리액의 pH가 약 5.0인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터 상의 용리액의 pH가 약 6.0인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터 상의 용리액의 pH가 약 7.0인 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포인 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 조제물이 수확된 세포 배양액, 포획 풀 또는 회수된 단백질 풀을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편인 방법.
제30항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 IgG1 항체인 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR은 아미노산 서열 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 아미노산 서열 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열식별번호:17)이고, LCDR2는 AVSKLDS (서열식별번호:18)이고, LCDR3은 VQGTHYPFT (서열식별번호:19)이고, HCDR1은 GYDFTRYYIN (서열식별번호:20)이고, HCDR2는 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열식별번호:21)이고, HCDR3은 EGITVY (서열식별번호:22)인 방법.
제32항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가 LCVR을 포함하고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가 HCVR을 포함하고, 여기서 LCVR은
이고, HCVR은
인 방법.
제32항 또는 제33항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가
이고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가
인 방법.
제34항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 도나네맙인 방법.
제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 100 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 방법.
제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 것인 방법: 단백질 S100-A6, 단백질 S100-A11, 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 라이소좀 보호 단백질, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a, 칼리크레인-11, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1, 보체 C1r 하위구성요소, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 및 퍼옥시레독신-1.
제37항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A6 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 10 ppm 미만의 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 칼리크레인-11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 보체 C1r 하위구성요소 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 열 충격 동계 71 kDa 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 100 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 방법.
제32항 내지 제35항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 것인 방법: 단백질 S100-A6, 단백질 S100-A11, 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 라이소좀 보호 단백질, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a, 칼리크레인-11, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1, 보체 C1r 하위구성요소, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 및 퍼옥시레독신-1.
제51항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A6 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 또는 제52항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 10 ppm 미만의 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 칼리크레인-11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 보체 C1r 하위구성요소 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 열 충격 동계 71 kDa 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR은 아미노산 서열 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 아미노산 서열 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSLGNWLA (서열식별번호: 27)이고, LCDR2는 YQASTLES (서열식별번호: 28)이고, LCDR3은 QHYKGSFWT (서열식별번호: 29)이고, HCDR1은 AASGFTFSSYPMS (서열식별번호: 30)이고, HCDR2는 AISGSGGSTYYADSVKG (서열식별번호: 31)이고, HCDR3은 AREGGSGSYYNGFDY (서열식별번호: 32)인 방법.
제64항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가 LCVR을 포함하고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가 HCVR을 포함하고, 여기서 LCVR은
이고, HCVR은
인 방법.
제64항 또는 제65항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가
이고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가
인 방법.
제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 10 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 방법.
제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 것인 방법: 폴리유비퀴틴, 라이소좀 보호 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1, 40S 리보솜 단백질 S28, 티오레독신 동형 X1, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질, 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2, 갈렉틴-1, 퍼옥시레독신-1 및 코르니핀 알파.
제68항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 폴리유비퀴틴 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 또는 제69항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질이 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 40S 리보솜 단백질 S28 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 티오레독신 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 갈렉틴-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제68항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 코르니핀 알파 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 10 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 방법.
제64항 내지 제66항 및 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 것인 방법: 폴리유비퀴틴, 라이소좀 보호 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1, 40S 리보솜 단백질 S28, 티오레독신 동형 X1, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질, 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2, 갈렉틴-1, 퍼옥시레독신-1 및 코르니핀 알파.
제82항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 폴리유비퀴틴 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 또는 제83항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질이 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 40S 리보솜 단백질 S28 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 티오레독신 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 갈렉틴-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제82항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 코르니핀 알파 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 조성물.
포유동물 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량을 감소시키는 방법으로서,
a) 단백질 조제물을 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용하는 단계;
b) 크로마토그래피 컬럼으로부터 항-N3pGlu Aβ 항체를 용리시킴으로써 항-N3pGlu Aβ 항체를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
c) 필요한 경우, 용리액의 pH를 pH 5.0 내지 pH 7.5 사이로 조정하고, 용리액을 심층 필터에 적용하고, 여과된 단백질 조제물을 수득하는 단계이며, 여기서 심층 필터는 완전 합성 심층 필터인 단계
를 포함하는 방법.
제96항에 있어서, 크로마토그래피 컬럼이 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L 친화성 크로마토그래피 컬럼을 포함하는 것인 방법.
