KR20200116913A - 단백질 이합체화를 규명하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

단백질 이합체화를 규명하기 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

단백질의 하위도메인 수준에서 이합체화 계면을 특징규명하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 예시적인 방법은 단백질 이합체 샘플을 하위도메인으로 소화시키는 단계, 소화된 단백질 샘플을 표지하는 단계, 표지된 이합체성 하위도메인 단편 및 단량체성 하위도메인 단편을 단리하는 단계, 및 표지된 샘플을 펩타이드 맵핑하여 이합체 단편이 어디서 표지되는지 및 이합체 단편이 어디서 표지되지 않는지를 결정하는 단계를 포함한다. 단량체 분획에서보다 이합체 분획에서 감소된 표지 정도를 나타내는 영역은 이합체화 계면에 관여되고 이와 근접할 것으로 예상된다.

Description

단백질 이합체화를 규명하기 위한 시스템 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 2월 2일로 출원된 미국 가특허 출원 제62/625,732호 및 2018년 9월 28일로 출원된 미국 가특허 출원 제62/738,051호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이들 둘 다는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 단백질 및 이의 단편에서의 비공유 상호작용 부위를 특징규명하기 위한 분석 방법 및 시스템에 관한 것이다.
단일클론 항체(mAb: monoclonal antibody)는 지난 20년에 걸쳐 광범위한 치료 분야를 표적화하도록 성공적으로 사용되었다(Walsh G., Nature biotechnology 2014; 32:992-1000; Lawrence S. Nature biotechnology 2007; 25:380-2). 단백질 응집은 단일클론 항체 및 다른 치료학적 단백질의 생산에서 여전히 주요 우려사항이다. 효력 및 면역원성에 대한 잠재적인 영향으로 인해, 산물 품질을 보장하도록 적절한 제어 전략이 실행될 수 있도록 응집 기전을 이해하는 것이 중요한다.
mAb 분자에서 이합체화 계면을 맵핑하는 것은 mAb 이합체의 복잡함 및 이종성으로 인해 도전으로 있다. 수소-중수소 교환 질량 분광법(HDX MS)이 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 성공적이지만, 아마도 단백질 측쇄 상호작용을 검출하는 데 있어서의 방법 제한으로 인해 mAb 이합체화 계면을 밝혀내는 데에 이루어진 성공이 거의 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 단백질의 비균질한 이합체화 계면을 맵핑하기 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이합체화 수준이 감소된 단백질 약물 산물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이합체화가 감소된 단백질 약물 산물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
단백질의 펩타이드/잔기 수준에서 단백질 이합체화 계면을 규명하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 예시적인 방법은 단백질 이합체 샘플을 하위도메인으로 소화시키는 단계, 소화된 단백질 샘플 혼합물을 표지하는 단계, 표지된 이합체성 하위도메인 단편 및 단량체성 하위도메인 단편을 단리하는 단계 및 표지된 샘플을 펩타이드 맵핑하여 이합체 및 단량체에서 표지 정도를 결정하고 비교하는 단계를 포함한다. 단량체 분획에서보다 이합체 분획에서 감소된 표지 정도를 나타내는 영역은 이합체화 계면에 관여되고 이와 근접할 것으로 예상된다.
일 실시형태에서, 비공유 이합체는 단리되고 비공유 상호작용 부위를 배치하도록 펩타이드 맵핑에 의해 분석된다. 다른 실시형태에서 펩타이드/잔기 수준에서 비공유 이합체화 계면을 국재화기 위해, 농후화된 mAb 이합체 샘플은 F(ab)[또는 F(ab')] 단독이합체, F(ab)[또는 F(ab')] 및 Fc 단량체의 혼합물로 소화되고, 표지 실험이 되고, 이후 부분분리, 트립신 소화 및 표지 정도 정량화를 위한 LC-MS 분석 및 펩타이드/잔기 수준에서의 비교가 수행된다. 개시된 방법의 단계들의 더 상세내용은 하기에 제공된다.
또 다른 실시형태는 항체를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포 배양물에서 항체를 생산하는 세포를 배양하는 단계, 세포 배양물로부터 샘플을 얻는 단계, 상기 기재된 방법에 따라 항체 샘플에서 이합체화 계면을 규명하는 단계 및 세포 배양 동안 생산된 항체의 이합체화 또는 비공유 상호작용/응집의 양을 감소시키도록 세포 배양의 하나 이상의 배양 조건을 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 동안 임의의 간격으로 샘플을 취한다. 다른 실시형태에서, 제조 배양 이후에, 단백질 수확 이후에 또는 정제 이후에 샘플을 취한다. 이합체화 또는 응집의 양을 감소시키도록 변한 하나 이상의 세포 배양 조건은 온도, pH, 세포 밀도, 아미노산 농도, 삼투질농도, 성장 인자 농도, 아지테이션, 가스 분압, 계면활성제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 세포는 진핵생물 또는 원핵생물일 수 있다. 세포는 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS 세포(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero 세포, CV1 세포, 신장 세포(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa 세포, HepG2 세포, WI38 세포, MRC 5 세포, Colo25 세포, HB 8065 세포, HL-60 세포, 림프구 세포, 예를 들어 자가유래 T 세포, Jurkat(T 림프구) 또는 Daudi(B 림프구), A431(표피) 세포, U937 세포, 3T3 세포, L 세포, C127 세포, SP2/0 세포, NS-0 세포, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 임의의 전술된 세포로부터 유래된 세포주일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 하이브리도마 또는 쿼드로마 세포이다.
또 다른 실시형태는 항체를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포 배양물에서 항체를 생산하는 세포를 배양하는 단계, 이후 항체를 정제하고 제제화하여 제제화된 약물 물질(FDS: formulated drug substance)을 얻는 단계, 항체를 제제화하기 전에 및/또는 후에 정제된 항체의 샘플을 얻는 단계, 상기 기재된 방법에 따라 항체 샘플 또는 FDS 샘플에서 이합체화 계면을 규명하는 단계 및 세포 배양 동안 생산된 항체의 이합체화 또는 비공유 상호작용/응집의 양을 감소시키도록 하나 이상의 항체 정제 또는 제제화 조건을 변형시키는 단계를 포함한다. 이합체화 또는 응집의 양을 감소시키도록 변한 하나 이상의 항체 정제 조건은 온도, pH, 친화도 매트릭스, 크로마토그래피 수지, 완충액, 필터 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이합체화 또는 응집의 양을 감소시키도록 변한 하나 이상의 항체 제제화 조건은 pH, 항체 농도, 부형제 농도, 완충액, 계면활성제, 안정화제 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 FDS 부형제는 이합체화 또는 응집의 양을 감소시키도록 변할 수 있고, 당해 분야에서의 임의의 공지된 부형제로부터 선택된다.
또 다른 실시형태는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 항체를 제공한다.
비변형된 단백질 약물 산물에 비해 이합체화 또는 비공유 상호작용이 감소한 변형된 단백질 약물 산물을 제공하는 방법이 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 단백질 약물 산물은 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
도 1은 mAb 이합체화 계면 맵핑에 대한 예시적인 제한된 소화 및 단일-표지 전략의 작업흐름 다이어그램이다.
도 2는 농후화된 HMW 샘플의 제한된 Lys-C 소화로부터 생성된 mAb-1 Fab 이합체와 Fab 단량체 사이의 차등 GEE 표지 차트를 보여주는 표시된 사슬/잔기에 대한 글리신 에틸 에스테르 하이드로콜로라이드(glycine ethyl ester hydrocholoride )(GEE)(단량체-이합체) 백분율의 그래프이다.
도 3a는 펩타이드 수준에서 mAb-1의 표시된 항체 단편에 대한 GEE 백분율의 막대 그래프이다. 도 3b는 아미노산 잔기 수준에서 mAb-2의 표시된 항체 단편에 대한 GEE 백분율의 막대 그래프이다.
도 4A 내지 도 4C는 제한된 LysC 소화된 mAb1 HMW 샘플에 대한 산화된 종의 포아송 적합화(Poisson fitting)를 보여주는 산점도이다. 도 4A는 Fc 영역을 나타내고, 도 4B는 LC 영역을 나타내고, 도 4C는 Fd 영역을 나타낸다. 선은 각각의 그래프에 대한 포아송 적합을 나타낸다.
도 5a는 mAb-1의 펩타이드 수준에서 표시된 단편에 대한 FPOP 변형 정도의 막대 그래프이다. 도 5b는 mAb-1의 잔기 수준에서 표시된 단편에 대한 FPOP 변형 정도의 막대 그래프이다.
도 6a 및 도 6b는 상이한 초점 위치 및 레이저 파워 조건에 의한 라이소자임 단백질에 대한 산화된 종의 포아송 적합화를 보여주는 산점도이다.
