CN103003694A - 人巨细胞病毒感染的检测方法 - Google Patents

人巨细胞病毒感染的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103003694A
CN103003694A CN2011800337382A CN201180033738A CN103003694A CN 103003694 A CN103003694 A CN 103003694A CN 2011800337382 A CN2011800337382 A CN 2011800337382A CN 201180033738 A CN201180033738 A CN 201180033738A CN 103003694 A CN103003694 A CN 103003694A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
antigen
acid sequence
polypeptide
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800337382A
Other languages
English (en)
Inventor
藤井信之
本多秀夫
内田好昭
小见和也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujirebio Inc
Original Assignee
Fujirebio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujirebio Inc filed Critical Fujirebio Inc
Publication of CN103003694A publication Critical patent/CN103003694A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/04—Varicella-zoster virus
    • C07K14/045—Cytomegalovirus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56994—Herpetoviridae, e.g. cytomegalovirus, Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G01N2333/04—Varicella-zoster virus
    • G01N2333/045—Cytomegalovirus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了可以高灵敏度地检测HCMV感染的实用性高的新方法。本申请的发明人合成了15种HCMV蛋白的全长蛋白，对其与HCMV感染患者血清的反应性进行了深入研究，结果发现：使用pp28全长蛋白作为抗原时，可以无遗漏地检测所有的感染患者。可以使用大肠杆菌以重组蛋白的形式大量合成、纯化pp28全长蛋白，并可以将其作为用于检查HCMV的抗原进行商业利用。