제96항 또는 제97항에 있어서, 심층 필터 세공 크기가 적어도 약 9 μ 내지 약 0.1 μ인 방법.
제98항에 있어서, 심층 필터 세공 크기가 적어도 약 2 μ 내지 약 0.1 μ인 방법.
제99항에 있어서, 심층 필터 세공 크기가 약 0.1 μ인 방법.
제96항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터가 X0SP 필터인 방법.
제96항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터 상의 용리액의 pH가 약 5.0인 방법.
제96항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터 상의 용리액의 pH가 약 6.0인 방법.
제96항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 심층 필터 상의 용리액의 pH가 약 7.0인 방법.
제96항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포인 방법.
제96항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 조제물이 수확된 세포 배양액, 포획 풀 또는 회수된 단백질 풀을 포함하는 것인 방법.
제96항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편인 방법.
제107항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 IgG1 항체인 방법.
제96항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR은 아미노산 서열 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 아미노산 서열 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열식별번호:17)이고, LCDR2는 AVSKLDS (서열식별번호:18)이고, LCDR3은 VQGTHYPFT (서열식별번호:19)이고, HCDR1은 GYDFTRYYIN (서열식별번호:20)이고, HCDR2는 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열식별번호:21)이고, HCDR3은 EGITVY (서열식별번호:22)인 방법.
제109항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가 LCVR을 포함하고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가 HCVR을 포함하고, 여기서 LCVR은
이고, HCVR은
인 방법.
제109항 또는 제110항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가
이고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가
인 방법.
제111항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 도나네맙인 방법.
제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 100 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 방법.
제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 것인 방법: 단백질 S100-A6, 단백질 S100-A11, 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 라이소좀 보호 단백질, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a, 칼리크레인-11, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1, 보체 C1r 하위구성요소, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1, 열 충격 동계 71 kDa 단백질, 및 퍼옥시레독신-1.
제114항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A6 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 또는 제115항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 10 ppm 미만의 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 칼리크레인-11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 보체 C1r 하위구성요소 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 열 충격 동계 71 kDa 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제114항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 5 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 100 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 방법.
제109항 내지 제112항 및 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 것인 방법: 단백질 S100-A6, 단백질 S100-A11, 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 라이소좀 보호 단백질, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a, 칼리크레인-11, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1, 보체 C1r 하위구성요소, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1, 열 충격 동계 71 kDa 단백질, 퍼옥시레독신-1.
제128항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A6 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 또는 제129항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 10 ppm 미만의 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 칼리크레인-11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 보체 C1r 하위구성요소 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 열 충격 동계 71 kDa 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제128항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 5 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제96항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR은 아미노산 서열 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 아미노산 서열 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSLGNWLA (서열식별번호: 27)이고, LCDR2는 YQASTLES (서열식별번호: 28)이고, LCDR3은 QHYKGSFWT (서열식별번호: 29)이고, HCDR1은 AASGFTFSSYPMS (서열식별번호: 30)이고, HCDR2는 AISGSGGSTYYADSVKG (서열식별번호: 31)이고, HCDR3은 AREGGSGSYYNGFDY (서열식별번호: 32)인 방법.
제141항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가 LCVR을 포함하고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가 HCVR을 포함하고, 여기서 LCVR은
이고, HCVR은
인 방법.
제141항 또는 제142항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가
이고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가
인 방법.
제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 10 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 방법.
제141항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 것인 방법: 폴리유비퀴틴, 라이소좀 보호 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1, 40S 리보솜 단백질 S28, 티오레독신 동형 X1, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질, 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2, 갈렉틴-1, 퍼옥시레독신-1 및 코르니핀 알파.
제145항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 폴리유비퀴틴 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 또는 제146항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 40S 리보솜 단백질 S28 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 티오레독신 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 갈렉틴-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제145항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 조제물이 약 1 ppm 미만의 코르니핀 알파 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물 중 숙주 세포 단백질 함량이 10 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 방법.
제141항 내지 제143항 및 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 것인 방법: 폴리유비퀴틴, 라이소좀 보호 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1, 40S 리보솜 단백질 S28, 티오레독신 동형 X1, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질, 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2, 갈렉틴-1, 퍼옥시레독신-1 및 코르니핀 알파.
제159항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 폴리유비퀴틴 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 또는 제160항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질이 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 40S 리보솜 단백질 S28 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 티오레독신 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 갈렉틴-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 것인 방법.
