JP2022513043A - 操作されたｃｄ２５ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
少なくとも１つの拘束がＣＤ２５参照標的に由来する空間的に関連するトポロジー的拘束の組み合わせを含む操作されたポリペプチド、およびこの操作されたポリペプチドを選択する方法が、本明細書で提供される。抗体などの結合分子のライブラリーをスクリーニングする方法において、陽性および／または陰性選択分子などを含む、操作されたポリペプチドを使用する方法が、さらに提供される。これらの操作されたポリペプチドを使用して選択されたＣＤ２５抗体が、本明細書でさらに提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月１８日出願の米国仮特許出願第６２／９０２，３３４号；および２０１８年１１月１４日出願の米国仮特許出願第６２／７６７，４３１号の利益を主張し、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月１８日出願の米国仮特許出願第６２／９０２，３３４号；および２０１８年１１月１４日出願の米国仮特許出願第６２／７６７，４３１号の利益を主張し、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＤ２５タンパク質は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）受容体のアルファ鎖であり、調節性Ｔ細胞および活性化されたＴ細胞上に存在する膜貫通タンパク質である。正常な状態では、調節性Ｔ細胞は、ＣＤ２５を構成的に発現し、エフェクターＴ細胞の拡大増殖を抑制するように作用する。調節性Ｔ細胞は、健康な状態を維持し、エフェクターＴ細胞が自己抗原に対して反応することまたは外来抗原に対して過剰反応することを阻害する。正常な保護的免疫応答では、エフェクターＴ細胞は、外来抗原との接触後に増大し、調節性Ｔ細胞による阻害を克服する。しかし、増殖性疾患の場合、がん細胞は、調節性Ｔ細胞の量を増加させ、それによって、がん細胞に対するエフェクターＴ細胞の生成を制限することによって、健康な免疫応答を無効にする場合がある。したがって、例えば、がん治療における使用のために免疫系を抑えるための、ＣＤ２５発現調節性Ｔ細胞の増殖を変更する治療薬に興味が持たれている。これらの治療薬には、ＣＤ２５標的化抗体が含まれ得る。
ＣＤ２５標的化抗体は、ＣＤ２５免疫原を使用した動物の免疫化によって産生され得るが、ＣＤ２５免疫原を開発する現行の方法は、予測不能な望ましくない特徴、例えば、抗体の混乱または種を横断した低い交差反応性をもたらす場合が多い。
したがって、ＣＤ２５またはその部分に対する構造的および／または動力学的類似性を有する新たな操作されたポリペプチド、例えば、ＩＬ－２結合部位の外側のエピトープを模倣するように設計された操作されたポリペプチドが、当該分野で必要とされている。
一態様では、本開示は、ＣＤ２５参照標的と少なくとも４６％の構造的および／または動力学的同一性を共有する操作されたポリペプチドであって、ＣＤ２５参照標的が、ＣＤ２５残基５５～６３、１３～２０：１２７～１３２、５～１７、５～１１：１５６～１６３、７７～８９、１４７～１５７、１１～１４または４４～５６から選択されるＣＤ２５の一部分である、操作されたポリペプチドを提供する。
実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と少なくとも６０％の構造的および／または動力学的同一性を共有する。実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と少なくとも８０％の構造的および／または動力学的同一性を共有する。実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～１６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を共有する。実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と少なくとも４６％の構造的および／または動力学的同一性を共有し、ＣＤ２５参照標的は、ＣＤ２５残基５５～６３、１３～２０：１２７～１３２、５～１７、５～１１：１５６～１６３、７７～８９、１４７～１５７、１１～１４または４４～５６から選択されるＣＤ２５の一部分である。実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と少なくとも８０％の構造的および／または動力学的同一性を共有する。実施形態では、ＣＤ２５参照標的に対する構造的および／または動力学的同一性は、ＰＤＢ ＩＤ番号２ＥＲＪ、Ａ鎖で寄託されたＣＤ２５の構造を使用して決定される。実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｎ末端改変またはＣ末端改変を含み、適宜、Ｎ末端ビオチン－ＰＥＧ２－またはＣ末端－ＧＳＧＳＧＫ－ビオチンを含む。
実施形態では、操作されたポリペプチドのアミノ酸の１０％～９８％の間は、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たす。実施形態では、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たすアミノ酸は、ＣＤ２５参照標的と、８．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）の構造的相同性を有する。実施形態では、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たすアミノ酸は、３０Å２～３０００Å２の間の、参照とのファンデルワールス表面積重複を有する。実施形態では、ＣＤ２５参照標的由来拘束は、原子間距離；原子ゆらぎ；原子エネルギー；化学的記述子；溶媒曝露；アミノ酸配列類似性；生物情報学的記述子；非共有結合傾向；ファイ角；プサイ角；ファンデルワールス半径；二次構造傾向；アミノ酸隣接性；およびアミノ酸接触からなる群から独立して選択される。実施形態では、操作されたポリペプチドは、１つ以上の参照標的由来拘束を満たすポリペプチドのアミノ酸にわたって、参照標的と４６％～９６％のＲＭＳＩＰまたはそれよりも高い構造的類似性を共有する。
別の態様では、本開示は、ＣＤ２５残基５５～６３、１３～２０：１２７～１３２、５～１７、５～１１：１５６～１６３、７７～８９、１４７～１５７、１１～１４または４４～５６から選択されるＣＤ２５エピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＤ２５特異的抗体を提供する。実施形態では、抗体は、ＣＤ２５の結合について、エピトープ特異的参照結合剤と競合し、エピトープ特異的結合剤は、ＩＬ－２、ダクリズマブ、バシオリキシマブ（ｂａｓｉｏｌｉｘｉｍａｂ）および／または７Ｇ７Ｂ６である。実施形態では、抗体は、オフターゲット参照結合剤と競合せず、オフターゲット結合剤は、ＩＬ－２、ダクリズマブ、バシオリキシマブおよび／または７Ｇ７Ｂ６である。実施形態では、抗体は、１０－２／ｓ未満、１０－３／ｓ未満または１０－４／ｓ未満のｋｏｆｆを有し、ｋｏｆｆは、可溶性ヒトＣＤ２５を用いたバイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して測定される。実施形態では、抗体は、１０－２／ｓと１０－５／ｓとの間のｋｏｆｆを有し、ｋｏｆｆは、可溶性ヒトＣＤ２５を用いたバイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して測定される。実施形態では、抗体は、１００ｎＭ未満、２５ｎＭ未満または５ｎＭ未満のＫＤを有し、ＫＤは、可溶性ヒトＣＤ２５を用いたバイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して測定される。実施形態では、抗体は、１００ｎＭと１ｎＭとの間のＫＤを有し、ＫＤは、可溶性ヒトＣＤ２５を用いたバイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して測定される。
実施形態では、抗体は、ＣＤ２５を発現する細胞に特異的に結合する。実施形態では、抗体は、少なくとも１０４または少なくとも１０５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、ＣＤ２５を発現する細胞に結合する。実施形態では、抗体は、１０４と１０６との間の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、ＣＤ２５を発現する細胞に結合する。実施形態では、抗体は、ＣＤ２５（－）細胞に結合しない。実施形態では、抗体は、１０３未満の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、ＣＤ２５（－）細胞に結合する。実施形態では、抗体は、表７Ｄの組み合わせ１～１２６のいずれか１つの６つのＣＤＲを含む。
実施形態では、抗体は、表３Ａおよび表３Ｂ中に提供されるＹＵ３９０－Ｂ１２、ＹＵ３９７－Ｆ０１、ＹＵ３９７－Ｄ０１、ＹＵ３９８－Ａ１１、ＹＵ４０４－Ｈ０１、ＹＵ４００－Ｂ０７、ＹＵ４００－Ｄ０９、ＹＵ４０１－Ｂ０１、ＹＵ４０１－Ｇ０７、ＹＵ４０４－Ｃ０２、ＹＵ４０３－Ｇ０７、ＹＵ４０３－Ｇ０５、ＹＵ３９１－Ｂ１２、ＹＵ４００－Ａ０３、ＹＵ４００－Ｄ０２、ＹＵ３９２－Ａ０９、ＹＵ３９２－Ｂ１１、ＹＵ３９２－Ｂ１２、ＹＵ３９２－Ｅ０５、ＹＵ３９２－Ｅ０６、ＹＵ３９２－Ｇ０８、ＹＵ３８９－Ａ０３、ＹＵ３９２－Ｇ０９、ＹＵ３９２－Ｇ１２、ＹＵ３９２－Ｈ０２、ＹＵ３９２－Ｈ０４、ＹＵ４０２－Ｆ０１、ＹＵ３８９－Ｂ１１、ＹＵ３９４－Ｄ０８、またはＹＵ３９０－Ａ１１のいずれか１つについての６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
実施形態では、抗体は、表５中に提供されるＹＵ３９０－Ｂ１２、ＹＵ３９７－Ｆ０１、ＹＵ３９７－Ｄ０１、ＹＵ３９８－Ａ１１、ＹＵ４０４－Ｈ０１、ＹＵ４００－Ｂ０７、ＹＵ４００－Ｄ０９、ＹＵ４０１－Ｂ０１、ＹＵ４０１－Ｇ０７、ＹＵ４０４－Ｃ０２、ＹＵ４０３－Ｇ０７、ＹＵ４０３－Ｇ０５、ＹＵ３９１－Ｂ１２、ＹＵ４００－Ａ０３、ＹＵ４００－Ｄ０２、ＹＵ３９２－Ａ０９、ＹＵ３９２－Ｂ１１、ＹＵ３９２－Ｂ１２、ＹＵ３９２－Ｅ０５、ＹＵ３９２－Ｅ０６、ＹＵ３９２－Ｇ０８、ＹＵ３８９－Ａ０３、ＹＵ３９２－Ｇ０９、ＹＵ３９２－Ｇ１２、ＹＵ３９２－Ｈ０２、ＹＵ３９２－Ｈ０４、ＹＵ４０２－Ｆ０１、ＹＵ３８９－Ｂ１１、ＹＵ３９４－Ｄ０８、またはＹＵ３９０－Ａ１１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を各々が共有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。実施形態では、抗体は、全長免疫グロブリンＧモノクローナル抗体である。実施形態では、抗体は、表５中に提供されるＹＵ３９０－Ｂ１２、ＹＵ３９７－Ｆ０１、ＹＵ３９７－Ｄ０１、ＹＵ３９８－Ａ１１、ＹＵ４０４－Ｈ０１、ＹＵ４００－Ｂ０７、ＹＵ４００－Ｄ０９、ＹＵ４０１－Ｂ０１、ＹＵ４０１－Ｇ０７、ＹＵ４０４－Ｃ０２、ＹＵ４０３－Ｇ０７、ＹＵ４０３－Ｇ０５、ＹＵ３９１－Ｂ１２、ＹＵ４００－Ａ０３、ＹＵ４００－Ｄ０２、ＹＵ３９２－Ａ０９、ＹＵ３９２－Ｂ１１、ＹＵ３９２－Ｂ１２、ＹＵ３９２－Ｅ０５、ＹＵ３９２－Ｅ０６、ＹＵ３９２－Ｇ０８、ＹＵ３８９－Ａ０３、ＹＵ３９２－Ｇ０９、ＹＵ３９２－Ｇ１２、ＹＵ３９２－Ｈ０２、ＹＵ３９２－Ｈ０４、ＹＵ４０２－Ｆ０１、ＹＵ３８９－Ｂ１１、ＹＵ３９４－Ｄ０８、またはＹＵ３９０－Ａ１１の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を共有するｓｃＦｖを含む。
実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。実施形態では、抗体は、マウス可変ドメインおよびヒト定常ドメインを含む。実施形態では、抗体は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ＣＤ２５にも結合する。
別の態様では、本開示は、本開示の任意の抗体を含み、適宜、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。別の態様では、本開示は、処置を必要とする対象を処置する方法であって、対象に、治療有効量の本開示の任意の抗体または医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。実施形態では、対象は、がんを患っている。実施形態では、対象は、自己免疫性疾患または障害を患っている。別の態様では、本開示は、対象において調節性Ｔ細胞の数を枯渇させる方法であって、対象に、治療有効量の本開示の任意の抗体または医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。実施形態では、対象は、がんを患っている。実施形態では、対象は、自己免疫性疾患または障害を患っている。
別の態様では、本開示は、本開示の任意の抗体または医薬組成物の抗体を含むキットを提供する。
一部の態様では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％の配列類似性を有する操作された免疫原が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、操作された免疫原は、その配列に対して少なくとも８０％の類似性を有する。他の実施形態では、操作された免疫原は、その配列に対して少なくとも９０％の類似性を有する。ある特定の実施形態では、操作された免疫原は、少なくとも１つの特徴をＣＤ２５と共有する。なおさらなる実施形態では、操作された免疫原は、ＣＤ２５の抗体に結合する。一部の実施形態では、操作された免疫原は、約７．３と約７．５との間のｐＨでの結合親和性と比較して、７．０を下回るｐＨで、ＣＤ２５の抗体に対するより高い結合親和性を有する。一部の実施形態では、操作された免疫原は、約７．３と約７．５との間のｐＨでの結合親和性と比較して、約６．４と約６．６との間のｐＨで、ＣＤ２５の抗体に対するより高い結合親和性を有する。
なお他の実施形態では、抗体を産生する方法であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％の配列類似性を有する操作された免疫原で動物を免疫化すること；ならびに抗体を産生することを含む方法が、本明細書で提供される。方法の一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５に対する抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、約７．３と約７．５との間のｐＨでの結合親和性と比較して、７．０を下回るｐＨで、ＣＤ２５に対するより高い結合親和性を示す。なおさらなる実施形態では、抗体は、約７．３と約７．５との間のｐＨでの結合親和性と比較して、約６．４と約６．６との間のｐＨで、ＣＤ２５に対するより高い結合親和性を示す。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５のＩＬ－２への結合を遮断しない。他の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５のＩＬ－２への結合を遮断する。請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法であって、抗体は、ＣＤ２５のＩＬ－２への結合を遮断しない。一部の実施形態では、抗体は、ＩＬ－２Ｒ－アルファ、ＩＬ－２Ｒ－ベータおよびＩＬ－２Ｒ－ガンマのヘテロトリマー化を防止する。ある特定の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５のシス配向およびトランス配向の両方に結合することが可能である。
本特許または出願ファイルは、カラーで描かれた少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を伴う本特許または特許出願のコピーは、請求および必要な手数料の納付の際に、特許庁によって提供されるであろう。本出願は、添付の図面と併せて解釈される以下の説明に対する言及によって理解することができる。
参照ＣＤ２５標的の一部分と構造的および／または動力学的同一性を共有する操作されたポリペプチドが、本明細書で提供される。目的のエピトープには、図６に示される８つのエピトープが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、選択されたエピトープは、ＩＬ－２、ダクリズマブおよび／またはバシリキシマブに対する結合部位（エピトープ）と重複しない。一部の実施形態では、エピトープは、７Ｇ７Ｂ６に対するエピトープと重複する。一部の実施形態では、選択されたエピトープは、５５～６３、１２～２０：１２７～１３２（非連続エピトープ）、５～１７、５～１１：１５６～１６３（非連続エピトープ）、７７～８９、１４７～１５７、１１～１４または４４～５６から選択される。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、コンフォメーション的に安定であり、ＣＤ２５に特異的に結合する抗体との相互作用に関与するＣＤ２５エピトープを提示する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５に特異的に結合する抗体と相互作用しないことが公知のＣＤ２５の表面部分を提示する。かかる操作されたポリペプチドは、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する抗体を選択および／または産生するために使用され得る。
Ｉ．操作されたポリペプチド。
Ｉ．操作されたポリペプチド。
一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と少なくとも４６％の構造的および／または動力学的同一性を共有し、ＣＤ２５参照標的は、以下の表中に列挙されたものから選択されるＣＤ２５の一部分である。本明細書で一般に提供されるように、％構造的／動力学的同一性は、二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）同一性（本明細書の上記で提供される）×１００％である。一部の実施形態では、構造的同一性は、配列同一性を指す。
一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたポリペプチドは、
から選択されるアミノ酸配列と８０％の配列同一性を共有する。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の構造的および／または動力学的同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を共有する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、選択されたＣＤ２５エピトープを模倣するように設計される。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、メソスケールの操作された分子、例えば、メソスケールの操作されたポリペプチドを含む。メソスケールの操作されたポリペプチドを選択する方法、ならびにこの操作されたポリペプチドを含む組成物およびそれを使用する方法が、本明細書で提供される。例えば、抗体のインビトロ選択において操作されたポリペプチドを使用する方法が、本明細書で提供される。
本開示の操作されたポリペプチドは、１ｋＤａと１０ｋＤａとの間であり、本明細書で「メソスケール」と呼ばれる。このサイズの操作されたポリペプチドは、一部の実施形態では、特定の利点、例えば、タンパク質様機能性、候補を選択する大きい理論的空間、細胞透過性、ならびに／または構造的および動力学的変動性を有し得る。メソスケールペプチドおよびメソスケールポリペプチドという用語は、本明細書で相互交換可能に使用され、メソスケール分子（ＭＥＭ）という用語は、これらをカバーする意図である。
本明細書で提供される方法は、その一部がＣＤ２５参照標的に由来し得る複数の空間的に関連するトポロジー的拘束を同定すること、これらの拘束の組み合わせを構築すること、候補ペプチドをこの組み合わせと比較すること、およびこの組み合わせと重複する拘束を有する候補を選択することを含む。空間的に関連するトポロジー的拘束を使用することによって、操作されたポリペプチドの異なる態様が、意図した使用、または所望の機能、または別の所望の特徴に依存して、組み合わせ中に含められ得る。さらに、一部の実施形態では、全ての拘束がＣＤ２５参照標的に由来する必要があるわけではない。かかる方法を介して、一部の実施形態では、選択された操作されたポリペプチドは、単にＣＤ２５参照標的のバリエーション（例えば、単一の参照のペプチド突然変異誘発または進行性の改変を介して得られ得る）であるのではなく、所望の機能的特徴および／または重要な下位構造をなおも保持しつつ、参照ペプチドとは異なる全体的構造を有し得る。
１つ以上の操作されたポリペプチドを使用したプログラム可能なインビトロ選択の方法を含む、この操作されたポリペプチドを使用する方法が、本明細書でさらに提供される。かかる選択は、例えば、抗体の同定において使用され得る。
これらの方法および操作されたポリペプチドは、以下により詳細に記載される。
ＩＩ．操作されたポリペプチドを選択する方法
ＩＩ．操作されたポリペプチドを選択する方法
一部の態様では、操作されたポリペプチドを選択する方法であって、
ＣＤ２５参照標的の１つ以上のトポロジー的特徴を同定すること；
各トポロジー的特徴について空間的に関連する拘束を設計して、ＣＤ２５参照標的由来拘束の組み合わせを産生すること；
候補ペプチドの空間的に関連するトポロジー的特徴を、ＣＤ２５参照標的に由来する組み合わせと比較すること；および
ＣＤ２５参照標的に由来する拘束の組み合わせと重複する空間的に関連するトポロジー的特徴を有する候補ペプチドを選択すること
を含む方法が、本明細書で提供される。
ＣＤ２５参照標的の１つ以上のトポロジー的特徴を同定すること；
各トポロジー的特徴について空間的に関連する拘束を設計して、ＣＤ２５参照標的由来拘束の組み合わせを産生すること；
候補ペプチドの空間的に関連するトポロジー的特徴を、ＣＤ２５参照標的に由来する組み合わせと比較すること；および
ＣＤ２５参照標的に由来する拘束の組み合わせと重複する空間的に関連するトポロジー的特徴を有する候補ペプチドを選択すること
を含む方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的に由来しない１つ以上のさらなる空間的に関連するトポロジー的拘束が、組み合わせ中に含められる。
ａ．空間的に関連するトポロジー的拘束
ａ．空間的に関連するトポロジー的拘束
本明細書に記載される操作されたポリペプチドは、それらが空間的に関連するトポロジー的拘束の組み合わせとどの程度密接にマッチするかに基づいて選択される。この組み合わせは、「テンソル」の数学的概念を使用して記述することもできる。かかる組み合わせ（またはテンソル）では、各拘束は、３次元空間中に独立して記述され（例えば、空間的に関連する）、３次元空間中のこれらの拘束の組み合わせは、例えば、位置に対する異なる所望の特徴およびそれらの所望のレベル（該当する場合）の表示「マップ」を提供する。このマップは、一部の実施形態では、線状の、または他の方法であらかじめ決定されたアミノ酸骨格には基づかず、したがって、記述される所望の組み合わせを満たすことができる構造における柔軟性を可能にし得る。例えば、一部の実施形態では、「マップ」は、規定の拘束制限が２つの隣接アミノ酸によって適切に満たされ得る空間領域を含む － 一部の実施形態では、これらのアミノ酸は、直接的に結合され得る（例えば、２つ連続するアミノ酸）が、他の実施形態では、アミノ酸は、互いに直接的に結合されないが、ペプチドのフォールディングによって空間的に一緒にされ得る（例えば、連続するアミノ酸ではない）。別々の拘束自体も、構造に必ずしも基づかなくてもよく、例えば、化学的記述子および／または機能的記述子を含み得る。一部の実施形態では、拘束には、構造的記述子、例えば、所望の二次構造またはアミノ酸残基が含まれる。ある特定の実施形態では、各拘束は、独立して選択される。
例えば、図１は、空間的に関連するトポロジー的拘束の代表的な組み合わせの構築を示す模式図である。図１中の３つの拘束は、配列、最近傍距離および原子運動であり、最近傍距離および原子運動は、１つの絵に組み合わされている。示されるように、一部の拘束は、骨格の場所（例えば、特定の側鎖の原子運動）とは独立してマッピングされ、したがって、参照足場上の１つ以上の位置を単に変動させることと比較して、はるかに多様な構造的立体配置が試行されるのを可能にする。３つの異なる拘束およびそれらの空間的記述は、行列（例えば、テンソル）へと組み合わされ、次いで、一連の候補ペプチドが、所望の基準を満たす新たな操作されたポリペプチドを同定するために、この組み合わせと比較され得る。一部の実施形態では、１つ以上のさらなる非参照由来拘束もまた、組み合わせ中に含められる。規定された組み合わせとの候補ペプチドの比較は、例えば、所望の組み合わせに対する各候補ペプチドの拘束を評価するためのインシリコ方法、および候補がどの程度マッチするかの比率を使用して、実施され得る。次いで、規定の組み合わせとの所望のレベルの重複を有するこれらの候補は、当業者に公知の標準的なペプチド合成法を使用して合成され得、評価され得る。
一部の実施形態では、拘束の組み合わせは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、３～１２個の間、３～１０個の間、３～８個の間、３～６個の間、または３個、または４個、または５個、または６個の、独立して選択された空間的に関連するトポロジー的拘束を含む。拘束のうち１つ以上は、ＣＤ２５参照標的に由来する。一部の実施形態では、拘束の各々は、ＣＤ２５参照標的に由来する。他の実施形態では、少なくとも１つの拘束が、ＣＤ２５参照標的に由来し、残りの拘束は、参照標的に由来しない。例えば、一部の実施形態では、１個と９個との間の拘束、１個と７個との間の拘束、１個と５個との間の拘束、または１個と３個との間の拘束がＣＤ２５参照標的に由来し、１個と９個との間の拘束、１個と７個との間の拘束、１個と５個との間の拘束、または１個と３個との間の拘束は、ＣＤ２５参照標的に由来しない。
拘束の組み合わせが構築されると、一連の候補ペプチドが、所望の基準を満たす１つ以上の新たな操作されたポリペプチドを同定するために、この組み合わせと比較される。一部の実施形態では、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、少なくとも１５０個、少なくとも１７５個、少なくとも２００個もしくは少なくとも２５０個またはそれよりも多くの候補ペプチドが、所望の基準を満たす１つ以上の新たな操作されたポリペプチドを同定するために、この組み合わせと比較される。一部の実施形態では、例えば、２５０個よりも多くの候補ペプチド、３００個よりも多くの候補ペプチド、４００個よりも多くの候補ペプチド、５００個よりも多くの候補ペプチド、６００個よりも多くの候補ペプチド、または７５０個よりも多くの候補ペプチドが比較される。一部の実施形態では、トポロジー的特徴シミュレーションが、存在する場合には、拘束の組み合わせと比較される候補ペプチドのトポロジー的特徴の重複を評価するために使用される。一部の実施形態では、１つ以上の候補ペプチドは、ＣＤ２５参照標的とも比較され、存在する場合には、ＣＤ２５参照標的のトポロジー的特徴との、候補ペプチドのトポロジー的特徴の重複が評価される。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、５個よりも多くの、１０個よりも多くの、２０個よりも多くの、３０個よりも多くの、４０個よりも多くの、５０個よりも多くの、６０個よりも多くの、７０個よりも多くの、８０個よりも多くの、９０個よりも多くの、または１００個よりも多くの別個のペプチドのコンピューター的サンプル、およびトポロジー的特徴シミュレーションから同定され、操作されたポリペプチドが選択され、選択された操作されたポリペプチドは、サンプリングされた総集団のうち、ＣＤ２５参照標的と比較して最も高いトポロジー的特徴の重複を有する。
所望の組み合わせ（例えば、所望のテンソル）を構築するために使用される空間的に関連するトポロジー的拘束は、可能な特徴の広範な群から各々独立して選択され得る。これらには、例えば、構造的、動力学的、化学的もしくは機能的特徴を記述する拘束、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
構造的拘束には、例えば、原子間距離、アミノ酸配列類似性、溶媒曝露、ファイ角、プサイ角、二次構造もしくはアミノ酸接触、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
動力学的拘束には、例えば、原子ゆらぎ、原子エネルギー、ファンデルワールス半径、アミノ酸隣接性または非共有結合傾向が含まれ得る。原子エネルギーには、例えば、２つの原子間のペアワイズ誘引エネルギー、２つの原子間のペアワイズ反発エネルギー、原子レベル溶媒和エネルギー、２つの原子間のペアワイズ荷電誘引エネルギー、２つの原子間のペアワイズ水素結合誘引エネルギー、もしくは非共有結合エネルギー、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
化学的特徴には、例えば、化学的記述子が含まれ得る。かかる化学的記述子には、例えば、疎水性、極性、原子容、原子半径、正味電荷、ｌｏｇＰ、ＨＰＬＣ保持時間、ファンデルワールス半径、電荷パターンもしくはＨ結合パターン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
機能的特徴には、例えば、生物情報学的記述子、生物学的応答または生物学的機能が含まれ得る。生物情報学的記述子には、例えば、ＢＬＯＳＵＭ類似性、ｐＫａ、ｚＳｃａｌｅ、Ｃｒｕｃｉａｎｉ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｋｉｄｅｒａ Ｆａｃｔｏｒｓ、ＶＨＳＥ－スケール、ＰｒｏｔＦＰ、ＭＳ－ＷＨＩＭスコア、Ｔ－スケール、ＳＴ－スケール、膜貫通傾向、タンパク質埋没領域、ヘリックス傾向、シート傾向、コイル傾向、ターン傾向、免疫原性傾向、抗体エピトープの存在、および／もしくはタンパク質界面の存在、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
一部の実施形態では、拘束を設計することは、残基毎のエネルギー、残基毎の相互作用、残基毎のゆらぎ、残基毎の原子間距離、残基毎の化学的記述子、残基毎の溶媒曝露、残基毎のアミノ酸配列類似性、残基毎の生物情報学的記述子、残基毎の非共有結合傾向、残基毎のファイ／プサイ角、残基毎のファンデルワールス半径、残基毎の二次構造傾向、残基毎のアミノ酸隣接性、または残基毎のアミノ酸接触についての情報を取り込む。一部の実施形態では、これらの特徴は、ＣＤ２５参照標的中の総残基のサブセット、もしくは拘束の総組み合わせの総残基のサブセット、またはそれらの組み合わせのために使用される。一部の実施形態では、１つ以上の異なる特徴は、１つ以上の異なる残基のために使用される。即ち、一部の実施形態では、１つ以上の特徴が、残基のあるサブセットのために使用され、少なくとも１つの異なる特徴が、残基の異なるサブセットのために使用される。一部の実施形態では、１つ以上の拘束を設計するために使用されるこれらの特徴のうち１つ以上は、コンピューターシミュレーションによって決定される。適切なコンピューターシミュレーション法には、例えば、分子動力学シミュレーション、Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーション、粗視化シミュレーション、Ｇａｕｓｓｉａｎネットワークモデル、機械学習、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