Description

人巨细胞病毒感染的检测方法
技术领域
本发明涉及人巨细胞病毒感染的检测方法。
背景技术
在以人巨细胞病毒(HCMV)为病因的感染症的血清学诊断中，通常使用病毒抗原(天然抗原)。但在天然抗原中，不可忽视因制备方法而产生的批间差异。另外，由于是处理病毒本身，因此在安全性或简便性上也存在问题。
为了实现HCMV血清学诊断的标准化，人们希望实现抗原的重组化，但在只使用重组抗原时，已知检查的灵敏度、特异性尚不充分。这是由于难以从多个病毒抗原中选择适合重组化的适当的抗原的缘故。除此之外，认为使用各抗原蛋白的部分表达片段也是一个原因。
例如，作为主要的抗原而已知的pp150是分子量为约150kDa的蛋白，因此不可能使用大肠杆菌进行大量合成，且难以在检查中使用全长蛋白。因此，在市售的检查试剂盒中，是将pp150的片段(代表性的是30个残基～40个残基左右)与其他HCMV蛋白片段适当混合用作抗原。但是，有报道称：只使用部分表达片段时，检查的灵敏度为60%左右，并不充分。
但是，还已知：在采用免疫测定的血清检查领域，虽然必需使用全长抗原，但检测灵敏度未必有所提高。例如，在非专利文献1中，对于HCMV的天然抗原(包含全长病毒蛋白)，研究HCMV阳性患者血清组的抗体反应性，并给出了对于每个蛋白评价其抗体反应性的结果，但能够达到接近100%的检测灵敏度的只有pp150，根据蛋白的种类，检测灵敏度变得非常低，达到50%左右以下。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2000-514300号公报；
非专利文献
非专利文献1：Journal of Clinical Microbiology: 37(1), 第179-188页, 1999。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供：可以高灵敏度地检测HCMV感染的实用性高的新方法。
解决课题的方法
本发明人等合成了15种HCMV蛋白的全长蛋白，并深入研究了其与HCMV感染患者血清的反应性，结果发现：使用pp28全长蛋白作为抗原时，可以无遗漏地检测所有的感染患者，还可以使用大肠杆菌以重组蛋白的形式大量合成、纯化pp28全长蛋白，并将其作为用于检查HCMV的抗原进行商业利用，从而完成了本发明。
即，本发明提供人巨细胞病毒感染的检测方法，该检测方法包括：通过使用人工多肽作为抗原的免疫测定，测定从受试者中分离的样品中所能含有的抗pp28的抗体，所述人工多肽由与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列构成、且具有与针对人巨细胞病毒所产生的pp28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性。另外，本发明还提供人巨细胞病毒感染的检测试剂，其中包含人工多肽，所述人工多肽由与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列构成、且具有与针对人巨细胞病毒所产生的pp28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性。本发明还提供人巨细胞病毒感染的检测试剂盒，其中包含上述本发明的检测试剂。
发明效果
根据本发明，提供检测灵敏度极其优异的HCMV感染的检测方法。根据本发明，通过简便的免疫测定，可以无遗漏地准确检测所有的HCMV感染患者。在公知的抗体检查方法中，有使用pp28片段作为抗原的方法，例如非专利文献1中还记载着：使用pp28的30个残基左右的大小的片段检测血清中的抗HCMV抗体的方法。但是，根据非专利文献1，使用pp28片段时，在一成以上的患者中出现假阴性。若出现假阴性，则漏掉了感染患者，因此在临床检查中成为重大问题。根据本发明的方法，不会漏掉感染患者，可以准确地进行检测，可以对临床检查作出重大贡献。
附图说明
图1是通过蛋白质印迹确认使用抗体柱纯化在大肠杆菌中表达的pp28重组蛋白的过程的结果。左部分是使用实施例中制备的抗pp28单克隆抗体进行检测的结果，右部分是使用抗大肠杆菌抗原的抗体进行检测的结果。Ma：标记物、元：柱添加前、pass：通过组分、elute：洗脱组分、conc.：浓缩组分。
具体实施方式
pp28是作为HCMV的结构蛋白之一的28kDa的磷蛋白，由于其编码在UL99基因中，所以有时还被称作UL99。SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列是HCMV AD169株所具有的pp28的氨基酸序列，在GenBank中也以X17403(全基因组)等检索号注册。编码SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的病毒DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO: 1。
在本发明中，使用由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的人工pp28作为抗原。或者，使用人工多肽作为抗原，所述人工多肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中有少数氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列构成、且具有与针对HCMV产生的pp28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性。后一种多肽与SEQ ID NO: 2的同源性为90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上。作为后一种多肽，还优选由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸残基被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列构成的多肽。
在实施例中，只使用由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的pp28全长蛋白作为抗原，可以检测所有的来自HCMV感染患者的100个检体。病毒的基因组突变频繁，关于pp28的氨基酸序列，在临床分离株中就发现了各种各样的突变序列。因此，在采集了上述检体的100名感染患者中，认为在HCMV的pp28的氨基酸序列上存在一部分差异。即使是针对由上述的各种氨基酸序列构成的天然的pp28而在生物体内诱导的抗体，也均与由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的多肽反应而被检测出来，因此即使是以与SEQ ID NO: 2在氨基酸序列上存在一部分差异的多肽作为抗原的情形，认为也同样可以检测抗pp28的抗体(抗pp28抗体)。当为与SEQ ID NO: 2的同源性足够高的多肽时，与在HCMV感染者体内诱导的抗pp28抗体的反应性和由原始的SEQ ID NO: 2构成的pp28同等的几率高。