제158항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 물질 조제물이 약 1 ppm 미만의 코르니핀 알파 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 것인 방법.
제96항 내지 제171항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 조성물.
인간 N3pGlu Aβ에 결합하는 항체 (항-N3pGlu Aβ 항체)를 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 항-N3pGlu Aβ 항체는 포유동물 숙주 세포로부터 항-N3pGlu 항체를 정제하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되고, 조성물 중 숙주 세포 단백질 (HCP)의 총 함량은 약 100 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 제약 조성물.
제173항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포인 제약 조성물.
제173항 또는 제174항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체 또는 항체 단편인 제약 조성물.
제175항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 IgG1 항체인 제약 조성물.
제173항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR은 아미노산 서열 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 아미노산 서열 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 KSSQSLLYSRGKTYLN (서열식별번호:17)이고, LCDR2는 AVSKLDS (서열식별번호:18)이고, LCDR3은 VQGTHYPFT (서열식별번호:19)이고, HCDR1은 GYDFTRYYIN (서열식별번호:20)이고, HCDR2는 WINPGSGNTKYNEKFKG (서열식별번호:21)이고, HCDR3은 EGITVY (서열식별번호:22)인 제약 조성물.
제177항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가 LCVR을 포함하고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가 HCVR을 포함하고, 여기서 LCVR은
이고, HCVR은
인 제약 조성물.
제177항 또는 제178항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가
이고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가
인 제약 조성물.
제179항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 도나네맙인 제약 조성물.
제173항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 제약 조성물: 단백질 S100-A6, 단백질 S100-A11, 포스포리파제 B-유사 2 단백질, 라이소좀 보호 단백질, 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a, 칼리크레인-11, 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1, 보체 C1r 하위구성요소, 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1, 열 충격 동계 71 kDa 단백질 및 퍼옥시레독신-1.
제181항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A6 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 또는 제182항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 단백질 S100-A11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 ppm 미만의 포스포리파제 B-유사 2 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 유비퀴틴-40S 리보솜 단백질 S27a (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 칼리크레인-11 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 세린 프로테아제 HTRA1 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 보체 C1r 하위구성요소 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 액틴, 대동맥 평활근 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 열 충격 동계 71 kDa 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제181항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제173항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체가 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 포함하고, 여기서 경쇄는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고, 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하고, 여기서 LCVR은 아미노산 서열 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 아미노산 서열 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSLGNWLA (서열식별번호: 27)이고, LCDR2는 YQASTLES (서열식별번호: 28)이고, LCDR3은 QHYKGSFWT (서열식별번호: 29)이고, HCDR1은 AASGFTFSSYPMS (서열식별번호: 30)이고, HCDR2는 AISGSGGSTYYADSVKG (서열식별번호: 31)이고, HCDR3은 AREGGSGSYYNGFDY (서열식별번호: 32)인 제약 조성물.
제194항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가 LCVR을 포함하고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가 HCVR을 포함하고, 여기서 LCVR은
이고, HCVR은
인 제약 조성물.
제194항 또는 제195항에 있어서, 항-N3pGlu Aβ 항체의 LC가
이고, 항-N3pGlu Aβ 항체의 HC가
인 제약 조성물.
제194항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중 숙주 세포 단백질 (HCP)의 총 함량이 약 10 ppm 미만 (LCMS에 의해 측정 시)인 제약 조성물.
제197항에 있어서, 하기의 숙주 세포 단백질 중 하나, 이들의 조합 또는 이들 전체를 포함하는 제약 조성물: 폴리유비퀴틴, 라이소좀 보호 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1, 40S 리보솜 단백질 S28, 티오레독신 동형 X1, 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1, 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질, 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2, 갈렉틴-1, 퍼옥시레독신-1 및 코르니핀 알파.
제198항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 폴리유비퀴틴 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 또는 199항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 라이소좀 보호 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 글루타치온 S-트랜스퍼라제 Y1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 40S 리보솜 단백질 S28 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 티오레독신 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 기저막-특이적 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 코어 단백질 동형 X1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 세뇨관간질성 신장염 항원-유사 단백질 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 액틴 - 부분적 세포질 2 동형 X2 (LCMS에 의해 측정 시)를 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 갈렉틴-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.
제198항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 ppm 미만의 퍼옥시레독신-1 (LCMS에 의해 측정 시)을 포함하는 제약 조성물.