TW202229307A - 於蛋白質純化方法中降低宿主細胞蛋白質含量之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑係在計畫投與患者之蛋白質之製造製程中,於宿主細胞中經重組產生。
Description
本發明係關於重組蛋白質製造領域。更特別地,本發明提供一種於包含所關注蛋白質之蛋白質製劑中降低宿主細胞蛋白質含量之方法,該所關注蛋白質於意在投與給患者之蛋白質之製造製程中於宿主細胞中經重組產生,諸如治療性或診斷性蛋白質。
宿主細胞蛋白質(HCP)係宿主細胞之蛋白質,其參與細胞維持及生長、及蛋白質合成及加工。然而,在治療性或診斷性蛋白質之領域中,HCP的存在因造成諸如聚集、藉由催化活性及/或免疫原性之產物片段化之擔憂而威脅產物品質及患者安全性。因此,HCP經識別為蛋白質調配物之關鍵品質屬性(CQA)。非所需聚集物之形成及產物片段化需要另外純化步驟以降低/移除HCP且此等另外純化步驟經常導致所需蛋白質之產率降低且總體製造成本增加。
已揭示自製造製程消除HCP之挑戰及改良該等製程以降低HCP之嘗試,例如如以下中所闡述:Gilgunn等人;Goey等人,Biotechnology Advances 36 (2018) 1223–1237;及Current Opinion in Chemical Engineering 2018,22:98–106。然而,此等移除HCP之製程具有限制。例如,在一些情況下,此等揭示內容證實以下中之一者或多者:不完全移除HCP;移除HCP之製程之不一致而導致所需蛋白質及HCP之聚集、共純化;產物功能受損;患者中免疫原性擔憂及/或藥物動力學性質(諸如半衰期)降低。此外,為移除HCP所開發的製程經常要求例如需要以增加之體積及另外純化步驟工作,從而經常導致製造成本增加及產率降低。在一些情況下,該方法之適用性受限於特定分子及/或形式。因此,仍需要於治療性或診斷性蛋白質之純化製程中降低HCP之替代方法。此類替代方法降低HCP較佳地而不影響產物穩定性、產率或成本以最終維持產物品質且適合大規模製造並確保患者安全。
因此,本發明藉由提供於製備治療性或診斷性蛋白質中降低HCP之替代方法來解決上述問題中之一者或多者。本發明之方法提供高效移除HCP,同時保留蛋白質穩定性,降低聚集,維持產物產率的具有複驗性之方法,且具有降低免疫原性風險之潛力。此類方法可有效地移除HCP而不需要增加蛋白質製劑體積。驚人地,本發明之方法達成遠低於<100 ppm之工業可接受標準之HCP計數。驚人地,在實施例中,本發明方法達成< 50 ppm之HCP計數,同時保持蛋白質穩定性,降低聚集,及維持產物產率。更驚人地,本發明之其他實施例達成< 20 ppm之HCP計數,同時保留蛋白質穩定性,降低聚集,及維持產物產率。此外,本發明之實施例提供HCP移除方法,該等方法適用於廣泛範圍之分子。本發明之其他實施例使能消除另外純化步驟,從而導致分批加工時間縮短及製造成本降低。
因此,特定實施例提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0,使溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。在一些實施例中,弱酸具有不多於一個小於7.0的pKa值,及強酸具有不多於一個小於7.0的pKa值。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
因此,在特定實施例中,提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,對溶離液進行病毒滅活,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0,使溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。在一些實施例中,弱酸具有不多於一個小於7.0的pKa值,及強酸具有不多於一個小於7.0的pKa值。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
因此,在特定實施例中,提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,進行病毒滅活,其包括將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
因此,在特定實施例中,提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為磷酸或乳酸,將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在本發明之一些實施例中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為磷酸,其中該乙酸之濃度為約20 mM,且其中該磷酸之濃度為約5 mM至約10 mM,將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在本發明之一些實施例中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為乳酸,其中該乙酸之濃度為約20 mM,且其中該乳酸之濃度為約5 mM,將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在一些實施例中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為磷酸或乳酸,調整來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH,其中該調整溶離液之pH之步驟包括將約20 mM HCl添加至溶離液,其中將溶離液之pH調整至約pH 3.3至約pH 3.7,且其中將溶離液維持在約pH 3.3至約pH 3.7約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在一些實施例中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為磷酸或乳酸,調整來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH,其中該調整溶離液之pH之步驟包括將約20 mM HCl添加至溶離液,其中將溶離液之pH調整至約pH 3.5,且其中將溶離液維持在約pH 3.5約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在一些特定實施例中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為磷酸或乳酸,將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5,其包括將約250 mM Tris緩衝液添加至溶離液,及使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,將溶離液之pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5包括將約100 mM至約1000 mM Tris緩衝液添加至溶離液。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.5至約pH 7.5之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在一些實施例中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為磷酸或乳酸,將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至約pH 7.0,其包括將約250 mM Tris緩衝液添加至溶離液,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,將溶離液之pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5包括將約100 mM至約1000 mM Tris緩衝液添加至溶離液。在一些實施例中,來自將pH升高至約pH 7.0之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在一些實施例中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為磷酸或乳酸,將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至高於約6.0的pH,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑,其中經過深度過濾器之溶離液具有約10 mM至約45 mM之離子強度。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在特定實施例中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸為乙酸及該強酸為磷酸或乳酸,將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,且其中達成病毒滅活。