도 7A 내지 도 7F는 다양한 포촉제 농도(500 μM, 350 μM 또는 200 μM His) 및 다양한 레이저 파워 환경(97 mJ 또는 156 mJ)에 의한 라이소자임 단백질에 대한 산화된 종의 포아송 적합화를 보여주는 산점도이다.
도 8A 내지 도 8D는 다양한 포촉제 농도(500 μM 또는 200 μM His) 및 다양한 단백질 농도(1 mg/mL 또는 0.1 mg/mL)에 의한 라이소자임 단백질에 대한 산화된 종의 포아송 적합화를 보여주는 산점도이다.
도 9A 및 도 9B는 mAb1(도 9A) 또는 탈글리코실화된 mAb1(도 9B)에 대한 산화된 종의 포아송 적합화를 보여주는 산점도이다.
I. 정의
현재 청구된 발명을 기술하는 맥락에서(특히 청구항의 맥락에서) 단수 형태의 용어 및 유사한 지시어의 사용은, 본원에 달리 표시되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명확히 반대되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포괄하도록 해석되어야 한다.
본원에서 값의 범위의 언급은, 본원에 달리 표시되지 않는 한, 단순히 그 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 약칭의 방법으로 작용하도록 의도되고, 각각의 별개의 값은 이것이 본원에 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
용어 "약"의 사용은 대략 ± 10%의 범위로 기재된 값 초과 또는 미만의 값을 기술하도록 의도되고; 다른 실시형태에서 그 값은 대략 ± 5%의 범위로 기재된 값 초과 또는 미만의 값의 범위일 수 있고; 다른 실시형태에서 그 값은 대략 ± 2%의 범위로 기재된 값 초과 또는 미만의 값의 범위일 수 있고; 다른 실시형태에서 그 값은 대략 ± 1%의 범위로 기재된 값 초과 또는 미만의 값의 범위일 수 있다. 이전의 범위는 문맥에 의해 명확해지도록 의도되고, 추가의 제한이 암시되지 않는다. 본원에 기재된 모든 방법은, 본원에 달리 표시되지 않는 한 또는 달리 문맥에 의해 명확히 반대되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 실시예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하도록 의도되고, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 부여하지 않는다. 본 명세서에서의 언어는 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
"단백질"은 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 단백질은 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함하고, 또한 글라이코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 알킬화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 단백질 기반 약물을 포함하는 단백질은 과학적으로 또는 상업적으로 관심이 있을 수 있고, 단백질은 그 중에서도 효소, 리간드, 수용체, 항체, 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 단백질은 널리 공지된 세포 배양 방법을 사용하여 다양한 유형의 재조합 세포에 의해 생산되고, 일반적으로 유전자 조작 뉴클레오타이드 벡터(예를 들어, 키메라 단백질을 암호화하는 서열, 또는 코돈 최적화된 서열, 인트론무 서열(intronless sequence) 서열 등)의 형질주입에 의해 세포로 도입되고, 여기서 이 벡터는 에피솜으로 있거나 세포의 게놈에 도입될 수 있다.
"항체"는 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄가 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR: framework region)이라 칭하는 더 보존된 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)이라 칭하는 초가변의 영역으로 더 하위분할될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 각각의 VH/CH1 및 VL/CL 사슬은 (예를 들어, 디설파이드 브리지에 의해) 회합하여 이의 N-말단에서 항원-결합 부위를 갖는 F(ab) 또는 한 쌍을 형성한다. 따라서, 제한된 효소 소화 이후에, F(ab)[또는 F(ab')] 단편은 항원에 여전히 결합하지만 Fc 부분 없이 일가인 항체 단편이다. 항체는 통상적으로 항원-결합과 관련하여 2가이고, 그리하여 상부 힌지에서 디설파이드 브리지에 의해 함께 연결된 F(ab')2라 칭하는 2개의 F(ab) 부분을 포함한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역의 일부를 온전히 두면서 대부분의 Fc 영역을 제거하도록 전체 항체의 제한된 소화에 의해 생성되고, F(ab') 단편으로 더 환원될 수 있다. 용어 "항체"는 임의의 이소타입 또는 하위종류의 글리코실화된 면역글로불린 및 비글리코실화된 면역글로불린 둘 다의 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 재조합 수단에 의해 준비되거나 발현되거나 생성되거나 단리된 항체 분자, 예컨대 항체를 발현하도록 형질주입된 숙주 세포로부터 단리된 항체를 포함한다. 용어 항체는 또한 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종사합체성 면역글로불린을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이가 항체 구조는 또한 상이한 항원에 대한 각각의 항원-결합 부위의 특이성과 관련하여 이중특이적일 수 있다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 출원 공보 제2010/0331527호(본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
"Fc 융합 단백질"은 달리 자연에서 함께 발견되지 않는 2개 이상의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는데, 이들 중 하나는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이다. 항체-유래된 폴리펩타이드(Fc 도메인을 포함)의 다양한 부분에 융합된 소정의 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 예를 들어 Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; 및 Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11, 1992에 의해 기재되어 있다. "수용체 Fc 융합 단백질"은, 일부 실시형태에서 힌지 영역, 이어서 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 2개 이상의 구별되는 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 예를 들어 IL-1 트랩 또는 VEGF 트랩과 같은 트랩이다.
"세포 배양"은 플라스크 또는 생물반응기와 같은 용기에서의 세포의 전파 또는 증식을 지칭하고, 유가 배양, 연속 배양, 관류 배양 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "MS/MS"는 탠덤의 2개의 질량 분광기를 사용하는 질량 분광법 기법을 지칭한다. 충돌 가스 셀은 2개의 분석기(MS1 및 MS2) 사이에 있다. MS1에 의해 선택된 전구체 이온은 셀에서 고압 가스(보통 He)와 충돌하고 단편화를 겪는다.
용어 "LC-MS"는 액체 크로마토그래피(또는 HPLC)의 물리적 분리 역량을 질량 분광법(MS)의 질량 분석 역량과 조합하는 분석 화학 기법인 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 지칭한다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체함을 지칭한다. 이 유형의 대체는 상응하는 단백질에서 기능이상을 좀저럼 초래하지 않을 것으로 예상된다.
Ⅱ. 단백질 약물 산물
일 실시형태는 단백질 약물 산물 이합체화 또는 비공유 상호작용을 감소시키도록 변형된 단백질 약물 산물을 제공한다. 이 변형은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 보존적 아미노산 치환에서 한 아미노산은 유사한 특성을 갖는 다른 것으로 교환된다. 이 유형의 대체는 상응하는 단백질에서 기능이상을 좀저럼 초래하지 않을 것으로 예상된다.