需要说明的是，由任意的氨基酸序列构成的多肽是否具有与针对HCMV所产生的pp28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性，这例如可以通过使由已知的HCMV感染患者分离的血清等样品与该多肽反应而容易地进行确认。如果可以确认存在于血清中的抗体与多肽结合，则可以判断该多肽具有上述的反应性。
这里，氨基酸序列的“同源性”是指，将应该进行比较的两个氨基酸序列排列整齐，使这两个氨基酸序列的氨基酸残基尽可能多地一致，用一致的氨基酸残基数除以总氨基酸残基数，所得的值用百分率表示，即为同源性的值。进行上述排比时，根据需要，在进行比较的两个序列的一方或双方中插入适当的间隙。关于这样的序列的排比化，例如可以使用BLAST、FASTA、CLUSTAL W等众所周知的程序容易地进行。插入间隙时，上述总氨基酸残基数是指将1个间隙作为1个氨基酸残基来计数的残基数。如此计数的总氨基酸残基数在进行比较的两个序列间不同时，同源性(%)用一致的氨基酸残基数除以长的序列的总氨基酸残基数来计算。
需要说明的是，已知构成天然蛋白的20种氨基酸可以分成具有类似性质的组，如具有低极性侧链的中性氨基酸(Gly、Ile、Val、Leu、Ala、Met、Pro)、具有亲水性侧链的中性氨基酸(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr、Cys)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、碱性氨基酸(Arg、Lys、His)、芳族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)，当为这些组间的取代时，多肽的性质往往不会发生变化。因此，当SEQ ID NO: 2的少数氨基酸残基在上述各组内被取代时，与针对HCMV所产生的pp28而在生物体内诱导的抗体的反应性、与由原始的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的多肽同等的可能性特别高。在本发明中用作抗原的多肽中，由如此取代的氨基酸序列构成的多肽是由不同于SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的多肽的一个优选例子。
“人工多肽”是指，通过化学合成、基因工程学方法及其他方法人工制造的多肽，不包含对在感染了HCMV的细胞内由HCMV基因组表达产生的蛋白进行回收而得到的多肽。如上所述，pp28的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列注册在数据库中并众所周知，本申请序列表中也有记载。另外，编码各氨基酸的密码子是公知的，因此可以容易地鉴定编码特定的氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列。因此，即使是由不同于SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的多肽，也可以容易地鉴定编码该多肽的多核苷酸的核苷酸序列。根据上述序列信息，本发明中用作抗原的多肽可以通过任一种方法来制造。
作为化学合成法的具体例子，例如可以列举：Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等。另外，还可以利用各种市售的肽合成仪按照常规方法进行合成。进行化学合成时，只根据氨基酸序列，即可合成所期望的多肽。
利用基因工程学方法来制作多肽的方法也众所周知，简而言之，制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸插入适当的表达载体中，再使用适当的表达系统使之表达并回收、纯化，从而可以以重组多肽的形式得到目标抗原多肽。本发明中用作抗原的多肽具有百数十残基以上的大小，因此为了以低成本进行大量合成，优选利用基因工程学方法，使用大肠杆菌等宿主细胞制作重组多肽。根据使用的宿主细胞的种类，重组多肽可以接受各种翻译后修饰(N末端甲硫氨酸的脱离、N末端乙酰化、添加糖链、在细胞内利用蛋白酶进行的有限分解、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、磷酸化等)，但这样的翻译后被修饰的形态的多肽，只要其具有与针对HCMV所产生的pp28而在生物体内诱导的抗体的反应性，在本发明的方法中也可用作抗原。
通过基因工程学方法制作由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的多肽时，编码该多肽的多核苷酸(SEQ ID NO: 1)可以如下制备：用具有由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的pp28的HCMV(AD169株等)感染适当的宿主细胞，从该感染细胞中提取病毒DNA，再通过PCR合成DNA，即可制得。关于PCR中使用的引物，本领域技术人员根据SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列可以容易地进行设计、制备，例如可以使用实施例中使用的由SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列构成的引物。使用表达由其他的氨基酸序列构成的pp28的HCMV株时，可以制备编码由不同于SEQ ID NO: 2的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸。另外，关于编码由所期望的氨基酸序列构成的多肽的多核苷酸，可以使用市售的核酸合成仪、或者如上所述利用常规方法向已制备的DNA中导入适当的突变而得到。将制备的多核苷酸插入适当的载体中，使其在适当的表达系统中表达，再将其回收、纯化，从而可以得到所期望的多肽。使用的载体或各种表达系统(细菌表达系统、酵母细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、无细胞表达系统等)也众所周知，各种载体或宿主细胞、试剂类、试剂盒均有销售，所以本领域技术人员可以适当选择使用。HCMV株也有市售，另外还可以从感染患者中分离得到，因此容易获取。病毒DNA的提取、PCR、向载体中插入DNA、向宿主细胞中导入载体、所表达的多肽的回收、纯化等方法本身均为众所周知的常规方法。
如下述实施例中具体所述，由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成的重组多肽可以使用大肠杆菌表达系统进行表达，该已表达的多肽例如可以使用固定有与pp28特异性结合的单克隆抗体的抗体柱简便地进行纯化。若使用如此操作而得到的重组多肽作为免疫测定的抗原，则可以无遗漏地检测所有的HCMV感染患者。需要说明的是，单克隆抗体的制作方法是众所周知的常规方法，本领域技术人员可以容易地进行制作。例如，如下述实施例中也记载的那样，用灭活病毒对动物进行免疫，再从该动物中采集脾细胞等产生抗体的细胞，使其与骨髓瘤细胞融合制作杂交瘤，再选择产生具有所期望的结合性的抗体的杂交瘤使之增殖，从而可以从培养上清中回收与pp28进行特异性结合的单克隆抗体。
免疫测定本身在该领域众所周知。若将免疫测定按照反应方式进行分类，则分成夹层法、竞争法、凝聚法、免疫层析法、蛋白质印迹法等；若按照标记进行分类，则分成放射免疫测定、荧光免疫测定、酶免疫测定(EIA)、生物素免疫测定等。另外，使用抗原的抗体检查方法也已知有各种方法，作为具体例子并不限于这些，可以列举：EIA(ELISA、CLEIA(化学发光酶免疫测定法)、蛋白质印迹等)、凝聚法(乳胶凝聚法等)、补体结合反应(CF)等。按照本发明的方法测定样品中的抗pp28抗体时，可以采用公知的任一种免疫测定法。需要说明的是，在本发明中，“测定”一词包含检测、定量和半定量。
用于免疫测定时，上述的人工多肽抗原可以以在单末端或两末端添加有任意的氨基酸序列的形态(作为由包含这样的添加序列的氨基酸序列构成的多肽)进行使用。在该领域，即使是与不同的蛋白融合而得到的融合蛋白，也可以使用识别一方的蛋白的抗体进行检测，这是广为人知的事实。因此，即使以这样的形态使用上述人工多肽，也可以对样品中的抗pp28抗体进行免疫测定。例如，即使是以与其他蛋白的融合蛋白的形态进行使用的情形，在该融合蛋白中发挥抗pp28抗体的抗原的功能的也是上述的人工多肽部分，因此包含在“使用人工多肽作为抗原”中。如上所述，将上述人工多肽抗原以在单末端或两末端添加有任意的氨基酸序列的形态进行使用的情形也包含在本发明的方法中。上述人工多肽中所添加的氨基酸序列可以是构成任何的功能性蛋白或其功能性片段的氨基酸序列，也可以是接头等不具有生理活性的序列。当为重组多肽时，有时在制造步骤中添加GST或His等标记序列，但即使是添加有这样的标记序列的状态，也可以直接用作抗原。
例如，进行ELISA或CLEIA时，将上述人工多肽抗原分别在板或颗粒等上固化，使其与样品反应，将样品中的抗pp28抗体捕集到固相上，进行清洗，之后与酶标记的抗IgG抗体和/或抗IgM抗体反应，再进行清洗，之后添加底物。根据酶反应量，可以测定捕集到固相上的抗pp28抗体。进行蛋白质印迹时，将上述人工多肽抗原电泳后转移到薄膜上，使该薄膜与样品反应，之后与上述同样地与酶标记的抗IgG抗体和/或抗IgM抗体反应即可。当为凝聚法时，例如将上述人工多肽抗原固定在乳胶颗粒等上，使其与样品反应，再根据吸光度等测定颗粒的凝聚量即可。
在生物体内针对HCMV而诱导的抗体主要是IgG和IgM。初感染时，首先IgM上升，感染数天后达到最大值，之后减少，IgG在感染后1周左右开始上升，以后长期持续。因此，当为可以将样品中的抗pp28抗体分为IgG和IgM进行检测的方法时(例如上述的ELISA或蛋白质印迹等)，从准确检测HCMV感染的角度考虑，在用抗原补足的抗pp28抗体的检测中，优选使用抗IgG抗体和抗IgM抗体两者。
本发明的方法所适用的样品为从受试者体内分离的样品，优选为血液样品(全血、血浆、血清等)。
实施本发明的方法时，可以同时使用上述人工多肽以外的HCMV抗原蛋白或其片段。例如，进行ELISA时，将所有的抗原混合固化在板上、或者分别固化在分开的孔中，使其与样品反应即可。进行CLEIA时，将所有的抗原混合固化在颗粒上，使其与样品反应即可。进行蛋白质印迹时，例如将所有的抗原混合进行电泳，之后转移到薄膜上，使其与样品反应即可。进行凝聚法时，将已混合的抗原固定在颗粒上，或者将抗原各自单独固定的颗粒混合，使该颗粒与样品反应即可。
上述的人工多肽可以作为HCMV感染的检测试剂来提供。该试剂可以仅含有上述的多肽，也可以进一步含有pp28以外的一种以上的抗原蛋白或其片段。另外，还可以进一步含有对这些多肽的稳定化等有用的其他成分。另外，还可以以抗原多肽被固定在板或颗粒等固相上的形态来提供。
上述检测试剂可以与其他的试剂类等适当组合，以HCMV感染的检测试剂盒的形式来提供。免疫测定所必需的其他试剂类众所周知。例如，在本发明的检测试剂盒中，除上述的检测试剂外，还可以包含可用作样品稀释液或清洗液等的缓冲液、用于检测与抗原多肽结合的抗体的标记抗免疫球蛋白抗体等。
实施例
以下，根据实施例来更具体地说明本发明。但本发明并不限于下述实施例。
1．候选抗原的选择
利用小麦胚芽无细胞表达系统合成HCMV蛋白中的15种(下述表1)蛋白的全长蛋白。合成中使用セルフリーサイエンス公司的Protemist DT。载体中所插入的插入DNA可以如下获得：用HCMV AD169株(从理研バイオリソースセンター购入)感染MRC-5细胞，从该感染细胞中提取病毒DNA，通过使用市售试剂盒的PCR扩增编码各全长蛋白的DNA即可得到。将各DNA克隆到包含SP6启动子的质粒载体中，使用所得的质粒DNA，利用5mL的反应系统(25μg质粒DNA)进行37℃、6小时的转录反应和15℃、20小时的翻译，合成各全长蛋白。需要说明的是，在pp28的DNA的扩增中，使用由SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列构成的引物(分别包含BamHI识别序列和NotI识别序列)，并使用Pfu Ultra DNA聚合酶(Agilent Technologies公司)在95℃ 2分钟的变性处理、30个循环的95℃ 20秒－55℃ 20秒－72℃ 1分钟、最后72℃ 3分钟的反应条件下进行PCR。
[表1]
蛋白名称 氨基酸数
ppUL32(pp150) 1048
ppUL44(pp52) 433
ppUL83(pp65) 561
ppUL80a(pp38) 373
ppUL99(pp28) 190
ppUL55(gp130) 907
UL75 743
UL123 491
UL122 411
pUL57 1235
UL115 306
UL100 372
UL73 138
UL74 466
UL82 559
2．候选抗原的确定
关于上述合成的各全长蛋白，通过蛋白质印迹法研究其与100例HCMV感染患者血清的反应性。将各全长蛋白进行电泳，之后转移到薄膜上，使薄膜与100例HCMV感染患者血清反应，之后利用抗人IgG+IgM进行检测。其结果，如下述表2所示，pp150、pp28、gp130这三种均显示出100%的反应性。
[表2]
Figure 676800DEST_PATH_IMAGE002
3．利用大肠杆菌表达系统制作抗原
为了大量生产重组蛋白，优选利用大肠杆菌表达系统。于是，对于显示出100%的反应性的三种抗原，使用常规方法的大肠杆菌表达系统研究全长蛋白的制作。将编码上述制备的各抗原蛋白的cDNA插入大肠杆菌用的表达载体中，再导入大肠杆菌中使之表达。其结果，可以确认pp28的表达。而pp150、gp130(膜蛋白)不可能在大肠杆菌中表达。
关于可以在大肠杆菌中表达的pp28，使用抗体柱对其进行纯化。用灭活病毒对小鼠进行免疫，利用常规方法制作pp28抗原特异性单克隆抗体，将该抗体固定在CNBr-活化Sepharose 4B柱(GE Healthcare公司)上，作为纯化用的抗体柱。其结果，只通过一次的柱处理即可纯化pp28蛋白，而且没有来自大肠杆菌的蛋白的污染(图1)。利用该重组pp28蛋白，也可以100%检测HCMV感染患者。
Figure IDA00002712068900011
Figure IDA00002712068900021
Figure IDA00002712068900031

Claims (6)

1. 人巨细胞病毒感染的检测方法，该检测方法包括：通过使用人工多肽作为抗原的免疫测定，测定从受试者中分离的样品中所能含有的抗pp28的抗体，所述人工多肽由与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列构成、且具有与针对人巨细胞病毒所产生的pp28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性。
2. 权利要求1所述的方法，其中，上述人工多肽由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列或该氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列构成。
3. 权利要求2所述的方法，其中，上述人工多肽由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列构成。
4. 权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，上述人工多肽是利用基因工程学方法制作的重组多肽。
5. 人巨细胞病毒感染的检测试剂，其中包含人工多肽，所述人工多肽由与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列构成、且具有与针对人巨细胞病毒所产生的pp28而在生物体内诱导的抗体通过抗原抗体反应进行结合的反应性。
6. 人巨细胞病毒感染的检测试剂盒，其中包含权利要求5所述的检测试剂。
CN2011800337382A 2010-07-07 2011-07-05 人巨细胞病毒感染的检测方法 Pending CN103003694A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-154937 2010-07-07
JP2010154937A JP5712513B2 (ja) 2010-07-07 2010-07-07 ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法
PCT/JP2011/065343 WO2012005238A1 (ja) 2010-07-07 2011-07-05 ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103003694A true CN103003694A (zh) 2013-03-27

Family

ID=45441217

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800337382A Pending CN103003694A (zh) 2010-07-07 2011-07-05 人巨细胞病毒感染的检测方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20130109010A1 (zh)
EP (1) EP2592419A4 (zh)
JP (1) JP5712513B2 (zh)
KR (1) KR20130088845A (zh)
CN (1) CN103003694A (zh)
WO (1) WO2012005238A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105866422A (zh) * 2015-02-09 2016-08-17 厦门大学 用于评估机体发生人巨细胞病毒活动性感染风险的方法及相关的试剂盒

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105510581A (zh) * 2015-12-11 2016-04-20 郑州安图生物工程股份有限公司 巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒
KR102281998B1 (ko) * 2017-08-30 2021-07-27 삼성전자 주식회사 이종재질 통신장치 함체
CN112694520B (zh) * 2020-12-02 2023-01-17 图凌(杭州)生物医药有限公司 一种人工多肽hm、其抗体及在病理检测中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998002746A1 (en) * 1996-07-12 1998-01-22 Akzo Nobel N.V. Peptide reagent for the detection of human cytomegalovirus (cmv)
CN1651918A (zh) * 2005-01-08 2005-08-10 王明丽 重组抗原pp65包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒
JP2006223180A (ja) * 2005-02-17 2006-08-31 Hokkaido Univ マルチプレックスｐｃｒを用いたヘルペスウイルス遺伝子検出法
CN101289513A (zh) * 2007-04-20 2008-10-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 病原体原发感染的检测
CN101605808A (zh) * 2007-02-07 2009-12-16 希格马托制药工业公司 人巨细胞病毒(hcmv)的重组抗原

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3619902A1 (de) * 1986-06-13 1988-03-03 Biotechnolog Forschung Gmbh Cmv-dna-strukturen, expressionsvektor dafuer, cmv-proteinstrukturen und deren verwendung
US6733989B1 (en) * 1988-02-24 2004-05-11 Dade Behring Marburg Gmbh Structural phosphoprotein (pp28) of human cytomegalovirus (HCMV), the preparation and use thereof
EP0702083A3 (de) * 1994-07-26 1997-01-15 Biotest Ag Polypeptide und Fusionsproteine bestehend aus dem UL 57 Leserahmen bzw. dem C-terminalen Bereich des Tegumentproteins pp150 aus HCMV, entsprechende Oligonucleotide und Nachweis reagentien
US5945276A (en) * 1996-04-10 1999-08-31 Signal Pharmaceuticals, Inc. Reporter cell line system for detecting cytomegalovirus and identifying modulators of viral gene expression
AUPR593101A0 (en) * 2001-06-26 2001-07-19 Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The Cytomegalovirus t cell epitopes
ITRM20030386A1 (it) * 2003-08-05 2005-02-06 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Metodo e test diagnostici basati sull'analisi citofluorimetrica dei linfociti t antigene-specifici.
US7976845B2 (en) * 2004-11-29 2011-07-12 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Human cytomegalovirus immunotherapy
CN101868250B (zh) * 2007-05-11 2014-07-30 疫苗工程管理有限公司 包含hcmv颗粒的组合物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998002746A1 (en) * 1996-07-12 1998-01-22 Akzo Nobel N.V. Peptide reagent for the detection of human cytomegalovirus (cmv)
CN1651918A (zh) * 2005-01-08 2005-08-10 王明丽 重组抗原pp65包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒
JP2006223180A (ja) * 2005-02-17 2006-08-31 Hokkaido Univ マルチプレックスｐｃｒを用いたヘルペスウイルス遺伝子検出法
CN101605808A (zh) * 2007-02-07 2009-12-16 希格马托制药工业公司 人巨细胞病毒(hcmv)的重组抗原
CN101289513A (zh) * 2007-04-20 2008-10-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 病原体原发感染的检测