本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱,從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液,其中該弱酸包含濃度為約20 mM之乙酸,且其中該強酸包含磷酸、甲酸或乳酸中之任何一者,且其中該強酸之濃度為約5 mM至約10 mM,調整來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH,其中該調整溶離液之pH之步驟包括將HCl、磷酸、檸檬酸或乙酸加上磷酸組合中之任何一者添加至溶離液,其中將該pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘,將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0至約pH 7.5,使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之蛋白質製劑。在一些實施例中,來自將pH升高至高於約pH 6.0至約7.5之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm。在其他實施例中,溶離步驟包括酸組合,該酸組合包括乙酸及磷酸、乙酸及乳酸、或乙酸及甲酸,且其中該將pH調整至低於約pH 4.0之步驟包括添加HCl、磷酸、檸檬酸、或乙酸及磷酸組合中之任何一者。在其他實施例中,溶離步驟包括約20 mM乙酸及約10 mM磷酸、約20 mM乙酸及約5 mM磷酸、或約20 mM乙酸及約5 mM甲酸中之任何一者之組合,且其中該將pH調整至低於約pH 4.0之步驟包括添加約20 mM HCl、約15 mM至約200 mM磷酸、約1000 mM檸檬酸、或約20 mM乙酸及約10 mM磷酸組合中之任何一者。在此類實施例中,來自將pH升高至高於約6.0的pH之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。
在本發明之一個態樣中,本發明提供一種降低蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,該蛋白質製劑包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質,該方法包括以下步驟:
使於宿主細胞中經重組產生的蛋白質製劑經過親和層析管柱;
從層析管柱用包含弱酸及強酸之酸組合溶離所關注蛋白質以獲得包含所關注蛋白質之溶離液;其中該弱酸為乙酸且該強酸為磷酸或乳酸;
將來自該從層析管柱溶離蛋白質之步驟的包含蛋白質之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將溶離液維持在低於約pH 4.0約0分鐘至約180分鐘;
將溶離液之pH升高至高於約pH 6.0;
使包含蛋白質之溶離液經過深度過濾器;及
獲得經過濾之蛋白質製劑。
較佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量減小。更佳地,經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm,降低至小於50 ppm,或降低至小於約20 ppm。
在一些實施例中,該蛋白質為治療性或診斷性蛋白質,例如抗體、Fc融合蛋白、肽、免疫黏附素、酵素、生長因子、受體、激素、調節因子、細胞介素、抗原、肽或結合劑。在一些實施例中,該蛋白質為抗體,例如單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、雙特異性抗體或抗體片段。在一些實施例中,該蛋白質為IgG1抗體或含有IgG1抗體之Fc部分。在一些實施例中,該蛋白質為抗SARS-COV-2抗體。
在本發明之另一個態樣中,本發明提供一種降低於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,該方法包括以下步驟:
使於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑經過親和層析管柱,例如蛋白A親和層析管柱;
使用包含乙酸及磷酸之酸組合、或乙酸及乳酸之組合溶離抗SARS-COV-2抗體,以獲得包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液;
藉由添加約20 mM HCl來調整包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH調整至約pH 3.3至約pH 3.7,且其中將溶離液維持在約pH 3.3至約pH 3.7約0分鐘至約180分鐘;
藉由添加約250 mM Tris緩衝液來升高包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5;及
使包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑,
其中,於該深度過濾之後,經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量降低至約0 ppm至約100 ppm,且其中該抗SARS-COV-2抗體為IgG1抗體。
在本發明之一些實施例中,本發明提供一種降低於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑經過蛋白A層析管柱,使用包含約20 mM乙酸及約5 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約10 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約5 mM乳酸之酸組合,從層析管柱溶離抗SARS-COV-2抗體,以獲得包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液,藉由添加約20 mM HCl調整包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH降低至約pH 3.3至約pH 3.7,且其中將溶離液維持在約pH 3.3至約pH 3.7約0分鐘至約180分鐘,藉由添加約250 mM Tris緩衝液升高包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5,使包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑,其中該經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑之宿主細胞蛋白質含量為約0 ppm至約100 ppm,且其中該抗SARS-COV-2抗體為IgG1抗體。在一些實施例中,將溶離液之pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5包括將約100 mM至約1000 mM Tris緩衝液添加至溶離液。
在本發明之一些實施例中,本發明提供一種降低於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑經過蛋白A層析管柱,從層析管柱用包含約20 mM乙酸及約5 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約10 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約5 mM乳酸之酸組合溶離抗SARS-COV-2抗體以獲得包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液,用約20 mM HCl調整包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH調整至約pH 3.5,且其中將溶離液維持在約pH 3.5約0分鐘至約180分鐘,用約250 mM Tris緩衝液升高包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5,使包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑,其中該經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑之宿主細胞蛋白質含量為約0 ppm至約100 ppm,且其中該抗SARS-COV-2抗體為IgG1抗體。在一些實施例中,將溶離液之pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5包括將約100 mM至約1000 mM Tris緩衝液添加至溶離液。