A. 관심 대상의 단백질
일 실시형태에서, 단백질 약물 산물은 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포에서의 발현에 적합한 하나 이상의 관심 대상의 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 대상의 단백질은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편, ScFv 또는 이의 단편, Fc-융합 단백질 또는 이의 단편, 성장 인자 또는 이의 단편, 사이토카인 또는 이의 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 관심 대상의 단백질은 단일의 아단위로 이루어진 단순한 폴리펩타이드, 또는 2개 이상의 아단위를 포함하는 복잡한 다중아단위 단백질일 수 있다. 관심 대상의 단백질은 생물의약품 제품, 식품 첨가제 또는 보존제, 또는 정제 및 품질 표준의 지배를 받는 임의의 단백질 산물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 산물(관심 대상의 단백질)은 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단일클론 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단쇄 항체, 다이아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-IG)이라 칭하는 이중-특이적, 4가 면역글로불린 G-유사 분자, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 다른 실시형태에서, 항체는 키메라 힌지를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 키메라 Fc를 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-예정 세포사 1 항체(anti-Programmed Cell Death 1 antibody)(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2015/0203579A1호에 기재된 바와 같은 항-PD1 항체), 항-예정 세포사 리간드-1(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2015/0203580A1호에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-앙기오포이에틴-2 항체(anti-Angiopoetin-2 antibody)(예를 들어, 미국 특허 제9,402,898호에 기재된 바와 같은 항-ANG2 항체), 항-앙기오포이에틴-유사 3 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,018,356호에 기재된 바와 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,265,827호에 기재된 바와 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체(anti- Prolactin Receptor antibody)(예를 들어, 미국 특허 제9,302,015호에 기재된 바와 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체(anti-Complement 5 antibody)(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2015/0313194A1호에 기재된 바와 같은 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,132,192호에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 출원 공보 제US2015/0259423A1호에 기재된 바와 같은 항-EGFRvⅢ 항체), 항-프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신-9 항체(anti-Proprotein Convertase Subtilisin Kexin-9 antibody)(예를 들어, 미국 특허 제8,062,640호 또는 미국 특허 출원 공보 제US2014/0044730A1호에 기재된 바와 같은 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체(anti-Growth And Differentiation Factor-8 antibody)(예를 들어, 미국 특허 제8,871,209호 또는 제9,260,515호에 기재된 바와 같은 항-마이오스타틴 항체로도 공지된 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체(anti-Glucagon Receptor)(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2015/0337045A1호 또는 제US2016/0075778A1호에 기재된 바와 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터류킨 4 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2014/0271681A1호 또는 미국 특허 제8,735,095호 또는 제8,945,559호에 기재된 바와 같은 항-IL4R 항체), 항-인터류킨 6 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제7,582,298호, 제8,043,617호 또는 제9,173,880호에 기재된 바와 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터류킨 33(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2014/0271658A1호 또는 제US2014/0271642A1호에 기재된 바와 같은 항-IL33 항체), 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체(anti-Respiratory syncytial virus antibody)(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2014/0271653A1호에 기재된 바와 같은 항-RSV 항체), 항-분화 클러스터 3(anti-Cluster of differentiation 3)(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 출원 제62/222,605호에 기재된 바와 같은 항-CD3 항체), 항-분화 클러스터 20(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 특허 제7,879,984호에 기재된 바와 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-분화 클러스터-48(예를 들어, 미국 특허 제9,228,014호에 기재된 바와 같은 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,079,948호에 기재된 바와 같음), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스(anti-Middle East Respiratory Syndrome virus)(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2015/0337029A1호에 기재된 바와 같은 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체(anti-Ebola virus antibody)(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2016/0215040호에 기재된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체(anti-Zika virus antibody), 항-림프구 활성화 유전자 3 항체(anti-Lymphocyte Activation Gene 3 antibody)(예를 들어, 항-LAG3 항체 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체(anti-Nerve Growth Factor antibody)(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제US2016/0017029호 및 미국 특허 제8,309,088호 및 제9,353,176호에 기재된 바와 같은 항-NGF 항체) 및 항-액티빈 A 항체(anti-Activin A antibody)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체(미국 특허 출원 공보 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호에 기재된 바와 같음), 항-CD3 x 항-뮤신 16 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3 x 항-Muc16 이중특이적 항체) 및 항-CD3 x 항-전립선-특이적 막 항원 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 관심 대상의 단백질은 압식시맙, 아달리무맙, 아달리무맙-아토, 아도-트라스투주맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 베즐록톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 카나키누맙, 카프로맙 펜데타이드, 세르톨리주맙 페골, 세미플리맙, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 듀필루맙, 더발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에미시주맙-kxwh, 엠탄신 알리로쿠맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 파시누맙, 골리무맙, 구셀쿠맙, 이브리투모맙, 티툭산, 이다루시주맙, 인플릭시맙, 인플릭시맙-abda, 인플릭시맙-dyyb, 이플리무맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 네시투무맙, 네스바쿠맙, 니볼루맙, 오빌톡사시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레슬리주맙, 리누쿠맙, 리툭시맙, 사릴루맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 토실리주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 트레보그루맙, 우스테키누맙 및 베돌리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 관심 대상의 단백질은 Fc 모이어티 및 또 다른 도메인을 함유하는 재조합 단백질(예를 들어, Fc-융합 단백질)이다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 함유하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 힌지 영역, 이어서 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일의 리간드 또는 다수의 리간드 중 어느 하나에 결합하는 2개 이상의 구별되는 수용체 사슬을 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 예를 들어 IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 Il-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트; 본원에 그 전체 내용이 참고로 포함된 미국 특허 제6,927,004호 참조), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하는 아플리베르셉트 또는 ziv-아플리베르셉트; 미국 특허 제7,087,411호 및 제7,279,159호 참조)과 같은 TRAP 단백질이다. 다른 실시형태에서, Fc-융합 단백질은, Fc 모이어티에 커플링된 항체의, 하나 이상의 항원-결합 도메인(들), 예컨대 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편 중 하나 이상을 함유하는 ScFv-Fc-융합 단백질이다.
B. 단백질을 생산하는 방법
일부 실시형태에서, 단백질 약물 산물은 유가 세포 배양에서 생산된다. 단백질 생산에서, "유가 세포 배양" 또는 "유가 배양"은 초기에 세포 및 배양 배지가 배양 용기에 공급되고, 배양 종결 전에 세포 및/또는 산물을 정기적으로 수확하거나 하지 않으면서 배양 동안에 추가의 배양 영양소가 배양물에 별개의 증분으로 천천히 공급되는 회분 배양을 지칭한다. 유가 배양은 (세포 및 배지를 포함할 수 있는) 전체 배양물이 제거되고 새로운 배지에 의해 정기적으로 대체되는 "반연속 유가 배양"을 포함한다. 유가 배양은 단순한 "회분 배양"과 구별되는 반면, (동물 세포 및 모든 배양 영양소를 포함하는) 세포 배양을 위한 모든 성분은 회분 배양에서 배양 과정의 시작 시 배양 용기에 공급된다. 유가 배양은 상청액이 표준 유가 과정 동안 배양 용기로부터 제거되지 않는 한 "관류 배양"과 다를 수 있는 반면, 관류 배양에서 세포는 예를 들어 여과에 의해 배양에서 저지되고, 배양 배지는 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 배양 용기로부터 제거된다. 그러나, 유가 세포 배양 동안 시험 목적을 위해 샘플 제거가 고려된다. 유가 과정은 최대 작업 용적 및/또는 단백질 생산이 도달되고, 단백질이 후속하여 수확되는지가 결정될 때까지 계속된다.
일 실시형태는 연속 세포 배양에서 생산된 단백질 약물 산물을 제공한다. 구절 "연속 세포 배양"은 보통 특정 성장 단계에서 세포를 계속해서 성장시키도록 사용되는 기법을 지칭한다. 예를 들어, 일정한 세포 공급이 필요하거나, 관심 대상의 특정 단백질의 생산이 필요하면, 세포 배양은 특정 성장 단계에서 유지를 필요로 할 수 있다. 따라서, 그 조건은 계속해서 모니터링되고 그 특정 단계에서 세포를 유지시키기 위해 이에 따라 조정되어야 한다.
단백질 약물 산물을 생산하기 위해 사용된 세포 배양물은 세포 배양 배지를 포함한다. 용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 세포의 성장을 향상시키는 필수 영양소를 통상적으로 제공하는 포유류 세포를 성장시키기 위해 사용되는 영양소 용액, 예컨대 탄수화물 에너지원, 필수 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌, 발린, 트레오닌, 트립토판, 메티오닌, 류신, 이소류신, 리신 및 히스티딘) 및 비필수 아미노산(예를 들어, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신), 미량 원소, 에너지원, 지질, 비타민 등을 지칭한다. 세포 배양 배지는 세포 성장을 지지하는 원료를 공급하는 추출물, 예를 들어 혈청 또는 펩톤(가수분해물)을 함유할 수 있다. 배지는 동물-유래된 추출물 대신에 효모-유래된 추출물 또는 대두 추출물을 함유할 수 있다. 화학적으로 한정된 배지는 모든 화학 성분을 알고 있는(즉, 화학 구조를 알고 있는) 세포 배양 배지를 지칭한다. 화학적으로 한정된 배지는 동물-유래된 성분, 예컨대 혈청-유래된 펩톤 또는 동물-유래된 펩톤이 전부 없다. 일부 실시형태에서, 배지는 화학적으로 한정된 배지이다.
용액은 또한 호르몬 및 성장 인자를 포함하여 최소 속도보다 높게 성장 및/또는 생존을 향상시키는 성분을 함유할 수 있다. 용액은 배양되는 특정 세포의 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제제화될 수 있다.
"세포주"는 세포의 연속 계대배양 또는 서브클로닝을 통해 특정 계통으로부터 유래된 세포 또는 세포들을 지칭한다. 용어 "세포"는 "세포 집단"과 상호교환되어 사용된다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포, 예컨대 박테리아 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비인간 동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 또는 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 세포 융합물을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 하기 세포로부터 선택된다: 중국 햄스터 난소(CHO)(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, 예를 들어 Jurkat(T 림프구) 또는 Daudi(B 림프구), A431(표피), U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 전술된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 CHO K1 세포이다.
단백질을 정제하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 약물 산물은 숙주 세포 단백질 및 비정상 형태의 약물 산물을 포함하여 세포 배양 과정과 연관된 불순물을 제거하도록 세포 배양 및 단백질 수확 이후에 다수의 정제 단계로 처리될 수 있다. 크로마토그래피 분리시키도록 등전점, 소수화도 또는 크기와 같은 단백질의 일반 특성보다 단백질들 사이의 특이적인, 가역적 상호작용을 사용하는 크로마토그래피 방법인 "친화도 크로마토그래피"와 같은 크로마토그래피의 형태는 널리 공지되어 있다. "단백질 A 친화도 크로마토그래피" 또는 "단백질 A 크로마토그래피"는 면역글로불린 분자의 Fc 부분에 대한 단백질 A의 IgG 결합 도메인의 친화도를 사용하는 특이적 친화도 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 이 Fc 부분은 인간 또는 동물 면역글로불린 불변 도메인 CH2 및 CH3 또는 이들과 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인을 포함한다. 다른 형태의 크로마토그래피 또는 분리 기법은 단백질 G 친화도 크로마토그래피, His-태그화 친화도 크로마토그래피, 이온-교환(약한 양이온, 약한 음이온, 강한 양이온, 강한 음이온) 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 각각의 기법은 비제한적인 예로서 수지 전하 및 크기, 세척 조건, pH, 로드 용적, 로드 농도 등을 포함하는 적합한 조건의 최적화를 필요로 한다. 한외여과 및 정용여과 기법은 정제 과정에서 또한 고려된다.