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASTRID E.GREIJER, ET AL.: "Molecular Fine-Specificity Analysis of Antibody Responses to Human Cytomegalovirus and Design of Novel Synthetic-Peptide-Based Serodiagnostic Assays.", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》, vol. 37, no. 1, 31 January 1999 (1999-01-31), pages 179 - 188, XP002257029 *
H.MEYER, ET AL.: "Identification and Procaryotic Expression on the Gene Coding for the Highly Immunogenic 28-Kilodalton Structural Phosphoprotein (pp28) of Human Cytomegalovirus.", 《JOURNAL OF VIROLOGY》, vol. 62, no. 7, 31 July 1988 (1988-07-31), pages 2243 - 2250, XP000106691 *
KAORU WADA, ET AL.: "Recombinant Tanpakushitsu (pp150, gp58) ni yoru CMV kotai no Kenshutsu.", 《PROCEEDINGS OF THE JAPANESE SOCEITY FOR IMMUNOLOGY》, vol. 24, 25 October 1994 (1994-10-25), pages 624, XP008168634 *
MEYER, H., ET AL.: "phosphoprotein 28[Human herpesvirus 5] GenBank: AAA45985.1", 《GENBANK数据库》, 2 August 1993 (1993-08-02) *
THOMAS R.JONES, ET AL.: "An Acidic Cluster of Human Cytomegalovirus UL99 Tegument Protein Is Required for Trafficking and Function.", 《JOURNAL OF VIROLOGY》, vol. 78, no. 3, 29 February 2004 (2004-02-29), pages 1489 - 1, XP008166852, DOI: doi:10.1128/JVI.78.3.1488-1502.2004 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105866422A (zh) * 2015-02-09 2016-08-17 厦门大学 用于评估机体发生人巨细胞病毒活动性感染风险的方法及相关的试剂盒
WO2016127785A1 (zh) * 2015-02-09 2016-08-18 厦门大学 用于评估机体发生人巨细胞病毒活动性感染风险的方法及相关的试剂盒
US10309964B2 (en) 2015-02-09 2019-06-04 Xiamen University Method for assessing risk of human cytomegalovirus active infection in body and related kit

Also Published As

Publication number Publication date
EP2592419A1 (en) 2013-05-15
WO2012005238A1 (ja) 2012-01-12
JP2012018051A (ja) 2012-01-26
KR20130088845A (ko) 2013-08-08
EP2592419A4 (en) 2014-03-05
JP5712513B2 (ja) 2015-05-07
US20130109010A1 (en) 2013-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111285933A (zh) 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒
CN112553172B (zh) 一种covid-19假病毒及其制备方法和用途
CN111398581B (zh) 一种covid-19快速诊断试剂盒及其制备方法
CN112375768A (zh) Covid-19冠状病毒的假病毒及其制备方法和应用
CN105384803A (zh) 一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP4及其编码基因与应用
JP2021006811A (ja) 魚介類アレルギーの診断の方法及び製品
CN111647055B (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的n蛋白及其制备与应用
CN103003694A (zh) 人巨细胞病毒感染的检测方法
CN104678110B (zh) 一种血清cenpf抗体定量检测试剂盒
CN108948153B (zh) 一种瓜氨酸修饰肽抗原组合及其应用
CN114349855A (zh) 新型冠状病毒Delta突变株特异性抗体及其应用
CN106397551A (zh) 一种梅毒螺旋体感染依赖性抗原及其试剂盒和应用
CN114163522A (zh) 一种可以高精确度和敏感性识别猪伪狂犬病毒的纳米抗体、制备方法和应用
CN105541992A (zh) 人MBP18.5kD变体抗原表位肽及特异性检测试剂盒
CN116239684B (zh) 针对人钙网蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用
CN111596070A (zh) 一种三疣梭子蟹原肌球蛋白过敏检测试剂的应用
CN105254732A (zh) 一种日本血吸虫重组蛋白SjSAPLP5及其编码基因与应用
CN101509002B (zh) 一种重组风疹病毒蛋白及其应用
EP1879029B1 (en) A neuroglobin enzyme-linked immunodetection kit and the use of it
CN115819580A (zh) 针对人il-12的高亲和力兔单克隆抗体及其应用
CN107033225B (zh) 一种小反刍兽疫病毒hn蛋白抗原表位肽及其确定、制备方法和应用
CN109679970A (zh) 猫疱疹i型病毒快速检测的制备方法
CN108948173B (zh) 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
CN108948174B (zh) 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
CN114075270B (zh) 一种人源包虫病抗原的重组蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130327