CN107037116B - 检测gpcr之间相互作用及其交界面的方法 - Google Patents

检测gpcr之间相互作用及其交界面的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107037116B
CN107037116B CN201611088483.0A CN201611088483A CN107037116B CN 107037116 B CN107037116 B CN 107037116B CN 201611088483 A CN201611088483 A CN 201611088483A CN 107037116 B CN107037116 B CN 107037116B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gpcr
apj
transmembrane peptides
transmembrane
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201611088483.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107037116A (zh
Inventor
白波
陈京
蔡欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201611088483.0A priority Critical patent/CN107037116B/zh
Publication of CN107037116A publication Critical patent/CN107037116A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107037116B publication Critical patent/CN107037116B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G01N27/64—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode using wave or particle radiation to ionise a gas, e.g. in an ionisation chamber
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供用于检测GPCR之间相互作用及其交界面的方法，包括利用跨膜肽和MALDI‑TOF质谱法检测GPCR的二聚化及其交界面。

Description

检测GPCR之间相互作用及其交界面的方法
发明领域
本发明涉及生物检测技术，具体涉及检测GPCR之间相互作用及其交界面的方法。
背景技术
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)具有七次跨膜结构，其成员有800多个，其相关药物占市场上药物的40％-50％，因此是重要的药物靶点之一。最初认为GPCR是以单体形式存在并以单体的形式发挥作用。但在过去的二十年里越来越多的研究表明，GPCR能够在完整细胞中形成二聚体甚至高阶寡聚体。近期研究发现，视紫红质受体与β-arrestin结合的化学计量比由1∶1变为2∶1，这无疑证实了受体二聚体的存在。GPCR之间存在相互作用，其不同亚型及不同类型之间可以形成同源(相同受体)或异源(不同受体)二聚体，它们具有不同于单体的特异功能特征。GPCR的二聚化是调节受体功能的一种重要方式，受体-受体的相互作用可能形成较稳定的结构形式，并改变下游信号的G蛋白偶联从而产生二聚体特异的信号转导，并增加GPCR表型的多样性[10]。近年来的研究表明，GPCR同源或异源二聚体具有生理相关性。GPCR不论紧密相关，还是关系较远的都能够相互结合并且调节它们的活性，如μ阿片和CB1大麻素受体之间的相互作用影响神经突触形成(neuritogenesis)。大麻素/腺苷A2A受体二聚体影响大麻素在纹状体中介导的运动效应。另外，GPCR同源或异源二聚体具有疾病特异性，参与多种病理过程，使它们成为有吸引力的药物靶点。AT1R-B1R异源二聚化对于先兆子痫综合症(preeclampsia)的发生起关键作用，提高了血管紧张素II的敏感性，增强了AT1R的活性。为了进一步证实AT1-B2受体异源二聚化在高血压中所起的作用，对自发性高血压大鼠的肾小球系膜上检测发现AT1R-B1R异源二聚体含量增高。此外，APJ-AT1R异源二聚体能够抑制血管紧张素介导的动脉粥样硬化。Apelin作用APJ-AT1R异二聚体，从而拮抗血管紧张素II的信号转导途径。研究表明，GPCR二聚体还与疼痛、哮喘、帕金森等有关。因此，对GPCR之间相互作用的研究将有助于探寻相关疾病治疗的新突破点及新药开发。