단백질을 제제화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 약물 산물은 본 발명의 항원-결합 분자(예를 들어, 항체)를 포함하는 액체 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이동, 전달, 관용성 등을 제공하는 다른 물질로 제제화된다. 다수의 적절한 제제는 모든 약화학자에게 공지된 처방집에서 발견될 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 예를 들어, 부형제는 안정화제, 완충액, 긴장제(tonicifier), 계면활성제, 유기 용매, 염 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정화제는 폴리올, 당, 아미노산, 비이온성 계면활성제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 긴장제는 당, 아미노산, 염, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 약물 산물은 약물 산물의 액체 제제 또는 재구성된 동결건조 제제이다. 일부 실시형태에서, 약물 산물은 2개 이상의 상이한 항체를 포함하는 통합제제(co-formulation)이다.
Ⅲ. 단백질에서 이합체화 계면을 규명하는 방법
단백질 응집은 단일클론 항체의 생산에서 여전히 주요 우려사항이다. 순도, 효력 및 면역원성에 대한 잠재적인 영향으로 인해, 산물 품질을 보장하도록 적절한 제어 전략이 실행될 수 있도록 응집 기전을 이해하는 것이 중요한다. mAb 분자에서 이합체화 계면을 맵핑하는 것은 mAb 이합체의 복잡함 및 이종성으로 인해 도전으로 있는다. 수소-중수소 교환 질량 분광법(HDX MS)이 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 성공적이지만, 아마도 단백질 측쇄 상호작용을 검출하는 데 있어서의 방법 제한으로 인해 mAb 이합체화 계면을 밝혀내는 데에 거의 성공되지 않았다.
이들 장애를 극복하기 위해, 포괄적 MS-기반 방법에 의해 단백질의 비균질한 이합체화 계면(공유 및 비공유 둘 다)을 성공적으로 맵핑하기 위해 새로운 시스템 및 방법이 제공한다. 이합체화 계면 맵핑에 대한 예시적인 전략은 도 1에 제공된다. 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 재조합 단백질, 또는 융합 단백질일 수 있다.
A. 비공유 상호작용 부위를 규명하는 방법
일 실시형태는 단백질의 펩타이드/잔기 수준에서 이합체화 계면을 결정하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 단백질 이합체 샘플을 하위도메인으로 소화시키는 단계, 소화된 단백질 샘플 혼합물을 표지하는 단계, 표지된 이합체성 하위도메인 단편 및 단량체성 하위도메인 단편을 단리하는 단계 및 표지된 샘플을 펩타이드 맵핑하여 이합체 및 단량체에서 표지 정도를 결정하고 비교하는 단계를 포함한다. 단량체 분획에서보다 이합체 분획에서 감소된 표지 정도를 나타내는 영역은 이합체화 계면에 관여되고 이와 근접할 것으로 예상된다.
일 실시형태에서, 펩타이드는 단리되고 비공유 상호작용 부위를 배치하도록 펩타이드 맵핑에 의해 분석된다. 다른 실시형태에서 펩타이드/잔기 수준에서 비공유 이합체화 계면을 국재화기 위해, 농후화된 mAb 이합체 샘플은 F(ab)[또는 F(ab')] 단독이합체, F(ab)[또는 F(ab')] 및 Fc 단량체의 혼합물로 소화되고, 공유 표지 실험이 되고, 이후 SEC-부분분리, 트립신 소화 및 표지 정도 정량화를 위한 LC-MS 분석 및 펩타이드/잔기 수준에서의 비교가 수행된다. 또 다른 실시형태에서 펩타이드/잔기 수준에서 비공유 이합체화 계면을 국재화기 위해, 농후화된 mAb 이합체 샘플은 F(ab)[또는 F(ab')] 단독이합체, F(ab)[또는 F(ab')] 및 Fc 단량체의 혼합물로 소화되고, 이후 단일 FPOP(단백질의 빠른 광화학적 산화(fast photochemical oxidation of protein)) 표지 실험이 되고, 이후 SEC-부분분리, 트립신 소화 및 표지 정도 정량화를 위한 LC-MS 분석 및 펩타이드/잔기 수준에서의 비교가 수행된다. 개시된 방법의 단계들의 더 상세내용은 하기에 제공된다.
1. 단백질 이합체의 단편화
일부 실시형태에서, 단백질 약물 산물, 예를 들어 항체는 세포 배양물로부터 얻어지고 농후화된 이합체 샘플을 제공하도록 이합체에 대해 농후화된다. 농후화된 이합체 샘플은 비제한적인 예로서 액체 크로마토그래피를 포함하는 다양한 농후화 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 바람직한 액체 크로마토그래피 기법은 크기 배제 크로마토그래피를 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 농후화된 이합체 샘플은 이합체 이외의 일부 단백질 응집체를 함유한다. 따라서, 농후화된 이합체 샘플은 오직 이합체로 이루어질 필요는 없다. 일부 실시형태에서, 농후화된 이합체 샘플은 50% 초과의 이합체를 함유한다.
예를 들어 mAb 이합체를 형성하는 비공유 상호작용을 보존하기 위한 단백질 산물의 단편화 또는 소화는 화학 기법 및 효소 기법을 포함하는, 대개 제한된 소화라 칭하는, 종래의 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, mAb 이합체 샘플은 프로테아제를 사용하여 다양한 Fab 및 Fc 단편, 예를 들어 F(ab) 단독이합체, F(ab) 및 Fc 단량체의 혼합물을 제조하도록 자연적 조건(native condition) 하에 소화된다. 예시적인 프로테아제는 엔도프로테아제 LysC이다. 다른 프로테아제는 파파인 및 휘신을 포함한다. 일부 실시형태에서, mAb 이합체는 10 mM Tris-HCl(pH 7.5)에 희석되고, 이후 엔도프로테아제 Lys-C(단백질:효소 = 400:1)과 항온처리될 수 있다. 이 제한된 소화 처리는 2개의 힌지 영역 디설파이드 결합에 N-말단인 Lys 잔기에서 중쇄를 특이적으로 절단하여 Fab 및 Fc 단편을 생성시킨다. 이합체 종으로부터 임의의 비공유 이합체 상호작용(가장 흔하게는 F(ab) - F(ab))이 혼합물에서 유지된다.
다른 실시형태에서, mAb 이합체 샘플은 명칭 FabRICATOR® 하에 판매되는 IdeS 프로테아제로 자연적 조건 하에 F(ab')2 및 Fc* 단편(즉, 본원에서 Fc 단량체라고 칭하는, 비공유 상호작용에 의해 상호작용하는 2개의 Fc 폴리펩타이드)으로 소화된다. mAb 이합체는 처음에 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 희석될 수 있고, 이후 FabRICATOR®(1 ㎍의 단백질당 1 IUB 밀리단위)로 소화될 수 있다. 이 제한된 소화 처리는 2개의 Gly 잔기들 사이에 2개의 힌지 영역 디설파이드 결합에 C-말단인 부위를 특이적으로 절단한다. 이 처리는 1개의 F(ab')2 단편 및 비공유 상호작용을 통해 함께 결합된 2개의 동일한 Fc/2 단편(Fc*)을 생성시킬 수 있다. 이후, 소화 혼합물은 사슬내 디설파이드 결합을 온전하게 유지시키면서 사슬간 디설파이드 결합을 환원시키는 환원제와 항온처리될 수 있다. 그 결과, F(ab')2 단편은 2개의 F(ab') 단편으로 환원되고, Fd 및 LC은 비공유 상호작용을 통해 함께 결합된다. 이합체 종으로부터의 비공유 이합체 상호작용(대부분 흔히 F(ab') - F(ab'))이 혼합물에서 또한 유지된다.
사용될 수 있는 예시적인 환원제는 디티오트레이톨(DTT, CAS 3483-12-3), 베타-머캅토에탄올(BME, 2BME, 2-ME, b-합체, CAS 60-24-2), 2-아미노에탄티올(2-MEA-HCl, 시스테아민-HCl이라고도 칭함, CAS 156-57-0), Tris (2-카복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, CAS 5961-85-3), 시스테인 하이드로클로라이드(Cys-HCl, CAS 52-89-1) 또는 2-머캅토에탄설폰산 나트륨염(MESNA)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 펩타이드 및 단백질 디설파이드 결합의 고상 환원이 가능하게 하도록 티올계 환원제가 부동화된 수지를 함유하는 부동화된 환원제 칼럼과 같은 단백질 결합을 환원시키는 다른 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 폴리펩타이드들 사이의 화학 상호작용을 감소시키기에 적합한 산화제를 포함하는 환원제가 또한 고안된다.
