CN104892744B

CN104892744B - 一种具有拮抗趋化因子受体cxcr4的活性多肽的及其设计制备和生物医学应用

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Publication number: CN104892744B
Application number: CN201510037065.8A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2015-01-26
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2035-01-26
Also published as: CN104892744A

Abstract

本发明公开了一种设计具有天然趋化因子N端区域的活性多肽。这类活性多肽通过拮抗趋化因子受体的活性，从而抑制HIV‑1侵入细胞并感染。本发明还公开了这类活性多肽的设计方法，通过分子动力学模拟，设计合适的连接桥将两个多肽片段连接起来，确定多肽合成序列，固相合成多肽，并最终测试活性多肽的生物学活性。本发明的活性多肽可作为CXCR4受体的拮抗剂，用于治疗艾滋病的先导药物，干细胞动员剂，急性髓系白血病，以及与CXCR4相关的多种疾病的治疗。

Description

一种具有拮抗趋化因子受体CXCR4的活性多肽的及其设计制备和生物医学应用

技术领域

本发明涉及一种具有拮抗趋化因子受体CXCR4的活性多肽及其制备方法和应用。

背景技术

CXCR4是CXC趋化因子受体家族的一员，总共有356个氨基酸残基。CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1(SDF-1，CXCL12)的特异性受体，与SDF-1结合后使细胞产生趋化作用。SDF-1a和CXCR4广泛地表达于多种细胞和组织中，包括免疫细胞、脑、心脏、肾、肝、肺和脾，在免疫系统、循环系统及中枢神经系统的发育中起着至关重要的作用。

CXCR4蛋白被发现与多种疾病密切相关。上世纪90年代，研究人员发现了HIV病毒感染的共受体，即CXCR4和CCR5。这两个穿膜蛋白均属于趋化因子受体家族，且与HIV病毒的入侵有着很大的联系。CXCR4是研究最多的趋化因子受体之一，主要是它可作为HIV-1入侵的辅助受体。因此，CXCR4蛋白也被认为是研究抗HIV药物的重要靶点蛋白。

CXCR4与SDF-1a轴可使造血干细胞回溯到骨髓。因此，阻断CXCR4与SDF-1a的相互作用可以使得造血干细胞从骨髓中迁移出来，用于治疗非霍杰金淋巴瘤和多发性骨髓瘤化疗之后的造血功能损伤。

CXCR4在很多肿瘤组织中被发现过量表达，并且在肿瘤细胞的增殖，侵润，血管增生，以及转移中起到非常重要的作用。CXCR4在23种不同类型肿瘤中均有表达，是肿瘤细胞表达最为普遍的趋化因子受体，并且和患者的预后相关。乳腺癌患者中，CXCR4表达阳性与患者淋巴结、远处转移相关，而高表达CXCR4的乳房癌患者预后较差。关于结直肠癌的研究表明，CXCR4高表达与肿瘤的复发、肝脏转移相关，并且相应患者生存率也较低。另外，在卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、神经母细胞瘤等其他肿瘤的研究中也得到了相似的结果。非小细胞肺癌患者恶性胸水中肿瘤细胞CXCR4表达阳性，而胸膜间皮细胞则表达SDF-1a，CXCR4/SDF-1a信号轴可能在非小细胞肺癌胸膜播散过程中起到了一定的作用。因此，CXCR4也是靶向治疗肿瘤及肿瘤转移的研究新热点。

发明内容

本发明提供了一种分支多肽及其衍生物的设计、合成和应用，目的之一是提供一种具有拮抗CXCR4活性的抗艾滋病和相关免疫疾病的先导化合物。

本发明所提供的分支多肽结构式为Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp-Lys-Cys-Ala-Leu-Gly-Tyr-Asn-Lys-Arg-Pro-Leu-Pro-Lys(NH₂)-ε-(-AAn)。其中，AAn为Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp，或Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro，或以上序列通过缺失、加入、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得到的多肽序列。上述氨基酸为D型氨基酸或L型氨基酸。

可在所述多肽的N端或残基侧链上被聚乙二醇化，所述的聚乙二醇分子的分子量在2,000到60,000之间。

可在所述的分支多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行一个或多个羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙基化、磷酸化、酯化或糖基化，得到所述分支多肽衍生物。

所述的分支多肽可以与酸或碱反应形成药学上可接受的盐类化合物。

本发明的另一个目的是提供所述分支多肽及衍生物的应用。

所述分支多肽可以用于治疗艾滋病及相关免疫疾病的药物分子。

所述分支多肽可以用于进行干细胞动员的药物分子。

所述分支多肽可以用于治疗急性髓系白血病的药物分子。

与现有发明相比，本发明具有以下优点：

本发明的多肽为分枝状多肽，能显著提高多肽与蛋白的结合效率，具有很强的抗趋化因子受体CXCR4的作用，表现出较强的抗肿瘤细胞转移和抗HIV-1病毒入侵的作用。且为D型多肽，生物稳定性好。

附图说明

图1：多肽与蛋白结合模式图。

图2：多肽与蛋白结合位点。

图3：DD2多肽HPLC色谱图。

图4：DS1多肽的HPLC色谱图。

图5：DD2多肽MALDI质谱图。

图6：DS1多肽MALDI质谱图。

图7：DD2多肽的亲合活性。

图8：DS1多肽的亲合活性。

图9：DD2多肽的趋化活性。

图10：DS1多肽的趋化活性。

图11：DD2多肽的抗HIV-1病毒活性。

图12：DS1多肽的抗HIV-1病毒活性

图13：DD2多肽抑制细胞内钙流的活性

图14：DS1多肽抑制细胞内钙流的活性

具体实施方式

实施例1多肽的设计。

多肽设计使用分子动力学模拟的方法来进行。具体是使用SYBYL-x软件包中Biopolymer模块进行模拟计算，用以预测设计多肽与CXCR4蛋白的结合构象。CXCR4蛋白模型由已发表的晶体结构所构建(PDB：3ODU)。用软件对CXCR4晶体结构进行整理，去掉多余的配体分子，水分子和其他小分子，对蛋白文件加氢和电荷，并得到mol2文件。多肽分子的结构经过模拟退火和能量最小化得到能量相对较低的构象。通过手动调整，将多肽分子移至蛋白分子的表面，并调整二面角避免分子碰撞。在分子动力学模拟的过程中，对多肽和蛋白的结构进行溶剂化，选取水分子作为溶剂，水分子模型使用TIP3P模型。在Tripos力场下，分子动力学模拟预先进行10psec，使系统温度参数梯度升高至300K。然后，分子动力学模拟在300K的温度参数下保持1nsec。在分子动力学模拟过程中，只有多肽配体分子和CXCR4蛋白中ECL的氨基酸残基可以运动，而其他的残基均保持坐标不变。运算结束之后，使蛋白-多肽配体的系统重新能量最低化，并写入输出文件，并分析模拟过程中能量的变化以及蛋白-多肽的结合方式。

基于已知CXCR4的抑制剂多肽DV1。DV1是由CXCR4的另一个天然配体vMIP-II的衍生化所得到的。vMIP-II是由人类疱疹病毒8所编码的一个类趋化因子蛋白，是CXCR4的天然抑制性配体。同时，vMIP-II也可以和CCR5/CCR3等其他的趋化因子受体结合。根据对vMIP-II的构效关系研究发现，vMIP-II的N端21个氨基酸残基的多肽转变为D型氨基酸时，D型多肽的活性比V1更强，且具有很好的受体选择性。我们选取该多肽作为设计新型多肽的一个模板。

实施例2多肽的合成和纯化。

采用固相合成方法来合成多肽。固相树脂采用TentaGel Amide树脂，通过分离得到的多肽为C端氨基化的多肽。所有的氨基酸均使用9-芴甲氧羰基(9-Fmoc)保护氨基。在合成过程中，第一个氨基酸的羧基与固相树脂的活化氨基形成酰胺键，连接在固相上。通过20％的哌啶80％二甲基甲酰胺(DMF)的脱保护作用，将Fmoc基团脱去，露出氨基，并在缩合剂DIC(5当量)和HOBt(5当量)的作用下与下一个氨基酸(5当量)的羧基反应。多余的反应物和缩合剂在反应后通过用DMF清洗固相树脂而除去。这样，多肽的序列就从C端到N端一个个连接在固相树脂上面。当最后一个氨基酸连接完毕后，使用多肽分离试剂使多肽从固相树脂上分离下来。多肽分离试剂使用90％三氟乙酸，5％硫代苯酚和5％的水经混合后得到。多肽分离试剂同时也能脱掉氨基酸残基上面多余的保护基团。通常，反应时间为2小时，期间用玻璃棒轻轻搅拌数次，如多肽序列里面有精氨酸等则能观察到树脂的颜色变成深红色。分离结束后，用空气吹去多余的溶剂至残留1～2mL，使用预冷的乙醚(10mL)沉淀多肽30min。沉淀完毕后，使用离心机将多肽收集在试管底部，倒掉上清。沉淀后的多肽用双蒸水溶解，放置在冻干机中干燥，得到粗品多肽。

赖氨酸的4个碳的侧链作为连接桥连接两个多肽模板。赖氨酸的侧链由Dde(N-[1-(4，4-dimethyl-2，6-dioxocyclohex-1-ylidene ethyl]))基团保护，脱保护时使用温和的脱保护剂肼的DMF溶液(2％)。脱保护反应重复3次，每次2min，之后用DMF清洗树脂并用Kaiser测试检验脱保护反应是否完成。反应完毕后，赖氨酸的侧链氨基即与新的氨基酸的羧基反应，得到分枝状的多肽。

多肽合成完毕后得到的粗品肽，使用制备型高效液相色谱仪进行纯化。在检测好的纯化条件进行纯化，收集色谱中出现的色谱峰，并置于冻干机中干燥。干燥后的多肽用分析型高效液相色谱进行纯度鉴定，并用基质辅助激光解吸/电离质谱检测其分子量来确认。所有的多肽的纯度均达95％以上。

实施例3多肽的亲合活性测试。

HEK293细胞外源性的插入了CXCR4的质粒，能够稳定表达CXCR4蛋白。该细胞在RPMI1640(10％小牛血清，100IU青霉素，0.1mg/mL链霉素，2mM谷氨酰胺)中培养，并加入0.4mg/mL的G418加以筛选。实验之前，HEK293细胞用胰酶消化并收集，用4℃的FACS缓冲液(0.5％BSA，0.05％叠氮化钠的PBS溶液)洗涤两遍，并最终用缓冲液稀释成1×10⁷细胞/mL。细胞被混合均匀后置于锥形孔的96孔板，每孔5×10⁵细胞。一抗(12G5，鼠抗人CXCR4抗体，1∶3000)和不同浓度的多肽与细胞在冰上孵育40min后，用FACS缓冲液洗涤细胞2次。完毕后，加二抗(抗鼠抗体-FITC，1∶250)冰上避光孵育30min。反应完毕后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次。细胞的荧光强度(485EX/528EM)由荧光检测仪(Synergy 2，BioTek)所记录。实验数据是由至少三次独立实验所得到，每次实验均有两次重复。CXCR4的结合曲线用Sigmoidaldose-response模型所得到，IC₅₀值则由GraphPad Prism 4计算得出。

实施例4多肽的趋化活性测试。

本实验所用的细胞是天然表达CXCR4蛋白的SUP-T1细胞系。SUP-T1细胞在RPMI1640(10％小牛血清，100IU青霉素，0.1mg/mL链霉素，2mM谷氨酰胺)中培养，实验开始前收集细胞，确定细胞密度。SUP-T1细胞用缓冲液洗涤两次，并稀释成终密度为1.25×10⁷/mL的细胞混悬液。将1×10⁶的细胞置于Transwell(Corning)的上层孔中。下层孔加入200uL的缓冲液和SDF-1a作为促使细胞迁移的趋化物。在抑制剂实验模式中，上层孔中的细胞在进行细胞迁移之前，与不同浓度的抑制剂预先37℃孵育2hr。孵育后，将上层孔板置于下层孔中，置于细胞孵育箱中，使细胞迁移3hr。在激活剂实验模式中，下层孔的缓冲液除了加入SDF-1a之外，也在平行孔中加入不同浓度的多肽。然后将上层孔板置于下层孔中，置于细胞孵育箱中，使细胞迁移3hr。孵育结束后，移走上层孔板，在下层孔中加入40uL/孔的CellTiter Blue(Promoga)，用来定量迁移至下层孔的细胞。实验数据由至少3次独立实验所得到，每次实验均有2次重复。

实施例5多肽的抗HIV-1病毒活性测试。

本实验所需要的细胞是Cf2TH-CD4-CXCR4或Cf2Th-CXCR4细胞系。在感染实验之前，细胞以6×10³/孔的密度置于96孔板中，并孵育24hr。感染实验当天，将不同浓度的抑制剂(1～100uM)加入病毒中(10000个逆转录酶单位)，37℃孵育30min。将细胞中的培养液移走，加入病毒-抑制剂混合物，在37℃中孵育48hr。孵育结束后，将细胞的培养液移走并加入细胞裂解液，冻融3次后完全裂解细胞。在细胞裂解物中加入100uL荧光素缓冲液(15mMMgSO₄，15mM KPO₄，1mM ATP，1mM DTT)和50uL的D-荧光素钾(1mN，BD Pharmingen)，并用生物发光酶标仪(EG&G Berthold MicroplateLuminometer LB 96V)记录荧光信号。

实施例6多肽对细胞钙流的测试。

本实验所用的细胞是SUP-T1细胞系。实验前收集细胞，给细胞计数以确定细胞密度，用实验缓冲液(20mM HEPES的HBSS溶液)洗涤细胞，并最终将细胞液稀释成1×10⁶/mL。本实验使用Fura-2AM(Molecular Probes)用于追踪钙离子的信号，同时使用丙磺舒作为离子通道抑制剂阻止细胞将Fura-2AM泵出。当SDF-1a或CXCR4激活剂与CXCR4结合并触发信号转导通路时，钙离子从内质网流出，与细胞质内的Fura-2AM结合，形成高强度的荧光螯合物，被荧光检测仪所检测，以此确定受体是否被激活。CXCR4钙离子内流实验也分为抑制剂模式和激活剂模式。

CXCR4激动剂模式：稀释好的细胞悬浊液用Fura-2AM Dye(2uM)与丙磺舒(5uM)染色，放于37℃的细胞孵育箱中45min，每10min混匀一次。染色结束后，用实验缓冲液洗涤细胞2次。将细胞液加入石英分光液槽中，置入荧光检测仪中，调整波长为340EX/510EM，记录荧光信号。手动加入不同浓度的SDF-1a(50nM)或CXCR4激动剂(10nM～10uM)后，观察是否能够增加荧光强度。

CXCR4抑制剂模式：细胞处理方法同激动剂模式。在细胞液加入石英分光液槽后，先加入一定浓度的抑制剂(10nM～10uM)，等待120sec，再加入SDF-1a(50nM)。观察荧光信号与没有加抑制剂组的差别。

表1本发明中包括的多种分支多肽的序列

序列表

<110> 徐岩，黄子为

<120> 一种具有拮抗趋化因子受体CXCR4的活性多肽的及其设计制备和生物医学应用

<130> MP1707735Z

<141> 2019-10-18

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(22)

<223> Leu是D-氨基酸； Ala是D-氨基酸； Ser是D-氨基酸；Trp是D-氨基酸； His是D-氨基酸； Arg是D-氨基酸； Pro是D-氨基酸； Asp是D-氨基酸； Lys是D-氨基酸； Cys是D-氨基酸； Gly是D-氨基酸； Tyr是D-氨基酸； Asn是D-氨基酸；

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<223> Lys的侧链氨基上连接一个多肽支链，多肽支链的氨基酸序列为:Lys ProVal Ser Leu Ser Tyr Arg; Lys的侧链氨基与Arg的羧基形成酰胺键

<400> 1

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly Tyr Asn

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Lys

20

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(22)

<223> Leu是D-氨基酸； Ala是D-氨基酸； Ser是D-氨基酸； Trp是D-氨基酸； His是D-氨基酸； Arg是D-氨基酸； Pro是D-氨基酸； Asp是D-氨基酸； Lys是D-氨基酸；Cys是D-氨基酸； Tyr是D-氨基酸； Asn是D-氨基酸；

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<223> Lys的侧链氨基上连接一个多肽支链，多肽支链的氨基酸序列为:Lys ProVal Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro; Lys的侧链氨基与Pro的羧基形成酰胺键

<400> 2

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly Tyr Asn

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Lys

20

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(22)

<223> Leu是D-氨基酸； Ala是D-氨基酸； Ser是D-氨基酸； Trp是D-氨基酸； His是D-氨基酸； Arg是D-氨基酸； Pro是D-氨基酸； Asp是D-氨基酸； Lys是D-氨基酸； Cys是D-氨基酸； Tyr是D-氨基酸； Asn是D-氨基酸； Val是D-氨基酸；

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<223> Lys的侧链氨基上连接一个多肽支链，多肽支链的氨基酸序列为:Lys ProVal Ser Leu Ser Tyr Arg，Lys是D-氨基酸；Pro是D-氨基酸； Val是D-氨基酸； Ser是D-氨基酸； Leu是D-氨基酸； Ser是D-氨基酸； Tyr是D-氨基酸； Arg是D-氨基酸； Lys的侧链氨基与Arg的羧基形成酰胺键

<400> 3

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly Tyr Asn

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Lys

20

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(10)

<223> Leu是D-氨基酸；Ala是D-氨基酸；Ser是D-氨基酸；Trp是D-氨基酸；His是D-氨基酸；Arg是D-氨基酸；Pro是D-氨基酸；Asp是D-氨基酸；Lys是D-氨基酸；

<400> 4

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(10)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Lys侧链氨基上连接一个多肽支链，多肽支链的序列为：Leu Gly Ala SerTrp His Arg Pro Asp Lys，Leu是D-氨基酸； Gly是D-氨基酸； Ala是D-氨基酸； Ser是D-氨基酸； Trp是D-氨基酸； His是D-氨基酸； Arg是D-氨基酸； Pro是D-氨基酸； Asp是D-氨基酸； Lys是D-氨基酸；Lys侧链氨基与多肽链末端Lys的羧基形成酰胺键；

<400> 5

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(22)

<223> Leu是D-氨基酸； Ala是D-氨基酸； Ser 是D-氨基酸；Trp是D-氨基酸； His是D-氨基酸； Arg是D-氨基酸； Pro是D-氨基酸； Asp是D-氨基酸； Lys是D-氨基酸； Cys是D-氨基酸； Tyr 是D-氨基酸；Asn是D-氨基酸；

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<400> 6

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly Tyr Asn

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Lys

20

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(22)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (22)..(22)

<223> Lys的侧链氨基上连接一个多肽支链，多肽支链的氨基酸序列为:Lys ProVal Ser Leu Ser Tyr Arg Ser Ala; Lys的侧链氨基与Ala的羧基形成酰胺键

<400> 7

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Ala Leu Gly Tyr Asn

1 5 10 15

Lys Arg Pro Leu Pro Lys

20

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(11)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (11)..(11)

<400> 8

Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Lys

1 5 10

Claims

1.具有CXCR4拮抗活性的分支多肽，其特征在于：所述分支多肽的序列从氨基端到羧基端的序列如下：

Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp-Lys-Cys-Ala-Leu-Gly-Tyr-Asn-Lys-Arg- Pro-Leu-Pro-Lys(NH ₂ )-ε-(-AAn)，

其中，AAn从N端到C端的序列如下：

Lys-Pro-Val-Ser-Leu-Ser-Tyr-Arg，或Leu-Gly-Ala-Ser-Trp-His-Arg-Pro-Asp- Lys；

其中，Lys(NH ₂ )-ε与AAn的羧基端的Arg或Lys的羧基形成酰胺键；

斜体表示D型氨基酸。

2.一种分支多肽衍生物，是权利要求1所述的分支多肽的药学上可接受的盐。

3.根据权利要求1所述分支多肽的制备方法，其特征在于：

(1)采用分子动力学模拟的方法，预测多肽的空间构象，并确定多肽的序列；

(2)固相合成方法合成目标多肽，并使用HPLC进行纯化；

(3)检验多肽的生物活性，筛选目标多肽。

4.根据权利要求2所述分支多肽衍生物的制备方法，其特征在于：

(2)固相合成方法合成目标多肽，并使用HPLC进行纯化；

(3)检验多肽的生物活性，筛选目标多肽，将所述目标多肽与酸或碱反应形成药学上可接受的盐类化合物。

5.根据权利要求3所述分支多肽的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述生物活性检测，包括受体亲和性实验，趋化抑制实验，细胞内钙流实验和抗HIV-1侵入实验。

6.根据权利要求1所述分支多肽作为CXCR4受体拮抗剂在制备作为抗艾滋病的先导药物的应用。

7.根据权利要求2所述分支多肽衍生物作为CXCR4受体拮抗剂在制备作为抗艾滋病的先导药物的应用。

8.根据权利要求1所述分支多肽作为CXCR4受体拮抗剂在制备作为造血干细胞动员中的先导药物的应用。

9.根据权利要求2所述分支多肽衍生物作为CXCR4受体拮抗剂在制备作为造血干细胞动员中的先导药物的应用。

10.根据权利要求1所述分支多肽作为CXCR4受体拮抗剂在制备作为急性髓系白血病中的先导药物的应用，所述急性髓系白血病为阳性表达CXCR4的急性髓系白血病。

11.根据权利要求2所述分支多肽衍生物作为CXCR4受体拮抗剂在制备作为急性髓系白血病中的先导药物的应用，所述急性髓系白血病为阳性表达CXCR4的急性髓系白血病。