近年来，随着X-射线晶体学发展，使得GPCR的高分辨率结构解析工作取得很大的进展，为解析更多的GPCR精确结构和功能及相关药物研发奠定重要基础。研究证实GPCR的A类受体二聚体的交界面主要是跨膜区，GPCR结构核心显示出7个跨膜区(Transmembrane，TM)。GPCR二聚体中，受体之间的相互作用涉及到二者跨膜区(交界面)构象的变化，了解二聚体结构的基础是识别它们的交界面(Interface)。目前，关于二聚体的交界面主要分为两大类，I型，二聚体的交界面主要为TM1，TM2和H8(helix 8)；II型，二聚体交界面主要为TM5以及部分TM4或TM6。。
发明内容
本发明提供用于检测GPCR之间相互作用及其交界面的方法，包括利用跨膜肽和MALDI-TOF质谱法检测GPCR的二聚化及其交界面。
本发明的一个方面提供用于检测GPCR之间相互作用及交界面的方法，包括以下步骤：
(1)合成包含第一GPCR的一个或多个跨膜肽的融合蛋白，其中每个融合蛋白包含第一GPCR的一个跨膜肽和连接在所述跨膜肽的氨基酸或羧基端的膜结合肽，所述膜结合肽能与细胞膜上存在的分子连接从而促进跨膜肽在细胞膜上整合，且每个融合蛋白中膜结合肽与跨膜肽连接的顺序使得所述融合蛋白中包含的第一GPCR跨膜肽在细胞中能以与天然状态相同的方式与膜结合；
(2)在细胞中表达全长第二GPCR，并用步骤(1)中合成的每个融合蛋白分别孵育细胞，然后提取细胞中蛋白，并用全长第二GPCR的抗体对所提取的蛋白分别进行免疫沉淀；
(3)取免疫沉淀的蛋白混合物分别进行基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析，根据分子量的大小判断每个跨膜肽和全长第一GPCR之间是否发生相互作用以及相互作用的交界面。
在进一步的实施方案中，在步骤(3)中，如果基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析检测结果中存在分子量等于特定跨膜肽和全长第一GPCR二者分子量之和的峰，则认为免疫沉淀的蛋白混合物中具有该特定跨膜肽和全长第一GPCR的二聚体，由此可以判断第一GPCR和第二GPCR相互作用的交界面在该特定跨膜肽上。
在一些实施方案中，所述第一GPCR与所述第二GPCR可以是相同的GPCR或不同的GPCR。
在优选的实施方案中，所述融合蛋白由第一GPCR的一个跨膜肽和连接在所述跨膜肽的氨基酸或羧基端的膜结合肽组成。
在优选的实施方案中，所述膜结合肽是HIV TAT肽，其序列是YGRKKRRQRRR(SEQ IDNO：11)。
在一些实施方案中，步骤(1)中合成第一GPCR的部分跨膜肽。在另一些实施方案中，步骤(1)中合成第一GPCR的全部七个跨膜肽。
在优选的实施方案中，所述第一GPCR和/或第二GPCR是apelin受体(putativereceptor protein related to AT1，血管紧张素受体ATI相关受体蛋白，APJ)。
在优选的实施方案中，所述第一GPCR的一个或多个跨膜肽选自APJ的跨膜肽APJTMD1、APJ TMD2、APJ TMD3、APJ TMD4、APJ TMD5、APJ TMD6和APJ TMD7。其中APJ TMD1的序列是PAIYMLVFLLGTTGNGLVLWTVF(SEQ ID NO：1)，APJ TMD2的序列是FIASLAVADLTFVVTLPLWATYT(SEQ ID NO：2)，APJ TMD3的序列是IFVNMYASVFCLTGLSFDRYLAI(SEQ ID NO：3)，APJ TMD4的序列是VSGAVATAVLWVLAALLAMPVMV(SEQ ID NO：4)，APJ TMD5的序列是VSSTTVGFVVPFTIMLTCYFFIA(SEQ ID NO：5)，APJ TMD6的序列是RLLSIIVVLVVTFALCWMPYHLV(SEQ ID NO：6)，和/或APJ TMD7的序列是LMNIFPYCTCISYVNSCLNPFLY(SEQ ID NO：7)。在进一步优选的实施方案中，在包含APJ TMD1、APJ TMD3、APJ TMD5或APJ TMD7的融合蛋白中，膜结合肽连接在APJ TMD1、APJ TMD3、APJTMD5或APJ TMD7的羧基末端；和/或，在包含APJ TMD2、APJ TMD4或APJ TMD6的融合蛋白中，膜结合肽连接在APJ TMD2、APJ TMD4或APJ TMD6的氨基末端。
在另一个优选的实施方案中，所述第一GPCR是食欲素1型受体(OXR1)，第二GPCR是5-羟色胺受体1a(5HT1AR)。
在优选的实施方案中，所述第一GPCR的一个或多个跨膜肽选自OXR1的跨膜肽OXR1TMD1、OXR1 TMD5、OXR1 TMD7。其中OXR1 TMD1的序列是WVLIAAYVAVFLIALVGNTLV(SEQ IDNO：8)，OXR1 TMD5的序列是SCFFFVTYLAPLGLMGMAYFQIF(SEQ ID NO：9)，和/或OXR1 TMD7的序列是YACFTFSHWLVYANSAANPIIYNF(SEQ ID NO：10)。在进一步优选的实施方案中，膜结合肽连接在OXR1TMD1、OXR1TMD5或OXR1TMD7的羧基末端。
在优选的实施方案中，步骤(2)中每个融合肽与细胞在37℃孵育60min。