2. 단백질 단편 표지
i. 카보익슬기(Carboyxl Group) 표지
일 실시형태에서, 소화된 mAb 샘플은 카복실기 표지를 사용하여 표지된다. 카복실기 풋프린팅은 Asp 및 Glu 잔기의 측쇄를 글리신 에틸 에스테르 하이드로클로라이드(GEE: glycine ethyl ester hydrochloride)로 표지하여 단백질 구조 및 상호작용을 연구하기 위해 흔히 사용되는 공유 표지 기법이다. GEE 표지 반응에서, 단백질의 표면에 위치한 Asp 및 Glu 잔기로부터의 카복실기는 쉽게 변형되는 반면, 단백질 구조의 내부에 묻힌 것은 변형을 덜 겪거나 심지어는 겪지 않는다. 일 실시형태에서, 소화된 샘플은 0.2 M 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 2 M GEE와 혼합될 수 있고, 실온에서 1시간 동안 항온처리될 수 있다. GEE 표지 반응은 1 M Tris-HCl(pH 8)을 첨가하여 켄칭될 수 있다. 일 실시형태에서, 이후 샘플 용액은 농축될 수 있다. 샘플을 농축시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 방법은 막 투석, 침전 또는 염석, 셀룰로스 막 농축기 및 원심분리를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, 샘플은 예를 들어 Ultracel-10K 원심분리 필터를 사용하여 원심분리에 의해 농축된다.
ⅱ. 단백질의 빠른 광화학적 산화(FPOP)
일 실시형태에서, 소화된 mAb 샘플은 FPOP를 사용한 표지이다. FPOP는 ㎲ 시간 규모로 아미노산 잔기 측쇄에서 단백질을 표지하는 잘 개발된 하이드록실 라디칼 표지 방법이고, 단백질-단백질/리간드 상호작용을 연구하는 데에 널리 적용되고 있다. 일 실시형태에서, mAb 단편을 함유하는 소화된 mAb 이합체 및 비공유로 결합된 단편 이합체는 적절한 완충액, 예를 들어 PBS(pH 7.4)로 완충액 교환된다. 켄쳐가 OH 라디칼과 빨리 반응하고 표지 동안 회피되어야 하므로 완충액 교환이 필요할 수 있다. 통상적인 켄쳐는 소정의 완충액 용액, 예컨대 Tris-HCl 및 화학물질, 예컨대 글리세롤 및 DTT를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
Figure pct00001
OH 표지는 단백질의 자연적 구조에 구조 변화를 초래할 수 있다. 일 실시형태에서, 단백질이 과표지되지 않아 자연적 구조가 포획되게 보장하고 구조 변화를 갖는 과표지된 단백질이 아니도록, 포촉제(scaverger)는 OH 라디칼 수명을 조절하도록 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 포촉제는 Cys, Trp, Tyr, Met, His, Phe, Arg, Ile, Leu, Val, Pro, Gln, Thr 및 Lys를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, 포촉제는 His이다. 완충액 교환된 혼합물은 처음에 PBS 및 농축된 포촉제 용액 및 H2O2 스톡 용액과 혼합될 수 있다. His는 200 내지 500 μM의 농도로 첨가될 수 있다. His 농도는 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500 μM일 수 있다. 예시적인 혼합물은 최종 100 ㎕의 용액을 만들도록 1 mg/mL의 mAb 소화 혼합물, 350 μM His 및 20 mM H2O2를 함유한다. 일 실시형태에서, H2O2는 FPOP에 대한 배관에 용액을 인퓨징하기 바로 전에 첨가될 수 있다.
단백질의 산화적 표지는 포아송 분포에 의해 비변형된, +16 Da, +32 Da 및 +48 Da 종의 강도를 모델링함으로써 모니터링될 수 있다. 산소-첨가 상태 분포 값은 포아송 분포에 대한 적합도(goodness-of-fit)에 대해 시험될 수 있다. 일 실시형태에서, 예상된 포아송 분포로 적합화되지 않는 데이터는 단백질의 과표지를 나타낸다. 대안적으로, 데이터가 포아송 모델로 적합화되면, 단백질의 과표지 없이 충분한 표지가 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 100 ㎕의 기밀 시린지로 로딩될 수 있고, 150 ㎛ i.d.의 퓨즈가 있는 실리카 배관에 커플링된 시린지 펌프를 통해 도입될 수 있다. 배관은 레이저 빔을 마주보는 중앙에 투명한 창을 가질 수 있다. 레이저는 엑시머 레이저, 예를 들어 KrF 엑시머 레이저일 수 있다. 임의의 상업적으로 입수 가능한 엑시머 레이저, 예를 들어 COMPex 50 레이저(Coherent Inc.)가 사용될 수 있다. KrF 엑시머 레이저 파워는 약 100 내지 150 mJ/펄스일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 레이저 파워는 약 100 내지 120 mJ/펄스일 수 있다. 레이저 펄스 주파수는 6 Hz로 설정될 수 있다. 투명한 샘플 관 창에서의 레이저 빔의 폭은 약 1.5 ㎜ 내지 3.0 ㎜일 수 있다. 레이저 폭은 1.5 ㎜, 1.75 ㎜, 2 ㎜, 2.25 ㎜, 2.5 ㎜, 2.75 ㎜, 또는 3 ㎜일 수 있다. 레이저 파워는 시간이 지나면서 변동할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 최대 표지 일관성을 위해 동일한 날짜에 동일한 세트의 표지 실험이 수행될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 선량계는 런-투-런(run-to-run) 표지 효율 변동을 모니터링하기 위해 첨가될 수 있다.
펄스 레이저를 켠 후, 샘플 용액은 예를 들어 23.86 ㎕/분의 유량으로 배관에 인퓨징될 수 있다. 유량은 배관 내경(i.d.), 레이저 주파수 및 측정된 레이저 빔 폭에 따라 조정될 수 있다. 유량은 반복된
Figure pct00002
OH 노출 및 반응을 피하도록 20% 배제 용적을 보장하기에 적절해야 한다. 일부 실시형태에서, 모세관 유출은 잔류 H2O2를 감소시키도록 용액을 함유하는 바이알에 수집될 수 있다. 잔류 H2O2의 감소는 환원제, 항산화제, 또는 이들의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 예시적인 비효소 항산화제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타 카로텐, 카로텐, 타우린, 하이포타우린, 글루타티온, 셀레늄, 아연, 메티오닌 및 유비퀴논을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 효소 항산화제는 SOD, 카탈라아제, 글루타레독신 및 글루타티온 환원효소를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, 잔류 H2O2를 감소시키기 위한 용액은 메티오닌 및 카탈라아제를 함유한다. 표지된 샘플 유출 용액은 예를 들어 ultracel-10K 원심분리 필터를 사용하여 원심분리에 의해 농축될 수 있다.
ⅲ. 표지된 mAb 단편 이합체 및 단량체의 단리
일 실시형태에서, 공유 표지된 샘플 혼합물은 크기 배제 크로마토그래피, 예를 들어 BEH® SEC 칼럼을 사용하여 분리될 수 있다. SEC 분리 및 UV 검출(280 ㎚) 이후에, 이합체성 단편 및 단량체성 단편은 트립신분해 펩타이드 맵핑 분석을 위해 수집될 수 있다.
개시된 방법이 본원에 제시된 바와 같은 부분분리(제한된 소화) 및 표지의 단계들의 임의의 특정 순서로 제한되지 않는다고 이해된다.
