JP2017521677A - タンパク質高次構造を比較するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、2014年5月21日に出願した米国仮特許出願第62/001,303号明細書の利益を主張するものである。
質量分析法は、タンパク質解析のためにアミノ酸レベルの分解能を提供でき;大型タンパク質、立体構造的柔軟性が高いタンパク質にも対応でき、同位体標識の組込みを必要とせず、また、小さな試料サイズを用いて実施できるため、タンパク質HOS解析のための強力な方法として台頭しつつある。
生物製剤薬物(biologics drugs)の使用の増加に伴い、タンパク質のHOSを高分解能で精査することができる解析方法を開発することへの関心が高まってきている。H/D交換およびHFRなどの質量分析法に基づく方法が、この目的のために調査されている。しかし、H/D交換、HRF、架橋、およびアミノ酸特異的共有結合標識は、タンパク質表面構造解析、タンパク質−リガンド複合体解析、およびタンパク質−タンパク質複合体解析において有効性を示しているが、あるタンパク質の全体的HOSを参照と比較する低コストの信頼性が高い方法が、依然として必要とされている。既存の方法には、特に、タンパク質のHOSが不変のままであるという保証が必要とされる状況において(例えば、製造工程の変更を検討する場合、輸送条件がタンパク質HOSに与える潜在的影響を評価する場合、またはバイオシミラーを評価する場合)、依然として制限がある。アミノ酸特異的共有結合標識は、特定のアミノ酸残基の立体構造研究のために使用されており、立体構造的変化を検出できるが、標識できる残基の数が少ないことが妨げとなって、この方法は、高分解能のタンパク質HOS研究を実現する(generating)単独手段として使用されていない。実際に、最近の研究は、アミノ酸特異的共有結合標識は単独の方法として十分ではなく、H/D交換またはHFRなどの高分解能方法の補完物としてのみ使用されるべきであると主張している。タンパク質治療物質のHOS解析のための既存の方法を評価または考察する他の報告は、H/D交換、HRF、または架橋など他の方法を含む考察において、アミノ酸特異的共有結合標識に言及していない。(Zhang, Shen, Rempel, Monsey, Vidavsky, Gross, and Bose Molecular and Cellular Proteomics, 2011, 10, M110.005678-1 to 16);(Gau, Garai, Frieden, and Gross Biochemistry, 2011, 50, 8117-8126);(Kaur, Kiselar, Shi, Deperalta, Wecksler, Gokulrangan, Ling, and Chance mAbs, 2014, 606, 1486-1499);(Shang, Cui, and Gross FEBS Letters, 2014, 588, 308-317);(Konermann, Vahidi, and Sowole Analytical Chemistry, 2014, 86, 213-232);(Berkowitz, Engen, Mazzeo, and Jones Nature Reviews: Drug Discovery, 2012, 11, 527-540)。
〔実施例〕
β−2−ミクログロブリンを、熱分解条件のために75℃で30分間または1日、インキュベートした。また、還元剤の存在下で、加熱実験も行い、この場合、タンパク質を加熱した後に、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を添加した。酸化条件は、3%H2O2または10%H2O2(w/w)の存在下で、室温で1日、タンパク質をインキュベートすることによって、実行した。強制分解条件の後、これらのタンパク質をDEPCと反応させた。DEPCの保存溶液は、アセトニトリル中で調製した。タンパク質のDEPC反応は、37℃で1分間実施し、DEPCを2.5のモル過剰で添加することによって開始した。実験の合計反応体積は100μLであり、添加したアセトニトリルの総量は1%であった。10mMイミダゾールを添加することによって、1分後に反応を停止させた(14)。タンパク質分解消化の前に、10,000MWCOフィルターを用いて、修飾されたタンパク質を精製した。β2mはジスルフィド結合を有しているため、TCEP(タンパク質:TCEP=1:40のモル比)を添加してジスルフィド結合を還元し、ヨードアセトアミドを暗所、室温で30分間、同時に添加して、還元されたCys残基をアルキル化した。得られた試料を、固定したキモトリプシン(1:10の酵素/基質比)を用いて37℃で消化する前に、50℃で45分間、10%(体積/体積)アセトニトリルと共にインキュベートした。2時間後、相対遠心力9000で2分間、反応混合物を遠心分離して、タンパク質から酵素を分離させた。その後、LC−MSによって試料を直ちに解析した。図1〜5は、β−2−ミクログロブリンのDEPC標識に関する熱分解研究、酸化的分解研究、および還元分解研究の結果を示す。
EPOを50℃で2時間の熱分解に供した。試料は、β−2−ミクログロブリンについて説明したのと同じ方法で処理した。次に図3に言及すると、標識された残基の標識率(%)を2つの条件について示している。各残基について、未変性条件を一番左の棒に示し、熱分解条件を一番右の棒に示している。図3は、熱分解条件が、未変性条件と比べた場合に、特定のアミノ酸の修飾率(%)に変化を引き起こしたことを示している。例えば、熱分解処理により、EPOの残基(116)の修飾率(%)は約62%から約75%の修飾まで上昇した。
熱変性:IgG1を、未変性の状態で、または75℃で15分間インキュベートした後に、解析した。
前述した実施例のβ−2−ミクログロブリン試料を、タンパク質凝集と相関があるDEPC標識パターンについて解析した。標識する前に還元剤(TCEP)を添加してタンパク質構造をさらに分解させること以外は、先に説明した熱分解研究を繰り返すことによって、追加のβ−2−ミクログロブリン分解試料を生成した。その後のステップはすべて、β−2−ミクログロブリンについて前述した方法と同一であった。次に図7に言及すると、残基11、13、67、および68の標識率(%)を、条件が厳しくなる順に示している。図では、未変性条件を一番左の棒によって示し、30分間の加熱を左から2番目の棒によって示し、30分間の加熱/還元を左から3番目の棒によって示し、1日の加熱を左から4番目の棒によって示し、3%HOOHへの曝露を左から5番目の棒によって示し、10%HOOHへの曝露を左から6番目の棒によって示し、1日の加熱/還元を左から7番目の棒によって示している。さらに図7に言及すると、残基11および13の調査は、厳しい条件が使用されるにつれて、標識率(%)の低下を示しているのに対し、残基67および68は、条件が厳しくなると共に、標識率(%)の上昇を示している。次に図8に言及すると、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)データを用いて、凝集物のレベルを測定することができ、10分より前に溶出するピークはβ−2−ミクログロブリン凝集物に対応するのに対し、10.5分でのピークは、β−2−ミクログロブリン単量体に対応する。SECデータの考察により、75℃で1日経過後に採取した試料中の凝集物の存在、および10%過酸化水素への曝露後に採取した試料における凝集物の増加が実証されている(図9)。これらの残基のいずれかの標識率(%)の観察は、タンパク質凝集物の発生および増大の指標として使用され得る。
Claims (26)
- タンパク質の高次構造の変化を検出するための方法であって、
所定の一連の条件下で、参照タンパク質を第1の化合物で処理するステップであって、 共有結合によって標識された参照タンパク質をもたらす、ステップと;
前記所定の一連の条件下で、標的タンパク質を前記第1の化合物と接触させるステップであって、共有結合によって標識された標的タンパク質をもたらす、ステップと
を含み、ここで、前記参照タンパク質および前記標的タンパク質は、同一の一次構造を有し;
前記共有結合によって標識された標的タンパク質および前記共有結合によって標識された参照タンパク質を質量分析法によって解析するステップと
を含む、前記方法。 - 前記共有結合によって標識された参照タンパク質および前記共有結合によって標識された標的タンパク質の前記解析の結果を比較するステップと;
前記比較するステップにおいて差異がある場合に、前記参照タンパク質と前記標的タンパク質の高次構造に差異があると結論を下すステップと
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記参照タンパク質および前記標的タンパク質が、システイン、ヒスチジン、リジン、チロシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、抗体、酵素、リガンド、または調節因子からなるタンパク質の群から選択される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記参照タンパク質が、前記標的タンパク質と同じ処理ステップまたは同じ製造ステップにさらされていない、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記参照タンパク質を安定させるように設計された懸濁緩衝液中または凍結乾燥形態で、前記参照タンパク質が前記懸濁緩衝液中または凍結乾燥形態で保存された時間よりも長い期間、前記標的タンパク質が保存されている、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、リン酸、アミノ酸、無機塩類、界面活性剤、金属キレート剤、ポリマー、不活性タンパク質、および保存剤を含む試薬の群から選択される少なくとも1種の試薬を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、約3.5から約7.5の間、約4.5から約6.5の間、および約5.5から約7.3の間からなる群から選択される少なくとも1つのpH範囲にあるpHを有する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、ヒスチジン、アルギニン、グリシン、メチオニン、プロリン、リジン、グルタミン酸、アラニン、およびアルギニン混合物からなる群から選択されるアミノ酸の内の少なくとも1つを含む、請求項6〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、および塩化マグネシウムからなる群から選択される無機塩類の内の少なくとも1つを含む、請求項6〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、ポリソルベート、SDS、Brij35、およびトリトンX−10からなる群から選択される界面活性剤の内の少なくとも1つを含む、請求項6〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、金属キレート剤としてEDTAを含む、請求項6〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、ポリエチレングリコール(PEG)および多糖からなる群から選択されるポリマーの内の少なくとも1つを含む、請求項6〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、デキストラン、ヒドロキシルエチルデンプン(HETA)、PEG−4000、およびゼラチンからなる群から選択される不活性タンパク質の内の少なくとも1つを含む、請求項6〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記懸濁緩衝液が、ベンジルアルコール、m−クレゾール、およびフェノールからなる群から選択される保存剤の内の少なくとも1つを含む、請求項6〜14のいずれかに記載の方法。
- 前記参照タンパク質および前記標的タンパク質を標識するのに使用される前記化合物がピロ炭酸ジエチル(diethyl pyrocarbonate)である、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 前記標識されるタンパク質が、分子量が少なくとも5kDaであるタンパク質である、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- 前記標識されるタンパク質が、分子量が少なくとも12kDaであるタンパク質である、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- 前記標識されるタンパク質が、治療用タンパク質である、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記標識されるタンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記接触させるステップにおける前記タンパク質の濃度および/または共有結合標識モディファイヤー(modifier)の濃度の関数として、前記標的タンパク質中の標識される前記アミノ酸の割合を決定するステップ
をさらに含む、請求項1〜20のいずれかに記載の方法。 - 前記標的タンパク質中の、前記化合物によって修飾される前記アミノ酸の前記割合が、前記標的タンパク質および前記化合物が互いに接触している時間の関数として決定される、請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- アッセイにおける前記タンパク質の1つまたは複数が、部分的な分解または変性を受けている、請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
- タンパク質凝集物の発生および増大が、1つまたは複数のアミノ酸における標識率(%)に基づいて観察され、標識率(%)は凝集と相関している、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
- タンパク質のHOSを比較するための手段であって、
参照タンパク質を共有結合標識で標識して、標識された参照タンパク質を形成させるステップと;
標的タンパク質を、共有結合によって標識された参照タンパク質を形成させるための共有結合標識でタグ化して、標識された標的タンパク質を形成させるステップと
を含み、ここで、前記参照タンパク質と前記標的タンパク質の両方とも、前記タンパク質を共有結合によって標識する少なくとも1つの試薬で処理され;
前記標識された参照タンパク質と前記標識された標的タンパク質の両方を、同じ質量分析法を用いて解析するステップと;
前記標識された参照タンパク質および標識された標的タンパク質の質量スペクトルを互いに比較するステップとを含み、
ここで、前記参照タンパク質および前記標的タンパク質は互いに実質的に類似しているものである、
前記手段。 - 前記参照タンパク質および前記標的タンパク質を共有結合によって標識する前記試薬がピロ炭酸ジエチル(diethyl pyrocarbonate)である、請求項25に記載の手段。
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