在优选的实施方案中，步骤(2)中的免疫沉淀是将所提取的蛋白离心后取上清，然后加入抗APJ抗体和protein A/G-beads，4℃孵育过夜，然后离心除去上清并洗涤。
在优选的实施方案中，步骤(3)中在进行基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析之前，先将免疫沉淀的蛋白混合物进行抗原洗脱后，离心取上清，将该上清作为MALDI-TOF分析的上样样品。其中优选用0.1M甘氨酸-HCl进行抗原洗脱。
附图说明
图1是LC-MS分析合成的TMD1肽的序列(Water1010)。
图2是LC-MS分析合成的TMD2肽的序列(Shimadzu)。
图3是LC-MS分析合成的TMD3肽的序列(Water1010)。
图4是LC-MS分析合成的TMD4肽的序列(Shimadzu)。
图5是LC-MS分析合成的TMD5肽的序列(Water1010)。
图6是LC-MS分析合成的TMD6肽的序列(Water1010)。
图7是LC-MS分析合成的TMD7肽的序列(Water1010)。
图8是利用质谱法检测APJ跨膜肽TMD1与APJ相互作用的结果。
图9是利用质谱法检测APJ跨膜肽TMD2对APJ相互作用的结果。
图10是利用质谱法检测APJ跨膜肽TMD3对APJ相互作用的结果。
图11是利用质谱法检测APJ跨膜肽TMD4对APJ相互作用的结果。
图12是利用质谱法检测APJ跨膜肽TMD5对APJ相互作用的结果。
图13是利用质谱法检测APJ跨膜肽TMD6对APJ相互作用的结果。
图14是利用质谱法检测APJ跨膜肽TMD7对APJ相互作用的结果。
图15是用质谱法检测OX1R跨膜肽TM1与5-羟色胺受体1a(5HT1a)相互作用的结果。
图16是用质谱法检测OX1R跨膜肽TM5与5-羟色胺受体1a(5HT1a)相互作用的结果。
图17是用质谱法检测OX1R跨膜肽TM7与5-羟色胺受体1a(5HT1a)相互作用的结果。
具体实施方案
本发明所用的术语“GPCR”是指G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)，是跨膜受体蛋白家族，它是细胞信号传导中的重要蛋白质。通常GPCR可被分为5类，但所有的GPCR都具有共同的结构特征，它们都具有七个疏水跨膜结构域，每个结构域的长度为20-30个氨基酸，并且所述7个疏水跨膜结构域通过多种长度的氨基酸序列连接。受体具有细胞外N末端，而C末端则位于细胞质中。
本发明所使用的术语“交界面”是指蛋白质或多肽间发生相互作用的位点或该位点所在的区域。
本文所使用的术语“膜结合肽”是指能与细胞膜上存在的分子连接的肽，例如HIVTAT(YGRKKRRQRRR)(SEQ ID NO：11)或极性标签SKSKSK(SEQ ID NO：12)，它能够与4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(存在于膜的内表面)连接。当所述膜结合肽与跨膜肽相连时，可以促进跨膜肽在细胞膜上整合。
合成肽的方法是本领域众所周知的，例如可以通过固相合成、溶液合成或重组技术来制备本发明的融合蛋白。固相合成技术通常是先将要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键同一个不溶性高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分，脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链，并重复进行缩合、洗涤、去保护、中和和洗涤、下一轮缩合的操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要合成的多肽。其中α-氨基可以用BOC(叔丁氧羰基)或FMOC(9-芴甲氧羰基)保护。重组技术通常是用包含编码肽的核酸的表达载体转化宿主细胞，在宿主细胞中表达并纯化所需的肽。
在细胞中表达全长GPCR的方法是本领域众所周知的，例如可以构建含有全长GPCR的表达质粒，将该表达质粒转入细胞，从而在细胞中稳定表达全长GPCR。所述质粒可以是以pcDNA3.1为基础构建的，也可以使用病毒质粒。将表达质粒转入细胞的方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、脂质体转染或病毒介导的转染技术。
本文所述的“免疫沉淀”是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白。其中抗体与样品中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，用洗脱液将沉淀中的抗原洗脱后，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白，可用于下一步分析。
基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析的基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析可以获得精确的分子量测定结果。基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱仪可以商购获得。