在本發明之一些實施例中,本發明提供一種降低於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑經過蛋白A層析管柱,從層析管柱用包含約20 mM乙酸及約5 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約10 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約5 mM乳酸之酸組合溶離抗SARS-COV-2抗體以獲得包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液,藉由添加約20 mM HCl調整包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH降低至約pH 3.5,且其中將溶離液維持在約pH 3.5約0分鐘至約180分鐘,且其中達成病毒滅活。
在本發明之一些實施例中,本發明提供一種降低於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑經過蛋白A層析管柱,從層析管柱用包含約20 mM乙酸及約5 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約10 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約5 mM乳酸之酸組合溶離抗SARS-COV-2抗體以獲得包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液,藉由添加約20 mM HCl調整包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH降低至約pH 3.3至約pH 3.7,且其中將溶離液維持在約pH 3.3至約pH 3.7約0分鐘至約180分鐘,用約250 mM Tris緩衝液升高包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH升高至約pH 7.25,使包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑,其中該經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑之宿主細胞蛋白質含量為約0 ppm至約100 ppm,且其中該抗SARS-COV-2抗體為IgG1抗體。在一些實施例中,將溶離液之pH升高至約pH 7.25包括將約100 mM至約1000 mM Tris緩衝液添加至溶離液。
在本發明之一些實施例中,本發明提供一種降低於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,該方法包括使於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑經過蛋白A層析管柱,從層析管柱用包含約20 mM乙酸及約5 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約5 mM磷酸之酸組合、或包含約20 mM乙酸及約5 mM乳酸之酸組合溶離抗SARS-COV-2抗體以獲得包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液,藉由添加約20 mM HCl調整包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH降低至約pH 3.5,且其中將溶離液維持在約pH 3.5約0分鐘至約180分鐘,藉由添加約250 mM Tris緩衝液升高包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液之pH,其中將該pH升高至約pH 7.25,使包含抗SARS-COV-2抗體之溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑,其中該經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑之宿主細胞蛋白質含量為約0 ppm至約100 ppm,且其中該抗SARS-COV-2抗體為IgG1抗體。在一些實施例中,將溶離液之pH升高至約pH 7.25包括將約100 mM至約1000 mM Tris緩衝液添加至溶離液。
在一些實施例中,本發明提供降低於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法。
在一些實施例中,抗SARS-COV-2抗體係巴尼韋單抗(bamlanivimab)。在一些實施例中,抗SARS-COV-2抗體包含包含SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列之可變輕鏈。在一些實施例中,抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列之輕鏈。在其他實施例中,抗SARS-COV-2抗體為埃特司韋單抗(etesevimab)。在又其他實施例中,抗SARS-COV-2抗體包含包含SEQ ID NO: 5所示的胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO: 6所示的胺基酸序列之可變輕鏈。在又其他實施例中,抗SARS-COV-2抗體包含包含SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 8所示的胺基酸序列之輕鏈。在一些實施例中,抗SARS-COV-2抗體為貝洛韋單抗(bebtelovimab)。在又其他實施例中,抗SARS-COV-2抗體包含包含SEQ ID NO: 9所示的胺基酸序列之可變重鏈及包含SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列之可變輕鏈。在又其他實施例中,抗SARS-COV-2抗體包含包含SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中,該蛋白質,例如治療性或診斷性蛋白質於哺乳動物細胞中產生。在一些實施例中,哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或幼倉鼠腎(BHK)細胞、鼠類融合瘤細胞或鼠類骨髓瘤細胞。在一些實施例中,治療性或診斷性蛋白質於細菌細胞中產生。在其他實施例中,治療性或診斷性蛋白質於酵母細胞中產生。
在一些實施例中,本發明提供方法,其中該降低於包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法在經過深度過濾器後進一步經過離子交換層析。
在一些實施例中,本發明提供一種降低於包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,其中該蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約100 ppm。在其他實施例中,蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約50 ppm。在其他實施例中,蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約20 ppm。在其他實施例中,蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於約10 ppm。在其他實施例中,蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至約0 ppm。
在一些實施例中,本發明提供一種降低於包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,其中該蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質內容物包含PLBL2,且其中該PLBL2降低至小於約100 ppm。在其他實施例中,PLBL2降低至小於約50 ppm。在其他實施例中,PLBL2降低至小於約20 ppm。在其他實施例中,PLBL2降低至小於約10 ppm。在其他實施例中,PLBL2降低至約0 ppm。
在一些實施例中,本發明提供一種降低於包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,其中在從蛋白質捕獲溶離液進行深度過濾後,該蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低約97%。在其他實施例中,蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低約99%。在其他實施例中,蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低約99.9%。在其他實施例中,蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低約99.99%。在其他實施例中,蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低約100%。
