CN116997562A - 异串联双环肽复合物 - Google Patents

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CN116997562A CN202280019732.8A CN202280019732A CN116997562A CN 116997562 A CN116997562 A CN 116997562A CN 202280019732 A CN202280019732 A CN 202280019732A CN 116997562 A CN116997562 A CN 116997562A
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L·雷帕西
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本发明涉及异串联(heterotandem)双环肽复合物，其包含结合存在于癌细胞上的成分的第一肽配体，所述第一肽配体通过接头与一个或多个第二肽配体缀合，所述第二肽配体结合存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分。本发明还涉及所述异串联双环肽复合物在预防、抑制或治疗癌症中的用途。

Description

异串联双环肽复合物
技术领域
本发明涉及异串联(heterotandem)双环肽复合物，其包含结合存在于癌细胞上的成分的第一肽配体，所述第一肽配体通过接头与一个或多个第二肽配体缀合，所述第二肽配体结合存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分。本发明还涉及所述异串联双环肽复合物在预防、抑制或治疗癌症中的用途。
背景技术
环肽能够以高亲和力和靶标特异性与蛋白质靶标结合，因此是对于治疗剂开发有吸引力的分子类别。事实上，临床上已经成功使用了几种环肽，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制剂环孢霉素或抗癌药奥曲肽(Driggers等人(2008),Nat Rev Drug Discov 7(7),608-24)。良好的结合特性是由于肽与靶标之间形成的相对较大的相互作用表面以及环状结构的构象柔韧性降低所致。通常，大环与数百平方埃的表面结合，例如环肽CXCR4拮抗剂CVX15(Wu等人(2007),Science 330,1066-71)、具有与整联蛋白αVb3/>结合的Arg-Gly-Asp基序的环肽(Xiong等人(2002),Science 296(5565),151-5)或结合尿激酶型纤溶酶原激活因子的环肽抑制剂upain-1(/>Zhao等人(2007),J Struct Biol 160(1),1-10)。
由于其环状构型，肽大环比线性肽柔韧性差，导致与靶标结合后熵损失较小，并导致更高的结合亲和力。与线性肽相比，降低的柔韧性还导致锁定靶标特异性构象，增加结合特异性。这种作用已通过一种基质金属蛋白酶8(MMP-8)的有效的和选择性抑制剂得到了例证，该抑制剂在开环时失去相对于其他MMP的选择性(Cherney等人(1998),J Med Chem 41(11),1749-51)。通过大环化获得的有利的结合性质在具有多于一个肽环的多环肽中更为显著，例如在万古霉素、乳酸链球菌肽和放线菌素中。
不同的研究团队先前已将具有半胱氨酸残基的多肽系于(tether)一个合成的分子结构上(Kemp和McNamara(1985),J.Org.Chem；Timmerman等人(2005),ChemBioChem)。Meloen和同事已使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速定量地环化到合成支架上，以结构模拟蛋白质表面(Timmerman等人(2005),ChemBioChem)。WO 2004/077062和WO2006/078161中公开了用于生成候选药物化合物的方法，其中所述化合物是通过将包含半胱氨酸的多肽连接到分子支架上而生成的，所述分子支架例如为三(溴甲基)苯。
已经开发了基于噬菌体展示的组合方法以生成和筛选针对目标靶标的双环肽的大型文库(Heinis等人(2009),Nat Chem Biol 5(7),502-7和WO 2009/098450)。简要地，在噬菌体上展示了包含三个半胱氨酸残基和两个六随机氨基酸的区域(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)的线性肽的组合文库，并通过将半胱氨酸侧链共价连接至小分子(三-(溴甲基)苯)而得以环化。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种异串联双环肽复合物，其包含：
(a)第一肽配体，其结合存在于癌细胞上的成分；通过接头与以下缀合
(b)一个或多个第二肽配体，其结合存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分；
其中，每个所述肽配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，并且所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环。
根据本发明的进一步的方面，提供了一种药物组合物，其包含如本文所定义的异串联双环肽复合物，与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
根据本发明的进一步的方面，提供了如本文所定义的异串联双环肽复合物，其用于预防、抑制或治疗癌症。
附图说明
图1：通过CD107a上调测量的BCY15664和BCY15911对NK细胞的激活。
图2至图4：BCY15664、BCY15923和BCY17226的NK细胞毒性测定结果。
图5：BCY17226的IFNγ分泌测定结果。
图6至图10：BCY17225、BCY21686、BCY21687、BCY17231、BCY17235、BCY18731、BCY20793、BCY15924、BCY18042、BCY18049、BCY18603和BCY18604的NK细胞毒性测定结果。
图11至图12：BCY17225、BCY21686、BCY21687和BCY18048的细胞因子分泌测定结果。
具体实施方式
根据本发明的第一方面，提供了一种异串联双环肽复合物，其包含：
(a)第一肽配体，其结合存在于癌细胞上的成分；通过接头与以下缀合
(b)一个或多个第二肽配体，其结合存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分；
其中，每个所述肽配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，并且所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环。
第一肽配体
本文提及的术语“癌细胞”包括已知参与癌症的任何细胞。当负责调节细胞分裂的基因受损时，产生癌细胞。致癌作用(carcinogenesis)是由正常细胞遗传物质的突变和表观突变引起的，其破坏增殖和细胞死亡之间的正常平衡。这导致不受控制的细胞分裂和这些细胞在体内通过自然选择的进化。细胞增殖不受控制且通常是快速的，可以导致良性或恶性肿瘤(癌症)。良性肿瘤不会扩散到身体的其他部位或侵入其他组织。恶性肿瘤可以侵入其他器官，扩散到远处(转移)并变得危及生命。
在一个实施方案中，癌细胞选自HT1080、A549、SC-OV-3、PC3、HT1376、NCI-H292、LnCap、MC38、MC38#13、4T1-D02、H322、HT29、T47D和RKO肿瘤细胞。
在一个实施方案中，存在于癌细胞上的成分是粘连蛋白-4(Nectin-4)。
粘连蛋白-4是表面分子，属于蛋白质的粘连蛋白家族，该家族包括4个成员。粘连蛋白是细胞粘附分子，在发育和成年期间在上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞和神经元细胞的各种生物过程(如极性、增殖、分化和迁移)中发挥关键作用。它们在人中参与多种病理过程。它们是脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒和麻疹病毒的主要受体。编码粘连蛋白-1(PVRL1)或粘连蛋白-4(PVRL4)的基因突变导致与其他异常相关的外胚层发育不良综合征。粘连蛋白-4在胎儿发育过程中表达。在成人组织中，它的表达比其他家族成员的表达更受限制。粘连蛋白-4是肿瘤相关抗原，分别存在于50％、49％和86％的乳腺癌、卵巢癌和肺癌中，主要在预后不良的肿瘤中。在相应的正常组织中未检测到其表达。在乳腺肿瘤中，粘连蛋白-4主要在三阴性和ERBB2+癌中表达。在患有这些癌症的患者的血清中，检测到可溶形式的粘连蛋白-4与预后不良有关。血清粘连蛋白-4水平在转移性进展期间升高，治疗后降低。这些结果表明粘连蛋白-4可能是治疗癌症的可靠靶点。因此，在现有技术中已经描述了数种抗粘连蛋白-4抗体。特别是，Enfortumab Vedotin(ASG-22ME)是靶向粘连蛋白-4的抗体药物缀合物(ADC)，目前正在临床研究用于治疗实体瘤患者。
在一个实施方案中，第一肽配体包含结合粘连蛋白-4的双环肽配体。
WO 2019/243832中公开了结合粘连蛋白-4的双环肽配体的合适示例，其肽通过引用并入本文。
在一个实施方案中，结合粘连蛋白-4的双环肽配体包含以下氨基酸序列：
CiP[1Nal][dD]CiiM[HArg]DWSTP[HyP]WCiii(SEQ ID NO：1；在本文中称为BCY8116)。
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一、第二和第三半胱氨酸残基，1Nal表示1-萘丙氨酸，HArg表示高精氨酸，HyP表示反式-4-羟基-L-脯氨酸。
在可选的实施方案中，存在于癌细胞上的成分是EphA2。
Eph受体酪氨酸激酶(Eph)属于一大组受体酪氨酸激酶(RTK)，即磷酸化蛋白质的酪氨酸残基的激酶。Eph及其膜结合的肝配蛋白配体(ephrin)控制细胞定位和组织结构(Poliakov等人(2004)Dev Cell 7,465-80)。功能和生化Eph反应在较高的配体寡聚状态下发生(Stein等人(1998)Genes Dev 12,667-678)。
在其他模式化功能中，已表明各种Eph和肝配蛋白在血管发育中发挥作用。敲除EphB4和肝配蛋白-B2导致缺乏将毛细血管床重建为血管的能力(Poliakov等人，同上)和胚胎致死。在新形成的成人微血管中也观察到了一些Eph受体和肝配蛋白的持续表达(Brantley-Sieders等人(2004)Curr Pharm Des 10,3431-42；Adams(2003)J Anat 202,105-12)。
还观察到一些肝配蛋白及其受体在成人中的失调的重新出现有助于肿瘤侵袭、转移和新血管生成(Nakamoto等人(2002)Microsc Res Tech 59,58-67；Brantley-Sieders等人，同上)。此外，已发现一些Eph家族成员在来自各种人肿瘤的肿瘤细胞上过度表达(Brantley-Sieders等人，同上；Marme(2002)Ann Hematol 81 Suppl 2,S66；Booth等人(2002)Nat Med 8,1360-1)。
EPH受体A2(A型肝配蛋白受体2)是在人中由EPHA2基因编码的蛋白质。
EphA2在人中的多种癌症中上调，经常与疾病进展、转移和预后不良相关，例如：乳腺癌(Zelinski等人(2001)Cancer Res.61,2301-2306；Zhuang等人(2010)Cancer Res.70,299-308；Brantley-Sieders等人(2011)PLoS One 6,e24426)、肺癌(Brannan等人(2009)Cancer Prev Res(Phila)2,1039-1049；Kinch等人(2003)Clin Cancer Res.9,613-618；Guo等人(2013)J Thorac Oncol.8,301-308)、胃癌(Nakamura等人(2005)Cancer Sci.96,42-47；Yuan等人(2009)Dig Dis Sci 54,2410-2417)、胰腺癌(Mudali等人(2006)Clin ExpMetastasis 23,357-365)、前列腺癌(Walker-Daniels等人(1999)Prostate 41,275-280)、肝癌(Yang等人(2009)Hepatol Res.39,1169-1177)和胶质母细胞瘤(Wykosky等人(2005)Mol Cancer Res.3,541-551；Li等人(2010)Tumor Biol.31,477-488)。
尽管有证据表明在包括肿瘤细胞生长、存活、侵袭和血管生成在内的癌症进展的多个阶段存在相互作用，但EphA2在癌症进展中的全部作用仍未确定。下调EphA2的表达抑制肿瘤癌细胞增殖(Binda等人(2012)Cancer Cell 22,765-780)，而阻断EphA2抑制VEGF诱导的细胞迁移(Hess等人(2001)Cancer Res.61,3250-3255)、出芽和血管生成(Cheng等人(2002)Mol Cancer Res.1,2–11；Lin等人(2007)Cancer 109,332-40)和转移性进展(Brantley-Sieders等人(2005)FASEB J.19,1884-1886)。
已显示与EphA2缀合的抗体药物在大鼠和小鼠异种移植模型中显著减少肿瘤生长(Jackson等人(2008)Cancer Research 68,9367-9374)，并且已在人中尝试了类似的方法，尽管由于治疗相关的不良事件而必须停止治疗(Annunziata等人(2013)Invest New Drugs31,77-84)。
在一个实施方案中，第一肽配体包含结合EphA2的双环肽配体。
WO 2019/122860、WO 2019/122861和WO 2019/122863中公开了结合EphA2的双环肽配体的合适示例，其肽通过引用并入本文。
在一个实施方案中，结合EphA2的双环肽配体包含以下氨基酸序列：
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(SEQ ID NO：2)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii表示第一(i)、第二(ii)和第三(iii)反应性基团，HyP表示反式-4-羟基-L-脯氨酸，HArg表示高精氨酸。
在进一步的实施方案中，结合EphA2的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
A-[HArg]-D-(SEQ ID NO：2)(在本文中称为BCY9594)；
或其药学上可接受的盐，其中HArg表示高精氨酸。
在可选的实施方案中，存在于癌细胞上的成分是PD-L1。
程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)是一种290个氨基酸的I型跨膜蛋白，由小鼠19号染色体和人9号染色体上的CD274基因编码。PD-L1表达参与慢性感染中涉及的免疫反应的逃逸，例如慢性病毒感染(尤其包括例如HIV、HBV、HCV和HTLV)、慢性细菌感染(尤其包括例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))和慢性寄生虫感染(包括例如曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni))。PD-L1表达已经在许多组织和细胞类型中检测到，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和非造血细胞(包括内皮细胞、肝细胞、肌肉细胞和胎盘)。
PD-L1表达也参与抗肿瘤免疫活性的抑制。肿瘤表达可以被宿主T细胞识别的抗原，但是肿瘤的免疫清除很少。这种失败的部分原因是由于肿瘤微环境对免疫的抑制。PD-L1在许多肿瘤上的表达是这种抑制性环境的一个组成部分，并与其他免疫抑制信号协同作用。PD-L1表达已在许多种实体瘤上原位显示，包括乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤、黑色素瘤、膀胱肿瘤、肝肿瘤、唾液腺肿瘤、胃肿瘤、胶质瘤、甲状腺肿瘤、胸腺上皮肿瘤和头颈肿瘤(Brown JA等人2003 Immunol.170:1257-66；Dong H等人2002Nat.Med.8:793-800；Hamanishi J等人2007Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:3360-65；Strome SE等人2003Cancer Res.63:6501-5；Inman BA等人2007Cancer 109:1499-505；Konishi J等人2004Clin.Cancer Res.10:5094-100；Nakanishi J等人2007Cancer Immunol.Immunother.56:1173-82；Nomi T等人2007Clin.Cancer Res.13:2151-57；Thompson RH等人2004Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:17174-79；Wu C等人2006 Acta Histochem.108:19-24)。另外，PD-L1的受体程序性细胞死亡蛋白1(也称为PD-1和CD279)的表达在肿瘤浸润性淋巴细胞中上调，这也有助于肿瘤的免疫抑制(Blank C等人2003Immunol.171:4574-81)。最重要地，有关肿瘤上PD-L1表达与疾病结果的研究表明，PD-L1表达与肾癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌的不良预后密切相关(Hamanishi J等人2007Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:3360-65；Inman BA等人2007 Cancer 109:1499-505；Konishi J等人2004 Clin.Cancer Res.10:5094-100；Nakanishi J等人2007 CancerImmunol.Immunother.56:1173-82；Nomi T等人2007 Clin.Cancer Res.13:2151-57；Thompson RH等人2004 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:17174-79；Wu C等人2006 ActaHistochem.108:19-24)。另外，这些研究显示肿瘤上较高水平的PD-L1表达可能促进肿瘤分期的进展和侵袭到更深的组织结构中。
PD-1途径也可以在血液系统恶性肿瘤中发挥作用。PD-L1在多发性骨髓瘤细胞中表达，但在正常浆细胞中不表达(Liu J等人2007 Blood 110:296-304)。PD-L1在一些原发性T细胞淋巴瘤(特别是间变性大细胞T淋巴瘤)上表达(Brown Ja等人,2003 Immunol.170:1257-66)。PD-1在血管免疫母细胞性淋巴瘤的T细胞中高表达，而PD-L1在相关联的滤泡树突状细胞网络中表达(Dorfman DM等人2006 Am.J.Surg.Pathol.30:802-10)。在结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤中，与淋巴细胞或组织细胞(L&H)相关联的T细胞表达PD-1。使用由PD-1连接诱导的基因的读数进行的微阵列分析表明，在霍奇金淋巴瘤中，与肿瘤相关的T细胞对PD-1信号原位响应(Chemnitz JM等人2007 Blood 110:3226-33)。PD-1和PD-L1在HTLV-1介导的成人T细胞白血病和淋巴瘤的CD4 T细胞上表达(Shimauchi T等人2007Int.J.Cancer 121:2585-90)。这些肿瘤细胞对TCR信号反应低下。
动物模型研究表明，肿瘤上的PD-L1抑制T细胞激活和肿瘤细胞裂解，并在一些情况下导致肿瘤特异性T细胞死亡的增加(Dong H等人2002 Nat.Med.8:793-800；Hirano F等人2005 Cancer Res.65:1089-96)。肿瘤相关的APC也可以利用PD-1:PD-L1途径来控制抗肿瘤T细胞反应。肿瘤环境因素上调肿瘤相关的髓系DC群体上的PD-L1表达(Curiel TJ等人2003 Nat.Med.9:562-67)。B16黑色素瘤的肿瘤引流淋巴结中的浆细胞样树突状细胞(DC)表达IDO，其强烈激活调节性T细胞的抑制活性。IDO处理的调节性T细胞的抑制活性需要细胞与表达IDO的DC接触(Sharma MD等人2007 Clin.Invest.117:2570-82)。
在一个实施方案中，第一肽配体包含结合PD-L1的双环肽配体。
在一个实施方案中，结合PD-L1的双环肽配体包含以下氨基酸序列：
CiSAGWLTMCiiQKLHLCiii(SEQ ID NO：3)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一(i)、第二(ii)和第三(iii)半胱氨酸残基。
在进一步的实施方案中，分子支架是TATA，并且结合PD-L1的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
Ac-D-[Harg]-(SEQ ID NO：3)-PSH(在本文中称为BCY11865)；
或其药学上可接受的盐，其中HArg表示高精氨酸。
WO 2020/128526和WO 2020/128527中公开了结合PD-L1的双环肽配体的合适示例，其肽通过引用并入本文。
在可选的实施方案中，存在于癌细胞上的成分是膜1型基质金属肽酶14(MT1，也称为MMP14)。MT1-MMP是一种跨膜金属蛋白酶，其直接通过降解细胞外基质的数种成分并间接通过激活pro-MMP2而在细胞外基质重塑中起主要作用。MT1-MMP对肿瘤血管生成至关重要(Sounni等人(2002),FASEB J.16(6),555-564)并且在多种实体瘤上过表达，因此本发明的结合MT1-MMP的双环肽在靶向治疗癌症中具有特别的效用，所述癌症特别是实体瘤，如非小细胞肺癌。在一个实施方案中，本发明的双环肽是人MT1-MMP特异性的。在进一步的实施方案中，本发明的双环肽是小鼠MT1-MMP特异性的。在仍进一步的实施方案中，本发明的双环肽是人和小鼠MT1-MMP特异性的。在仍进一步的实施方案中，本发明的双环肽是人、小鼠和狗MT1-MMP特异性的。
在一个实施方案中，结合MT1的双环肽配体包含以下氨基酸序列：
CiV[Harg]ECiiA[tBuAla]LFP[Harg]TCiii(SEQ ID NO：4)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一(i)、第二(ii)和第三(iii)半胱氨酸残基。
在进一步的实施方案中，分子支架是TATA，并且结合MT1的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
LPP-(SEQ ID NO：4)(在本文中称为BCY14320)；
或其药学上可接受的盐。
WO 2016/067035中公开了结合MT1的双环肽配体的合适示例，其肽通过引用并入本文。
在可选的实施方案中，存在于癌细胞上的成分是前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)(也称为谷氨酸羧肽酶II(GCPII)、N-乙酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酸肽酶I(NAALADase I)和NAAG肽酶)是在人中由FOLH1(叶酸水解酶1)基因编码的酶。人GCPII含有750个氨基酸，重约84kDa。
人PSMA在前列腺中高度表达，大约比大多数其他组织中高一百倍。在一些前列腺癌中，PSMA是上调程度第二的基因产物，比非癌前列腺细胞中的水平增加了8至12倍。由于这种高表达，PSMA正被开发为一些癌症的治疗和成像的潜在生物标志物。在人前列腺癌中，较高表达的肿瘤与较快的进展时间和较高比例的复发患者相关。
在一个实施方案中，第一肽配体包含结合PSMA的双环肽配体。
WO 2019/243455和WO 2020/120980中公开了结合PSMA的双环肽配体的合适示例，其肽通过引用并入本文。
第二肽配体
将理解的是，一个或多个第二肽配体需要与存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分结合。还将理解的是，当有多于一个第二肽配体时，所述第二肽配体可以与NK细胞内的相同或不同靶标结合。因此，在一个实施方案中，所述第二双环肽配体对NK细胞内的相同靶标具有特异性。在进一步的实施方案中，异串联双环肽复合物包含至少两个相同的第二双环肽配体。“相同”是指具有相同氨基酸序列的第二双环肽，最重要的是，相同的氨基酸序列是指所述第二双环肽的结合部分(例如，序列在连接位置上可能不同)。在该实施方案中，异串联双环肽复合物内的每一个第二双环肽将结合NK细胞的同一靶标上的完全相同的表位——因此所得靶标结合复合物将产生同源二聚体(如果异串联双环肽复合物包含两个相同的第二双环肽)、同源三聚体(如果异串联双环肽复合物包含三个相同的第二双环肽)或同源四聚体(如果异串联双环肽复合物包含四个相同的第二双环肽)等。
在可选的实施方案中，异串联双环肽复合物包含至少两个不同的第二双环肽配体。“不同”是指第二双环肽具有不同的氨基酸序列。在该实施方案中，异串联双环肽复合物内的不同第二双环肽配体将结合NK细胞上的不同表位——因此所得靶标结合复合物将产生双互补位(biparatopic)(如果异串联双环肽复合物包含两个不同的第二双环肽)、三互补位(triparatopic)(如果异串联双环肽复合物包含三个不同的第二双环肽)或四互补位(tetraparatopic)(如果异串联双环肽复合物包含四个不同的第二双环肽)等。
不受理论束缚，据信，所得异串联双环肽复合物能够通过异种交联NK细胞上的不同靶标(如不同靶标受体)来激活受体。因此，在一个实施方案中，所述第二双环肽配体对NK细胞上的不同靶标具有特异性。将理解的是，在该实施方案中，异串联双环肽复合物包含至少两个不同的第二双环肽配体(即具有不同氨基酸序列的第二双环肽配体)。在该实施方案中，异串联双环肽复合物内的每一个第二双环肽将结合NK细胞上的不同表位——因此所得靶标结合复合物将产生双特异性异串联双环肽复合物(如果异串联双环肽复合物包含两个不同的第二双环肽)、三特异性多聚结合复合物(如果异串联双环肽复合物包含三个不同的第二双环肽)、四特异性异串联双环肽复合物(如果异串联双环肽复合物包含四个不同的第二双环肽)等。
结合NKp46的双环肽
自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的成员，占外周血单个核细胞的一小部分。作为前线响应者，这些免疫细胞检测并消除不健康的细胞，并将先天免疫反应与适应性免疫反应联系起来。由于其固有的特性，NK细胞是增强免疫肿瘤学和自身免疫中的治疗工具的优异候选物。
NK细胞负责通过许多种抑制性受体和激活性受体进行的免疫监视。NK细胞表面的这些激活性受体和抑制性受体是一种复杂的手段，NK细胞的活性在健康个体中通过这种手段保持平衡。NK细胞识别健康细胞表面的MHC I类分子，并通过抑制性受体受到抑制，以免消除这些健康细胞。在应激、感染或转化时，NK细胞识别不健康的细胞，通过细胞表面上MHCI类的丢失和与激活性受体结合的NK细胞受体配体的诱导来进行。NK细胞对非我的识别引发细胞毒性反应，释放细胞因子和细胞毒性分子以消除不健康的细胞。
NK细胞活性是通过涉及激活性信号和抑制性信号两者的复杂机制。多份报告已为NK细胞受体在天然细胞毒性中的核心作用和在癌症治疗中的有用性提供了证据。进一步理解并增强NK细胞介导的肿瘤细胞识别和杀伤的需求尚未得到满足。报告表明，肿瘤细胞利用许多机制来降低NK活性，并且NK细胞的存在和功效与患者的有利预后有关(Passero等人(2015)Oncotarget 6(16),14360-14373，Stringaris等人(2014)Haematologica 99(5),836-847)。正是通过治疗干预，人们可以利用NK细胞在介导免疫反应中可以发挥的潜力，以对抗癌症和自身免疫性疾病。
在一个实施方案中，存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分是存在于NK细胞表面上的天然细胞毒性受体。在进一步的实施方案中，存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分是选自NKp30、NKp44和NKp46的天然细胞毒性受体。在仍进一步的实施方案中，存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分是NKp46。
天然细胞毒性受体(NCR)是在NK细胞表面上表达的刺激受体家族，其引发NK激活和细胞介导的细胞毒性。NCR家族由Kp30、NKp44和NKp46三个成员组成。虽然NKp46的细胞配体是未知的，但已显示NKp46在抗肿瘤免疫中的作用。NK细胞的病毒抗原介导的NKp46激活导致肿瘤排斥反应(Chinnery等人2012)。在与其配体相互作用时，NKp46受体触发NK细胞诱导定向细胞毒性，通过使用抗NKp46阻断抗体抑制NK细胞裂解靶标的能力来说明(Arnon等人2004)。NK细胞表面上的NCR表达量也会增加NK细胞毒性。已鉴定了NCR表达密度与NK细胞杀伤靶细胞(包括许多种肿瘤细胞)的能力之间的强相关性(Moretta等人2006)。在AML和宫颈癌和前驱病变中，NCR或NCR配体的不足量使肿瘤细胞耐受NK细胞毒性(Costello等人2002，Garcia-Iglesias等人2009)。在许多实体瘤中，NK细胞被肿瘤微环境下调，其中包括NCR配体的肿瘤脱落和免疫编辑，这阻止了NK细胞识别、浸润并杀伤肿瘤细胞的能力(Nayyar 2019，Stojanovic等人2011，Sordo-Bahamonde等人2020，Watanabe等人2010，Izawa等人2011，Koo等人2013，Sun等人2015，Hasmim等人2015，Han等人2018)。Stringaris等人(2014)报道了来自AML患者的NK细胞的NKp46下调，NK细胞抑制性受体NKG2A上调和低细胞毒性能力。此外，在实体癌(如前列腺癌)中，报道了数种激活性受体(CD16、NKp30、NKp46、NKG2D和DNAM-1)的表达降低，抑制性受体CD85j增加(Pesaro等人2016)。相比之下，Gautheir等人(2019)已将NKp46鉴定为在癌症中靶向NK细胞上的激活性受体的良好候选物，证明在SCCHN、乳腺癌、肝癌、肺癌、肾癌和转移性黑色素瘤患者的外周中NKp46没有统计学上显著的下调。另外，在多种实体瘤中NKp46表达持续，与其他激活性受体(如NKG2D、NKp30和NKp44)的下调以及肿瘤浸润淋巴细胞的低CD16表达有关，已对于癌症(如急性髓系白血病、乳腺癌和肺癌)报道(Fauriat等人2007，Mamessier等人2011，Platonova等人2011，Levi等人2015，Kim等人2010，MacFarlane等人2017)。因此，已显示NKp46是适用于治疗应用的特异性NK表面标志物，以鉴定NK细胞并将其靶向至肿瘤。
在一个实施方案中，一个或多个结合NKp46的双环肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
CiY[Cba]PDYLCii[dA]DEYCiii(SEQ ID NO：5)；
CiYLPDYLCiiGDEYCiii(SEQ ID NO：6)；
CiDLTTHNCiiQWGICiii(SEQ ID NO：7)；
CiNLQAPCiiMQTGKVCiii(SEQ ID NO：8)；
CiNLQNPCiiMKFPCiii(SEQ ID NO：9)；
CiYLPDYLCii[dK(PYA)]DEYCiii(SEQ ID NO：10)；和
CiLLHDHCiiPNTHPKLCiii(SEQ ID NO：11)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一、第二和第三半胱氨酸残基，其中Cba表示β-环丁基丙氨酸，dA表示D-丙氨酸，PYA表示戊炔酸。
在进一步的实施方案中，分子支架是TATA，并且一个或多个结合NKp46的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
Ac-(SEQ ID NO：5)-[K(PYA)](在本文中称为BCY17224)；
A-(SEQ ID NO：6)-A-[dK(PYA)](在本文中称为BCY15452)；
A-(SEQ ID NO：7)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY15686)；
A-(SEQ ID NO：8)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY15687)；
A-(SEQ ID NO：9)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY18004)；
A-(SEQ ID NO：10)-A(在本文中称为BCY17662)；和
A-(SEQ ID NO：11)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY18005)；
或其药学上可接受的盐，其中PYA表示戊炔酸。
结合CD16a的双环肽配体
在一个实施方案中，存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分是存在于NK细胞表面上的Fc受体。在进一步的实施方案中，存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分是低亲和力Fcγ受体(FcγR)，其选自FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB。在仍进一步的实施方案中，存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分是FcγRIIIA(也称为CD16a)。
Fc受体在许多白细胞的表面上表达。在人中，五种经典的低亲和力Fcγ受体(FcγR)(FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB)与免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分结合，并且是通过免疫细胞激活以及抑制来调节炎症的介质(Muta等人1994，Ravetch等人2001)。FcγRIIIA(CD16a)通过与IgG分子的Fc部分接合而被激活，并且对于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)过程至关重要。ADCC是一种机制，其中抗原特异性抗体引导NK细胞杀伤表达抗原的癌细胞(Arnould等人2006)。在IgG1 mAb的抗肿瘤作用中起着至关重要的作用，数项研究表明，曲妥珠单抗(一种人IgG1抗人表皮生长因子受体2(HER-2)抗体)以及EGFR抗体西妥昔单抗在转移性结直肠患者中的一部分抗肿瘤作用是通过ADCC(Zhang等人2007,2020，Wu等人2003)。可以对利妥昔单抗描述类似的结果，该单抗是对B细胞分化抗原CD20的嵌合IgG1 mAb(Manches等人2003，Clynes等人2000)。已在过表达研究中说明了CD16表达在引导免疫细胞以促进肿瘤细胞杀伤方面的有用性。通过Ig-Fc的逆转录病毒转导，IgFc在B16黑色素瘤细胞表面的表达导致体内肿瘤杀伤(Riddle等人2005)。也已在嵌合抗原受体T细胞表达CD16scFv并引导至抗体包被的肿瘤细胞的研究中说明了FcγR接合对将NK细胞引导至肿瘤的作用。在体内模型中，将CD16-CarT引入用西妥昔单抗或利妥昔单抗处理的EGFR或CD20荷瘤小鼠中，增强了免疫细胞靶向和ADCC杀伤，从而根除逃避性肿瘤(Rataj等人2019，Caratelli等人2017)。
FcγR基因对自身免疫性疾病的贡献已引起了广泛关注，并且据报道，功能性FcγR多态性在自身免疫性疾病的发病机制中起重要作用(Salmon等人2001，Morgan等人2003，Wu等人1997)。FcγR-敲除小鼠模型表明，激活性FcγR和抑制性FcγR两者均影响自身免疫性疾病的发生(Nabbe等人2003，Kleinau等人2000，Bolland等人2000)。FcγR表达的变化显著影响IgG免疫复合物介导的信号阈值。值得注意地，促炎细胞因子和抗炎细胞因子可以调节激活性FcγR和抑制性FcγR的表达水平，其影响对IgG免疫复合物的阈值免疫细胞反应(Pricop等人2001，Boruchov等人2005)。在台湾患者中，FCGR3A和FCGR3B拷贝数的变化与系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)有关(Chen等人2014)。高FCGR3A拷贝数被证明是SLE的风险因素。在SLE患者中，特别是在患有活动性疾病的那些患者中，观察到产生细胞因子的FcγRIIIA阳性树突状细胞(DC)的频率较高，表明DC中FcγRIIIA介导的炎性细胞因子产生可能有助于疾病发病机制(Henriques等人2012)。据认为，免疫细胞(NK细胞、单核细胞、DC、巨噬细胞和T细胞亚群)表面上较高密度的激活性FcγRIIIA可以使免疫反应的微妙平衡转向强烈的炎症，这可能导致SLE的发展(Chen等人2014)。已表明了NK细胞上低FCGR3A拷贝数与低CD16A表达之间的相关性，表明FCGR3A拷贝数对NK细胞功能具有生理意义。最重要地，FCGR3A缺乏与2种不同的自身免疫性疾病(SLE和RA)有关，表明FcγRIIIA功能缺陷可能是各种自身免疫性疾病的共同风险因素。疾病关联表明，调节FcγRIIIA功能可能是狼疮性肾炎的重要治疗靶点(Chen等人2014)。
治疗创新已为通过FcγR相互作用阻断自身免疫性疾病中的炎症的手段提供了一些希望。先前研究支持抑制FcγR作为抑制自身免疫性疾病中免疫复合物介导事件的治疗策略的潜力(Clarkson等人1986，Flaherty等人2012)。IgG Fc片段本身已在RA动物模型和患有血小板减少症(ITP)或川崎病的人中表现出良好的疗效(Anthony等人2008，DebréM等人1993，Hsu等人1993)。已显示多价Fc构建体会抑制血小板减少症和关节炎鼠类模型中的免疫复合物过程(Ortiz等人2016)。此外，输注可溶性FcγR3a和2a可以在鼠类狼疮模型中抑制免疫复合物触发的炎症(Li等人2014)。阻断NK细胞上的免疫复合物形成是探索减少炎症激活从而减少自身免疫性疾病的途径。
在一个实施方案中，一个或多个结合CD16a的双环肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
CiVGLEELGPCiiSDLCiii(SEQ ID NO：12)；
CiRWHFSEPCiiGAWCiii(SEQ ID NO：13)；和
CiRWSVEDPCiiGAWCiii(SEQ ID NO：14)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一、第二和第三半胱氨酸残基。
在进一步的实施方案中，分子支架是TBMT，并且一个或多个结合CD16a的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
A-(SEQ ID NO：12)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY13886)；
A-(SEQ ID NO：13)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY20361)；和
A-(SEQ ID NO：14)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY13883)；
或其药学上可接受的盐，其中PYA表示戊炔酸。
在一个实施方案中，异串联双环肽复合物包含一个(即单个)第二肽配体，其与存在于自然杀伤(NK)细胞上的成分结合。在进一步的实施方案中，单个第二肽配体是如本文所定义的结合NKp46的双环肽配体或如本文所定义的结合CD16a的双环肽。
在可选的实施方案中，异串联双环肽复合物包含两个第二肽配体，其与存在于自然杀伤(NK)细胞上的成分结合。在进一步的实施方案中，两个第二肽配体是：
两者均为如本文所定义的结合NKp46的双环肽配体；或
两者均为如本文所定义的结合CD16a的双环肽；或
一个为如本文所定义的结合NKp46的双环肽配体，一个为如本文所定义的结合CD16a的双环肽。
在仍进一步的实施方案中，当异串联双环肽复合物包含如本文所定义的两个结合NKp46的双环肽配体时，所述肽配体是相同的(即共享相同的肽序列)。
在仍进一步的实施方案中，当异串联双环肽复合物包含如本文所定义的两个结合CD16a的双环肽配体时，所述肽配体是相同的(即共享相同的肽序列)。
在可选的实施方案中，异串联双环肽复合物包含三个第二肽配体，其与自然杀伤(NK)细胞上存在的成分结合。在进一步的实施方案中，三个第二肽配体各自为如本文所定义的结合NKp46的双环肽配体。在仍进一步的实施方案中，如本文所定义的三个结合NKp46的双环肽配体是相同的(即共享相同的肽序列)。
接头
将理解的是，第一肽配体可以通过任何合适的接头与一个或多个第二肽配体缀合。通常，所述接头的设计将使得两个或更多个总双环肽以这样的方式呈现，即它们可以不受阻碍地与其各自的靶标结合，或者是单独结合，或者是同时与两个靶受体结合。另外，接头应当允许同时与两个靶标结合，同时保持靶细胞之间的适当距离，这将导致所需的功能结果。可以调节接头的特性以增加长度、刚性或溶解度以优化所需的功能结果。接头还可以设计成允许将多于一个双环连接至相同靶标。增加任一结合肽的化合价，可以用来增加异串联物(heterotandem)对靶细胞的亲和力，或可以有助于诱导靶受体之一或两者的寡聚化。
在一个实施方案中，接头是线性接头。不受理论束缚，据信，线性接头的优点是允许一端存在一个第一肽，另一端存在一个第二肽。
在进一步的实施方案中，线性接头选自：
在一个实施方案中，接头是支链接头。不受理论束缚，据信，支链接头的优点是允许一端存在一个第一肽，另一端存在两个或更多个第二肽。
在进一步的实施方案中，支链接头选自：
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在一个具体的实施方案中，支链接头是：
异串联复合物
在一个具体的实施方案中，第一肽配体包含结合EphA2的双环肽配体，其连接至TATA支架，一个或多个第二肽配体包含两个结合NKp46的双环肽配体，其连接至TATA支架，并且所述异串联复合物是表A1、表A2和表A3中列出的复合物：
表A1(EphA2:NKp46；1:1)
异串联双环肽复合物BCY17225由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过叠氮化物-PEG5-酸接头与一个NKp46特异性肽(BCY17224)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY18731由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过叠氮化物-PEG24-酸接头与一个NKp46特异性肽(BCY17224)连接，图示如下：
表A2(EphA2:NKp46；1:2)
异串联双环肽复合物BCY15664由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY15452)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY15923由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY15686)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY17226由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY17224)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY15924由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY15687)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY18042由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY18004)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY18048由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY17662)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY18049由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY18005)连接，图示如下：
表A3(EphA2:NKp46；1:3)
异串联双环肽复合物BCY21686由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过甲烷-N-(PEG5-酸)-三(MeOPr-酰胺-PEG4-叠氮化物)接头与三个NKp46特异性肽(全部为BCY17224)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY21687由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过甲烷-N-(PEG10-酸)-三(MeOPr-酰胺-PEG10-叠氮化物)接头与三个NKp46特异性肽(全部为BCY17224)连接，图示如下：
在一个具体的实施方案中，第一肽配体包含结合EphA2的双环肽配体，其连接至TATA支架，一个或多个第二肽配体包含两个结合CD16a的双环肽配体，其连接至TBMT支架，并且所述异串联复合物选自表B1中列出的复合物：
表B1(EphA2:CD16a；1:2)
异串联双环肽复合物BCY15911由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个CD16a特异性肽(两者均为BCY13886)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY20810由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(酸-PEG10)-N-双(PEG10-叠氮化物)接头与两个CD16a特异性肽(两者均为BCY20361)连接，图示如下：
在一个具体的实施方案中，第一肽配体包含结合EphA2的双环肽配体，其连接至TATA支架，两个第二肽配体包含连接至TATA支架的一个结合NKp46的双环肽配体和连接至TBMT支架的一个结合CD16a的双环肽配体，并且所述异串联复合物选自表C中列出的复合物：
表C(EphA2:NKp46:CD16a；1:1:1)
异串联双环肽复合物BCY17231由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(PEG3-酸)-N-(PEG3-叠氮化物)-N-(PEG3-NH-AcAz)接头与NKp46特异性肽(BCY17224)和CD16a特异性肽(BCY13883)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY17235由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过TCA-[Peg23]3接头与NKp46特异性肽(BCY17224)和CD16a特异性肽(BCY13883)连接，图示如下：
异串联双环肽复合物BCY20793由以下组成：EphA2特异性肽BCY9594通过N-(PEG3-酸)-N-(PEG3-叠氮化物)-N-(PEG3-NH-AcAz)接头与NKp46特异性肽(BCY17224)和CD16a特异性肽(BCY20361)连接，图示如下：
在一个具体的实施方案中，第一肽配体包含结合MT1的双环肽配体，其连接至TATA支架，一个或多个第二肽配体包含两个结合NKp46的双环肽配体，其连接至TATA支架，并且所述异串联复合物选自表D中列出的复合物：
表D(MT1:NKp46；1:2)
异串联双环肽复合物BCY18604由以下组成：MT1特异性肽BCY14320通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY17224)连接，图示如下：
在一个具体的实施方案中，第一肽配体包含结合PD-L1的双环肽配体，其连接至TATA支架，一个或多个第二肽配体包含两个结合NKp46的双环肽配体，其连接至TATA支架，并且所述异串联复合物选自表E中列出的复合物：
表E(PD-L1:NKp46；1:2)
异串联双环肽复合物BCY18603由以下组成：PD-L1特异性肽BCY11865通过N-(酸-PEG3)-N-双(PEG3-叠氮化物)接头与两个NKp46特异性肽(两者均为BCY17224)连接，图示如下：
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义，如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域。分子生物学、遗传学和生物化学方法使用标准技术(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(1999),第4版,JohnWiley&Sons,Inc.)，其通过引用并入本文。
术语
编号
当提及本发明的肽内的氨基酸残基位置时，由于其不变而从编号中省略了半胱氨酸残基(Ci、Cii和Ciii)，因此，本发明的肽内的氨基酸残基的编号如下提及：
-Ci-N1-L2-Q3-A4-P5-Cii-M6-Q7-T8-G9-K10-V11-Ciii-(SEQ ID NO：1)。
出于本说明的目的，假设所有双环肽均用TATA或TBMT环化并产生三取代的结构。用TATA或TBMT环化发生在第一、第二和第三反应性基团(即Ci、Cii、Ciii)上。
分子形式
双环核心序列的N-或C-末端延伸区添加于序列的左侧或右侧，以连字符分隔。例如，N-末端的βAla-Sar10-Ala尾巴将表示为：
βAla-Sar10-A-(SEQ ID NO：X)。
反向肽序列
根据Nair等人(2003)J Immunol 170(3),1362-1373中的公开，设想本文公开的肽序列也将以其逆-反形式使用。例如，该序列逆转(即N-末端变为C-末端，反之亦然)，其立体化学同样也逆转(即D-氨基酸变为L-氨基酸，反之亦然)。为避免疑义，除非另有说明，否则在本文中以其全名或以其氨基酸单字母或三字母代码提及氨基酸旨在表示L-氨基酸。如果这种氨基酸旨在表示D-氨基酸，则该氨基酸将在方括号内以小写d开头，例如[dA]、[dD]、[dE]、[dK]、[d1Nal]、[dNle]等。
肽配体的优点
多功能NK细胞接合物(engager)(NKCE)方法组合并增强了NK细胞免疫监视能力以及其细胞毒性功能。双特异性(BiKE)、三特异性(TRiKE)或四特异性杀伤接合物(TetraKE)是小的工程改造抗体分子，其设计为在效应子NK细胞和靶向肿瘤细胞之间建立联系(Felices等人2016，Moore等人2011)。重要地，mAb介导的NCR激活导致激活针对许多类型的靶细胞的NK细胞毒性。由特异性mAb诱导的交联引起强烈的NK细胞激活，导致增加细胞毒性和细胞因子产生。这些接合物含有抗CD16抗体，其将结合CD16以触发NK细胞的细胞毒性，并且含有对肿瘤细胞的抗体或抗原。BiKE的一个示例是CD16xCD33，其在体外增强针对CD33+HL60 AML细胞系的NK活性(Gleason等人2014)。TRiKE和TetraKE使用细胞因子白细胞介素15(IL-15)分子作为抗体之间的连接，表现出比BiKE更多的细胞毒性和炎性细胞因子的生成(Davis等人2017，Felices等人2019)。为了最大限度地提高NK抗肿瘤反应，Vivier小组最近显示了多功能NKCE的效力，所述多功能NKCE由以下组成：用于CD16结合的Fc片段，以及靶向激活性NK细胞受体NKp46和特定的肿瘤抗原(如CD19、CD20和EGFR)的两个抗体结构域(Gauthier等人2019)。该NKCE在体内模型中显示出增强的NK细胞浸润至肿瘤中并促进肿瘤清除，并进一步说明了与目前临床使用的抗体(如利妥昔单抗和西妥昔单抗)相比疗效增强。此外，利用NK细胞上多种刺激性受体(CD16和NKp46)的激活潜力，克服了抑制并实现了完全的NK细胞活性(BenShumel 2020，Tarzona 2020，Davis等人2017)。
本发明的某些双环肽具有许多有利的特性，其使得它们被认为是适合注射、吸入、经鼻、经眼、口服或局部施用的类药物分子。此类有利的特性包括：
-物种交叉反应性。这是临床前药效学和药代动力学评估的典型要求；
-蛋白酶稳定性。双环肽配体应当在大多数情况下表现出对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定的”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、细胞内蛋白酶等的稳定性。蛋白酶的稳定性应当在不同物种之间保持，使得可以在动物模型中开发双环肽先导候选物，并可以有把握地对人施用；
-理想的溶解度曲线。其是带电荷的和亲水的残基相对于疏水的残基和分子内/分子间氢键的比例的函数，其对于制剂和吸收目的很重要；和
-在循环中最佳的血浆半衰期。根据临床适应症和治疗方案，可能需要开发具有短的或长的体内暴露时间的双环肽，以管理慢性或急性疾病状态。最佳暴露时间将由持续暴露的要求(以获得最大治疗效率)与短的暴露时间的要求(以最小化持续暴露于药剂而引起的毒理学效应)来控制。
肽配体
如本文所指的，肽配体是指与分子支架共价结合的肽。通常，这样的肽包含两个或更多个能够与支架形成共价键的反应性基团(即半胱氨酸残基)，和在所述反应性基团之间对向(subtend)存在的序列，所述序列因为当肽与支架结合时形成环而被称为环序列。在当前情况下，肽包含至少三个反应性基团，其选自半胱氨酸、3-巯基丙酸和/或半胱胺，并且在支架上形成至少两个环。
反应性基团
本发明的分子支架可以通过多肽上的官能团或反应性基团与多肽结合。其通常由多肽聚合物中存在的特定氨基酸的侧链形成。此类反应性基团可以是半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链或N-末端胺基或任何其他合适的反应性基团，如青霉胺。合适的反应性基团的具体信息可以见于WO 2009/098450中。
天然氨基酸的反应性基团的示例是半胱氨酸的硫醇基、赖氨酸的氨基、天冬氨酸或谷氨酸的羧基、精氨酸的胍基、酪氨酸的酚基或丝氨酸的羟基。非天然氨基酸可以提供范围广泛的反应性基团，包括叠氮化物、酮羰基、炔烃、乙烯基或芳基卤基团。多肽末端的氨基和羧基也可以用作反应性基团以形成与分子支架/分子核心的共价键。
本发明的多肽含有至少三个反应性基团。所述多肽还可以含有四个或更多个反应性基团。所用的反应性基团越多，则在分子支架中可以形成越多的环。
在优选的实施方案中，生成具有三个反应性基团的多肽。所述多肽与具有三重旋转对称性的分子支架/分子核心的反应生成单一产物异构体。由于数种原因，单一产物异构体的生成是有利的。化合物文库的核酸仅编码多肽的一级序列，而不编码在多肽与分子核心反应后形成的分子的异构态。如果仅可以形成一种产物异构体，则清楚地定义了产物异构体的核酸排布。如果形成多种产物异构体，则核酸不能提供关于在筛选或选择过程中分离出的产物异构体的性质的信息。如果合成的是本发明文库的特定成员，则单一产物异构体的形成也是有利的。在这种情况下，多肽与分子支架的化学反应产生单一产物异构体而不是异构体的混合物。
在另一个实施方案中，生成具有四个反应性基团的多肽。所述多肽与具有四面体对称性的分子支架/分子核心的反应生成两种产物异构体。尽管所述两种不同的产物异构体由同一核酸编码，也可以通过化学合成两种异构体、分离这两种异构体并测试这两种异构体与靶配体的结合来确定分离出的异构体的异构性质。
在本发明的一个实施方案中，多肽的反应性基团中的至少一个与其余的反应性基团正交。正交反应性基团的使用允许将所述正交反应性基团引导至分子核心的特定位点。涉及正交反应性基团的连接策略可用于限制形成的产物异构体的数量。换言之，通过针对至少三个键中的一个或多个，选择独特或不同的反应性基团，以区别于至少三个键的其余部分所选择的那些反应性基团，可以有效地实现特定的键合顺序，或将所述多肽的特定反应性基团定向至分子支架上的特定位置。
在另一个实施方案中，本发明的多肽的反应性基团与分子接头反应，其中所述接头能够与分子支架反应，使得接头将以最终的键合状态插入分子支架和多肽之间。
在一些实施方案中，文库或多肽组的成员的氨基酸可以被任何天然或非天然氨基酸替换。排除在这些可交换的氨基酸之外的是具有用于使多肽交联至分子核心的官能团的那些氨基酸，使得仅环序列是可交换的。所述可交换的多肽序列具有随机序列、恒定序列或具有随机和恒定氨基酸的序列。具有反应性基团的氨基酸位于多肽内的确定位置，因为这些氨基酸的位置决定了环的大小。
在一个实施方案中，具有三个反应性基团的多肽具有序列(X)lY(X)mY(X)nY(X)o，其中Y表示具有反应性基团的氨基酸，X表示随机氨基酸，m和n是3至6之间的数，其定义了中间的多肽片段的长度，其可以相同或不同，l和o是0至20之间的数，其定义了侧翼的多肽片段的长度。
硫醇介导的缀合的替代方法可以用于通过共价相互作用使分子支架与肽连接。可选地，这些技术可以用于在根据本发明选择或分离后，将进一步的部分(如不同于分子支架的感兴趣的小分子)修饰或连接至多肽——在本实施方案中，然后显然所述连接不必是共价的并且可以包含非共价连接。这些方法可以代替硫醇介导的方法(或与其组合)，通过生产展示带有具有必需化学反应性基团的非天然氨基酸的蛋白质和肽的噬菌体，与带有互补反应性基团的小分子组合来使用，或在选择/分离阶段之后制备分子时，通过将非天然氨基酸掺入化学或重组合成的多肽来使用。进一步的具体信息可以见于WO 2009/098450或Heinis等人，Nat Chem Biol 2009,5(7),502-7。
在一个实施方案中，反应性基团选自半胱氨酸、3-巯基丙酸和/或半胱胺残基。
药学上可接受的盐
将理解的是，盐形式在本发明的范围内，并且提及肽配体包括所述配体的盐形式。
本发明的盐可以由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成，其通过常规化学方法如Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.Heinrich Stahl(编辑),Camille G.Wermuth(编辑),ISBN:3-90639-026-8,精装,388页,2002年8月中所述的方法来进行。通常地，可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与合适的碱或酸在水中或在有机溶剂中、或在两者的混合物中反应来制备此类盐。
可以用很多种酸(无机酸和有机酸两者)形成酸加成盐(单盐或二盐)。酸加成盐的示例包括与酸形成的单盐或二盐，所述酸选自乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸(例如L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑、樟脑磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、D-葡萄糖酸、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(例如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟基乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-L-苹果酸、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、鞣酸、(+)-L-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一碳烯酸和戊酸、以及酰化的氨基酸和阳离子交换树脂。
一组特别的盐由由以下形成的盐组成：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟基乙磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(methanesulfonic,mesylate)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡糖醛酸和乳糖酸。一种特别的盐是盐酸盐。另一种特别的盐是乙酸盐。
如果化合物是阴离子的，或具有可以是阴离子的官能团(例如-COOH可以是-COO-)，则可以与有机碱或无机碱形成盐，生成合适的阳离子。合适的无机阳离子的示例包括但不限于：碱金属离子，如Li+、Na+和K+；碱土金属阳离子，如Ca2+和Mg2+；和其他阳离子，如Al3+或Zn+。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和被取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +和NR4 +)。一些合适的被取代的铵离子的示例是那些衍生自以下的：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇、以及氨基酸如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的一个示例是N(CH3)4 +。
当本发明的化合物含有胺官能团时，其可以例如根据技术人员众所周知的方法与烷基化剂反应而形成季铵盐。此类季铵化合物在本发明的范围内。
修饰衍生物
将理解的是，本文所定义的肽配体的修饰衍生物在本发明的范围内。此类合适的修饰衍生物的示例包括选自以下的一种或多种修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基(如用一个或多个电子等排的或等电子的氨基酸替换一个或多个极性氨基酸残基；用其他非天然电子等排的或等电子的氨基酸替换一个或多个非极性氨基酸残基)；添加间隔子基团；用一个或多个抗氧化氨基酸残基替换一个或多个对氧化敏感的氨基酸残基；用丙氨酸替换一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体中一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键替换一个或多个肽键；肽骨架长度的修饰；用另一个化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，用合适的胺、硫醇、羧酸和酚反应性试剂修饰氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和酪氨酸)以官能化所述氨基酸，以及引入或替换引入适合于官能化的正交反应活性的氨基酸，例如带有叠氮基或炔基的氨基酸，其分别允许用带有炔基或叠氮基的部分进行官能化。
在一个实施方案中，修饰衍生物包含N-末端和/或C-末端修饰。在进一步的实施方案中，其中所述修饰衍生物包含使用合适的氨基反应性化学的N-末端修饰和/或使用合适的羧基反应性化学的C-末端修饰。在进一步的实施方案中，所述N-末端或C-末端修饰包括添加效应子基团，其包括但不限于细胞毒性剂、放射螯合剂或发色团。
在进一步的实施方案中，修饰衍生物包含N-末端修饰。在进一步的实施方案中，N-末端修饰包含N-末端乙酰基。在该实施方案中，在肽合成过程中，N-末端半胱氨酸基团(在本文中称为Ci的基团)被乙酸酐或其他合适的试剂封端，导致分子被N-末端乙酰化。该实施方案提供了去除氨基肽酶的潜在识别点的优点，并避免了双环肽降解的可能性。
在可选的实施方案中，N-末端修饰包括添加分子间隔子基团，其促进效应子基团的缀合和保持双环肽对其靶标的效力。
在进一步的实施方案中，修饰衍生物包含C-末端修饰。在进一步的实施方案中，C-末端修饰包含酰胺基。在该实施方案中，在肽合成过程中，C-末端半胱氨酸基团(在本文中称为Ciii的基团)被合成为酰胺，导致分子被C-末端酰胺化。该实施方案提供了去除羧肽酶的潜在识别点的优点，并降低了所述双环肽的蛋白水解降解的可能性。
在一个实施方案中，修饰衍生物包含用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。在该实施方案中，可以选择具有电子等排的/等电子的侧链的非天然氨基酸，其既不被降解蛋白酶识别，也不对靶标效力产生任何不利影响。
可选地，可以使用具有受约束的氨基酸侧链的非天然氨基酸，使得附近的肽键的蛋白水解在构象和空间上受到阻碍。特别地，其涉及脯氨酸类似物、大型侧链、C□-二取代的衍生物(例如氨基异丁酸(Aib))和环氨基酸，一个简单的衍生物是氨基-环丙基羧酸。
在一个实施方案中，修饰衍生物包含添加间隔子基团。在进一步的实施方案中，修饰衍生物包含在N-末端半胱氨酸(Ci)和/或C-末端半胱氨酸(Ciii)上添加间隔子基团。
在一个实施方案中，修饰衍生物包含用一个或多个抗氧化氨基酸残基替换一个或多个对氧化敏感的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，修饰衍生物包含用萘丙氨酸或丙氨酸残基替换色氨酸残基。该实施方案提供了改善所得双环肽配体的药物稳定性特征的优点。
在一个实施方案中，修饰衍生物包含用一个或多个疏水氨基酸残基替换一个或多个带电荷的氨基酸残基。在可选的实施方案中，修饰衍生物包含用一个或多个带电荷的氨基酸残基替换一个或多个疏水氨基酸残基。带电荷的与疏水的氨基酸残基的正确平衡是双环肽配体的重要特征。例如，疏水氨基酸残基影响血浆蛋白结合的程度，从而影响血浆中游离可利用部分的浓度，而带电荷的氨基酸残基(特别是精氨酸)可以影响肽与细胞表面磷脂膜的相互作用。两者组合可以影响肽药物的半衰期、分布容积和暴露，并且可以根据临床终点进行调整。另外，(如果所述肽药物已经皮下施用)带电荷的和疏水的氨基酸残基的正确组合和数量可以减少在注射部位的刺激。
在一个实施方案中，修饰衍生物包含用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基。该实施方案被认为通过空间位阻和通过D-氨基酸稳定β-转角构象的倾向来增加蛋白水解稳定性(Tugyi等人(2005),PNAS,102(2),413-418)。
在一个实施方案中，修饰衍生物包含去除任何氨基酸残基并用丙氨酸替换。该实施方案提供了去除潜在的蛋白水解进攻位点的优点。
应当指出的是，每个上述修饰用于有意地改善肽的效力或稳定性。通过修饰，可以通过以下机制进一步提高效力：
-并入利用疏水作用并导致较低的解离速率的疏水部分，使得实现更高的亲和力；
-并入利用长距离离子相互作用的带电基团，导致更快的结合速率和更高的亲和力(参见例如Schreiber等人,Rapid,electrostatically assisted association ofproteins(1996),Nature Struct.Biol.3,427-31)；和
-将附加的约束并入肽中，例如通过正确地约束氨基酸的侧链使得在靶标结合时熵的损失最小，通过限制骨架的扭转角使得在靶标结合时熵的损失最小，和出于相同的原因在分子中引入另外的环化。
(综述见Gentilucci等人,Curr.Pharmaceutical Design,(2010),16,3185-203和Nestor等人,Curr.Medicinal Chem(2009)16,4399-418)。
同位素变体
本发明包括所有药学上可接受的(放射性)同位素标记的本发明的肽配体，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常自然界中存在的原子质量或质量数的原子替换，和本发明的肽配体，其中连接金属螯合基团(称为“效应子”)，其能够持有相关的(放射性)同位素，和本发明的肽配体，其中某些官能团被相关的(放射性)同位素或同位素标记的官能团共价取代。
适用于包含在本发明的肽配体中的同位素的示例包括氢同位素，如2H(D)和3H(T)；碳同位素，如11C、13C和14C；氯同位素，如36Cl；氟同位素，如18F；碘同位素，如123I、125I和131I；氮同位素，如13N和15N；氧同位素，如15O、17O和18O；磷同位素，如32P；硫同位素，如35S；铜同位素，如64Cu；镓同位素，如67Ga或68Ga；钇同位素，如90Y；和镥同位素，如177Lu；和铋同位素，如213Bi。
本发明的某些同位素标记的肽配体，例如掺入放射性同位素的那些，可用于药物和/或底物的组织分布研究，和用于在临床上评估患病组织上存在和/或不存在粘连蛋白-4靶标。本发明的肽配体可以进一步具有有价值的诊断特性，即其可以用于检测或鉴定标记的化合物与其他分子、肽、蛋白质、酶或受体之间的复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用用标记剂标记的化合物，如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶)等。放射性同位素氚即3H(T)和碳-14即14C，由于其易于掺入和现成的检测方法而对于这一目的特别有用。
用更重的同位素如氘即2H(D)取代，可以由于更大的代谢稳定性而提供某些治疗优势，例如增加的体内半衰期或减少的剂量要求，因此在某些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素如11C、18F、15O和13N取代，可以用于正电子发射成像(PET)研究以检查靶标占有率。
通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例中描述的那些方法类似的方法，使用合适的同位素标记的试剂代替之前采用的非标记的试剂，来制备本发明的肽配体的同位素标记的化合物。
分子支架
分子支架描述于例如WO 2009/098450和在其中引用的参考文献中，特别是WO2004/077062和WO 2006/078161。
如前述文档中所提及的，分子支架可以是小分子，如有机小分子。
在一个实施方案中，分子支架可以是大分子。在一个实施方案中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。
在一个实施方案中，分子支架包含能够与多肽的官能团反应以形成共价键的反应性基团。
分子支架可以包含与肽形成键的化学基团，如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤和酰基卤。
本发明的分子支架含有允许本发明编码文库的多肽的官能团与分子支架形成共价键的化学基团。所述化学基团选自范围广泛的官能团，包括胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、叠氮化物、烷基卤和酰基卤。
可以用于分子支架以与半胱氨酸的硫醇基团反应的支架反应性基团是烷基卤(或者也称为卤代烃或卤代烷)。
示例包括溴甲基苯(以TBMB为例的支架反应性基团)或碘乙酰胺。用于选择性地将化合物与蛋白质中的半胱氨酸偶联的其他支架反应性基团是马来酰亚胺、含有α-不饱和羰基的化合物和含有α-卤甲基羰基的化合物。可以用作本发明的分子支架的马来酰亚胺的示例包括：三-(2-马来酰亚胺乙基)胺、三-(2-马来酰亚胺乙基)苯、三-(马来酰亚胺)苯。含有□□不饱和羰基的化合物的示例是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Angewandte Chemie,International Edition(2014),53(6),1602-1606)。含有α-卤甲基羰基化合物的示例是N,N',N”-(苯-1,3,5-三基)三(2-溴乙酰胺)。硒代半胱氨酸也是天然氨基酸，其与半胱氨酸具有相似的反应性并且可以用于相同的反应。因此，无论在何处提及半胱氨酸，除非上下文另有说明，否则通常可以接受取代硒代半胱氨酸。
在一个实施方案中，分子支架是1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(也称为三丙烯酰基六氢-s-三嗪(TATA))：
因此，在与本发明的双环肽在Ci、Cii和Ciii半胱氨酸残基上环化后，分子支架形成TATA的三取代的1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-1-酮衍生物，其具有以下结构：
其中*表示三个半胱氨酸残基的连接位点。
在一个替代实施方案中，所述分子支架是2,4,6-三(溴甲基)-s-三嗪(TBMT)：
因此，在与本发明的双环肽在Ci、Cii和Ciii半胱氨酸残基上环化后，分子支架形成TBMT的三取代的衍生物，其具有以下结构：
其中*表示三个半胱氨酸残基的连接位点。
合成
本发明的肽可以通过标准技术合成制备，然后与分子支架在体外反应。进行此过程时，可以使用标准化学方法。这使得能够快速大规模地制备可溶性材料，以用于进一步的下游实验或验证。可以使用如Timmerman等人(同上)中公开的常规化学方法来完成此类方法。
因此，本发明还涉及如本文所述选择的多肽或缀合物的制备，其中所述制备包括如下所述的任选的进一步的步骤。在一个实施方案中，这些步骤在通过化学合成制备的最终产物多肽/缀合物上进行。
制备缀合物或复合物时，目标多肽中的氨基酸残基可任选地被取代。
肽也可以延伸，以并入例如另一个环并因此引入多种特异性。
为了延伸肽，可以使用标准固相或溶液相化学方法，使用正交保护的赖氨酸(和类似物)在肽的N-末端或C-末端或环内简单地进行化学延伸。可以使用标准(生物)缀合技术来引入激活的或可激活的N-末端或C-末端。可选地，可以通过片段缩合或天然化学连接进行添加，例如(Dawson等人1994.Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation,Science 266:776-779)中所述的；或者可以通过酶进行添加，例如使用如(Chang等人，ProcNatl Acad Sci U S A.1994年12月20日；91(26):12544-8或Hikari等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters Volume 18,Issue 22,2008年11月15日,6000-6003页)中描述的变位酶(subtiligase)进行添加。
可选地，可以通过二硫键进行进一步缀合来延伸或修饰肽。这具有额外的优点，即允许第一肽和第二肽一旦在细胞的还原环境中即彼此解离。在这种情况下，可以在第一肽的化学合成过程中添加分子支架(例如TATA)以便与三个半胱氨酸基团反应；然后可以将进一步的半胱氨酸或硫醇附加至第一肽的N-末端或C-末端，使得该半胱氨酸或硫醇仅与第二肽的游离半胱氨酸或硫醇反应，形成二硫键连接的双环肽-肽缀合物。
类似的技术同等应用于两个双环且双特异性的大环的合成/偶联，潜在地产生四特异性分子。
此外，可以使用适当的化学方法，以相同的方式，在N-末端或C-末端或经由侧链进行偶联来添加其他官能团或效应子基团。在一个实施方案中，以不阻断任一实体活性的方式进行偶联。
药物组合物
根据本发明的一个进一步的方面，提供了一种药物组合物，其包含如本文所定义的肽配体，与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
一般地，本发明的肽配体将以纯化形式与药理学上合适的赋形剂或载体(carrier)一起使用。通常，这些赋形剂或载体包括水性或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和/或缓冲介质。肠胃外载剂(vehicle)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸林格氏液。如果需要使多肽复合物保持悬浮，则合适的生理学上可接受的佐剂可以选自增稠剂(如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐)。
静脉内载剂包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。也可以存在防腐剂和其他添加剂(如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)(Mack(1982),Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版)。
本发明的肽配体可以用作单独施用的组合物或与其他试剂联用。这些其他试剂可以包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物(如环孢霉素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素)。药物组合物可以包括各种细胞毒性试剂或其他试剂的“混合物(cocktail)”与本发明的蛋白质配体组合，或甚至与具有不同特异性的根据本发明选择的多肽组合，如使用不同靶标配体选择的多肽，无论其在施用前合并与否。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员通常已知的任何途径。为了治疗，可以根据标准技术将本发明的肽配体施用于任何患者。可以通过任何合适的方式进行施用，包括肠胃外、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、经由肺途径、或者适当地通过用导管直接输注进行施用。优选地，根据本发明的药物组合物将通过吸入施用。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和病症、其他药物的同时施用、禁忌症以及临床医生要考虑的其他参数。
可以将本发明的肽配体冻干用于储存，并在使用前在合适的载体中复溶。已经表明该技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和复溶技术。本领域技术人员将理解的是，冻干和复溶可以导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调节水平以进行补偿。
可以施用包含本发明的肽配体或其混合物的组合物以进行预防性和/或治疗性治疗。在某些治疗应用中，将足以完成选择的细胞群体的至少部分抑制(inhibition)、抑制(suppression)、调节、杀伤或一些其他可测量参数的量定义为“治疗有效剂量”。达到该剂量所需的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但一般为每千克体重0.005至5.0mg选择的肽配体，更常用的剂量为0.05至2.0mg/kg/剂。对于预防性应用，也可以以相似或稍低的剂量施用含有本发明的肽配体或其混合物的组合物。
含有根据本发明的肽配体的组合物可以用于预防和治疗环境，以协助哺乳动物中所选择的靶细胞群体的改变、失活、杀伤或去除。另外，本文所述的肽配体可以在体外(extracorporeally)或体外(in vitro)选择性地用于从异质细胞集合中杀伤、消耗或以其他方式有效地去除靶细胞群体。可以将来自哺乳动物的血液与选择的肽配体在体外组合，从而将不期望的细胞杀伤或以其他方式从血液中去除，用于根据标准技术返回至哺乳动物。
治疗用途
根据本发明的进一步的方面，提供了用于预防、抑制或治疗癌症的如本文所定义的异串联双环肽复合物。
可以治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应物)的示例包括但不限于：上皮起源的肿瘤(腺瘤和各种类型的癌，包括腺癌、鳞状癌、移行细胞癌和其他癌)如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食道癌、胃(胃部)癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、胰腺外分泌癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、颊腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、唾液腺癌、鼻腔癌和鼻旁窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤和附件癌(例如黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角膜棘皮瘤、增生性痣)；血液系统恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和血液系统癌前疾患以及边缘恶性肿瘤，包括淋巴系的血液系统恶性肿瘤和相关病症(例如急性淋巴细胞性白血病[ALL]、慢性淋巴细胞性白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤如弥漫性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤性[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、原因不明的单克隆免疫球蛋白增多症、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后的淋巴增生性疾患)和骨髓系的血液系统恶性肿瘤和相关病症(例如急性骨髓性白血病[AML]、慢性骨髓性白血病[CML]、慢性骨髓单核细胞性白血病[CMML]、高嗜酸性粒细胞增多症、骨髓增生性疾患如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病)；间充质起源的肿瘤，例如软组织、骨或软骨的肉瘤(如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因氏肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织细胞瘤和隆突性皮肤纤维肉瘤)；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体瘤、肾上腺瘤、胰岛细胞瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌瘤和甲状腺髓样癌)；眼部和附属器肿瘤(例如视网膜母细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；以及小儿和胚胎肿瘤(例如髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、维尔姆斯瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其他形式的综合征，其使患者容易患恶性肿瘤(例如着色性干皮病)。
在进一步的实施方案中，癌症选自造血系统恶性肿瘤，如选自：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性B淋巴细胞性白血病(B-CLL)、B和T急性淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)、急性骨髓性白血病(AML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)和慢性骨髓性白血病(CML)。
本文提及的术语“预防”涉及在诱导疾病之前施用保护性组合物。“抑制”是指在诱导事件之后但在疾病的临床表现之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状变得明显之后施用保护性组合物。
已有可以用于筛选肽配体在预防或治疗疾病中的有效性的动物模型系统。本发明促进动物模型系统的使用，其允许开发可以与人和动物靶标交叉反应的多肽配体，从而允许使用动物模型。
下面参考以下实施例进一步描述本发明。
实施例
通常，可以按照以下一般方法制备一些本发明的异串联双环肽复合物：
将所有溶剂脱气并用N2吹扫。将BP-23825(1.0eq)、HATU(1.2eq)和DIPEA(2.0eq)的DMF溶液混合5分钟，然后加入双环1(1.2eq.)。在40℃搅拌反应混合物16小时。然后将反应混合物减压浓缩以除去溶剂，并通过制备型HPLC纯化以得到中间体2。
将中间体2(1.0eq)和双环2(2.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1)中，然后加入CuSO4(1.0eq)、VcNa(4.0eq)和THPTA(2.0eq)。最后，加入0.2M NH4HCO3以调节pH至8。在N2气氛下、在40℃搅拌反应混合物16小时。直接通过制备型HPLC纯化反应混合物。
下面列出用该方法制备的异串联双环肽复合物：
下文提供了本发明的所选的异串联双环肽复合物的更详细的实验：
实施例1：中间体BP23825-BCY9594的合成
向化合物1(BP23825，60.0mg，96.2μmol，1.0eq)在DMF(3mL)中的混合物中加入DIEA(12.4mg，96.2μmol，16.8μL，1.0eq)和HATU(38.4mg，101μmol，1.05eq)并搅拌混合物5min。然后将BCY9594(243mg，101μmol，1.05eq)加入混合物中并用N2吹扫，然后在N2气氛下、在40℃搅拌16小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到一个具有所需m/z的主峰。通过制备型HPLC纯化反应混合物，得到白色固体状的BP23825-BCY9594(154mg，48.1μmol，50.0％产率，94.0％纯度)。计算MW：3006.48，观测m/z：1002.8([M+3H]3+),1504.4([M+2H]2+)。
实施例2：BCY15664的合成
将化合物1(20.0mg，6.65μmol，1.0eq.)、化合物2(30.0mg，13.97μmol，2.1eq.)和THPTA(2.9mg，6.65μmol，1.0eq.)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，1mL)中，所述t-BuOH/H2O经脱气并用N2吹扫。在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，16.6μL，1.0eq.)和Vc(4.7mg，26.61μmol，4.0eq.)。通过滴加0.2MNH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示BP23825-BCY9594完全消耗，并检测到一个具有所需m/z的主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC纯化粗产物，获得白色固体状的BCY15664(15.0mg，1.97μmol，29.6％产率，97.7％纯度)。计算MW：7317.3，观测m/z：1220.3([M+6H]6+),915.5([M+8H]8+)。
实施例3：BCY15911的合成
将化合物1(20.0mg，6.65μmol，1.0eq.)、化合物2(31.6mg，16.63μmol，2.5eq.)和THPTA(2.9mg，6.65μmol，1.0eq.)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，1mL)中，所述t-BuOH/H2O经脱气并用N2吹扫。在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，16.6μL，1.0eq.)和Vc(4.7mg，26.61μmol，4.0eq.)。将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示BP23825-BCY9594完全消耗，并检测到一个具有所需m/z的主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC纯化粗产物，获得白色固体状的BCY15911(10.4mg，1.50μmol，22.61％产率，94％纯度)。计算MW：6814.8，观测m/z：1364.0([M+5H]5+),1137.0([M+6H]6+)。
实施例4：BCY15923的合成
将化合物1(20.0mg，6.65μmol，1.0eq.)、化合物2(35.0mg，16.79μmol，2.5eq.)和THPTA(2.9mg，6.65μmol，1.0eq.)的混合物溶解于t-BuOH/0.2MNH4HCO3(1:1，1mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2气氛下加入CuSO4的水溶液(0.4M,16.6μL,1.0eq.)和抗坏血酸(4.69mg,26.61μmol,4eq.)。通过滴加0.2M NH4HCO3将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25℃搅拌反应混合物2小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到所需m/z(计算MW：7191.31，观测m/z：1439.3([M/5+H]+),1199.6([M/6+H]+))。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY15923(4mg，5.28e-1umol，7.94％产率，95％纯度)。
实施例5：BCY17226的合成
将化合物1(20.0mg，6.65μmol，1.0eq.)、化合物2(30.5mg，14.64μmol，2.2eq.)和THPTA(5.8mg，13.30μmol，2.0eq.)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，1.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2气氛下加入CuSO4的水溶液(0.4M，24.9μL，1.5eq.)和VcNa(4.0mg，19.96μmol，3.0eq.)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到含有所需m/z(计算MW：7169.18，观测m/z：1434.9([M/5+H]+),1195.9([M/6+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY17226(24.0mg，3.35μmol，50.32％产率，97.0％纯度)。
实施例6：BCY15924的合成
将化合物1(5mg，1.66μmol，1.0eq)、化合物2(6.97mg，3.33μmol，2.0eq)和THPTA(1.45mg，3.33μmol，2.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，6.24μL，1.5eq)和VcNa(988.40μg，4.99μmol，3.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：7195.55，观测m/z：1440.1([M/5+H]+),1200.2([M/6+H]+),1029.1([M/7+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY15924(3.4mg，4.52e-1μmol，27.16％产率，95.6％纯度)。
实施例7：BCY18042的合成
将化合物1(15mg，4.99μmol，1.0eq)、化合物2(28.08mg，10.48μmol，2.1eq)和THPTA(4.34mg，9.98μmol，2.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，18.71μL，1.5eq)和VcNa(2.97mg，14.97μmol，3.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：6999.35，观测m/z：1400.7([M/5+H]+),1167.6([M/6+H]+),1000.9([M/7+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY18042(3.9mg，5.15e-1μmol，10.32％产率，96.0％纯度)。
实施例8：BCY18048的合成
将化合物1(15mg，4.99μmol，1.0eq)、化合物2(21.99mg，10.48μmol，2.1eq)和THPTA(4.34mg，9.98μmol，2.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，25.0μL，2.0eq)和VcNa(2.97mg，14.97μmol，3.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：7203.30，观测m/z：1441.3([M/5+H]+),1201.3([M/6+H]+),901.7([M/8+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY18048(7.4mg，9.85e-1μmol，19.74％产率，97.4％纯度)。
实施例9：BCY18049的合成
将化合物1(15mg，4.99μmol，1.0eq)、化合物2(24.41mg，10.48μmol，2.1eq)和THPTA(4.34mg，9.98μmol，2.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，18.71μL，1.5eq)和VcNa(2.97mg，14.97μmol，3.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：7666.02，观测m/z：959.3([M/8+H]+),1096.2([M/7+H]+),1278.6([M/6+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY18049(10.6mg，1.37μmol，27.41％产率，98.9％纯度)。
实施例10：BCY18603的合成
中间体BP23825-BCY11865的制备
将化合物1(15.0mg，24.0μmol，1.0eq)、HATU(10.1mg，26.5μmol，1.1eq)和DIEA(9.3mg，72.1μmol，12.6μL，3.0eq)的混合物溶解于DMF(1.0mL)中。在25-30℃激活反应混合物6min，然后将化合物2(68.5mg，26.5μmol，1.1eq)加入反应混合物中。在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示检测到具有所需m/z(MW：3196.7，观测m/z：1066.6[M/3+H]+,800.2[M/4+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化可溶性粗产物。获得白色固体状的化合物3(BP23825-BCY11865，43.0mg，13.4μmol，55.8％产率，97.4％纯度)。
BCY18603的制备
将化合物3(15.0mg，4.69μmol，1.0eq)、化合物4(20.5mg，9.85μmol，2.1eq)和THPTA(2.0mg，4.69μmol，1.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，17.6μL，1.5eq)和VcNa(2.8mg，14.1umol，3.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：7359.3，观测m/z：1472.9[M/5+H]+,1227.5[M/6+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY18603(13.4mg，1.82umol，38.8％产率，97.8％纯度)。
实施例11：BCY18604的合成
中间体BP23825-BCY14320的制备
将化合物1(20.0mg，32.1μmol，1.0eq)、HATU(13.4mg，35.3μmol，1.1eq)和DIEA(12.4mg，96.2μmol，16.8μL,3.0eq)的混合物溶解于DMF(1.0mL)中。在25-30℃激活反应混合物6min，然后将化合物2(74.4mg，35.3μmol，1.1eq)加入反应混合物中。在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示检测到具有所需m/z(MW：2714.27，观测m/z：1358.1[M/2+H]+,905.9[M/3+H]+,679.5[M/4+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物。获得白色固体状的化合物3(BP23825-BCY14320，42.3mg，15.6μmol，48.5％产率，97.7％纯度)。
BCY18604的制备
将化合物3(15.0mg，5.53μmol，1.0eq)、化合物4(24.2mg，11.6umol，2.1eq)和THPTA(2.4mg，5.53μmol，1.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，20.7uL，1.5eq)和VcNa(3.3mg，16.6μmol，3.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：6876.9，观测m/z：1376.4[M/5+H]+,1147.3[M/6+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY18604(19.1mg，2.77μmol，50.0％产率,97.1％纯度)。
实施例12：BCY20810的合成
BP25635-BCY9594的制备
将化合物1(50.0mg，32.3μmol，1.0eq.)、HATU(14.7mg，38.7μmol，1.2eq)和DIEA(8.3mg，64.5μmol，11.2μL，2.0eq.)的混合物溶解于NMP(0.5mL)中。在25-30℃激活反应混合物5min，然后将化合物2(85.2mg，35.5μmol，1.1eq.)加入反应混合物中。在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示检测到具有所需m/z(MW：3931.5，观测m/z：1310.5[M/3+H]+,983.8[M/4+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化可溶性粗产物。获得白色固体状的化合物3(BP25635-BCY9594，34.6mg，8.80μmol，27.2％产率，96.8％纯度)。
BCY20810的制备
将化合物3(15.0mg，3.82μmol，1.0eq)、化合物4(15.6mg，7.63μmol，2.0eq)和THPTA(3.3mg，7.63μmol，2.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，0.3mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，14.3μL，1.5eq)和VcNa(2.3mg，11.4μmol，3.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：8028.3，观测m/z：1338.7[M/6+H]+,1147.7[M/7+H]+,1004.4[M/8+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化可溶性粗产物，获得白色固体状的BCY20810(3.0mg，3.73e-1μmol，9.76％产率，95.2％纯度)。
实施例13：BCY21686的合成
中间体BP25517-BCY9594的制备
将化合物1(10.0mg，7.19μmol，1.0eq.)、HATU(3.3mg，8.6μmol，1.2eq)和DIEA(2.8mg，21.6μmol，3.8uL，3.0eq.)的混合物溶解于NMP(0.5mL)中。在25-30℃激活反应混合物5min，然后将化合物2(19.0mg，7.91μmol，1.1eq)加入反应混合物中。在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示检测到具有所需m/z(计算MW：3773.3，观测m/z：1258.4[M/3+H]+,944.1[M/4+H]+,755.5[M/5+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物。获得白色固体状的化合物3(BP25517-BCY9594，9.5mg，2.52μmol，35.0％产率，95.3％纯度)。
BCY21686的制备
将化合物3(9.5mg，2.52μmol，1.0eq)、化合物4(15.7mg，7.55μmol，3.0eq)和THPTA(2.2mg，5.04μmol，2.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，0.3mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，12.6μL，2.0eq)和VcNa(2.0mg，10.0μmol，4.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：10017.3，观测m/z：1431.7[M/7+H]+,1252.9[M/8+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY21686(12.8mg，1.23μmol，48.8％产率，96.4％纯度)。
实施例14：BCY21687的合成
中间体BP25668-BCY9594的制备
将化合物1(15.0mg，6.24μmol，1.0eq)、HATU(2.8mg，7.49μmol，1.2eq)和DIEA(2.4mg，18.7μmol，3.3μL，3.0eq.)的混合物溶解于NMP(0.5mL)中。在25-30℃激活反应混合物5min，然后将化合物2(16.5mg，6.86μmol，1.1eq)加入反应混合物中。在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示检测到具有所需m/z(MW：4786.5，观测m/z：1197.4[M/4+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去未溶解的残余物。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物。获得白色固体状的化合物3(BP25668-BCY9594，13.6mg，2.84μmol，45.51％产率，95.5％纯度)。
BCY21687的制备
将化合物3(13.6mg，2.84μmol，1.0eq)、化合物4(17.3mg，8.32μmol，3.0eq)和THPTA(2.5mg，5.68μmol，2.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，0.3mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.9mg，5.68μL，2.0eq)和VcNa(2.2mg，11.37μmol，4.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：11030.5，观测m/z：1379.6[M/8+H]+,1226.5[M/9+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化可溶性粗产物，获得白色固体状的BCY21687(14.5mg，1.31μmol，46.1％产率，94.5％纯度)。
实施例15：BCY17231的合成
中间体BP24527-BCY9594的制备
将化合物1(100.0mg，143μmol，1.0eq.)、HATU(59.9mg，157.6μmol，1.1eq)和DIEA(55.56mg，429.9μmol，74.88uL，3.0eq.)的混合物溶解于DMF(5.0mL)中。在25-30℃激活反应混合物6min，然后将化合物2(378mg，157μmol，1.1eq.)加入反应混合物中。在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示检测到具有所需m/z(MW：3080.59，观测m/z：1027.9[(M/3+H]+,771.2[(M/4+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物。获得白色固体状的化合物3(BP24527-BCY9594，342mg，111.02μmol，77.4％产率，91.5％纯度)。
中间体BCY17230的制备
将化合物3(100.0mg，32.5μmol，1.0eq)、化合物4(74.3mg，35.7μmol，1.1eq)和THPTA(14.1mg，32.5μmol，1.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，4.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，81.1μL，2.0eq.)和VcNa(12.86mg，64.92μmol，2.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：5161.94，观测m/z：1291.6([M/4+H]+),1033.4([M/5+H]+),861.4([M/6+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的化合物5(BCY17230，65.0mg,12.1μmol,37.28％产率,96.1％纯度)。
中间体BCY17233的制备
向化合物5(65.0mg，12.1μmol,1.0eq)的DCM(0.80mL)溶液中加入TEA(0.2mL)。在25℃搅拌混合物0.5小时。LC-MS显示化合物5完全消耗，并检测到具有所需m/z(MW：5061.9，观测m/z：1266.1[M/4+H]+,1013.2[M/5+H]+,844.5[M/6+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物，然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化可溶性级分。获得白色固体状的化合物6(36.8mg，7.13μmol，56.64％产率，98.1％纯度)。
中间体BCY17234的制备
向化合物6(BCY17233，36.8mg，7.13μmol，1.0eq)和AcAz(1.73mg，8.72μmol，1.2eq)的DMF(1.0mL)溶液中加入DIEA(1.9mg，14.4μmol，2.5μL，2.0eq)。在25℃搅拌混合物0.5小时。LC-MS显示化合物6完全消耗，并检测到具有所需m/z(MW：5141.35，观测m/z：1029.8[M/5+H]+,1286.9[M/4+H]+)的一个主峰。过滤反应混合物，然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化可溶性级分。获得白色固体状的化合物7(BCY17231，25.0mg，4.65μmol，63.96％产率，95.7％纯度)。
BCY17231的制备
将化合物7(22mg，4.28μmol，1.0eq.)、BCY13883(9.31mg，4.70μmol，1.1eq)和THPTA(1.86mg，4.28μmol，1.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，10.69μL，1.0eq)和VcNa(1.69mg，8.55μmol，2.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物7完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：7123.1，观测m/z：1425.3([M/5+H]+),1188.0([M/6+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY17231(4.8mg，6.29e-1μmol，14.70％产率，93.2％纯度)。
实施例16：BCY20793的合成
将化合物1(17.4mg，3.38μmol，1.0eq)、BCY20361(7.61mg，3.72μmol，1.1eq)和THPTA(1.47mg，3.38μmol，1.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，8.46μL，1.0eq)和VcNa(1.34mg，6.76μmol，2.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：7193.2，观测m/z：1439.3([M/5+H]+),1199.7([M/6+H]+)))的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY20793(8.0mg，1.05μmol，30.96％产率，94.1％纯度)。
实施例17：BCY17235的合成
中间体COM00000116-BCY17224的制备
将COM00000116(50.0mg，13.8μmol，1.0eq.)、BCY17224(23.0mg，11.1μmol，0.8eq.)和THPTA(30.1mg，69.3μmol，5.0eq.)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，10mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，13.8μL，0.4eq.)和VcNa(54.8mg，277.1μmol，20.0eq.)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物3小时。LC-MS显示所需质量(计算MW：5690.6，观测m/z：1416.3[(M-28)/4+H]+)。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，但纯度不良。获得白色固体状的化合物3(COM00000116-BCY17224，43.9mg，53.1％纯度)。
中间体COM00000116-BCY17224-BCY15017的制备
将化合物3(COM00000116-BCY17224，29.8mg，5.24μmol，1.0eq.)、化合物4(BCY15017，13.0mg，5.24μmol，1.0eq.)和THPTA(4.5mg，10.5μmol，2.0eq.)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，1mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，13.1μL，1.0eq.)和VcNa(3.1mg，15.7μmol，3.0eq.)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示检测到所需m/z(计算MW：8171.45，观测m/z：1362.6([M/6+H]+),1168.3([M/7+H]+))。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的化合物5(COM00000116-BCY17224-BCY15017，8.7mg，1.06μmol，20.2％产率，78.7％纯度)。
BCY17235的制备
将化合物5(COM00000116-BCY17224-BCY15017，4.2mg，5.14e-1μmol，1.0eq.)、化合物6(BCY13883，1.0mg，5.14e-1μmol，1.0eq.)和THPTA(0.2mg，5.14e-1μmol，1.0eq.)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，0.2mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，1.3μL，1.0eq.)和VcNa(0.2mg，1.03μmol，2.0eq.)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示化合物5完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：10149.8，观测m/z：1269.3([M/8+H]+),1128.4([M/9+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化可溶性粗产物，获得白色固体状的BCY17235(1.8mg，1.77e-1μmol，34.4％产率，91.6％纯度)。
实施例18：BCY17225的合成
将化合物1(20mg，7.36μmol，1.0eq)、化合物2(BCY17224，16.85mg，8.09μmol，1.1eq)和THPTA(3.20mg，7.36μmol，1.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，1.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，18.4μL，1.0eq)和VcNa(2.92mg，14.72μmol，2.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物1完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：4799.47，观测m/z：961.0([M/5+H]+),1200.9([M/4+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY17225(19.5mg，3.88μmol，52.73％产率，95.5％纯度)。
实施例19：BCY18731的合成
中间体N3-PEG24-BCY9594的制备
将化合物1(17.45mg，13.75μmol，1.1eq)、DIEA(3.23mg，24.99μmol，4.35μL，2.0eq)的混合物溶解于DMF(1.0mL)中。在25-30℃激活反应混合物6min，然后将化合物2(30.0mg，12.50μmol，1.0eq)加入反应混合物中。在25-30℃搅拌反应混合物0.5小时。LC-MS显示化合物2完全消耗，并检测到具有所需m/z(MW：3555.1，观测m/z：1186.1[(M/3+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物。获得白色固体状的化合物3(N3-PEG24-BCY9594，23.8mg，6.69μmol，52.40％产率，97.8％纯度)。
BCY18731的制备
将化合物3(N3-PEG24-BCY9594，23.8mg，6.69μmol，1.0eq)、化合物4(BCY17224，15.33mg，7.36μmol，1.1eq)和THPTA(2.91mg，6.69μmol，1.0eq)的混合物溶解于t-BuOH/H2O(1:1，2.0mL，预脱气并用N2吹扫3次)中，然后在N2下加入CuSO4的水溶液(0.4M，16.74μL，1.0eq)和VcNa(2.65mg，13.39μmol，2.0eq)。通过滴加0.2M NH4HCO3(在1:1t-BuOH/H2O中)将该溶液的pH调节至8，溶液变为浅黄色。在N2气氛下、在25-30℃搅拌反应混合物1小时。LC-MS显示化合物3完全消耗，并检测到具有所需m/z(计算MW：5636.47，观测m/z：1410.0([M/5+H]+),1128.3([M/5+H]+),940.4([M/6+H]+))的一个主峰。过滤反应混合物以除去不溶性残余物。通过制备型HPLC(TFA条件)纯化粗产物，获得白色固体状的BCY18731(14.7mg，2.50μmol，37.4％产率，96.0％纯度)。
生物数据
1.脱颗粒测定
可以通过杀伤靶细胞的裂解性颗粒的免疫分泌，使肿瘤细胞被CD8+T细胞毒性和NK细胞识别和杀伤。该过程涉及免疫效应子细胞的颗粒膜与细胞质膜融合，导致CD107a(LAMP1)的表面暴露。CD107a的膜表达构成免疫细胞激活和细胞毒性脱颗粒的标志物。使用脱颗粒测定评估EphA2/NKp46或EphA2/CD16a异串联双环肽复合物对NK细胞的激活。
在实验当天，通过向RPMI-1640(GibcoTM 11875-093；含L-谷氨酰胺)补充10％热灭活胎牛血清(FBS；35-011-CV)、10mM HEPES(GibcoTM 15-630-080)和1％青霉素链霉素(CorningTM 30-002-CI)来制备培养基，本文称为工作培养基。在水浴中快速解冻先前从全血中分离的人外周血单个核细胞(PBMC)，并在10mL预加温的工作培养基中以500rpm洗涤一次5分钟。然后PBMC沉淀在工作培养基中重悬至5×106个细胞/mL的浓度，并在组织培养包被培养瓶(T-183；CELLTREAT Scientific 229351)中水平地静置过夜(12-18小时)。此外，使用胰蛋白酶/EDTA使表达肝配蛋白A型受体(EphA2)的人肺癌细胞系A549(/>CCL-185；根据制造商的建议使细胞生长并维持)从培养皿脱离，并在15mL预加温的工作培养基中以500rpm洗涤一次5分钟。然后在工作培养基中以1×105个细胞/mL的浓度重悬细胞沉淀。随后，将100μL细胞悬液接种在平底组织培养包被96孔板(Greiner/>655180)中，并静置过夜(12-18小时)。
孵育过夜后，将PBMC从培养瓶中取出，并在10mL预加温的工作培养基中以500rpm洗涤一次5分钟。随后使用阴性分离试剂盒(STEMCELL Technologies17955)，根据制造商的建议，从总PBMC群体中分离NK细胞。然后在工作培养基中以1×105个细胞/mL的浓度重悬NK细胞沉淀。随后，将100μL细胞悬液接种在含有A549过夜静置细胞的96孔板中。
在工作培养基中稀释异串联双环肽复合物并加入相应的细胞板中，建议起始浓度为300nM或5μM，滴定为1:4稀释系列，以进行12点连续稀释。此外，根据制造商的建议，还加入了蛋白转运抑制剂GolgiStopTM(BD Biosciences 554715)。然后在37℃、5％ CO2下孵育板4小时。然后在200μL 1×磷酸盐缓冲液(PBS；GibcoTM 10-010-023)中以500rpm洗涤样品一次5分钟。在200μL PBS中重悬细胞并转移至96孔V形底聚丙烯板(Greiner Bio-One651201)。然后以500rpm离心样品5分钟并弃去上清液。
制备用于流式细胞术的样品：Zombie AquaTM可固定活力染料(423102)制备为1:1000PBS稀释液，向每个孔中加入100μL活力染料，并在4℃避光孵育30分钟。随后，用100μL PBS以500rpm洗涤孔5分钟并弃去上清液。接下来，通过在25μL染色缓冲液(补充有2％ FBS的1×PBS)中稀释1.5μL FcX来制备人TruStain FcXTM封闭液(422302)。在室温(RT)避光孵育Fc封闭液(25μL/孔)10分钟。通过每100μL染色缓冲液稀释1.5μL以下抗体来制备抗体预混液(master mix)混合物：FITC抗人CD45(304038；克隆HI30)，Brilliant Violet 605TM抗人CD3(/>344836；克隆SK7)，PE/Cyanine7抗人CD56(/>362510；克隆5.1H11)，PE抗人NKp46(331908；克隆9E2)和Brilliant Violet 421TM抗人CD107a（/>328626；克隆H4A3)。在预混液混合物(100μL)中重悬细胞，并在4℃避光孵育30分钟。随后，在100μL染色缓冲液中以500rpm洗涤细胞3次5分钟并弃去上清液。重悬于200μL染色缓冲液中的细胞在4℃避光保存，直至通过BD FACSCelestaTM流式细胞仪读数，并在FlowJoTM中分析FCS文件。
表1和图1所示的数据说明了用BCY15664和BCY15911处理后NK细胞表面CD107a的剂量依赖性上调。非结合对照BCY15667和BCY15666没有引发高于基线的上调。
表1和图1所示的数据说明了用BCY15664和BCY15911处理后NK细胞表面CD107a的剂量依赖性且肿瘤抗原依赖性的上调。全部由D-氨基酸组成的EphA2和NKp46双环肽两者的非结合对照(BCY15667)没有引发高于基线的上调。此外，全部由D-氨基酸组成的仅EphA2双环肽的对照(BCY15666)(其因此能够与NKp46结合，但不能与EphA2结合)没有引发高于基线的上调。
表1：与NK细胞上CD107a表面表达相关的半最大有效浓度(EC50)表明脱颗粒
异串联复合物编号 EC50脱颗粒几何平均CD107a(nM)
BCY15664 0.88
BCY15911 99.82
BCY15667 N/A
BCY15666 N/A
2.NK细胞毒性测定
评估了异串联双环肽复合物在NK-肿瘤细胞系共培养物中的NK功能读数(细胞毒性和细胞因子分泌)。
使用阴性分离试剂盒(STEMCELLTM Technologies 17955)从纯化自全血的总PBMC群体中分离NK细胞。然后将NK细胞沉淀重悬于DMEM培养基(CorningTM 10-013-CV)中，该培养基具有10％热灭活胎牛血清(FBS；35-011-CV)、10mM HEPES(GibcoTM 15-630-080)和1％青霉素链霉素(CorningTM 30-002-CI)和50IU/mL人IL-2(Miltenyi/>130-097-748)，该细胞的浓度为4×105个细胞/mL。对于NK细胞毒性测定，将50μL(2×104个)细胞悬液接种在96孔板(/>Bio OneTM 655090)中，该96孔板含有在DMEM(GibcoTM 11875-093；具有L-谷氨酰胺)中的50μl(4×103个)HT1080-luc细胞(/>CCL-121-luc2)，该DMEM具有10％热灭活胎牛血清(FBS；/>35-011-CV)、10mM HEPES(GibcoTM 15-630-080)和1％青霉素链霉素(CorningTM 30-002-CI)。测试物品或抗体(/>hegfr-mab1)稀释于DMEM培养基(CorningTM 10-013-CV)中，该培养基具有10％热灭活胎牛血清(FBS；/>35-011-CV)、10mM HEPES(GibcoTM 15-630-080)和1％青霉素链霉素(CorningTM 30-002-CI)，并将测试物品或抗体加入相应的细胞板中(50μl)，建议起始浓度为10nM，滴定为1/5稀释系列，以进行8点连续稀释。然后在37℃、5％ CO2下孵育板24小时。孵育后，以250×g离心板5分钟并弃去100μl上清液。然后将样品与50μl Bright-GloTM荧光素酶测定系统(PromegaTM E2620)孵育10分钟。使用带有MARS数据分析软件TM的酶标仪读取在570nm激发时的发光。在GraphPad PrismTM 8.0.2中将数据拟合至四参数非线性回归以生成EC50值。
在该测定中测试本发明所选的异串联双环肽复合物，结果如图2至图4和图6至图10所示。
图2说明BCY17226引发剂量依赖性NK细胞反应以杀伤EphA2+ve HT1080-luc肿瘤细胞系。与不添加异串联双环肽复合物的NK:HT1080-luc共培养物相比，没有观察到非结合的异串联双环肽复合物(BCY15667)在肿瘤细胞杀伤方面增强的剂量依赖性作用。在测定中使用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(hegfr-mab1)作为NK诱导的细胞毒性的阳性参考对照。无NK-TICA(指“无异串联双环肽复合物”)的平均发光任意显示在0.00001pM处以供参考。使用GraphPad PrismTM 8.0.2使用四参数逻辑回归计算BCY17226的EC50＝6.1pM。
图3说明BCY15664和BCY15923引发剂量依赖性NK细胞反应以杀伤EphA2+veHT1080-luc肿瘤细胞系。与不添加异串联双环肽复合物的NK:HT1080-luc共培养物相比，没有观察到非结合的异串联双环肽复合物(BCY15667)在肿瘤细胞杀伤方面增强的剂量依赖性作用。在测定中使用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(hegfr-mab1)作为NK诱导的细胞毒性的阳性参考对照。无NK-TICA(指“无异串联双环肽复合物”)的平均发光任意显示在0.00001pM处以供参考。使用GraphPad PrismTM 8.0.2软件使用四参数逻辑回归计算BCY15664(NKp46表位1，EC50＝21pM)或BCY15923(NKp46表位2，EC50＝44pM)。
图4说明了结合肿瘤抗原的双环肽在异串联双环肽复合物构建体中的必要性，以引发增强的NK细胞毒性活性。与不添加异串联双环肽复合物的NK:HT1080-luc共培养物相比，没有观察到非结合EphA2/非结合NKp46的异串联双环肽复合物(BCY15667)在肿瘤细胞杀伤方面增强的剂量依赖性作用。与不添加异串联双环肽复合物的NK:HT1080-luc共培养物相比，没有观察到非结合EphA2/结合NKp46的异串联双环肽复合物(BCY15666)在肿瘤细胞杀伤方面增强的剂量依赖性作用。在测定中使用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(hegfr-mab1)作为NK诱导的细胞毒性的阳性参考对照。无NK-TICA(指“无异串联双环肽复合物”)的平均发光任意显示在0.001nM处以供参考。使用GraphPad PrismTM8.0.2使用四参数逻辑回归计算BCY15664的EC50＝16pM。
图6说明了NK-TICA构建体中双环(Bicycle)NKp46不同价时，增强的NK细胞毒性活性。与不添加NK-TICA的NK:HT1080-luc共培养物相比，观察到NK-TICA构建体在肿瘤细胞杀伤方面增强的剂量依赖性作用：BCY17225_01_02(EC50＝3.6pM)，BCY21686_01_01(EC50＝1.3pM)。未观察到非结合NK-TICA(BCY15667_01_01)在肿瘤细胞杀伤方面增强的剂量依赖性作用。在测定中使用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(hegfr-mab1)作为NK诱导的细胞毒性的阳性参考对照(EC50＝0.053pM)。无NK-TICA的平均发光任意显示在0.005pM处以供参考。使用GraphPad PrismTM 8.0.2使用四参数逻辑回归计算双环的EC50值。
图7说明了不同NK-TICA构建体间隔子长度时，增强的剂量依赖性NK细胞毒性活性。与不添加NK-TICA的NK:HT1080-luc共培养物相比，观察到NKp46双环NK-TICA构建体在肿瘤细胞杀伤方面增强的剂量依赖性作用：BCY18731_01_01(EC50＝18pM)，BCY17231_01_01(EC50＝21pM)和BCY17235_04_01(EC50＝14pM)。未观察到非结合NK-TICA(BCY15667_01_01)对NK细胞毒性的增强作用。在测定中使用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(hegfr-mab1，6.7nM)作为NK诱导的细胞毒性的阳性参考对照。无NK-TICA的平均发光任意显示在0.05pM处以供参考。使用GraphPad PrismTM 8.0.2使用四参数逻辑回归计算双环的EC50值。
图8说明了用CD16结合双环和NKp46结合双环NK-TICA构建体(BCY20793_01_01)处理的NK细胞的剂量依赖性肿瘤杀伤增强。对BCY20793_01_01观察到NK细胞的杀肿瘤活性(EC50＝6.5pM)。在测定中使用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(hegfr-mab1)作为NK诱导的细胞毒性的阳性参考对照(EC50＝0.45pM)。与不添加NK-TICA的NK:HT1080-luc共培养物相比，没有观察到非结合NK-TICA(BCY15667_01_01)在肿瘤细胞杀伤方面增强的剂量依赖性作用。无NK-TICA的平均发光任意显示在0.02pM处以供参考。使用GraphPadPrismTM 8.0.2使用四参数逻辑回归计算双环的EC50值。
图9说明NK-TICA中可选的结合NKp46的双环诱导HT1080-luc细胞的增强杀伤。与不添加NK-TICA的NK:HT1080-luc共培养物相比，对于结合NKp46的NK-TICA构建体BCY18049_01_01(EC50＝不稳定)、BCY18042_01_01(EC50＝不稳定)和BCY15924_01_01(EC50＝0.5nM)，增强HT1080-luc肿瘤细胞系的NK细胞毒性。与不添加NK-TICA的NK:HT1080-luc共培养物相比，BCY15667_01_01(非结合NK-TICA)没有活性。无NK-TICA的平均发光任意显示在0.001pM处以供参考。在测定中使用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(hegfr-mab1，6.7nM)作为NK诱导的细胞毒性的阳性参考对照。使用GraphPad PrismTM 8.0.2使用四参数逻辑回归计算EC50值。
图10说明了在结合NKp46的NK-TICA构建体中包含额外的结合肿瘤的双环臂的NK-TICA诱导HT1080-luc细胞的增强杀伤。与不添加NK-TICA的NK:HT1080-luc共培养物相比，结合PD-L1的双环NK-TICA构建体(BCY18603_01_01；EC50＝3.0pM)或结合MT1的双环NK-TICA构建体(BCY18604_01_01；EC50＝7.9pM)增强了HT1080-luc肿瘤细胞系的NK细胞毒性。与不添加NK-TICA的NK:HT1080-luc共培养物相比，非结合对照NK-TICA构建体(BCY15667_01_02)没有活性。无NK-TICA的平均发光任意显示在0.005pM处以供参考。在测定中使用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(hegfr-mab1)作为NK诱导的细胞毒性的阳性参考对照(EC50＝0.70pM)。使用GraphPad PrismTM 8.0.2使用四参数逻辑回归计算EC50值。
3.细胞因子分泌测定
评估了异串联双环肽复合物在NK-肿瘤细胞系共培养物中的NK功能读数(细胞毒性和细胞因子分泌)。
使用阴性分离试剂盒(STEMCELL17955)从纯化自全血的总PBMC群体中分离NK细胞。然后将NK细胞沉淀重悬于DMEM培养基(CorningTM 10-013-CV)中，该培养基具有10％热灭活胎牛血清(FBS；/>35-011-CV)、10mM HEPES(GibcoTM 15-630-080)和1％青霉素链霉素(CorningTM 30-002-CI)和50IU/mL人IL-2(Miltenyi/>130-097-748)，该细胞的浓度为4×105个细胞/mL。对于NK细胞的细胞因子分泌测定，将50μL细胞悬液中的2×105个NK细胞接种在96孔U形底板(Grenier Bio OneTM 650180)中，该96孔板含有在DMEM(GibcoTM 11875-093；具有L-谷氨酰胺)中的50μl(4×104个)HT1080-luc细胞(CCL-121-luc2)，该DMEM具有10％热灭活胎牛血清(FBS；/>35-011-CV)、10mM HEPES(GibcoTM 15-630-080)和1％青霉素链霉素(CorningTM 30-002-CI)。测试物品或抗体(/>hegfr-mab1)稀释于DMEM培养基(CorningTM 10-013-CV)中，该培养基具有10％热灭活胎牛血清(FBS；/>35-011-CV)、10mM HEPES(GibcoTM 15-630-080)和1％青霉素链霉素(CorningTM 30-002-Ci)，并将测试物品或抗体加入相应的细胞板中(50μl)，建议起始浓度为10nM，滴定为1/5稀释系列，以进行8点连续稀释。然后在37℃、5％ CO2下孵育板4小时。孵育后，以250×g离心板5分钟并收获100μl上清液。样品立即储存在-20℃或评估细胞因子水平。通过人IFN-γQuantikineTM ELISA试剂盒(R&DSystems DIF50C)或人TNF-αQuantikineTM ELISA试剂盒(R&D Systems DTA00D)在50μl收集的上清液中测量干扰素-γ或TNF-α水平。在/>酶标仪上取得波长450nm处的数据，并在/>酶标仪MARS数据分析TM软件中将数据拟合至四参数非线性回归，并使用GraphPad PrismTM8.0.2软件进行分析以量化为细胞因子水平。可选地，通过Luminex测定来测量由25ul收集的上清液测量TNF-α和IFN-γ细胞因子：人XL细胞因子发现预混试剂盒(R&D Systems，FCSTM18-05)、Luminex 200TM流式仪和xPONENTTM分析软件。
在该测定中测试本发明所选的异串联双环肽复合物，结果如图5、图11和图12所示。
图5表明在BCY17226或非结合的异串联双环肽复合物BCY15667的存在下，NK细胞与HT1080-luc肿瘤细胞系共培养。作为阳性对照，利用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(InvivoGen，hegfr-mab1)。通过ELISA(R&D Systems，DIF50C)测量释放的细胞因子(IFNγ)，应用CLARIOstarTM酶标仪和MARS数据分析TM软件中的四参数非线性回归。
图11说明当与HT1080-luc肿瘤细胞系共培养时，在不同NKp46双环价的2nM结合NKp46的双环NK-TICA构建体的存在下，NK细胞产生TNF-α和IFN-γ。与非结合的NK-TICA构建体(BCY15667_01_01)相比，通过添加BCY00017225_01_02、BCY21686_01_01、BCY21687_01_01，观察到来自NK细胞的细胞因子产生。利用具有ADCC功能的抗EGFR抗体(InvivoGen，hegfr-mab1)作为NK诱导的细胞因子的阳性参考对照(1.34nM)。通过Luminex测定来测量释放的细胞因子(IFN-γ和TNF-α)：人XL细胞因子发现预混试剂盒(R&D Systems，FCSTM18-05)，通过Luminex 200流式仪和xPONENT分析软件进行。
图12说明当与HT1080-luc肿瘤细胞系共培养时，在10nM带有结构修饰的结合NKp46的双环NK-TICA构建体的存在下，NK细胞分泌细胞因子。与用非结合NK-TICA(BCY15667_01_01或BCY15666_01_01)处理时无细胞因子产生相比，结合NKp46的双环NK-TICA(BCY18048_01_01)诱导IFN-γ和TNF-α的分泌。作为阳性对照，利用6.7nM的具有ADCC功能的抗EGFR抗体(InvivoGen，hegfr-mab1)。通过ELISA(R&D Systems，DIF50C，DTA00D)测量释放的细胞因子(IFN-γ和TNF-α)，应用CLARIOstar酶标仪和MARS数据分析软件中的四参数非线性回归。
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
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<220>
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<220>
<221> Xaa
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<400> 1
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
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<223> Xaa是HyP
<220>
<221> Xaa
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<223> Xaa是HArg
<400> 2
Cys Xaa Leu Val Asn Pro Leu Cys Leu His Pro Asp Trp Xaa Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成肽
<220>
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<222> (3)..(3)
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<220>
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<220>
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<223> Xaa是HArg
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (3)..(3)
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<400> 5
Cys Tyr Xaa Pro Asp Tyr Leu Cys Ala Asp Glu Tyr Cys
1 5 10
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Cys Tyr Leu Pro Asp Tyr Leu Cys Gly Asp Glu Tyr Cys
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
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Cys Asp Leu Thr Thr His Asn Cys Gln Trp Gly Ile Cys
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<211> 14
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Cys Asn Leu Gln Ala Pro Cys Met Gln Thr Gly Lys Val Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Xaa
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是dK(PYA)
<400> 10
Cys Tyr Leu Pro Asp Tyr Leu Cys Xaa Asp Glu Tyr Cys
1 5 10
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
Cys Leu Leu His Asp His Cys Pro Asn Thr His Pro Lys Leu Cys
1 5 10 15
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Cys Val Gly Leu Glu Glu Leu Gly Pro Cys Ser Asp Leu Cys
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Cys Arg Trp His Phe Ser Glu Pro Cys Gly Ala Trp Cys
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Cys Arg Trp Ser Val Glu Asp Pro Cys Gly Ala Trp Cys
1 5 10

Claims (17)

1.一种异串联双环肽复合物，其包含：
(a)第一肽配体，其结合存在于癌细胞上的成分；通过接头与以下缀合
(b)一个或多个第二肽配体，其结合存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分；
其中，每个所述肽配体包含多肽和分子支架，所述多肽包含被至少两个环序列隔开的至少三个反应性基团，并且所述分子支架与所述多肽的反应性基团形成共价键，使得在分子支架上形成至少两个多肽环。
2.如权利要求1所定义的异串联双环肽复合物，其中所述反应性基团为半胱氨酸残基。
3.如权利要求1或2所定义的异串联双环肽复合物，其中所述存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分是存在于NK细胞表面的天然细胞毒性受体，如NKp30、NKp44和NKp46，特别是NKp46，如其中所述一个或多个第二肽配体包含一个或多个结合NKp46的双环肽配体。
4.如权利要求3所定义的异串联双环肽复合物，其中所述一个或多个结合NKp46的双环肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
CiY[Cba]PDYLCii[dA]DEYCiii(SEQ ID NO：5)；
CiYLPDYLCiiGDEYCiii(SEQ ID NO：6)；
CiDLTTHNCiiQWGICiii(SEQ ID NO：7)；
CiNLQAPCiiMQTGKVCiii(SEQ ID NO：8)；
CiNLQNPCiiMKFPCiii(SEQ ID NO：9)；
CiYLPDYLCii[dK(PYA)]DEYCiii(SEQ ID NO：10)；和
CiLLHDHCiiPNTHPKLCiii(SEQ ID NO：11)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一、第二和第三半胱氨酸残基，其中Cba表示β-环丁基丙氨酸，dA表示D-丙氨酸，PYA表示戊炔酸，特别是：
其中所述分子支架是TATA，并且所述一个或多个结合NKp46的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
Ac-(SEQ ID NO：5)-[K(PYA)](在本文中称为BCY17224)；
A-(SEQ ID NO：6)-A-[dK(PYA)](在本文中称为BCY15452)；
A-(SEQ ID NO：7)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY15686)；
A-(SEQ ID NO：8)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY15687)；
A-(SEQ ID NO：9)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY18004)；
A-(SEQ ID NO：10)-A(在本文中称为BCY17662)；和
A-(SEQ ID NO：11)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY18005)；
或其药学上可接受的盐，其中PYA表示戊炔酸。
5.如权利要求1或2所定义的异串联双环肽复合物，其中所述存在于自然杀伤(NK)细胞上的一种或多种成分是存在于NK细胞表面的Fc受体，如低亲和力Fcγ受体(FcγR)，其选自FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA和FcγRIIIB，特别是FcγRIIIA(也称为CD16a)，如其中所述一个或多个第二肽配体包含一个或多个结合CD16a的双环肽配体。
6.如权利要求5所定义的异串联双环肽复合物，其中所述一个或多个结合CD16a的双环肽配体包含选自以下的氨基酸序列：
CiVGLEELGPCiiSDLCiii(SEQ ID NO：12)；
CiRWHFSEPCiiGAWCiii(SEQ ID NO：13)；和
CiRWSVEDPCiiGAWCiii(SEQ ID NO：14)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一、第二和第三半胱氨酸残基，特别是：
其中所述分子支架是TBMT，并且所述一个或多个结合CD16a的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
A-(SEQ ID NO：12)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY13886)；
A-(SEQ ID NO：13)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY20361)；和
A-(SEQ ID NO：14)-A-[K(PYA)](在本文中称为BCY13883)；
或其药学上可接受的盐，其中PYA表示戊炔酸。
7.如权利要求1至6中任一项所定义的异串联双环肽复合物，其中所述癌细胞选自HT1080、A549、SC-OV-3、PC3、HT1376、NCI-H292、LnCap、MC38、MC38#13、4T1-D02、H322、HT29、T47D和RKO肿瘤细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所定义的异串联双环肽复合物，其中所述存在于癌细胞上的成分是EphA2，如其中所述第一肽包含结合EphA2的双环肽配体。
9.如权利要求8所定义的异串联双环肽复合物，其中所述结合EphA2的双环肽配体包含以下氨基酸序列：
Ci[HyP]LVNPLCiiLHP[dD]W[HArg]Ciii(SEQ ID NO：2)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii表示第一(i)、第二(ii)和第三(iii)反应性基团，HyP表示反式-4-羟基-L-脯氨酸，HArg表示高精氨酸，特别是：
其中所述分子支架是TATA，并且所述结合EphA2的双环肽配体任选地包含N-末端修饰，并包含：
A-[HArg]-D-(SEQ ID NO：2)(在本文中称为BCY9594)；
或其药学上可接受的盐，其中HArg表示高精氨酸。
10.如权利要求1至7中任一项所定义的异串联双环肽复合物，其中所述存在于癌细胞上的成分是PD-L1，如其中所述第一肽包含结合PD-L1的双环肽配体。
11.如权利要求10所定义的异串联双环肽复合物，其中所述结合PD-L1的双环肽配体包含以下氨基酸序列：
CiSAGWLTMCiiQKLHLCiii(SEQ ID NO：3)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一(i)、第二(ii)和第三(iii)半胱氨酸残基，特别是：
其中所述分子支架是TATA，并且所述结合PD-L1的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
Ac-D-[Harg]-(SEQ ID NO：3)-PSH(在本文中称为BCY11865)；
或其药学上可接受的盐，其中Harg表示高精氨酸。
12.如权利要求1至7中任一项所定义的异串联双环肽复合物，其中所述存在于癌细胞上的成分是MT1，如其中所述第一肽包含结合MT1的双环肽配体。
13.如权利要求12所定义的异串联双环肽复合物，其中所述结合MT1的双环肽配体包含以下氨基酸序列：
CiV[Harg]ECiiA[tBuAla]LFP[Harg]TCiii(SEQ ID NO：4)；
或其药学上可接受的盐，其中Ci、Cii和Ciii分别表示第一(i)、第二(ii)和第三(iii)半胱氨酸残基，特别是：
其中所述分子支架是TATA，并且所述结合MT1的双环肽配体任选地包含N-末端和/或C-末端修饰，并包含：
LPP-(SEQ ID NO：4)(在本文中称为BCY14320)；
或其药学上可接受的盐。
14.如权利要求1至13中任一项所定义的异串联双环肽复合物，其是表A1、表A2、表A3、表B1、表C、表D和表E中列出的复合物中的任一种。
15.如权利要求1至14中任一项所定义的异串联双环肽复合物，其中所述药学上可接受的盐选自游离酸或钠、钾、钙、铵盐。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1至15中任一项所述的异串联双环肽复合物，与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。
17.权利要求1至15中任一项所定义的异串联双环肽复合物或权利要求16所定义的药物组合物，其用于预防、抑制或治疗癌症的用途。
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