以下实施例仅仅是用于举例说明，并非是以任何方式限制本发明。
含全长apelin受体(putative receptor protein related to AT1，APJ)的质粒pcDNA3.1-APJ、pcDNA3.1-5HT1AR和pcDNA3.1-OXR1为本实验室构建，它们均是以pcDNA3.1为基础构建的。质粒pcDNA3.1-APJ带有全长APJ编码基因和必要元件，用于转染细胞，表达全长APJ。质粒pcDNA3.1-5HT1AR带有全长5-羟色胺1a受体(5HT1AR)的编码基因和必要元件，用于转染细胞以表达全长5HT1AR。质粒pcDNA3.1-OXR1带有全长食欲素I型受体(OXR1) 的编码基因和必要元件，用于转染细胞以表达全长OXR1。这些质粒也可以通过本领域公知的常规质粒构建方法构建。多聚赖氨酸(poly-L-lysine)购自Sigma公司。兔抗APJ抗体购自abcam公司。
实施例1 apelin受体(APJ)同源二聚体和交界面的筛选
1.1固相合成APJ的7个跨膜肽的融合蛋白
合成APJ的7个跨膜肽TMD1、TMD2、TMD3、TMD4、TMD5、TMD6和TMD7和HIV TAT肽的融合蛋白，序列如表1所示。HIV TAT(YGRKKRRQRRR)能够与4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(存在于膜的内表面)连接，从而促进TMD肽在细胞膜上的整合。在合成的TMD肽融合蛋白中，HIV TAT连接于奇数TMD的C端，偶数TMD的N端。
表1 APJ的7个跨膜肽融合蛋白的氨基酸序列
具体合成步骤如下：
(1)选取FMOC-Arg(pbf)-wang resin树脂。
(2)六氢吡啶去除树脂上的FMOC然后用DMF洗6遍。
(3)用TBTU+DIEA为缩合剂加入第二个氨基酸FMOC-aa-OH反应。
(4)反应完全后，重复2，3步骤接下剩下氨基酸直至最后一个氨基酸Ile。
(5)然后用六氢吡啶去除树脂上的FMOC，用DMF，DCM交替洗3遍，最后用甲醇收缩树脂抽干。
(6)用TFA裂解液切除侧链保护基和树脂2h后过滤，收集滤液加乙醚沉淀。
(7)加乙醚析出固体，抽干送质谱和纯化。
随后LC-MS(Shimadzu2020和Water1010)分析合成后多肽的序列，结果显示合成序列正确(图1-图7)。
1.2通过基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)识别APJ二 聚体交界面
一、样品前处理
用pcDNA3.1-APJ转染CHO细胞，48h以后，将转染的CHO细胞分为七组样品：TMD1、2、3、4、5、6和7，分别用步骤1.1中合成的相应的七个TMD肽融合蛋白(4μM)在37℃孵育60min，随后进行常规的总蛋白提取。TMD1、2、3、4、5、6和7样品提取的蛋白样品均用兔抗APJ抗体进行免疫沉淀。具体步骤如下：
A.将TMD1、2、3、4、5、6和7样品提取的蛋白样品进行12000g离心，各取上清，为待免疫沉淀蛋白样品；
B.分别将5μL兔抗APJ抗体和50μL protein A/G-beads(SantaCruz)加入到每一个待免疫沉淀蛋白样品中，4℃孵育过夜；
C.将每个免疫沉淀蛋白样品进行3000g离心去除上清，TBS溶液清洗3次；
D.用0.1M glycine-HCl洗脱抗原后，3000g离心，各取上清为待分析蛋白样品。所得7组待分析蛋白样品分别经MonoTip C18(Shimadzu)脱盐后上样进行基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
二、分析条件
A.分析仪器：基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱仪(AXIMA MALDI-LNR-TOF)
B.检测模式：Positive模式
C.质谱扫描范围：4k-10k Da
D.基质：10mg/ml芥子酸(SA)(50％乙腈，50％H2O，0.1％三氟乙酸)
样品检测结果用Shimadzu Laser BioLab MALDI Calibration kit进行校正。
三、质谱分析APJ二聚体的交界面：TMD1、2、3和4
APJ的分子量大小为42.66kDa，七个跨膜肽的分子量如表1所示，通过MALDI-TOF质谱法检测，根据其分子量的大小判断是否发生相互作用以及发生相互作用的区域。
结果显示，TMD1样品中检测到TMD1、TMD1二聚体、APJ、[APJ+TMD1]、APJ二聚体和[APJ+TMD1]二聚体，如图8所示，TMD2样品中检测到TMD2、TMD2二聚体、APJ、[APJ+TMD2]、APJ二聚体和[APJ+TMD2]二聚体，如图9所示；TMD3样品中检测到TMD3、TMD3二聚体、APJ、[APJ+TMD3]、APJ二聚体和[APJ+TMD3]二聚体，如图10所示；TMD4样品中检测到TMD4、TMD4二聚体、APJ、[APJ+TMD4]、APJ二聚体和[APJ+TMD4]二聚体，如图11所示；TMD5样品中检测到TMD5、APJ和APJ二聚体，如图12所示；TMD6样品中检测到TMD6、APJ和APJ二聚体，如图13所示；TMD7样品中检测到TMD7、APJ和APJ二聚体被检测到，如图14所示，结果表明APJ二聚体的交界面主要发生在TMD1、2、3和4，而不是TMD5、6和7。