在一些實施例中,本發明提供一種降低於包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,其中該蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質內容物包含PLBL2,且其中該PLBL2降低至小於約100 ppm。在其他實施例中,PLBL2降低至小於約50 ppm。在其他實施例中,PLBL2降低至小於約20 ppm。在其他實施例中,PLBL2降低至小於約10 ppm。在其他實施例中,PLBL2降低至約0 ppm。
在一些實施例中,本發明提供降低於包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,其中使該蛋白質製劑經過深度過濾。在一些實施例中,深度過濾器為X0SP、C0SP、X0HC、Emphaze™ AEX Hybrid Purifier綜合過濾器、Zeta Plus (ZB Media) (諸如Zeta Plus (60ZB05A)、Zeta Plus (90ZB05A)或Zeta Plus (90ZB08A))中之一者或多者。
在一些實施例中,本發明提供一種降低於包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量之方法,其中來自將pH升高至高於約6.0的pH之步驟之溶離液之離子強度為約10 mM至約45 mM。在一些實施例中,離子強度為小於約30 mM。在一些實施例中,離子強度為小於約20 mM。在其他實施例中,離子強度為小於約15 mM。
在一些實施例中,本發明提供方法,其中使包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑經過層析管柱。在一些實施例中,層析管柱為親和管柱、離子交換管柱、疏水性相互作用管柱、羥磷灰石管柱或混合模式管柱中之一者或多者。在一些實施例中,親和層析管柱為蛋白A管柱、蛋白G管柱或蛋白L管柱。在其他實施例中,離子交換層析管柱為陰離子交換管柱或陽離子交換管柱。在一些實施例中,本發明提供方法,其中將HCP從最終產物中充分移除。
在一些實施例中,本發明提供降低於包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中之宿主細胞蛋白質含量之方法,其中該蛋白質為治療性或診斷性蛋白質。在其他實施例中,該治療性或診斷性蛋白質為抗體、Fc融合蛋白、免疫黏附素、酵素、生長因子、受體、激素、調節因子、細胞介素、抗原或結合劑。在其他實施例中,抗體為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、雙特異性抗體或抗體片段。
在另一個態樣中,本文提供包含本文所述的蛋白質製劑、核酸或載體之醫藥組合物。在其他態樣中,本發明提供一種藉由如本文所述的方法產生的組合物。在又其他實施例中,本發明提供一種藉由如本文所述的方法產生的組合物,其中該組合物中之宿主細胞蛋白質含量小於約100 ppm。
本申請案根據35 U.S.C. §119(e)主張2020年10月2日申請之美國臨時申請案序號63/086,915之權益;該申請案之揭示內容係以引用之方式併入本文中。
術語「宿主細胞蛋白質(HCP)」為參與細胞維持及生長、及蛋白質合成及加工之宿主細胞之蛋白質。此類HCP例如包括彼等來自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞者,例如磷脂酶B-樣2 (PLBL2)、vLPL (脂蛋白脂酶)、vLAL (溶酶體酸脂酶、溶酶體脂酶、LIPA)、vPLA2 (磷脂酶A2)、vPPT1 (棕櫚醯蛋白硫酯酶1)、PLBD2及/或過氧化物還原酶(Peroxiredoxin)。
術語「弱酸」係指具有>約4之最低pKa之酸。弱酸之實例包括但不限於乙酸、琥珀酸及2-(
N-嗎啉基)乙磺酸。
術語「強酸」係指具有<約4之最低pKa之酸。強酸之實例包括但不限於磷酸、乳酸、甲酸、蘋果酸、丙二酸、乙醇酸、檸檬酸、酒石酸及鹽酸。
術語「深度過濾器」係指使用多孔過濾介質之過濾器元件,該多孔過濾介質將顆粒保留在整個介質中(於介質內及於介質上)而非僅僅於介質之表面上。深度過濾器可另外具有由於組成其的材料之化學性質所致之吸附能力。市售深度過濾器之實例包括但不限於X0SP、C0SP、X0HC、Emphaze™ AEX綜合過濾器、Zeta Plus (60ZB05A)、Zeta Plus (90ZB05A)及Zeta Plus (90ZB08A)。術語「深度過濾」係指使液體材料通過之動作,該液體材料可非均質或均質穿過深度過濾器。在一些實施例中,液體材料包含包含所關注蛋白質之蛋白質製劑。
「蛋白質製劑」係為純化製程或方法提供之材料或溶液,該材料或溶液含有治療性或診斷性所關注蛋白質且其亦可含有各種雜質。非限制性實例可包括例如所收穫的細胞培養液(HCCF)、所收穫的細胞培養物材料、澄清化細胞培養液、澄清化細胞培養物材料、捕獲集合物、所回收的集合物、及/或在一或多個離心步驟及/或過濾步驟之後的含有治療性或診斷性所關注蛋白質之所收集的集合物,該捕獲集合物、所回收的蛋白質集合物及/或所收集的集合物在一或多個純化步驟之後含有治療性或診斷性所關注蛋白質。
術語「雜質」係指不同於所需蛋白質產物之材料。該雜質包括但不限於:宿主細胞材料,諸如宿主細胞蛋白質、CHOP;淋溶(leached)蛋白A;核酸;變異體、大小變異體、片段、聚集物、或所需蛋白質之衍生物;另一蛋白質;內毒素;病毒污染物;細胞培養基組分等。
術語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用以指任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可係直鏈或分支鏈的,其可包含經修飾之胺基酸,且其可間雜非胺基酸。該等術語亦涵蓋已經天然修飾或藉由介入修飾之胺基酸聚合物;例如,二硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化、或任何其他操縱或修飾,諸如與標記組分的結合。該定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知的其他修飾之蛋白質。蛋白質之實例包括但不限於抗體、肽、酵素、受體、激素、調節因子、抗原、結合劑、細胞介素、Fc融合蛋白、免疫黏附素分子等。
術語「抗體」如本文所用係指結合抗原之免疫球蛋白分子。抗體之實施例包括單株抗體、多株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、雙特異性或多特異性抗體或結合抗體。該等抗體可係任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)及任何亞類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。
本發明之示例性抗體為免疫球蛋白G (IgG)型抗體,其包含四條多肽鏈:兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC),其係經由鏈間二硫鍵交聯。四條多肽鏈中各者之胺基端部分包含主要負責抗原識別之約100至125個或更多個胺基酸之可變區。四條多肽鏈中各者之羧基端部分含有主要負責效應功能之恆定區。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區。各輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區。IgG同型物可進一步分為亞類別(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。
VH及VL區域可進一步細分為稱為互補決定區(CDR)之超變區,其內部分散有更加保守之稱為框架區(FR)之區域。將CDR暴露於蛋白質之表面上且為抗體之針對抗原結合特異性之重要區域。各VH及VL包含三個CDR及四個FR,自胺基端至羧基端以以下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文中,重鏈之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」及輕鏈之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有大多數殘基,其與抗原形成特異性相互作用。CDR之胺基酸殘基分配可根據熟知方案來完成,該等方案包括描述於以下之其等方案:Kabat (Kabat等人,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))、Chothia (Chothia等人,「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,196,901-917 (1987);Al-Lazikani等人,「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」,Journal of Molecular Biology,273,927-948 (1997))、North (North等人,「A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations」,Journal of Molecular Biology,406,228-256 (2011))、或IMGT (國際ImMunoGeneTics資料庫,可獲自www.imgt.org;參見Lefranc等人,Nucleic Acids Res.1999;27:209-212)。