ⅳ. 표지된 이합체 단편의 펩타이드 맵핑
일 실시형태에서, 이합체 분획 및 단량체 분획은 트립신분해 펩타이드 맵핑으로 처리될 수 있다. 트립신분해 펩타이드 맵핑의 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 이합체 분획 및 단량체 분획은 예를 들어 SpeedVac에서 건조될 수 있고, 트립신분해 펩타이드 맵핑 전에 8 M 우레아, 5 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5)을 함유하는 용액에 재구성될 수 있다. 변성되고 환원된 샘플은 30분 동안 암소에서 10 mM 요오도아세트아미드(IAA)로 알킬화될 수 있다. 이후, 샘플 용액은 우레아 농도를 낮추도록 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5)로 희석될 수 있고, 밤새 37℃에서 1:20(w/w)의 효소-대-기질 비율로 트립신으로 소화될 수 있다. 소화는 10% 포름산(FA)을 각각의 소화된 단백질 샘플에 첨가하여 중단될 수 있다. 이후, 샘플은 역상 UPLC에 의해 분리될 수 있고, 이어서 펩타이드 질량을 결정하고 펩타이드 정체를 확인하기 위해 온라인 질량 분광학적 분석이 될 수 있다. 일 실시형태에서, MS 및 MS/MS 실험은 MS/MS 실험 동안 펩타이드 단편화에 사용된 고에너지 충돌 해리(HCD: higher-energy collisional dissociation)를 갖는 Thermo Q Exactive Plus MS 시스템에서 수행된다.
v. 이합체화 계면의 확인 및 규명
카복실릭기 표지를 위한 일 실시형태에서, GEE 표지된 트립신분해 펩타이드를 확인하기 위해, LC-MS/MS 데이터는, 예를 들어 BYONIC™(Protein Metrics)와 같은 소프트웨어를 사용하여, GEE1(+85.0522) 및 GEE2(+57.0209)의 가변적인 변형이 Asp 및 Glu 잔기에 제한된, 상응하는 mAb 단백질 서열을 함유하는 데이터베이스 또는 조사 엔진에 대해 조사된다. Asp/Glu 잔기를 함유하는 각각의 트립신분해 펩타이드에서 GEE 표지 정도를 정량화하기 위해, GEE 표지된 펩타이드 및 자연적 펩타이드 둘 다의 제1 동위원소 피크의 m/z에 기초한 추출된 이온 크로마토그램(EIC: extracted ion chromatogram)이 생성되고, 추출된 피크 면적이 적분된다. 각각의 GEE 표지된 펩타이드의 백분율은 표지된 펩타이드와 자연적 펩타이드의 피크 면적의 합에 대해 상응하는 EIC 피크 면적을 사용하여 계산된다. 다수의 Asp 및 Glu 잔기를 함유하는 트립신분해 펩타이드의 경우에, 상이한 보유 시간에 용리하는 GEE 표지된 펩타이드는 처음에 표지 부위를 확인하도록 MS/MS 스펙트럼에 대해 조사되고, 이후 상응하는 EIC 피크 면적은 부위-특이적 표지 백분율을 계산하도록 사용된다. 마지막으로, GEE 표지 정도는 각각의 트립신분해 펩타이드 또는 잔기에 대해 이합체 분획과 단량체 분획 사이에 비교된다. 단량체 분획에서보다 이합체 분획에서 감소된 표지 정도를 나타내는 영역은 이합체화 계면에 관여되고 이와 근접할 것으로 예상된다.
FPOP 표지를 위한 일 실시형태에서, LC-MS/MS 데이터는 처음에 모든 표지 산물/펩타이드를 확인하기 위해 모든 공지된 산화적 표지 산물에 의해 상응하는 mAb 단백질 서열을 함유하는 데이터베이스에 대해 조사된다(표 1). 펩타이드에서의 변형 부위는 MS/MS 정보에 기초하여 확인되고, 정확한 m/z에 의해 확인되고, 소정의 펩타이드에 대한 변형 정도는
Figure pct00003
로 계산되고, 상기 식에서 Iox는 변형된 펩타이드의 강도(비표지 샘플 취급 동안 도입된 Met에서의 가능한 산화로 인해 배제된 Met 산화)이고, I는 비변형된 펩타이드의 강도이다. 잔기 수준에서의 산화적 표지의 정량적 분석은 이합체와 단량체 사이의 펩타이드 수준에서의 변형 정도의 차이를 나타내는 펩타이드 및 Met 잔기를 함유하는 펩타이드에 대해 또한 수행된다. 펩타이드에서의 변형 부위는 MS2 정보에 의해 배정된다. 일부 실시형태에서, MS2로부터의 제한된 단편화 정보 또는 펩타이드 이성질체의 공동용리로부터의 간섭의 존재로 인해 단일 잔기에 대한 변형의 위치가 가능하지 않는 경우, 가능한 잔기의 세트에 변형이 발생하는 것으로 나타난다. 단량체 분획에서보다 이합체 분획에서 감소된 표지 정도를 나타내는 영역은 이합체화 계면에 관여되거나 또는 이와 근접할 것으로 예상된다.
일 실시형태는 자연적 제한된 소화 조건 하에 단백질 약물 산물의 농후화된 이합체 샘플을 소화시켜 비공유로 결합된 이합체성 하위도메인(예를 들어, F(ab) 이합체) 및 단량체성 하위도메인을 함유하는 단백질 약물 혼합물 샘플을 형성하는 단계 및 단백질 약물 혼합물 샘플의 이합체 및 단량체로 검출 가능한 변형을 도입하여 변형된 이합체 및 변형된 단량체를 제조하는 단계에 의해 단백질 약물 산물에서 비공유 상호작용 부위 또는 이합체화 계면을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 자연적 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 변형된 이합체 및 변형된 단량체를 변형된 이합체 분획 및 변형된 단량체 분획으로 분리시키는 단계 및 변형된 이합체 분획 및 변형된 단량체 분획의 다수의 펩타이드 결합을 소화시켜 소화된 펩타이드 샘플을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 액체 크로마토그래피/질량 분광법을 사용하여 소화된 펩타이드 샘플을 분석하여 소화된 펩타이드 샘플의 질량 분광법 데이터를 얻는 단계 및 단백질 약물 산물로 도입된 특이적 잔기 변형을 갖는 단백질 약물 산물의 알려진 질량 분광법 데이터와 비교된 소화된 펩타이드의 질량 분광법 데이터를 사용하여 소화된 펩타이드 샘플에서의 소화된 펩타이드에서의 변형 부위를 결정하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 이합체 및 단량체는 이합체 및 단량체로의 검출 가능한 산화적 변형을 형성하도록 빠른 광화학적 산화에 의해 변형된다. 변형은 아미노산 측쇄 변형일 수 있다.
상기 기술된 바대로, 단백질 약물 산물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 재조합 단백질, 융합 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직한 단백질 약물 산물은 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일 실시형태에서, 자연적 크기 배제 크로마토그래피는 아세트산암모늄 및 중탄산암모늄을 포함하는 이동상을 사용하여 수행된다. 다른 실시형태에서, 소화된 단백질 샘플은 역상 액체 크로마토그래피로 분리된다.
일부 실시형태에서, 변형은 산화, 이중산화(dioxidation), 삼중산화(trioxidation), 카이뉴레닌, 디티오메틸, 탈카복실화, 하이드록시카이뉴레닌, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
통상적으로, 단백질 약물 산물은 효소로 소화되고, 예를 들어 프로테아제로 소화된다. 제한된 소화에 사용된 예시적인 프로테아제는 파파인, 휘신, 엔도프로테아제 Lys-C 및 IdeS를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다수의 펩타이드를 형성하도록 펩타이드 결합 소화에 사용된 예시적인 프로테아제는 트립신, 키모트립신, 펩신 및 rLys-C를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 단백질 약물 산물 샘플은 유가 배양으로부터 얻는다.
B. 비공유 상호작용 또는 응집이 감소된 단백질 약물 산물을 생산하는 방법
일 실시형태는 항체를 생산하기에 적합한 조건 하에 항체를 생산하는 세포를 배양하는 단계; 항체를 추출하기에 적합한 조건 하에 항체를 정제하는 단계; 항체를 안정화시키기에 적합한 조건 하에 항체를 부형제와 혼합하는 단계; i) 세포 배양물로부터, ii) 세포 배양물로부터 항체를 정제한 후에, 또는 iii) 정제된 항체에 부형제를 첨가한 후에 항체의 샘플을 얻는 단계; 본원에 개시된 시스템 및 방법을 사용하여 항체에서 이합체화 계면을 규명하는 단계 및 비변형된 항체에 비해 감소된 이합체화 및 비공유 상호작용을 갖도록 항체를 생산하는 조건을 변형시키거나 항체의 이합체화 계면을 변형시키는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 항체를 생산하기 위한 조건의 변형은 이하에 설명된다.
일 실시형태에서, 변형은 이합체화 계면의 화학 변형 또는 보존적 아미노산 치환일 수 있다.
실시예
실시예 1: 공유 표지에 의한 이합체 및 단량체 혼합물의 단일-표지
방법
mAb-1의 제한된 소화
mAb-1, IgG1 이소타입은 엔도프로테아제 LysC로 자연적 조건 하에 F(ab) 및 Fc 단편으로 소화되었다. mAb-1 이합체를 처음에 10 mM Tris-HCl(pH 7.5)에 1 ㎍/㎕로 희석하고, 이후 37℃에서 1시간 동안 엔도프로테아제 Lys-C(단백질:효소 = 400:1)와 항온처리하였다. 이 제한된 소화 처리는 2개의 힌지 영역 디설파이드 결합의 N-말단인 Lys 잔기에서 중쇄를 특이적으로 절단하여 F(ab) 및 Fc 단편 둘 다를 생성시켰다. 이합체 종으로부터의 임의의 비공유 이합체 상호작용(가장 흔하게는 F(ab) - F(ab))은 혼합물에서 유지된다.
mAb-2의 제한된 소화
mAb-2, 및 IgG4 이소타입은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptocoocus pyogenes)로부터의 IdeS 효소인 FabRICATOR®로 자연적 조건 하에 F(ab')2 및 Fc* 단편으로 소화되었다. mAb-2 이합체를 처음에 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 1 ㎍/㎕로 희석하고, 이후 37℃에서 1시간 동안 FabRICATOR®(1 ㎍의 단백질당 1 IUB 밀리단위)로 소화시켰다. 이 제한된 소화 처리는 2개의 Gly 잔기들 사이에 2개의 힌지 영역 디설파이드 결합에 C-말단인 부위를 특이적으로 절단한다. 이 처리는 1개의 F(ab')2 단편 및 비공유 상호작용을 통해 함께 결합된 2개의 동일한 Fc/2 단편(Fc*)을 생성시켰다. 이후, 소화 혼합물을 37℃에서 30분 동안 5 mM의 디티오트레이톨(DTT)과 항온처리하고, 이는 사슬내 디설파이드 결합을 온전하게 유지시키면서 사슬간 디설파이드 결합을 환원시킨다. 그 결과, Fab2 단편은 2개의 F(ab') 단편으로 환원되고, Fd 및 LC는 비공유 상호작용을 통해 함께 결합된다. 이합체 종으로부터의 비공유 이합체 상호작용(가장 흔하게는 F(ab')-F(ab'))이 혼합물에서 또한 유지된다.
mAb 단편 및 비공유로 결합된 단편 이합체의 상기 생성된 혼합물을 처음에 약 2 mg/mL로 1×PBS(pH 7.4)로 완충액 교환한다.
카복실기 표지
카복실기 풋프린팅은 Asp 및 Glu 잔기의 측쇄를 GEE로 표지하여 단백질 구조 및 상호작용을 연구하기 위해 흔히 사용되는 공유 표지 기법이다. GEE 표지 반응에서, 단백질의 표면에 위치한 Asp 및 Glu 잔기로부터의 카복실기는 쉽게 변형되는 반면, 단백질 구조의 내부에 묻힌 것은 변형을 덜 겪거나 심지어는 겪지 않는다. 표지를 수행하기 위해, 100 ㎕의 mAb-1의 소화된 샘플을 50 ㎕의 0.2 M 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 50 ㎕의 2 M 글리신 에틸 에스테르 하이드로클로라이드(GEE)와 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 500 ㎕의 1M Tris-HCl(pH 8)을 첨가하여 GEE 표지 반응을 켄칭한 후, 샘플 용액을 약 40 ㎕로 Ultracel-10K 원심분리 필터를 사용하여 원심분리에 의해 농축시켰다.
단백질의 빠른 광화학적 산화(FPOP)
FPOP는 ㎲ 시간 규모로 아미노산 잔기 측쇄에서 단백질을 표지하는 잘 개발된 하이드록실 라디칼 표지 방법이고, 단백질-단백질/리간드 상호작용을 연구하는 데에 널리 적용되고 있다. 표지 과정에서, 50 ㎕의 상기 완충액 교환된 혼합물을 1 mg/mL의 mAb-2 소화 혼합물, 350 μM His 및 20 mM H2O2를 함유하는 최종 100 ㎕의 용액을 만들도록 처음에 1×PBS 및 농축된 His 용액 및 H2O2 스톡 용액과 혼합하였다. H2O2를 FPOP에 대한 배관에 용액을 인퓨징하기 바로 전에 첨가하였다. 샘플을 100 ㎕의 기밀 시린지에 로딩하고, 레이저 빔을 마주보는 중앙에 투명한 창을 갖는 150 ㎛ 내경(i.d.)의 퓨즈가 있는 실리카 배관에 커플링된 시린지 펌프를 통해 도입하였다. KrF 엑시머 레이저 파워는 100 내지 120 mJ/펄스로 조정되고, 이의 펄스 주파수는 6 Hz로 설정되었다. 투명한 샘플 관 창에서의 레이저 빔의 폭은 3.0 ㎜인 것으로 측정되었다. 펄스 레이저를 켠 후, 샘플 용액을 반복된
Figure pct00004
OH 노출 및 반응을 피하도록 20% 배제 용적을 보장하기에 (배관 내경, 레이저 주파수 및 측정된 레이저 빔 폭에 따라 조정된) 23.86 ㎕/분의 유량에서 배관에 인퓨징하였다. 모세관 유출을 잔류 H2O2를 감소시키도록 20 ㎕의 100 mM Met 및 2 ㎕의 1 mg/mL 카탈라아제를 함유하는 바이알에 수집하였다. 마지막으로, 표지된 샘플 용액을 Ultracel-10K 원심분리 필터를 사용하여 원심분리에 의해 약 40 ㎕로 농축시켰다.
SEC/MS
공유 표지된 샘플 혼합물을 0.2 mL/분의 유량으로 이동상(140 mM 아세트산암모늄 및 10 mM 중탄산암모늄, pH 7.4)으로 예비평형화된 BEH® SEC 칼럼(300 ㎜ x 4.6 ㎜, 200 Å, 1.7 ㎛)에 주입하였다. SEC 분리 및 UV 검출(280 ㎚) 이후에, 트립신분해 펩타이드 맵핑 분석을 위해 이합체성 단편 및 단량체성 단편을 수집하였다.
펩타이드 맵핑
트립신 소화 전에, 모든 이합체 분획 및 단량체 분획을 SpeedVac에 건조시키고, 8 M 우레아, 5 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5)을 함유하는 용액에 재구성하고, 50℃에서 30분 동안 유지시켰다. 변성되고 환원된 샘플을 30분 동안 암소에서 10 mM 요오도아세트아미드(IAA)로 알킬화하였다. 이후, 샘플 용액을 우레아 농도를 0.8 M으로 낮추도록 0.1 M Tris-HCl(pH 7.5)로 10배 희석하고, 밤새 37℃에서 1:20(w/w)의 효소-대-기질 비율로 트립신으로 소화시켰다. 이후, 소화는 최종 0.2% FA를 만들도록 10% FA를 첨가하여 중단되었다. 이후, 각각의 소화된 단백질 샘플의 분취액(약 5 ㎍)을 역상 UPLC에 의해 분리하고, 이어서 펩타이드 질량을 결정하고 펩타이드 정체를 확인하도록 온라인 질량 분광학적 분석을 하였다. MS 및 MS/MS 실험은 MS/MS 실험 동안 펩타이드 단편화에 사용된 고에너지 충돌 해리(HCD)를 갖는 Thermo Q Exactive Plus MS 시스템에서 수행되었다.
결과
카복실기 표지
GEE 표지된 트립신분해 펩타이드를 확인하기 위해, LC-MS/MS 데이터는, GEE1(+85.0522) 및 GEE2(+57.0209)의 가변적인 변형은 Asp 및 Glu 잔기에 제한된, 상응하는 mAb 단백질 서열을 함유하는 데이터베이스에 대해 조사되었다. Asp/Glu 잔기를 함유하는 각각의 트립신분해 펩타이드에서 GEE 표지 정도를 정량화하기 위해, GEE 표지된 펩타이드 및 자연적 펩타이드 둘 다의 제1 동위원소 피크의 m/z에 기초한 추출된 이온 크로마토그램(EIC)이 생성되고, 추출된 피크 면적이 적분되었다. 각각의 GEE 표지된 펩타이드의 백분율은 표지된 펩타이드와 자연적 펩타이드의 피크 면적의 합에 대해 상응하는 EIC 피크 면적을 사용하여 계산되었다. 다수의 Asp 및 Glu 잔기를 함유하는 트립신분해 펩타이드의 경우에, 상이한 보유 시간에 용리하는 GEE 표지된 펩타이드는 처음에 표지 부위를 확인하도록 MS/MS 스펙트럼에 대해 조사되고, 이후 상응하는 EIC 피크 면적은 부위-특이적 표지 백분율을 계산하도록 사용되었다. 마지막으로, GEE 표지 정도는 각각의 트립신분해 펩타이드 또는 잔기에 대해 이합체 분획과 단량체 분획 사이에 비교되었다. 단량체 분획에서보다 이합체 분획에서 감소된 표지 정도를 나타내는 영역은 이합체화 계면에 관여되고 이와 근접할 것으로 예상된다(도 2, 도 3a 및 도 3b).
FPOP 표지
FPOP 표지를 위해, LC-MS/MS 데이터는 처음에 모든 표지 산물을 확인하기 위해 모든 공지된 산화적 표지 산물에 의해 상응하는 mAb 단백질 서열을 함유하는 데이터베이스에 대해 조사되었다(표 1). 펩타이드에서의 변형 부위는 MS/MS 정보에 기초하여 확인되고, 정확한 m/z에 의해 확인되고, 소정의 펩타이드에 대한 변형 정도는
Figure pct00005
로 계산되었고, 상기 식에서 Iox는 변형된 펩타이드의 강도(비표지 샘플 취급 동안 도입된 Met에서의 가능한 산화로 인해 배제된 Met 산화)이고, I는 비변형된 펩타이드의 강도이다. 잔기 수준에서의 산화적 표지의 정량적 분석은 이합체와 단량체 사이의 펩타이드 수준에서의 변형 정도의 차이를 나타내는 펩타이드 및 Met 잔기를 함유하는 펩타이드에 대해 또한 수행되었다. 펩타이드에서의 변형 부위는 MS2 정보에 의해 배정되었다. 몇몇 경우에, MS2로부터의 제한된 단편화 정보 또는 펩타이드 이성질체의 공동용리로부터의 간섭의 존재로 인해 단일 잔기에 대한 변형의 위치가 가능하지 않는 경우, 가능한 잔기의 세트에 변형이 발생하는 것으로 나타났다. 하위도메인 수준에서의 +0, +16, +32, +48 등의 표지 종의 포아송 분포는 과표지가 발생하지 않았음을 나타낸다(도 4A 내지 도 4C). 단량체 분획에서보다 이합체 분획에서 감소된 표지 정도를 나타내는 영역은 이합체화 계면에 관여되거나 또는 이와 근접할 것으로 예상된다(도 5a 및 도 5b).
표 1.
Figure pct00006
실시예 2: FPOP 최적화
방법:
실시예 1로부터의 FPOP 프로토콜이 이어진다. 프로토콜의 다양한 구성성분, 즉 레이저 위치, 포촉제 농도 및 켄쳐의 포함은 검정에서의 이의 효과를 결정하도록 조작되었다.
결과:
표 2는 도 6a 및 도 6b에 대한 실험 매개변수를 보여준다. 도 6a 및 도 6b에 보이는 것처럼, 위치 및 레이저 파워는 라이소자임 단백질의 표지 효율에 영향을 미친다. 더 가까운 초점화 위치 및 122 mJ의 레이저 파워를 포함하는 도 6b의 매개변수를 사용하여 분석된 샘플에서의 산화된 종은 포아송 분포에 +0, +16, +32 … 상태 산물 분포의 양호한 적합을 보여준다. 이것은 증가된 표지 효율을 나타낸다.
표 2.
Figure pct00007
도 7A 내지 도 7F 및 도 8A 내지 도 8D에서 포아송 분포 데이트에 의해 입증되는 것처럼, 레이저 파워 및 포촉제 농도는 단백질 농도보다 훨씬 더 높은 수준으로 단백질의 표지 효율에 영향을 미친다.
완충액 교환 없이 탈글리코실화된 mAb1은 완충액 교환으로 처리된 mAb1(도 9A)과 비교하여 감소된 표지 정도(도 9B)를 보여준다. 이는 켄쳐가 단백질 산화적 표지를 방해할 수 있음을 시사한다.
상기 명세서에서 본 발명이 이의 소정의 실시형태와 관련하여 기재되어 있고, 많은 상세내용이 예시의 목적을 위해 기재되어 있지만, 본 발명이 추가 실시형태를 허용하고, 본원에 기재된 소정의 상세내용이 본 발명의 기본 원칙을 벗어나지 않으면서 상당히 변할 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다.
본 개시내용에 걸쳐 언급된 모든 참고문헌은 본원에 그 전체 내용이 참고로 포함된다.

Claims (23)

  1. 단백질 약물 산물에서 비공유 상호작용 부위 또는 이합체화 계면을 확인하는 방법으로서,
    자연적 조건(native condition) 하에 단백질 약물 산물의 제한된 소화를 이용하여 단량체 및 비공유로 결합된 이합체를 포함하는 단백질 약물 이합체 샘플 혼합물을 형성하는 단계;
    검출 가능한 변형을 단백질 약물 이합체 샘플 혼합물의 이합체 및 단량체로 도입하여 변형된 이합체 및 변형된 단량체를 제조하는 단계;
    자연적 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 상기 변형된 이합체 및 변형된 단량체를 변형된 이합체 및 변형된 단량체 분획으로 분리시키는 단계;
    상기 변형된 이합체 및 변형된 단량체 분획을 소화시켜 펩타이드 샘플을 형성하는 단계;
    액체 크로마토그래피/질량 분광법(LC-MS)을 사용하여 펩타이드 샘플을 분리하여 상기 펩타이드 샘플의 질량 분광법 데이터를 얻는 단계;
    이러한 단백질 약물 산물의 각각의 펩타이드 및 변형된 펩타이드의 질량을 계산하여 상기 단백질 약물 산물의 알려진 질량 데이터와 비교된 펩타이드의 질량 분광법 데이터를 사용하여 상기 펩타이드 샘플에서의 각각의 펩타이드에서의 변형 부위를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 자연적 제한된 소화 조건은 폴리펩타이드들 사이에 디설파이드 결합을 보유하고 이합체들 사이에 비공유 상호작용을 보유하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이합체 및 단량체는 이합체 및 단량체로의 검출 가능한 산화적 변형을 형성하는 빠른 광화학적 산화에 의해 변형되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 약물 산물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 재조합 단백질, 융합 단백질, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 약물 산물은 항체이고, 상기 혼합물에서의 이합체는 본질적으로 2개의 상호작용 F(ab') 또는 F(ab) 단편으로 이루어지는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 약물 산물은 항체이고, 상기 혼합물에서의 단량체는 본질적으로 F(ab) 단편 및 Fc 단편으로 이루어지는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 아미노산 측쇄 변형인, 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자연적 크기 배제 크로마토그래피는 아세트산암모늄 및 중탄산암모늄을 포함하는 이동상을 사용하여 수행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 소화된 단백질 샘플은 역상 액체 크로마토그래피로 분리되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 산화, 이중산화(dioxidation), 삼중산화(trioxidation), 카이뉴레닌, 디티오메틸, 탈카복실화, 하이드록시카이뉴레닌, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질 약물 산물은 효소로 소화되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 효소는 파파인, 휘신(ficain), 엔도프로테아제 Lys-C 및 IdeS 또는 이의 변형된 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 변형된 이합체 및 변형된 단량체 분획은 펩타이드를 형성하는 2개의 연속 아미노산 잔기를 연결하는 공유 화학 결합을 파괴하는 효소에 의해 소화되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 약물 산물 샘플은 유가 배양, 정제 공정 단계, 또는 제제화된 약물 물질로부터 얻은, 방법.
  16. 항체를 생산하는 방법으로서,
    상기 항체를 생산하기에 적합한 조건 하에 세포 배양물에서 상기 항체를 생산하는 세포를 배양하는 단계;
    상기 항체를 추출하기에 적합한 조건 하에 상기 항체를 정제하는 단계;
    상기 항체를 안정화시키기에 적합한 조건 하에 상기 항체를 부형제와 혼합하는 단계;
    항체의 샘플을 i) 상기 세포 배양물로부터, ii) 상기 세포 배양물로부터 상기 항체를 정제한 후에, 또는 iii) 정제된 항체에 부형제를 첨가한 후에 얻는 단계;
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 항체의 이합체화 계면 또는 비공유 상호작용 부위를 특징규명하는 단계, 및
    상기 항체의 이합체화 또는 비공유 상호작용의 양을 감소시키도록 하나 이상의 세포 배양, 정제 또는 부형제 조건을 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 이합체화 또는 비공유 상호작용의 양을 감소시키도록 변한 하나 이상의 조건은 pH, 세포 밀도, 아미노산 농도, 삼투질농도, 성장 인자 농도, 아지테이션, 용해된 산소, 금속 이온, 가스 분압, 친화도 매트릭스, 크로마토그래피 수지, 완충액, 계면활성제, 안정화제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS 세포(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero 세포, CV1 세포, 신장 세포(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa 세포, HepG2 세포, WI38 세포, MRC 5 세포, Colo25 세포, HB 8065 세포, HL-60 세포, 림프구 세포, 예를 들어 자가유래 T 세포, Jurkat(T 림프구) 또는 Daudi(B 림프구), A431(표피) 세포, U937 세포, 3T3 세포, L 세포, C127 세포, SP2/0 세포, NS-0 세포, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 임의의 전술된 세포로부터 유래된 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 세포는 하이브리도마 세포 또는 쿼드로마 세포인, 방법.
  20. 항체로서,
    제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 항체.
  21. 변형된 항체를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 상기 항체에서의 이합체화 계면 또는 비공유 상호작용 부위를 특징규명하는 단계, 및
    상기 항체의 이합체화 또는 비공유 상호작용을 감소시키도록 이합체화 계면 또는 비공유 상호작용 부위에서 아미노산을 변형시키는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항의 변형된 항체.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 항체.
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