实施例25-羟色胺受体1a(5HT1AR)和食欲素1型受体(OXR1)异源二聚体和交界面 的筛选
2.1固相合成OXR1的3个跨膜肽的融合蛋白
合成OXR1的3个跨膜肽TMD1、TMD5和TMD7和HIV TAT肽的融合蛋白，序列如表2所示。HIV TAT连接于每个TMD肽的C端。
表2 OXR1的3个跨膜肽融合蛋白的氨基酸序列
具体合成步骤与实施例1相同。
2.2通过基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)识别5HT1AR 和OXR1异源二聚体交界面
一、样品前处理
用pcDNA3.1-5HT1AR转染CHO细胞，48h以后，将转染的CHO细胞分为七组样品：TMD1、5和7，分别用步骤2.1中合成的相应的3个TMD肽融合蛋白(4μM)在37℃孵育60min，随后进行常规的总蛋白提取。TMD1、5和7样品提取的蛋白样品均用兔抗HT1AR抗体进行免疫沉淀。具体步骤如下：
A.将TMD1、5和7样品提取的蛋白样品进行12000g离心，各取上清，为待免疫沉淀蛋白样品；
B.分别将5μL兔抗5HT1AR抗体和50μL protein A/G-beads(SantaCruz)加入到每一个待免疫沉淀蛋白样品中，4℃孵育过夜；
C.将每个免疫沉淀蛋白样品进行3000g离心去除上清，TBS溶液清洗3次；
D.用0.1M glycine-HCl洗脱抗原后，3000g离心，各取上清为待分析蛋白样品。所得7组待分析蛋白样品分别经MonoTip C18(Shimadzu)脱盐后上样进行基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
二、分析条件
A.分析仪器：基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱仪(AXIMA MALDI-LNR-TOF)
B.检测模式：Positive模式
C.质谱扫描范围：4k-10k Da
D.基质：10mg/ml芥子酸(SA)(50％乙腈，50％H2O，0.1％三氟乙酸)
样品检测结果用Shimadzu Laser BioLab MALDI Calibration kit进行校正。
三、质谱分析5HT1AR和OXR1异源二聚体的交界面：TMD5和7。
结果显示跨膜区5和7为异源二聚体形成的关键交界面。详情见图15-17。
5HT1AR蛋白理论分子量为46.176kDa，OXR1的TM1多肽融合蛋白理论分子量为3788Da，OXR1的TM5多肽融合蛋白理论分子量为4209Da，OXR1的TM7多肽融合蛋白理论分子量为4355Da(参见表2)。从图15可观察到TM1、5HT1A1/2、5HT1A和5HT1A二聚体，从图16和17中可观察到TM5/TM7、TM5/TM7二聚体、TM5/TM7四聚体、TM5/TM7八聚体、5HT1A1/2、5HT1A、5HT1A二聚体、[5HT1A+TM5/TM7]1/2和[5HT1A+TM5/TM7]。根据结果初步可以认为TM5和TM7区域，而非TM1区域，可能对OX1R蛋白和5HT1AR蛋白的结合起到关键作用。

Claims (5)

1.用于检测GPCR之间相互作用及交界面的方法，包括以下步骤：
(1)合成包含第一GPCR的一个或多个跨膜肽的融合蛋白，其中每个融合蛋白包含第一GPCR的一个跨膜肽和连接在所述跨膜肽的氨基酸或羧基端的膜结合肽，所述膜结合肽能与细胞膜上存在的分子连接从而促进跨膜肽在细胞膜上整合，且每个融合蛋白中膜结合肽与跨膜肽连接的顺序使得所述融合蛋白中包含的第一GPCR跨膜肽在细胞中能以与天然状态相同的方式与膜结合；
(2)在细胞中表达全长第二GPCR，并用步骤(1)中合成的每个融合蛋白分别孵育细胞，然后提取细胞中蛋白，并用全长第二GPCR的抗体对所提取的蛋白分别进行免疫沉淀；
(3)取免疫沉淀的蛋白混合物分别进行基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱分析，根据分子量的大小判断每个跨膜肽和全长第一GPCR之间是否发生相互作用以及相互作用的交界面。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(3)中，如果基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱分析检测结果中存在分子量等于特定跨膜肽和全长第一GPCR二者分子量之和的峰，则认为免疫沉淀的蛋白混合物中具有该特定跨膜肽和全长第一GPCR的二聚体，由此可以判断第一GPCR和第二GPCR相互作用的交界面在该特定跨膜肽上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一GPCR与所述第二GPCR是相同的GPCR或不同的GPCR。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述膜结合肽是HIV TAT肽，其序列是YGRKKRRQRRR。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(1)中合成第一GPCR的部分跨膜肽或全部七个跨膜肽。