本發明之實施例亦包括抗體片段或抗原結合片段,其如本文所使用包含抗體之保留與抗原或抗原之抗原決定基特異性相互作用之能力的至少一部分,諸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗體片段、scFab、經二硫鍵連接之Fvs (sdFv)、Fd片段。
術語「抗SARS-CoV2抗體」如本文所用係指結合SARS-CoV-2之刺突(S)蛋白之抗體。SARS-CoV-2刺突(S)蛋白之胺基酸序列已在前文進行描述,例如GenBank寄存編號:YP_009724390.1。
術語「超過濾」或「過濾」係一種膜過濾形式,其中靜水壓迫使液體抵靠半透膜。高分子量之懸浮固體及溶質經保留,而水及低分子量溶質通過膜。在一些實例中,超過濾膜具有在1 μm至100 μm之範圍內之孔徑。術語「超過濾膜」、「超過濾過濾器」、「過濾膜」及「過濾過濾器」可互換使用。過濾膜之實例包括但不限於聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、乙酸纖維素、硝酸纖維素、聚四氟乙烯(PTFE、鐵氟龍(Teflon))、聚氯乙烯、聚醚碸、玻璃繊維、或適合用於cGMP製造環境中之其他過濾材料。
如本文所用,數值範圍包括限定該範圍之數值。
此項技術中公認的術語「EU編號」係指對免疫球蛋白分子之胺基酸殘基編號之系統。EU編號描述於例如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991);Edelman, G.M等人,Proc. Natl. Acad. USA,63,78-85 (1969);及http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs。術語「Kabat編號」在此項技術中公認為係指對胺基酸殘基編號之系統,該等殘基比在重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基更可變(亦即超變) (參見,例如Kabat等人,
Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971);Kabat等人,
Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S. Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號(1991))。術語「North編號」係指對胺基酸殘基編號之系統,該等殘基比在重鏈及輕鏈可變區中之其他胺基酸殘基更可變(亦即超變)且至少部分地基於具有大量晶體結構之親和力傳播叢集,如(North等人,
A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology,406:228-256 (2011)中所述。
如本文所用,術語「親和層析」係指用於基於生物分子之間的特定、可逆相互作用來分離生物化學混合物(例如,蛋白質及非所需生物分子物種)之層析方法。親和層析之示例性實施例包括蛋白A親和、蛋白G親和、蛋白L親和、κ親和配位體層析(諸如CaptureSelect™、KappaXL™、KappaSelect™、KappaXP™)或λ親和配位體層析。
本發明之蛋白質可併入至醫藥組合物中,該醫藥組合物可藉由此項技術中熟知的方法來製備且其包含本發明之蛋白質及一或多種醫藥上可接受之載劑及/或稀釋劑(例如,
Remington,
The Science and Practice of Pharmacy,第22版,Loyd V.編,Pharmaceutical Press,2012,其提供提供如操作者一般已知的調配物技術之概要)。用於醫藥組合物之適宜載劑包括任何材料,當與蛋白質組合時,其保留分子的活性且不會與患者的免疫系統反應。
此項技術中熟知能夠主導以可操作方式所連接的基因之表現之表現載體。表現載體可編碼促進宿主細胞分泌多肽之信號肽。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽。經表現之多肽中的各者可分別獨立由在一個載體中以可操作方式連接的不同啟動子表現,或替代地,可分別獨立由在多個載體中以可操作方式連接的不同啟動子表現。表現載體通常作為游離基因體(episome)或作為宿主染色體DNA之組成部分,在宿主生物體中複製。通常,表現載體將含有選擇標記(例如四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶),以允許偵測經過所需DNA序列轉化之彼等細胞。
宿主細胞係指經過表現本發明一或多種蛋白質之一或多種表現載體穩定或暫時轉染、轉化、轉導或感染之細胞。可使用此項技術中已知的標準技術來達成產生本發明蛋白質之宿主細胞系的建立及分離。哺乳動物細胞係用於表現本發明之蛋白質之較佳宿主細胞。特定哺乳動物細胞包括HEK 293、NS0、DG-44及CHO。較佳地,該等蛋白質經分泌至培養宿主細胞的培養基中,可藉由例如使用習知技術,自該培養基回收或純化該等蛋白質。例如,培養基可施加至蛋白A親和層析管柱及/或κ親和配位體或λ親和配位體層析管柱且從其溶離出。可藉由常用技術(包括尺寸排阻、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石層析)有效移除包括可溶性聚集物及多聚體的之非所需生物分子物種。產物可立即冷凍(例如在-70℃下)、冷藏、或可進行凍乾。可採用各種蛋白質純化方法且此類方法係此項技術中已知的且描述於例如Deutscher,
Methods in Enzymology182: 83-89 (1990) and Scopes,
Protein Purification: Principles and Practice,第3版,Springer,NY (1994)中。
實例
藉由 LCMS 測 量 宿主細胞蛋白質 (HCP) :於隨後的實例中為了評估對宿主細胞蛋白質(HCP)含量之純化影響,藉由肽圖譜分析(peptide mapping)/LC-MS/MS HCP概況分析經由例如耦合至Thermo Scientific質譜儀之超效液相層析(UPLC)來分析樣品。在該分析中,樣品經過胰蛋白酶消化,用二硫蘇糖醇(DTT)還原/沉澱,接著於HPLC小瓶中轉移並酸化上清液以進行LC-MS/MS分析。用所添加的抗體、刺突蛋白及對照蛋白質序列,藉由蛋白質組發現者針對CHO-K1蛋白質資料庫來分析LC-MS/MS資料。HCP含量報告為每個樣品中HCP的總百萬分率(ppm)用於總HCP含量(例如ng HCP/mg產物)。另外,亦提供磷脂酶B-樣2(PLBL2)含量。
藉由 ELISA 測量 HCP :亦在隨後的實例中藉由ELISA檢定來評估樣品中之HCP含量,該ELISA檢定使用Gyrolab
®CHO-HCP套組1 (Cygnus Technologies,按照製造商說明書進行)。HCP含量報告為每樣品中HCP的總百萬分率(ppm)用於總HCP含量。
實例 1 — mAb1 ( 埃特司韋單抗 ) 純化製程中 HCP 的降低
蛋白質捕獲步驟:使經消毒之蛋白A管柱(MabSelect SuRe蛋白A介質)平衡且將mAb1 (埃特司韋單抗)無細胞生物反應器收穫物加載至蛋白A管柱上並使用20 mM Tris (pH 7.0)作為最後一次洗滌來進行蛋白A管柱的三次洗滌。使用5管柱體積(CV) 20 mM乙酸 + 5 mM磷酸從管柱溶離mAb1。藉由在正面及背面上使用基於吸光度之峰值切割,將主要產物溶離份收集成單一總體溶離份。
低 pH 病毒滅活步驟及中和步驟:病毒滅活藉由添加20 mM HCl將所收集的含有mAb1之主要產物溶離份(蛋白質捕獲溶離液總體溶離份)之pH調整至在3.30與3.60之間的pH來進行。將混合物在18℃至25℃下培養約180分鐘。然後使用250 mM Tris鹼pH未調整之緩衝液將混合物中和至7.0的pH。
深度過濾步驟:用注射用水(WFI)沖洗深度過濾器(X0SP,Millipore)。將從低pH病毒滅活步驟及中和步驟獲得的mAb1混合物以1200 g/m
2(mAb公克數/m
2深度過濾器膜面積)之負載施加至深度過濾器。用WFI沖洗經負載之深度過濾器。使用250 mM Tris鹼pH未調整之緩衝液將來自深度過濾器之濾液(視需要包含負載後WFI沖洗液)中和至pH 8.0。
陰離子交換 (AEX) 層析步驟:用2 CV 20 mM Tris (pH 8.0)平衡經消毒之管柱(Q Sepharose快速流動陰離子交換層析介質,或QFF)。將從深度過濾步驟獲得的mAb1溶液以25 g至100 g/公升樹脂之負載加載至管柱上,且用平衡緩衝液進行另外洗滌。藉由由未結合溶離份加上另外洗滌所形成的峰面積的正面及背面上基於吸光度之峰值切割來收集mAb1。
結果:使用所述純化製程,如藉由LC-MS所測得的總HCP含量為:
● 於蛋白A溶離後,23299 ppm;
● 於X0SP深度過濾後,13 ppm;
● 於AEX層析後,2 ppm。