一部の実施形態では、複数の拘束が、１つのカテゴリーから選択される。例えば、一部の実施形態では、組み合わせは、独立してある型の生物学的応答である２つ以上の拘束を含む。一部の実施形態では、２つ以上の拘束は、独立して、ある型の二次構造である。ある特定の実施形態では、２つ以上の拘束は、独立して、ある型の化学的記述子である。他の実施形態では、組み合わせは、拘束の重複するカテゴリーを含まない。
一部の実施形態では、１つ以上の拘束は、独立して、生物学的応答または生物学的機能と関連する。一部の実施形態では、この拘束は、空間的に規定された原子（複数可）レベルの拘束、または空間的に規定された形状／面積／容量レベルの拘束（例えば、いくつかの異なる原子組成によって満足され得る特徴的な形状／面積／容量）、または空間的に規定された動力学的レベルの拘束（例えば、いくつかの異なる原子組成によって満足され得る特徴的な動力学または動力学のセット）である。
一部の実施形態では、１つ以上の拘束は、生物学的機能または生物学的応答と関連するタンパク質構造またはペプチド構造に由来する。例えば、一部の実施形態では、１つ以上の拘束は、細胞外ドメイン、例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）細胞外ドメインまたはイオンチャネル細胞外ドメインに由来する。一部の実施形態では、１つ以上の拘束は、タンパク質－タンパク質界面接合部に由来する。一部の実施形態では、１つ以上の拘束は、タンパク質－ペプチド界面接合部、例えば、ＭＨＣ－ペプチドまたはＧＰＣＲ－ペプチド界面に由来する。ある特定の実施形態では、かかるタンパク質またはペプチド構造に拘束される原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連する原子またはアミノ酸である。一部の実施形態では、かかるタンパク質またはペプチド構造に拘束される操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸は、ＣＤ２５参照標的に由来する原子またはアミノ酸である。一部の実施形態では、１つ以上の拘束は、ＣＤ２５参照標的の多型領域（例えば、個体間の対立遺伝子バリエーションに供される領域）に由来する。
一部の実施形態では、生物学的機能または生物学的応答と関連する１つ以上の原子は、炭素、酸素、窒素、水素、硫黄、リン、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マンガン、マグネシウム、銅、鉄、モリブデンおよびニッケルからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、原子は、酸素、窒素、硫黄および水素からなる群から選択される。
拘束のうち１つが生物学的機能もしくは生物学的応答と関連する１つ以上のアミノ酸であるおよび／または操作されたポリペプチドが生物学的機能もしくは生物学的応答と関連する１つ以上のアミノ酸を含む一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、２０種のタンパク質原性の天然に存在するアミノ酸、非タンパク質原性の天然に存在するアミノ酸および非天然アミノ酸からなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、非天然アミノ酸は、化学的に合成される。ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、２０種のタンパク質原性の天然に存在するアミノ酸から選択される。他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、非タンパク質原性の天然に存在するアミノ酸から選択される。なおさらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、非天然アミノ酸から選択される。なおさらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、２０種のタンパク質原性の天然に存在するアミノ酸、非タンパク質原性の天然に存在するアミノ酸および非天然アミノ酸の組み合わせから選択される。
本明細書に記載される操作されたポリペプチドを選択するために使用される拘束の組み合わせは、ＣＤ２５参照標的に由来する少なくとも１つの拘束を含むが、一部の実施形態では、組み合わせの１つ以上の拘束は、ＣＤ２５参照標的に由来しない。したがって、ある特定の実施形態では、選択された操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と共有されない１つ以上の特徴を含む。
一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的に由来し、組み合わせにおいて使用される１つ以上の拘束は、ＣＤ２５参照標的において観察される特徴の逆を記述する。したがって、例えば、ＣＤ２５参照標的は、特定のパターンの正の電荷を有し得、電荷に関連する拘束は、このＣＤ２５参照標的に由来し、由来の拘束は、類似のパターンではあるが中性の電荷または負の電荷を記述する。したがって、一部の実施形態では、１つ以上の逆拘束は、ＣＤ２５参照標的に由来し、組み合わせ中に含められる。かかる逆拘束は、例えば、特定のアッセイもしくはパニング法のための対照分子として、または本明細書に記載されるプログラム可能なインビトロ選択法における陰性選択分子として、操作されたポリペプチドを選択する際に有用であり得る。
一部の実施形態では、空間的に規定されたトポロジー的拘束の組み合わせは、１つ以上の非参照由来トポロジー的拘束を含む。一部の実施形態では、１つ以上の非参照由来トポロジー的拘束は、１つ以上の二次構造要素を強制もしくは安定化し、原子ゆらぎを強制し、ペプチドの総疎水性を変更し、ペプチドの溶解度を変更し、ペプチドの総電荷を変更し、標識されたもしくは標識なしのアッセイにおける検出を可能にし、インビトロアッセイにおける検出を可能にし、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）アッセイにおける検出を可能にし、複雑な混合物からの捕捉を可能にし、酵素的プロセシングを可能にし、細胞膜透過性を可能にし、二次標的への結合を可能にし、または免疫原性を変更する。ある特定の実施形態では、１つ以上の非参照由来トポロジー的拘束は、ＣＤ２５参照標的に由来した拘束の組み合わせ（または引き続いて選択されたペプチド）中の１つ以上の原子またはアミノ酸を拘束する。例えば、一部の実施形態では、拘束の組み合わせは、ＣＤ２５参照標的に由来した二次構造を含み、拘束の組み合わせは、二次構造要素を安定化する（例えば、さらなる水素結合、または疎水性相互作用、または側鎖スタッキング、または塩橋、またはジスルフィド結合を介して）拘束もまた含み、この安定化性の拘束は、ＣＤ２５参照標的中には存在しない。別の例では、一部の実施形態では、拘束の組み合わせ（または引き続いて選択されたペプチド）は、ＣＤ２５参照標的に由来した１つ以上の原子またはアミノ酸を含み、拘束の組み合わせは、標的参照に由来する原子またはアミノ酸の少なくとも一部分における原子ゆらぎを強制する拘束もまた含み、この拘束は、標的参照中には存在しない。一部の実施形態では、１つ以上の非参照由来拘束は、逆拘束である。例えば、一部の実施形態では、拘束の２つの組み合わせは、逆特徴を有する操作されたポリペプチドを選択するために構築される。一部のかかる実施形態では、拘束の第１の組み合わせは、ＣＤ２５参照標的に由来する１つ以上の拘束、およびＣＤ２５参照標的に由来しない１つ以上の拘束を含むであろう；拘束の第２の組み合わせは、ＣＤ２５参照標的に由来する同じ１つ以上の拘束、および第１の組み合わせの非ＣＤ２５参照標的拘束のうち１つ以上の逆を含むであろう。
ｂ．ＣＤ２５参照標的
ｂ．ＣＤ２５参照標的
任意の適切なＣＤ２５参照標的が、本明細書で提供される方法における使用のための１つ以上の空間的に関連するトポロジー的拘束を誘導するために使用され得る。一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的は、全長ネイティブタンパク質である。他の実施形態では、ＣＤ２５参照標的は、全長ネイティブタンパク質の一部分である。なおさらなる実施形態では、ＣＤ２５参照標的は、非ネイティブタンパク質、またはその部分である。
一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的は、
から選択される。
例えば、一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的は、ＣＤ２５の一部分、例えば、エピトープまたは予測されたエピトープである。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、免疫原であり、標的参照が由来するタンパク質に特異的に結合する１つ以上の抗体を生じるために使用され得る１つ以上の操作されたポリペプチドを選択するために使用され得る。なおさらなる実施形態では、本明細書で提供される方法は、目的のタンパク質、例えば、抗体、ＦａｂをディスプレイするファージまたはｓｃＦｖをディスプレイするファージの１つ以上の結合パートナーを選択するために次に使用され得る１つ以上の操作されたポリペプチドを選択するために使用され得る。
ｃ．拘束の比較
ｃ．拘束の比較
一部の実施形態では、１つ以上の拘束（例えば、参照由来または非参照由来）は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）もしくは実験室測定（例えば、ＮＭＲ）、またはそれらの組み合わせによって決定される。拘束が誘導され組み合わされると、操作されたポリペプチド候補が、一部の実施形態では、コンピューター的タンパク質設計（例えば、Ｒｏｓｅｔｔａ）を使用して生成される。一部の実施形態では、ペプチド空間をサンプリングする他の方法が使用される。次いで、動力学シミュレーションが、選択された拘束のパラメーターを得るために、候補の操作されたポリペプチドに対して実施され得る。原子ゆらぎの共分散行列が、ＣＤ２５参照標的について生成され、共分散行列が、候補の操作されたポリペプチドの各々中の残基について生成され、これらの共分散行列は、重複を決定するために比較される。主成分分析は、各共分散行列 － ＣＤ２５参照標的についての１つの共分散行列、および候補の操作されたポリペプチドの各々についての１つの共分散 － についての固有ベクトルおよび固有値を計算するために実施され、最も大きい固有値を有する固有ベクトルが保持される。
固有ベクトルは、シミュレートされた分子構造のセットにおいて観察される１番目、２番目、３番目、Ｎ番目に支配的な運動を記述する。いずれの理論によって束縛されることも望まないが、候補の操作されたポリペプチドがＣＤ２５参照標的と同様に動く場合、その固有ベクトルは、ＣＤ２５参照標的の固有ベクトルと類似するであろう。固有ベクトルの類似性は、整列され、同じ方向を指すそれらの成分（各ＣＡ原子を中心とした３Ｄベクトル）に対応する。
一部の実施形態では、候補の操作されたポリペプチドの固有ベクトルとＣＤ２５参照標的の固有ベクトルとの間のこの類似性は、２つの固有ベクトルの内積を使用して計算される。内積値は、２つの固有ベクトルが互いに対して９０度である場合には０であるか、または２つの固有ベクトルが同じ方向を正確に指す場合には１である。理論によって束縛されることは望まないが、固有ベクトルの順序付けは、それらの固有値に基づき、固有値は、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションが２つの異なる分子の根底にあるエネルギーランドスケープをサンプリングする確率論的性質に起因して、それらの異なる分子間で必ずしも同じでなくてもよいので、一部の実施形態では、複数の差次的にランク付けされた固有ベクトル間の内積が必要とされる（例えば、操作されたポリペプチドの固有ベクトル１×ＣＤ２５参照標的の固有ベクトル２、３、４など）。さらに、分子運動は複雑であり、１つよりも多くの（または数個よりも多くの）支配的な／主要なモードの運動が関与し得る。したがって、一部の実施形態では、候補の操作されたポリペプチドおよびＣＤ２５参照標的における固有ベクトルの全ての対間の内積が計算される。これは、内積の行列を生じ、その次元は、分析した固有ベクトルの数によって決定される。例えば、１０個の固有ベクトルについて、内積の行列は、１０×１０である。内積のこの行列は、１００（１０×１０の場合）の内積の二乗平均平方根値を計算することによって、単一の値に変えることができる。これは、二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である。この比較から、拘束の規定された組み合わせとの類似性を有する１つ以上の候補の操作されたポリペプチドが選択される。
ｄ．さらなる工程
ｄ．さらなる工程
一部の実施形態では、１つ以上の操作されたポリペプチドの選択は、１つ以上のさらなる工程を含む。例えば、一部の実施形態では、操作されたポリペプチド候補は、本明細書に記載されるように、空間的に関連するトポロジー的拘束の規定された組み合わせとの類似性に基づいて選択され、次いで、１つ以上のさらなる特徴を決定するための１つ以上の分析、および所望の特徴を付与または強制するための１つ以上の構造的調整を受ける。例えば、一部の実施形態では、選択された候補は、分子の全体的安定性および／または特定のフォールディングされた構造の傾向を決定するために、例えば、分子動力学シミュレーションを介して分析される。一部の実施形態では、１つ以上の改変が、所望のレベルの安定性、または所望のフォールディングされた構造の所望の傾向を付与または強化するために、操作されたポリペプチドに対してなされる。かかる改変には、例えば、１つ以上の架橋（例えば、ジスルフィド結合）、塩橋、水素結合相互作用もしくは疎水性相互作用、またはそれらの任意の組み合わせの導入が含まれ得る。
本明細書で提供される方法は、１つ以上の所望の特徴、例えば、所望の結合相互作用または活性について、１つ以上の選択された操作されたポリペプチドをアッセイすることをさらに含み得る。任意の適切なアッセイが、所望の特徴を測定するために必要に応じて使用され得る。
他の態様では、操作されたポリペプチド、例えば、本明細書に記載される方法を介して選択された操作されたポリペプチドが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１ｋＤａと１０ｋＤａとの間の分子質量を有し、最大で５０アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、２ｋＤａと１０ｋＤａとの間、２ｋＤａと１０ｋＤａとの間、３ｋＤａと１０ｋＤａとの間、４ｋＤａと１０ｋＤａとの間、５ｋＤａと１０ｋＤａとの間、６ｋＤａと１０ｋＤａとの間、７ｋＤａと１０ｋＤａとの間、８ｋＤａと１０ｋＤａとの間、９ｋＤａと１０ｋＤａとの間、１ｋＤａと９ｋＤａとの間、１ｋＤａと８ｋＤａとの間、１ｋＤａと７ｋＤａとの間、１ｋＤａと６ｋＤａとの間、１ｋＤａと５ｋＤａとの間、１ｋＤａと４ｋＤａとの間、１ｋＤａと３ｋＤａとの間、または１ｋＤａと２ｋＤａとの間の分子質量を有する。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、最大で４５アミノ酸、最大で４０アミノ酸、最大で３５アミノ酸、最大で３０アミノ酸、最大で２５アミノ酸、最大で２０アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸または少なくとも４０アミノ酸を含む。
ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、空間的に関連するトポロジー的拘束の組み合わせを含み、拘束のうち１つ以上は、ＣＤ２５参照標的由来拘束である。本明細書に記載される任意の拘束は、一部の実施形態では、組み合わせて使用され得る。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドのアミノ酸の１０％～９８％の間が、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たす（例えば、操作されたポリペプチドが５０アミノ酸を含む場合、５アミノ酸～４９アミノ酸の間が、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たす）。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのアミノ酸の２０％～９８％の間、３０％～９８％の間、４０％～９８％の間、５０％～９８％の間、６０％～９８％の間、７０％～９８％の間、８０％～９８％の間、９０％～９８％の間、１０％～９０％の間、１０％～８０％の間、１０％～７０％の間、１０％～６０％の間、１０％～５０％の間、１０％～４０％の間、１０％～３０％の間または１０％～２０％の間が、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たす。なおさらなる実施形態では、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たす１つ以上のアミノ酸は、ＣＤ２５参照標的と、８．０Å未満、７．５Å未満、７．０Å未満、６．５Å未満、６．０Å未満、５．５Å未満または５．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）の構造的相同性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１ｋＤａと１０ｋＤａとの間の分子質量を有し；最大で５０アミノ酸を含み；拘束のうち１つ以上がＣＤ２５参照標的由来拘束である、空間的に関連するトポロジー的拘束の組み合わせ；操作されたポリペプチドのアミノ酸の１０％～９８％の間は、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たし；１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たすアミノ酸は、ＣＤ２５参照標的と、８．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）の構造的相同性を有する。
一部の実施形態では、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たす操作されたポリペプチドのアミノ酸は、ＣＤ２５参照標的に対して１０％と９０％との間の配列相同性、２０％と９０％との間の配列相同性、３０％と９０％との間の配列相同性、４０％と９０％との間の配列相同性、５０％と９０％との間の配列相同性、６０％と９０％との間の配列相同性、７０％と９０％との間の配列相同性または８０％と９０％との間の配列相同性を有する。一部の実施形態では、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たすアミノ酸は、３０Å２～３０００Å２の間、または１００Å２～３０００Å２の間、または２５０Å２～３０００Å２の間、または５００Å２～３０００Å２の間、または７５０Å２～３０００Å２の間、または１０００Å２～３０００Å２の間、または１２５０Å２～３０００Å２の間、または１５００Å２～３０００Å２の間、または１７５０Å２～３０００Å２の間、または２０００Å２～３０００Å２の間、または２２５０Å２～３０００Å２の間、または２５００Å２～３０００Å２の間、または２７５０Å２～３０００Å２の間の、参照とのファンデルワールス表面積重複を有する。
操作されたポリペプチドが満たす拘束の組み合わせは、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上または７つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を含み得る。組み合わせは、本開示の他の箇所で記載されるように、ＣＤ２５参照標的に由来しない１つ以上の拘束を含み得る。これらの参照由来拘束、および存在する場合には非参照由来拘束は、独立して、本明細書に記載される拘束のいずれか、例えば、本明細書に記載される構造的、動力学的、化学的もしくは機能的特徴のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と比較した場合に少なくとも１つの構造的差異を含む。かかる構造的差異には、例えば、配列、アミノ酸残基の数、原子の総数、親水性の総計、疎水性の総計、正の電荷の総計、負の電荷の総計、１つ以上の二次構造、形状因子、Ｚｅｒｎｉｋｅ記述子、ファンデルワールス表面、構造グラフのノードおよびエッジ、容量表面（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ）、静電ポテンシャル表面、疎水性ポテンシャル表面、局所的直径、局所的表面特色、スケルトンモデル、電荷密度、親水性密度、表面対容量比、両親媒性密度もしくは表面粗度における差異、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。一部の実施形態では、１つ以上の特徴（例えば、本明細書に記載される１つ以上の特徴）における差異は、特徴の型に対して適用可能な場合、ＣＤ２５参照標的における特徴と比較した場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％である、または１００％よりも高い。例えば、一部の実施形態では、差異は原子の総数であり、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％もしくは少なくとも３０％多い原子、またはＣＤ２５参照標的よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％もしくは少なくとも３０％少ない原子を有する。一部の実施形態では、差異は、正の電荷の総計におけるものであり、操作されたポリペプチドの正の電荷の総計は、ＣＤ２５参照標的よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％大きい（例えば、より正である）が、他の実施形態では、操作されたポリペプチドの正の電荷の総計は、ＣＤ２５参照標的よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％小さい（例えば、より正でない）。
一部の実施形態では、空間的に規定されたトポロジー的拘束の組み合わせは、ＣＤ２５参照標的中に存在しない１つ以上の二次構造要素を含む。したがって、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的中に存在しない１つ以上の二次構造要素を含む。一部の実施形態では、組み合わせおよび／または操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的中に見出されない１つの二次構造要素、２つの二次構造要素、３つの二次構造要素、４つの二次構造要素、または４つよりも多くの二次構造要素を含む。一部の実施形態では、各二次構造要素は、ヘリックス、シート、ループ、ターンおよびコイルからなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的中に存在しない各二次構造要素は、独立して、α－ヘリックス、β－ブリッジ、β－ストランド、３１０ヘリックス、π－ヘリックス、ターン、ループまたはコイルである。
ある特定の実施形態では、ＣＤ２５参照標的は、生物学的応答または生物学的機能（例えば、本明細書に記載されるもの）と関連する１つ以上の原子を含み；操作されたポリペプチドは、生物学的応答または生物学的機能（例えば、本明細書に記載されるもの）と関連する１つ以上の原子を含み；操作されたポリペプチド中のこれらの原子の原子ゆらぎは、ＣＤ２５参照標的中のこれらの原子の原子ゆらぎと重複する。したがって、例えば、一部の実施形態では、原子自体は異なる原子であるが、それらの原子ゆらぎは重複する。他の実施形態では、原子は同じ原子であり、それらの原子ゆらぎは重複する。なおさらなる実施形態では、原子は独立して、同じまたは異なる。一部の実施形態では、重複は、０．２５よりも大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である。一部の実施形態では、重複は、０．３よりも大きい、０．３５よりも大きい、０．４よりも大きい、０．４５よりも大きい、０．５よりも大きい、０．５５よりも大きい、０．６よりも大きい、０．６５よりも大きい、０．７よりも大きい、０．７５よりも大きい、０．８よりも大きい、０．８５よりも大きい、０．９よりも大きい、または０．９５よりも大きいＲＭＳＩＰである。ある特定の実施形態では、ＲＭＳＩＰは、
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、生物学的応答または生物学的機能と関連する原子もしくはアミノ酸（またはそれらの組み合わせ）を含み、これらの原子もしくはアミノ酸または組み合わせのうち少なくとも一部分は、ＣＤ２５参照標的に由来し、操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸のセットおよびＣＤ２５参照標的中のセットの特定の拘束が、行列によって記述され得る。一部の実施形態では、行列は、Ｌ×Ｌ行列である。他の実施形態では、行列は、Ｓ×Ｓ×Ｍ行列である。なおさらなる実施形態では、行列は、Ｌ×２ファイ／プサイ角行列である。
例えば、一部の実施形態では、生物学的応答または生物学的機能と関連する、操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸の原子ゆらぎは、Ｌ×Ｌ行列によって記述され；これらの原子またはアミノ酸の一部分は、ＣＤ２５参照標的に由来し；この部分のＣＤ２５参照標的における原子ゆらぎは、Ｌ×Ｌ行列によって記述される。一部の実施形態では、各セットの隣接性（アミノ酸位置に関する）は、対応するＬ×Ｌ行列によって記述される。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドのＬ×Ｌ原子ゆらぎまたは隣接性行列の全ての行列要素（ｉ，ｊ）にわたる平均パーセンテージ誤差（ＭＰＥ）は、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部について、ＣＤ２５参照標的の原子ゆらぎまたは隣接性行列中の対応する（ｉ，ｊ）要素と比較して、７５％以下である。一部の実施形態では、ＭＰＥは、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部について、ＣＤ２５参照標的行列中の対応する要素と比較して、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満または４０％未満である。行列が原子ゆらぎを示す一部の実施形態では、Ｌは、アミノ酸位置の数であり、原子ゆらぎ行列要素中の（ｉ，ｊ）値は、（ｉ，ｊ）原子間距離が７Å以下である場合には、それぞれｉ番目およびｊ番目のアミノ酸についての分子内原子ゆらぎの合計であるか、または（ｉ，ｊ）原子間距離が７Åよりも大きい場合もしくは（ｉ，ｊ）が対角線上にある場合には、ゼロである。あるいは、一部の実施形態では、原子間距離は、０または１の乗数の代わりに、原子ゆらぎ行列要素（ｉ，ｊ）のための重み付け係数として働き得る。ある特定の実施形態では、ｉ番目およびｊ番目の原子ゆらぎおよび原子間距離は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。行列が隣接性を示す他の実施形態では、Ｌは、アミノ酸位置の数であり、隣接性行列要素（ｉ，ｊ）中の値は、原子間距離が７Å以下である場合には、それぞれｉ番目のアミノ酸とｊ番目のアミノ酸との間の分子内原子間距離であるか、または原子間距離が７Åよりも大きい場合もしくは（ｉ，ｊ）が対角線上にある場合には、ゼロである。あるいは、一部の実施形態では、原子間距離は、０または１の乗数の代わりに、隣接性行列要素（ｉ，ｊ）のための重み付け係数として働き得る。ある特定の実施形態では、ｉ番目およびｊ番目の原子間距離は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。
ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチド中の、応答または機能と関連する原子またはアミノ酸は、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部について、トポロジー的拘束の化学的記述子ベクトル、および同じ化学的記述子によって記述される参照と比較して７５％未満の平均パーセンテージ誤差（ＭＰＥ）を有し、化学的記述子ベクトル中の各ｉ番目の要素は、アミノ酸位置添字に対応する。一部の実施形態では、ＭＰＥは、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部について、同じ化学的記述子によって記述される参照と比較して、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満または４０％未満である。
なおさらなる実施形態では、行列は、Ｌ×２ファイ／プサイ角行列であり、操作されたポリペプチド中の、応答または機能と関連する原子またはアミノ酸は、参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部において、参照ファイ／プサイ角行列に関して７５％未満のＭＰＥを有し、Ｌは、アミノ酸位置の数であり、ファイ、プサイ値は、それぞれ、次元（Ｌ，１）および（Ｌ，２）である。一部の実施形態では、ＭＰＥは、参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部において、参照ファイ／プサイ角行列に関して、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満または４０％未満である。一部の実施形態では、ファイ／プサイ値は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）、知識ベースの構造予測または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定される。
一部の実施形態では、行列は、Ｓ×Ｓ×Ｍ二次構造要素相互作用行列であり、操作されたポリペプチド中の、応答または機能と関連する原子またはアミノ酸は、参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部において、参照二次構造要素関係行列と比較して７５％未満の平均パーセンテージ誤差（ＭＰＥ）を有し、Ｓは、二次構造要素の数であり、Ｍは、相互作用記述子の数である。一部の実施形態では、ＭＰＥは、参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部において、参照二次構造要素関係行列と比較して、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満または４０％未満である。相互作用記述子には、例えば、水素結合、疎水性パッキング、ファンデルワールス相互作用、イオン性相互作用、共有結合ブリッジ、キラリティー、配向もしくは距離、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。二次構造要素相互作用行列添字では、（ｉ，ｊ，ｍ）＝ｉ番目の二次構造要素とｊ番目の二次構造要素との間のｍ番目の相互作用記述子の値。
本明細書に記載される異なる行列についての平均パーセンテージ誤差（ＭＰＥ）は、
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と比較して、７５％未満のＭＰＥを有する。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的と比較して、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満または４０％未満のＭＰＥを有する。一部の実施形態では、ＭＰＥは、総トポロジー的拘束距離（ＴＣＤ）、トポロジー的クラスタリング係数（ＴＣＣ）、ユークリッド距離、パワー距離（ｐｏｗｅｒ ｄｉｓｔａｎｃｅ）、Ｓｏｅｒｇｅｌ距離、キャンベラ距離、ソーレンセン距離、ジャッカード距離、マハラノビス距離、ハミング距離、ライクネスの量的推計（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｅｓｔｉｍａｔｅ ｏｆ Ｌｉｋｅｎｅｓｓ）（ＱＥＬ）または鎖トポロジーパラメーター（ＣＴＰ）によって決定される。
ｅ．二次構造要素
ｅ．二次構造要素
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドの少なくとも一部分は、１つ以上の二次構造要素にトポロジー的に拘束される。一部の実施形態では、操作されたポリペプチド中の、生物学的応答または生物学的機能と関連する原子またはアミノ酸は、１つ以上の二次構造要素にトポロジー的に拘束される。一部の実施形態では、二次構造要素は、独立して、シート、ヘリックス、ターン、ループまたはコイルである。一部の実施形態では、二次構造要素は、独立して、α－ヘリックス、β－ブリッジ、β－ストランド、３１０ヘリックス、π－ヘリックス、ターン、ループまたはコイルである。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドの少なくとも一部分がトポロジー的に拘束される二次構造要素のうち１つ以上は、ＣＤ２５参照標的中に存在する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドの少なくとも一部分は、二次構造要素の組み合わせにトポロジー的に拘束され、各要素は、シート、ヘリックス、ターン、ループおよびコイルからなる群から独立して選択される。なおさらなる実施形態では、各要素は、α－ヘリックス、β－ブリッジ、β－ストランド、３１０ヘリックス、π－ヘリックス、ターン、ループおよびコイルからなる群から独立して選択される。
一部の実施形態では、二次構造要素は、パラレルまたはアンチパラレルシートである。一部の実施形態では、シート二次構造は、２残基以上を含む。一部の実施形態では、シート二次構造は、５０残基以下を含む。なおさらなる実施形態では、シート二次構造は、２残基と５０残基との間を含む。シートは、パラレルまたはアンチパラレルであり得る。一部の実施形態では、パラレルシート二次構造は、パラレルの２つのストランドｉ，ｊ（ｉストランドおよびｊストランドのＮ末端は反対配向）、および残基ｉ：ｊの水素結合のパターンを有すると記述され得る。一部の実施形態では、アンチパラレルシート二次構造もまた、アンチパラレルの２つのストランドｉ，ｊ（ｉストランドおよびｊストランドのＮ末端は同じ配向）、および残基ｉ：ｊ－１，ｉ：ｊ＋１の水素結合のパターンを有すると記述され得る。ある特定の実施形態では、ストランドの配向および水素結合は、知識ベースのもしくは分子動力学シミュレーションおよび／または実験室測定によって決定され得る。
一部の実施形態では、二次構造要素は、ヘリックスである。ヘリックスは、時計回りまたは反時計回りであり得る。一部の実施形態では、ヘリックスは、２．５と６．０との間の１ターン当たりの残基（残基／ターン）値、および３．０Åと９．０Åとの間のピッチを有する。一部の実施形態では、残基／ターンおよびピッチは、知識ベースのもしくは分子動力学シミュレーションおよび／または実験室測定によって決定される。
一部の実施形態では、二次構造要素は、ターンである。一部の実施形態では、ターンは、２～７の間の残基、および１つ以上の残基間水素結合を含む。一部の実施形態では、ターンは、２つ、３つまたは４つの残基間水素結合を含む。ある特定の実施形態では、ターンは、知識ベースのもしくは分子動力学シミュレーションおよび／または実験室測定によって決定される。
なおさらなる実施形態では、二次構造要素は、コイルである。ある特定の実施形態では、コイルは、２～２０の間の残基およびゼロ個の予測された残基間水素結合を含む。一部の実施形態では、これらのコイルパラメーターは、知識ベースのもしくは分子動力学シミュレーションおよび／または実験室測定によって決定される。
なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５参照標的に由来する１つ以上の原子またはアミノ酸を含み、これらの原子またはアミノ酸は、二次構造を有する。一部の実施形態では、これらの原子またはアミノ酸は、生物学的応答または生物学的機能と関連する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸の二次構造モチーフベクトルは、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部について、ＣＤ２５参照標的の二次構造モチーフベクトルと比較して、０．２５よりも大きいコサイン類似度を有し、ベクトルの長さは、二次構造モチーフの数であり、ｉ番目のベクトル位置における値は、ルックアップテーブルに由来する二次構造モチーフ（例えば、ヘリックス、シート）の正体を規定する。一部の実施形態では、各モチーフは、２つ以上のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、モチーフには、例えば、α－ヘリックス、β－ブリッジ、β－ストランド、３１０ヘリックス、π－ヘリックス、ターンおよびループが含まれる。一部の実施形態では、コサイン類似度は、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの一部について、ＣＤ２５参照標的の二次構造モチーフベクトルと比較して、０．３よりも大きい、０．３５よりも大きい、０．４よりも大きい、０．４５よりも大きいまたは０．５よりも大きい。コサイン類似度は、
一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、総トポロジー的拘束距離（ＴＣＤ）を使用して、対応するＣＤ２５参照標的の原子またはアミノ酸と比較され得る。一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的に由来するこれらの操作されたポリペプチドの原子またはアミノ酸の総ＴＣＤは、ＣＤ２５参照標的中の対応する原子のＴＣＤ距離と比較して＋／－７５％であり、２つの分子内トポロジー的拘束は、それらのペアワイズ距離が７Å以下である場合、相互作用している。一部の実施形態では、比較されている操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連する。２つの原子またはアミノ酸のｉ番目、ｊ番目のペアワイズ距離は、一部の実施形態では、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。総トポロジー的拘束距離（ＴＣＤ）を計算するための例示的な方程式は、
一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、鎖トポロジーパラメーター（ＣＴＰ）を使用して、対応するＣＤ２５参照標的の原子またはアミノ酸と比較され得る。一部の実施形態では、これらの操作されたポリペプチドの原子またはアミノ酸のＣＴＰは、ＣＤ２５参照標的中の対応する原子またはアミノ酸のＣＴＰと比較して＋／－５０％であり、鎖内トポロジー的相互作用は、７Å以下のペアワイズ距離である。一部の実施形態では、比較されている操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連する。一部の実施形態では、ｉ番目、ｊ番目のペアワイズ距離は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。ＣＴＰを評価するための例示的な方程式は、
一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、ライクネスの量的推計（ＱＥＬ）を使用して、対応するＣＤ２５参照標的の原子またはアミノ酸と比較され得る。一部の実施形態では、これらの操作されたポリペプチドの原子またはアミノ酸のＱＥＬは、ＣＤ２５参照標的中の対応する原子またはアミノ酸のＱＥＬと比較して＋／－５０％である。一部の実施形態では、比較されている操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連する。ＱＥＬを決定するための例示的な方程式は、
一部の実施形態では、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、トポロジー的クラスタリング係数（ＴＣＣ）ベクトルおよび平均パーセンテージ誤差（ＭＰＥ）を使用して、対応するＣＤ２５参照標的の原子またはアミノ酸と比較され得る。一部の実施形態では、ＴＣＣベクトルおよびＭＰＥは、ＣＤ２５参照標的中の対応する原子またはアミノ酸のＴＣＣと比較して７５％未満であり、ベクトルの各要素（ｉ）は、ｉ番目のアミノ酸位置についてのトポロジー的クラスタリング係数であり、分子内クラスターは、ｉ番目のアミノ酸位置からの７Å以下の相互作用性エッジ距離および２つのエッジ：ｉ－ｊ，ｊ－ｌによって規定される。一部の実施形態では、比較されている操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連する。一部の実施形態では、ｉ番目、ｊ番目およびｌ番目のエッジ距離は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。ｉ番目の位置についてのトポロジー的クラスタリング係数を評価するための例示的な方程式は、
なおさらなる実施形態では、ＣＤ２５参照標的に由来する操作されたポリペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、Ｌ×Ｍトポロジー的拘束行列、およびＭ次元全てにわたるユークリッド距離、パワー距離、Ｓｏｅｒｇｅｌ距離、キャンベラ距離、ソーレンセン距離、ジャッカード距離、マハラノビス距離またはハミング距離の平均パーセンテージ誤差（ＭＰＥ）を使用して、対応するＣＤ２５参照標的の原子またはアミノ酸と比較され得る。Ｌ×Ｍ行列要素（ｌ，ｍ）は、ｌ番目のアミノ酸位置についてのｍ番目の拘束値を含み、Ｌは、アミノ酸位置の数であり、Ｍは、別個のトポロジー的拘束の数である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのＬ×Ｍ行列のＭＰＥは、対応するＣＤ２５参照標的の原子またはアミノ酸の行列と比較して７５％未満である。一部の実施形態では、ＭＰＥは、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満または４５％未満である。一部の実施形態では、比較されている操作されたポリペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連する。
ＩＩＩ．プログラム可能なインビトロ選択
ＩＩＩ．プログラム可能なインビトロ選択
他の態様では、一連のプログラムされた選択工程を使用して結合パートナーを選択する際に本明細書に記載される操作されたポリペプチドを使用する方法が、本明細書でさらに提供され、少なくとも１つの選択工程は、潜在的結合パートナーのプールの、操作されたポリペプチドとの相互作用を評価することを含む。
一部の実施形態では、２つ以上の選択分子を使用して結合分子の選択を操縦する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、候補結合分子のプールを少なくとも１ラウンドの選択に供することを含み、各ラウンドは、プールの少なくとも一部分が陰性選択分子に対してスクリーニングされる少なくとも１つの陰性選択工程、およびプールの少なくとも一部分が陽性選択分子に対してスクリーニングされる少なくとも１つの陽性選択工程を含む。一部の実施形態では、方法は、少なくとも２ラウンド、少なくとも３ラウンド、少なくとも４ラウンド、少なくとも５ラウンド、少なくとも６ラウンド、少なくとも７ラウンド、少なくとも８ラウンド、少なくとも９ラウンド、少なくとも１０ラウンド、またはそれよりも多くのラウンドを含み、各ラウンドは、少なくとも１つの陰性選択工程および少なくとも１つの陽性選択工程を独立して含む。一部の実施形態では、各ラウンドは、１つよりも多くの陰性選択工程もしくは１つよりも多くの陽性選択工程、またはそれらの組み合わせを独立して含む。図５は、３ラウンドの選択を詳細に示す例示的な模式図を提供し、図中、第１および第３のラウンドは、１つよりも多くの陰性選択工程を含み、第１のラウンドは、１つよりも多くの陽性選択ラウンドをさらに含む。スキームに示されるように、２つの陰性選択分子（「ベイト」）が第１のラウンドにおいて使用され、３つの陰性選択分子が第３のラウンドにおいて使用される。さらに、２つの陽性選択分子が、第１のラウンドにおいて使用される。
方法が１つよりも多くのラウンドを含む一部の実施形態では、各陰性および陽性選択分子は、独立して選択される。他の実施形態では、同じ陰性選択分子もしくは同じ陽性選択分子、またはそれらの組み合わせが、１つよりも多くのラウンドにおいて使用され得る。例えば、図５では、ラウンド１で使用されるのと同じ陰性選択分子が、ラウンド３において再度使用され、さらなる第３の陰性選択分子もまた、ラウンド３に含められる。陰性選択工程および陽性選択工程の順序は、ある特定の実施形態では、選択の各ラウンド内で独立して選択され得る。したがって、例えば、一部の実施形態では、方法は、１ラウンド以上の選択を含み、各ラウンドは、最初に陰性選択工程を含み、次いで陽性選択工程を含む。他の実施形態では、方法は、１ラウンド以上の選択を含み、各ラウンドは、最初に陽性選択工程を含み、次いで陰性選択工程を含む。なおさらなる実施形態では、方法は、１ラウンド以上の選択を含み、各ラウンドは、陰性選択工程および陽性選択工程を独立して含み、各ラウンドにおいて、陰性選択工程は、独立して、陽性選択工程の前または陽性選択工程の後である。
選択のかかる方法は、特定の所望の特徴、例えば、結合特異性または結合親和性に向かうかまたはそこから離れるように候補結合分子のライブラリーを操縦するために、陽性（＋）および陰性（－）工程を使用する。陽性選択分子および陰性選択分子の両方を用いる複数の工程を使用することによって、候補のプールは、望ましい特徴についておよび望ましくない特徴に対して選択するために、段階的な様式で指示され得る。さらに、一部の実施形態では、各ラウンド内の各工程の順序、および互いに対するラウンドの順序は、選択を異なる方向に指示することができる。したがって、例えば、一部の実施形態では、（＋）選択とその後の（－）選択とを用いる１ラウンドを含む方法は、（－）選択が最初でありその後が（＋）選択である場合とは異なる最終プールの候補を生じるであろう。このことから、複数のラウンドを含む方法を推定すると、選択工程の順序は、同じ陽性および陰性選択分子が全体として使用される場合であっても、選択された候補の異なる最終プールを生じ得る。
一部の実施形態では、別の選択分子の逆特徴を有する選択分子が使用される。これは、例えば、陽性選択分子を使用して同定された（または陰性選択分子に起因して排除された）候補結合パートナーが、別々の無関係の結合相互作用に起因するのではなく、所望の形質（または所望でない形質）に起因して同定（または排除）されたことを確実にするために、有用であり得る。無関係の相互作用を介して結合している結合パートナーを除去するために、所望の形質（または所望でない形質）を伝達する残基／構造を除いて、選択分子と類似のまたは同じ構造および特徴を有する逆選択分子が使用され得る。例えば、陽性選択分子中の特定の電荷パターンとの相互作用が所望される場合、その電荷パターンを提供する残基が非荷電の残基および／または反対の電荷の残基で置き換えられた逆陰性選択分子が使用され得る。したがって、特定の選択分子について、複数の異なる対応する逆選択分子が可能であり得る。
本明細書で提供される選択方法では、選択分子のうち少なくとも１つは、本明細書に記載される操作されたポリペプチドである。一部の実施形態では、１つよりも多くの操作されたポリペプチドが使用される。一部の実施形態では、各操作されたポリペプチドは、独立して、陽性または陰性選択分子である。ある特定の実施形態では、１ラウンド以上の選択において使用される各選択分子は、独立して、操作されたポリペプチドである。他の実施形態では、操作されたポリペプチドではない少なくとも１つの分子が、選択分子として使用される。操作されたポリペプチドではないかかる選択分子は、例えば、天然に存在するポリペプチドまたはその一部分を含み得る。他の実施形態では、操作されたポリペプチドではない１つ以上の選択分子は、例えば、天然に存在しないポリペプチドまたはその部分を含み得る。例えば、一部の実施形態では、１つ以上の選択分子（例えば、陽性選択分子または陰性選択分子）は、免疫原、抗体、細胞表面受容体、もしくは膜貫通タンパク質、もしくはシグナル伝達タンパク質、もしくはマルチタンパク質複合体、もしくはペプチド－タンパク質複合体、またはそれらの任意の部分、あるいはそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、１つ以上の選択分子は、ＣＤ２５、またはＣＤ２５のいずれかの一部分である。
各工程においてそれについてまたはそれに対して選択される陽性および陰性特徴は、種々の形質から選択され得、得られた１つ以上の最終結合分子の所望の特色に依存して調整され得る。かかる所望の特色は、例えば、１つ以上の結合分子の意図した使用に依存し得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、１つ以上の陽性特徴、例えば、高い特異性について、および１つ以上の陰性特徴、例えば、交差反応性に対して、抗体候補をスクリーニングするために使用される。１つの文脈で陽性特徴とみなされるものは、別の文脈では陰性特徴であり得、逆もまた真であることを理解すべきである。したがって、１つのシリーズの選択ラウンドにおける陽性選択分子は、一部の実施形態では、異なるシリーズの選択ラウンドにおける、または異なる型の結合分子を選択する際の、または異なる目的のためにではあるが同じ型の結合分子を選択する際の、陰性選択分子であり得る。
一部の実施形態では、各選択特徴は、アミノ酸配列、ポリペプチド二次構造、分子動力学、化学的特色、生物学的機能、免疫原性、ＣＤ２５参照標的（複数可）多特異性、交差種ＣＤ２５参照標的反応性、所望でない参照標的（複数可）を超える所望のＣＤ２５参照標的（複数可）の選択性、配列および／または構造的に相同なファミリー内の参照標的（複数可）の選択性、類似のタンパク質機能を有する参照標的（複数可）の選択性、高い配列および／または構造的相同性を有する所望でない標的のより大きいファミリーからの別個の所望の参照標的（複数可）の選択性、別個の参照標的対立遺伝子または突然変異に対する選択性、別個の参照標的の残基レベルでの化学的改変に対する選択性、細胞型に対する選択性、組織型に対する選択性、組織環境に対する選択性、参照標的（複数可）の構造的多様性に対する許容度、参照標的（複数可）の配列多様性に対する許容度、ならびに参照標的（複数可）の動力学多様性に対する許容度からなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、各選択特徴は、異なる型の選択特徴である。他の実施形態では、２つ以上の選択特徴は、同じ型のものではあるが異なる特徴である。例えば、一部の実施形態では、２つ以上の選択特徴は、ポリペプチド二次構造であり、１つは、所望のポリペプチド二次構造についての陽性選択であり、１つは、所望でないポリペプチド二次構造についての陰性選択である。一部の実施形態では、２つ以上の選択特徴は、細胞型に対する選択性であり、陽性選択特徴は、特定の所望の細胞型に対する選択性であり、陰性選択特徴は、特定の所望でない細胞型に対する選択性である。一部の実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上の選択特徴が、同じ型のものである。
一部の実施形態では、選択特徴は、本開示の操作されたポリペプチドへの結合である。例えば、図７、表１、表８および表９に示される操作されたポリペプチドは、図６および表７に示されるエピトープに特異的に結合する抗体（または他の結合剤）について選択するために使用され得る。事例的な選択戦略は、表１０中に提供される。
なお別の態様では、２つ以上の選択操縦ポリペプチドを含む組成物であって、各ポリペプチドが、独立して、１つ以上の陽性操縦特徴を含む陽性選択分子または１つ以上の陰性操縦特徴を含む陰性選択分子である組成物が、本明細書で提供される。かかる特徴は、一部の実施形態では、アミノ酸配列、ポリペプチド二次構造、分子動力学、化学的特色、生物学的機能、免疫原性、参照標的（複数可）多特異性、交差種参照標的反応性、所望でない参照標的（複数可）を超える所望の参照標的（複数可）の選択性、配列および／または構造的に相同なファミリー内の参照標的（複数可）の選択性、類似のタンパク質機能を有する参照標的（複数可）の選択性、高い配列および／または構造的相同性を有する所望でない標的のより大きいファミリーからの別個の所望の参照標的（複数可）の選択性、別個の参照標的対立遺伝子または突然変異に対する選択性、別個の参照標的の残基レベルでの化学的改変に対する選択性、細胞型に対する選択性、組織型に対する選択性、組織環境に対する選択性、参照標的（複数可）の構造的多様性に対する許容度、参照標的（複数可）の配列多様性に対する許容度、ならびに参照標的（複数可）の動力学多様性に対する許容度からなる群から選択され得る。
したがって、さらなる態様では、本明細書に記載される選択操縦組成物を用いて結合分子のライブラリーをスクリーニングする方法であって、選択の各ラウンドが、プールの少なくとも一部分を陰性選択分子に対してスクリーニングする陰性選択工程；およびプールの少なくとも一部分を陽性選択分子についてスクリーニングする陽性選択工程を含み；各ラウンド内の選択工程の順序、およびラウンドの順序が、代替的順序とは異なるサブセットのプールの選択を生じる方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される選択操縦ポリペプチドの組成物または本明細書に記載されるスクリーニングの方法を使用して評価されている結合パートナーは、ファージライブラリー、例えば、Ｆａｂ含有ファージライブラリー；または細胞ライブラリー、例えば、Ｂ細胞ライブラリーもしくはＴ細胞ライブラリーである。
本明細書で提供されるスクリーニングの方法の一部の実施形態では、方法は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上または７つ以上のラウンドの選択を含む。１つよりも多くのラウンドが存在する一部の実施形態では、各ラウンドは、異なるセットの選択分子を含む。１つよりも多くのラウンドが存在する他の実施形態では、少なくとも２つのラウンドが、同じ陰性選択分子、同じ陽性選択分子、またはそれら両方を含む。
スクリーニング方法の一部の実施形態では、方法は、次のラウンドの選択に進む前に、プールのサブセットを分析することを含む。ある特定の実施形態では、各サブセットプール分析は、ペプチド／タンパク質バイオセンサー結合、ペプチド／タンパク質ＥＬＩＳＡ、ペプチドライブラリー結合、細胞抽出物結合、細胞表面結合、細胞活性アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、酵素活性アッセイ、遺伝子発現プロファイル、タンパク質改変アッセイ、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学からなる群から独立して選択される。一部の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、サブセットプールの完全配列レパートリー分析、例えば、次世代配列決定を含む。一部の実施形態では、統計的および／もしくは情報科学スコアリング、または機械学習訓練が、１つ以上の選択ラウンドにおいてプールの１つ以上のサブセットを評価するために使用される。
一部の実施形態では、引き続くラウンドのための陽性および／または陰性選択分子の正体および／または順序は、１つの選択ラウンドからのサブセットプールを分析することによって決定される。一部の実施形態では、統計的および／もしくは情報科学スコアリング、または機械学習訓練は、引き続くラウンド（例えば、次のラウンド、またはプログラム中のさらに進んだラウンド）のための陽性および／または陰性選択分子の正体および／または順序を決定するために、プールの１つ以上のサブセットを１つ以上の選択ラウンドで評価するために使用される。
なおさらなる実施形態では、選択の方法は、次の選択ラウンドに進む前に、選択ラウンドから得られたサブセットプールを改変することを含む。かかる改変には、例えば、サブセットプールの遺伝的突然変異、サブセットプールの遺伝的枯渇（例えば、選択に進めるサブセットプールのサブセットを選択すること）、サブセットプールの遺伝的富化（例えば、プールのサイズを増加させること）、サブセットプールの少なくとも一部分の化学的改変、もしくはサブセットプールの少なくとも一部分の酵素的改変、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。一部の実施形態では、統計的および／もしくは情報科学スコアリング、または機械学習訓練は、サブセットプールを評価し、改変されたサブセットプールを選択に進める前に行われる１つ以上の改変を決定するために使用される。ある特定の実施形態では、かかる統計的および／もしくは情報科学スコアリング、または機械学習訓練は、引き続くラウンドの選択のための陽性および／または陰性選択分子の正体および／または順序を決定するためにも使用される。
任意の適切なアッセイが、各工程における結合パートナーのプールの選択分子との結合を評価するために使用され得る。一部の実施形態では、結合は、例えば、結合パートナー上の標識を直接的に検出することによって、直接的に評価される。かかる標識には、例えば、蛍光標識、例えば、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質が含まれ得る。他の実施形態では、結合は、例えば、サンドイッチアッセイを使用して、間接的に評価される。サンドイッチアッセイでは、結合パートナーが選択分子に結合し、次いで、標識された二次試薬が、結合した結合パートナーを標識するために添加される。次いで、この標識された二次試薬が検出される。サンドイッチアッセイ成分の例には、抗Ｈｉｓタグ抗体もしくはＨｉｓタグ特異的蛍光プローブを用いて検出されるＨｉｓタグ化結合パートナー；標識されたストレプトアビジンもしくは標識されたアビジンを用いて検出されるビオチン標識された結合パートナー；または抗結合パートナー抗体を用いて検出される未標識の結合パートナーが含まれる。
一部の実施形態では、各工程において選択されている結合パートナーは、いくつもの利用可能な検出方法を使用して、結合シグナルまたは用量応答に基づいて同定される。これらの検出方法には、例えば、画像化、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、質量分析またはバイオセンサーが含まれ得る。一部の実施形態では、ヒット閾値が規定され（例えば、中央値シグナル）、そのシグナルを上回るシグナルを有する任意のものが、推定ヒットモチーフとしてフラグされる。
ＩＶ．抗体を産生するための操作されたポリペプチドの使用
ＩＶ．抗体を産生するための操作されたポリペプチドの使用
本明細書で提供される、および本明細書で提供される方法によって同定された操作されたポリペプチドは、例えば、１つ以上の抗体を産生するために使用され得る。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である。したがって、一部の実施形態では、免疫原で動物を免疫化することによって産生される抗体であって、免疫原が本明細書で提供される操作されたポリペプチドである抗体が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、動物は、ヒト、ウサギ、マウス、ハムスター、サルなどである。ある特定の実施形態では、サルは、カニクイザル、マカクザルまたはアカゲザルである。操作されたポリペプチドで動物を免疫化することは、例えば、ペプチドを含み、適宜アジュバントを含む組成物の少なくとも１つの用量を動物に投与することを含み得る。一部の実施形態では、動物から抗体を生成することは、抗体を発現するＢ細胞を単離することを含む。一部の実施形態は、抗体を発現するハイブリドーマを創出するために、Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させることをさらに含む。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドを使用して生成された抗体は、ヒトおよびサル、例えば、カニクイザルと交差反応できる。
ａ．操作されたポリペプチドの特徴
ａ．操作されたポリペプチドの特徴
本明細書で提供される操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５と共通する１つ以上の特徴を有する。一部の実施形態では、これらは、ＣＤ２５の表面の少なくとも１つの特徴、例えば、ＣＤ２５の結合パートナーに結合する機能的界面表面を示す。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＣＤ２５に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５に対する抗体と相互作用することが公知ではないＣＤ２５の表面の一部分の少なくとも１つの特徴を示す。
特定の型の特徴の一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の機能的界面（例えば結合表面）の模倣物を提示するが、操作されたポリペプチドによって共有される特徴は、全体としてＣＤ２５と共有されていると最良に記述され得る。例えば、共有される１つの特徴は、ＣＤ２５の結合パートナーとＣＤ２５との間の結合であり得、この結合は、ＣＤ２５の機能的結合界面との間に生じるが、機能的結合界面の構造および配向は、ＣＤ２５タンパク質の残部によって支持される。
かかる共有される特徴には、例えば、構造的測定基準もしくは機能的測定基準、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。少なくとも１つの共有される特徴には、例えば、１つ以上の構造的類似性、コンフォメーション的エントロピーの類似性、１つ以上の化学的記述子の類似性、１つ以上の機能的結合の類似性、もしくは１つ以上の表現型的類似性、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の表面の少なくとも一部分、例えば機能的界面、例えば結合表面と、これらの特徴のうち１つ以上を共有する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５（またはＣＤ２５の表面の一部分、例えば結合表面）に対して構造的類似性を有し、この構造的類似性は、骨格平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）または側鎖ＲＭＳＤによって評価される。ＲＭＳＤは、原子間の平均距離を評価し、類似の２つの別々の構造が３次元空間中にどのように存在するかを比較するために、３次元構造に適用され得る。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５（またはＣＤ２５の機能的界面）との間での、骨格もしくはアミノ酸側鎖またはそれら両方のＲＭＳＤは、ＣＤ２５（またはＣＤ２５の機能的界面）と異なる分子との間のＲＭＳＤよりも低い。一部の実施形態では、それは、操作されたポリペプチドと比較されるＣＤ２５の一部分（またはＣＤ２５の機能的界面の一部分）である。ＲＭＳＤは、例えば、操作されたポリペプチドの実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造；およびＣＤ２５（またはその機能的界面）の実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造を使用して評価され得る。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、操作されたポリペプチドの骨格が、ＣＤ２５のｘ線構造の骨格と比較して、６．０Å以下の平均ＲＭＳＤを有する場合、ＣＤ２５と構造的に類似とみなされる。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５（またはＣＤ２５の表面の一部分、例えば結合表面）と類似のコンフォメーション的エントロピーを有し、このコンフォメーション的エントロピーは、例えば、操作されたポリペプチドの実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造、およびＣＤ２５（またはその部分）の実験的に測定された構造または分子動力学シミュレートされた運動を使用して評価される。かかるシミュレーションでは、一部の実施形態では、ＣＤ２５（またはその部分、例えば、結合表面の一部分）の実験的に測定された構造または分子動力学シミュレートされた運動が使用される。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドのコンフォメーション的エントロピーは、標準的な生理的条件下で実行された操作されたポリペプチド分子動力学アンサンブルが、ＣＤ２５（またはその部分）の既知のｘ線結晶構造と比較して、全ての非水素原子位置がＲＭＳＤ≦６．０Åである全ての状態を有する場合、ＣＤ２５（またはその部分）のものと類似とみなされる。
なお他の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５（またはその一部分、例えば結合表面）と類似の１つ以上の化学的記述子を有する。他の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の結合パートナー（例えば、ＣＤ２５に対する抗体）に対して相補的な１つ以上の化学的記述子を有する。かかる化学的記述子（類似または相補的であり得る）には、例えば、疎水性パターン、Ｈ結合パターン、原子容／半径、電荷パターンもしくは原子占有パターン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。これらの化学的記述子は、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドの実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造およびＣＤ２５（またはその一部分、例えば結合表面）の実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造を使用して評価され得る。
なお他の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５と類似の機能的結合を有する。例えば、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５結合パートナーまたはその断片への結合を有する。一部の実施形態では、結合パートナーは、ネイティブ結合パートナーの断片であるかまたは改変されたネイティブ結合パートナーである。かかる改変には、例えば、ネイティブ結合パートナーの断片を少なくとも含む融合タンパク質；発色団を用いた標識化；フルオロフォアを用いた標識化；ビオチンを用いた標識化；またはＨｉｓタグを用いた標識化が含まれ得る。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の、結合パートナーとの結合の、約２桁以内または約１桁以内である、ＣＤ２５の結合パートナーとの結合を有する。一部の実施形態では、結合の類似性は、結合定数（Ｋｄ）、または阻害定数（Ｋｉ）、または結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）、または結合の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、または結合対の結合親和性、または結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を比較することによって評価される。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＣＤ２５に対する抗体である。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合定数（Ｋｄ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとのＫｄの１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。他の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの阻害定数（Ｋｉ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとのＫｉの１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）と類似である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）の１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。他の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）と類似である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとの解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）の１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５結合パートナーとの結合親和性は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合親和性と類似である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５結合パートナーとの結合親和性は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合親和性の１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５結合パートナーとの結合のギブズ自由エネルギーは、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合のギブズ自由エネルギーの１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。一部の実施形態では、ＣＤ２５結合パートナーは、ＣＤ２５の抗体である。
なお他の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５またはその一部分（例えば、ＣＤ２５の結合表面）と配列類似性を共有する。類似性は、ＣＤ２５（またはその部分）の連続アミノ酸配列またはＣＤ２５（またはその部分）の非連続配列と比較され得る。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＤ２５の結合表面は、非連続アミノ酸配列によって形成され、操作されたポリペプチドは、表面を形成する非連続配列の少なくとも一部分との配列類似性を有する。他の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の結合表面を形成する連続アミノ酸配列の少なくとも一部分との配列類似性を有する。一部の実施形態では、ＣＤ２５の結合表面は、ＣＤ２５に対する抗体に結合するエピトープを含む。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の連続配列、例えば、ＣＤ２５の結合表面を形成する連続配列の一部分に対して少なくとも４０％同一、少なくとも４５％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一または少なくとも９０％同一である配列を有する。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の非連続配列、例えば、ＣＤ２５の結合表面を形成する非連続配列の一部分に対して少なくとも４０％同一、少なくとも４５％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一または少なくとも９０％同一である配列を有する。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の結合表面の連続する部分に対して少なくとも４０％同一、少なくとも４５％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一または少なくとも９０％同一である配列を有する。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の結合表面の２つ以上の連続しない部分に対して少なくとも４０％同一、少なくとも４５％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一または少なくとも９０％同一である配列を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の結合表面と少なくとも部分的に同一な（本明細書に記載される通りの）配列を有し、結合表面は、ＣＤ２５に対する１つ以上の抗体に結合するエピトープを含む。
ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５（またはその部分）との配列類似性は、存在する場合、リンカーを含まない操作されたポリペプチドのペプチド部分（複数可）を使用して評価される。ある特定の実施形態では、１つ以上の連結部分は、例えば、操作されたポリペプチドが、アミノ酸を含む１つ以上のリンカーを含む場合と同様とみなされる。
ｂ．操作されたポリペプチド
ｂ．操作されたポリペプチド
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１つよりも多くのペプチド、例えば、少なくとも２つのペプチド、または少なくとも３つのペプチド、またはそれよりも多くのペプチドを含む。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１個と１０個との間のペプチド、１個と８個との間のペプチド、１個と６個との間のペプチド、１個と４個との間のペプチド、２個と１０個との間のペプチド、２個と８個との間のペプチド、２個と６個との間のペプチドまたは２個と４個との間のペプチドを含む。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、２～１００個の間のアミノ酸、例えば、２～８０個の間のアミノ酸、２～７０個の間のアミノ酸、２～６０個の間のアミノ酸、２～５０個の間のアミノ酸、２～４０個の間のアミノ酸、２～３０個の間のアミノ酸、２～２５個の間のアミノ酸、２～２０個の間のアミノ酸、２～１５個の間のアミノ酸、５～３０個の間のアミノ酸、５～２５個の間のアミノ酸、５～２０個の間のアミノ酸、５～１５個の間のアミノ酸または９と１５個の間のアミノ酸を含む。
ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、１つよりも多くのペプチド、例えば、少なくとも２つのペプチド、または少なくとも３つのペプチド、または少なくとも４つのペプチド、またはそれよりも多くのペプチドを含み、各ペプチドは、１～１００個の間のアミノ酸、または２～１００個の間のアミノ酸、例えば、２～８０個の間のアミノ酸、２～７０個の間のアミノ酸、２～６０個の間のアミノ酸、２～５０個の間のアミノ酸、２～４０個の間のアミノ酸、２～３０個の間のアミノ酸、２～２５個の間のアミノ酸、２～２０個の間のアミノ酸、２～１５個の間のアミノ酸、５～３０個の間のアミノ酸、５～２５個の間のアミノ酸、５～２０個の間のアミノ酸、５～１５個の間のアミノ酸または９個と１５個の間のアミノ酸を独立して含む。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸のみを含む。他の実施形態では、操作されたポリペプチドは、非天然アミノ酸、例えば、天然に存在すると非天然アミノ酸との組み合わせを含む。
操作されたポリペプチドが２つ以上のペプチドを含む一部の実施形態では、各ペプチドは、ＣＤ２５またはその一部分（例えば結合表面）の少なくとも１つの特徴を独立して示す。一部の実施形態では、各ペプチドは、ＣＤ２５またはその一部分の、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、または１個、または２個の特徴を独立して示す。一部の実施形態では、特徴は、ＣＤ２５の抗体と相互作用するＣＤ２５の一部分と共有される。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の結合パートナー、例えば、ＣＤ２５の抗体に対して相補的な少なくとも１つの特徴を有する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのペプチドは、ＣＤ２５またはその一部分と、１つ以上の構造的類似性を共有する。構造的類似性は、一部の実施形態では、骨格ＲＭＳＤまたは側鎖ＲＭＳＤによって評価され得る。例えば、ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドのペプチドとＣＤ２５（またはその一部分）との間での、骨格もしくはアミノ酸側鎖またはそれら両方のＲＭＳＤは、ＣＤ２５（またはその部分）と異なる分子（例えば、異なるペプチド）との間のＲＭＳＤよりも低い。一部の実施形態では、ＣＤ２５の一部分は、ペプチド、例えば、ＣＤ２５の表面の一部分、例えば、ＣＤ２５に対する抗体と相互作用する表面と比較される。構造的類似性のＲＭＳＤは、例えば、ペプチドの実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造およびＣＤ２５またはその部分の実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造を使用して、評価され得る。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのペプチドは、ペプチドの骨格が、ＣＤ２５またはその部分の既知のｘ線構造の骨格と比較して、６．０Å以下の平均ＲＭＳＤを有する場合、ＣＤ２５（またはその部分）と構造的に類似とみなされる。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５またはその一部分と類似のコンフォメーション的エントロピーを有する。一部の実施形態では、ペプチドの実験的に測定された構造または分子動力学シミュレートされた運動は、コンフォメーションエントロピーをＣＤ２５またはその一部分の実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造と比較するために使用される。コンフォメーション的エントロピーは、一部の実施形態では、標準的な生理的条件下で実行されたペプチド分子動力学アンサンブルが、ＣＤ２５またはその部分の既知のｘ線結晶構造と比較して、全ての非水素原子部分がＲＭＳＤ≦６．０Åである全ての状態を有する場合、類似とみなされる。一部の実施形態では、ＣＤ２５の一部分は、ペプチド、例えば、ＣＤ２５の抗体と相互作用するＣＤ２５の表面部分と比較される。
さらなる実施形態では、操作されたポリペプチドのペプチドとＣＤ２５（またはその部分）との間の類似性は、１つ以上の化学的記述子であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＣＤ２５（またはその一部分）と共通する１つ以上の化学的記述子またはＣＤ２５の結合パートナー（例えば、ＣＤ２５に対する抗体）に対して相補的な１つ以上の化学的記述子を有する。化学的記述子には、例えば、疎水性パターン、Ｈ結合パターン、原子容／半径、電荷パターンもしくは原子占有パターン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのペプチドは、ＣＤ２５もしくはその一部分と類似のまたはＣＤ２５の結合パートナー（例えば、ＣＤ２５に対する抗体）に対して相補的な、１つ以上の疎水性パターン、Ｈ結合パターン、原子容／半径、電荷パターンもしくは原子占有パターン、またはそれらの任意の組み合わせを有する。一部の実施形態では、類似性は、同じ化学的記述子、例えば、同じ疎水性パターン、Ｈ結合パターン、原子容／半径、電荷パターンまたは原子占有パターンのうち１つ以上を共通して有している。相補的な化学的記述子には、例えば、ＣＤ２５の結合パートナー、例えば、ＣＤ２５に対する抗体の負の電荷パターンを補完する正の電荷パターンを有するペプチドが含まれる。これらの化学的記述子は、一部の実施形態では、ペプチドの実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造およびＣＤ２５またはＣＤ２５結合パートナーの実験的に測定された構造またはシミュレートされた構造（例えば、相補的な評価のため）を使用して、評価され得る。
例えば、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５と結合パートナー（例えば、ＩＬ－２）との結合と類似して、ＣＤ２５の結合パートナーに結合する。一部の実施形態では、結合パートナーは、ネイティブ結合パートナー、ネイティブ結合パートナーの断片、または改変されたネイティブ結合パートナーもしくはその断片、またはＣＤ２５に特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、結合パートナーは、特定の状況下で結合するが、他の状況下では結合しない。一部の実施形態では、結合パートナーは、病理学的条件下で結合するかまたは非病理学的条件下で結合する。結合パートナーは、例えば、構成的に発現されてもよいし、もしくは偶発的な遺伝子の産物であってもよく、またはタンパク質もしくはその断片を含み得る。ある特定の実施形態では、結合パートナーは、ネイティブ結合パートナーの断片であるかまたは改変されたネイティブ結合パートナーである。改変には、一部の実施形態では、ネイティブ結合パートナーの断片を少なくとも含む融合タンパク質；発色団を用いた標識化；フルオロフォアを用いた標識化；ビオチンを用いた標識化；またはＨｉｓタグを用いた標識化が含まれ得る。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の、結合パートナーとの結合の、約２桁以内または約１桁以内である、ＣＤ２５の結合パートナーとの結合を有する。一部の実施形態では、結合の類似性は、結合定数（Ｋｄ）、または阻害定数（Ｋｉ）、または結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）、または結合の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、または結合対の結合親和性、または結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を比較することによって評価される。一部の実施形態では、結合パートナーは、ＣＤ２５に対する抗体である。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合定数（Ｋｄ）は、ＣＤ２５の結合パートナーとのＫｄの１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。他の実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５結合パートナーとの阻害定数（Ｋｉ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとのＫｉの１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）と類似である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）の１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。他の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）と類似である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドのＣＤ２５結合パートナーとの結合の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）は、ＣＤ２５と結合パートナーとの解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）の１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５結合パートナーとの結合親和性は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合親和性と類似である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５結合パートナーとの結合親和性は、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合親和性の１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドとＣＤ２５結合パートナーとの結合のギブズ自由エネルギーは、ＣＤ２５と結合パートナーとの結合のギブズ自由エネルギーの１０００倍以内、８００倍以内、６００倍以内、４００倍以内、２００倍以内、１００倍以内、９０倍以内、８０倍以内、７０倍以内、６０倍以内、５０倍以内、４０倍以内、３０倍以内、２０倍以内、１０倍以内、８倍以内、６倍以内、４倍以内、２倍以内、１．５倍以内、１．２倍以内またはそれと約同じである。一部の実施形態では、ＣＤ２５結合パートナーは、ＣＤ２５の抗体である。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５またはその一部分との配列類似性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の抗体に結合するＣＤ２５の表面の一部分との配列類似性を有する。ある特定の実施形態では、配列類似性は、ＣＤ２５の連続アミノ酸配列と比較される。他の実施形態では、配列類似性は、ＣＤ２５の非連続配列と比較される。例えば、ある特定の実施形態では、フォールディングされたＣＤ２５の結合表面は、非連続アミノ酸配列によって形成され、操作されたポリペプチドは、表面を形成する非連続配列の少なくとも一部分との配列類似性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の結合表面を形成する連続アミノ酸配列の少なくとも一部分との配列類似性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の連続配列、例えば、結合表面を形成する連続配列の少なくとも一部分に対して少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一または少なくとも９９％同一である配列を有する。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の非連続配列、例えば、結合表面を形成する非連続配列の少なくとも一部分に対して少なくとも４０％同一、少なくとも４５％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一または少なくとも９０％同一である配列を有する。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の連続する部分に対して少なくとも４０％同一、少なくとも４５％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一または少なくとも９０％同一である配列を有する。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の２つ以上の連続しない部分に対して少なくとも４０％同一、少なくとも４５％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一または少なくとも９０％同一である配列を有する。一部の実施形態では、少なくとも２つのペプチドを含む操作されたポリペプチドについて、操作された免疫原（ｉｍｍｕｎｇｏｅｎ）の２つ以上のペプチドは、ＣＤ２５、例えば、ＣＤ２５の結合表面と、配列類似性を独立して共有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドと配列類似性を共有するＣＤ２５の部分は、ＣＤ２５に対する抗体に結合する表面である。
ｃ．連結部分
ｃ．連結部分
本明細書で提供される操作されたポリペプチドは、連結部分を含んでもよい。存在する場合、連結部分は、例えば、独立して、架橋またはリンカーであり得る。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、Ｎ個のペプチドおよびＮ－１個の連結部分；またはＮ個のペプチドおよびＮ－１個の連結部分；またはＮ個のペプチドおよびＮ個の連結部分；またはＮ個のペプチドおよびＮ＋１個の連結部分；またはＮ個のペプチドおよびＮ＋２個の連結部分；またはＮ個のペプチドおよびＮ－２個の連結部分を含み、Ｎは、３以上である。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、少なくとも１つの連結部分、少なくとも２つの連結部分、少なくとも３つの連結部分、少なくとも４つの連結部分、少なくとも５つの連結部分、少なくとも６つの連結部分、１つ～６つの間の連結部分、１つ～５つの間の連結部分、１つ～４つの間の連結部分、１つ～３つの間の連結部分、１つの連結部分、または２つの連結部分を含む。一部の実施形態では、各連結部分は、独立して、架橋またはリンカーである。ある特定の実施形態では、各連結部分は、架橋である。他の実施形態では、各連結部分は、リンカーである。なおさらなる実施形態では、少なくとも１つの連結部分は架橋であり、残りの連結部分は、独立して、架橋またはリンカーである。他の実施形態では、少なくとも１つの連結部分はリンカーであり、残りの連結部分は、独立して、架橋またはリンカーである。
架橋には、例えば、１つのアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸の部分との間の共有結合が含まれる。アミノ酸は、独立して、天然または非天然アミノ酸であり得る。一部の実施形態では、架橋には、２つのアミノ酸の側鎖間、または１つのアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸のアミンもしくはカルボキシル基との間の共有結合が含まれる。架橋は、１つのペプチド内で形成し得るかまたは２つの別々のペプチド間で形成し得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたポリペプチドは、ペプチド内架橋およびペプチド間架橋の両方の混合物を含む。一部の実施形態では、架橋は、アミノ酸側鎖の２つのチオール基間のジスルフィド結合、例えば、２つのシステイン間のジスルフィド結合である。一部の実施形態では、架橋は、２つのアミノ酸のアミン基とカルボン酸基との間のアミド結合であり、アミン基およびカルボン酸基のうち少なくとも一方は、アミノ酸の側鎖上に位置決めされる（例えば、アミド結合は、骨格アミド結合ではない）。一部の実施形態では、架橋は、ジアミノピメリン酸とアスパラギン酸との間で形成されるアミド結合である。一部の実施形態では、アミド架橋は、ラクタムである。一部の実施形態では、架橋は、オキシムである。一部の実施形態では、架橋は、ヒドラゾンである。一部の実施形態では、架橋は、あるアミノ酸の側鎖と別のアミノ酸の部分との間の共有結合を含み、側鎖および部分の一方または両方は、共有結合を形成するように改変される。かかる改変には、例えば、酸化、還元、中間体を形成する触媒との反応、または当業者に公知の他の改変が含まれ得る。
リンカーには、例えば、ペプチドの少なくとも２つの部位に共有結合された分子または少なくとも２つのペプチド間で共有結合された分子が含まれる。リンカーは、１つのペプチド内の２つの部位に結合し得るかもしくは２つの別々のペプチド間を結合し得るかまたはそれら両方の組み合わせであり得る。例えば、２つよりも多くのペプチド結合部位を含むリンカーは、ペプチド内結合およびペプチド間結合の両方を形成し得る。少なくとも２つのペプチドおよび少なくとも１つのリンカーを含む操作されたポリペプチドでは、ペプチドおよびリンカーは、種々の異なる立体配置で接続され得る。例えば、操作されたポリペプチドは、ペプチドで終わる、ペプチド－リンカー－ペプチドなどのパターンを有し得る。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、分岐点を形成するリンカー、例えば、３つのペプチドに独立して結合されるリンカーを含む。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、３つのペプチド結合部位を有するリンカーを含み、リンカーは、２つのペプチドのみに結合される。
一部の実施形態では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。リンカーの一部を形成するアミノ酸は、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドから別々に同定され得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、界面タンパク質の機能的界面の構造および／または機能を反映する構造的、化学的および／または動力学的様式で、操作されたポリペプチドのペプチドを分離および提示する領域である。なおさらなる実施形態では、リンカーは、操作されたポリペプチドのペプチドに接続されない場合、それ自体では機能を有さない、例えば、ＣＤ２５の結合パートナーへの結合を示さない。一部の実施形態では、各リンカーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたはそれよりも多くのアミノ酸を独立して含む。一部の実施形態では、各リンカーは、１つのアミノ酸、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸、５つのアミノ酸または６つのアミノ酸を独立して含む。リンカーの一部を形成するアミノ酸は、一部の実施形態では、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸であり得る。各リンカーは、一部の実施形態では、１つ以上のアルファ－アミノ酸、１つ以上のベータ－アミノ酸もしくは１つ以上のガンマ－アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせを独立して含み得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、環状ベータ残基を独立して含む。環状ベータ残基には、例えば、ＡＰＣまたはＡＣＰＣが含まれ得る。なおさらなる実施形態では、リンカーは、１つ以上のグリシン残基、１つ以上のセリン残基または１つ以上のプロリン残基を含み得る。一部の実施形態では、リンカーは、ＡＰ、ＧＰ、ＧＳＧ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧ）ｎ、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、（ＰＧＳＧ）ｎおよびＰＧＳＧＳＧからなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、式中、ｎは、１と１０との間の整数である。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、少なくとも１つのリンカーを含み、各リンカーは、アミノ酸を含まないか、または各リンカーは、天然アミノ酸を含まないか、または各リンカーは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、ポリマーを含む。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧを含むリンカーは、例えば、少なくとも３個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも４個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも５個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも６個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも７個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも８個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも９個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも１０個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも１１個のＰＥＧモノマー単位、少なくとも１２個のＰＥＧモノマー単位または１２個よりも多くのＰＥＧモノマー単位を含み得る。ＰＥＧを含むリンカーの一部の実施形態では、ＰＥＧは、３個～１２個の間のモノマー単位、３個～６個の間のモノマー単位、６個～１２個の間のモノマー単位または４個～８個の間のモノマー単位を含む。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＰＥＧ３（３個のモノマー単位を含む）、ＰＥＧ６またはＰＥＧ１２を含む少なくとも１つのリンカーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、独立して、ＰＥＧ３、ＰＥＧ６またはＰＥＧ１２である。さらなる実施形態では、リンカーは、マルチアームＰＥＧを含む。例えば、ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、４アームＰＥＧまたは８アームＰＥＧを独立して含む。ある特定の実施形態では、各アームは、３個～１２個の間のモノマー単位、または３個～６個の間のモノマー単位、または６個～１２個の間のモノマー単位、または４個～８個の間のモノマー単位を独立して含む。ある特定の実施形態では、マルチアームＰＥＧの各アームは、４アームまたは８アームＰＥＧなど、同じ数のモノマー単位を含み、各アームは、３個のモノマー単位、６個のモノマー単位または１２個のモノマー単位を含む。
他の実施形態では、リンカーは、デンドリマーを含む。デンドリマーには、例えば、分子部分が放射状に伸長する対称コアを含むツリー様の分岐アーキテクチャを有する分子が含まれ、分岐点は、分子中に新たな層を形成する。各新たな分岐点は、新たなより大きい層を導入し、これらの放射状の伸長は、デンドリマーの外側末端表面において官能基で終結する場合が多い。したがって、分岐点の数を増加させることは、次に、表面における末端官能基の可能な数を増幅させる。
一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、アミノ酸でもポリマーでもない小分子を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、ベンゾジアゼピンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ピロリジンジオン部分（例えば、ピロリジン－２，５－ジオン部分）であり得る、スルフヒドリル－マレイミド反応の産物である一部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミジン部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、チオエーテル部分を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、トランス－ピロリジン－３，４－ジカルボキサミドを含む。
操作されたポリペプチドが少なくとも２つのリンカーを含む一部の実施形態では（例えば、操作されたポリペプチドが少なくとも２つの連結部分を含み、各連結部分が、独立して、リンカーもしくは架橋であるか、または各連結部分が独立してリンカーである実施形態では）、各リンカーは、独立して、本明細書に記載されるリンカーのいずれかである。例えば、一部の実施形態では、各リンカーは、独立して、１つ以上のアミノ酸を含むリンカー、ポリマーを含むリンカー、デンドリマーを含むリンカー、またはアミノ酸でもポリマーでもない小分子を含むリンカーである。
操作されたポリペプチドの１つ以上の連結部分は、目的の特定の構造的もしくは機能的特徴、またはそれらの組み合わせを付与し得る。例えば、一部の実施形態では、連結部分は、構造的特徴もしくは機能的特徴、またはそれらの組み合わせを付与するために、操作されたポリペプチド中に存在する。かかる構造的特徴には、例えば、増加した構造的柔軟性、減少した構造的柔軟性、方向特色（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｆｅａｔｕｒｅ）、増加した長さまたは減少した長さが含まれ得る。目的とされ得る方向特色には、例えば、構造的ターン、または線状構造の維持が含まれ得る。機能的特徴には、例えば、増強された溶解度、１つ以上のプロトン化部位、１つ以上のタンパク質分解部位、１つ以上の酵素的改変部位、１つ以上の酸化部位、標識、または捕捉ハンドルが含まれ得る。一部の実施形態では、リンカーは、１つ以上の機能的特徴もしくは１つ以上の構造的特徴、またはそれらの組み合わせを含む。
一部の実施形態では、１つ以上のリンカーは、操作されたポリペプチド中に構造的「ターン」を独立して導入する。かかるリンカーの例には、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ａｌａ－Ｐｒｏおよびtrans－ピロリジン－３，４－ジカルボキサミドが含まれる。一部の実施形態では、操作されたポリペプチド中に存在する１つ以上のリンカーは、リンカーが存在しない場合または異なるリンカーの選択と比較して、操作されたポリペプチドの構造的柔軟性を増加させる。例えば、別のリンカーよりも長いおよび／または立体障害の度合いが低いリンカーは、一部の実施形態では、リンカーが存在しなかった場合または別のリンカーが代わりに使用された場合よりも高い構造的柔軟性を有する分子を生じ得る。他の実施形態では、例えば、別のリンカーよりも短いおよび／もしくは立体障害の度合いが高いリンカー、または１つ以上のペプチドの柔軟性を低減させる位置もしくは型の架橋を含む、１つ以上の連結部分は、操作されたポリペプチドにおける構造的柔軟性を独立して減少させる。特定のペプチド間または特定のアミノ酸側鎖間の特定の位置における架橋の存在は、架橋が異なる位置にあった場合もしくは異なる側鎖間にあった場合（例えば、ジスルフィドまたはアミド架橋）または架橋が存在しなかった場合よりも低い構造的柔軟性を有する分子を生じ得る。
ｄ．さらなる成分
ｄ．さらなる成分
一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたポリペプチドは、１つ以上のさらなる成分を含む。例えば、一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、操作されたポリペプチドを固体表面、例えば、ビーズまたは平坦な表面に結合させる１つ以上の部分を含む。一部の実施形態では、結合部分は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）もしくはビオチン、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドを固体表面に結合させることは、例えば、操作されたポリペプチドの１つ以上の特徴の評価、例えば、ＣＤ２５の結合パートナー（例えば、ＣＤ２５に対する抗体）との結合の評価を可能にし得る。
ｅ．配列類似性
ｅ．配列類似性
一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたポリペプチドは、表１：
に列挙される配列のうち１つを有する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列類似性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列類似性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列類似性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列類似性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列類似性を有する。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つを含む。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つを有する。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つを含み；Ｎ末端もしくはＣ末端またはそれら両方において改変される。例えば、一部の実施形態では、Ｃ末端またはＮ末端は、別の分子に共有結合される。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、配列番号１～２１のいずれか１つ；およびＮ末端もしくはＣ末端またはそれら両方における１つ以上のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、Ｎ末端分子は、ビオチン－ＰＥＧ２：
一部の実施形態では、Ｃ末端分子は、ビオチンが後に続くリンカー（例えば、－ＧＳＧＳＧＫ－ビオチン）である。操作されたポリペプチドのＣ末端にビオチンを結合させるのに適切な他のリンカーには、ＧＳＧ、ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＳＳＧＳＳ、ＧＳＧＫ、ＧＳＳＫ、ＧＧＳＫ、ＧＧＳＧＧＳＫ、ＧＳＳＧＳＳＫなどが含まれる。
Ｖ．操作されたポリペプチドを選択する方法
Ｖ．操作されたポリペプチドを選択する方法
本明細書に記載される操作されたポリペプチドを選択する方法が、本明細書でさらに提供される。かかる方法は、例えば、操作されたポリペプチドの構造的特徴の反復最適化を使用することを含み得る。
一部の実施形態では、ＣＤ２５の１つ以上のセクションは、標的界面として同定される。一部の実施形態では、同定されたセクション（複数可）の少なくとも一部分は、ＣＤ２５の抗体に結合する。したがって、例えば、一部の実施形態では、１つ以上の抗体に対するエピトープであるＣＤ２５の一部分が、標的界面として同定される。他の実施形態では、ＣＤ２５のセクションは、抗体に結合しないかまたは抗体結合が生じるかどうかが未知である標的界面として同定される。ある特定の実施形態では、ＣＤ２５の少なくとも一部分についての結晶構造は未知であり、標的界面の初期選択は、ＣＤ２５およびＣＤ２５結合の分子動力学シミュレーションを含む。一部の実施形態では、１つ以上の初期インプット配列は、同定されたセクション（単数または複数）から得られ、各配列は、独立して、連続または非連続である。操作されたポリペプチド候補を開発する際に、各配列の界面残基の少なくとも一部は保持され、１つ以上の連結部分は、所望の構造的および動力学的特徴を提供するために配列中に取り込まれる。一部の実施形態では、同族標的の構造および動力学と比較して所望の構造的および動力学的特徴を達成するために、１つ以上の非界面残基が配列に付加されるかまたはインプット配列中の１つ以上の残基が１つ以上の非界面残基で置き換えられる。一部の実施形態では、これらの非界面残基は、ＣＤ２５の標的界面由来でないか、またはＣＤ２５の標的界面と１つ以上の特徴を共有しないか、または保持された界面残基よりも、より少ない特徴を共有するか、および／もしくはＣＤ２５の標的界面とあまり強くなく特徴を共有する。これらの中間の非界面残基は、一部の実施形態では、アミノ酸リンカーの一部または全てを形成し得る。
次に、一部の実施形態では、初期設計（または複数の設計）が生成され、設計の柔軟性および全体的安定性を決定するために分子動力学シミュレートされる。この初期設計がＲＭＳＤ要件を満たさない場合、これは、一部の実施形態では、コンピューター的突然変異誘発を使用した、１つ以上の連結部分（例えば、１つ以上の架橋または中間のリンカー残基）の反復最適化を受け得る。この最適化の間に、一部の実施形態では、界面残基は固定されるが、連結部分のうち１つ以上は、変更されるかまたは除去されるかまたは付加される。反復最適化は、標的界面および構造的秩序測定基準と比較した操作されたポリペプチドのＲＭＳＤ界面残基位置が特定の要件（例えば、それぞれ、≦６．０Åおよび≧０．２５。ここで、構造的秩序は、０～１の規準化されたスケールであり、１＝完全な構造的安定性である）を満たすまで、反復され得る。
一部の実施形態では、中間の構造的安定性残基領域は、１～５０アミノ酸長の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、これらの中間の構造的安定性残基領域は、リンカー、例えば、アミノ酸リンカーである。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法の特定の実施形態によって産生された操作されたポリペプチドの比較的小さいサイズ（例えば、大きい構造的に安定化性の足場上に界面をグラフトするアプローチと比較して）は、インビトロ発現系を必要とし得るより大きい分子とは対照的に、その分子の化学的合成を可能にし得る。さらに、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、中間の位置または界面位置中への非天然アミノ酸の取り込みを可能にし、これが、新規の部分および特性、例えば、翻訳後改変、溶解度、細胞透過性、酵素反応性、ｐＨ感受性、酸化感受性などによる界面操作の細かい制御を可能にし得る。なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドは、操作されたポリペプチドが免疫原またはエピトープ－ベイトとして使用される場合の、選択された抗体における種交差反応性または疾患関連突然変異反応性のより高い可能性によって選択され得る。
一部の実施形態では、最適化された分子は、本明細書で提供される操作されたポリペプチドである。他の実施形態では、最適化された分子は、さらなる評価、さらなる調整を受け得るかあるいはペプチドライブラリーもしくは候補の操作されたポリペプチドのライブラリー、またはそれらの任意の組み合わせを生成するために使用され得る、候補の操作されたポリペプチドである。ある特定の実施形態では、方法は、操作されたポリペプチド候補を使用してペプチドライブラリーまたは操作されたポリペプチド候補ライブラリーを生成すること、および次いで、ライブラリーをＣＤ２５の結合パートナー（例えば、ＣＤ２５に対する抗体）と接触させることをさらに含む。ペプチドライブラリーは、例えば、操作されたポリペプチド候補よりも小さく、それと少なくともいくらかの配列類似性を共有し、特定の残基が他の残基で置き換えられていてもよいペプチドを含み得る。操作されたポリペプチド候補ライブラリーは、例えば、操作されたポリペプチド候補のバリエーションを含み得る。
一部の実施形態では、ペプチドライブラリーのペプチドは、２個～１５個の間のアミノ酸、５個～１５個の間のアミノ酸、１０個～１５個の間のアミノ酸、２個～１０個の間のアミノ酸または５個～１０個の間のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ライブラリーの各ペプチド中のアミノ酸の総数は、例えば、リンカーアミノ酸を含み得る、界面アミノ酸および構造的アミノ酸の両方を含む。操作されたポリペプチド候補ライブラリーは、例えば、新たなライブラリーメンバーを作製するために候補中の１つ以上のアミノ酸または連結部分を変化させることによって調製され得る。操作されたポリペプチド候補ライブラリー中の操作されたポリペプチド候補は、一部の実施形態では、５個～４０個の間のアミノ酸、１０個～３５個の間のアミノ酸、１５個～３５個の間のアミノ酸または２０個～３０個の間のアミノ酸を独立して含む。一部の実施形態では、候補ライブラリーの各操作されたポリペプチド候補中のアミノ酸の総数は、一部の実施形態では、例えば、リンカーアミノ酸を含み得る、界面アミノ酸および構造的アミノ酸の両方を含み得る。ペプチドライブラリーおよび操作されたポリペプチド候補ライブラリーは、一部の実施形態では、５，０００個と１００，０００個との間のメンバー、５，０００個と８０，０００個との間のメンバー、５，０００個と６０，０００個との間のメンバー、５，０００個と４０，０００個との間のメンバー、５，０００個と３０，０００個との間のメンバー、１０，０００個と２５，０００個との間のメンバー、１５，０００個と２０，０００個との間のメンバーまたは約１７，０００個のメンバー（例えば、別個のペプチドまたは別個の操作されたポリペプチド候補）を独立して含み得る。一部の実施形態では、複数の別々のライブラリーが産生および評価される。ある特定の実施形態では、ライブラリーメンバーは、特定の架橋を含まない。例えば、一部の実施形態では、ライブラリーメンバーがジスルフィド架橋を有さないライブラリーが評価される。
候補ライブラリーのための候補を産生するための一部の実施形態では、１つ以上の連結部分が、元の操作されたポリペプチド候補の設計において、付加もしくは除去されるかまたは位置変更される。例えば、一部の実施形態では、ジスルフィド架橋が除去されるかもしくは付加されるかまたはその位置が移動される。他の実施形態では、ラクタム架橋が除去されるかもしくは付加されるかまたはその位置が移動される。一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基が置き換えられる。ペプチドライブラリーもしくは操作されたポリペプチド候補ライブラリーまたはそれら両方（存在する場合）へのＣＤ２５結合パートナーの結合は、操作されたポリペプチドの設計をさらに洗練させるためまたは操作されたポリペプチドを選択するために使用され得るさらなる情報を提供できる。これらのライブラリーをスクリーニングすることからのさらなる情報は、例えば、操作されたポリペプチドを変化させるため、例えば、ＣＤ２５の結合パートナーとの結合親和性を増加させるために使用され得る。操作されたポリペプチド候補ライブラリーは、一部の実施形態では、結合相互作用（そのような部分の存在または位置を含む）、例えば、ジスルフィド結合およびラクタムを含む架橋に対する特定のリンカー部分の影響に関するさらなる情報を提供できる。ペプチドもしくは操作されたポリペプチド候補ライブラリーまたはそれら両方は、一部の実施形態では、ＣＤ２５の結合パートナーに対する結合親和性もしくは結合特異性を増加させ得るかまたは他の所望の特徴を提供し得る共通のモチーフ（例えば、アミノ酸パターンもしくは連結部分、またはそれらの組み合わせ）を同定するために使用され得る。同族結合パートナーの、ペプチドもしくは操作されたポリペプチド候補ライブラリーまたはそれら両方のメンバーとの結合を評価することは、さらなる構造的および機能的情報を提供でき、これは、操作されたポリペプチドの設計をさらに洗練させるためまたは操作されたポリペプチド候補を選択するために使用され得る。
ａ．変化するｐＨ下での結合による選択
ａ．変化するｐＨ下での結合による選択
一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、より低いｐＨでの構造的柔軟性と比較した、生理的ｐＨでの構造的柔軟性に、少なくとも一部基づいて選択される。例えば、ＣＤ２５は、腫瘍細胞上で過剰発現され得、したがって、腫瘍微小環境におけるより高い親和性でのＣＤ２５への抗体の結合が、一部の実施形態では、所望され得る。したがって、一部の実施形態では、生理的ｐＨでの同じ操作されたポリペプチドと比較して、より低いｐＨでより柔軟性が低い操作されたポリペプチド、または１つ以上のアミノ酸がより低いｐＨで特定の配向を有する操作されたポリペプチド、またはより低いｐＨでより高い結合親和性もしくは結合選択性を有する操作されたポリペプチドを選択することが望ましい場合がある。多くのがん性腫瘍では、がん性細胞の成長速度は、腫瘍の部分において利用可能な酸素供給をしのぎ得、腫瘍内の低酸素微小環境を生じる。組織中の酸素のレベルは、組織環境のｐＨに影響を与え得、低酸素レベルは、減少したｐＨをもたらし得る（例えば、嫌気的解糖からの酸性代謝物の蓄積によるものを含む）。したがって、一部の実施形態では、低いｐＨにおいてより高い結合を有する（例えば、結合相互作用をもたらす望ましい構造的特徴を有する）が、生理的ｐＨでは低減された結合を有する（例えば、結合相互作用をもたらす望ましい構造的特徴が減少している、より少ない、またはそれを有さない）操作されたポリペプチドを選択することは、一部の実施形態では、腫瘍中にない場合の結合と比較して、腫瘍中の所望の標的へのより高い結合を有する抗体を産生することができる操作されたポリペプチドを生じ得る。生理的ｐＨは、典型的には、約７．３５と約７．４５との間、例えば、約７．４である。腫瘍微小環境のｐＨは、例えば、約７．４５未満、約７．４５未満、約７．４５と約６．０との間、約７．０と約６．０との間、約６．８と約６．２との間、約６．７と約６．３との間、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９または約７．０であり得る。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、コンピューター的方法、例えば、分子動力学シミュレーションを使用して、異なるｐＨで評価され得る。他の実施形態では、操作されたポリペプチドは、インビトロ方法を使用して、差次的ｐＨ特徴に基づいて選択される。適切なインビトロ方法には、例えば、異なるｐＨにおけるファージパニングが含まれ得る。例えば、抗体ファージディスプレイライブラリーが、生理的ｐＨで１つ以上の操作されたポリペプチドをパニングするために使用され得、そのｐＨで結合するファージは破棄され得る。次いで、第２のラウンドのパニングが、より低いｐＨで実施され得、より低いｐＨで１つ以上の操作されたポリペプチドに結合するファージが選択され得る。一部の実施形態では、より低いｐＨにおいてファージに結合しないかまたは低いｐＨおよび生理的ｐＨの両方において類似の親和性でファージに結合する操作されたポリペプチドは、腫瘍細胞を標的化する抗体を生成する際の使用にはあまり望ましくない場合がある。
ｂ．逆ペプチド評価
ｂ．逆ペプチド評価
なおさらなる実施形態では、操作されたポリペプチドを選択することは、操作されたポリペプチドの結合を逆操作されたポリペプチドの結合と比較することを含み得る。逆操作されたポリペプチドは、操作されたポリペプチドに基づき得るが、界面相互作用性アミノ酸残基（例えば、ＣＤ２５の表面に基づく）のうち１つ以上が、逆特徴を示すアミノ酸で置き換えられている。例えば、大きい立体的に嵩高い疎水性側鎖を有するアミノ酸は、より小さい側鎖、または親水性側鎖、またはより小さくかつ親水性の側鎖を有するアミノ酸で置き換えられ得る。一部の実施形態では、水素結合供与側鎖を有するアミノ酸は、水素結合受容側鎖を有するアミノ酸または水素結合しない側鎖を有するアミノ酸で置き換えられ得る。操作されたポリペプチドおよび逆操作されたポリペプチドを使用して比較され得る結合特徴には、一部の実施形態では、特異性および／または親和性が含まれ得る。操作されたポリペプチドの結合特徴を逆操作されたポリペプチドの結合特徴と比較することは、一部の実施形態では、界面相互作用性アミノ酸がリンカーなどの連結部分の特徴ではなく結合相互作用を駆動する、操作されたポリペプチドを選択することを助け得る。結合がリンカーなどの連結部分によって駆動される操作されたポリペプチドは、オフターゲット結合または他の望ましくない結合特徴を示し得るので、一部の実施形態では、あまり望ましくない場合がある。
さらなる実施形態では、方法は、選択された操作されたポリペプチドを改変することをさらに含む。
ｃ．結合評価
ｃ．結合評価
本明細書に記載されるように、一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたポリペプチドを選択する方法は、操作されたポリペプチド候補の、タンパク質またはその断片、例えば、ＣＤ２５の結合パートナー（例えば、ＣＤ２５に対する抗体）への結合を評価することを含む。例えば、一部の実施形態では、操作されたポリペプチド候補ライブラリーまたはペプチドライブラリーは、ＣＤ２５の結合パートナーへの結合についてスクリーニングされる。
タンパク質またはその断片（例えば、ＣＤ２５の結合パートナー）の、１つ以上のペプチドまたは操作されたポリペプチド候補（例えば、ライブラリーのメンバー）との結合は、種々の方法で評価され得る。一部の実施形態では、結合は、例えば、タンパク質またはその断片上の標識を直接的に検出することによって、直接的に評価される。かかる標識には、例えば、蛍光標識、例えば、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質が含まれ得る。他の実施形態では、結合は、例えば、サンドイッチアッセイを使用して、間接的に評価される。サンドイッチアッセイでは、ペプチドまたは操作されたポリペプチド候補（例えば、ライブラリーのメンバー）が結合パートナーに結合し、次いで、標識された二次試薬が、結合した結合パートナーを標識するために添加される。次いで、この標識された二次試薬が検出される。サンドイッチアッセイ成分の例には、抗Ｈｉｓタグ抗体もしくはＨｉｓタグ特異的蛍光プローブを用いて検出されるＨｉｓタグ化結合パートナー；標識されたストレプトアビジンもしくは標識されたアビジンを用いて検出されるビオチン標識された結合パートナー；または抗結合パートナー抗体を用いて検出される未標識の結合パートナーが含まれる。
一部の実施形態では、目的のペプチドまたは操作されたポリペプチド候補は、いくつもの利用可能な検出方法を使用して、結合シグナルまたは用量応答に基づいて同定される。これらの検出方法には、例えば、画像化、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、質量分析またはバイオセンサーが含まれ得る。一部の実施形態では、ヒット閾値が規定され（例えば、中央値シグナル）、そのシグナルを上回るシグナルを有する任意のものが、推定ヒットモチーフとしてフラグされる。
コンビナトリアルライブラリーの開発のために、タンパク質またはその断片との結合に基づいてペプチドライブラリーから同定されたペプチドは、一部の実施形態では、配列もしくは構造的情報、またはそれらの組み合わせを使用して、別個の群へとさらにクラスタリングされ得る。このグループ分けは、例えば、一般に利用可能な配列アラインメント、化学的記述子、構造的予測、ならびにエントロピー予測情報科学ツール（例えば、ＭＵＳＣＬＥ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＰＳＩＰＲＥＤ、ＡＭＢＥＲ、Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ＣａｌｃｕｌａｔｏｒおよびＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｐｏｉｎｔ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ）およびクラスタリングアルゴリズム（例えば、Ｋ－Ｍｅａｎｓ、ＧｉｂｂｓおよびＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ）を使用して、実施され得る。ペプチドヒット中に存在するモチーフ（例えば、構造的もしくは機能的モチーフ）のクラスターは、この分析から同定され得る。個々のペプチドモチーフヒットも同定され得る。これらのモチーフクラスターおよび個々のモチーフを使用して、一部の実施形態では、標的界面におけるタンパク質相互作用を駆動するように見えるモチーフの配列、構造および化学的特徴のうち１つ以上を規定する設計規則が考案され得る。一部の実施形態では、標的界面の構造は、これらの界面モチーフ設計規則の同定のために必要ではない。むしろ、設計規則は、一部の実施形態では、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることから同定されたペプチドの分析に由来し得る。
一部の実施形態では、結合アッセイは、約１０５の感受性動力学的範囲を有する。したがって、一部の実施形態では、操作されたポリペプチド候補は、ネイティブＣＤ２５：結合パートナーシグナルの１０５シグナルブラケット（ｓｉｇｎａｌ ｂｒａｃｋｅｔ）以内の、ＣＤ２５結合パートナーとの結合事象を有する場合、目的のものであると同定される。シグナルの型は、使用されているアッセイの型が何であるかまたはシグナルがどのように評価されているかに依存して異なり得る。例えば、一部の実施形態では、シグナルは、センサーグラムにおける応答単位、画像ベースの読み出しにおける蛍光シグナル、または酵素ベースのアッセイにおける酵素的読み出しである。結合事象についてのシグナルは、ＣＤ２５：結合パートナーシグナルと比較して測定され得る。
一部の実施形態では、操作されたポリペプチド候補は、結合を評価する前に改変される。例えば、一部の実施形態では、ビオチン、ＰＥＧもしくは別の結合部分、またはそれらの組み合わせが、結合評価システムにおいてそれが使用されるのを可能にするために、ペプチドのＣ末端またはＮ末端に結合される。例えば、一部の実施形態では、ビオチン－ＰＥＧ１２－は、操作されたポリペプチドのＮ末端に共有結合される。他の実施形態では、操作されたポリペプチド候補は、Ｃ末端において－ＧＳＧＳＧＫ－ＰＥＧ４－ビオチンで改変される。ある特定の実施形態では、かかるビオチン改変された操作されたポリペプチド候補は、次いで、ビオチン部分を介してストレプトアビジンビーズに結合され、ビーズ支持された免疫原が、ＣＤ２５の結合パートナーへの結合について評価される。
ＶＩ．操作されたポリペプチドおよびＣＤ２５抗体の使用
ＶＩ．操作されたポリペプチドおよびＣＤ２５抗体の使用
本明細書で提供される、および本明細書で提供される方法によって同定された操作されたポリペプチドは、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する１つ以上の抗体を産生するために使用され得る。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である。
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、抗原に特異的に結合する、免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリン、またはその断片であり得、天然供給源または組換え供給源に由来し得る。
用語「抗体断片」または「抗体結合ドメイン」は、標的、例えば、抗原およびその規定されたエピトープへの抗体断片の認識および特異的結合を付与するのに十分な、抗原結合ドメイン、即ち、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を含む、抗体の少なくとも１つの部分またはその組換え変異体を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、単鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と短縮される）（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、および抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片および重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む融合タンパク質を指し、軽鎖および重鎖可変領域は、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して連続して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現されることが可能であり、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。
抗体に関して、「重鎖可変領域」または「ＶＨ」（または単一ドメイン抗体、例えばナノボディの場合、「ＶＨＨ」）は、フレームワーク領域として公知の隣接するストレッチ間に差し込まれた３つのＣＤＲを含む重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は、一般に、ＣＤＲよりも高度に保存されており、ＣＤＲを支持する足場を形成する。
特定しない限り、本明細書で使用する場合、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を有し得、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得るかまたはＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。
用語「抗体軽鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションにある抗体分子中に存在する２つの型のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパ（「Κ」）。
したがって、一部の実施形態では、免疫原で動物を免疫化することによって産生される抗体であって、免疫原が本明細書で提供される操作されたポリペプチドである抗体が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、動物は、ヒト、ウサギ、マウス、ハムスター、サルなどである。ある特定の実施形態では、サルは、カニクイザル、マカクザルまたはアカゲザルである。操作されたポリペプチドで動物を免疫化することは、例えば、免疫原を含み、適宜アジュバントを含む組成物の少なくとも１つの用量を動物に投与することを含み得る。一部の実施形態では、動物から抗体を生成することは、抗体を発現するＢ細胞を単離することを含む。一部の実施形態は、抗体を発現するハイブリドーマを創出するために、Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させることをさらに含む。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドを使用して生成された抗体は、ヒトおよびサル、例えば、カニクイザルと交差反応できる。
ある特定の実施形態では、抗体を生成する方法は、抗体に対する１つ以上のエピトープを決定することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、例えば、エピトープライブラリーを抗体と接触させ、ライブラリーのエピトープへの抗体の結合を評価することによって、２つ以上のエピトープへの結合について抗体をスクリーニングすることを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のエピトープに結合する抗体は、破棄される。一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の１つのエピトープを模倣する。他の実施形態では、操作されたポリペプチドは、ＣＤ２５の２つ以上のエピトープを模倣する。ある特定の実施形態では、操作されたポリペプチドがＣＤ２５の２つ以上のエピトープを模倣する、２つ以上のエピトープへの結合について抗体をスクリーニングすることは、エピトープライブラリーを抗体と接触させること、およびライブラリーのエピトープへの抗体の結合を評価すること、および２つ以上のエピトープに結合する１つ以上の抗体を破棄することを含み、これらのエピトープは、操作されたポリペプチドによって模倣されたエピトープではない。
一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたポリペプチドを使用して産生された抗体は、ＣＤ２５に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、抗体は、抗体がＣＤ２５に結合している場合、ＩＬ－２のＣＤ２５との結合を遮断しない。
一部の実施形態では、抗体は、非ＩＬ－２遮断抗体（非ＩＬ－２遮断剤）である － 即ち、ＣＤ２５への抗体の結合は、ＩＬ－２リガンドのＣＤ２５（ＩＬ－２アルファ鎖）への結合を破壊も防止もせず、ＩＬ－２媒介性シグナル伝達、例えば、ＩＬ－２／ＪＡＫ３／ＳＴＡＴ－５シグナル伝達経路を介したシグナル伝達に影響を与えない。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５（ＩＬ－２アルファ鎖）へのＩＬ－２リガンドの結合を破壊せず、７Ｇ７Ｂ６抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５（ＩＬ－２アルファ鎖）へのＩＬ－２リガンドの結合を破壊しないが、ＩＬ－２受容体のベータ、ガンマおよびアルファ（ＣＤ２５）鎖のトリマー化を破壊する。
一部の実施形態では、抗体は、ＩＬ－２遮断抗体であり、例えば、抗体は、受容体のアルファ、ベータおよび／またはガンマ鎖へのＩＬ－２リガンドの結合を破壊または防止し、ＩＬ－２媒介性シグナル伝達を減少または阻害する。ある特定の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ－２リガンドの結合を破壊または防止する。一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ－２リガンドの結合を破壊または防止し、ダクリズマブまたはバシリキマブ（ｂａｃｉｌｉｘｉｍａｂ）のいずれかが結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、部分的に遮断抗体であり、完全にではないが部分的に、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のアルファ、ベータおよび／もしくはガンマ鎖へのＩＬ－２リガンドの結合を破壊し、ならびに／または完全にではないが部分的に、ＩＬ－２媒介性シグナル伝達を減少させる。
一部の実施形態では、抗体は、アルファ、ベータおよびガンマＩＬ－２鎖のヘテロトリマー化を破壊または防止する。一部の実施形態では、抗体は、ＩＬ－２リガンドとＣＤ２５との結合を遮断しないが、アルファ、ベータおよびガンマＩＬ－２Ｒ鎖のヘテロトリマー化を破壊または防止する。ある特定の実施形態では、抗体は、Ｔｒｅｇ細胞に選択的に結合する。他の実施形態では、抗体は、Ｔｅｆｆ細胞に選択的に結合する。
なおさらなる実施形態では、本明細書で提供される操作されたポリペプチドを使用して産生された抗体がＣＤ２５のＩＬ－２との結合を遮断するかどうかが評価される。一部の実施形態では、ＩＬ－２とのＣＤ２５結合を遮断しない抗体が選択される。他の実施形態では、ＣＤ２５のＩＬ－２との結合を遮断する抗体が選択される。かかる遮断または非遮断は、例えば、ＣＤ２５をバイオセンサー先端にカップリングし、ＩＬ－２の存在下および非存在下での抗体による結合を評価することによって、評価され得る。一部の実施形態では、抗体は、抗体の結合、およびＣＤ２５へのＩＬ－２結合の遮断または非遮断を評価するためにフローサイトメトリーにおいてＮｉ－ＮＴＡと共に使用され得る６×Ｈｉｓタグと共に発現される。ある特定の実施形態では、抗体の結合は、生理的ｐＨ（例えば、約ｐＨ７．３と約ｐＨ７．５との間、または約ｐＨ７．４）において、また、腫瘍微小環境のｐＨ（例えば、約ｐＨ６．４と約ｐＨ６．６との間、または約ｐＨ６．５）において評価される。ある特定の実施形態では、遮断／非遮断活性は、ＩＬ－２遮断剤抗体（例えば、ダクリズマブまたはバクリリキシマブ（ｂａｃｌｉｌｉｘｉｍａｂ））の結合と比較される。ある特定の実施形態では、遮断／非遮断活性は、ＩＬ－２非遮断剤抗体（例えば、抗体７Ｇ７Ｂ６）の結合と比較される。ある特定の実施形態では、遮断／非遮断活性は、ＩＬ－２遮断抗体およびＩＬ－２非遮断抗体の両方と比較される。
一部の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５に対するアゴニスト抗体である。他の実施形態では、抗体は、ＣＤ２５に対するアンタゴニスト抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、トランス配向でＣＤ２５に結合する。他の実施形態では、抗体は、シス配向でＣＤ２５に結合する。なおさらなる実施形態では、抗体は、シスまたはトランスのいずれかの立体配置のＣＤ２５に結合することが可能である。
起源の抗体クローンは、示されたＩＤ、例えば、表２中のクローンＩＤによって同定され得る。例えば、抗体は、表２の横列１に示される抗体クローン「ＹＵ３８９－Ａ０１」重鎖相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含み得る。
一部の実施形態では、抗体は、表２中に開示されたものから各々独立して選択される、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を有する。
一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１は、GGTFSSYA、GGSISSGGYY、GFTFSSYG、GYTFTSYY、GYTFTSYG、GYTFTDYY、GGSISSGGYS、GGSISSSNW、GYSFTSYW、GFTFSNYG、GFTFSSSA、GFTFSSYW、GFIFSRHA、GYTFNNYG、GFTFSSYA、GYTFTTYA、GFTFNNAW、GFTFSSYE、GYSFTTYW、GYSFNTYW、GFTFRRYW、GYSFSTYW、GFAFSSYG、GYKFANYW、GYTFKNFG、GFTFSSYS、GDSISSSSYY、およびGGSISRSNW;から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ２は、IIPIFGTA、IIPIFGTA、IYYSGST、ISYDGSNK、INPSGGST、ISAYNGNT、IMPIFDTA、VDPEDGET、IYHSGST、IYPGDSDT、ISHDGHVK、IKQDGSEK、ISVYNGDI、INTNTGDP、IKSKTDGGTT、ISSSGSTI、ISSRGSTI、IYPSDSDT、ISGRKGNT、ISSSSSYI、INHSGST、IYHTGST、およびISYDGNNK;から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、AREMYYYYGMDV、AREMYYYYGMDV、ARGNLWSGYYF、AKELLEGAFDI、ARDRVTMVRGALAY、ARERSYYGMDV、ASWSERIGYQYGLDV、ARDILGLDY、ATEDTAMGGIDY、ATEGRYGMDV、AVEGGRAPGTYYYDSSGLAY、ARAGYYYGMDV、ARDLGTMVRGVIEPYYFDY、ARGVRGTGFDP、ARDRNGYFQH、AKDLLGELSFFDY、ARLENNWDYGGWFDP、ARDRSYYGMDV、ARDKGYYGMDV、AKEISPRSSVGWPLDY、ARDFWSGYNELGGMDV、ARTWFGEFFDY、ARVIGGWFDP、ARGRLAYGDTEGFDY、ARDILRGESSILDH、ARDRYYYGMDV、ARDLLGSGYDIIDY、ARVWGKNGDFDY、ARDRFHYGMDV、ARDRGDY、TTEGVELLSFGGAPFDY、ARRRGGGFDY、AREKGSWFDP、ARDRGDRVGGLVFDY、ARQVAGGLDY、ARDRGYYGMDV、FRFGEGFDY、ARDGGYYFDD、ARDFRMDV、ARDAYAYGLDV、ARDLMNYGMDV、AREYDYGDYVFDY、ARLENNWNYGGWFDP、ARDYYYYGMDV、ARDIGYYYGMDV、ARVGDGYSLDY、AKAITSIEPY、AKGQGDGMDV、ARLGWGMDV、ARVWGDTTLGYGMDV、AIPWDAELGNYGMDV、ARGRWSGLGDY、ARARGGRYFDY、ARDQLAARRGYYYGMDV、AKGDVNYGMDV、ARDFYYGSGSYPNGYYYGMDV、ARDFNPFSITIFEMDV、ANLAMGQYFDY、ARDLGEAKSSSPHEPDY、ARDQEMYYFDY、ARGKGSYAFDI、およびAKGYSSSPGDY;から選択される。
一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ１は、QSISSY、QSISSY、SSNIGNNF、QSISNY、NIETKS、KLGDKY、QSVSNY、QTISQW、SSNIGSNY、NFNIGNNL、RNIWSY、QSISSW、QSVSSR、QTISGL、DIESEM、NIGSKS、QSIGNY、QGISSW、QSVSSTY、QDISNY、NIESES、SSDVGAYNY、QDINNY、QGISNS、SSNIGNNY、EGIRTS、QGTSSW、SSDVGGYNY、QSVSNNY、QGINSY、QAVRID、QSISRY、QSIGYW、SSNVGSNY、QSIKNY、QDIKRR、SGSIASSY、NSNVGNNY、SLRSYY、KLGERF、SGSVSTSYY、SSNIGRNY、EDIRMY、QGISTY、SSNVGSRT、NIGTKS、NIGSKT、QSINSY、SSNIGSNT、QSIITY、QSLLHSDGKTY、およびGGNIARNYから選択される。
一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ２は、AAS、AAS、DST、DDD、KDN、GAS、KAS、RNN、SNN、AND、DAF、DDS、AAT、AVS、DAS、GVS、DNN、DVS、RAS、GTS、EDN、DND、GKN、QYI、NTD、RNH、EGS、DGR、TAS、DDT、EVS、およびEDDから選択される。
一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ３は、QQSYSTPPT、QQSYSTPPT、GSWDTNLSGYV、QVWDSSSGHREV、QAWDSSTYV、QQYNHWPPL、QQYSGDSMYT、AAWDDSLSGVV、AAWDDSLNGVV、ATWDDSLSGVV、QQSHSTPIT、QQYNSYSRT、QQYTNWPQT、LQYDRYSGA、QVWHTTNDHVL、QVWDSSSDHWV、QQSKQIPYT、QQSYSLPLT、QQFDISGGLI、QQYDNLPLT、QVWDSSSDHTVA、SSYTTTDTFV、QQYDNLPYT、QQYYSTPPH、QQSYSTPLT、QVWDSSSDHVV、GTWDSSLSAYV、QQTHTWPWT、QQANSFPLT、QQSYSTPYT、SSYTSSSTYV、QRYGSSPR、QQVHSFPFT、LQHNTFPYT、QQSHSTPLT、QQYNSYPFT、QQYNSSPLMYT、QQTYSTPLT、QQANTFPQT、QSYDGSSVV、GSWEARESVFV、QQTYNDPPT、NSRDSSGNHVV、QTWDGSIVV、VLYMGSGIWV、ATWDDALSGWV、SSYTSSSTLVV、QQSYSTPWT、SSYTSSSTWV、LQDYNYPPA、QQYYDDPQ、QQLNGYPTT、AAWDDSLIGHV、QVWDTSGDLHWA、QQSYTTPLT、QVWDSSSDLLWV、GTWDSSLSALV、AAWDDSLNGPV、MQTKQLPLT、QQANSFPPT、QSYDGNNHMV、およびSSYTSSSTLWVから選択される。
一部の実施形態では、抗体は、表３Ａおよび表３Ｂ中に開示されたものから各々独立して選択される、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を有する。異なる抗体からのＣＤＲを任意の組み合わせで組み合わせて新たな抗体を生成することが可能である。遺伝子合成およびハイスループットスクリーニングテクノロジーは、当業者が過度の実験なしに６つのＣＤＲの全ての組み合わせを試験することを可能にする。
一部の実施形態では、抗体は、表４に提供される組み合わせのいずれか１つの６つのＣＤＲを有する。
一部の実施形態では、抗体は、表５から選択されるｓｃＦｖ、または表５中のｓｃＦｖに由来する抗原結合ドメインを有する任意の抗体である。実施形態では、全長重鎖および軽鎖可変領域は、表５中のｓｃＦｖ配列から抽出され、可溶性Ｆａｂ断片、モノクローナル抗体、二特異性抗体、または当該分野で公知の任意の他の型の抗体を生成するために使用される。表５中のｓｃＦｖがＶＨ：ＶＬ ｓｃＦｖである場合、ＶＬ：ＶＨ ｓｃＦｖを生成するために重鎖および軽鎖の順序を逆転させることが可能である。表５中のｓｃＦｖがＶＬ：ＶＨ ｓｃＦｖである場合、ＶＨ：ＶＬ ｓｃＦｖを生成するために重鎖および軽鎖の順序を逆転させることが可能である。
一部の実施形態では、抗体は、表１４Ａおよび表１４Ｂ中に開示されたものから各々独立して選択される、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を有する。一部の実施形態では、抗体は、表１４Ａおよび表１４Ｂ中に列挙されるいずれか１つのクローンから各々独立して選択される、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を有する。一部の実施形態では、抗体は、表１５Ａおよび表１５Ｂ中に群で開示されたものから各々独立して選択される、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を有する。本開示は、個々のクローンからのＣＤＲを有する抗体、または任意の他の５つのＣＤＲと共にマッチするいずれか１つのＣＤＲからのＣＤＲを有する抗体を提供する。表１４Ａおよび表１４Ｂ中に同定された抗体は、マウスファージディスプレイライブラリーに由来する。公知の方法が、これらのＣＤＲをヒト化またはキメラ抗体に変換するために使用され得る。
ＶＩＩ．ＣＤ２５抗体の使用
ＶＩＩ．ＣＤ２５抗体の使用
一部の実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、治療薬に、例えば、増殖性疾患もしくは障害、例えば、がんにおける使用に、または自己免疫性疾患における使用に有用である。
したがって、それを必要とする対象に治療有効量の治療的ＣＤ２５抗体を投与することを含む、がんを処置する方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、がんは、原発性がんである。一部の実施形態では、がんは、転移性がんである。一部の実施形態では、がんには、固形腫瘍が関わる；他の実施形態では、がんには、液性腫瘍、例えば、血液ベースのがんが関わる。例示的な実施形態では、ＣＤ２５抗体は、非ＩＬ－２遮断抗体である。
したがって、それを必要とする対象に治療有効量の治療的ＣＤ２５抗体を投与することを含む、自己免疫性関連疾患または障害を処置する方法が、本明細書で提供される。例示的な実施形態では、ＣＤ２５抗体は、非ＩＬ－２遮断抗体である。
本明細書で使用する場合、対象は、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園、スポーツまたはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。対象は、雄性または雌性であり得る。
本明細書で提供される治療的ＣＤ２５抗体のいずれかの投与は、他の公知の薬物／処置（例えば、小分子薬物または生物製剤）と組み合わせて投与され得る。投与は、順次的または同時発生的であり得る。
本明細書に記載される治療的ＣＤ２５抗体のインビボ投与は、静脈内で、腫瘍内で、頭蓋内で、病巣内で（例えば、病巣内注射、直接接触拡散）、腔内で（腹腔内、胸膜内（ｉｎｔｒａｌｐｌｅｕｒａｌ）、子宮内、直腸内）、腹腔内で、筋肉内で、皮下で、外用で、経口で、経皮で、移植により、吸入により、髄腔内で、脳室内で、または鼻腔内で実施され得る。例示的な実施形態では、投与の経路は、静脈内注射によるものである。
治療有効量の治療的抗体が一般に投与されるであろう。治療的抗体の適切な投薬量は、疾患の重症度、対象の臨床状態、対象の臨床歴および処置に対する応答、ならびに担当医の裁量に基づいて決定され得る。
ＶＩＩＩ．診断的使用
ＶＩＩＩ．診断的使用
本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、診断および検出目的のために使用され得る。適用に依存して、ＣＤ２５抗体は、インビボまたはインビトロで検出および定量化され得る。
本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、種々のイムノアッセイにおける使用のために修正可能である。これらのイムノアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、分光光度測定、Ｘ線撮影、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、例えば、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、蛍光的、電気的、光学的または化学的方法によって検出可能な、検出可能な標識を含み得る。本発明において有用な標識には、蛍光色素、放射能標識、酵素、比色標識、アビジンまたはビオチンが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、核医学装置（ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴまたはシンチグラフィー）による画像化のために有用な同位体で放射能標識される。
ＶＩＩＩ．医薬組成物
ＶＩＩＩ．医薬組成物
本開示は、治療的ＣＤ２５抗体を含む組成物を提供し、一部の実施形態では、組成物は無菌である。医薬組成物は、一般に、薬学的に許容される賦形剤中に有効量の治療的抗体を含む。
ＩＸ．キットおよび製造品
ＩＸ．キットおよび製造品
本開示は、例えば、治療的使用または診断的使用のいずれかのための、本明細書に記載されるＣＤ２５抗体のいずれかを含むキットもまた提供する。一部の実施形態では、キットは、二次抗体、免疫組織化学分析のための試薬、薬学的に許容される賦形剤および取扱説明書のいずれか、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される成分をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と共に、本明細書に記載される治療的組成物のうちいずれか１つ以上を含む。
本出願は、本明細書に記載される治療的または診断的組成物またはキットのうちいずれか１つを含む製造品もまた提供する。製造品の例には、バイアル（例えば、密封バイアル）が含まれる。
本明細書で提供される記載は、多数の例示的な立体配置、方法、パラメーターなどを示す。しかし、かかる記載は、本開示の範囲に対する制限を意図するものではなく、むしろ、例示的な実施形態の説明として提供されることを認識すべきである。
以下の実施例は、事例的に過ぎず、本開示の任意の態様を限定する意味では決してない。
ＣＤ２５の特徴を共有する操作された免疫原の開発
ＣＤ２５の結晶構造を得た。ＣＤ２５について入手可能ないくつかの結晶構造は、タンパク質の可動性のループセクションを失っている。分子動力学シミュレーションを実施して、この可動性のループ、およびＣＤ２５のＩＬ－２との結合相互作用のより良い理解を得た。
ＣＤ２５の結晶構造を得た。ＣＤ２５について入手可能ないくつかの結晶構造は、タンパク質の可動性のループセクションを失っている。分子動力学シミュレーションを実施して、この可動性のループ、およびＣＤ２５のＩＬ－２との結合相互作用のより良い理解を得た。
ＣＤ２５の異なるセクションを、操作された免疫原を開発するためのインプットとして選択した。これらの領域の一部は、図３４Ｂおよび図３４Ｃに示される。これらのインプットをＲＯＳＥＴＴＡプログラムで使用して、界面残基の全体的な望ましい構造的および動力学的特性を改善した。このプロセスは、セグメントの構造的（非界面）部分を変化させて、それらが由来したネイティブＣＤ２５の状況に応じた界面残基の構造、コンフォメーション、動力学および他の特性を安定化および再現した。開発中のセグメントの安定性および柔軟性もまた分析し、これらのパラメーターを変更するために必要に応じて、配列を調整した。例えば、Ｎ末端またはＣ末端は、所望の特性を追加するために、１つ以上のアミノ酸の付加によって伸長され得る。操作された免疫原候補に対する架橋の影響もまた、異なるアミノ酸残基の側鎖間に形成するジスルフィド結合を使用して評価した。設計操作 － アミノ酸付加、架橋および構造的残基最適化 － の各段階において、ＲＯＳＥＴＴＡプログラムのネイティブスコアリングおよびエネルギー関数を使用して、多くの設計候補の各々を定量的に評価した。最良のＲＯＳＥＴＴＡエネルギーを有する候補を、設計の引き続く段階に進め、最終的に、分子動力学シミュレーションによる評価および検証に進める。生理的ｐＨ（例えば、おおよそｐＨ７．４）でこれらのパラメーターを評価することに加えて、パラメーターを、一部の例では、腫瘍微小環境ｐＨ（例えば、おおよそｐＨ６．５）でも評価した。
分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを使用して異なる設計をランク付けするための定量的測定基準は、ＲＭＳＤを介して評価される、ＣＤ２５に対する類似性；および候補の構造的柔軟性を含んだ。図３３Ａおよび図３３Ｂは、図３２に示されるインプットセクション（図３３Ａについて左矢印、図３３Ｂについて右矢印）を使用して開発した例示的な操作された免疫原についての、生理的ｐＨにおける安定性 対 ＲＭＳＤの例示的な比較を示す。図３３Ｃは、図３３Ｂの例示的な免疫原についての、腫瘍微小環境ｐＨにおける安定性 対 ＲＭＳＤの例示的な比較である。代表的なスコアリングアルゴリズムは、以下に提示される。
構造的類似性を、参照構造へのＲＭＳ整列後の、ＭＤアンサンブル中の各ペプチドコンフォメーションの原子座標と参照構造との間の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を使用して計算した。ＲＭＳＤを、コンピューター的に設計された操作された免疫原候補構造を参照構造として使用して、または実験的に特徴付けられた（例えば、Ｘ線結晶構造）構造を参照として使用することによって、計算した。これらのシミュレーションにおいて、候補の機能的界面残基（一部のシミュレーションにおいて）および候補の構造的残基を含む全ての残基（他のシミュレーションにおいて）を、参照と比較した。
ＭＤによってサンプリングされたコンフォメーションのアンサンブルを、ＲＭＳＤに基づいて互いに構造的に類似する群（クラスター）へとクラスタリングした。無秩序を、アンサンブル中の全ての他のコンフォメーションとの構造的相違（例えば、高いＲＭＳＤ）に起因して類似のコンフォメーションのクラスターへとグループ分けすることができなかったＭＤアンサンブル中のコンフォメーションの割合として評価した。したがって、代替的候補よりも多くの無秩序を有する操作された免疫原候補は、より柔軟であった。秩序を、類似のコンフォメーション（低いＲＭＳＤ）のクラスターへとグループ分けされたＭＤアンサンブル中のコンフォメーションの割合として評価した。代替的候補よりも高い秩序を有する操作された免疫原候補は、柔軟性がより低く、このとき、コンフォメーションのそのアンサンブルのより高い割合が、代替的候補よりも少ないクラスターに入った。
操作された免疫原候補が追加されたクラスターを、ＲＭＳＤを使用して参照構造と比較した。クラスターのＲＭＳＤが４オングストロームの閾値値を下回った場合、このクラスターを、秩序立っており（例えば、低い柔軟性）、参照と類似する（構造的類似性）とみなした。低い柔軟性および高い構造的類似性のこの基準を満たすそのアンサンブルの高い割合を有する操作された免疫原候補は、低い柔軟性および高い構造的類似性のこの基準を満たすそのアンサンブルの低い割合を有する代替的候補よりも、活性が高いと予測される。
この定量的分析を、生物物理学的、生物学的および物理－化学的相互作用に関するＭＤ軌跡の定性的分析と組み合わせ、インビトロで評価するために所与の免疫原候補を選択するために使用した。以下の表６は、上記のように調製した１１個の操作された免疫原を列挙している。
操作された免疫原のインビトロ評価
実施例１で調製した操作された免疫原の結合を、ＣＤ２５に対する抗体を使用して評価する。操作された免疫原を、Ｃ末端上で－ＧＳＧＳＧＫ－ビオチン基で改変し、次いで、ストレプトアビジンコーティングされたバイオセンサー先端に別々に結合させる。ＣＤ２５抗体を含む緩衝液を、３００秒間の会合段階の間に先端上に流し、次いで、流した溶液を、ＣＤ２５抗体なしの緩衝液に切り替え、バイオセンサー先端からの解離を測定する。先端が当初結合したいずれの操作された免疫原もタンパク質も有さない対照もまた実行して、先端へのＣＤ２５抗体のいずれの背景結合をも評価する。全長ＣＤ２５がビオチン化されバイオセンサー先端に結合された第２の対照を実施して、全長ＣＤ２５へのＣＤ２５抗体の結合レベルを実証する。これらのバイオセンサー実験から得られたデータを使用して、操作された免疫原の結合を定性的にランク付けする。
実施例１で調製した操作された免疫原の結合を、ＣＤ２５に対する抗体を使用して評価する。操作された免疫原を、Ｃ末端上で－ＧＳＧＳＧＫ－ビオチン基で改変し、次いで、ストレプトアビジンコーティングされたバイオセンサー先端に別々に結合させる。ＣＤ２５抗体を含む緩衝液を、３００秒間の会合段階の間に先端上に流し、次いで、流した溶液を、ＣＤ２５抗体なしの緩衝液に切り替え、バイオセンサー先端からの解離を測定する。先端が当初結合したいずれの操作された免疫原もタンパク質も有さない対照もまた実行して、先端へのＣＤ２５抗体のいずれの背景結合をも評価する。全長ＣＤ２５がビオチン化されバイオセンサー先端に結合された第２の対照を実施して、全長ＣＤ２５へのＣＤ２５抗体の結合レベルを実証する。これらのバイオセンサー実験から得られたデータを使用して、操作された免疫原の結合を定性的にランク付けする。
ファージパニングによる操作された免疫原の評価
本明細書で提供される操作された免疫原を、ファージパニング技術を使用して評価する。
本明細書で提供される操作された免疫原を、ファージパニング技術を使用して評価する。
マウスＨｕＣＤ２５免疫化ファージライブラリーを、標準的なファージディスプレイプロトコールを使用して、ＴＧ１におけるエレクトロポレーションによって形質転換し、ＣＭ１３の添加によってファージ増殖させる。ファージを分泌するＴＧ１培養物を、１時間にわたる氷上でのインキュベーション後に、ＰＥＧ／ＮａＣｌでＰＥＧ沈殿させる。使用され得る例示的なライブラリーには、７８０７、７８０８、７８０９および７８１０が含まれる。
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）ｐＨサブトラクティブ選択：ファージパニングを、生理的ｐＨおよびＴＭＥ ｐＨで実施する。生理的ｐＨで全長ＣＤ２５に高い親和性で結合する抗体を枯渇させるために、サブトラクティブパニングを、ＰＢＳＴ ｐＨ７．４中１０ｕｇ／ｍｌの全長ＣＤ２５（４００ｎＭ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上での１時間にわたる吸収による、ｐＨ７．４での３×１０１１ｐｆｕファージ（３×１０８の１０００倍表示）の対抗選択によって最初に実施する。得られたファージ上清を収集し、ｐＨをＰＢＳＴでｐＨ６．５に調整する。引き続くファージパニング選択を、ｐＨ６．５で実施する。
パニング選択を、１時間のインキュベーション後に、抗原なしの２５マイクロリットルのストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓであらかじめ清澄化する。次いで、ファージを、新たなあらかじめブロッキングしたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄチューブに添加する。ビオチン化された操作された免疫原（例えば、実施例１に記載されるもの）を、１００ｎＭ濃度で（一部の場合には、さらなる５００ｍＭ ＮａＣｌを添加して、ファージへの免疫原の非特異的結合を低減させた）４０分間～１時間添加する。次いで、サンプルを、２５マイクロリットルのストレプトアビジンビーズまたはストレプトアビジンコーティングされたプレートと共に、ＲＴで１時間インキュベートする。サンプルをペレット化し、磁石／磁気ビーズを使用して洗浄し、またはプレートを用いる場合、ＰＢＳＴで７～１０回洗浄する。チューブを２回交換して、残留ファージを除去する。
ファージを溶出させるために、５０～８００μＬのグリシンｐＨ２．２を、それぞれビーズおよびプレートに添加し、１０分間以下インキュベートし、次いで、高ｐＨ Ｔｒｉｓ ９．０で中和する。溶出したファージを、１～５ｍｌの新たに成長させたＴＧ１（ＯＤ６００約０．５）に添加し、２０～３０分間インキュベートする。
フラクショナル対数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｌｏｇ）希釈系列をプレートし、残りを２５ｍｌの２×ＹＴに移す。１ｍｌのグリセロールストックを、引き続くパニングラウンドのために確保し、ヘルパーファージ／ＩＰＴＧをＯＤ６００約０．５で添加する。
ｐＨ７．４における対抗選択と共に、ｐＨ６．５における操作された免疫原に対する選択をもう１回実施する。ペリプラズム抽出物を、ファージＥＬＩＳＡおよびｏｃｔｅｔスクリーニングを使用して引き続いて評価する。
ｆａｂファージが、操作された免疫原に加えて全長ＣＤ２５にも結合することを確実にするために、全長ＣＤ２５を用いた最終選択を、操作された免疫原の代わりに、全長ＣＤ２５を用いて適宜実施することができる（操作された免疫原に対する２ラウンドの選択、次いで、全長ＣＤ２５に対する１ラウンドの選択）。
全長ＣＤ２５を用いた選択を実施するために、２５マイクロリットルのストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓによってパニング選択をあらかじめ清澄化し、新たなあらかじめブロッキングされたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄチューブにファージを添加した後に、ビオチン化された全長ＣＤ２５を、１００ｎｍ濃度で１時間添加する。次いで、サンプルを、２５マイクロリットルのストレプトアビジンビーズと共にＲＴで１時間インキュベートする。ペレット化、洗浄および溶出工程は、上記に従う。
ファージＥＬＩＳＡプロトコールおよびバイオセンサー／Ｏｃｔｅｔスクリーニング
ＥＬＩＳＡ／抽出物調製：ファージＥＬＩＳＡ、およびＦａｂ Ｏｃｔｅｔスクリーニングのためのペリプラズム抽出物調製を実施する。
ＥＬＩＳＡ／抽出物調製：ファージＥＬＩＳＡ、およびＦａｂ Ｏｃｔｅｔスクリーニングのためのペリプラズム抽出物調製を実施する。
ＣＤ２５抗原を希釈し、ＥＬＩＳＡプレートウェルに添加し、インキュベートする。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＢＳＡを添加しその後２５℃で２時間インキュベートすることによってブロッキングする。ファージを、１×ＰＢＳＴ １．０％ＢＳＡ、ｐＨ６．５中に２倍希釈し、５０マイクロリットルを１つ当たりに添加し、室温で５分間インキュベートする。ブロッキング溶液を、ウェルから振り落とし、５０μＬの希ファージ調製物を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートウェルを、２００マイクロリットルのＰＢＳＴ ｐＨ６．５で３～５回洗浄する。ＨＲＰコンジュゲートした抗Ｍ１３抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５０３７０）を、１×ＰＢＳＴ １．０％ＢＳＡ ｐＨ６．５で１：５０００希釈する。５０マイクロリットルの希釈された二次抗体コンジュゲートを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡプレートウェルを、２００マイクロリットルのＰＢＳＴ ｐＨ６．５で３～５回洗浄する。ＥＣＬ Ｌｕｍｏ基質（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を、記載されたように、１：１混合物に調製した。５０マイクロリットルの基質溶液を各ウェルに添加し、室温で５～６０分間インキュベートし、その後読み取る。
コロニーに、０．０３～４ｍｌの２×ＹＴ０．２％グルコース中で、０．１ｍｌの一晩培養物（９６ウェルプレート中の１ｍｌの培養物または１４ｍｌ ｆａｌｃｏｎチューブ中の４ｍｌの培養物）を接種する。ＯＤ６００が約０．５～１．０になるまで、これらを２５０～７００ｒｐｍで３７℃でインキュベートする。培養物を、５０～４００μＬの０．０２５～０．１Ｍ ＩＰＴＧで誘導する。一部の場合には、温度を、２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃まで低減させる。次いで、これらを一晩インキュベートする。１～４ｍｌの培養物を、３４００ｒｃｆで１０～１５分間ペレット化することによって回収する。上清を廃棄する。培養物を、１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤と共に５０～７５μＬのＰＰＢ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％スクロース）で再懸濁し、揺動プラットフォーム上で室温で５分間または４℃で１０分間インキュベートする。次いで、培養物を、１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤と共に１５０～２２５μＬの冷ｄｄＨ２Ｏで再懸濁し、揺動プラットフォーム上で室温で１時間または４℃で１～２時間インキュベートする。溶解物懸濁液を、４℃で１５０００ｒｃｆで１０～１５分間スピンした。上清を収集し、希釈する。
Ｆａｂ発現および精製プロトコール：細胞培養物を接種し、一晩成長させ、次いで、５０μＬの２５ｍＭ～１Ｍ ＩＰＴＧで誘導する。温度を３０℃まで低減させ、ｒｐｍを１５０まで低減させた。インキュベーションを一晩実施した。５０ｍｌの培養物またはプレートを、３４００ｒｃｆで１５分間ペレット化することによって回収した。上清を廃棄した。５０ｍＬの培養物からの細胞ペレットを、－８０℃のフリーザー中に１時間置き、一方で、プレート中で成長させた培養物には、１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡなし（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に７５μＬのＰＰＢを添加し、ボルテックスした。プレートを、１０００ｒｐｍで４℃で１０分間振盪する。１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡなし（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む２２５ｕＬ容量の冷水を、各ウェルに添加する。サンプルを混合し、最大速度、即ち１０００ｒｐｍで４℃で１～２時間振盪した。プレートを、３５００ｒｐｍで４℃で１０分間スピンする。上清（ＰＰＥ）を新たなプレートに移し、－２０℃で貯蔵する。５０ｍＬの培養物からの細胞ペレットを、フリーザーから取り出し、５ｍｌのＰＢＳ、１０ｍＭのイミダゾールを、２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび１×Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤、ＥＤＴＡなし（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に添加する。ペレットを室温で３０分間解凍した後、溶解物を、３４００ｒｃｆで１５分間遠心分離した。上清を取り出し、ペレットを廃棄する。Ｆａｂ精製のために、５００μＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（あらかじめ洗浄し、ペレットしたもの）を添加したか、またはＮｉ－ＮＴＡスピンカラムを使用した。清澄化した溶解物と共に３０分間～１時間インキュベートする。これを１５００ｒｃｆでスピンした。これらを、１ｍｌのＰＢＳ、１０ｍＭのイミダゾールで５回洗浄した。各スピン後に、緩衝液を廃棄した。１ｍｌのＰＢＳ、２００ｍＭのイミダゾールを添加および混合し、３０分間インキュベートし、１５００ｒｃｆで１５分間スピンした。溶出したタンパク質を、タンパク質濃度を決定した後、４℃または２０℃で貯蔵した。Ｚｅｂａカラムを、脱塩／緩衝液交換に使用した。
Ｏｃｔｅｔ／バイオセンサースクリーニング：生上清におけるＯｃｔｅｔ Ｋｏｆｆ ｒａｔｅスクリーニングのために、５０μＬの溶解物を、３８４ウェルＰａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔプレートにおいて使用する。データを、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４（ＭＤ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で収集する。簡潔に述べると、ヒトＣＤ２５を、ＡＲ２Ｇ先端にカップリングさせる（１ｕｇ／ｍｌ）。データ収集のために、ベースラインを、ＰＢＳＴ １％ＢＳＡ緩衝液中で６０秒間評価する。次いで、先端を、５０μＬの溶解物に移動させ、会合を３００秒間測定する。最後に、先端をＰＢＳＴ １％ＢＳＡ緩衝液に移動させる。次いで、先端を、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－グリシン、ｐＨ２．５で再生させ、ＰＢＳＴ、１％ＢＳＡで中和する。データ分析のために、二重参照（先端上にＣＤ２５なし、ならびにブランクの参照ウェル）を、参照サブトラクションのためにＯｃｔｅｔ ＨＴ １１．０ソフトウェアで実施する。
免疫原から生成した抗体の評価
抗体を、本明細書に記載される操作された免疫原でマウスを免疫化することによって産生する。これらの抗体を、交差反応性、交差遮断、親和性および解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）の推定のために評価する。
抗体を、本明細書に記載される操作された免疫原でマウスを免疫化することによって産生する。これらの抗体を、交差反応性、交差遮断、親和性および解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）の推定のために評価する。
バイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ３８４、Ｐａｌｌ Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）による交差反応性決定のためのプロトコール：このプロトコールを使用して、個々の試験クローン（抗ヒトＣＤ２５マウスモノクローナル）がヒト、カニクイザルおよびマウス種由来の標的（抗原）に結合する能力を決定する。標的タンパク質を、一級アミンを介して、デキストランコーティングされたセンサー先端に共有結合的にカップリングさせるか、または抗６×Ｈｉｓモノクローナル抗体コーティングされたセンサー先端上に６×Ｈｉｓタグ化標的タンパク質を親和性捕捉する。溶液中のモノクローナル上清を、バイオセンサー先端上の抗原に結合させる。正味の結合シグナルは、ブランクまたは抗原コーティングされた先端へのブランク培地または緩衝液の結合を対応するシグナルからサブトラクトした結合シグナルである。シグナル＞３×背景結合を、実際の結合事象とみなす。
バイオセンサーによる交差遮断のためのプロトコール：この方法は、個々の試験クローン（抗ヒトＣＤ２５マウスモノクローナル）が対照抗体を交差遮断することができるかどうかを決定するためのものである。交差遮断は、試験クローンが対照抗体の対応するエピトープと重複するエピトープを認識することを示し得る。さらに、これは、試験抗体が対照抗体と類似の機能的特性を有し得ることを暗示し得る。このプロトコールのために、対照抗体を、一級アミンを介して、デキストランコーティングされたセンサー先端に共有結合的にカップリングさせる。溶液中の標的抗原を、対照抗体に結合させる。この工程の後に、溶液中の試験抗体を、サンドイッチ形式で抗原に結合させる。試験抗体が抗原に結合できる場合には、それは対照抗体を交差遮断しないことが示されるが、非結合は、対照抗体を交差遮断する能力として解釈され得る。
バイオセンサーによる親和性決定のためのプロトコール：この方法を使用して、試験抗体の濃度が既知である場合の、個々の試験クローンの抗原との親和性を決定する。捕捉分子、例えば、プロテインＧまたは抗マウスＩｇＧモノクローナルもしくは抗ヒトＩｇＧモノクローナルを、バイオセンサー先端上にコーティングする。試験クローンを、捕捉分子コーティングされた表面上で捕捉する。これらの試験クローンに、溶液中の抗原を、会合段階については６０～６００秒間、解離段階については６０～１８００秒間の範囲の期間にわたって、会合および解離させる。次いで、結果データ（または「センサーグラム」）を、１：１ラングミュアモデルまたは２：１不均一モデル（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｍｏｄｅｌ）のいずれかを使用してフィットさせる。前者は、データをフィットさせるための２：１モデルがより良いフィットを生じる場合、相互作用対が均一であることを仮定し、これは、クローンが、固有の不均一性に起因してさらなるサブクローニングを必要とすることを示している。データ曲線フィットは、結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）定数および解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）定数の比として、解離定数を提供する。
バイオセンサーによる解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）推定のためのプロトコール：この方法を使用して、抗体の濃度が未知である場合または試験クローンがさらなるサブクローニングを必要とする場合の、試験クローンの解離速度定数を推計する。捕捉分子、例えば、プロテインＧまたは抗マウスＩｇＧモノクローナルもしくは抗ヒトＩｇＧモノクローナルを、バイオセンサー先端上にコーティングする。試験クローンを、捕捉分子コーティングされた表面上で捕捉する。これらの試験クローンに、溶液中の抗原を、会合段階については６０～６００秒間、解離段階については６０～１８００秒間の範囲の期間にわたって、会合および解離させる。次いで、結果データ（または「センサーグラム」）を、１：１ラングミュアモデルまたは２：１不均一モデルのいずれかを使用してフィットさせる。前者は、データをフィットさせるための２：１モデルがより良いフィットを生じる場合、相互作用対が均一であることを仮定し、これは、クローンが、固有の不均一性に起因してさらなるサブクローニングを必要とすることを示している。データは、解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）定数についてのみフィットされ、結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）（または会合）速度定数についてはフィットされない。これは、試験クローンを順序付けるために使用され得る解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）定数の推計を提供する。
参照標的としてＣＤ２５部分を使用した、操作されたポリペプチドの選択
ＣＤ２５の配列および３次元（３Ｄ）構造を、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）から検索した（ＰＤＢ ＩＤ番号２ＥＲＪ、Ａ鎖）：
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGSSSHSSWDNQCQCTSSATRSTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTG
ＣＤ２５の配列および３次元（３Ｄ）構造を、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）から検索した（ＰＤＢ ＩＤ番号２ＥＲＪ、Ａ鎖）：
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図６に示されるように、ＣＤ２５の推定治療的エピトープを、操作されたポリペプチドの選択のための参照標的として同定した。配列番号１に関する残基位置およびエピトープ配列は、表７中に提供される。
原子間距離およびアミノ酸記述子トポロジーを決定した。参照標的の原子間距離およびアミノ酸記述子トポロジーを、動力学的シミュレーションを使用して得、原子ゆらぎの共分散行列を、参照標的中のエピトープについて生成した。次に、異なる操作されたポリペプチド候補を、コンピューター的タンパク質設計（例えば、Ｒｏｓｅｔｔａ）、候補に対して実施した動力学シミュレーション、ならびに決定された原子間距離およびアミノ酸記述子トポロジーを使用して生成した。原子ゆらぎの共分散行列を、参照標的エピトープについて、および参照標的のエピトープ中の残基に対応する候補中の残基について生成した。
主成分分析を実施して、各共分散行列 － 各参照標的についての１つの共分散行列および候補の各々についての１つの共分散 － についての固有ベクトルおよび固有値を計算した。最も大きい固有値を有する固有ベクトルのみを保持する。固有ベクトルは、シミュレートされた分子構造のセットにおいて観察される１番目、２番目、３番目、Ｎ番目に支配的な運動を記述する。候補が参照エピトープと同様に動く場合、その固有ベクトルは、参照標的（エピトープ）の固有ベクトルと類似するであろう。固有ベクトルの類似性は、整列され、同じ方向を指すそれらの成分（各ＣＡ原子を中心とした３Ｄベクトル）に対応する。候補の固有ベクトルと参照標的の固有ベクトルとの間のこの類似性を、２つの固有ベクトルの内積を使用して計算した。内積値は、２つの固有ベクトルが互いに対して９０度である場合には０であったか、または２つの固有ベクトルが同じ方向を正確に指す場合には１であった。
固有ベクトルの順序付けは、それらの固有値に基づき、固有値は、分子動力学シミュレーションが２つの異なる分子の根底にあるエネルギーランドスケープをサンプリングする確率論的性質に起因して、それらの異なる分子間で必ずしも同じでなくてもよいので、複数の差次的にランク付けされた固有ベクトル間の内積が必要とされた（例えば、候補の固有ベクトル１×参照標的の固有ベクトル２、３、４など）。さらに、いずれの理論によって束縛されることも望まないが、分子運動は複雑であり、１つよりも多くの（または数個よりも多くの）支配的な／主要なモードの運動が関与し得る。
これら２つの課題を解決するために、候補および参照標的における固有ベクトルの全ての対間の内積を計算した。これは、内積の行列を生じ、その次元を、分析した固有ベクトルの数によって決定した － １０個の固有ベクトルについて、内積の行列は、１０×１０である。内積のこの行列を、内積の二乗平均平方根値を計算することによって、単一の値に変えた。これは、二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である。
主成分分析（ＰＣＡ）は、３Ｌ×３Ｌ次元座標共分散行列（Ｌは原子の数である）を、固有ベクトルΦ（参照標的）およびΨ（ＭＥＭ）、ならびに固有値Λのセットにする。セットΦは、参照標的についてのＮ個の固有ベクトルφｉを含み、セットΨは、ＭＥＭについてのＮ個の固有ベクトルψｊを含み、固有ベクトルは、それらの関連する固有値によって、それらのそれぞれのセットにおいて順序付けられる。最も大きい固有値を有する固有ベクトルは、総座標共変動の最も大きい割合を構成する。各φｉおよびψｊ固有ベクトルの内積を計算して、参照標的とＭＥＭとの間の運動の類似性を比較する。φｉおよびψｊ固有ベクトルの全ての内積組み合わせの二乗平均平方根は、参照標的との、操作されたポリペプチド候補（ＭＥＭ）の運動の類似性の総計を与える（ＲＭＳＩＰ）。
図７に示されるように、各操作されたポリペプチドにおいて、足場残基（灰色）を付加した、エピトープ残基（金色）および３Ｄ空間中の位置を、このコンピューター的設計手順によって選択する。ＰＤＢ ＩＤ番号２ＥＲＪ、Ａ鎖に関する残基位置およびエピトープ配列は、表８および表９中に提供される。架橋位置は、各ＭＥＭ配列における細胞内ジスルフィド結合形成の、期待される存在を指す。
ＭＥＭプログラムされたインビトロ選択を使用した抗体の選択
各々が３ラウンドの陽性選択を含む３２個の異なるパニング戦略（Ｓ１～Ｓ３２）を考案した（表１０）。各プログラムは、選択分子として、少なくとも１つの操作されたポリペプチドを使用した。従来の方法（陽性標的としてＣＤ２５）を使用する従来の選択もまた含めた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、非特異的結合に対して選択する陰性標的として使用した。
各々が３ラウンドの陽性選択を含む３２個の異なるパニング戦略（Ｓ１～Ｓ３２）を考案した（表１０）。各プログラムは、選択分子として、少なくとも１つの操作されたポリペプチドを使用した。従来の方法（陽性標的としてＣＤ２５）を使用する従来の選択もまた含めた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、非特異的結合に対して選択する陰性標的として使用した。
パニングプロトコールは、ヒトナイーブｓｃＦｖライブラリーで始まり、パニングを、ビオチンに結合した選択分子（しかしなおも溶液中にある）を用いて溶液中で実施した。各ラウンドについて、出発プールを、溶液中で陰性選択分子（ＢＳＡ）と最初に合わせ、次いで、ストレプトアビジンコーティングされた基質（例えば、磁気ビーズ）を混合物に適用して、陰性選択分子を結合させた。こうして、プール中の陰性選択分子に結合した全てのファージを、ストレプトアビジンコーティングされた支持体に結合させた。残りの溶液を取り出し、次いで、このフロースルーを、陽性選択工程に供した。フロースルーを、陽性選択分子（抗原１）と合わせ、結合させ、次いで、ストレプトアビジンコーティングされた固体基質を混合物に適用した。この工程では、結合したファージが保持されたが、残りの未結合のファージは除去された。次いで、結合したファージを溶出させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、３０分間のカルチベーションを使用して、溶出したファージでトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を、分析のための次世代配列決定およびＤＮＡ単離のために分割し、次いで、ファージを、引き続くパニングラウンドにおける使用のために増幅した。各パニングプログラムについて、各ラウンドにおいて、陰性選択を最初に実施し、陽性選択を次に実施した。
一次ＥＬＩＳＡスクリーニングおよびヒット選択
各戦略について３８４個のクローンを、３ラウンドのパニング後の、全長ＣＤ２５に対するＥＬＩＳＡ応答分析のために選択した（図９）。データは、エピトープ（図６）によって指定された仕分けされた戦略を用いて示される。各エピトープについて少なくとも１つの戦略が、ＣＤ２５に結合することが可能なクローンを生じた。同じ操作されたポリペプチドを使用した異なる戦略が、別個の高親和性クローン性サブセットを富化することが観察された（図１０、黒色の棒）。表１１に示されるように、ほとんどのＭＥＭプログラムされた選択戦略は、従来の全長パニングよりもより生産的に、抗ＣＤ２５ヒットを産生した。
ヒットのうち１４７５個は、ＥＬＩＳＡにおいて以下の２つの基準のうち１つを満たしたので、それらをさらなる特徴付けのために選択した：１）全長ＣＤ２５ ＥＬＩＳＡにおける＞１０：１のシグナル対ノイズ（ｓ／ｎ）；または２）ＭＥＭ ＥＬＩＳＡにおける＞３：１のｓ／ｎおよびＣＤ２５ ＥＬＩＳＡにおける＞５：１のｓ／ｎ。
バイオレイヤーインターフェロメトリーによる確認試験
バイオレイヤーインターフェロメトリーによる確認試験
異なるｓｃＦｖ抗体の親和性を、単一サイクル速度論アッセイ設計を使用して、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４（商標）バイオレイヤーインターフェロメトリー機器で評価した。Ｈｉｓタグ化ｓｃＦｖを、抗ｈｉｓバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ（登録商標）ＨＩＳ１Ｋ）上に固定化した。全長ＣＤ２５分析物を、センサー先端から洗い流し、ｓｃＦｖへの分析物中の分子の結合を記録した。各アッセイを二連で実行した。対照もまた、緩衝液のみ（センサードリフトについて対照をとるため）およびヒト血清から精製されたポリクローナルＩｇＧアイソタイプ抗体の別々の対照（非特異的ＩｇＧ結合について対照をとるため）を使用して実行した。
図１１に示されるように、１４７５個の抗ＣＤ２５ ｓｃＦｖのバイオレイヤーインターフェロメトリーを、ファージディスプレイパニングによって同定する。１４３３個のヒット（９７％）がＣＤ２５に結合することが確認されることを示す。これらのヒットの観察されたＫＤ範囲は、１０～２００ｎＭであり、中央値ＫＤは２８．５ｎＭであった。図１１に示されるように、ほとんどのスクリーニング戦略は、ＣＤ２５に対する高い親和性を有するｓｃＦｖを生成した。１０－３／ｓ未満のｋｏｆｆを有するｓｃＦｖのみが示される。適切なＫＤ値は、ｙ軸上に与えられる。図１２に示されるように、パニング戦略のほとんどは、１０－３／ｓ未満のｋｏｆｆを有する少なくとも１つのヒットを生じた。
フローサイトメトリーによる確認試験
フローサイトメトリーによる確認試験
異なるｓｃＦｖ抗体のＣＤ２５特異性を、ＣＤ２５を発現する細胞［ＣＤ２５（＋）］またはＣＤ２５を発現しない細胞［ＣＤ２５（－）］を使用して、フローサイトメーターで評価した。図１３に示されるように、このアッセイで分析した１２４８個のｓｃＦｖヒットのうち、１１６０個（９３％）が、ＣＤ２５（＋）細胞に特異的に結合する。
ヒットの配列分析
ヒットの配列分析
次世代配列決定を、各ラウンドのパニングされたファージに対して実施した。図１５に示されるように、ＭＥＭ操縦されたパニングは、戦略依存的様式で、抗体ライブラリーのＣＤＲ多様性を集中させる。選択の各ラウンドは、レパートリー多様性を減少させ（図１６）、ＣＤＲ長さを、各ＭＥＭについての好ましい長さに集中させた（図１７）。
個々のｓｃＦｖを、Ｓａｎｇｅｒ配列決定法を使用して配列決定した。各ｓｃＦｖについての完全なタンパク質配列は、表５中に提供される。免疫グロブリン遺伝子使用および相補性決定領域は、それぞれ、表１２および表２中に提供される。
ＣＤＲおよび生殖系列使用の分析は、配列決定した１４７５個のｓｃＦｖが少なくとも１２６個の別個のクローンに相当することを示唆している。このセットは、４０個の異なるＶＨ＋ＪＨフレームワーク選択および３５個のＶＬ＋ＪＬフレームワーク選択を含む。独自のＣＤＲ配列には、
が含まれる。
個々の標的エピトープに対するｓｃＦｖに適用した配列分析は、抗体の各セット内の共通のＣＤＲ使用パターンを同定する：
ＣＤ２５エピトープ１（５５～６３）について、使用したＣＤＲには、以下が含まれる：
ＣＤ２５エピトープ２（１３～２０：１２７～１３２）について、使用したＣＤＲには、以下が含まれる：
ＣＤ２５エピトープ３（５～１７）について、使用したＣＤＲには、以下が含まれる：
ＣＤ２５エピトープ４（５～１１：１５６～１６３）について、使用したＣＤＲには、以下が含まれる：
ＣＤ２５エピトープ５（７７～８９）について、使用したＣＤＲには、以下が含まれる：
ＣＤ２５エピトープ６（１４７～１５７）について、使用したＣＤＲには、以下が含まれる：
ＣＤ２５エピトープ７（１１～１４）について、使用したＣＤＲには、以下が含まれる：
ＣＤ２５エピトープ８（４４～５６）について、使用したＣＤＲには、以下が含まれる：
競合的結合によるエピトープ特異性の確認
１２６個の抗ＣＤ２５クローンを、図１８に示される４標的競合的結合アッセイを用いたエピトープ分解に供した。図中に示されるＩＬ－２、ダクリズマブおよびバシオリキシマブに対する結合部位は、Ｘ線結晶学的構造決定に基づく。７Ｇ７Ｂ６に対する結合部位は、ペプチドマッピングに基づく。
１２６個の抗ＣＤ２５クローンを、図１８に示される４標的競合的結合アッセイを用いたエピトープ分解に供した。図中に示されるＩＬ－２、ダクリズマブおよびバシオリキシマブに対する結合部位は、Ｘ線結晶学的構造決定に基づく。７Ｇ７Ｂ６に対する結合部位は、ペプチドマッピングに基づく。
交差競合アッセイを、古典的サンドイッチ形式で実施した。これには、第１の抗体をバイオセンサー上に固定化すること、その後の、抗原および次いで第２のサンドイッチ抗体とのインキュベーションが関与する。Ｈｉｓタグ化ｓｃＦｖを発現させ、上清からのＨｉｓタグ捕捉を使用してバイオセンサー上でインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で精製した。バイオセンサーＨｉｓタグ捕捉を、全てのｓｃＦｖ測定にわたって一貫したレベルまで先端負荷応答をモニタリングすることによって、ｓｃＦｖクローンにわたって規準化した。ｓｃＦｖを各々、抗Ｈｉｓバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ ＨＩＳ１Ｋ）に個々に捕捉した。ベースライン測定値を、ランニング緩衝液中で取得した。次いで、ＣＤ２５を抗体に捕捉させた。最後に、ＩＬ－２、７Ｇ７Ｂ６、バシリキシマブまたはダクリズマブを含む、種々の競合的分析物の各々を添加した。競合的分析物は、競合的分析物の結合エピトープが、固定化されたｓｃＦｖの結合エピトープと重複しない場合にのみ、捕捉されたＣＤ２５に結合することができる。
図１９に示されるように、全長ＣＤ２５パニングクローンは、ＩＬ－２界面エピトープによって支配される。ほとんどのクローンは、ＩＬ－２、ダクリズマブおよびバシオリキシマブによって遮断されるが、７Ｇ７Ｂ６によっては遮断されない。
図２０に示されるように、１４７～１５７エピトープＭＥＭ操縦クローンは、意図したエピトープにおいて主に結合する。ほとんどのクローンは、ダクリズマブによって遮断されるが、ＩＬ－２によっても、バシオリキシマブによっても７Ｇ７Ｂ６によっても遮断されない。
図２１に示されるように、６～１７エピトープＭＥＭ操縦クローンは、意図したエピトープにおいて主に結合する。ほとんどのクローンは、７Ｇ７Ｂ６によって遮断されるが、ＩＬ－２によっても、ダクリズマブによってもバシオリキシマブによっても遮断されない。
図２２に示されるように、１３～２０：１２７～１３２エピトープＭＥＭ操縦クローンは、意図したエピトープにおいて主に結合する。ほとんどのクローンは、７Ｇ７Ｂ６によって遮断されるが、ＩＬ－２によっても、ダクリズマブによってもバシオリキシマブによっても遮断されない。
図２３に示されるように、４４～５６エピトープＭＥＭ操縦クローンは、意図したエピトープにおいて主に結合する。クローンを、２つのプロファイルに分割した。プロファイル１では、クローンは、７Ｇ７Ｂ６によって遮断されるが、ＩＬ－２によっても、ダクリズマブによってもバシオリキシマブによっても遮断されない。プロファイル２では、クローンは、ＩＬ－２、ダクリズマブおよびバシオリキシマブによって遮断されるが、７Ｇ７Ｂ６によっては遮断されない。これらの遮断プロファイルは、異なるアプローチ角からの、意図したエピトープへの結合を示す。
図２４に示されるように、５５～６３エピトープＭＥＭ操縦クローンは、意図したエピトープにおいて主に結合する。クローンを、３つのプロファイルに分割した。プロファイル１では、クローンは、７Ｇ７Ｂ６によって遮断されるが、ＩＬ－２によっても、ダクリズマブによってもバシオリキシマブによっても遮断されない。プロファイル２では、クローンは、ＩＬ－２、ダクリズマブおよびバシオリキシマブによって遮断されるが、７Ｇ７Ｂ６によっては遮断されない。これらの遮断プロファイルは、異なるアプローチ角からの、意図したエピトープへの結合を示す。プロファイル３では、クローンは、ＩＬ－２および７Ｇ７Ｂ６によって遮断されるが、ダクリズマブによってもバシオリキシマブによっても遮断されない。これらの遮断プロファイルは、異なるアプローチ角からの、意図したエピトープへの結合を示す。
アラニン突然変異誘発による機能的エピトープのマッピング
アラニン突然変異を、ＭＥＭ操縦クローンが意図したエピトープをビニングすることを確認または拒絶するように設計した（図２５）。アラニン突然変異誘発は、競合アッセイによって規定された構造的エピトープではなく機能的エピトープに対して作用するので、抗体をビニングするための直交法としてこれを選択した。表面アクセス可能な残基の種々の対を、突然変異誘発のために選択した。コンピューター的モデル化を使用して、これらのアッセイにおける使用のために選択されたアラニン突然変異が全体的安定性にも局所的安定性にも影響を与えないことを確認する。例えば、図２６は、１４５～１５７エピトープ内のアラニン突然変異のモデル化についての結果を示す。各突然変異体および野生型について：結晶構造を参照として使用した、８つの異なる出発アポ－ＣＤ２５立体配置の各々についての露わな溶媒中での３つの独立した１００ｎｓ ＭＤシミュレーションからのＲＭＳＤ。図２７～２９に示されるように、ＣＤ２５のアラニン突然変異体バージョンは、それぞれ、バシリキシマブ、ダクリズマブおよび７Ｇ７Ｂ６に対する結合応答を有する。
アラニン突然変異を、ＭＥＭ操縦クローンが意図したエピトープをビニングすることを確認または拒絶するように設計した（図２５）。アラニン突然変異誘発は、競合アッセイによって規定された構造的エピトープではなく機能的エピトープに対して作用するので、抗体をビニングするための直交法としてこれを選択した。表面アクセス可能な残基の種々の対を、突然変異誘発のために選択した。コンピューター的モデル化を使用して、これらのアッセイにおける使用のために選択されたアラニン突然変異が全体的安定性にも局所的安定性にも影響を与えないことを確認する。例えば、図２６は、１４５～１５７エピトープ内のアラニン突然変異のモデル化についての結果を示す。各突然変異体および野生型について：結晶構造を参照として使用した、８つの異なる出発アポ－ＣＤ２５立体配置の各々についての露わな溶媒中での３つの独立した１００ｎｓ ＭＤシミュレーションからのＲＭＳＤ。図２７～２９に示されるように、ＣＤ２５のアラニン突然変異体バージョンは、それぞれ、バシリキシマブ、ダクリズマブおよび７Ｇ７Ｂ６に対する結合応答を有する。
意図したように、１４７～１５７エピトープ標的化された操作されたポリペプチドを用いたインビトロ選択からの結合性のｓｃＦｖヒットは、ＣＤ２５の意図した部分に対する特異性と一致する。
スクリーニングキャンペーンからの１１７個のｓｃＦｖの各々を、４つのアラニン突然変異対に対して試験した（図３１）。機能的エピトープの多様性が観察される。ＭＥＭ操縦されたヒットは、別個のイン－エピトープアラニン置換位置感受性を有する。
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）形式の抗体の確認試験
３０個の抗体を、さらなる試験のために全長免疫グロブリンとして選択した。重鎖および軽鎖配列を、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）形式にクローニングし、発現させ、精製した。ＣＤ２５への結合を、表１３に示されるように、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）によって評価した。
３０個の抗体を、さらなる試験のために全長免疫グロブリンとして選択した。重鎖および軽鎖配列を、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ１）形式にクローニングし、発現させ、精製した。ＣＤ２５への結合を、表１３に示されるように、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）によって評価した。
マウス抗体配列のパニング偏りライブラリー
ファージディスプレイライブラリーを、全長ＣＤ２５で免疫化したマウスの免疫グロブリン遺伝子から生成した。ＣＤ２５結合抗体に偏ったこのライブラリーを、示された操作されたポリペプチドに対してパニングして、表１４Ａおよび表１４Ｂに示される相補性決定領域配列を得た。
ファージディスプレイライブラリーを、全長ＣＤ２５で免疫化したマウスの免疫グロブリン遺伝子から生成した。ＣＤ２５結合抗体に偏ったこのライブラリーを、示された操作されたポリペプチドに対してパニングして、表１４Ａおよび表１４Ｂに示される相補性決定領域配列を得た。
配列分析は、クローン性系譜に由来するこれらの抗体が、表１５Ａおよび表１５Ｂに示されるようにグループ分けされ得ることを示唆している。
Claims (78)
- ＣＤ２５参照標的と少なくとも４６％の構造的および／または動力学的同一性を共有する操作されたポリペプチドであって、前記ＣＤ２５参照標的が、
から選択されるＣＤ２５の一部分である、操作されたポリペプチド。 - 前記ＣＤ２５参照標的と少なくとも６０％の構造的および／または動力学的同一性を共有する、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記ＣＤ２５参照標的と少なくとも８０％の構造的および／または動力学的同一性を共有する、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。
-
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を共有する、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。 - 選択されたＣＤ２５エピトープを模倣するように設計された操作されたポリペプチドであって、
から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を共有する、操作されたポリペプチド。 - 前記操作されたポリペプチドが、ＣＤ２５参照標的と少なくとも４６％の構造的および／または動力学的同一性を共有し、前記ＣＤ２５参照標的が、
から選択されるＣＤ２５の一部分である、請求項５に記載の操作されたポリペプチド。 - 前記ＣＤ２５参照標的と少なくとも８０％の構造的および／または動力学的同一性を共有する、請求項６に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記ＣＤ２５参照標的に対する前記構造的および／または動力学的同一性が、ＰＤＢ ＩＤ番号２ＥＲＪ、Ａ鎖で寄託されたＣＤ２５の構造を使用して決定される、請求項１～７のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- Ｎ末端改変またはＣ末端改変を含み、適宜、Ｎ末端ビオチン－ＰＥＧ２－またはＣ末端－ＧＳＧＳＧＫ－ビオチンを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記操作されたポリペプチドのアミノ酸の１０％～９８％の間が、１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たし、適宜、前記１つ以上の参照標的由来拘束を満たす前記ポリペプチドの前記アミノ酸が、請求項５で下線で示された残基である、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たす前記アミノ酸が、前記ＣＤ２５参照標的と、８．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）の構造的相同性を有する、請求項１０に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記１つ以上のＣＤ２５参照標的由来拘束を満たす前記アミノ酸が、３０Å２～３０００Å２の間の、前記参照とのファンデルワールス表面積重複を有する、請求項１０または請求項１１に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記ＣＤ２５参照標的由来拘束が、原子間距離；原子ゆらぎ；原子エネルギー；化学的記述子；溶媒曝露；アミノ酸配列類似性；生物情報学的記述子；非共有結合傾向；ファイ角；プサイ角；ファンデルワールス半径；二次構造傾向；アミノ酸隣接性；およびアミノ酸接触からなる群から独立して選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
- 前記１つ以上の参照標的由来拘束を満たす前記ポリペプチドの前記アミノ酸にわたって、前記参照標的と４６％～９６％のＲＭＳＩＰまたはそれよりも高い構造的類似性を共有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。
-
から選択されるＣＤ２５エピトープに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む、ＣＤ２５特異的抗体。 - 前記ＣＤ２５エピトープが、５５～６３であり、前記抗体が、
から各々独立して選択される６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５に記載の抗体。 - 前記ＣＤ２５エピトープが、１３～２０：１２７～１３２であり、前記抗体が、
から各々独立して選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１５に記載の抗体。 - 前記ＣＤ２５エピトープが、５～１７であり、前記抗体が、
から各々独立して選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１５に記載の抗体。 - 前記ＣＤ２５エピトープが、５～１１：１５６～１６３であり、前記抗体が、
から各々独立して選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１５に記載の抗体。 - 前記ＣＤ２５エピトープが、７７～８９であり、前記抗体が、
から各々独立して選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１５に記載の抗体。 - 前記ＣＤ２５エピトープが、１４７～１５７であり、前記抗体が、
から各々独立して選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１５に記載の抗体。 - 前記ＣＤ２５エピトープが、１１～１４であり、前記抗体が、
から各々独立して選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１５に記載の抗体。 - 前記ＣＤ２５エピトープが、４４～５６であり、前記抗体が、
から各々独立して選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１５に記載の抗体。 - ａ）表３Ａ、GGTFSSYA、GGSISSGGYY、GFTFSSYG、GYTFTSYY、GYTFTSYG、GYTFTDYY、GGSISSGGYS、GGSISSSNW、GYSFTSYW、GFTFSNYG、GFTFSSSA、GFTFSSYW、GFIFSRHA、GYTFNNYG、GFTFSSYA、GYTFTTYA、GFTFNNAW、GFTFSSYE、GYSFTTYW、GYSFNTYW、GFTFRRYW、GYSFSTYW、GFAFSSYG、GYKFANYW、GYTFKNFG、GFTFSSYS、GDSISSSSYY、およびGGSISRSNW;から選択されるＣＤＲ－Ｈ１；
ｂ）表３Ａ、IIPIFGTA、IIPIFGTA、IYYSGST、ISYDGSNK、INPSGGST、ISAYNGNT、IMPIFDTA、VDPEDGET、IYHSGST、IYPGDSDT、ISHDGHVK、IKQDGSEK、ISVYNGDI、INTNTGDP、IKSKTDGGTT、ISSSGSTI、ISSRGSTI、IYPSDSDT、ISGRKGNT、ISSSSSYI、INHSGST、IYHTGST、およびISYDGNNK;から選択されるＣＤＲ－Ｈ２：
ｃ）表３Ａ、AREMYYYYGMDV、AREMYYYYGMDV、ARGNLWSGYYF、AKELLEGAFDI、ARDRVTMVRGALAY、ARERSYYGMDV、ASWSERIGYQYGLDV、ARDILGLDY、ATEDTAMGGIDY、ATEGRYGMDV、AVEGGRAPGTYYYDSSGLAY、ARAGYYYGMDV、ARDLGTMVRGVIEPYYFDY、ARGVRGTGFDP、ARDRNGYFQH、AKDLLGELSFFDY、ARLENNWDYGGWFDP、ARDRSYYGMDV、ARDKGYYGMDV、AKEISPRSSVGWPLDY、ARDFWSGYNELGGMDV、ARTWFGEFFDY、ARVIGGWFDP、ARGRLAYGDTEGFDY、ARDILRGESSILDH、ARDRYYYGMDV、ARDLLGSGYDIIDY、ARVWGKNGDFDY、ARDRFHYGMDV、ARDRGDY、TTEGVELLSFGGAPFDY、ARRRGGGFDY、AREKGSWFDP、ARDRGDRVGGLVFDY、ARQVAGGLDY、ARDRGYYGMDV、FRFGEGFDY、ARDGGYYFDD、ARDFRMDV、ARDAYAYGLDV、ARDLMNYGMDV、AREYDYGDYVFDY、ARLENNWNYGGWFDP、ARDYYYYGMDV、ARDIGYYYGMDV、ARVGDGYSLDY、AKAITSIEPY、AKGQGDGMDV、ARLGWGMDV、ARVWGDTTLGYGMDV、AIPWDAELGNYGMDV、ARGRWSGLGDY、ARARGGRYFDY、ARDQLAARRGYYYGMDV、AKGDVNYGMDV、ARDFYYGSGSYPNGYYYGMDV、ARDFNPFSITIFEMDV、ANLAMGQYFDY、ARDLGEAKSSSPHEPDY、ARDQEMYYFDY、ARGKGSYAFDI、およびAKGYSSSPGDY;から選択されるＣＤＲ－Ｈ３；
ｄ）表３Ｂ、QSISSY、QSISSY、SSNIGNNF、QSISNY、NIETKS、KLGDKY、QSVSNY、QTISQW、SSNIGSNY、NFNIGNNL、RNIWSY、QSISSW、QSVSSR、QTISGL、DIESEM、NIGSKS、QSIGNY、QGISSW、QSVSSTY、QDISNY、NIESES、SSDVGAYNY、QDINNY、QGISNS、SSNIGNNY、EGIRTS、QGTSSW、SSDVGGYNY、QSVSNNY、QGINSY、QAVRID、QSISRY、QSIGYW、SSNVGSNY、QSIKNY、QDIKRR、SGSIASSY、NSNVGNNY、SLRSYY、KLGERF、SGSVSTSYY、SSNIGRNY、EDIRMY、QGISTY、SSNVGSRT、NIGTKS、NIGSKT、QSINSY、SSNIGSNT、QSIITY、QSLLHSDGKTY、およびGGNIARNY;から選択されるＣＤＲ－Ｌ１；
ｅ）表３Ｂ、AAS、AAS、DST、DDD、KDN、GAS、KAS、RNN、SNN、AND、DAF、DDS、AAT、AVS、DAS、GVS、DNN、DVS、RAS、GTS、EDN、DND、GKN、QYI、NTD、RNH、EGS、DGR、TAS、DDT、EVS、およびEDD;から選択されるＣＤＲ－Ｌ２；ならびに／または
ｆ）表３Ｂ、QQSYSTPPT、QQSYSTPPT、GSWDTNLSGYV、QVWDSSSGHREV、QAWDSSTYV、QQYNHWPPL、QQYSGDSMYT、AAWDDSLSGVV、AAWDDSLNGVV、ATWDDSLSGVV、QQSHSTPIT、QQYNSYSRT、QQYTNWPQT、LQYDRYSGA、QVWHTTNDHVL、QVWDSSSDHWV、QQSKQIPYT、QQSYSLPLT、QQFDISGGLI、QQYDNLPLT、QVWDSSSDHTVA、SSYTTTDTFV、QQYDNLPYT、QQYYSTPPH、QQSYSTPLT、QVWDSSSDHVV、GTWDSSLSAYV、QQTHTWPWT、QQANSFPLT、QQSYSTPYT、SSYTSSSTYV、QRYGSSPR、QQVHSFPFT、LQHNTFPYT、QQSHSTPLT、QQYNSYPFT、QQYNSSPLMYT、QQTYSTPLT、QQANTFPQT、QSYDGSSVV、GSWEARESVFV、QQTYNDPPT、NSRDSSGNHVV、QTWDGSIVV、VLYMGSGIWV、ATWDDALSGWV、SSYTSSSTLVV、QQSYSTPWT、SSYTSSSTWV、LQDYNYPPA、QQYYDDPQ、QQLNGYPTT、AAWDDSLIGHV、QVWDTSGDLHWA、QQSYTTPLT、QVWDSSSDLLWV、GTWDSSLSALV、AAWDDSLNGPV、MQTKQLPLT、QQANSFPPT、QSYDGNNHMV、およびSSYTSSSTLWVから選択されるＣＤＲ－Ｌ３
を含む、請求項１５に記載の抗体。 - 前記抗体が、ＣＤ２５の結合について、エピトープ特異的参照結合剤と競合し、前記エピトープ特異的結合剤が、ＩＬ－２、ダクリズマブ、バシオリキシマブおよび／または７Ｇ７Ｂ６である、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、オフターゲット参照結合剤と競合せず、前記オフターゲット結合剤が、ＩＬ－２、ダクリズマブ、バシオリキシマブおよび／または７Ｇ７Ｂ６である、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体のＩＬ－２への結合が、
ａ）Ｄ７７ＡおよびＱ７９Ａ；
ｂ）Ｑ８１ＡおよびＴ８３Ａ；
ｃ）Ｄ７７ＡおよびＮ７８Ａ；
ｄ）Ｔ３５ＡおよびＱ１５１Ａ；
ｅ）Ｍ３９ＡおよびＭ１４７Ａ；
ｆ）Ｈ３３ＡおよびＴ３５Ａ；
ｇ）Ｋ３７ＡおよびＹ１４９Ａ；
ｈ）Ｅ３０ＡおよびＨ３３Ａ；
ｉ）Ｄ２７ＡおよびＥ３０Ａ；
ｊ）Ｒ１７６ＡおよびＱ１７９Ａ；
ｋ）Ｑ１８１ＡおよびＩ１８３Ａ；
ｌ）Ｅ１００ＡおよびＲ１０４Ａ；
ｍ）Ｑ１０１ＡおよびＫ１０５Ａ；
ｎ）Ｋ１０２ＡおよびＫ１０５Ａ；
ｏ）Ｋ１６９ＡおよびＴ１７１Ａ；
ｐ）Ｋ１７４ＡおよびＲ１７６Ａ；
ｑ）Ｔ１７５ＡおよびＲ１７６Ａ；
ｒ）Ｍ１７０ＡおよびＨ１７２Ａ；
ｓ）Ｎ７０ＡおよびＳ７１Ａ；
ｔ）Ｓ７２ＡおよびＨ７３Ａ；
ｕ）Ｓ７４ＡおよびＳ７５Ａ；および
ｖ）Ｌ２３ＡおよびＤ２５Ａ
から選択されるＩＬ－２に対する突然変異によって破壊される、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、１０－２／ｓ未満、１０－３／ｓ未満または１０－４／ｓ未満のｋｏｆｆを有し、前記ｋｏｆｆが、可溶性ヒトＣＤ２５を用いたバイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して測定される、請求項１５～２７のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、１０－２／ｓと１０－５／ｓとの間のｋｏｆｆを有し、前記ｋｏｆｆが、可溶性ヒトＣＤ２５を用いたバイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して測定される、請求項１５～２８のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、１００ｎＭ未満、２５ｎＭ未満または５ｎＭ未満のＫＤを有し、前記ＫＤが、可溶性ヒトＣＤ２５を用いたバイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して測定される、請求項１５～２９のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、１００ｎＭと１ｎＭとの間のＫＤを有し、前記ＫＤが、可溶性ヒトＣＤ２５を用いたバイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して測定される、請求項１５～３０のいずれか一項に記載の抗体。
- ＣＤ２５を発現する細胞に特異的に結合する、請求項１５～３１のいずれか一項に記載の抗体。
- 少なくとも１０４または少なくとも１０５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、ＣＤ２５を発現する細胞に結合する、請求項１５～３２のいずれか一項に記載の抗体。
- １０４と１０６との間の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、ＣＤ２５を発現する細胞に結合する、請求項１５～３３のいずれか一項に記載の抗体。
- ＣＤ２５（－）細胞に結合しない、請求項１５～３４のいずれか一項に記載の抗体。
- １０３未満の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で、ＣＤ２５（－）細胞に結合する、請求項１５～３５のいずれか一項に記載の抗体。
- 表７Ｄの組み合わせ１～１２６のいずれか１つの６つのＣＤＲを含む、請求項１５に記載の抗体。
- 請求項１５～３７に記載の抗体のいずれか１つを含み、適宜、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- 処置を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体または請求項３８に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 前記対象が、がんを患っている、請求項３９に記載の方法。
- 前記対象が、自己免疫性疾患または障害を患っている、請求項３９に記載の方法。
- 配列番号２～５、配列番号７～８および配列番号１７～２１からなる群から選択される配列に対して少なくとも６０％の配列類似性を有する、操作された免疫原。
- 前記配列に対して少なくとも８０％の類似性を有する、請求項４２に記載の操作された免疫原。
- 前記配列に対して少なくとも９０％の類似性を有する、請求項４２または４３に記載の操作された免疫原。
- 少なくとも１つの特徴をＣＤ２５と共有する、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の操作された免疫原。
- ＣＤ２５の抗体に結合する、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の操作された免疫原。
- 約７．３と約７．５との間のｐＨでの結合親和性と比較して、７．０を下回るｐＨで、ＣＤ２５の抗体に対するより高い結合親和性を有する、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の操作された免疫原。
- 約７．３と約７．５との間のｐＨでの結合親和性と比較して、約６．４と約６．６との間のｐＨで、ＣＤ２５の抗体に対するより高い結合親和性を有する、請求項４７に記載の操作された免疫原。
- 抗体を産生する方法であって、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の操作された免疫原で動物を免疫化すること、および抗体を産生することを含む、方法。
- 前記抗体が、ＣＤ２５に対する抗体である、請求項４９に記載の方法。
- 前記抗体が、約７．３と約７．５との間のｐＨでの結合親和性と比較して、７．０を下回るｐＨで、ＣＤ２５に対するより高い結合親和性を示す、請求項４９または５０に記載の方法。
- 前記抗体が、約７．３と約７．５との間のｐＨでの結合親和性と比較して、約６．４と約６．６との間のｐＨで、ＣＤ２５に対するより高い結合親和性を示す、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、ＣＤ２５のＩＬ－２への結合を遮断しない、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、ＣＤ２５のＩＬ－２への結合を遮断する、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、ＩＬ－２Ｒ－アルファ、ＩＬ－２Ｒ－ベータおよびＩＬ－２Ｒ－ガンマのヘテロトリマー化を防止する、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、ＣＤ２５のシス配向およびトランス配向の両方に結合することが可能である、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の方法。
-
から各々独立して選択される６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体。 -
から各々独立して選択される６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体。 -
から各々独立して選択される６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体。 -
から各々独立して選択される６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体。 - 表４中に提供される組み合わせのいずれか１つから選択される６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体。
- 表３Ａおよび表３Ｂ中に提供されるＹＵ３９０－Ｂ１２、ＹＵ３９７－Ｆ０１、ＹＵ３９７－Ｄ０１、ＹＵ３９８－Ａ１１、ＹＵ４０４－Ｈ０１、ＹＵ４００－Ｂ０７、ＹＵ４００－Ｄ０９、ＹＵ４０１－Ｂ０１、ＹＵ４０１－Ｇ０７、ＹＵ４０４－Ｃ０２、ＹＵ４０３－Ｇ０７、ＹＵ４０３－Ｇ０５、ＹＵ３９１－Ｂ１２、ＹＵ４００－Ａ０３、ＹＵ４００－Ｄ０２、ＹＵ３９２－Ａ０９、ＹＵ３９２－Ｂ１１、ＹＵ３９２－Ｂ１２、ＹＵ３９２－Ｅ０５、ＹＵ３９２－Ｅ０６、ＹＵ３９２－Ｇ０８、ＹＵ３８９－Ａ０３、ＹＵ３９２－Ｇ０９、ＹＵ３９２－Ｇ１２、ＹＵ３９２－Ｈ０２、ＹＵ３９２－Ｈ０４、ＹＵ４０２－Ｆ０１、ＹＵ３８９－Ｂ１１、ＹＵ３９４－Ｄ０８、またはＹＵ３９０－Ａ１１、のいずれか１つについての６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体。
- 表５中に提供されるＹＵ３９０－Ｂ１２、ＹＵ３９７－Ｆ０１、ＹＵ３９７－Ｄ０１、ＹＵ３９８－Ａ１１、ＹＵ４０４－Ｈ０１、ＹＵ４００－Ｂ０７、ＹＵ４００－Ｄ０９、ＹＵ４０１－Ｂ０１、ＹＵ４０１－Ｇ０７、ＹＵ４０４－Ｃ０２、ＹＵ４０３－Ｇ０７、ＹＵ４０３－Ｇ０５、ＹＵ３９１－Ｂ１２、ＹＵ４００－Ａ０３、ＹＵ４００－Ｄ０２、ＹＵ３９２－Ａ０９、ＹＵ３９２－Ｂ１１、ＹＵ３９２－Ｂ１２、ＹＵ３９２－Ｅ０５、ＹＵ３９２－Ｅ０６、ＹＵ３９２－Ｇ０８、ＹＵ３８９－Ａ０３、ＹＵ３９２－Ｇ０９、ＹＵ３９２－Ｇ１２、ＹＵ３９２－Ｈ０２、ＹＵ３９２－Ｈ０４、ＹＵ４０２－Ｆ０１、ＹＵ３８９－Ｂ１１、ＹＵ３９４－Ｄ０８、またはＹＵ３９０－Ａ１１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を各々が共有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体。
- 全長免疫グロブリンＧモノクローナル抗体である、請求項６３に記載の抗体。
- 表５中に提供されるＹＵ３９０－Ｂ１２、ＹＵ３９７－Ｆ０１、ＹＵ３９７－Ｄ０１、ＹＵ３９８－Ａ１１、ＹＵ４０４－Ｈ０１、ＹＵ４００－Ｂ０７、ＹＵ４００－Ｄ０９、ＹＵ４０１－Ｂ０１、ＹＵ４０１－Ｇ０７、ＹＵ４０４－Ｃ０２、ＹＵ４０３－Ｇ０７、ＹＵ４０３－Ｇ０５、ＹＵ３９１－Ｂ１２、ＹＵ４００－Ａ０３、ＹＵ４００－Ｄ０２、ＹＵ３９２－Ａ０９、ＹＵ３９２－Ｂ１１、ＹＵ３９２－Ｂ１２、ＹＵ３９２－Ｅ０５、ＹＵ３９２－Ｅ０６、ＹＵ３９２－Ｇ０８、ＹＵ３８９－Ａ０３、ＹＵ３９２－Ｇ０９、ＹＵ３９２－Ｇ１２、ＹＵ３９２－Ｈ０２、ＹＵ３９２－Ｈ０４、ＹＵ４０２－Ｆ０１、ＹＵ３８９－Ｂ１１、ＹＵ３９４－Ｄ０８、またはＹＵ３９０－Ａ１１の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）配列と少なくとも９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を共有するｓｃＦｖを含む、請求項１５～３７のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒト抗体である、請求項１５～３７または６１～６５のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒト化抗体である、請求項１５～３７または６１～６５のいずれか一項に記載の抗体。
- キメラ抗体である、請求項１５～３７または６１～６５のいずれか一項に記載の抗体。
- マウス可変ドメインおよびヒト定常ドメインを含む、請求項１５～３７または６１～６５のいずれか一項に記載の抗体。
- カニクイザルＣＤ２５にも結合する、請求項１５～３７または６１～６９のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項１５～３７または６１～７０のいずれか一項に記載の抗体を含み、適宜、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
- 処置を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１５～３７もしくは６１～７０のいずれか一項に記載の抗体または請求項７１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 前記対象が、がんを患っている、請求項７２に記載の方法。
- 前記対象が、自己免疫性疾患または障害を患っている、請求項７２に記載の方法。
- 対象において調節性Ｔ細胞の数を枯渇させる方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１５～３７もしくは６１～７０のいずれか一項に記載の抗体または請求項７１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 前記対象が、がんを患っている、請求項７５に記載の方法。
- 前記対象が、自己免疫性疾患または障害を患っている、請求項７５に記載の方法。
- 請求項１５～３７もしくは６１～７０のいずれか一項に記載の抗体または請求項７１に記載の医薬組成物を含む、キット。
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