CN201611088483.0A 2016-12-01 2016-12-01 检测gpcr之间相互作用及其交界面的方法 Expired - Fee Related CN107037116B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611088483.0A CN107037116B (zh) 2016-12-01 2016-12-01 检测gpcr之间相互作用及其交界面的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611088483.0A CN107037116B (zh) 2016-12-01 2016-12-01 检测gpcr之间相互作用及其交界面的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107037116A CN107037116A (zh) 2017-08-11
CN107037116B true CN107037116B (zh) 2019-04-23

Family

ID=59530922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611088483.0A Expired - Fee Related CN107037116B (zh) 2016-12-01 2016-12-01 检测gpcr之间相互作用及其交界面的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107037116B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202311746A (zh) * 2018-02-02 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
CN113307862B (zh) * 2021-05-31 2022-07-05 陈京 一种抗抑郁多肽及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102187223A (zh) * 2008-07-31 2011-09-14 Cis-生物国际公司 检测膜蛋白内化的方法
CN103874711A (zh) * 2011-05-13 2014-06-18 瑞塞普托斯公司 用于结晶g-蛋白偶联受体目的的新的融合伴体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080032418A1 (en) * 2003-02-10 2008-02-07 David Adams Cell Free Assay Systems For Identifying A Substance Of Interest
EP4282882A3 (en) * 2011-06-21 2024-03-06 Vib Vzw Binding domains directed against gpcr:g protein complexes and uses derived thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102187223A (zh) * 2008-07-31 2011-09-14 Cis-生物国际公司 检测膜蛋白内化的方法
CN103874711A (zh) * 2011-05-13 2014-06-18 瑞塞普托斯公司 用于结晶g-蛋白偶联受体目的的新的融合伴体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｇ 蛋白偶联受体寡聚体的研究方法;陈京等;《济宁医学院学报》;20120630;第154-162页
G蛋白偶联受体与G蛋白相互作用的最新研究进展;姜云路等;《生命科学》;20140228;第181-187页

Also Published As

Publication number Publication date
CN107037116A (zh) 2017-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Navarro et al. Detection of heteromers formed by cannabinoid CB 1, dopamine D 2, and adenosine A 2A G-protein-coupled receptors by combining bimolecular fluorescence complementation and bioluminescence energy transfer