m Ab1 之深度過濾器設置 1 評估: 基本上如上所述,透過蛋白A、低pH病毒滅活、中和及深度過濾步驟加工mAb1。四種不同深度過濾器:Emphaze™ AEX綜合過濾器、Zeta Plus BC25 –60ZB05A、Zeta Plus BC25 – 90ZB05A及Zeta Plus BC25 – 90ZB08A (3M)以2000 g/m
2之負載進行測試,如表1中所示。表1中之結果顯示,針對所測試的4個深度過濾器,當與於蛋白A溶離後藉由LCMS (28901 ppm)及Elisa (527 ppm)所觀測到的總HCP含量進行比較時,於深度過濾後藉由LCMS (在24至31 ppm之範圍內)及/或ELISA (在6至16 ppm之範圍內)測得的總HCP含量顯著降低。
表 1. 深度過濾之前及之後的 mAb1 總 HCP 含量
實例 2 — mAb2 ( 巴尼韋單抗 ) 純化製程中 HCP 的降低
蛋白 A 溶離後的總 HCP 含量 (ppm) | 深度過濾器 | 深度過濾後的總 HCP 含量 (ppm) | ||
LCMS | ELISA | LCMS | ELISA | |
28901 | 527 | Emphaze™ AEX綜合過濾器 | 不可用 | 16 |
Zeta Plus BC25 – (60ZB05A) | 31 | 8 | ||
Zeta Plus BC25 – (90ZB05A) | 29 | 7 | ||
Zeta Plus BC25 – (90ZB08A) | 24 | 6 |
蛋白 A 溶離緩衝液比較:基本上如實例1中針對mAb1所描述來製備mAb2 (巴尼韋單抗),但具有以下不同:1)使用如表2中所列的緩衝液組合從蛋白A捕獲管柱溶離mAb2,2)在低pH病毒滅活步驟之後且在深度過濾步驟之前,使用250 mM Tris鹼pH未調整之緩衝液將mAb2溶液中和至7.25而非7.0的pH,及3) AEX層析係使用Poros XQ樹脂進行。在如表2及表3所列的純化單元操作之後,經由LCMS評估HCP含量(總HCP含量及PLBL2含量)。
表2及表3中之結果顯示,針對所測試的所有3種酸組合,在深度過濾步驟之後之總HCP及PLBL2含量均降低。具體而言,當與20 mM乙酸 + 5 mM檸檬酸組合進行比較時,20 mM乙酸 + 5 mM磷酸及20 mM乙酸 + 5 mM L-乳酸之組合顯示在深度過濾之後總HCP含量之更大降低至小於20 ppm。此外,用20 mM乙酸 + 5 mM磷酸及20 mM乙酸 + 5 mM L-乳酸組合的深度過濾之後的PLBL2含量降低至低於定量極限。
表 2. 使用不同蛋白 A 溶離緩衝液的 mAb2 總 HCP 含量
表 3. 使用不同蛋白 A 溶離緩衝液的 mAb2 PLBL2 含量
蛋白 A 溶離緩衝液 | 蛋白 A 溶離之後藉由 LCMS 偵測的總 HCP(ppm) | X0SP 深度濾過之後藉由 LCMS 偵測的總 HCP (ppm) | AEX 層析之後藉由 LCMS 偵測的總 HCP (ppm) |
20 mM 乙酸 + 5 mM 檸檬酸 | 71022 | 469 | 55 |
20 mM 乙酸 + 5 mM 磷酸 | 77892 | 7 | 11 |
20 mM 乙酸 + 5 mM L- 乳酸 | 78669 | 16 | 低於定量極限 |
蛋白 A 溶離緩衝液 | 蛋白 A 溶離之後藉由 LCMS 偵測的 PLBL2 (ppm) | X0SP 深度過濾之後藉由 LCMS 偵測的 PLBL2 (ppm) | AEX 層析之後藉由 LCMS 偵測的 PLBL2 (ppm) |
20 mM 乙酸 + 5 mM 檸檬酸 | 356 | 454 | 8 |
20 mM 乙酸 + 5 mM 磷酸 | 351 | 低於定量極限 | 低於定量極限 |
20 mM 乙酸 + 5 mM L- 乳酸 | 404 | 低於定量極限 | 低於定量極限 |
深度過濾器設置 2 評估:基本上如針對mAb1所述來製備mAb2,但具有以下不同:1)在低pH病毒滅活步驟之後且在深度過濾步驟之前,使用250 mM Tris鹼pH未調整之緩衝液將mAb2溶液中和至7.25而非7.0的pH,及2)利用顯示於表4中之深度過濾器來進行深度過濾步驟。
表4中之結果顯示,在深度過濾步驟之後,利用1500 g/m
2負載之所用3種設置2深度過濾器(X0SP、C0SP、X0HC,(Millipore))的深度過濾之後的總HCP及PLBL2含量降低至小於20 ppm。
表 4. 深度過濾之前及之後的 mAb2 HCP 總含量及 PLBL2 含量
實例 3. mAb3 ( 貝洛韋單抗 ) 純化製程中 HCP 的降低
於蛋白 A 溶離之後藉由 LCMS 測得 的總 HCP 含量 (ppm) | 於蛋白 A 溶離之後藉由 LCMS 測得 的 PLBL2 含量 (ppm) | 深度過濾器 | 於深度過濾之後藉由 LCMS 測得 的總 HCP 含量 (ppm) | 於深度過濾之後藉由 LCMS 測得 的 PLBL2 含量 (ppm) |
74528 | 543 | X0SP | 3 | 低於定量極限 |
C0SP | 18 | 5 | ||
X0HC | 2 | 低於定量極限 |
mAb3
( 貝洛韋單抗 )係基本上如實例1中針對mAb1所述使用蛋白質捕獲、低pH病毒滅活、中和及深度過濾步驟來製備,不同之處為使用負載為900 g/m
2之X0SP深度過濾器。使用所描述的純化製程,藉由LCMS測得的總HCP含量為:
● 於蛋白A溶離後,179964 ppm,
● 於X0SP (Millipore)深度過濾後,77 ppm。
實例 4. 雙特異性抗體 (mAb4) 純化製程中 HCP 的降低
雙特異性抗體mAb4基本上如實例1中針對mAb1所述使用蛋白質捕獲步驟來製備,不同之處為使用蛋白L親和捕獲管柱(Cytiva)且用表5中所示之緩衝液體系溶離。藉由ELISA測量總HCP含量,產生約1300至約2500 ppm之範圍。於蛋白質捕獲之後,基本上如實例1中針對mAb1所述來進行低pH病毒滅活,不同之處為使用列於表5中之滴定劑,接著使用500 mM Tris鹼pH未調整之緩衝液中和直至pH 7.0。基本上如實例1中針對mAb1所述使用X0SP深度過濾器在1200 g/m
2之負載下進行深度過濾步驟。於深度過濾之後藉由ELISA來測量HCP含量。
表5中之結果顯示,於深度過濾之後,對於項1至7,總HCP含量顯著降低至小於≤ 50 ppm,其中施加至深度過濾器之混合物之離子強度為小於約45 mM。此外,觀測到施加至深度過濾器之混合物之離子強度與深度過濾之後之總HCP含量之間的相關性。此外,項2顯示,雖然離子強度可藉由稀釋緩衝液來降低,從而於深度過濾之後提供低HCP含量,然而,來自稀釋之體積增加可能對製造製程不利。
表 5. 蛋白 L 溶離及深度過濾之後 mAb4 製劑中之 HCP 含量
*於低pH病毒滅活且用500mM Tris中和至pH 7.0之後,用2份水稀釋mAb4溶液(mAb4溶液:H
2O為1:2比)
實例 5. mAb5 純化製程中 HCP 的降低
項 | 蛋白 L 溶離緩衝液 | 低 pH 病毒滅活滴定劑 | 施加至深度過濾器之混合物之離子強度 (mM) | 於 X0SP 深度過濾之後藉由 ELISA 測得 的總 HCP 含量 (ppm) |
1 | 20 mM乙酸 + 10 mM磷酸 | 20 mM乙酸 + 10 mM磷酸 | 38 | 38 |
2 | 20 mM乙酸 + 10 mM磷酸 | 20 mM乙酸 + 10 mM磷酸 | 13 (於1:2 H 2O稀釋之後) * | 18 |
3 | 20 mM乙酸 + 10 mM磷酸 | 20 mM HCl | 36 | 35 |
4 | 20 mM乙酸 + 5 mM磷酸 | 20 mM HCl | 27 | 30 |
5 | 20 mM乙酸 + 5 mM甲酸 | 20 mM HCl | 23 | 26 |
6 | 20 mM乙酸 + 10 mM磷酸 | 200 mM磷酸 | 43 | 50 |
7 | 20 mM乙酸 + 10 mM磷酸 | 15 mM磷酸 | 37 | 36 |
8 | 20 mM乙酸+ 10 mM磷酸 | 1000 mM檸檬酸 | 64 | 209 |
基本上如實例1中針對mAb1所述使用蛋白質捕獲步驟來製備mAb5,不同之處為用表6中所示之緩衝液體系進行溶離步驟。藉由ELISA測量總HCP含量,產生約2800至約3200 ppm之範圍。於蛋白質捕獲之後,基本上如實例1中針對mAb1所述來進行低pH病毒滅活步驟,接著使用500 mM Tris鹼pH未調整之緩衝液在pH 5.0或pH 7.0下進行中和步驟。基本上如實例1中針對mAb1所述使用X0SP深度過濾器在1000 g/m
2之負載下進行深度過濾步驟。於深度過濾步驟之後藉由ELISA測量HCP含量。
表6中之結果顯示,當施加至深度過濾器之混合物之pH為pH 7.0時,於深度過濾之後,對於mAb5,總HCP含量顯著降低至小於≤ 50 ppm。當施加至深度過濾器之混合物之pH為pH 5.0時,總HCP含量降低至更少程度。
表 6. 於蛋白 A 溶離及深度過濾之後 mAb5 製劑中之 HCP 含量
實例 6. 在 生物分子純化製程期間測定離子強度之方法
抗體 | 蛋白 A 溶離緩衝液 | 施加至深度過濾器之材料之 pH | 於深度過濾之後的 HCP 含量 |
mAb5 | 20 mM乙酸 + 5 mM乳酸 | pH 5 | 338 |
pH 7 | 41 | ||
20 mM乙酸 + 5 mM磷酸 | pH 5 | 331 | |
pH 7 | 9 |
本文描述一種用於估算離子強度之方法,基於該離子強度可知在生物分子純化單元製程期間緩衝液組成。溶液之離子強度(
I)係該溶液中離子之濃度之量度,且為所有離子物種之物種濃度
c
i 及淨電荷
z
i 的函數。為了測定離子強度,使用式1。
(1)
強電解質:對於在低濃度(例如低於50 mM)下之強電解質,假設完全解離。就完全解離而言,容易計算組成,使離子強度計算簡單。例如,50 mM NaCl的溶液解離以得到50 mM的Na
+及Cl
-各者,其中離子強度為0.5 × [50 mM × 1
2+ 50 mM × (-1)
2] = 50 mM。另舉例而言,50 mM Na
2SO
4解離產生100 mM Na
+及50 mM SO
4 2-,產生0.5 × [100 mM × 1
2+ 50 mM × (-2)
2] = 150 mM之離子強度。在沒有緩衝物種下,此等計算中預期近中性pH,使得來自水的解離之離子之濃度不會有意義地貢獻給離子強度。取水之解離常數爲
K
w = [H
+][OH
-] = 10
-14,其中[H
+] = 10
-pH,其中方括號指示濃度。出於本文中計算之目的,H
+離子的物理解釋(與例如鋞離子相反)係不必要的,且同樣不必區分H
+濃度與活度。
酸解離常數常常以
pK
a = -log
10(
K
a )之對數形式使用。熱力學
pK
a (表示為
pK
a,0 )在文獻中可得用於許多所關注緩衝液。然而,緩衝液之有效
pK
a 偏離熱力學值,除了在極稀的溶液中由於活性係數與單位偏離。對於本發明中所考慮的中等稀溶液,使用擴展之Debye Hückel等式或Davies等式來計算非單位活性係數。文獻中發現的一些常數之值可能略有不同,但在本發明中所關注離子強度值之範圍內產生相似結果。擴展之Debye Hückel等式提供爲式3:
(3)
Davies等式提供爲式4:
(4)
其中
n= 2
z- 1且
z係用於計算
n之酸性緩衝液形式之淨電荷(Scopes,Protein Purification:Principles and Practices,2013)。
由於
pK
a 為離子強度的函數,因此組成及離子強度不能獨立地確定,而是等式系統之一部分。等式系統包括前述離子強度等式、各緩衝液之酸解離常數及各緩衝液之
pK
a 等式,且亦包括各緩衝液之電中性條件及總物種平衡。就此種等式系統而言,可估算若干值。例如,已知溶液pH可用於估算緩衝液調配物之基於酸之比率,或相反地,基於酸之比率可用於估算溶液pH及相應滴定體積。在任何此等應用中,均可估算離子強度,以幫助指導合理選擇溶離劑及滴定劑選項。
為了計算與本發明中之緩衝體系相關之離子強度,諸如用於深度過濾之餽料(feed material)之離子強度,需要溶液之緩衝液組成。該組成可基於用於該製程中之緩衝液及滴定劑之體積及組成來合理地估算。該領域中已知的離子測量技術亦可用於估算組成。
作為用於估算溶液組成的起點,一種可能的方法係假設親和管柱溶離液集合物具有與溶離劑相同的緩衝液組成,不同之處為在溶離液集合物之pH測定值下經緩衝。例如,若用20 mM乙酸、5 mM乳酸從蛋白A管柱溶離所關注蛋白質,且溶離液集合物具有4.2之pH測定值,則將假設溶離液集合物之緩衝液組成為20 mM乙酸鹽、5 mM乳酸鹽及足夠的使pH達到4.2之NaOH;此將等於約8.2 mM NaOH。因為僅總鈉陽離子Na
+含量對於計算重要,故是否假設溶離液鈉含量源自於乙酸鈉、磷酸鈉、氫氧化鈉或其任何組合是無所謂的,因此為方便起見,使用將鈉歸屬於NaOH之規約。
已使用溶離劑組成及溶離液pH來估算溶離液之緩衝液組成下,則考慮溶液滴定。例如,就估算得的20 mM乙酸鹽、5 mM乳酸鹽、在pH 4.2下約8.2 mM NaOH之溶離液組成而言,若要求將pH降低至3.45之目標值以進行病毒滅活所需的20 mM HCl之體積等於0.305倍於起始體積,則在pH 3.45下該製程中間體之組成將自稀釋已知。乙酸鹽、乳酸鹽及NaOH將會以1/1.305倍於其各自初始值(亦即,約15.3 mM乙酸鹽、約3.8 mM乳酸鹽及約6.2 mM NaOH)存在且HCl以0.305/1.305於其在滴定劑中之值(約4.7 mM HCl)存在。類似地,對於用250 mM Tris鹼的中和,若為將pH升高至pH 7.0的目標之比率係0.0743倍於pH 3.45溶液之體積,則將應用1/1.0743及0.0743/1.0743之比率以發現在經中和溶液中之最終濃度(約14.3 mM乙酸鹽、約3.6 mM乳酸鹽、約5.8 mM NaOH、約4.4 mM HCl及約17.3 mM Tris)。將所有已知值均插入等式系統(式5至15)中以計算離子強度:
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
其中Tris、乙酸鹽及乳酸鹽之各自的
pK
a,o 值取爲在22℃下,8.15、4.76及3.86。深度過濾餽料之離子強度之所得估算值為22.1 mM。
如本文所述,蛋白質產物之緩衝能力並非直接建模。因此,當使用強酸或鹼進行滴定時,在計算與經驗滴定結果之間可產生一些偏差。例如,當將蛋白A溶離液滴定至低pH以進行病毒滅活時,緩衝液計算通常低估所需的20 mM HCl之經驗量;該所需的經驗量可約50%大於所計算的估算值。為了說明此種差異的一種方法係以更高pH建模親和管柱溶離液材料,從而經驗上調整該值直至所估算的滴定體積與實驗值相匹配。例如,在以上實例中,若20 mM HCl之量係50%高於最初估算的0.305比率,則蛋白A溶離液將經建模為約pH 4.45而不是pH 4.2。對建模進行此種經驗變化時,實例中之所估算的離子強度定向降低,但僅降低少量:從最初的22.1 mM估算值下降到21.9 mM。因此,結論是,任何一種方法足以估算離子強度以導出本發明之較佳實施例。
替代方法: 離子含量測量方法可用於測定深度過濾餽料之緩衝液組成來計算離子強度。此要求確認,測量產生與任何已知量(諸如所添加的滴定劑之量)自相一致的結果。由於假設親和管柱溶離液之緩衝液組成等效於溶離劑之緩衝液組成,但在不同pH下,所以於真實組成上之差異可藉由離子含量測量值來確定。例如,可使用基於溶離劑組成之量或測量值以計算溶離劑中緩衝液組分之離子強度。
序列以下核酸及/或胺基酸序列在本發明中提及且提供於下文以供參考。
SEQ ID NO: 1 – 巴尼韋單抗可變重鏈 (VH) SEQ ID NO: 2 – 巴尼韋單抗可變輕鏈 (VL) SEQ ID NO: 3 – 巴尼韋單抗重鏈 (HC) SEQ ID NO: 4 – 巴尼韋單抗輕鏈 (LC) SEQ ID NO: 5 – 埃特司韋單抗可變重鏈 (VH) SEQ ID NO: 6 – 埃特司韋單抗可變輕鏈 (VL) SEQ ID NO: 7 – 埃特司韋單抗重鏈 (HC) SEQ ID NO: 8 – 埃特司韋單抗輕鏈 (LC) SEQ ID NO: 9 – 貝洛韋單抗可變重鏈 (VH) SEQ ID NO: 10 – 貝洛韋單抗可變輕鏈 (VL) SEQ ID NO: 11 – 貝洛韋單抗重鏈 (HC) SEQ ID NO: 12 – 貝洛韋單抗輕鏈 (LC)
<![CDATA[<110> 美商美國禮來大藥廠(Eli Lilly and Company)]]> <![CDATA[<120> 於蛋白質純化方法中降低宿主細胞蛋白質含量之方法]]> <![CDATA[<130> X22634]]> <![CDATA[<150> US 63/086,915]]> <![CDATA[<151> 2020-10-02]]> <![CDATA[<160> 12 ]]> <![CDATA[<170> PatentIn version 3.5]]> <![CDATA[<210> 1]]> <![CDATA[<211> 125]]> <![CDATA[<212> PRT]]> <![CDATA[<213> 人造序列]]> <![CDATA[<220>]]> <![CDATA[<223> 合成構築體]]> <![CDATA[<400> 1]]> Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Glu Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <![CDATA[<210> 2]]> 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Claims (54)
- 一種降低包含於宿主細胞中經重組產生的所關注蛋白質之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量的方法,該方法包括以下步驟: a. 使該蛋白質製劑經過親和層析管柱; b. 用包含弱酸及強酸之酸組合從該層析管柱溶離該所關注蛋白質以獲得包含該所關注蛋白質之溶離液; c. 將該溶離液之pH升高至高於約pH 6.0;及 d. 使該溶離液經過深度過濾器且獲得經過濾之蛋白質製劑。
- 如請求項1之方法,其中該層析管柱包含蛋白A、蛋白G或蛋白L親和層析管柱。
- 如請求項1之方法,其中該弱酸具有不多於一個小於7.0的pKa值,及該強酸具有不多於一個小於7.0的pKa值。
- 如請求項1之方法,其中該弱酸為乙酸且該強酸為磷酸或乳酸。
- 如請求項4之方法,其中該乙酸之濃度為約20 mM,且其中該強酸為磷酸及其中該磷酸之濃度為約5 mM至約10 mM。
- 如請求項4之方法,其中該乙酸之濃度為約20 mM,且其中該強酸為乳酸及其中該乳酸之濃度為約5 mM。
- 如請求項1之方法,該方法進一步包括進行病毒滅活之步驟。
- 如請求項1之方法,該方法進一步包括進行病毒滅活之步驟,該步驟包括取來自從層析管柱溶離蛋白質之該步驟之溶離液之pH調整至低於約pH 4.0,且其中將該溶離液維持在低於約pH 4.0下約0分鐘至約180分鐘。
- 如請求項8之方法,其中調整溶離液之pH之該步驟包括將該溶離液之pH調整至約pH 3.3至約pH 3.7。
- 如請求項9之方法,其中將該溶離液之pH調整至約pH 3.5。
- 如請求項8至10中任一項之方法,其中調整該溶離液之pH包括添加HCl、磷酸、或乙酸及磷酸組合中之任何一者。
- 如請求項1之方法,其中升高該溶離液之pH之該步驟包括將pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5。
- 如請求項12之方法,其中將該溶離液之pH升高至約pH 7.0。
- 如請求項12或13中任一項之方法,其中升高該溶離液之pH之步驟包括添加Tris。
- 如請求項1至14中任一項之方法,其中在升高pH至高於約6.0之該步驟中之溶離液具有約10 mM至約45 mM之離子強度。
- 如請求項1至15中任一項之方法,該方法進一步包括使該經深度過濾之蛋白質製劑經過離子交換層析之步驟。
- 如請求項1至16中任一項之方法,其中該經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質含量降低至小於100 ppm。
- 如請求項1至16中任一項之方法,其中該經過濾之蛋白質製劑中宿主細胞蛋白質內容物包含PLBL2,且其中該PLBL2降低至小於100 ppm。
- 如請求項1至18中任一項之方法,其中該蛋白質製劑包含所收穫的細胞培養物流體、捕獲集合物或所回收的蛋白質集合物。
- 如請求項1至19中任一項之方法,其中該蛋白質係治療性或診斷性蛋白質。
- 如請求項1至19中任一項之方法,其中該蛋白質為抗體、Fc融合蛋白、肽、免疫黏附素、酵素、生長因子、受體、激素、調節因子、細胞介素、抗原、肽或結合劑。
- 如請求項21之方法,其中該抗體為單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、雙特異性抗體或抗體片段。
- 如請求項22之方法,其中該抗體為IgG1抗體。
- 如請求項1至23中任一項之方法,其中該蛋白質為抗SARS-COV-2抗體。
- 如請求項24之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體為巴尼韋單抗(bamlanivimab)。
- 如請求項24之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 1所示的VH及SEQ ID NO: 2所示的VL。
- 如請求項24之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 3所示的HC及SEQ ID NO: 4所示的LC。
- 如請求項24之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體為埃特司韋單抗(etesevimab)。
- 如請求項24之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 5所示的VH及SEQ ID NO: 6所示的VL。
- 如請求項24之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 7所示的HC及SEQ ID NO: 8所示的LC。
- 如請求項24之方法,其中抗SARS-COV-2抗體為貝洛韋單抗(bebtelovimab)。
- 如請求項24之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 9所示的VH及SEQ ID NO: 10所示的VL。
- 如請求項24之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 11所示的HC及SEQ ID NO: 12所示的LC。
- 一種降低於宿主細胞中經重組產生的抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量的方法,該方法包括: a. 使於宿主細胞中經重組產生的該抗SARS-COV-2抗體製劑經過蛋白A親和層析管柱; b. 用包含乙酸及磷酸、或乙酸及乳酸組合之酸組合溶離該抗SARS-COV-2抗體以獲得包含該抗SARS-COV-2抗體之溶離液; c. 藉由添加約20 mM HCl來調整包含該抗SARS-COV-2抗體之該溶離液之pH,其中將該pH降低至約pH 3.3至約pH 3.7,且其中將該溶離液維持在約pH 3.3至約pH 3.7約0分鐘至約180分鐘; d. 藉由添加約250 mM Tris緩衝液來升高包含該抗SARS-COV-2抗體之該溶離液之pH,其中將該pH升高至約pH 6.5至約pH 7.5;及 e. 使包含該抗SARS-COV-2抗體之該溶離液經過深度過濾器,及獲得經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑, 其中該經過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑中之宿主細胞蛋白質含量降低至約0 ppm至約20 ppm,且其中該抗SARS-COV-2抗體為IgG1抗體。
- 如請求項34之方法,其中步驟b之酸組合包含20 mM乙酸及5 mM磷酸、或20 mM乙酸及5 mM磷酸、或20 mM乙酸及5 mM乳酸。
- 如請求項34之方法,其中調整該溶離液之pH之步驟c包括將該溶離液之pH調整至約3.5。
- 如請求項34至36中任一項之方法,其中藉由添加約20 mM HCl調整包含該抗SARS-COV-2抗體之該溶離液之pH之該步驟達成病毒滅活。
- 如請求項34之方法,其中升高該溶離液之pH之該步驟包括將該pH升高至約pH 7.25。
- 如請求項34或38中任一項之方法,其中該溶離液在該升高pH之步驟之後具有約10 mM至約45 mM之離子強度。
- 如請求項34至39中任一項之方法,該方法進一步包括使該經深度過濾之抗SARS-COV-2抗體製劑經過離子交換層析之步驟。
- 如請求項34至40中任一項之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體為巴尼韋單抗。
- 如請求項34至40中任一項之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含胺基酸SEQ ID NO: 1所示的VH及胺基酸SEQ ID NO: 2所示的VL。
- 如請求項34至40中任一項之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含胺基酸SEQ ID NO: 3所示的HC及胺基酸SEQ ID NO: 4所示的LC。
- 如請求項34至40中任一項之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體為埃特司韋單抗。
- 如請求項34至40之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 5所示的VH及SEQ ID NO: 6所示的VL。
- 如請求項34至40之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含SEQ ID NO: 7所示的HC及SEQ ID NO: 8所示的LC。
- 如請求項34至40中任一項之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體為貝洛韋單抗。
- 如請求項34至40中任一項之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含胺基酸SEQ ID NO: 9所示的VH及胺基酸SEQ ID NO: 10所示的VL。
- 如請求項34至40中任一項之方法,其中該抗SARS-COV-2抗體包含胺基酸SEQ ID NO: 11所示的HC及胺基酸SEQ ID NO: 12所示的LC。
- 如請求項1至49中任一項之方法,其中該深度過濾器包括C0SP、X0SP、X0HC、Emphaze AEX Hybrid Purifier綜合過濾器或Zeta Plus (ZB Media)。
- 如請求項1至50中任一項之方法,其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
- 如請求項51之方法,其中該哺乳動物細胞為CHO細胞。
- 一種藉由如請求項1至52中任一項之方法產生之組合物。
- 如請求項53之組合物,其中該組合物中之宿主細胞蛋白質含量小於約100 ppm。
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