Dong et al. A Triple Arg Motif Mediates α2 B‐Adrenergi c Receptor Interaction with Sec 24 C/D and Export
WO2006009888A2 (en) C-met kinase binding proteins
CN107037116B (zh) 检测gpcr之间相互作用及其交界面的方法
CN112707968A (zh) 一种用于检测新冠病毒中和抗体的重组的受体结合蛋白、重组的受体蛋白
WO2001036471A2 (en) Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
WO2011020033A2 (en) Engineered proteins including mutant fibronectin domains
AU2021239879A1 (en) Modified angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) and use thereof
EP2855510A1 (en) Virus-like particle based protein-protein interaction
Walpurgis et al. Testing for the erythropoiesis‐stimulating agent Sotatercept/ACE‐011 (ActRIIA‐Fc) in serum by means of Western blotting and LC‐HRMS
CN105473745B (zh) 用于表征人膜蛋白的功能和相互作用的病毒体展示阵列
Chen et al. Surface plasmon resonance-based membrane protein-targeted active ingredients recognition strategy: construction and implementation in ligand screening from herbal medicines
CN112630444A (zh) 基于靶点蛋白的多肽筛选方法
Bu et al. Recent advances in cell membrane-coated technology for drug discovery from natural products
CN114478778B (zh) 抗Tim-3纳米抗体及其应用
US20130309766A1 (en) Endogenous and Non-Endogenous Versions of Human G Protein-Coupled Receptors
CN113832188A (zh) 一种基于荧光蛋白的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒及应用
Sjöström et al. Tuning the binding interface between Machupo virus glycoprotein and human transferrin receptor
EP1987057A2 (en) Peptide aptamer for neutralizing the binding of platelet antigene specific antibodies and diagnostic and therapeutic applications containing the same
CN103003694A (zh) 人巨细胞病毒感染的检测方法
CN104892744B (zh) 一种具有拮抗趋化因子受体cxcr4的活性多肽的及其设计制备和生物医学应用
Rastogi et al. ERG monoclonal antibody in the diagnosis and biological stratification of prostate cancer: delineation of minimal epitope, critical residues for binding, and molecular basis of specificity
DeLuca et al. The activity of prolactin releasing peptide correlates with its helicity
Grygiel et al. Synthesis by native chemical ligation and crystal structure of human CCL2
EP4328236A1 (en) Glycosylated rbd and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190423

Termination date: 20191201

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee