KR20220041784A - 메소 스케일 조작된 펩티드 및 선택 방법 - Google Patents

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KR20220041784A
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매튜 피. 그레빙
케빈 에두아드 하우저
앤드류 모린
조던 알. 윌리스
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루브릭 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 포함하는 조작된 펩티드 -여기서 적어도 하나의 제약조건은 참조 표적으로부터 유래됨, - 및 상기 조작된 펩티드를 선택하는 방법이 본원에 제공된다. 결합 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 방법에서 양성 및/또는 음성 선택 분자를 포함하는, 조작된 펩티드를 사용하는 방법이 추가로 제공된다.

Description

메소 스케일 조작된 펩티드 및 선택 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 5월 31일에 출원되고 발명의 명칭이 "Meso-Scale Engineered Peptides and Methods of Selecting"인 미국 특허출원 제62/855,767호에 대한 우선권과 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
치료 공간에서의 많은 기본 연구는 새로운 치료 항체를 개발하기 위한 새로운 펩티드 치료제 또는 새로운 펩티드 면역원과 같은, 바람직한 특성을 갖는 신규한 분자를 동정하고 개발하는 것에 관한 것이다. 그러나, 표준 분자 발견 패러다임은 유망한 기능성 분자를 동정하기 위해 확률적 프로세스를 사용하는 무작위 샘플링에 의존한다. 그런 다음, 이 분자 후보물질들이 특정 용도에 대해 원하는 활성, 기능, 약동학 및/또는 기타 필요한 특징을 가지게 될 것이라는 희망을 가지고 여러 차례의 평가 및 시험을 거친다. 이 시스템은, 무작위 그룹의 스크리닝으로 시작하여, 하나 이상의 필요한 특징이 충족되지 않은, 실패를 종종 초래한다. 따라서, 연산, 화학적 및 생물학적 설계의 요소들을 포함하는 조작된 펩티드를 개발하는 방법이 필요하다.
일부 측면에서, 조작된 펩티드가 본원에 제공되며, 여기서 상기 조작된 펩티드는 1 kDa 내지 10 kDa의 분자량을 가지고, 최대 50개의 아미노산을 포함하고, 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 포함하고, 여기서 상기 제약조건 중 하나 이상은 참조 표적-유래 제약조건이고; 그리고 여기서 상기 조작된 펩티드의 아미노산의 10% 내지 98%는 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족하고, 여기서 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 참조 표적과 8.0 Å 미만의 백본 평균 제곱근 편차(RSMD) 구조적 상동성을 갖는다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 참조 표적과 10% 내지 90%의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시예에서, 이들은 반 데르 발스 표면적이 30 Å2 내지 3000 Å2의 참조와 중첩된다. 특정 실시예에서, 조합은 적어도 2개, 또는 적어도 5개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함한다. 일부 실시예에서, 제약조건들의 조합은 참조 표적으로부터 유래되지 않은 하나 이상의 제약조건을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 비-참조 표적-유래 제약조건은 원하는 구조적, 역학적, 화학적 또는 기능적 특징, 또는 이들의 임의의 조합을 기술한다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 독립적으로 연관된다. 일부 실시예에서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 베타-시트 또는 알파 나선과 같은, 참조 표적 내의 이차 구조적 요소로 위상적으로 제약된다.
다른 측면에서, 조작된 펩티드를 선택하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은:
참조 표적의 하나 이상의 위상 특징을 식별하는 단계;
각각의 위상 특징에 대해 공간적으로-연관된 제약조건을 설계해서 상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 생산하는 단계;
후보 펩티드의 공간적으로-연관된 위상 특징을 상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합과 비교하는 단계; 및
상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합과 중첩되는 공간적으로-연관된 위상 특징을 갖는 후보 펩티드를 선택해서 상기 조작된 펩티드를 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 각각의 특징 사이의 중첩은 독립적으로 총 위상 제약조건 거리(Total Topological Constraint Distance, TCD), 위상 클러스터링 계수(topological clustering coefficient, TCC), 유클리드 거리(Euclidean distance), 전력 거리, 수르겔 거리(Soergel distance), 캔버라 거리(Canberra distance), 소렌슨 거리(Sorensen distance), 자카드 거리(Jaccard distance), 마할라노비스 거리(Mahalanobis distance), 해밍 거리(Hamming distance), 유사도의 정량적 추정치(Quantitative Estimate of Likeness, QEL) 또는 체인 위상 파라미터(Chain Topology Parameter, CTP) 중 하나 이상에 의해 결정되는 75% 이하의 평균 백분율 오차(MPE)이다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 잔기별 에너지, 잔기별 상호작용, 잔기별 요동, 잔기별 원자 거리, 잔기별 화학 기술어(chemical descriptor), 잔기별 용매 노출, 잔기별 아미노산 서열 유사도, 잔기별 생물정보 기술어, 잔기별 비공유 결합 성향, 잔기별 phi/psi 각도, 잔기별 반 데르 발스 반지름, 잔기별 이차 구조 성향, 잔기별 아미노산 인접도, 또는 잔기별 아미노산 접촉로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 후보 펩티드의 특징은 컴퓨터 시뮬레이션에 의해 결정된다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 독립적으로 연관된다. 일부 실시예에서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 베타-시트 또는 알파 나선과 같은, 참조 표적 내의 이차 구조적 요소로 위상적으로 제약된다.
또 다른 측면에서, 2개 이상의 선택 조종(steering) 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 폴리펩티드는 독립적으로 하나 이상의 양성 조종 특징을 포함하는 양성 선택 분자이고, 또는 하나 이상의 음성 조종 특징을 포함하는 음성 선택 분자를 포함하고, 여기서 각각의 특징 유형은 다음으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고: 아미노산 서열, 폴리펩티드 이차 구조, 분자 역학, 화학적 특징, 생물학적 기능, 면역원성, 참조 표적(들) 다중 특이성, 종간 참조 표적 반응성, 원하지 않는 참조 표적(들)에 대한 원하는 참조 표적(들)의 선택성, 서열 및/또는 구조적으로 상동성인 계열 내에서의 참조 표적(들)의 선택성, 유사한 단백질 기능을 갖는 참조 표적(들)의 선택성, 높은 서열 및/또는 구조적 상동성을 갖는 원하지 않는 표적의 더 큰 계열로부터 구별되는 원하는 참조 표적(들)의 선택성, 구별되는 참조 표적 대립유전자 또는 돌연변이에 대한 선택성, 구별되는 참조 표적 잔기 수준 화학적 변형에 대한 선택성, 세포 유형에 대한 선택성, 조직 유형에 대한 선택성, 조직 환경에 대한 선택성, 참조 표적(들) 구조적 다양성에 대한 내성, 참조 표적(들) 서열 다양성에 대한 내성, 및 참조 표적(들) 역학 다양성에 대한 내성; 여기서 상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드이다.
일부 실시예에서, 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 양성 선택 분자이고, 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 음성 선택 분자이다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 미처리(native) 단백질이다. 특정 실시예에서, 적어도 하나의 공유된 특징 유형을 포함하는 적어도 한 쌍의 대응되는 양성 선택 분자 및 음성 선택 분자를 포함하고, 여기서 상기 양성 선택 분자는 상기 양성 특징을 포함하고, 상기 음성 선택 분자는 상기 음성 특징을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 2개 이상의 선택 조종 분자를 포함하는 조성물로 결합 분자 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 후보 결합 분자 풀이 적어도 1회의 선택 라운드를 거치는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 선택 라운드는:
음성 선택 분자에 대해 상기 풀의 적어도 일부분을 스크리닝하는 음성 선택 단계; 및
양성 선택 분자에 대해 상기 풀의 적어도 일부분을 스크리닝하는 양성 선택 단계를 포함하고;
여기서 각각의 라운드 내의 선택 단계 순서, 및 라운드 순서는, 대체 순서와는 다른 풀의 서브세트를 선택하도록 한다.
일부 실시예에서, 결합 분자 라이브러리는 파지 라이브러리, 또는 B 세포 라이브러리 또는 T 세포 라이브러리와 같은 세포 라이브러리이다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 2회 이상의 선택 라운드, 또는 3회 이상의 선택 라운드를 포함한다. 특정 실시예에서, 각각의 라운드는 상이한 선택 분자 세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 적어도 2회의 라운드는 동일한 음성 선택 분자, 또는 동일한 양성 선택 분자, 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 다음 선택 라운드로 진행하기 전에 선택 라운드로부터 수득된 풀의 서브세트를 분석하는 단계를 포함한다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행되는 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개공보의 사본은 요청 시, 필요 수수료를 지불하면 특허청에서 제공될 것이다. 본 출원은 첨부된 도면들과 관련하여 다음성 설명을 참조하여 이해될 수 있다.
도 1은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드를 선택하는 데 사용하기 위한, 3개의 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 예시적인 조합의 구성을 보여주는 개략도를 제공한다.
도 2는 참조-유래 공간적으로-연관된 위상 제약조건을 결정하는 일부 예시적인 방법에 관여하는 단계들 및 조작된 펩티드(메소스케일 분자, MEM)를 선택하는 데 이러한 제약조건을 사용하는 것의 개략도를 제공한다.
도 3a-3c는 본원에 기술된 방법을 사용한 조작된 펩티드 군의 선택을 보여주는 개략도를 제공한다. 도 3a는 참조 내의 관심있는 계면에 대한 공간적으로-연관된 위상 정보의 추출, 및 조작된 펩티드를 선택하는 데 사용하기 위한 위상 제약조건을 정의하는 데 있어서 이의 사용을 도시한다. 도 3b는 인 실리코 스크린 단계를 상세히 설명하는 개략도를 제공하며, 위상과 일치하는 후보물질이 보유되는 동안 불일치하는 후보가 어떻게 폐기되는지를 보여준다. 도 3c는 식별된 상위 12개의 선택된 조작된 펩티드 후보를 제시한다.
도 4a-4b는 본원에 기술된 방법을 사용하여, 상이한 세트의 참조 파라미터에 기초하여 상이한 조작된 펩티드의 군을 선택하는 것을 보여주는 제2 세트의 개략도를 제공한다. 도 4a는 공간적으로-연관된 위상 정보의 추출 및 위상 행렬의 구성을 보여준다. 도 4b는 위상 제약조건과 비교하는 인 실리코에 의해 선택된 상위 8개의 조작된 펩티드 후보물질의 목록을 제공한다.
도 5는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드를 사용하고, 또한 천연 단백질을 양성 (T) 또는 음성 (X) 선택 분자로서 사용하는 예시적인 프로그래밍 가능한 시험관 내 선택의 설계의 개요를 제공하는 개략도이다.
도 6a-6h는 5개의 조작된 펩티드의 선택, 및 파지 패닝을 위한 프로그래밍 가능한 시험관 내 선택 프로토콜에서의 이의 사용에 대한 개요를 제공한다. 도 6a는 VEGF를 참조 표적으로서 선택하고, 공간적으로-연관된 위상 정보를 도출하고 공간적으로-연관된 위상 제약의 조합을 구성하기 위해 사용한 VEGF의 부분을 식별하는 것을 보여준다 (단계 1). 그런 다음, 이 조합을 사용하여 양성 선택 분자 및 음성 선택 분자를 식별하기 위한 후보물질 조작 펩티드들의 인 실리코 스크리닝을 수행하였다 (2단계). 선택된 후보물질을 가교 결합 옵션을 안정화하기 위해 추가로 인 실리코 스크리닝하였다. 일단 실벽되고, 안정화된 조작된 펩티드를 수득한 다음에는, 이를 사용해 파지 패닝을 위한 프로그래밍 가능한 시험관 내 선택 프로토콜을 구성하였다. 도 6b는 조작된 펩티드를 선택하는 데 사용될 참조 표적(VEGF의 일부분)에 기초한 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 분석 및 식별을 보여준다. 도 6c, 도 6d, 도 6e는 각각 제1, 제2 및 제3 후보 조작된 펩티드의 구성, 및 도 6b에서 개발된 제약조건의 조합과 비교하기 위한 파라미터들의 도출을 보여준다. 도 6f는 참조 표적과 비교한 각 MEM에 대한 평균 백분율 오차(MPE), 및 MPE에 기초한 이들의 순위를 열거한다. 도 6g는 참조 표적에 기초하여 추가적인 제약조건 세트가 조합에 어떻게 추가되었는지를 보여준다. 도 6h에서, 이러한 추가적인 제약조건 세트가 후보 MEM 1을 평가하는 데 사용된다. 이 비교의 MPE는 36.6%였다.
도 7a는 VEGF의 리본 다이어그램이며, 조작된 펩티드를 선택하는 데 사용된 참조 부위가 표시되어 있다 (R82-H90). 도 7b는 도 7a의 표적 참조로부터 개발된 제약조건에 기초하여 선택된 5개의 후보 조작된 펩티드의 리본 다이어그램이다. 서열 및 평균 제곱근 RMSIP가 표 1에 열거되어 있다. 도 7d는 참조 표적에서 에피토프의 2개의 가장 우세한 움직임을 기술하는 2개의 고유벡터를 보여주며, 에피토프에서 10개의 C 원자의 x-, y-, 및 z-성분과 고유벡터의 고유값이 표로 제시되어 있으며; 구조는 에피토프에서 각각의 Ca 원자가 고유벡터 1(화살표) 및 고유벡터 2(화살표)를 따라 투사되는 것을 보여준다. 고유벡터는 정의상 정위형이다. 도 7e는 참조 표적의 에피토프(좌측) 및 MEM(우측)에서 가장 우세한 움직임(모드)을 기술하는 고유벡터이다. 에피토프 상에 겹쳐진 MEM의 구조가 MEM 변이 ID 및 RMSIP와 함께 도시되어 있다. 도 7f는 참조 표적의 에피토프(좌측) 및 MEM(우측)에서 두 번째로 가장 우세한 움직임(모드)을 기술하는 고유벡터를 제공한다. 에피토프 상에 겹쳐진 MEM의 구조가 MEM 변이 ID 및 RMSIP와 함께 도시되어 있다. 도 7g는 RMSIP를 연산하는 데 사용되는 내적 행렬 내에서의 이들의 위치와 관련하여 3개의 가장 우세한 움직임(모드, 고유벡터 1-3)을 따라 연관된 투시를 갖는 참조 표적 및 MEM의 구조를 제공한다. 사용된 RMSIP 방정식이 참조용으로 도시되어 있다.
도 8은 실험 데이터 또는 컴퓨터 시뮬레이션으로부터 생성된 참조 표적(상단) 및 MEM(하단)의 구조 앙상블 및 좌표 공분산 행렬을 보여준다. 에피토프는 참조 표적의 우측 상부에 있는 더 어두운 부위다.
도 9는 양성 또는 음성 선택을 위해 4개의 조작된 펩티드(메소 스케일 조작된 분자, 또는 MEM으로도 불림)를 사용하는 시험관 내 프로그래밍 가능한 선택 설계의 개요이다. MEM의 원자 움직임 및 위상 스코어가 참조를 위해 포함된다. 서열은 서열번호 1-4로서 제공된다.
도 10a-10d는 베바시주맙에 대한 도 9의 상이한 조작된 펩티드를 사용하는 결합 바이오센서 검정의 그래프이다.
도 11은 8개의 상이한 패닝 프로그램(7개가 하나 이상의 선택 분자로서 조작된 펩티드를 포함함), 및 선택을 위해 종래의 미처리(native) 단백질을 사용하는 8개의 프로그램에 대한 설명이다. 미처리 Hu scFV 라이브러리를 각각의 프로그램으로 별도로 패닝하였다.
도 12a 및 12b는 도 11에 기술된 상이한 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 결합 파트너에 대한 VEGF 결합 반응을 비교하는 VEGF ELISA 반응 그래프이다. 도 12a에 도시된 바와 같이, MEM 프로그래밍된 시험관 내 선택은 특이적인 MEM 프로그램 입력으로, 전장 표적 결합 성향을 유의하게 감소시키지는 않지만, 모든 입력이 그런 것은 아니다. 수평 막대는 평균을 나타내고; P12와 P7 간의 유의한 차이: p-값 < 0.0001. 도 12b에 도시된 바와 같이, MEM 프로그래밍된 시험관 내 선택은 추정-에피토프 선택성 클론을 향해 통계적으로 유의한 방식으로 유도한다. 수평 막대는 평균을 나타내고, P12 대 P6: p-값은 0.024이고; P12 대 P9: p-값은 0.0004이고; P12 대 P10: p-값은 0.049이다.
도 13a-13h는 sMEM 조작된 펩티드 대 VEGF(참조)을 이용하여 도 11에 기술된 상이한 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 결합 파트너들의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 14a-14i는 베바시주맙과의 용량-반응성 경쟁(0 nM, 67 pM, 670 pM, 6.7 nM)을 이용한 VEGF의 교차 차단 검정에서 도 11에 기술된 상이한 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 결합 파트너들의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 15는 도 11에 개략된 상이한 선택 프로그램 각각으로부터 얻어진 확인된 교차 차단 특징을 갖는 구별되는 클론들의 그래프이다.
도 16은 도 11에 개략된 선택 프로그램으로부터 생산된 모든 Fab에 대한 결합, 교차 차단, CDR 서열 및 생식선 사용의 요약이다.
도 17 및 도 18은 도 17에 나열된 모든 Fab에 대한 ELISA 결합 결과이다.
도 19는 도 11에 개략된 선택 프로그램(0 nM, 67 pM, 670 pM, 6.7 nM)으로부터 선택된 것들 대비 무작위 클론들에 대한 베바시주맙 차단 성향 스코어를 보여준다. ELISA Z-스코어(sMEM + VEGF - iMEM) + 베바시주맙 차단 Z-스코어.
도 20은 도 11에 기술된 패닝 프로그램에 걸쳐 클론들의 무작위 균일 선택에 대한 교차 차단 강화를 요약한다.
도 21은 선택된 클론들의 차세대 시퀀싱 샘플이 어떻게 제조되었는지를 보여주는 개략도이다. 발현 벡터의 불변 부분에서의 개별 중쇄 및 경쇄 서열을 2 x 250 쌍의 말단 시퀀싱 실행을 사용하여, 클로닝해냈다. 그런 다음, 말단을 접합시키고 리드에 주석을 달았다 (예를 들어, PyIg를 사용함). 각각의 선택 프로그램을 사용하여 선택된 클론들로부터 수득된 리드는 막대 그래프로 도시되어 있다.
도 22는 상이한 패닝 라운드의 클론형성능 분석(구별되는 항체의 수), 및 정규화된 Shannon 분석을 보여준다.
도 23은 도 11에 도시된 상이한 스크리닝 프로그램의 클론형성능을 보여준다.
도 24a-24l은 1 라운드(도 24a-24d), 2 라운드(도 24e-24h), 및 3 라운드(도 24i-24l) 동안, 상이한 스크리닝 라운드 및 프로그램이 생성된 선택된 풀의 다양성을 어떻게 형상화하는지를 분석하는 생식선 사용 히트맵 및 치수 감소 플롯이다.
도 25a-25b는 각각의 선택 프로그램으로부터 단리된 클론 (x축에서의 S#) 및 VEGF 및 조작된 펩티드 sMEM에 대한 이들의 결합을 요약한 것이다.
도 26은 VEGF 및 교차-차단 베바시주맙에 결합하는 것으로 확인되었고, 조작된 펩티드를 사용하지 않는 종래의 패닝에서 확인되지 않은, 각 프로그램의 각 라운드로부터 수득된 고유 mAb 적중의 강화 속도에 대한 요약이다 (프로그램 12).
도 27은 VEGF에 결합하는 것으로 확인되었지만 추정 에피토프 선택성 mAb 적중이 아닌 종래의 패닝 프로그램(12)을 수득한 mAb 적중의 강화 속도의 요약이다.
도 28은 상이한 패닝 프로그램으로부터 수득된 상이한 클론들의 sMEM 또는 VEGF에 대한 결합을 요약한 것이다.
도 29는 PD-L1 상에서 제안된 치료 에피토프 참조 부위를 표적화하는, 프로그래밍된 시험관 내 선택 프로토콜의 제2 예시적인 세트의 개략도이다. 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 이러한 추정 부위로부터 유래되고, 합쳐지고, 제약조건들의 조합과 중첩되는 특징을 갖는 조작된 펩티드를 인 실리코 스크리닝하는 데 사용되었다. 그런 다음, 미처리 Hu scFv 라이브러리의 파지 패닝에서 이들을 선택 라운드에 사용하였다.
도 30은 도 29의 개략도에 따라 선택된 3개의 조작된 펩티드의 모델링된 구조 및 펩티드 서열을 제공한다. 서열은 서열번호 5-7로서 제공된다.
도 31a-31d는 참조(도 31a), 및 조작된 펩티드 sMEM(도 31b), nMEM(도 31c), 및 iMEM(도 31d)로부터 유래된 원자 거리 및 아미노산 기술어 행렬이다. 참조 위상과 비교했을 때, sMEM, nMEM 및 iMEM 위상의 평균 백분율 오차는 각각 3.58%, 0.84% 및 19.3%였다.
도 31e-31g는 아벨루맙과 도 30에 기술된 조작된 펩티드 간의 결합을 보여주는 바이오센서 결합 그래프이다. 아벨루맙과 nMEM 결합의 KD는 43.4 uM이었다.
도 32a-32c는 더발루맙과 도 30에 기술된 조작된 펩티드 간의 결합을 보여주는 바이오센서 결합 그래프이다.
도 33은 도 30에 기술된 조작된 펩티드 중 하나 이상을 사용하는 프로그래밍된 시험관 내 선택 패닝 프로그램, 및 천연 단백질(C1)을 사용하는 종래의 패닝 방법의 차이에 대한 요약이다. 도 30의 조작된 펩티드 sMEM, nMEM, 및 iMEM은 도 33에서의 sMEM #1, sMEM #5, 및 iMEM이다.
도 34는 도 33에 기술된 각각의 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 클론에 대한 PD-L1 ELISA 결합 반응의 그래프 및 요약이다.
도 35는 도 33에 기술된 각각의 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 클론에 대한 sMEM #1에 대한 ELISA 결합 반응의 그래프 및 요약이다.
도 36은 도 33에 기술된 각각의 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 클론에 대한 nMEM #5에 대한 ELISA 결합 반응의 그래프 및 요약이다.
도 37은 도 33에 기술된 각각의 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 클론에 대한 PD-L1 및 sMEM #1에 대한 ELISA 에피토프 선택성 반응의 그래프 및 요약이다.
도 38은 도 33에 기술된 각각의 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 클론에 대한 PD-L1 및 nMEM #5에 대한 ELISA 에피토프 선택성 반응의 그래프 및 요약이다.
도 39a-39u는 도 34 내지 38의 상이한 ELISA 결합 반응을 비교하는 도면으로서, 상이한 프로그램을 사용하여 선택된 결합 파트너들의 선택성을 보여주고 있다.
도 40은 도 33에 기술된 선택 프로그램으로부터 수득된 클론을 분석하는데 사용되는 항-PD-L1 패닝 ELISA 적중 식별 기준을 요약하는 표다.
도 41a-41c는 도 33에 기술된 상이한 패닝 프로그램을 사용하여 선택된 결합 파트너들에 대한 PD-L1 (각각 도 41a 및 42b)과 비교한 sMEM #1 및 nMEM#5, 및 nMEM #5(도 41c)과 비교한 sMEM #1에 대한 상이한 ELISA 결합 반응을 비교하는 도면이다.
도 42a-42f는 도 33에 기술된 프로그램 모두에 대한 상이한 ELISA 반응 및 확인된 Tx mAb X-차단제를 비교하는 도면이다.
도 43은 교차 차단 적중 및 이들의 서열로부터 식별된 바와 같이, 도 33에 기술된 프로그램으로부터 23개의 구별되는 클론을 요약하였다.
도 44는 도 33에 기술된 프로그램들 각각으로부터 수득된 확인된 구별되는 교차 차단 클론들의 차트다.
도 45a는 도 33에 기술된 프로그램들 각각으로부터 수득된 무작위 선택된 클론들의 차단 성향에 대한 그래프다. 차단은 아벨루맙 또는 더발루맙에 대한 PD-L1의 결합 클론에 의한 차단으로서 평가하였다. 차단 성향을 ELISA Z-스코어(sMEM1 + sMEM5 + PD-L1 - iMEM) + MAX(아벨루맙 차단 Z-스코어, 더발루맙 차단 Z-스코어)로서 평가하였다.
도 45b 및 도 45c는 도 45a에서 평가한 상이한 프로그램으로부터 수득된 클론들의 차단 성향을 요약한 것이다. 도 45c에서 어두운 입력들은 미처리 단백질을 사용한 종래의 선택 접근법을 사용하여 수득하였다.
도 46은 대조군(기존 접근법)과 비교하여, 도 33에 기술된 프로그램을 사용하여 수득된 클론 풀에서 관찰된 교차 차단 강화의 요약이다.
도 47은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드의 선택에 사용될 수 있는 위상 행렬의 예이다.
도 48은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드의 선택에 사용될 수 있는 위상 제약조건 화학 기술어 벡터의 일 예이다.
도 49는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드의 선택에 사용될 수 있는 예시적인 Lx2 phi/psi 행렬이다.
도 50은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드의 선택에 사용될 수 있는 이차 구조 상호작용 기술어에 대한 예시적인 SxSxM 행렬이다.
도 51은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드의 선택에 사용될 수 있는 예시적인 조작된 펩티드에 대한 클러스터 및 TCC 벡터를 보여주는 예시적인 다이어그램이다.
도 52는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드의 선택에 사용될 수 있는 예시적인 LxM 위상 제약조건 행렬이다.
도 53은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드의 선택에 사용될 수 있는 예시적인 이차 구조 지수 및 조회 표다.
도 54는 VEGF 패닝 프로그램으로부터 얻어진 데이터의 또 다른 표현이다. S1은 항-VEGF 패닝 프로그램 6을 지칭하고, S2는 항-VEGF 패닝 프로그램 13을 지칭하며, C는 종래의 전장 VEGF 프로그램이다.
도 55는 도 24i에 제공된 데이터의 또 다른 표현이다. S1은 항-VEGF 패닝 프로그램 6을 지칭하고, S2는 항-VEGF 패닝 프로그램 13을 지칭하며, C는 종래의 전장 VEGF 프로그램이다.
도 56은 도 26에 제공된 데이터의 또 다른 표현이다. S1은 항-VEGF 패닝 프로그램 6을 지칭하고, S2는 항-VEGF 패닝 프로그램 13을 지칭하며, C는 종래의 전장 VEGF 프로그램이다.
도 57a-57e는 프로그래밍된 시험관 내 선택으로부터 선택된 온-에피토프 클론에 대한 VEGF(회색 실선) 및 교차 차단(점선) 결합 데이터의 그래프이다.
도 58a-58c는 전장 시험관 내 선택으로부터 오프-에피토프로 선택된 클론에 대한 VEGF 결합 데이터의 그래프이다.
도 59a-59b는 항체 클론이 항-VEGF 프로그래밍된 시험관 내 선택(적색) 및 종래의 시험관 내 선택(회색)에 대한 CDR 루프 서열 다양성을 적중하는 것을 요약한 것이다.
도 60은 본원에 기술된 바와 같은 예시적인 조작된 펩티드를 사용하여, 본원에 기술된 프로그래밍 가능한 시험관 내 선택 방법을 사용하여 선택된 클론의 서열 정렬이다. 상단 줄은 모든 프로그래밍된 시험관 내 선택 프로그램에 걸쳐 선택된 상위 5개의 온-에피토프 클론의 중쇄 서열의 정렬이고; 두번째 줄은 VEGF 및 BSA를 선택 분자로서 사용하여, 종래의 접근법을 사용하여 선택된 상위 5개의 오프-에피토프 클론의 중쇄 서열의 정렬이고; 세번째 줄은 모든 프로그래밍된 시험관 내 선택 프로그램에 걸쳐 선택된 상위 5개의 온-에피토프 클론의 경쇄 서열의 정렬이고; 하단 줄은 VEGF 및 BSA를 사용하는 종래의 접근법을 사용하여 선택된 클론의 경쇄 서열의 정렬이다.
도 61은 조작된 폴리펩티드 설계의 예시적인 방법의 개략도이다.
도 62는 조작된 폴리펩티드 설계를 위한 머신 러닝 모델을 사용하는 예시적인 방법의 개략도이다.
메소 스케일의 조작된 펩티드를 선택하는 방법, 및 상기 조작된 펩티드를 포함하는 조성물 및 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 항체의 시험관 내 선택에서 조작된 펩티드를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
본 개시의 조작된 펩티드는 1 kDa 내지 10 kDa이며, 본원에서 "메소 스케일(meso-scale)"로 지칭된다. 이러한 크기의 조작된 펩티드는, 일부 실시예에서, 단백질 유사 기능성, 후보물질을 선택하기 위한 큰 이론적 공간, 세포 투과성, 및/또는 구조적 및 역학적 가변성과 같은, 소정의 이점을 가질 수 있다.
본원에 제공된 방법은, 이들 중 일부는 참조 표적으로부터 유래될 수 있는, 복수의 공간적으로-연관된 위상 제약조건을 식별하는 단계, 상기 제약조건의 조합을 구성하고, 후보 펩티드를 상기 조합과 비교하고, 상기 조합과 중첩되는 제약조건을 갖는 후보를 선택하는 단계를 포함한다. 공간적으로-연관된 위상 제약조건을 사용함으로써, 조작된 펩티드의 상이한 측면들이 의도된 용도, 또는 원하는 기능, 또는 다른 원하는 특징에 따라 조합에 포함될 수 있다. 또한, 모든 제약조건이, 일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래되어야 하는 것은 아니다. 이러한 방법을 통해, 일부 실시예에서, 선택된 조작된 펩티드는 단순히 참조 표적의 변형(예컨대, 펩티드 돌연변이 유발 또는 단일 참조의 점진적 변형을 통해 수득될 수 있음)이 아니라, 오히려 참조 펩티드와는 상이한 전체 구조를 가지면서도 원하는 기능적 특징 및/또는 주요 하위 구조를 여전히 보유할 수 있다.
하나 이상의 조작된 펩티드를 사용하는 프로그래밍 가능한 시험관 내 선택 방법을 포함하는, 상기 조작된 펩티드를 사용하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 이러한 선택은, 예를 들어, 항체의 동정에 사용될 수 있다.
이들 방법 및 조작된 펩티드는 이하에서 더욱 상세히 기술된다.
I. 조작된 펩티드를 선택하는 방법
일부 측면에서, 조작된 펩티드를 선택하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은:
참조 표적의 하나 이상의 위상 특징을 식별하는 단계;
각각의 위상 특징에 대해 공간적으로-연관된 제약조건을 설계하여 참조 표적-유래 제약조건의 조합을 생산하는 단계;
후보 펩티드의 공간적으로-연관된 위상 특징을 참조 표적으로부터 유래된 조합과 비교하는 단계; 및
참조 표적으로부터 유래된 제약조건의 조합과 중첩되는 공간적으로-연관된 위상 특징을 갖는 후보 펩티드를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래되지 않은 하나 이상의 추가적인 공간적으로-연관된 위상 제약조건이 조합에 포함된다.
a. 공간적으로-연관된 위상 제약조건(Spatially-associated Topological Constraints)
본원에 기술된 조작된 펩티드는 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합과 얼마나 가깝게 일치하는지에 기초하여 선택된다. 이러한 조합은 또한 "텐서(tensor)"의 수학적 개념을 사용하여 설명될 수 있다. 이러한 조합(또는 텐서)에서, 각각의 제약조건은 (예를 들어, 공간적으로-연관된) 3차원 공간에서 독립적으로 설명되고, 3차원 공간에서의 이러한 제약조건의 조합은, 예를 들어, 위치에 대해 상이한 원하는 특징 및 그들의 원하는 수준(해당되는 경우)의 표현적 "맵"을 제공한다. 이러한 맵은, 일부 실시예에서, 선형 또는 달리 미리 결정된 아미노산 골격에 기초하지 않으며, 따라서 기술된 바와 같이, 원하는 조합을 충족시킬 수 있는 구조에서 유연성을 허용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, "맵"은 2개의 인접한 아미노산에 의해 규정된 제약조건 제한 사항이 적절히 충족될 수 있는 공간적 영역을 포함하는데 - 일부 실시예에서, 이들 아미노산은 직접적으로 결합될 수 있는 반면(예를 들어, 2개의 연속 아미노산), 다른 실시예에서는, 아미노산은 서로 직접적으로 결합되지 않지만 펩티드의 접힘에 의해 공간 내에서 함께 합쳐질 수 있다(예를 들어, 연속 아미노산이 아님). 별도의 제약조건 자체는 또한 반드시 구조를 기반으로 하는 것은 아니지만, 예를 들어, 화학적 기술어 및/또는 기능적 기술어를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 제약조건은 원하는 이차 구조 또는 아미노산 잔기와 같은, 구조적 기술어를 포함한다. 특정 실시예에서, 각각의 제약조건은 독립적으로 선택된다.
예를 들어, 도 1은 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 대표적인 조합의 구성을 설명하는 개략도이다. 도 1의 3개의 제약조건은 서열, 가장 가까운 이웃 거리, 및 원자 움직임이며, 가장 가까운 이웃 거리 및 원자 움직임은 하나의 그래픽으로 합쳐진다. 도시된 바와 같이, 일부 제약조건은 골격의 위치(예를 들어, 특정 측쇄의 원자 움직임)와는 독립적으로 맵핑되어, 참조 스캐폴드 상의 단지 하나 이상의 위치를 변화시키는 것에 비해, 훨씬 더 다양한 구조적 구성을 시험할 수 있게 한다. 3개의 상이한 제약조건과 이들의 공간적 설명은 행렬(예: 텐서)로 조합되고, 그런 다음 일련의 후보 펩티드를 이 조합과 비교하여 원하는 기준을 충족시키는 새로운 조작된 펩티드를 식별할 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 추가적인 비-참조 유래 제약조건이 조합에 포함된다. 예를 들어, 원하는 조합에 대한 각각의 후보 펩티드의 제약조건을 평가하기 위해 인 실리코 방법을 사용하여, 후보 펩티드를 정의된 조합과 비교하고, 후보가 얼마나 잘 일치하는지 평가할 수 있다. 그런 다음, 규정된 조합과 원하는 수준의 중첩을 갖는 상기 후보를 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 표준 펩티드 합성 방법을 사용하여 합성하고, 평가할 수 있다.
일부 실시예에서, 제약조건의 조합은 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 3개 내지 12개, 적어도 3개 내지 10개, 적어도 3개 내지 8개, 적어도 3개 내지 6개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 6개의 독립적으로 선택된 공간적으로-연관된 위상 제약조건을 포함한다. 하나 이상의 제약조건이 참조 표적으로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 각각의 제약조건은 참조 표적으로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 적어도 하나의 제약조건은 참조 표적으로부터 유래되고, 나머지 제약조건은 참조 표적으로부터 유래되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 1 내지 9개의 제약조건, 1 내지 7개의 제약조건, 1 내지 5개의 제약조건, 또는 1 내지 3개의 제약조건, 및 1 내지 9개의 제약조건, 1 내지 7개의 제약조건, 1 내지 5개의 제약조건, 또는 1 내지 3개의 제약조건은 참조 표적으로부터 유래되지 않는다.
일단 제약조건의 조합이 구성되면, 일련의 후보 펩티드를 상기 조합과 비교하여 원하는 기준을 충족시키는 하나 이상의 새로운 조작된 펩티드를 식별한다. 일부 실시예에서, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 125개, 적어도 150개, 적어도 175개, 적어도 200개, 또는 적어도 250개 이상의 후보 펩티드를 상기 조합과 비교하여 원하는 기준을 충족시키는 하나 이상의 새로운 조작된 펩티드를 식별한다. 일부 실시예에서, 예를 들어, 250개 초과의 후보 펩티드, 300개 초과의 후보 펩티드, 400개 초과의 후보 펩티드, 500개 초과의 후보 펩티드, 600개 초과의 후보 펩티드, 또는 750개 초과의 후보 펩티드가 비교된다. 일부 실시예에서, 위상 특징 시뮬레이션을 사용해서, 제약조건의 조합과 비교하여 후보 펩티드의 위상 특징 중첩(존재하는 경우)을 평가한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 후보 펩티드도 참조 표적과 비교되고, 참조 표적 위상 특징을 갖는 후보 펩티드 위상 특징의 중첩(존재하는 경우)이 평가된다. 일부 실시예에서, 상기 조작된 펩티드는 5 초과, 10 초과, 20 초과, 30 초과, 40 초과, 50 초과, 60 초과, 70 초과, 80 초과, 90 초과, 또는 100 초과의 구별되는 펩티드의 연산 샘플 및 위상 특징 시뮬레이션으로부터 식별되고 조작된 펩티드가 선택되고, 여기서 상기 선택된 조작된 펩티드는, 전체 샘플 모집단 중에서, 참조 표적과 비교하여 가장 높은 위상 특징 중첩을 가진다.
원하는 조합(예를 들어, 원하는 텐서)을 구성하기 위해 사용되는 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 각각 넓은 가능한 특징 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 구조적, 역학적, 화학적, 또는 기능적 특징, 또는 이들의 임의의 조합을 기술하는 제약조건을 포함할 수 있다.
구조적 제약조건은, 예를 들어, 원자 거리, 아미노산 서열 유사도, 용매 노출, phi 각도, psi 각도, 이차 구조, 또는 아미노산 접촉, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
역학적 제약조건은, 예를 들어, 원자 요동, 원자 에너지, 반 데르 발스 반지름, 아미노산 인접도, 또는 비공유 결합 성향을 포함할 수 있다. 원자 에너지는, 예를 들어, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 반발 에너지, 원자 레벨의 용매화 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 하전된 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 수소 결합 인력 에너지, 또는 비공유 결합 에너지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
화학적 특징은, 예를 들어, 화학적 기술어를 포함할 수 있다. 이러한 화학적 기술어는, 예를 들어, 소수성, 극성, 원자 부피, 원자 반지름, 순 전하, logP, HPLC 머무름, 반 데르 발스 반지름, 전하 패턴, 또는 H-결합 패턴, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
기능적 특징은, 예를 들어, 생물정보학 기술어, 생물학 반응, 또는 생물학적 기능을 포함할 수 있다. 생물정보학 기술어는, 예를 들어, BLOSUM 유사도, pKa, zScale, Cruciani Properties, Kidera Factors, VHSE-스케일, ProtFP, MS-WHIM 스코어, T-스케일, ST-스케일, 막관통 경향, 단백질 매립 면적, 나선 성향, 시트 성향, 코일 성향, 회전 성향, 면역원성 성향, 및 항체 에피토프 발생, 및/또는 단백질 계면 발생, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 제약조건을 설계하는 것은 잔기별 에너지, 잔기별 상호작용, 잔기별 요동, 잔기별 원자 거리, 잔기별 화학 기술어, 잔기별 용매 노출, 잔기별 아미노산 서열 유사도, 잔기별 생물정보 기술어, 잔기별 비공유 결합 성향, 잔기별 phi/psi 각도, 잔기별 반 데르 발스 반지름, 잔기별 이차 구조 성향, 잔기별 아미노산 인접도, 또는 잔기별 아미노산 접촉에 관한 정보를 포함한다. 일부 실시예에서, 이들 특징은 참조 표적에서의 총 잔기의 서브 세트, 또는 제약조건의 총 조합의 총 잔기의 서브 세트, 또는 이들의 조합에 사용된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 상이한 특징은 하나 이상의 상이한 잔기에 사용된다. 즉, 일부 실시예에서, 하나 이상의 특징은 잔기의 서브세트에 사용되고, 적어도 하나의 상이한 특징은 잔기의 상이한 서브세트에 사용된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 제약조건을 설계하는 데 사용되는 상기 특징 중 하나 이상은 컴퓨터 시뮬레이션에 의해 결정된다. 적절한 컴퓨터 시뮬레이션 방법은, 예를 들어, 분자 역학 시뮬레이션, 몬테 카를로(Monte Carlo) 시뮬레이션, 거친 입자(coarse-grained) 시뮬레이션, 가우시안 네트워크 모델(Gaussian network model), 머신 러닝(machine learning), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 다수의 제약조건이 하나의 카테고리로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 조합은 독립적으로 생물학적 반응의 유형인 둘 이상의 제약조건을 포함한다. 일부 실시예에서, 둘 이상의 제약조건은 독립적으로 이차 구조의 유형이다. 특정 실시예에서, 둘 이상의 제약조건은 독립적으로 화학적 기술어의 유형이다. 다른 실시예에서, 조합은 제약조건의 중첩하는 카테고리를 포함하지 않는다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 독립적으로 연관된다. 일부 실시예에서, 상기 제약조건은 공간적으로-한정된 원자(들) 수준 제약조건, 또는 공간적으로-한정된 형상/면적/부피 수준 제약조건(예컨대, 여러 개의 상이한 원자 조성물에 의해 충족될 수 있는 특징적인 형상/면적/부피), 또는 공간적으로-한정된 역학적 수준 제약조건(예컨대, 여러 개의 상이한 원자 조성물에 의해 충족될 수 있는 특징적인 역학 또는 역학 세트)이다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 단백질 구조 또는 펩티드 구조로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 세포외 도메인, 예컨대 G 단백질-결합 수용체(GPCR) 세포외 도메인, 또는 이온 채널 세포외 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 단백질-단백질 계면 접합부로부터 유래된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 단백질-펩티드 계면 접합부, 예컨대 MHC-펩티드 또는 GPCR-펩티드 계면으로부터 유래된다. 소정의 실시예에서, 이러한 단백질 또는 펩티드 구조에 제약되는 원자 또는 아미노산은 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 원자 또는 아미노산이다. 일부 실시예에서, 이러한 단백질 또는 펩티드 구조에 제약되는 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산은 참조 표적으로부터 유래된 원자 또는 아미노산이다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 제약조건은 참조 표적의 다형성 영역(예를 들어, 개체들 간의 대립유전자 변이가 생기는 영역)으로부터 유래된다.
일부 실시예에서, 상기 생물학적 반응 또는 생물학적 기능은 유전자 발현, 대사 활성, 단백질 발현, 세포 증식, 세포 사멸, 사이토카인 분비, 키나아제 활성, 후성유전자 변형, 세포 사멸 활성, 염증 신호, 화학주성, 조직 침윤, 면역 세포 계통 결정(lineage commitment), 조직 미세환경 변형, 면역 시냅스 형성, IL-2 분비, IL-10 분비, 성장 인자 분비, 인터페론 감마 분비, 형질전환 성장 인자 베타 분비, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 활성, 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 활성, 항체 유도 세포 세포독성, 보체 유도 세포독성, 생물학적 경로 작용, 생물학적 경로 길항작용, 생물학적 경로 재유도, 키나아제 캐스케이드 변형, 단백질분해 경로 변형, 단백질항상성 경로 변형, 단백질 접힘/ 경로, 번역 후 변형 경로, 대사 경로, 유전자 전사/번역, mRNA 분해 경로, 유전자 메틸화/아세틸화 경로, 히스톤 변형 경로, 후성유전학적 경로, 면역 지향성 제거, 옵소닌화, 호르몬 신호전달, 인테그린 경로, 막 단백질 신호 전달, 이온 채널 플럭스, 및 g-단백질 결합 수용체 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 하나 이상의 원자는 탄소, 산소, 질소, 수소, 황, 인, 나트륨, 칼륨, 아연, 망간, 마그네슘, 구리, 철, 몰리브덴 및 니켈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 원자는 산소, 질소, 황 및 수소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 제약조건 중 하나는 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 하나 이상의 아미노산이고/이거나, 조작된 펩티드는 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 하나 이상의 아미노산은 20개의 단백질원성 자연 발생 아미노산, 비-단백질원성 자연 발생 아미노산, 및 비-천연 아미노산으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 비-천연 아미노산은 화학적으로 합성된다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 아미노산은 20개의 단백질원성 자연 발생 아미노산으로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 아미노산은 비-단백질원성 자연 발생 아미노산으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 아미노산은 비-천연 아미노산으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 아미노산은 20개의 단백질원성 자연 발생 아미노산, 비-단백질원성 자연 발생 아미노산, 및 비-천연 아미노산의 조합으로부터 선택된다.
본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드를 선택하는 데 사용되는 제약조건의 조합은 참조 표적으로부터 유래된 적어도 하나의 제약조건을 포함하지만, 일부 실시예에서, 조합의 하나 이상의 제약조건은 참조 표적으로부터 유래되지 않는다. 따라서, 특정 실시예에서, 선택된 조작된 펩티드는 참조 표적과 공유되지 않는 하나 이상의 특징을 포함한다.
일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래되고 조합에 사용된 하나 이상의 제약조건은 참조 표적에서 관찰된 바와 같은 특징의 반대를 기술한다. 따라서, 예를 들어, 참조 표적은 양 전하의 특정 패턴을 가질 수 있고, 전하와 관련된 제약조건은 상기 참조 표적으로부터 유래되고, 유래된 제약조건은 유사한 패턴이지만 중성 전하 또는 음 전하를 기술한다. 따라서, 일부 실시예에서, 하나 이상의 역 제약조건은 참조 표적으로부터 유래되고 조합에 포함된다. 이러한 역 제약조건은, 예를 들어, 특정 검정 또는 패닝 방법을 위한 대조군 분자로서, 또는 본원에 기술된 프로그래밍 가능한 시험관 내 선택 방법에서 음성 선택 분자로서 조작된 펩티드를 선택하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시예에서, 공간적으로-한정된 위상 제약조건의 조합은 하나 이상의 비-참조 유래 위상 제약조건을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 비-참조 유래 위상 제약조건은 하나 이상의 이차 구조적 요소를 강화하거나 안정화하고, 원자 요동을 강화하고, 펩티드 총 소수성을 변경시키고, 펩티드 용해도를 변경시키고, 펩티드 총 전하를 변경시키고, 표지된 또는 표지가 없는 검정에서 검출을 가능하게 하고, 시험관 내 분석에서 검출을 가능하게 하고, 생체 내 검정에서 검출을 가능하게 하고, 복합 혼합물로부터의 포획을 가능하게 하고, 효소 처리를 가능하게 하고, 세포막 투과성을 가능하게 하고, 이차 표적에 대한 결합을 가능하게 하고, 또는 면역원성을 변경시킨다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 비-참조 유래의 위상 제약조건은 참조 표적으로부터 유래된 제약조건의 조합으로(또는 후속하여 선택된 펩티드) 하나 이상의 원자 또는 아미노산을 제한한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 제약조건의 조합은 참조 표적으로부터 유래된 이차 구조를 포함하고, 제약조건의 조합은 또한 (예를 들어, 추가적인 수소 결합, 또는 소수성 상호작용, 또는 측쇄 적층, 또는 염 브릿지, 또는 이황화 결합을 통해) 이차 구조적 요소를 안정화시키는 제약조건을 포함하며, 여기서 안정화 제약조건은 참조 표적에 존재하지 않는다. 다른 실시예에서, 일부 실시예에서, 제약조건의 조합은 (또는 후속하여 선택된 펩티드) 참조 표적으로부터 유래된 하나 이상의 원자 또는 아미노산을 포함하고, 제약조건의 조합은 또한 표적 참조로부터 유래된 원자 또는 아미노산의 적어도 일부분에서 원자 요동을 강화하는 제약조건을 포함하며, 여기서 제약조건은 표적 참조에 존재하지 않는다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 비-참조 유래 제약조건은 역 제약조건이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 2개의 제약조건의 조합이 역 특징을 갖는 조작된 펩티드를 선택하도록 구성된다. 일부 이러한 실시예에서, 제1 제약조건 조합은 참조 표적으로부터 유래된 하나 이상의 제약조건, 및 참조 표적으로부터 유래되지 않은 하나 이상의 제약조건을 포함할 것이고; 및 제2 제약조건 조합은 참조 표적으로부터 유래된 동일한 하나 이상의 제약조건, 및 제1 조합의 하나 이상의 비-참조 표적 제약조건의 반대를 포함할 것이다.
d. 참조 표적(Reference Target)
임의의 적절한 참조 표적은 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건을 유도하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 참조 표적은 전장 천연 단백질이다. 다른 실시예에서, 참조 표적은 전장 천연 단백질의 부분이다. 또 다른 실시예에서, 참조 표적은 비-천연 단백질 또는 이의 부분이다.
예를 들어, 일부 실시예에서, 참조 표적은 세포 표면 수용체, 또는 막관통 단백질, 또는 신호전달 단백질, 또는 다중 단백질 복합체, 또는 단백질-펩티드 복합체, 또는 이의 일부분이다. 일부 실시예에서, 참조 표적은 관심 단백질의 일부분이며, 관심 단백질은 인간과 같은 유기체에서의 질병 과정에 관여한다. 일부 실시예에서, 관심 단백질은 암의 성장 또는 전이에 관여하거나, 염증성 장애에 관여하고, 참조 표적은 추정 에피토프인 상기 관심 단백질의 일부분이다. 따라서, 일부 실시예에서, 본원에 제공된 방법은 면역원으로서 작용할 수 있는 하나 이상의 조작된 펩티드를 선택하는 데 사용될 수 있고, 관심 단백질의 항체를 상승시키는 데 사용될 수 있다. 관심 단백질의 예는, 예를 들어, PD-1, PD-L1, CD25, IL2, MIF, CXCR4, 또는 VEGF를 포함한다. 따라서, 일부 실시예에서, 참조 표적은 PD-1, PD-L1, CD25, IL2, MIF, CXCR4, 또는 VEGF, 또는 이의 일부분, 예컨대 에피토프이다. 일부 실시예에서, 본원에 제공된 방법은 면역원인 하나 이상의 조작된 펩티드를 선택하는 데 사용될 수 있으며, 이는 표적 참조가 유래되는 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 상승시키는 데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 조작된 펩티드를 선택하는 데 사용될 수 있으며, 이는 차례로 항체 또는 Fab-디스플레이 파지와 같은, 관심 단백질의 하나 이상의 결합 파트너를 선택하는 데 사용될 수 있다.
c. 제약조건 비교
일부 실시예에서, 하나 이상의 제약조건(예: 참조-유래 또는 비-참조 유래)은 분자 시뮬레이션(예: 분자 역학), 또는 실험실 측정(예: NMR), 또는 이들의 조합에 의해 결정된다. 일단 제약조건이 유도되고 조합되면, 일부 실시예에서, 조작된 펩티드 후보물질은 연산 단백질 설계(예를 들어, Rosetta)를 사용하여 생성된다. 일부 실시예에서, 펩티드 공간을 샘플링하는 다른 방법이 사용된다. 그런 다음, 역학적 시뮬레이션을 후보 조작된 펩티드에 대해 수행하여 선택된 제약조건의 파라미터를 수득할 수 있다. 참조 표적에 대해 원자 요동의 공분산 행렬이 생성되고, 각각의 후보 조작된 펩티드의 잔기에 대해 공분산 행렬이 생성되며, 이들 공분산 행렬을 비교하여 중첩을 결정한다. 주요 성분 분석을 수행하여 각 공분산 행렬에 대한 고유벡터 및 고유값 - 참조 표적에 대한 하나의 공분산 행렬 및 각각의 후보 조작된 펩티드에 대한 하나의 공분산 - 및 가장 큰 고유값을 갖는 고유벡터를 연산한다.
고유벡터는 시뮬레이션된 분자 구조의 세트에서 관찰된 가장, 두 번째로 가장, N번째로 가장 우세한 움직임을 기술한다. 임의의 이론에 구속되고자 함이 없이, 후보 조작된 펩티드가 참조 표적과 유사하게 이동하는 경우, 이의 고유벡터는 참조 표적의 고유벡터와 유사할 것이다. 고유벡터의 유사도는, 정렬되고, 동일한 방향을 가리키는 그들의 성분(각 CA 원자에 중심을 둔 3D 벡터)에 대응한다. 참조 표적과 조작된 펩티드 후보물질 간의 예시적인 고유벡터 비교가 도 7d-7g에 나타나 있다.
일부 실시예에서, 후보 조작된 펩티드와 참조 표적 고유벡터 간의 이러한 유사도는 2개의 고유벡터의 내부 생성물을 사용해 연산된다. 2개의 고유벡터가 서로 90도인 경우 내적 값은 0이고, 2개의 고유벡터가 동일한 방향을 정확하게 가리키는 경우 1이다. 이론에 구속되고자 하지 않고, 고유벡터의 순서는 고유값을 기반으로 하기 때문에, 그리고 고유값은 분자 역학(MD) 시뮬레이션이 이들 상이한 분자의 근본적인 에너지 랜드스케이프를 샘플링하는 확률적 성질로 인해 반드시 2개의 상이한 분자들 사이에서 동일하지 않을 수 있기 때문에, 다수의 차등적으로 순위가 매겨진 고유벡터 사이의 내적이, 일부 실시예에서, 요구된다(예: 조작된 펩티드의 고유벡터 1, 참조 표적의 고유벡터 2, 3, 4, 등). 또한, 분자 움직임은 복잡하며, 둘 이상의 (또는 몇 개 이상의) 우세한/주 움직임 모드를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시예에서, 후보 조작된 펩티드와 참조 표적 내의 모든 쌍의 고유벡터 사이의 내적이 연산된다. 이는 내적의 행렬을 초래하며, 그 치수는 분석된 고유벡터의 수에 의해 결정된다. 예를 들어, 10개의 고유벡터에 대해, 내적의 행렬은 10 x 10이다. 이러한 내적의 행렬은 100(10 x 10인 경우) 내적의 평균 제곱근 값을 연산함으로써 단일 값으로 증류될 수 있다. 이는 평균 제곱근 내적(RMSIP)이다. RMSIP에 대한 방정식이 도 7g에 나타나 있다. 이 비교로부터, 제약조건의 한정된 조합과 유사도를 갖는 하나 이상의 후보 조작된 펩티드가 선택된다.
e. 추가 단계
일부 실시예에서, 하나 이상의 조작된 펩티드의 선택은 하나 이상의 추가 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 조작된 펩티드 후보물질은 본원에 기술된, 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 정의된 조합과의 유사도에 기초하여 선택되고, 그런 다음 하나 이상의 추가 특징을 결정하기 위한 하나 이상의 분석, 및 상기 원하는 특징을 부여하거나 강화하기 위한 하나 이상의 구조적 조정을 거친다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 선택된 후보물질은 분자의 전체적인 안정성 및/또는 특정 접힘 구조에 대한 성향을 결정하기 위해, 예컨대 분자 역학 시뮬레이션을 통해, 분석된다. 일부 실시예에서, 원하는 수준의 안정성, 또는 원하는 접힘 구조에 대한 원하는 성향을 부여하거나 강화하도록 하나 이상의 변형이 조작된 펩티드에 이루어진다. 이러한 변형은, 예를 들어, 하나 이상의 가교 결합(예컨대, 이황화 결합), 염 브릿지, 수소 결합 상호작용, 또는 소수성 상호작용, 또는 이들의 임의의 조합의 설치를 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 방법은 원하는 결합 상호작용 또는 활성과 같은, 하나 이상의 원하는 특징에 대해 하나 이상의 선택된 조작된 펩티드를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 원하는 특징을 측정하기에 적절한, 임의의 적절한 검정이 사용될 수 있다.
II. 선택된 조작된 펩티드
다른 측면에서, 본원에 기술된 방법을 통해 선택된 조작된 펩티드와 같은, 조작된 펩티드가 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드는 1 kDa 내지 10 kDa의 분자량을 가지며, 최대 50개의 아미노산을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 조작된 펩티드는 2 kDa 내지 10 kDa, 2 kDa 내지 10 kDa, 3 kDa 내지 10 kDa, 4 kDa 내지 10 kDa, 5 kDa 내지 10 kDa, 6 kDa 내지 10 kDa, 7 kDa 내지 10 kDa, 8 kDa 내지 10 kDa, 9 kDa 내지 10 kDa, 1 kDa 내지 9 kDa, 1 kDa 내지 8 kDa, 1 kDa 내지 7 kDa, 1 kDa 내지 6 kDa, 1 kDa 내지 5 kDa, 1 kDa 내지 4 kDa, 1 kDa 내지 3 kDa, 또는 1 kDa 내지 2 kDa의 분자량을 가지고 있다. 특정 실시예에서, 조작된 펩티드는 최대 45개 아미노산, 최대 40개 아미노산, 최대 35개 아미노산, 최대 30개 아미노산, 최대 25개 아미노산, 최대 20개 아미노산, 적어도 5개 아미노산, 적어도 10개 아미노산, 적어도 15개 아미노산, 적어도 20개 아미노산, 적어도 25개 아미노산, 적어도 30개 아미노산, 적어도 35개 아미노산, 또는 적어도 40개 아미노산을 포함한다.
소정의 실시예에서, 조작된 펩티드는 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 포함하며, 여기서 제약조건 중 하나 이상은 참조 표적-유래 제약조건이다. 본원에 기술된 임의의 제약조건은 일부 실시예에서, 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 조작된 펩티드의 아미노산의 10% 내지 98%가 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시킨다(예를 들어, 조작된 펩티드가 50개의 아미노산을 포함하는 경우, 5 내지 49개의 아미노산이 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시킨다). 일부 실시예에서, 조작된 펩티드의 아미노산의 20% 내지 98%, 30% 내지 98%, 40% 내지 98%, 50% 내지 98%, 60% 내지 98%, 70% 내지 98%, 80% 내지 98%, 90% 내지 98%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 또는 10% 내지 20%이 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시킨다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 하나 이상의 아미노산은 참조 표적과 8.0 Å 미만, 7.5 Å 미만, 7.0 Å 미만, 6.5 Å 미만, 6.0 Å 미만, 5.5 Å 미만, 또는 5.0 Å 미만의 백본 평균 제곱근 편차(RSMD) 구조적 상동성을 갖는다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드는 1 kDa 내지 10 kDa의 분자량을 가지며; 최대 50개의 아미노산; 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 포함하고, 상기 제약조건의 하나 이상은 참조 표적-유래 제약조건이고; 조작된 펩티드의 아미노산의 10% 내지 98%가 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족하고; 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 참조 표적과 8.0 Å 미만의 백본 평균 제곱근 편차(RSMD) 구조적 상동성을 갖는다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 조작된 펩티드의 아미노산은 참조 표적과 10% 내지 90%의 서열 상동성, 20% 내지 90%의 서열 상동성, 30% 내지 90%의 서열 상동성, 40% 내지 90%의 서열 상동성, 50% 내지 90%의 서열 상동성, 60% 내지 90%의 서열 상동성, 70% 내지 90%의 서열 상동성, 또는 80% 내지 90%의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 참조와 30 Å2 내지 3000 Å2, 또는 100 Å2 내지 3000 Å2, 또는 250 Å2 내지 3000 Å2, 또는 500 Å2 내지 3000 Å2, 또는 750 Å2 내지 3000 Å2, 또는 1000 Å2 내지 3000 Å2, 또는 1250 Å2 내지 3000 Å2, 또는 1500 Å2 내지 3000 Å2, 또는 1750 Å2 내지 3000 Å2, 또는 2000 Å2 내지 3000 Å2, 또는 2250 Å2 내지 3000 Å2, 또는 2500 Å2 내지 3000 Å2, 또는 2750 Å2 내지 3000 Å2의 반 데르 발스 표면적 중첩을 갖는다.
조작된 펩티드가 충족시키는 제약조건의 조합은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 포함할 수 있다. 조합은 본 개시의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 참조 표적으로부터 유래되지 않은 하나 이상의 제약조건을 포함할 수 있다. 이들 참조-유래 제약조건 및 비-참조 유래 제약조건은, 존재하는 경우, 독립적으로, 본원에 기술된 임의의 구조적, 역학적, 화학적 또는 기능적 특징, 또는 이들의 조합과 같은, 본원에 기술된 임의의 제약조건일 수 있다.
일부 실시예에서, 조작된 펩티드는 참조 표적과 비교했을 때 적어도 하나의 구조적 차이를 포함한다. 이러한 구조적 차이는, 예를 들어, 서열의 차이, 아미노산 잔기의 수, 총 원자 수, 총 친수성, 총 소수성, 총 양전하, 총 음전하, 하나 이상의 이차 구조, 형상 인자, Zernike의 기술어, 반 데르 발스 표면, 구조 그래프 노드 및 가장자리, 체적 표면, 정전기 전위 표면, 소수성 전위 표면, 국소 직경, 국소 표면 특징부, 골격 모형, 전하 밀도, 친수성 밀도, 표면 대 부피 비율, 양친매성 밀도, 또는 표면 조도, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, (본원에 기술된 하나 이상의 특징과 같은) 하나 이상의 특징의 차이는 특징의 유형에 적용 가능한 대로, 참조 표적의 특징과 비교했을 때 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 100% 초과이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 차이는 총 원자 수이고, 조작된 펩티드는 참조 표적보다 적어도 10%, 적어도 20%, 또는 적어도 30% 더 많은 원자, 또는 참조 표적보다 적어도 10%, 적어도 20%, 또는 적어도 30% 더 적은 원자를 갖는다. 일부 실시예에서, 차이는 총 양전하이고, 조작된 펩티드의 총 양전하는 참조 표적보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 더 크지만(예를 들어, 더 양임), 다른 실시예에서, 조작된 펩티드의 총 양전하는 참조 표적보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 더 작다(예를 들어, 덜 양임) 것이다.
일부 실시예에서, 공간적으로-한정된 위상 제약조건의 조합은 참조 표적에 존재하지 않는 하나 이상의 이차 구조적 요소를 포함한다. 따라서, 일부 실시예에서, 조작된 펩티드는 참조 표적에 존재하지 않는 하나 이상의 이차 구조적 요소를 포함한다. 일부 실시예에서, 조합 및/또는 조작된 펩티드는 참조 표적에서 발견되지 않는 1개의 이차 구조적 요소, 2개의 이차 구조적 요소, 3개의 이차 구조적 요소, 4개의 이차 구조적 요소, 또는 4개 초과의 이차 구조적 요소를 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 이차 구조적 요소는 나선, 시트, 루프, 회전, 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 참조 표적에 존재하지 않는 각각의 이차 구조적 요소는 독립적으로 α-나선, β-브릿지, β-가닥, 310 나선, π-나선, 회전, 루프, 또는 코일이다.
일부 실시예에서, 조작된 펩티드는 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 원자, 또는 하나 이상의 아미노산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 생물학적 반응 또는 생물학적 기능은 유전자 발현, 대사 활성, 단백질 발현, 세포 증식, 세포 사멸, 사이토카인 분비, 키나아제 활성, 후성유전자 변형, 세포 사멸 활성, 염증 신호, 화학주성, 조직 침윤, 면역 세포 계통 결정(lineage commitment), 조직 미세환경 변형, 면역 시냅스 형성, IL-2 분비, IL-10 분비, 성장 인자 분비, 인터페론 감마 분비, 형질전환 성장 인자 베타 분비, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 활성, 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 활성, 항체 유도 세포 세포독성, 보체 유도 세포독성, 생물학적 경로 작용, 생물학적 경로 길항작용, 생물학적 경로 재유도, 키나아제 캐스케이드 변형, 단백질분해 경로 변형, 단백질항상성 경로 변형, 단백질 접힘/ 경로, 번역 후 변형 경로, 대사 경로, 유전자 전사/번역, mRNA 분해 경로, 유전자 메틸화/아세틸화 경로, 히스톤 변형 경로, 후성유전학적 경로, 면역 지향성 제거, 옵소닌화, 호르몬 신호전달, 인테그린 경로, 막 단백질 신호 전달, 이온 채널 플럭스, 및 g-단백질 결합 수용체 반응으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시예에서, 참조 표적은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능(예를 들어, 본원에 기술된 것)과 관련된 하나 이상의 원자를 포함하고; 조작된 펩티드는 생물학적 반응 또는 생물학적 기능(예컨대 본원에 기술된 것)과 연관된 하나 이상의 원자를 포함하고; 조작된 펩티드 내의 상기 원자들의 원자 요동은 참조 표적 내의 상기 원자들의 원자 요동과 중첩된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시예에서, 원자 자체는 상이한 원자이지만, 원자 요동은 중첩된다. 다른 실시예에서, 원자는 동일한 원자이며, 이들의 원자 요동은 중첩된다. 또 다른 실시예에서, 원자는 독립적으로 동일하거나 상이하다. 일부 실시예에서, 중첩은 0.25 초과의 제곱근 평균 내적(root mean square inner product, RMSIP)이다. 일부 실시예에서, 중첩은 0.3 초과, 0.35 초과, 0.4 초과, 0.45 초과, 0.5 초과, 0.55 초과, 0.6 초과, 0.65 초과, 0.7 초과, 0.75 초과, 0.8 초과, 0.85 초과, 0.9 초과, 또는 0.95 초과의 RMSIP이다. 특정 실시예에서, RMSIP는 다음에 의해 계산된다:
Figure pct00001
, 이때 n은 조작된 펩티드 위상 제약조건의 고유벡터고, v는 참조 표적 위상 제약조건의 고유벡터다.
일부 실시예에서, 조작된 펩티드는 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 원자 또는 아미노산(또는 이들의 조합)을 포함하고, 상기 원자 또는 아미노산 또는 조합의 적어도 일부분은 참조 표적으로부터 유래되며, 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산의 세트와 참조 표적 내의 세트의 특정 제약조건은 행렬에 의해 기술될 수 있다. 일부 실시예에서, 행렬은 LxL 행렬이다. 다른 실시예에서, 행렬은 SxSxM 행렬이다. 또 다른 실시예에서, 행렬은 Lx2 phi/psi 각도 행렬이다
예를 들어, 일부 실시예에서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산의 원자 요동은 LxL 행렬에 의해 기술되고; 상기 원자 또는 아미노산의 일부분은 참조 표적으로부터 유래되고; 상기 부분의 참조 표적 내의 원자 요동은 LxL 행렬에 의해 기술된다. 일부 실시예에서, (아미노산 위치와 관련된) 각각의 세트의 인접도는 상응하는 LxL 행렬에 의해 기술된다. 특정 실시예에서, 조작된 펩티드 LxL 원자 요동 또는 인접 행렬의 모든 행렬 요소 (i, j)에 걸친 평균 백분율 오차(MPE)는, 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에 대해, 참조 표적 원자 요동 또는 인접 행렬 내의 상응하는 (i, j) 요소에 비해 75% 이하이다. 일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에 대해, MPE는 참조 표적 행렬 내의 상응하는 요소에 비해 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 또는 40% 미만이다. 일부 실시예에서, 행렬은 원자 요동을 나타내고, L은 아미노산 위치의 수이고, 원자 요동 행렬 요소 내의 (i, j) 값은 (i, j) 원자 거리가 7 Å 이하인 경우 각각 i번째 및 j번째 아미노산에 대한 분자 내 원자 요동의 합이고, 또는 (i, j) 원자 거리가 7 Å 보다 크거나 (i, j)가 대각선 상에 있는 경우 0이다. 대안적으로, 일부 실시예에서, 원자 거리는 0 또는 1 승수 대신에 원자 요동 행렬 요소(i, j)에 대한 가중 인자로서 작용할 수 있다. 특정 실시예에서, i번째 및 j번째 원자 요동 및 거리는 분자 시뮬레이션(예: 분자 역학) 및/또는 실험실 측정(예: NMR)에 의해 결정될 수 있다. 다른 실시예에서, 행렬은 인접도를 나타내고, L은 아미노산 위치의 수이고, 인접도 행렬 요소 (i, j)에서의 값은 원자 거리가 7 Å 이하인 경우 각각 i번째 및 j번째 아미노산 사이의 분자 내 원자 거리이고, 또는 원자 거리가 7 Å 보다 크거나 (i, j)가 대각선 상에 있는 경우 0이다. 대안적으로, 일부 실시예에서, 원자 거리는 0 또는 1 승수 대신에 인접도 행렬 요소(i, j)에 대한 가중 인자로서 작용할 수 있다. 특정 실시예에서, i번째 및 j번째 원자 거리는 분자 시뮬레이션(예: 분자 역학) 및/또는 실험실 측정(예: NMR)에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시예에서, 조작된 펩티드 내의 반응 또는 기능과 연관된 원자 또는 아미노산은, 지질학적 제약조건의 화학적 기술어 벡터 및 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에 대해, 동일한 화학적 기술어에 의해 기술된 참조 대비 75% 미만의 평균 백분율 오차(MPE)를 가지며, 여기서 화학적 기술어 벡터 내의 각각의 i번째 요소는 아미노산 위치 지수에 대응한다. 일부 실시예에서, MPE는 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에 대해, 동일한 화학적 기술어에 의해 기술된 참조 대비 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 또는 40% 미만이다. 예시적인 벡터가 도 48에 제시되어 있다.
또 다른 실시예에서, 행렬은 Lx2 phi/psi 각도 행렬이고, 조작된 펩티드 내의 반응 또는 기능과 연관된 원자 또는 아미노산은 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에서의 참조 phi/psi 각도 행렬에 대해 75% 미만의 MPE를 가지며, 여기서 L은 아미노산 위치의 수이고, phi, psi 값은 차원(L, 1), 및 (L, 2) 각각에 있다. 일부 실시예에서, MPE는 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에서의 참조 phi/psi 각도 행렬에 대하여 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 또는 40% 미만이다. 일부 실시예에서, phi/psi 값은 분자 시뮬레이션(예: 분자 역학), 지식 기반 구조 예측, 또는 실험실 측정(예: NMR)에 의해 결정된다. 예시적인 Lx2 phi/psi 행렬이 도 49에 나타나 있다.
일부 실시예에서, 행렬은 SxSxM 이차 구조적 요소 상호작용 행렬이고, 조작된 펩티드 내의 반응 또는 기능과 연관된 원자 또는 아미노산은 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에서의 참조 이차 구조적 요소 관계 행렬에 비해 75% 미만의 평균 백분율 오차(MPE)를 가지며, 여기서 S는 이차 구조적 요소의 수이고, M은 상호작용 기술어의 수이다. 일부 실시예에서, MPE는 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에서, 참조 이차 구조적 요소 관계 행렬에 비해 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 또는 40% 미만이다. 상호작용 기술어는, 예를 들어, 수소 결합, 소수성 패킹, 반 데르 발스 상호작용, 이온 상호작용, 공유 브릿지, 키랄성, 배향, 또는 거리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이차 구조적 요소 상호작용 행렬 지수에서, (i, j, m) = i번째 및 j번째 이차 구조적 요소 사이의 m번째 상호작용 기술어 값. 예시적인 SxSxM 행렬이 도 50에 제시되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 상이한 행렬에 대한 평균 백분율 오차(MPE)는 다음에 의해 계산될 수 있다:
평균 백분율 오차(MPE) =
Figure pct00002
,
이때 n은 조작된 펩티드(engn) 및 대응하는 참조(refn)에 대한 위상 제약조건 벡터 또는 행렬 위치 지수이고, 벡터 또는 행렬 위치 n까지 합산된다. 위상 행렬의 예시적인 예가 도 47에 제공되고 있다.
일부 실시예에서, 조작된 펩티드는 참조 표적과 비교해 75% 미만의 MPE를 갖는다. 특정 실시예에서, 조작된 펩티드는 참조 표적에 비교해 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 또는 40% 미만의 MPE를 갖는다. 일부 실시예에서, MPE는 총 위상 제약조건 거리(Total Topological Constraint Distance, TCD), 위상 클러스터링 계수(topological clustering coefficient, TCC), 유클리드 거리(Euclidean distance), 전력 거리, 수르겔 거리(Soergel distance), 캔버라 거리(Canberra distance), 소렌슨 거리(Sorensen distance), 자카드 거리(Jaccard distance), 마할라노비스 거리(Mahalanobis distance), 해밍 거리(Hamming distance), 유사도의 정량적 추정치(Quantitative Estimate of Likeness, QEL) 또는 체인 위상 파라미터(Chain Topology Parameter, CTP)에 의해 결정된다.
a. 이차 구조적 요소
일부 실시예에서, 조작된 펩티드의 적어도 일부분은 하나 이상의 이차 구조적 요소에 위상적으로 제약된다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드 내의 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 원자 또는 아미노산은 하나 이상의 이차 구조적 요소에 위상적으로 제약된다. 일부 실시예에서, 이차 구조적 요소는 독립적으로 시트, 나선, 회전, 루프, 또는 코일이다. 일부 실시예에서, 이차 구조적 요소는 독립적으로 α-나선, β-브릿지, β-가닥, 310 나선, π-나선, 회전, 루프, 또는 코일이다. 특정 실시예에서, 조작된 펩티드의 적어도 일부분이 위상적으로 제약되는 하나 이상의 이차 구조적 요소가 참조 표적에 존재한다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드의 적어도 일부분은 이차 구조적 요소의 조합에 위상적으로 제약되며, 여기서 각각의 요소는 시트, 나선, 회전, 루프 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 또 다른 실시예에서, 각각의 요소는 α-나선, β-브릿지, β-가닥, 310 나선, π-나선, 회전, 루프 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시예에서, 이차 구조적 요소는 평행 또는 역-평행 시트이다. 일부 실시예에서, 시트 이차 구조는 2개 이상의 잔기를 포함한다. 일부 실시예에서, 시트 이차 구조는 50개 이하의 잔기를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 시트 이차 구조는 2 내지 50개의 잔기를 포함한다. 시트는 평행하거나 역-평행할 수 있다. 일부 실시예에서, 평행 시트 이차 구조는 2개의 가닥 i, j를 평행으로 갖는 것(i 및 j 가닥의 N-말단이 반대 배향), 및 잔기 i:j의 수소 결합 패턴을 갖는 것으로 설명될 수 있다. 일부 실시예에서, 역-평행 시트 이차 구조는 또한 2개의 가닥 i, j를 역-평행으로 갖는 것(i 및 j 가닥의 N-말단이 동일 배향), 및 잔기 i:j-1, i:j+1의 수소 결합 패턴을 갖는 것으로 설명될 수 있다. 소정의 실시예에서, 가닥의 배향 및 수소 결합은 지식 기반 또는 분자 역학 시뮬레이션 및/또는 실험실 측정에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 이차 구조적 요소는 나선이다. 나선은 오른손형 또는 왼손형일 수 있다. 일부 실시예에서, 나선은 2.5 내지 6.0의 회전 당 잔기(잔기/회전) 값, 및 3.0 Å 내지 9.0 Å의 피치를 갖는다. 일부 실시예에서, 잔기/회전 및 피치는 지식 기반 또는 분자 역학 시뮬레이션 및/또는 실험실 측정에 의해 결정된다.
일부 실시예에서, 이차 구조적 요소는 회전이다. 일부 실시예에서, 회전은 2 내지 7개의 잔기, 및 하나 이상의 잔기-간 수소 결합을 포함한다. 일부 실시예에서, 회전은 2, 3 또는 4개의 잔기-간 수소 결합을 포함한다. 특정 실시예에서, 회전은 지식 기반 또는 분자 역학 시뮬레이션 및/또는 실험실 측정에 의해 결정된다.
또 다른 실시예에서, 이차 구조적 요소는 코일이다. 특정 실시예에서, 코일은 2개 내지 20개의 잔기 및 0개의 예측된 잔기-간 수소 결합을 포함한다. 일부 실시예에서, 이들 코일 변수는 지식 기반 또는 분자 역학 시뮬레이션 및/또는 실험실 측정에 의해 결정된다.
또 다른 실시예에서, 조작된 펩티드는 참조 표적으로부터 유래된 하나 이상의 원자 또는 아미노산을 포함하고, 상기 원자 또는 아미노산은 이차 구조를 갖는다. 일부 실시예에서, 이들 원자 또는 아미노산은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산의 이차 구조 모티프 벡터는 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에 대한 참조 표적 이차 구조 모티프 벡터에 대해 0.25보다 큰 코사인 유사도를 가지며, 여기서 벡터의 길이는 이차 구조 모티프의 수이고, i번째 벡터 위치에서의 값은 조회 표에서 유래된 이차 구조 모티프(예를 들어, 나선, 시트)의 실체를 한정한다. 일부 실시예에서, 각각의 모티프는 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 소정의 실시예에서, 모티프는, 예를 들어, α-나선, β-브릿지, β-가닥, 310 나선, π-나선, 회전, 및 루프를 포함한다. 일부 실시예에서, 코사인 유사도는 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 분획에 대해 참조 표적 이차 구조 모티프 벡터에 비해 0.3 초과, 0.35 초과, 0.4 초과, 0.45 초과, 또는 0.5 초과이다. 예시적인 이차 구조 지수 및 조회 표가 도 53에 제공되고 있다. 코사인 유사도는 다음에 의해 계산될 수 있다:
코사인 유사도 =
Figure pct00003
여기서 A는 이차 구조 모티프 식별자의 펩티드 벡터이고, B는 이차 구조 모티프 식별자의 참조 벡터이고, n은 이차 구조 모티프 벡터의 길이이고, i는 i번째 이차 구조 모티프이다.
일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 하나 이상의 원자 또는 아미노산은 총 위상 제약조건 거리(TCD)를 사용하여 대응하는 참조 표적 원자 또는 아미노산과 비교될 수 있다. 일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드 원자 또는 아미노산의 총 TCD는 참조 표적에서의 대응하는 원자의 TCD 거리에 비해 +/- 75%이며, 여기서 2개의 분자 내 위상 제약조건은 이들의 쌍쌍 거리가 7 Å 이하일 경우 상호작용하고 있다. 일부 실시예에서, 비교되는 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산은 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된다. 2개의 원자 또는 아미노산의 i번째, j번째 쌍쌍 거리는, 일부 실시예에서, 분자 시뮬레이션(예: 분자 역학) 및/또는 실험실 측정(예: NMR)에 의해 결정될 수 있다. 총 위상 제약조건 거리(TCD)를 계산하기 위한 예시적인 방정식은 다음과 같다:
Figure pct00004
,
이때 i, j는 아미노산(i, j)에 대한 분자 내 위치 지수이고, Sij는 제약조건 S(i)와 S(j) 사이의 차이이고, 아미노산(i, j)이 7 Å 상호작용 임계값 내에 있는 경우 Δ(i,j) = 1이고, L은 펩티드 또는 상응하는 참조 표적 내의 아미노산 위치의 수이다. 대안적으로, 일부 실시예에서, Δ(i,j)는 0 또는 1 승수 대신에 Sij 차이에 대한 가중 인자로서 작용할 수 있다.
일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 하나 이상의 원자 또는 아미노산은 체인 위상 파라미터(CTP)를 사용하여 대응하는 참조 표적 원자 또는 아미노산과 비교될 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드 원자 또는 아미노산의 CTP는 참조 표적에서의 대응하는 원자 또는 아미노산의 CTP에 비해 +/- 50%이며, 여기서 체인 내 위상 상호작용은 7 Å 이하의 쌍쌍 거리이다. 일부 실시예에서, 비교되는 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산은 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된다. 일부 실시예에서 i번째, j번째 쌍방향 거리는 분자 시뮬레이션(예: 분자 역학) 및/또는 실험실 측정(예: NMR)에 의해 결정될 수 있다. CTP를 평가하기 위한 예시적인 방정식은 다음과 같다:
체인 위상 파라미터(CTP) =
Figure pct00005
,
이때 i, j는 아미노산(i, j)에 대한 위치 지수이고, Sij는 위상 제약조건 S(i)와 S(j) 사이의 차이이고, 아미노산(i, j)이 7 Å 체인 위상 상호작용 임계값 내에 있는 경우 Δ(i,j) = 1이고, L은 펩티드 또는 상응하는 참조 표적 내의 아미노산 위치의 수이고, N은 조작된 펩티드 또는 참조 표적 내의 7 Å 위상 상호작용을 충족시키는 체인 내 교호 총 수이다. 대안적으로, 일부 실시예에서 Δ(i,j)는 0 또는 1 승수 대신에 Sij 차이에 대한 가중 인자로서 작용할 수 있다.
일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 하나 이상의 원자 또는 아미노산은 유사도의 정량적 추정치(QEL)를 사용하여 대응하는 참조 표적 원자 또는 아미노산과 비교될 수 있다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드 원자 또는 아미노산의 QEL은 참조 표적에서의 대응하는 원자 또는 아미노산의 QEL에 비해 +/- 50%이다. 일부 실시예에서, 비교되는 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산은 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된다. QEL을 결정하기 위한 예시적인 방정식은 다음과 같다:
유사도의 정량적 추정치(QEL) =
Figure pct00006
,
여기서 di는 i번째 아미노산 또는 원자 위치에 대한 위상 제약조건, 또는 i번째 아미노산 또는 원자 위치에 대한 다수의 위상 제약조건을 조합하는 조성물 함수(예: 선형 회귀 함수)이고, n은 펩티드 또는 참조 표적 내의 아미노산 또는 원자 위치의 수이다.
일부 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 하나 이상의 원자 또는 아미노산은 위상 클러스터링 계수(TCC) 벡터 및 평균 백분율 오차(MPE)를 사용하여 대응하는 참조 표적 원자 또는 아미노산과 비교될 수 있다. 일부 실시예에서, TCC 벡터 및 MPE는 참조 표적에서의 대응하는 원자 또는 아미노산의 TCC에 비해 75% 미만이고, 여기서 벡터의 각각의 요소 (i)는 i번째 아미노산 위치에 대한 위상 클러스터링 계수이고, 분자 내 클러스터는 7 Å 이하의 상호작용 에지 거리, 및 i번째 아미노산 위치로부터의 2개의 에지: i-j, j-l에 의해 정의된다. 일부 실시예에서, 비교되는 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산은 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된다. 일부 실시예에서, i번째, j번째 및 l번째 에지 거리는 분자 시뮬레이션(예: 분자 역학) 및/또는 실험실 측정(예: NMR)에 의해 결정될 수 있다. i번째 위치에 대한 위상 클러스터링 계수를 평가하기 위한 예시적인 방정식은 다음과 같다:
i번째 위치에 대한 위상 클러스터링 계수 (TCCi) =
Figure pct00007
,
여기서 분자 내 아미노산 위치: (i, j), (i, l), (j, l)가 각각 7 Å 상호작용 에지 임계값 내에 있는 경우 Δ(i,j) = 1, Δ(i,l) = 1, Δ(j,l) = 1이고, Sijl은 i번째, j번째 및 l번째 아미노산에 대한 위상 제약조건의 조합(예: 합)이고, L은 펩티드 벡터 또는 상응하는 참조 표적 벡터 내의 아미노산 위치의 수이고, Nc는 i번째 아미노산에 대한 분자 내 상호작용 아미노산 위치의 수이고, 7 Å 에지 임계값 및 i번째 아미노산으로부터 2개의 에지: i-j, j-l를 충족시킨다. 대안적으로, 일부 실시예에서, Δ(i,j), Δ(i,l) 및 Δ(j,l)은 0 또는 1 승수 대신에 클러스터링 계수 벡터 요소 (i)에 대한 가중 인자로서 작용할 수 있다. 예시적인 조작된 펩티드에 대한 클러스터 및 TCC 벡터를 보여주는 예시적인 다이어그램이 도 51에 제공되고 있다.
또 다른 실시예에서, 참조 표적으로부터 유래된 조작된 펩티드의 하나 이상의 원자 또는 아미노산은, 모든 M-차원에 걸쳐 유클리드 거리(Euclidean distance), 전력 거리, 수르겔 거리(Soergel distance), 캔버라 거리(Canberra distance), 소렌슨 거리(Sorensen distance), 자카드 거리(Jaccard distance), 마할라노비스 거리(Mahalanobis distance), 또는 해밍 거리(Hamming distance)의 LxM 위상 제약조건 행렬 및 평균 백분율 오차(MPE)를 사용하여 대응하는 참조 표적 원자 또는 아미노산과 비교될 수 있다. LxM 행렬 요소(l, m)는 l번째 아미노산 위치에 대한 m번째 제약조건 값을 함유하며, 여기서 L은 아미노산 위치의 수이고, M은 구별되는 위상 제약조건의 수이다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드 LxM 행렬의 MPE는 대응하는 참조 표적 원자 또는 아미노산의 행렬에 비해 75% 미만이다. 일부 실시예에서, MPE는 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 또는 45% 미만이다. 일부 실시예에서, 비교되는 조작된 펩티드 내의 원자 또는 아미노산은 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된다. 예시적인 LxM 행렬이 도 52에 제공되고 있다.
III. 프로그램 가능한 시험관 내 선택
다른 측면에서, 일련의 프로그래밍된 선택 단계를 사용하여 결합 파트너를 선택함에 있어서 본원에 기술된 조작된 펩티드를 사용하는 방법이 본원에 추가로 제공되며, 적어도 하나의 선택 단계는 잠재적 결합 파트너 풀과 조작된 펩티드와의 상호작용을 평가하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 2개 이상의 선택 분자를 사용하여 결합 분자의 선택을 조종하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 후보 결합 분자의 풀을 적어도 하나의 선택 라운드에 거치게 하는 단계를 포함하며, 각각의 라운드는 적어도 하나의 음성 선택 단계 -여기서 상기 풀의 적어도 일부분은 음성 선택 분자에 대해 스크리닝됨-, 및 적어도 하나의 양성 선택 단계 -여기서 상기 풀의 적어도 일부분은 양성 선택 분자에 대해 스크리닝됨-를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 적어도 2회 라운드, 적어도 3회 라운드, 적어도 4회 라운드, 적어도 5회 라운드, 적어도 6회 라운드, 적어도 7회 라운드, 적어도 8회 라운드, 적어도 9회 라운드, 적어도 10회 라운드, 또는 그 이상을 포함하고, 여기서 각각의 라운드는 독립적으로 적어도 하나의 음성 선택 단계 및 적어도 하나의 양성 선택 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 라운드는 독립적으로 하나 초과의 음성 선택 단계, 또는 하나 초과의 양성 선택 단계, 또는 이들의 조합을 포함한다. 도 5는 3회의 선택 라운드를 상세히 설명하는 예시적인 개략도를 제공하며, 제1 및 제3 라운드는 하나 초과의 음성 선택 단계를 포함하고, 제1 라운드는 하나 초과의 양성 선택 라운드를 추가로 포함한다. 상기 개략도에 나타낸 바와 같이, 2개의 음성 선택 분자("미끼")가 제1 라운드에 사용되고, 3개의 음성 선택 분자가 제3 라운드에 사용된다. 또한, 2개의 양성 선택 분자가 제1 라운드에서 사용된다.
상기 방법이 1회 초과의 라운드를 포함하는 일부 실시예에서, 각각의 음성 및 양성 선택 분자는 독립적으로 선택된다. 다른 실시예에서, 동일한 음성 선택 분자, 또는 동일한 양성 선택 분자, 또는 이들의 조합이 1회 초과의 라운드에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 5에서, 1 라운드에 사용된 동일한 음성 선택 분자가 3 라운드에 다시 사용되며, 추가의 제3 음성 선택 분자도 3 라운드에 포함된다. 음성 선택 단계 및 양성 선택 단계의 순서는, 소정의 실시예에서, 각각의 선택 라운드 내에서 독립적으로 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시예에서, 상기 방법은 1회 이상의 선택 라운드를 포함하고, 여기서 각각의 라운드는 먼저 음성 선택 단계, 및 이어서 양성 선택 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 1회 이상의 선택 라운드를 포함하고, 여기서 각각의 라운드는 먼저 양성 선택 단계, 및 이어서 음성 선택 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 1회 이상의 선택 라운드를 포함하고, 여기서 각각의 라운드는 독립적으로 음성 선택 단계 및 양성 선택 단계를 포함하고, 여기서 각각의 라운드에서 음성 선택 단계는 양성 선택 단계 이전에 또는 양성 선택 단계 이후에 독립적으로 이루어진다.
이러한 선택 방법은 양성 (+) 및 음성 (-) 단계를 사용하여 결합 특이성 또는 결합 친화도와 같은, 소정의 원하는 특징을 향하여 그리고 그로부터 멀리 후보 결합 분자의 라이브러리를 조종한다. 양성 및 음성 선택 분자 둘 다를 갖는 다수의 단계를 사용함으로써, 후보물질의 풀은 바람직한 특징 및 바람직하지 않은 특징에 대해 선택하도록 단계적으로 유도될 수 있다. 또한, 일부 실시예에서, 각각의 라운드 내의 각각의 단계의 순서, 및 서로에 대한 라운드의 순서는 상이한 방향으로 선택을 유도할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시예에서, (+) 선택에 이은 (-) 선택이 있는 한 라운드를 포함하는 방법은 (-) 선택이 먼저 이루어지고 (+) 선택이 이어지는 경우와는 다른 최종 후보 풀을 생성할 것이다. 이를 다수의 라운드를 포함하는 방법에 외삽하면, 동일한 양성 선택 분자 및 음성 선택 분자가 전체적으로 사용되더라도 선택 단계의 순서는 선택된 후보의 상이한 최종 풀을 생성할 수 있다.
일부 실시예에서, 또 다른 선택 분자의 역특징을 갖는 선택 분자가 사용된다. 이는, 예를 들어, 양성 선택 분자를 사용하여 식별된(또는 음성 선택 분자로 인해 배제된) 후보 결합 파트너가, 별도의 무관한 결합 상호작용 때문이 아닌, 원하는 형질(또는 원하지 않는 형질)로 인해 식별(또는 배제)되었는지 보장하는 데 유용할 수 있다. 무관한 상호작용을 통해 결합 중인 결합 파트너를 제거하기 위해, 원하는 형질(또는 원하지 않는 형질)을 전달하는 잔기/구조를 제외하고, 선택 분자와 유사하거나 동일한 구조 및 특징을 갖는 역 선택 분자가 사용될 수 있다. 예를 들어, 양성 선택 분자에서 특정 전하 패턴과의 상호작용을 원하는 경우, 이러한 전하 패턴에 미전하 잔기, 및/또는 반대 전하의 잔기로 제공하는 잔기를 대체한 역 음성 선택 분자가 사용될 수 있다. 따라서, 특정 선택 분자에 대해, 다수의 상이한 대응하는 역선택 분자가 가능할 수 있다.
본원에 제공된 선택 방법에서, 선택 분자 중 적어도 하나는 본원에 기술된 바와 같은 조작된 펩티드이다. 일부 실시예에서, 둘 이상의 조작된 펩티드가 사용된다. 일부 실시예에서, 각각의 조작된 펩티드는 독립적으로 양성 또는 음성 선택 분자이다. 특정 실시예에서, 1회 이상의 선택 라운드에 사용된 각각의 선택 분자는 독립적으로 조작된 펩티드이다. 다른 실시예에서, 조작된 펩티드가 아닌 적어도 하나의 분자가 선택 분자로서 사용된다. 조작된 펩티드가 아닌 이러한 선택 분자는, 예를 들어, 자연 발생 폴리펩티드, 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 조작되지 않은 펩티드인 하나 이상의 선택 분자는, 예를 들어, 비-자연 발생 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 하나 이상의 선택 분자(예를 들어, 양성 선택 분자 또는 음성 선택 분자)는 면역원, 항체, 세포 표면 수용체, 또는 막관통 단백질, 또는 신호전달 단백질, 또는 멀티단백질 복합체, 또는 펩티드-단백질 복합체, 또는 이들의 임의의 부분, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 선택 분자는 PD-1, PD-L1, CD25, IL2, MIF, CXCR4, 또는 VEGF, 또는 이들 중 어느 하나의 부분, 또는 이들 중 어느 하나에 대한 항체(예: 베바시주맙, 아벨루맙, 또는 더발루맙)이다.
각각의 단계에서 선택되거나 대항하여 선택되는 양 및 음성 특징은 다양한 형질로부터 선택될 수 있고, 수득된 최종 하나 이상의 결합 분자의 원하는 특징에 따라 재단될 수 있다. 이러한 원하는 특징은, 예를 들어, 하나 이상의 결합 분자의 의도된 용도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원에 제공된 방법은 높은 특이성과 같은 하나 이상의 양성 특징에 대해, 그리고 교차 반응성과 같은 하나 이상의 음성 특징에 대항하여 항체 후보물질을 스크리닝하는 데 사용된다. 하나의 맥락에서 양성 특징으로 간주되는 것이 다른 맥락에서는 음성 특징일 수 있고, 그 반대일 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 하나의 일련의 선택 라운드에서의 양성 선택 분자는, 일부 실시예에서, 상이한 일련의 선택 라운드에서, 또는 상이한 유형의 결합 분자를 선택함에 있어서, 또는 동일한 유형의 결합 분자를 선택하지만 상이한 목적을 위한 경우에 음성 선택 분자일 수 있다.
일부 실시예에서, 각각의 선택 특징은 아미노산 서열, 폴리펩티드 이차 구조, 분자 역학, 화학적 특징, 생물학적 기능, 면역원성, 참조 표적(들) 다중특이성, 종간 참조 표적 반응성, 원하지 않는 참조 표적(들) 대비 원하는 참조 표적(들)의 선택성, 서열 및/또는 구조적으로 상동성 계열 내의 참조 표적(들)의 선택성, 유사한 단백질 기능을 갖는 참조 표적(들)의 선택성, 높은 서열 및/또는 구조적 상동성을 갖는 원하지 않는 표적의 더 큰 계열로부터 구별되는 원하는 참조 표적(들)의 선택성, 구별되는 참조 표적 대립유전자 또는 돌연변이에 대한 선택성, 구별되는 참조 표적 잔기 수준 화학적 변형에 대한 선택성, 세포 유형에 대한 선택성, 조직 유형에 대한 선택성, 조직 환경에 대한 선택성, 참조 표적(들) 구조적 다양성에 대한 내성, 참조 표적(들) 서열 다양성에 대한 내성, 및 참조 표적(들) 역학 다양성에 대한 내성으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 각각의 선택 특징은 상이한 유형의 선택 특징이다. 다른 실시예에서, 둘 이상의 선택 특징은 상이한 특징이지만 동일한 유형의 것이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 2개 이상의 선택 특징은 폴리펩티드 이차 구조이고, 여기서 하나는 원하는 폴리펩티드 이차 구조에 대한 양성 선택이고, 하나는 원하지 않는 폴리펩티드 이차 구조에 대한 음성 선택이다. 일부 실시예에서, 둘 이상의 선택 특징은 세포 유형에 대한 선택성이고, 양성 선택 특징은 특이적인 원하는 세포 유형에 대한 선택성이고, 음성 선택 특징은 특이적인 원하지 않는 세포 유형에 대한 선택성이다. 일부 실시예에서, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 선택 특징은 동일한 유형이다.
또 다른 측면에서, 2개 이상의 선택 조종 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 폴리펩티드는 독립적으로 하나 이상의 양성 조종 특징을 포함하는 양성 선택 분자, 또는 하나 이상의 음성 조종 특징을 포함하는 음성 선택 분자이다. 이러한 특징은, 일부 실시예에서, 아미노산 서열, 폴리펩티드 이차 구조, 분자 역학, 화학적 특징, 생물학적 기능, 면역원성, 참조 표적(들) 다중특이성, 종간 참조 표적 반응성, 원하지 않는 참조 표적(들) 대비 원하는 참조 표적(들)의 선택성, 서열 및/또는 구조적으로 상동성 계열 내의 참조 표적(들)의 선택성, 유사한 단백질 기능을 갖는 참조 표적(들)의 선택성, 높은 서열 및/또는 구조적 상동성을 갖는 원하지 않는 표적의 더 큰 계열로부터 구별되는 원하는 참조 표적(들)의 선택성, 구별되는 참조 표적 대립유전자 또는 돌연변이에 대한 선택성, 구별되는 참조 표적 잔기 수준 화학적 변형에 대한 선택성, 세포 유형에 대한 선택성, 조직 유형에 대한 선택성, 조직 환경에 대한 선택성, 참조 표적(들) 구조적 다양성에 대한 내성, 참조 표적(들) 서열 다양성에 대한 내성, 및 참조 표적(들) 역학 다양성에 대한 내성으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
따라서, 추가 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 선택 조종 조성물로 결합 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 각각의 선택 라운드는 음성 선택 분자에 대해 상기 풀의 적어도 일부분을 스크리닝하는 음성 선택 단계; 및 양성 선택 분자에 대해 풀의 적어도 일부분을 스크리닝하는 양성 선택 단계를 포함하고; 여기서 각각의 라운드 내의 선택 단계 순서, 및 라운드 순서는, 대체 순서와는 다른 풀의 서브세트를 선택하도록 한다.
일부 실시예에서, 본원에 기술된 바와 같은 선택 조종 폴리펩티드의 조성물, 또는 본원에 기술된 바와 같은 스크리닝 방법을 사용하여 평가되는 결합 파트너는, 파지 라이브러리, 예를 들어 Fab-함유 파지 라이브러리; 또는 세포 라이브러리, 예를 들어 B-세포 라이브러리 또는 T-세포 라이브러리이다.
본원에 제공된 스크리닝 방법의 일부 실시예에서, 상기 방법은 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 또는 7회 이상의 선택 라운드를 포함한다. 일부 실시예에서, 1회 초과 라운드가 있으며, 각각의 라운드는 상이한 선택 분자 세트를 포함한다. 다른 실시예에서, 1회 초과 라운드가 있는 경우, 적어도 2개의 라운드는 동일한 음성 선택 분자, 동일한 양성 선택 분자, 또는 둘 다를 포함한다.
스크리닝 방법의 일부 실시예에서, 상기 방법은 다음 선택 라운드로 진행하기 전에 풀의 서브세트를 분석하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 각각의 서브세트 풀 분석은 펩티드/단백질 바이오센서 결합, 펩티드/단백질 ELISA, 펩티드 라이브러리 결합, 세포 추출물 결합, 세포 표면 결합, 세포 활성 검정, 세포 증식 검정, 세포 사멸 검정, 효소 활성 검정, 유전자 발현 프로파일, 단백질 변형 검정, 웨스턴 블롯, 및 면역조직화학으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시예에서, 유전자 발현 프로파일은 차세대 시퀀싱과 같은, 서브세트 풀의 전체 서열 레파토리 분석을 포함한다. 일부 실시예에서, 통계적 및/또는 정보적 점수화, 또는 머신 러닝 트레이닝을 이용해서 1회 이상의 선택 라운드에서 풀의 하나 이상의 서브세트를 평가한다.
일부 실시예에서, 후속 라운드에 대한 양성 및/또는 음성 선택 분자의 실체 및/또는 순서는 한 선택 라운드로부터 서브세트 풀을 분석함으로써 결정된다. 일부 실시예에서, 통계적 및/또는 정보적 점수화, 또는 머신 러닝 트레이닝은, 1회 이상의 선택 라운드에서 풀의 하나 이상의 서브세트를 평가하여 후속 라운드(예를 들어, 다음 라운드, 또는 프로그램에서 추가 라운드)에 대한 양성 및/또는 음성 선택 분자의 실체 및/또는 순서를 결정하는 데 사용된다.
또 다른 실시예에서, 선택 방법은 다음 선택 라운드로 진행하기 전에 선택 라운드로부터 수득된 서브세트 풀을 변형시키는 단계를 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어, 서브세트 풀의 유전자 돌연변이, 서브세트 풀의 유전자 고갈(예를 들어, 선택에서 전진하기 위해 서브세트 풀의 서브세트를 선택함), 서브세트 풀의 유전자 강화(예를 들어, 풀의 크기 증가), 서브세트 풀의 적어도 일부분의 화학적 변형, 또는 서브세트 풀의 적어도 일부분의 효소적 변형, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 통계적 및/또는 정보적 점수화, 또는 머신 러닝 트레이닝은, 변형된 서브세트 풀을 선택시 앞으로 이동시키기 전에 서브세트 풀을 평가하고 하나 이상의 변형을 결정하는 데 사용된다. 소정의 실시예에서, 이러한 통계적 및/또는 정보적 점수화, 또는 머신 러닝 트레이닝은 후속 선택 라운드를 위한 양성 및/또는 음성 선택 분자의 실체 및/또는 순서를 결정하는 데에도 사용된다.
임의의 적절한 검정을 사용하여 각 단계에서 선택 분자와 결합 파트너 풀의 결합을 평가할 수 있다. 일부 실시예에서, 결합은, 예를 들어 결합 파트너 상의 표지를 직접 검출함으로써 직접 평가된다. 이러한 표지는, 예를 들어 형광단 또는 형광 단백질과 같은, 형광 표지를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 결합은, 예를 들어 샌드위치 검정을 사용하여, 간접적으로 평가된다. 샌드위치 검정에서, 결합 파트너는 선택 분자에 결합하고, 이어서 이차 표지된 시약을 첨가하여 결합된 결합 파트너를 표지한다. 그런 다음, 이 이차 표지된 시약이 검출된다. 샌드위치 검정 성분의 예는 항-His-태그 항체 또는 His-태그-특이적 형광 프로브로 검출된 His-태그된 결합 파트너; 표지된 스트렙타비딘 또는 표지된 아비딘으로 검출된 비오틴-표지된 결합 파트너; 또는 항-결합-파트너 항체로 검출된 미표지 결합 파트너를 포함한다.
일부 실시예에서, 각 단계에서 선택되는 결합 파트너는 임의의 수의 이용 가능한 검출 방법을 사용하여, 결합 신호, 또는 투여량-반응에 기초하여 식별된다. 이들 검출 방법은, 예를 들어, 이미징, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 질량 분광분석, 또는 바이오센서를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 히트 임계값(예를 들어, 중앙 신호)이 정의되고, 그 신호 위의 임의의 신호가 추정적 히트 모티프로서 플래그된다.
IV. 조작된 펩티드를 사용한 항체 생산
본원에 제공되고, 본원에 제공된 방법에 의해 식별된 조작된 펩티드는, 예를 들어, 하나 이상의 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 항체는 단클론 또는 다클론 항체이다. 따라서, 일부 실시예에서, 면역원으로 동물을 면역화하여 생산된 항체가 본원에 제공되며, 여기서 면역원은 본원에 제공된 바와 같은 조작된 펩티드이다. 일부 실시예에서, 동물은 인간, 토끼, 마우스, 햄스터, 원숭이 등이다. 특정 실시예에서, 원숭이는 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이, 짧은꼬리(macaque) 원숭이, 또는 붉은털(rhesus macaque) 원숭이이다. 조작된 펩티드로 동물을 면역화하는 것은, 예를 들어, 펩티드를 포함하는 조성물 및 임의로 동물에 대한 애쥬번트의 적어도 1회 투여량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 동물로부터 항체를 발생시키는 것은 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 것을 포함한다. 일부 실시예는 B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 항체를 발현하는 하이브리도마를 발생시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 조작된 펩티드를 사용하여 발생된 항체는 인간 및 원숭이, 예를 들어 시노몰구스 원숭이와 교차 반응할 수 있다.
본원에 제공된 설명은 다수의 예시적인 구성, 방법, 파라미터 등을 제시한다. 그러나, 이러한 설명은 본 개시의 범위에 대한 한정으로서 의도된 것이 아니라, 대신에 예시적인 실시예들의 설명으로서 제공된다는 것을 인식해야 한다.
예시적인 실시예
실시예 I-1. 조작된 펩티드로서, 상기 조작된 펩티드는 1 kDa 내지 10 kDa의 분자량을 가지고 최대 50개의 아미노산을 포함하고, 상기 조작된 펩티드는:
공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 포함하고, 상기 제약조건 중 하나 이상은 참조 표적-유래 제약조건이고; 그리고
상기 조작된 펩티드의 아미노산의 10% 내지 98%는 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키고,
상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조 표적과 8.0 Å 미만의 골격 평균 제곱근 편차(RSMD) 구조적 상동성을 갖는, 조작된 펩티드.
실시예 I-2. 실시예 I-1에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조 표적과 10% 내지 90%의 서열 상동성을 갖는, 조작된 펩티드.
실시예 I-3. 실시예 I-1 또는 I-2에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조와 30 Å2 내지 3000 Å2의 반 데르 발스 표면적 중첩을 갖는, 조작된 펩티드.
실시예 I-4. 실시예 I-1 내지 I-3 중 어느 하나에 있어서, 상기 조합은 적어도 2개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-5. 실시예 I-1 내지 I-4 중 어느 하나에 있어서, 상기 조합은 적어도 5개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-6. 실시예 I-1 내지 I-5 중 어느 하나에 있어서, 상기 제약조건의 조합은 참조 표적으로부터 유래되지 않은 하나 이상의 제약조건을 포함하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-7. 실시예 I-6에 있어서, 상기 하나 이상의 비-참조 표적-유래 제약조건은 원하는 구조적, 역학적, 화학적, 또는 기능적 특징, 또는 이들의 임의의 조합을 기술하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-8. 실시예 I-1 내지 I-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 제약조건은 다음으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 펩티드:
원자 거리;
원자 요동;
원자 에너지;
화학적 기술어;
용매 노출;
아미노산 서열 유사도;
생물정보 기술어;
비공유 결합 성향;
phi 각도;
psi 각도;
반 데르 발스 반지름;
이차 구조 성향;
아미노산 인접도; 및
아미노산 접촉.
실시예 I-9. 실시예 I-1 내지 I-8 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 원자 요동인, 조작된 펩티드.
실시예 I-10. 실시예 I-1 내지 I-9 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 화학적 기술어인, 조작된 펩티드.
실시예 I-11. 실시예 I-1 내지 I-10 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 원자 거리인, 조작된 펩티드.
실시예 I-12. 실시예 I-1 내지 I-11 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 이차 구조인, 조작된 펩티드.
실시예 I-13. 실시예 I-1 내지 I-12 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 반 데르 발스 표면인, 조작된 펩티드.
실시예 I-14. 실시예 I-1 내지 I-13 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 독립적으로 연관된, 조작된 펩티드.
실시예 I-15. 실시예 I-1 내지 I-14 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 원자를 포함하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-16. 실시예 I-1 내지 I-15 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-17. 실시예 I-14 내지 I-16 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 반응 또는 생물학적 기능은 유전자 발현, 대사 활성, 단백질 발현, 세포 증식, 세포 사멸, 사이토카인 분비, 키나아제 활성, 후성유전자 변형, 세포 사멸 활성, 염증 신호, 화학주성, 조직 침윤, 면역 세포 계통 결정(lineage commitment), 조직 미세환경 변형, 면역 시냅스 형성, IL-2 분비, IL-10 분비, 성장 인자 분비, 인터페론 감마 분비, 형질전환 성장 인자 베타 분비, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 활성, 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 활성, 항체 유도 세포 세포독성, 보체 유도 세포독성, 생물학적 경로 작용, 생물학적 경로 길항작용, 생물학적 경로 재유도, 키나아제 캐스케이드 변형, 단백질분해 경로 변형, 단백질항상성 경로 변형, 단백질 접힘/ 경로, 번역 후 변형 경로, 대사 경로, 유전자 전사/번역, mRNA 분해 경로, 유전자 메틸화/아세틸화 경로, 히스톤 변형 경로, 후성유전학적 경로, 면역 지향성 제거, 옵소닌화, 호르몬 신호전달, 인테그린 경로, 막 단백질 신호 전달, 이온 채널 플럭스, 및 g-단백질 결합 수용체 반응으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 펩티드.
실시예 I-18. 실시예 I-15에 있어서, 상기 참조 표적은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 원자를 포함하고,
생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 하나 이상의 원자의 원자 요동은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 참조 표적 내의 하나 이상의 원자의 원자 요동과 중첩되는, 조작된 펩티드.
실시예 I-19. 실시예 I-18에 있어서, 상기 중첩은 0.25 초과의 평균 제곱근 내적(RMSIP)인, 조작된 펩티드.
실시예 I-20. 실시예 I-19에 있어서, 상기 중첩은 0.75 초과의 평균 제곱근 내적(RMSIP)을 갖는, 조작된 펩티드.
실시예 I-21. 실시예 I-18 내지 I-20 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 상기 참조 표적 내의 이차 구조 요소에 위상적으로 제약되는, 조작된 펩티드.
실시예 I-22. 실시예 I-21에 있어서, 상기 이차 구조 요소는 베타-시트인, 조작된 펩티드.
실시예 I-23. 실시예 I-21에 있어서, 상기 이차 구조 요소는 알파 나선인, 조작된 펩티드.
실시예 I-24. 실시예 I-21에 있어서, 상기 이차 구조 요소는 회전이고, 여기서 상기 회전은 2 내지 7개의 잔기를 포함하고, 적어도 하나의 잔기-간 수소 결합을 포함하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-25. 실시예 I-21에 있어서, 상기 이차 구조 요소는 코일이고, 상기 코일은 2 내지 20개의 잔기를 포함하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-26. 실시예 I-25에 있어서, 상기 코일은 잔기-간 수소 결합을 포함하지 않는, 조작된 펩티드.
실시예 I-27. 실시예 I-21 내지 I-26 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 베타-시트, 알파 나선, 회전, 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2개 이상의 이차 구조 요소의 조합에 위상적으로 제약되는, 조작된 펩티드.
실시예 I-28. 실시예 I-1 내지 I-27 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 원자 거리인, 조작된 펩티드.
실시예 I-29. 실시예 I-1 내지 I-28 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 원자 에너지인, 조작된 펩티드.
실시예 I-30. 실시예 I-29에 있어서, 각각의 원자 에너지는 독립적으로 2개의 원자 사이의 쌍쌍 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 반발 에너지, 원자 레벨 용매화 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 하전된 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 수소 결합 인력 에너지, 또는 비공유 결합 에너지인, 조작된 펩티드.
실시예 I-31. 실시예 I-1 내지 I-30 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 화학적 기술어인, 조작된 펩티드.
실시예 I-32. 실시예 I-31에 있어서, 각각의 화학적 기술어는 독립적으로 소수성, 극성, 부피, 순 전하, logP, 고성능 액체 크로마토그래피 보유, 또는 반 데르 발스 반지름인, 조작된 펩티드.
실시예 I-33. 실시예 I-1 내지 I-32 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 생물정보 기술어인, 조작된 펩티드.
실시예 I-34. 실시예 I-33에 있어서, 각각의 생물정보 기술어는 독립적으로 BLOSUM 유사도, pKa, zScale, Cruciani Properties, Kidera Factors, VHSE-스케일, ProtFP, MS-WHIM 스코어, T-스케일, ST-스케일, 막관통 경향, 단백질 매립 면적, 나선 성향, 시트 성향, 코일 성향, 회전 성향, 면역원성 성향, 항체 에피토프 발생, 또는 단백질 계면 발생인, 조작된 펩티드.
실시예 I-35. 실시예 I-1 내지 I-34 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 용매 노출인, 조작된 펩티드.
실시예 I-36. 실시예 I-1 내지 I-35 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 GPCR 세포외 도메인인, 조작된 펩티드.
실시예 I-37. 실시예 I-1 내지 I-36 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 이온 채널 세포외 도메인인, 조작된 펩티드.
실시예 I-38. 실시예 I-1 내지 I-37 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 단백질-단백질 또는 펩티드-단백질 계면 접합부인, 조작된 펩티드.
실시예 I-39. 실시예 I-1 내지 I-38 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 상기 표적의 다형성 영역으로부터 유래되는, 조작된 펩티드.
실시예 I-40. 실시예 I-1 내지 I-39 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연련된 하나 이상의 원자를 포함하고, 상기 하나 이상의 원자 각각은 탄소, 산소, 질소, 수소, 황, 인, 나트륨, 칼륨, 아연, 망간, 마그네슘, 구리, 철, 몰리브덴, 및 니켈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 펩티드.
실시예 I-41. 실시예 I-1 내지 I-40 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 각각은 독립적으로 단백질원성 자연 발생 아미노산, 비-단백질원성 자연 발생 아미노산, 또는 화학적으로 합성된 비-천연 아미노산인, 조작된 펩티드.
실시예 I-42. 실시예 I-1 내지 I-41 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 펩티드는 상기 참조 표적과 비교했을 때 적어도 하나의 구조적 차이를 갖는, 조작된 펩티드.
실시예 I-43. 실시예 I-42에 있어서, 상기 적어도 하나의 구조적 차이는 서열의 차이, 아미노산 잔기의 수, 총 원자 수, 총 친수성, 총 소수성, 총 양전하, 총 음전하, 하나 이상의 이차 구조, 형상 인자, Zernike의 기술어, 반 데르 발스 표면, 구조 그래프 노드 및 가장자리, 체적 표면, 정전기 전위 표면, 소수성 전위 표면, 국소 직경, 국소 표면 특징부, 골격 모형, 전하 밀도, 친수성 밀도, 표면 대 부피 비율, 양친매성 밀도, 및 표면 조도로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 펩티드
실시예 I-44. 실시예 I-16에 있어서, 상기 하나 이상의 이차 구조에서의 차이는 상기 참조 표적과 비교하여 상기 조작된 펩티드에서 하나 이상의 추가 이차 구조 요소의 존재이고, 여기서 각각의 추가 이차 구조 요소는 알파 나선, 베타-시트, 루프, 회전 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 펩티드.
실시예 I-45. 실시예 I-1 내지 I-44 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산의 10% 내지 90%는 하나 이상의 비-참조 표적-유래 위상 제약조건을 충족시키는, 조작된 펩티드.
실시예 I-46. 실시예 I-45에 있어서, 상기 하나 이상의 비-참조 표적-유래 위상 제약조건은 미리 지정된 기능을 강화하는, 조작된 펩티드.
실시예 I-47. 실시예 I-46에 있어서,
비-참조 유래 위상 제약조건은 상기 펩티드의 참조 유래 분획에서 이차 구조 요소를 강화하거나 안정화시키고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 상기 펩티드의 참조 유래 분획에서 원자 요동을 강화하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 총 소수성을 변경시키고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 용해도를 변경시키고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 총 전하를 변경시키고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 표지된 또는 표지가 없는 검정에서 검출을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 시험관 내 검정에서 검출을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 생체 내 검정에서 검출을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 복합 혼합물로부터의 포획을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 효소 처리를 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 세포막 투과성을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 이차 표적에 대한 결합을 가능하게 하고, 그리고
비-참조 유래 위상 제약조건은 면역원성을 변경시키는, 조작된 펩티드.
실시예 I-48. 조작된 펩티드를 선택하는 방법으로서,
참조 표적의 하나 이상의 위상 특징을 식별하는 단계;
각각의 위상 특징에 대해 공간적으로-연관된 제약조건을 설계해서 상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 생산하는 단계;
후보 펩티드의 공간적으로-연관된 위상 특징을 상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합과 비교하는 단계; 및
상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합과 중첩되는 공간적으로-연관된 위상 특징을 갖는 후보 펩티드를 선택해서 상기 조작된 펩티드를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
실시예 I-49. 실시예 I-48에 있어서, 상기 각각의 특징 사이의 중첩은 독립적으로 총 위상 제약조건 거리(Total Topological Constraint Distance, TCD), 위상 클러스터링 계수(topological clustering coefficient, TCC), 유클리드 거리(Euclidean distance), 전력 거리, 수르겔 거리(Soergel distance), 캔버라 거리(Canberra distance), 소렌슨 거리(Sorensen distance), 자카드 거리(Jaccard distance), 마할라노비스 거리(Mahalanobis distance), 해밍 거리(Hamming distance), 유사도의 정량적 추정치(Quantitative Estimate of Likeness, QEL) 또는 체인 위상 파라미터(Chain Topology Parameter, CTP) 중 하나 이상에 의해 결정되는 75% 이하의 평균 백분율 오차(MPE)인, 방법.
실시예 I-50. 실시예 I-48 또는 I-49에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 잔기별 에너지, 잔기별 상호작용, 잔기별 요동, 잔기별 원자 거리, 잔기별 화학 기술어, 잔기별 용매 노출, 잔기별 아미노산 서열 유사도, 잔기별 생물정보 기술어, 잔기별 비공유 결합 성향, 잔기별 phi/psi 각도, 잔기별 반 데르 발스 반지름, 잔기별 이차 구조 성향, 잔기별 아미노산 인접도, 또는 잔기별 아미노산 접촉에 관한 정보로부터 유래되는, 방법.
실시예 I-51. 실시예 I-48 내지 I-50 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 후보 펩티드의 특징은 컴퓨터 시뮬레이션에 의해 결정되는, 방법.
실시예 I-52. 실시예 I-51에 있어서, 상기 컴퓨터 시뮬레이션은 분자 역학 시뮬레이션, 몬테 카를로(Monte Carlo) 시뮬레이션, 거친 입자(coarse-grained) 시뮬레이션, 가우시안 네트워크 모델(Gaussian network model), 머신 러닝(machine learning), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
실시예 I-53. 실시예 I-48 내지 I-52 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 후보 펩티드의 특징은 실험적 특징화에 의해 결정되는, 방법.
실시예 I-54. 실시예 I-48 내지 I-53 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조 표적과 10% 내지 90%의 서열 상동성을 갖는, 방법.
실시예 I-55. 실시예 I-48 내지 I-54 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조와 30 Å2 내지 3000 Å2의 반 데르 발스 표면적 중첩을 갖는, 방법.
실시예 I-56. 실시예 I-48 내지 I-55 중 어느 하나에 있어서, 상기 조합은 적어도 2개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함하는, 방법.
실시예 I-57. 실시예 I-48 내지 I-56 중 어느 하나에 있어서, 상기 조합은 적어도 5개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함하는, 방법.
실시예 I-58. 실시예 I-48 내지 I-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 제약조건의 조합은 참조 표적으로부터 유래되지 않은 하나 이상의 제약조건을 포함하는, 방법.
실시예 I-59. 실시예 I-58에 있어서, 상기 하나 이상의 비-참조 표적-유래 제약조건은 원하는 구조적, 역학적, 화학적, 또는 기능적 특징, 또는 이들의 임의의 조합을 기술하는, 방법.
실시예 I-60. 실시예 I-48 내지 I-59 중 어느 하나에 있어서, 상기 제약조건은 다음으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법:
원자 거리;
원자 요동;
원자 에너지;
화학적 기술어;
용매 노출;
아미노산 서열 유사도;
생물정보 기술어;
비공유 결합 성향;
phi 각도;
psi 각도;
반 데르 발스 반지름;
이차 구조 성향;
아미노산 인접도; 및
아미노산 접촉.
실시예 I-61. 실시예 I-48 내지 I-60 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 원자 요동인, 방법.
실시예 I-62. 실시예 I-48 내지 I-61 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 화학적 기술어인, 방법.
실시예 I-63. 실시예 I-48 내지 I-62 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 원자 거리인, 방법.
실시예 I-64. 실시예 I-48 내지 I-63 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 이차 구조인, 방법.
실시예 I-65. 실시예 I-48 내지 I-64 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 독립적으로 반 데르 발스 표면인, 방법.
실시예 I-66. 실시예 I-48 내지 I-65 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 제약조건은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 독립적으로 연관된, 방법.
실시예 I-67. 실시예 I-48 내지 I-66 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 원자를 포함하는, 방법.
실시예 I-68. 실시예 I-48 내지 I-66 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 방법
실시예 I-69. 실시예 I-66 내지 I-68 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 반응 또는 생물학적 기능은 유전자 발현, 대사 활성, 단백질 발현, 세포 증식, 세포 사멸, 사이토카인 분비, 키나아제 활성, 후성유전자 변형, 세포 사멸 활성, 염증 신호, 화학주성, 조직 침윤, 면역 세포 계통 결정(lineage commitment), 조직 미세환경 변형, 면역 시냅스 형성, IL-2 분비, IL-10 분비, 성장 인자 분비, 인터페론 감마 분비, 형질전환 성장 인자 베타 분비, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 활성, 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 활성, 항체 유도 세포 세포독성, 보체 유도 세포독성, 생물학적 경로 작용, 생물학적 경로 길항작용, 생물학적 경로 재유도, 키나아제 캐스케이드 변형, 단백질분해 경로 변형, 단백질항상성 경로 변형, 단백질 접힘/ 경로, 번역 후 변형 경로, 대사 경로, 유전자 전사/번역, mRNA 분해 경로, 유전자 메틸화/아세틸화 경로, 히스톤 변형 경로, 후성유전학적 경로, 면역 지향성 제거, 옵소닌화, 호르몬 신호전달, 인테그린 경로, 막 단백질 신호 전달, 이온 채널 플럭스, 및 g-단백질 결합 수용체 반응으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시예 I-70. 실시예 I-66에 있어서, 상기 참조 표적은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 원자를 포함하고,
생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 하나 이상의 원자의 원자 요동은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 참조 표적 내의 하나 이상의 원자의 원자 요동과 중첩되는, 방법.
실시예 I-71. 실시예 I-70에 있어서, 상기 중첩은 0.25 초과의 평균 제곱근 내적(RMSIP)인, 방법.
실시예 I-72. 실시예 I-71에 있어서, 상기 중첩은 0.75 초과의 평균 제곱근 내적(RMSIP)을 갖는, 방법.
실시예 I-73. 실시예 I-67 내지 I-69 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 상기 참조 표적 내의 이차 구조 요소에 위상적으로 제약되는, 방법.
실시예 I-74. 실시예 I-73에 있어서, 상기 이차 구조 요소는 베타-시트인, 방법.
실시예 I-75. 실시예 I-73에 있어서, 상기 이차 구조 요소는 알파 나선인, 방법.
실시예 I-76. 실시예 I-73에 있어서, 상기 이차 구조 요소는 회전이고, 여기서 상기 회전은 2 내지 7개의 잔기를 포함하고, 적어도 하나의 잔기-간 수소 결합을 포함하는, 방법.
실시예 I-77. 실시예 I-73에 있어서, 상기 이차 구조 요소는 코일이고, 상기 코일은 2 내지 20개의 잔기를 포함하는, 방법.
실시예 I-78. 실시예 I-73에 있어서, 상기 코일은 잔기-간 수소 결합을 포함하지 않는, 방법.
실시예 I-79. 실시예 I-67 내지 I-69 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 베타-시트, 알파 나선, 회전, 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2개 이상의 이차 구조 요소의 조합에 위상적으로 제약되는, 방법.
실시예 I-80. 실시예 I-48 내지 I-79 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 원자 거리인, 방법.
실시예 I-81. 실시예 I-48 내지 I-80 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 원자 에너지인, 방법.
실시예 I-82. 실시예 I-81에 있어서, 각각의 원자 에너지는 독립적으로 2개의 원자 사이의 쌍쌍 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 반발 에너지, 원자 레벨 용매화 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 하전된 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 수소 결합 인력 에너지, 또는 비공유 결합 에너지인, 방법.
실시예 I-83. 실시예 I-48 내지 I-82 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 화학적 기술어인, 방법.
실시예 I-84. 실시예 I-83에 있어서, 각각의 화학적 기술어는 독립적으로 소수성, 극성, 부피, 순 전하, logP, 고성능 액체 크로마토그래피 보유, 또는 반 데르 발스 반지름인, 방법.
실시예 I-85. 실시예 I-48 내지 I-84 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 생물정보 기술어인, 방법.
실시예 I-86. 실시예 I-85에 있어서, 각각의 생물정보 기술어는 독립적으로 BLOSUM 유사도, pKa, zScale, Cruciani Properties, Kidera Factors, VHSE-스케일, ProtFP, MS-WHIM 스코어, T-스케일, ST-스케일, 막관통 경향, 단백질 매립 면적, 나선 성향, 시트 성향, 코일 성향, 회전 성향, 면역원성 성향, 항체 에피토프 발생, 또는 단백질 계면 발생인, 방법.
실시예 I-87. 실시예 I-48 내지 I-86 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 용매 노출인, 방법.
실시예 I-88. 실시예 I-48 내지 I-87 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 GPCR 세포외 도메인인, 방법.
실시예 I-89. 실시예 I-48 내지 I-88 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 이온 채널 세포외 도메인인, 방법.
실시예 I-90. 실시예 I-48 내지 I-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 단백질-단백질 또는 펩티드-단백질 계면 접합부인, 방법.
실시예 I-91. 실시예 I-48 내지 I-90 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 상기 표적의 다형성 영역으로부터 유래되는, 방법.
실시예 I-92. 실시예 I-48 내지 I-91 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연련된 하나 이상의 원자를 포함하고, 상기 하나 이상의 원자 각각은 탄소, 산소, 질소, 수소, 황, 인, 나트륨, 칼륨, 아연, 망간, 마그네슘, 구리, 철, 몰리브덴, 및 니켈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
실시예 I-93. 실시예 I-48 내지 I-92 중 어느 하나에 있어서, 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 각각은 독립적으로 단백질원성 자연 발생 아미노산, 비-단백질원성 자연 발생 아미노산, 또는 화학적으로 합성된 비-천연 아미노산인, 방법.
실시예 I-94. 실시예 I-48 내지 I-93 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 펩티드는 상기 참조 표적과 비교했을 때 적어도 하나의 구조적 차이를 갖는, 방법.
실시예 I-95. 실시예 I-94에 있어서, 상기 적어도 하나의 구조적 차이는 서열의 차이, 아미노산 잔기의 수, 총 원자 수, 총 친수성, 총 소수성, 총 양전하, 총 음전하, 하나 이상의 이차 구조, 형상 인자, Zernike의 기술어, 반 데르 발스 표면, 구조 그래프 노드 및 가장자리, 체적 표면, 정전기 전위 표면, 소수성 전위 표면, 국소 직경, 국소 표면 특징부, 골격 모형, 전하 밀도, 친수성 밀도, 표면 대 부피 비율, 양친매성 밀도, 및 표면 조도로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법
실시예 I-96. 실시예 I-95에 있어서, 상기 하나 이상의 이차 구조에서의 차이는 상기 참조 표적과 비교하여 상기 조작된 펩티드에서 하나 이상의 추가 이차 구조 요소의 존재이고, 여기서 각각의 추가 이차 구조 요소는 알파 나선, 베타-시트, 루프, 회전 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
실시예 I-97. 실시예 I-48 내지 I-96 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산의 10% 내지 90%는 하나 이상의 비-참조 표적-유래 위상 제약조건을 충족시키는, 방법.
실시예 I-98. 실시예 I-97에 있어서, 상기 하나 이상의 비-참조 표적-유래 위상 제약조건은 미리 지정된 기능을 강화하는, 방법.
실시예 I-99. 실시예 I-98에 있어서,
비-참조 유래 위상 제약조건은 상기 펩티드의 참조 유래 분획에서 이차 구조 요소를 강화하거나 안정화시키고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 상기 펩티드의 참조 유래 분획에서 원자 요동을 강화하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 총 소수성을 변경시키고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 용해도를 변경시키고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 총 전하를 변경시키고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 표지된 또는 표지가 없는 검정에서 검출을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 시험관 내 검정에서 검출을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 생체 내 검정에서 검출을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 복합 혼합물로부터의 포획을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 효소 처리를 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 세포막 투과성을 가능하게 하고;
비-참조 유래 위상 제약조건은 이차 표적에 대한 결합을 가능하게 하고, 또는
비-참조 유래 위상 제약조건은 면역원성을 변경시키거나,
또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
실시예 I-100. 2개 이상의 선택 조종 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 여기서 각각의 폴리펩티드는 독립적으로 하나 이상의 양성 조종 특징을 포함하는 양성 선택 분자, 또는 하나 이상의 음성 조종 특징을 포함하는 음성 선택 분자이고, 여기서 각각의 특징 유형은 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고:
아미노산 서열,
폴리펩티드 이차 구조,
분자 역학,
화학적 특징,
생물학적 기능,
면역원성,
참조 표적(들) 다중특이성,
종간 참조 표적 반응성,
원하지 않는 참조 표적(들) 대비 원하는 참조 표적(들)의 선택성,
서열 및/또는 구조적으로 상동성 계열 내의 참조 표적(들)의 선택성,
유사한 단백질 기능을 갖는 참조 표적(들)의 선택성,
높은 서열 및/또는 구조적 상동성을 갖는 원하지 않는 표적의 더 큰 계열로부터 구별되는 원하는 참조 표적(들)의 선택성,
구별되는 참조 표적 대립유전자 또는 돌연변이에 대한 선택성,
구별되는 참조 표적 잔기 수준 화학적 변형에 대한 선택성,
세포 유형에 대한 선택성,
조직 유형에 대한 선택성,
조직 환경에 대한 선택성,
참조 표적(들)의 구조적 다양성에 대한 내성,
참조 표적(들) 서열 다양성에 대한 내성, 및
참조 표적(들) 역학 다양성에 대한 내성;
그리고 상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 실시예 I-1에 따른 조작된 펩티드인, 조성물.
실시예 I-101. 실시예 I-100에 있어서, 상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 양성 선택 분자이고, 상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 음성 선택 분자인, 조성물.
실시예 I-102. 실시예 I-100 또는 I-101에 있어서, 상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 천연 단백질인, 조성물.
실시예 I-103. 실시예 I-100 내지 I-102 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 공유된 특징 유형을 포함하는 적어도 한 쌍의 대응적인 양성 및 음성 선택 분자를 포함하되, 상기 양성 선택 분자는 상기 양성 특징을 포함하고 상기 음성 선택 분자는 상기 음성 특징을 포함하는, 조성물.
실시예 I-104. 실시예 I-100의 조성물로 결합 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 방법으로서, 후보 결합 분자의 풀이 적어도 1회의 선택 라운드를 거치게 하는 단계를 포함하고, 여기서 각각의 선택 라운드는:
음성 선택 분자에 대해 풀의 적어도 일부분을 스크리닝하는 음성 선택 단계; 및
양성 선택 분자에 대해 상기 풀의 적어도 일부분을 스크리닝하는 양성 선택 단계를 포함하고;
여기서 각각의 라운드 내의 선택 단계 순서, 및 라운드 순서는, 대체 순서와는 다른 풀의 서브세트를 선택하도록 하는, 방법.
실시예 I-105. 실시예 I-104에 있어서, 상기 결합 분자의 라이브러리는 파지 라이브러리인, 방법.
실시예 I-106. 실시예 I-105에 있어서, 상기 결합 분자의 라이브러리는 세포 라이브러리인, 방법.
실시예 I-107. 실시예 I-106에 있어서, 상기 결합 분자의 라이브러리는 B 세포 라이브러리인, 방법.
실시예 I-108. 실시예 I-106에 있어서, 상기 결합 분자의 라이브러리는 T 세포 라이브러리인, 방법.
실시예 I-109. 실시예 I-104 내지 I-108 중 어느 하나에 있어서, 2회 이상의 선택 라운드를 포함하는, 방법.
실시예 I-110. 실시예 I-104 내지 I-109 중 어느 하나에 있어서, 3회 이상의 선택 라운드를 포함하는, 방법.
실시예 I-111. 실시예 I-109 또는 I-110에 있어서, 각각의 라운드는 상이한 선택 분자 세트를 포함하는, 방법.
실시예 I-112. 실시예 I-109 또는 I-110에 있어서, 적어도 2개의 라운드는 동일한 음성 선택 분자, 동일한 양성 선택 분자, 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
실시예 I-113. 실시예 I-109 내지 I-112 중 어느 하나에 있어서, 다음 선택 라운드로 진행하기 전에 선택 라운드로부터 수득된 풀의 서브세트를 분석하는 단계를 포함하는, 방법.
실시예 I-114. 실시예 I-113에 있어서, 상기 서브세트 풀 분석은 하나 이상의 후속 선택 라운드에 사용되는 양성 및/또는 음성 선택 분자 세트를 결정하는, 방법.
실시예 I-115. 실시예 I-113 또는 I-114에 있어서, 각각의 서브세트 풀 분석은 펩티드/단백질 바이오센서 결합, 펩티드/단백질 ELISA, 펩티드 라이브러리 결합, 세포 추출물 결합, 세포 표면 결합, 세포 활성 검정, 세포 증식 검정, 세포 사멸 검정, 효소 활성 검정, 유전자 발현 프로파일, 단백질 변형 검정, 웨스턴 블롯, 및 면역조직화학으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
실시예 I-116. 실시예 I-113 내지 I-115 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 후속 선택 라운드에 사용되는 양성 선택 분자, 음성 선택 분자, 또는 양성 선택 분자 및 음성 선택 분자 둘 다는 서브세트 풀 분석의, 통계적 및/또는 정보적 점수화, 또는 머신 러닝 트레이닝에 의해 결정되는, 방법.
실시예 I-117. 실시예 I-109 내지 I-116 중 어느 하나에 있어서, 상기 선택 라운드로부터 수득된 서브세트 풀은 다음 선택 라운드로 이동하기 전에 변형되는, 방법.
실시예 I-118. 실시예 I-117에서, 상기 서브세트 풀 분석은 하나 이상의 후속 선택 라운드에 사용되는 양성 선택 분자, 음성 선택 분자, 또는 양성 선택 분자 및 음성 선택 분자 모두; 및 다음 선택 라운드로 이동하기 전에 상기 서브세트 풀의 변형을 결정하는, 방법.
실시예 I-119. 실시예 I-117 또는 I-118에 있어서, 각각의 변형은 유전자 돌연변이, 유전자 고갈, 유전자 강화, 화학적 변형, 및 효소적 변형으로부터 선택된 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
예
다음성 예들은 단지 예시적인 것이며, 어떤 방식으로도 본 개시의 임의의 측면을 제한하려는 것이 아니다.
예 1: 참조 표적으로서 VEGF 에피토프를 사용한 조작된 펩티드 선택
도 6a 및 도 7a에 도시된 바와 같이, VEGF의 추정 치료 에피토프를 조작된 펩티드 선택을 위한 참조 표적으로서 식별하였고, 원자 거리 및 아미노산 기술어 위상을 결정하였다(도 6b 참조). 역학 시뮬레이션을 사용하여 참조 표적의 원자 거리 및 아미노산 기술어 위상을 얻고, 참조 표적의 에피토프에 대해 원자 요동의 공분산 행렬을 생성하였다. 다음으로, 연산 단백질 설계(예: 로제타), 후보물질에 대해 수행된 역학 시뮬레이션, 및 결정된 원자 거리 및 아미노산 기술어 위상을 사용하여 상이한 조작된 펩티드 후보물질을 생성하였다(도 6c-6e 참조). 이들 위상의 이러한 평균 백분율 오차(MPE)를 비교하였다(도 6g-6h). MPE 값은: 참조 위상 대 후보 1 위상: 6.03%; 참조 위상 대 후보 2 위상: 6.00%; 및 참조 위상 대 후보 3 위상: 22.8%.
하나의 후보물질 조작된 펩티드 - 원자 요동의 평가를 위해 조합에 추가 제약조건을 추가하였다(도 6g-6h). 이 후보물질과 VEGF-유래 참조 표적 간에 더 높은 차원의 위상 유사도를 비교했을 때, MPE는 36.6%였다.
예 2: 참조 표적으로서 VEGF 에피토프를 사용한 조작된 펩티드 선택
상기 예 1에서 식별된 동일한 참조 표적을 사용하여, 제2 세트의 조작된 펩티드를 개발하였다. 조작된 펩티드 후보물질은 연산 단백질 설계(예: 로제타) 또는 펩티드 공간을 샘플링하는 다른 방법을 사용하여 생성되었고, 역학 시뮬레이션을 후보물질에 대해 수행하였다. 참조 표적 에피토프, 및 참조 표적의 에피토프 내의 잔기에 상응하는 후보물질 내의 잔기에 대해 원자 요동의 공분산 행렬을 생성하였다.
각각의 공분산 행렬에 대한 고유벡터 및 고유값---참조 표적에 대한 하나의 공분산 행렬 및 각각의 후보물질에 대한 하나의 공분산---을 연산하기 위해 주요 성분 분석을 수행하였으며 가장 큰 고유값을 가진 고유벡터 만 보유한다(도 8 참조). 고유벡터들은 시뮬레이션된 분자 구조 세트에서 관찰된 가장, 두 번째로 가장, 세 번째로 가장, N 번째로 가장 우세한 움직임을 기술한다. 만약 후보물질이 참조 에피토프처럼 이동하는 경우, 그 고유벡터는 참조 표적(에피토프)의 고유벡터와 유사할 것이다. 고유벡터의 유사도는 정렬 중인 그들의 성분(각 CA 원자에 중심을 둔 3D 벡터)에 상응하며---동일한 방향으로 가리키고 있다(도 7d-7g). 후보물질과 참조 표적 고유벡터 간의 이러한 유사도는 2개의 고유벡터의 내적을 이용하여 연산하였다. 2개의 고유벡터가 서로 90도인 경우 내적 값은 0이었고, 2개의 고유벡터가 동일한 방향을 정확하게 가리키는 경우 내적 값은 1이었다.
고유벡터의 순서는 이의 고유값에 기초하고, 분자 역학 시뮬레이션이 이들 상이한 분자의 기저 에너지 조경을 샘플링하는 확률적 성질로 인해 두 개의 상이한 분자들 간에 고유값이 반드시 동일하지 않을 수 있기 때문에, 다수의 차등적으로 순위가 매겨진 고유벡터들 사이의 내적이 필요하였다 (예, 후보물질의 고유벡터 1 x 참조 표적의 고유벡터 2, 3, 4 등등). 또한, 임의의 이론에 구속되고자 하지 않고, 분자 움직임은 복잡하며, 하나 초과(또는 몇 개 초과)의 우세/주요 움직임 모드를 포함할 수 있다.
이들 두 가지 도전과제를 해결하기 위해, 후보물질과 참조 표적의 모든 고유벡터 쌍 사이의 내적을 연산하였다. 이는 내적의 행렬을 생성하였으며, 그 차원은 분석된 고유벡터의 수에 의해 결정되었고 - 10개의 고유 벡터에 대해-, 내적의 행렬은 10 x 10이다. 이러한 내적의 행렬을 내적의 평균 제곱근 값을 연산하여 단일 값으로 증류하였다. 이는 평균 제곱근 내적(RMSIP)이다.
주 성분 분석(PCA)은 3Lx3L 차원 좌표 공분산 행렬(L은 원자 수임)을 고유벡터, Φ(참조 표적) 및 Ψ (MEM)의 세트, 및 고유값, Λ로 감소시킨다. 세트 Φ는 참조 표적에 대한 N 고유벡터 φi를 포함하고, 세트 Ψ는 MEM에 대한 N 고유벡터 Ψj를 포함하며, 이때 고유벡터들은 이들의 연관된 고유벡터들에 의해 각자의 세트로 순서가 정해진다. 가장 큰 고유값을 갖는 고유벡터는 총 좌표 공변량의 가장 큰 분획을 차지한다. 각각의 φi 및 Ψj 고유벡터의 내적은 참조 표적과 MEM 사이의 움직임의 유사도를 비교하기 위해 연산된다. φi 및 Ψj 고유벡터의 모든 내적 조합의 평균 제곱근은 참조 표적(RMSIP)에 대한 조작된 펩티드 후보물질(MEM)의 움직임의 총 유사도를 렌더링한다(도 8).
VEGF 참조 에피토프 대비 5개의 후보 조작된 펩티드로부터의 RMSIP 결과를 표 1에 나타냈다. 이들 데이터는, 참조 정적 구조 RMSD 컷오프 대비 로제타 설계를 사용하여 생성된 1000개의 후보에 대한 총 시뮬레이션으로부터 샘플링하였다. 1000개의 후보물질 중에서, XTR-1000-T0이 가장 낮은 로제타(정적 구조) 에너지(낮을수록 더 유리함)를 가졌지만, 중간 RMSIP 역학 매칭을 가졌다. 후보물질 XTR-1000-B1 및 B2는 가장 높은 역학-매칭 스코어를 가졌다 (예를 들어, 이들의 움직임은 RMSIP에 의해 연산된, 참조 표적의 움직임과 가장 근접하게 일치했음). 후보 XTR-1000-W1 및 W2는 가장 낮은 역학-매칭 스코어를 가졌는데, 이는 이 1000개의 후보 데이터 세트에서 RMSIP 역학 범위, RMSIP 범위 0.772 내지 0.545를 나타내는 것으로 나타났다. VEGF 참조 에피토프에 대해 정렬된 후보물질의 구조는 도 7b를 참조한다.
참조 에피토프 QIMRIKPHQGQHIGE
MEM 변이 ID MEM 서열 RMSIP
XTR-1000-T0 QQIM C IKPHQGQ C IGEAEEALKITAKA 0.673
XTR-1000-B1 SQIM C IKPHQGQHIGETSEDCDKAAKS 0.772
XTR-1000-B2 SQI C RIKPHQGQH C GETSEDADKAAKS 0.766
XTR-1000-W1 QQIM C IKPHQGQ C IGEAEEVYKKRKKS 0.545
XTR-1000-W2 QQIM C IKPHQGQ C IGEAEEYYTKAKRS 0.550
예 3: VEGF 추정 에피토프에 대해 조작된 펩티드를 사용한 프로그램된 시험관 내 파지 선택
예 1에 기술된 3개의 조작된 펩티드, 및 유사한 절차에 따라 개발된 추가적인 제4의 조작된 펩티드를 일련의 파지 패닝 절차에 사용하였다. 이들 펩티드는 도 9에 도시되어 있다. 펩티드 중 2개는 양성 선택 분자(uMEM 및 sMEM)였고 2개는 음성 선택 분자(iMEM2 및 iMEM1)였다. sMEM 펩티드는 고 위상 참조 매치였으며, uMEM은 저 위상 참조 매치였다. 2개의 iMEM 펩티드는 제로 위상 참조 매치였으며, 원하는 결합 상호작용 이외의 이유로 sMEM 또는 uMEM에 결합하게 될 결합 파트너에 대해 선택하기 위해 sMEM 및 uMEM의 역 버전으로 포함시켰다. 바이오센서 분석을 사용하여 비오틴-결합 펩티드를 분석한 결과 베바시주맙에 대한 결합이 확인되었으며, 이는 참조 표적에 대한 후보물질 위상의 유사도로 예측되었다.
옥텟/바이오센서 스크리닝: 상이한 조작된 펩티드들의 친화도를 단일-사이클 역학 검정 설계를 사용하여, Octet Red 384 기구에서 평가하였다. 펩티드들을 분리해서 평가하고, 비오틴 링커를 통해 바이오센서의 스트렙타비딘-코팅 팁에 고정시켰다. 나머지 개방된 스트렙타비딘 부위는 비오시틴으로 차단하였다. 분석물을 센서 팁 위로 세척하고 펩티드에 대한 분석물 내의 분자의 결합을 기록하였다. 이 검정을 위해, 분석물은 0.19 uM 내지 1.5 uM인, 베바시주맙의 연속 희석물이었다. 각각의 검정을 2회 진행하였다. 또한, 완충액(센서 드리프트를 위한 대조군) 및 인간 ND 혈청으로부터의 정제된 IgG의 별도 대조군(비특이적 IgG 결합을 위한 대조군)을 사용하여, 대조군들을 진행하였다.
7개의 상이한 패닝 프로그램을 고안하였으며, 이들 각각은 3회의 라운드를 포함하며, 각각의 라운드는 양성 선택 단계 및 음성 선택 단계를 포함한다(도 11). 각각의 프로그램은 적어도 하나의 조작된 펩티드를 선택 분자로서 사용하였다. 종래의 선택 또한 종래의 방법(비특이적 결합에 대한 양성 표적으로서 VEGF 및 음성 표적으로서 BSA)을 사용하여 포함시켰다. 3회의 패닝 후 ELISA 반응 분석을 위해 738개의 클론을 선택하였다.
패닝 프로토콜은 인간 미처리 scFv 라이브러리로 시작하였고, 선택 분자가 비오틴에 결합된(그러나 여전히 용액 내에 있음), 용액에서 패닝을 수행하였다. 각각의 라운드에 대해, 먼저 용액 속의 음성 선택 분자와 출발 풀을 합친 다음, 스트렙타비딘-코팅된 기질(예를 들어, 자성 비드)을 혼합물에 가하여 음성 선택 분자에 결합시켰다. 따라서, 음성 선택 분자에 결합된 풀 속의 임의의 파지 또한 스트렙타비딘-코팅된 지지체에 결합하였다. 나머지 용액을 제거하고, 그런 다음, 이 통과액을 양성 선택 단계로 가져갔다. 통과액을 양성 선택 분자와 합치고, 결합하게 하고, 이어서 스트렙타비딘-코팅된 고체 기질을 혼합물에 가하였다. 이 단계에서, 결합된 파지는 보유되는 반면 나머지 미결합 파지는 제거되었다. 그런 다음, 결합된 파지를 용리시켰다. 30분 배양을 사용하여 E. coli를 용리된 파지로 형질감염시키고, 차세대 시퀀싱 및 분석을 위한 DNA 단리를 위해 형질감염된 세포를 분할한 다음, 후속 패닝 라운드에 사용하기 위해 파지 증폭시켰다. 각각의 패닝 프로그램에 대해, 각각의 라운드에서 음성 선택을 먼저 수행하고, 양성 선택을 두 번째로 수행하였다.
그런 다음, 7개의 패닝 프로그램 + 종래의 패닝 방법 각각으로부터 수득된 후보 풀을, VEGF 및 sMEM 양성 선택 분자(iMEM 보정됨)에 대한 반응에 대해 ELISA를 사용하여 분석하여, 전장 VEGF 및 추정 에피토프 sMEM에 대한 결합을 평가하였다. 이들 ELISA 시험의 분석은 도 12a-12b 및 도 13a-13h에 도시되어 있다. 이 결과들은 조작된 펩티드를 사용하는 시험관 내 선택 프로그램이 전장 VEGF 결합 성향을 감소시키지 않았고, 이들이 패닝된 클론에서 추정 에피토프 선택 결합 편향을 형성했음을 입증한다. 또한 후보 풀을 베바시주맙:VEGF 결합의 차단에 대한 교차 차단 ELISA 검정에서 시험하였다(0 nM, 67 pM, 670 pM, 및 6.7 nM에서 베바시주맙과의 용량-반응적 경쟁). 이들 결과는 도 14a-14i 및 표 2에 나타나 있으며, 각 프로그램으로부터 얻어진 확인된 교차 차단 클론의 총 수가 도 15에 요약되어 있다. 이들은, 조작된 펩티드를 사용하는 프로그램 가능한 시험관 내 선택 프로그램이, 조작된 펩티드를 유도하는 데 사용된 참조 표적 에피토프를 공유하는, 베바시주맙을 교차 차단하는 전체 클론 라이브러리로부터 클론을 단리할 수 있었음을 입증한다.
클론 ID 프로그램 X-차단 반응 기울기: Rubust Z-스코어 sMEM - IMEM VEGF - IMEM (sMEM + VEGF) - IMEM 차단 성향
추정 ELISA 교차 차단제, 교차 차단 검정으로 검증
YU344-H07 S9 2159.1 43.2 229.5 276.0 2435.1
YU344-G05 S13 2055.0 17.1 44.4 61.5 2116.5
YU344-G02 S8 1742.9 21.6 125.1 147.9 1890.7
YU344-G09 S10 1430.7 15.7 126.8 142.5 1573.2
YU344-C11 S6 1326.7 29.9 165.8 198.0 1524.6
YU344-A11 S10 1378.7 19.8 57.1 77.8 1456.5
YU344-B02 S8 1326.7 19.8 67.2 87.9 1414.6
YU344-H03 S9 650.3 21.4 92.8 115.5 765.8
YU344-G06 S9 650.3 31.3 32.2 64.6 714.9
YU344-B06 S13 650.3 12.8 29.9 46.8 697.1
YU344-C04 S9 442.2 15.7 96.0 111.9 554.1
YU344-F02 S8 338.2 20.0 122.9 142.2 480.4
YU344-G10 S10 286.1 58.9 113.0 178.4 464.6
YU344-H01 S8 338.2 19.8 85.5 105.7 443.9
YU344-C05 S13 78.0 30.4 211.4 243.8 321.8
YU344-H02 S8 78.0 18.2 45.3 70.3 148.3
YU344-D05 S13 -26.0 12.8 134.7 150.4 124.4
YU344-F04 S9 26.0 16.9 47.5 64.3 90.4
추정 ELISA 교차 차단제, 교차 차단 검정으로 검증되지 않음
YU344-C02 S8 -78.0 16.6 62.4 78.6 0.5
YU344-B07 S9 -390.2 44.1 187.6 235.2 -155.0
YU344-G04 S9 -962.5 49.2 198.5 254.3 -708.2
YU344-A03 S9 -1742.9 24.1 181.2 213.3 -1529.5
YU344-G03 S9 -1846.9 40.0 204.8 250.2 -1596.7
교차 차단 거동을 나타내는 클론들을 Sanger 시퀀싱을 통해 시퀀싱하고, 11개의 구별되는 클론이 확인되는 것으로 밝혀졌다. 조작된 펩티드를 사용하여 프로그래밍된 시험관 내 선택으로부터 얻어진 것들을 표 3a에 나타냈다. VEGF 및 BSA를 이용한 종래의 선택을 통해 얻어진 것들이 표 3b에 열거되어 있다. 도 17은 추가 시험을 위해 생산된 모든 Fab에 대한 결합, 교차 차단, CDR 서열 및 생식선 사용을 요약한 것이다. 도 17 및 도 18은 표 3a 및 3B에 열거된 Fab에 대한 ELISA 결합 결과를 보여준다. 이들은 프로그래밍 가능한 시험관 내 선택이 종래의 패닝과 상이한 방식으로 항체 CDR 루프 다양성 및 Ig 생식선 사용을 조종한다는 것을 입증한다.
[표 3a]
Figure pct00008
[표 3b]
Figure pct00009
승인된 Tx mAb
베바시주맙 GYTFTNYG_INTYTGEP_AKYPHYYGSSHWYFDV QDISNY_FTS_QQYSTVPWT
라니비주맙 GYDFTHYG_INTYTGEP_AKYPYYYGTSHWYFDV QDISNY_FTS_QQYSTVPWT
선택 풀은 다음 방정식을 사용하여 점수를 매겼다:
차단 성향 = SUM(X-차단 기울기, (sMEM + VEGF) - iMEM), 이때 X-차단 기울기, sMEM 및 VEGF는 Robust Z-스코어다.
채점 근거: (Robust z-스코어에 의한) 유의한 음성 기울기를 통해, 차단 반응이 관찰되는 경우라면, 차단 성향은 VEGF 결합 및 X-차단 기울기에 대한 z-스코어의 조합이다. 차단 성향은 도 19 및 아래 표에 요약되어 있다.
상이한 프로그래밍된 선택 프로토콜 (S#)로부터 얻어진 클론 및 차단 성향 요약.
클론 ID 전략 차단 성향 클론 ID 전략 차단 성향
YU348-A12 S6 1.40 YU348-F09 S10 5.88
YU348-C12 S6 1.37 YU348-G09 S10 3.45
YU348-B12 S6 0.00 YU348-E09 S10 2.03
YU348-H11 S6 0.00 YU348-G06 S10 1.53
YU348-E12 S6 0.00 YU348-D07 S10 1.35
YU348-G04 S6 0.00 YU348-A10 S10 1.01
YU348-F04 S6 0.00 YU348-B10 S10 0.33
YU348-F12 S6 0.00 YU348-B07 S10 0.00
YU348-E04 S6 0.00 YU348-H09 S10 0.00
YU348-D12 S6 0.00 YU348-C07 S10 0.00
YU348-G11 S6 0.00 YU348-A07 S10 0.00
YU348-F11 S6 0.00 YU348-H06 S10 0.00
YU348-D01 S7 4.12 YU348-A05 S11 12.06
YU348-E01 S7 1.01 YU348-D05 S11 3.87
YU348-C01 S7 1.01 YU348-D06 S11 3.85
YU348-A01 S7 0.68 YU348-E05 S11 1.70
YU348-A11 S7 0.66 YU348-B06 S11 0.68
YU348-H10 S7 0.34 YU348-C05 S11 0.32
YU348-E10 S7 0.00 YU348-E06 S11 0.00
YU348-F10 S7 0.00 YU348-F05 S11 0.00
YU348-G10 S7 0.00 YU348-F06 S11 0.00
YU348-C10 S7 0.00 YU348-C06 S11 0.00
YU348-D10 S7 0.00 YU348-B05 S11 0.00
YU348-B01 S7 0.00 YU348-H04 S11 0.00
YU348-A04 S8 4.76 YU348-B03 S12 3.49
YU348-B09 S8 2.01 YU348-B08 S12 0.73
YU348-H01 S8 0.67 YU348-F07 S12 0.38
YU348-C09 S8 0.67 YU348-C08 S12 0.35
YU348-D11 S8 0.66 YU348-E07 S12 0.00
YU348-F01 S8 0.33 YU348-H07 S12 0.00
YU348-H08 S8 0.00 YU348-A08 S12 0.00
YU348-A02 S8 0.00 YU348-H02 S12 0.00
YU348-E11 S8 0.00 YU348-G02 S12 0.00
YU348-G01 S8 0.00 YU348-A03 S12 0.00
YU348-A09 S8 0.00 YU348-F02 S12 0.00
YU348-D09 S8 0.00 YU348-G07 S12 0.00
YU348-D04 S9 3.61 YU348-D08 S13 1.02
YU348-B04 S9 3.33 YU348-G03 S13 0.68
YU348-A06 S9 0.35 YU348-C03 S13 0.68
YU348-C04 S9 0.00 YU348-H03 S13 0.67
YU348-D02 S9 0.00 YU348-F03 S13 0.00
YU348-B02 S9 0.00 YU348-F08 S13 0.00
YU348-C11 S9 0.00 YU348-H12 S13 0.00
YU348-H05 S9 0.00 YU348-G08 S13 0.00
YU348-E02 S9 0.00 YU348-D03 S13 0.00
YU348-G05 S9 0.00 YU348-G12 S13 0.00
YU348-B11 S9 0.00 YU348-E08 S13 0.00
YU348-C02 S9 0.00 YU348-E03 S13 0.00
또한, (선택 분자로서 VEGF 및 BSA 만을 사용하는) 종래의 프로그램과 비교할 때 모든 시험관 내 선택 프로그램의 균일한 무작위 샘플링을 사용하여, 대조군(종래) 프로그램과 비교한 교차 차단 강화에 대해 상이한 선택 프로그램들을 평가하였으며, 조작된 펩티드를 사용하는 프로그램 중 적어도 4개는 강화를 나타내었고, 이는 도 20에 요약되어 있다. 교차 차단 강화에 대한 통계적 검정은 다음과 같이 Kruskal-Wallis Test였다:
1. 모든 패닝 프로그램으로부터 96-클론의 무작위 균일한 샘플링, 교차 차단 활성 측정
2. 모든 96-클론에 걸쳐 교차 차단 순위 매김
3. 프로그램별 평균 교차 차단 순위 대 대조군을 계산하기 위해 Kruskal-Wallis 검정 수행
4. X-차단 강화 = 100% * (프로그램 교차 차단 평균 순위 - 대조군 평균 순위) / (대조군 평균 순위)
클론들을 또한 차세대 시퀀싱(NGS)으로 처리하여 게놈 수준에서 CDR 루프에 관한 정보를 얻었다. 도 21은 NGS 샘플의 제조에 대한 개략도를 제공한다. 간략하게, 발현 벡터의 불변 부분에서 개별 중쇄 및 경쇄 서열을 클로닝하여 샘플을 제조하였다. 2 x 250 쌍의 말단 시퀀싱 실행을 사용하였고, 리드를 결합하고 PyIg와 같은 도구로 주석을 달았다.
2개의 고유 서열이 "클론형성능"으로 지칭되는, 시퀀싱 오류 대비, 실제로 상이한 항체인지 여부를 결정하기 위해 서열을 분석하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, 정규화된 Shannon 평가 또한 사용하였다. 각 프로그램의 각 라운드에 대한 클론형성능의 요약이 도 23에 나타나 있다.
전장 단백질(VEGF) 만을 사용하는 고전적인 패닝 접근법은 다양성에 초점을 맞추지만(프로그램 12), 조작된 펩티드로 프로그래밍된 패닝 접근법은 레퍼토리 다양성에 적어도 2X 더 효율적으로 초점을 맞춘다. 도 24a-24l은 1회차(도 24a-24d), 2회차(도 24e-24h), 및 3회차(도 24i-24l)에 대한, 상이한 스크리닝 라운드가 어떻게 생성된 선택된 풀의 다양성을 형성하는지를 분석하는 페어링 빈도 비교 및 치수 차트이다.
조작된 펩티드(MEM)-프로그램된 시험관 내 선택은, 제1 선택 라운드에서 종래의 접근법에 비해 더 높은 다양성 생식선 사용을 갖는 구별되는 항체 클로노타입을 단리한다. sMEM-기반 시험관 내 선택을 사용하면 전장 항원 및 uMEM에 비해 1 라운드에서 보다 다양한 경쇄 생식선 사용을 생성한다. MEM-기반 시험관 내 선택 프로그램은 전장 항원 대비 2 라운드에서 구별되는 중쇄 생식선 사용을 생성한다. 시험관 내 선택 프로그램에 사용된 MEM의 순서 및 정체는 중쇄 생식선 사용에 영향을 미친다. MEM-기반 시험관 내 선택 프로그램은 전장 항원 대비 2 라운드에서 구별되는 경쇄 생식선 사용을 생성한다. 시험관 내 선택 프로그램에 사용된 MEM의 순서 및 정체는 경쇄 생식선 사용에 영향을 미친다. MEM-기반 시험관 내 선택 프로그램은 전장 항원 대비 3 라운드에서 구별되고 더욱 다양한 중쇄 생식선 사용을 생성한다. 시험관 내 선택 프로그램에 사용된 MEM의 순서 및 정체는 중쇄 생식선의 사용 및 다양성에 영향을 미친다. MEM-기반 시험관 내 선택 프로그램은 전장 항원 대비 3 라운드에서 구별되고 더욱 다양한 경쇄 생식선 사용을 생성한다. 시험관 내 선택 프로그램에 사용된 MEM의 순서 및 정체는 경쇄 생식선의 사용 및 다양성에 영향을 미친다.
상이한 파지 패닝 프로그램이 Fab 히트에 초점을 맞추는 방법에 대한 요약이 도 25a 및 25b에 제공되고 있다.
도 26에 도시된 각 프로그램에 대한 패닝 라운드당 온-에피토프 (sMEM) VEGF 적중 빈도를 요약한 그래프는, 조작된 펩티드 시험관 내 선택 프로토콜이 VEGF 및 교차-차단 베바시주맙에 결합하는 것으로 확인된 고유 mAb 적중을 식별하는 것을 나타내며, 이 중 다수의 적중은 종래의 접근법에서는 식별되지 않았다. 도 27은 각 프로그램에 대한 패닝 라운드당 오프-에피토프 VEGF 적중 빈도를 요약하며, 종래의 프로그램이 VEGF에 결합하는 것으로 확인된 mAb 적중을 식별하였지만 추정 에피토프 선택성 mAb 적중은 아닌 것으로 입증한다. 도 28은 결합을 요약한 것이다.
예 4: PD-L1 치료 에피토프에 대해 조작된 펩티드를 사용한 프로그램된 시험관 내 파지 선택
PD-L1 상의 식별된 치료 에피토프 참조 표적 부위를 사용하여, 도 29-31d에 요약된 바와 같이, 일반적으로 예 2에 기술된 바와 같은 유사한 프로토콜에 따라 일련의 조작된 펩티드(MEM)를 설계하였다. 이들 3개의 조작된 펩티드, sMEM, nMEM (둘 다 양성 선택 분자) 및 iMEM (역특징을 가진 음성 선택 분자)의 능력을 바이오센서를 사용하여 2개의 항-PD-L1 아벨루맙 및 더발루맙에 대한 결합에 대해 평가하였으며(두 항체 모두 참조 표적 에피토프에 결합하는 것으로 알려짐), 데이터는 도 31a-32c에 도시되어 있다. 도 33에 도시된 바와 같이, 종래의 선택 분자 PD-L1 및 BSA를 사용하는 대조군 프로그램과 마찬가지로, 조작된 펩티드를 사용하는 일련의 5개의 상이한 패닝 프로그램을 설계하고, 파지 상에 디스플레이된 미처리 인간 Ig scFv 포맷 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용하였다. 예 3에서 상술한 바와 같은 유사한 패닝 프로토콜을 사용하였다. 각각의 패닝 프로그램에 대해, 각각의 라운드에서 음성 선택을 먼저 수행하고, 양성 선택을 두 번째로 수행하였다.
PD-L1에 대한 각 프로그램을 사용하여 선택된 결과 풀 및 상이한 조작된 펩티드의 ELISA 반응은 도 34 내지 38에 요약되어 있으며, 도 39a-39u에서 전체 ELISA 반응은 상이한 프로그램을 비교하고 있다. 선택된 풀은 또한 도 40에 요약된 바와 같이 원하는 결합 거동의 상이한 조합을 갖는 상이한 선택 필터 기준을 사용하여 분석하였다. 교차 차단 검정을 통해 추가로 취해진, ELISA 결과로부터 선택된 상이한 클론에 대한 요약이, 아래 표 2a 및 2b에 제공되어 있다.
[표 2a]
교차 차단 검정을 위한 ELISA 결과에서 선택된 항-PD-L1 패닝 클론 (전체 목록: ELISA 적중 및 대조군 포함)
Figure pct00010
[표 2a]
교차 차단 검정을 위한 ELISA 결과에서 선택된 항-PD-L1 패닝 클론 (전체 목록: ELISA 적중 및 대조군 포함)
Figure pct00011
이러한 ELISA 적중을 0 nM, 67 pM, 670 pM, 및 6.7 nM에서, 아벨루맙 또는 더발루맙과의 용량 반응 PD-L1 경쟁으로 분석하여 34개의 추정 교차 차단 클론 적중을 식별하였다. 차단 성향은 다음과 같이 계산하였다: ELISA Z-스코어 (sMEM1 + sMEM5 + PD-L1 - iMEM) + MAX(아벨루맙 차단 Z-스코어, 더발루맙 차단 Z-스코어). 결과 요약이 아래 표 3에 제공되어 있다.
[표 3]
교차 차단 ELISA 반응 및 차단 성향 요약
Figure pct00012
ELISA 반응은 도 42a-42f에 제공되어 있다. 교차 차단 적중으로부터 식별된 23개의 구별되는 클론을 (Sanger 시퀀싱을 통해) 시퀀싱하였으며, 도 43에 나열되어 있다. 패닝 프로그램을 거친 교차 차단 적중의 구별되는 클론 수에 대한 요약이 도 44에 제공되어 있다.
이러한 결과를 분석하여 시험관 내 선택 프로그램 중 어느 하나가 PD-L1:아벨루맙/더발루맙을 교차 차단하는 클론들의 무작위 선택 강화를 생성하는지 여부를 결정하였다. (PD-L1 및 BSA 만을 선택 분자로서 사용하는) 종래의 프로그램과 비교하여 모든 시험관 내 선택 프로그램의 균일한 무작위 샘플링으로부터의 클론을 사용하는 ELISA 및 교차 차단 데이터에 기초하여, 조작된 펩티드를 사용하는 프로그램 중 적어도 2개가 강화를 나타냈다. 클론들의 결과 및 요약이 도 45a-46에 도시되어 있다 (도 45c의 어두운 입력 부분은 종래의 패닝으로부터의 것이다). 다음과 같은 이론적 근거를 분석에 사용하였다: 차단 반응이 유의한 (robust z-스코어에 의한) 음성 기울기를 통해, 관찰될 경우, 차단 성향은 PD-L1, MEM 결합 및 X-차단 기울기에 대한 z-스코어들의 조합이며, 이때 사용된 X-차단 z-스코어는 더발루맙 대비 아벨루맙의 최대 z-스코어인데 이들 Tx mAb이 약간 다른 표면 상의 에피토프를 가지기 때문이다.
예 5: 조작된 펩티드 선택을 위한 머신 러닝 모델
참조 표적을 사용하여, 참조 표적 (서열)의 위상 특징을 식별하고, 스캐폴드 청사진에서 암호화한다 (도 61, 상단). 스캐폴드 청사진은, 참조 표적 내의 아미노산의 순서와 일치하도록 조작된 폴리펩티드 내의 아미노산의 서열을 제약할 수 있다. 서열 상동성은 100%로 제약되거나 (참조 표적 내의 각각의 아미노산은 청사진 내의 하나의 아미노산에 상응함), 서열 상동성이 더 낮게, 예를 들어, 10 내지 90%의 상동성으로 허용될 수도 있다. 스캐폴드 청사진은 벡터 표현으로 변환되고 (도 61, 좌측), 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합과 공간적으로-연관된 위상 특징이 중첩되는 후보 폴리펩티드를 생성하여 조작된 펩티드를 생산하는데 사용될 수 있으며, 각각의 스캐폴드 청사진은 중첩 점수에 기초하여 라벨을 할당한다 (도 61, 우측).
머신 러닝(ML) 모델은 스캐폴드 청사진의 표현 및 상응하는 스코어를 포함하는 트레이닝 데이터에 대해 트레이닝될 수 있다. 표현은, 예를 들어, 숫자들의 1차원 벡터, 영숫자 데이터의 2차원 행렬, 정규화된 숫자들의 3차원 텐서일 수 있다. 보다 구체적으로, 일부 경우에, 표현은 개입하는 스캐폴드 잔기 위치의 수의 순서화된 목록을 포함하는 벡터이다. 이러한 표현은 표적 잔기의 순서가 표적 구조로부터 추론될 수 있기 때문에 사용될 수 있으며, 따라서 표현은 표적 잔기 위치의 아미노산 정체를 식별할 필요가 없다. 스캐폴드 청사진의 스코어는, 각각의 스캐폴드 청사진에 대한 에너지 항(energy term)을 결정하는 연산 단백질 모델링 (예를 들어, 로제타 리모델러(Rosetta remodeler))을 사용하여 생성될 수 있다. 그런 다음, 연산 단백질 모델링에 의해 생성된 에너지 항에 기초하여 스코어를 계산할 수 있다.
ML 모델은, 예를 들어, 부스팅된 결정 트리 알고리즘, 결정 트리의 앙상블, 익스트림 그래디언트 부스팅(XGBoost) 모델, 랜덤 포레스트(random forest), 서포트 벡터 머신(SVM) 등일 수 있다. 일단 트레이닝되면, 이어서 ML 모델을 실행하여 스캐폴드 청사진 세트로부터 예측된 스코어 세트를 생성한다. 예측된 스코어가 원하는 스코어를 초과하는 경우, 예측된 스코어에 대응하는 스캐폴드 청사진을 연산 단백질 모델링에 의해 시뮬레이션하여 실측정(ground-truth) 스코어를 생성할 수 있다. 실측정 스코어 및 예측된 스코어를 비교하여 ML 모델의 재트레이닝을 결정할 수 있다. 일부 이식에서, 트레이닝 및 실행 단계는 원하는 스코어를 갖는 최적/개선된 스캐폴드 청사진이 예측될 때까지 도 62에 도시된 바와 같이 반복될 수 있다. 그런 다음, 최적/개선된 스캐폴드 청사진은 조작된 펩티드로 변환된다.
<110> RUBRYC THERAPEUTICS, INC. <120> MESO-SCALE ENGINEERED PEPTIDES AND METHODS OF SELECTING <130> 2021-FPA-1127 <150> US 62/855,767 <151> 2019-05-31 <160> 289 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered peptide meso-scale engineered molecule uMEM (+) <400> 1 Lys Thr Tyr Val Leu Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln 1 5 10 15 His Ile Gly Glu Val Glu Phe His Glu Gly Ser Gly Ser Gly Lys 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered peptide meso-scale engineered molecule iMEME2 (-) <400> 2 Lys Thr Tyr Val Leu Leu Thr Gln Glu Asp Ile Glu Gly Tyr Asp Thr 1 5 10 15 Tyr Tyr Lys Leu Val Glu Phe His Glu Gly Ser Gly Ser Gly Lys 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered peptide meso-scale engineered molecule sMEM (+) <400> 3 Cys Glu Ile Tyr Leu Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln 1 5 10 15 His Ile Gly Glu Val Pro Tyr Pro Cys Gly Ser Gly Ser 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RubrYc CDR 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is Ala, Gln or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is Ser, Ala, Thr or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa is Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is Asp, Ser or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) <223> Xaa is Gly, Ala or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa is Val, Trp or Tyr <400> 268 Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Ser Leu Ser Xaa Xaa Val Tyr 1 5 10 <210> 269 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional CDR 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa is Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa is Tyr or Phe <400> 269 Gln Ser Val Ser Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 270 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional CDR 2 <400> 270 Gly Ala Ser 1 <210> 271 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional CDR 3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is tyr or Trp <400> 271 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Xaa Thr 1 5 <210> 272 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Reference Epitope <400> 272 Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 1 5 10 15 <210> 273 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered peptide XTR-1000-T0 <400> 273 Gln Gln Ile Met Cys Ile Lys Pro His Gln Gly Gln Cys Ile Gly Glu 1 5 10 15 Ala Glu Glu Ala Leu Lys Ile Thr Ala Lys Ala 20 25 <210> 274 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered peptide XTR-1000-B1 <400> 274 Ser Gln Ile Met Cys Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ser Glu Asp Cys Asp Lys Ala Ala Lys Ser 20 25 <210> 275 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered peptide XTR-1000-B2 <400> 275 Ser Gln Ile Cys Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Cys Gly Glu 1 5 10 15 Thr Ser Glu Asp Ala Asp Lys Ala Ala Lys Ser 20 25 <210> 276 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered peptide XTR-1000-W1 <400> 276 Gln Gln Ile Met Cys Ile Lys Pro His Gln Gly Gln Cys Ile Gly Glu 1 5 10 15 Ala Glu Glu Val Tyr Lys Lys Arg Lys Lys Ser 20 25 <210> 277 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered peptide XTR-1000-W2 <400> 277 Gln Gln Ile Met Cys Ile Lys Pro His Gln Gly Gln Cys Ile Gly Glu 1 5 10 15 Ala Glu Glu Tyr Tyr Thr Lys Ala Lys Arg Ser 20 25 <210> 278 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bevacizumab VH CDR1 <400> 278 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 279 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bevacizumab VH CDR2 <400> 279 Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 280 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bevacizumab VH CDR3 <400> 280 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 281 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bevacizumab VL CDR1 <400> 281 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 282 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bevacizumab VL CDR2 <400> 282 Phe Thr Ser 1 <210> 283 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bevacizumab VL CDR3 <400> 283 Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 284 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ranibizumab VH CDR1 <400> 284 Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly 1 5 <210> 285 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ranibizumab VH CDR2 <400> 285 Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro 1 5 <210> 286 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ranibizumab VH CDR3 <400> 286 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 287 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ranibizumab VL CDR1 <400> 287 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 288 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ranibizumab VL CDR2 <400> 288 Phe Thr Ser 1 <210> 289 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ranibizumab VL CDR3 <400> 289 Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 1 5

Claims (119)

  1. 조작된 펩티드로서,
    상기 조작된 펩티드는 1 kDa 내지 10 kDa의 분자량을 가지고 최대 50개의 아미노산을 포함하며,
    상기 조작된 펩티드는 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 포함하고, 상기 제약조건 중 하나 이상은 참조 표적-유래 제약조건이며; 및
    상기 조작된 펩티드의 아미노산의 10% 내지 98%는 상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키고,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조 표적과 8.0 Å 미만의 골격 평균 제곱근 편차(RSMD) 구조적 상동성을 갖는 조작된 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조 표적과 10% 내지 90%의 서열 상동성을 갖는 조작된 펩티드.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조와 30 Å2 내지 3000 Å2의 반 데르 발스 표면적 중첩을 갖는 조작된 펩티드.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조합은 적어도 2개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함하는 조작된 펩티드.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조합은 적어도 5개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함하는 조작된 펩티드.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제약조건의 조합은 참조 표적으로부터 유래되지 않은 하나 이상의 제약조건을 포함하는 조작된 펩티드.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 하나 이상의 비-참조 표적-유래 제약조건은 원하는 구조적, 역학적, 화학적, 또는 기능적 특징, 또는 이들의 임의의 조합을 기술하는 조작된 펩티드.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제약조건은 다음으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 조작된 펩티드:
    원자 거리;
    원자 요동;
    원자 에너지;
    화학적 기술어;
    용매 노출;
    아미노산 서열 유사도;
    생물정보 기술어;
    비공유 결합 성향;
    phi 각도;
    psi 각도;
    반 데르 발스 반지름;
    이차 구조 성향;
    아미노산 인접도; 및
    아미노산 접촉.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 원자 요동인 조작된 펩티드.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 화학적 기술어인 조작된 펩티드.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 원자 거리인 조작된 펩티드.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 이차 구조인 조작된 펩티드.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 반 데르 발스 표면인 조작된 펩티드.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 독립적으로 연관된 조작된 펩티드.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 원자를 포함하는 조작된 펩티드.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 조작된 펩티드.
  17. 청구항 14 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 반응 또는 생물학적 기능은 유전자 발현, 대사 활성, 단백질 발현, 세포 증식, 세포 사멸, 사이토카인 분비, 키나아제 활성, 후성유전자 변형, 세포 사멸 활성, 염증 신호, 화학주성, 조직 침윤, 면역 세포 계통 결정(lineage commitment), 조직 미세환경 변형, 면역 시냅스 형성, IL-2 분비, IL-10 분비, 성장 인자 분비, 인터페론 감마 분비, 형질전환 성장 인자 베타 분비, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 활성, 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 활성, 항체 유도 세포 세포독성, 보체 유도 세포독성, 생물학적 경로 작용, 생물학적 경로 길항작용, 생물학적 경로 재유도, 키나아제 캐스케이드 변형, 단백질분해 경로 변형, 단백질항상성 경로 변형, 단백질 접힘/ 경로, 번역 후 변형 경로, 대사 경로, 유전자 전사/번역, mRNA 분해 경로, 유전자 메틸화/아세틸화 경로, 히스톤 변형 경로, 후성유전학적 경로, 면역 지향성 제거, 옵소닌화, 호르몬 신호전달, 인테그린 경로, 막 단백질 신호 전달, 이온 채널 플럭스, 및 g-단백질 결합 수용체 반응으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조작된 펩티드.
  18. 청구항 15에 있어서,
    상기 참조 표적은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 원자를 포함하고,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 하나 이상의 원자의 원자 요동은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 참조 표적 내의 하나 이상의 원자의 원자 요동과 중첩되는 조작된 펩티드.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 중첩은 0.25 초과의 평균 제곱근 내적(RMSIP)인 조작된 펩티드.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 중첩은 0.75 초과의 평균 제곱근 내적(RMSIP)을 갖는 조작된 펩티드.
  21. 청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 상기 참조 표적 내의 이차 구조 요소에 위상적으로 제약되는 조작된 펩티드.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 이차 구조 요소는 베타-시트인 조작된 펩티드.
  23. 청구항 21에 있어서,
    상기 이차 구조 요소는 알파 나선인 조작된 펩티드.
  24. 청구항 21에 있어서,
    상기 이차 구조 요소는 회전이고, 여기서 상기 회전은 2 내지 7개의 잔기를 포함하고, 적어도 하나의 잔기-간 수소 결합을 포함하는 조작된 펩티드.
  25. 청구항 21에 있어서,
    상기 이차 구조 요소는 코일이고, 상기 코일은 2 내지 20개의 잔기를 포함하는 조작된 펩티드.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 코일은 잔기-간 수소 결합을 포함하지 않는 조작된 펩티드.
  27. 청구항 21 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 베타-시트, 알파 나선, 회전, 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2개 이상의 이차 구조 요소의 조합에 위상적으로 제약되는 조작된 펩티드.
  28. 청구항 1 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 원자 거리인 조작된 펩티드.
  29. 청구항 1 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 원자 에너지인 조작된 펩티드.
  30. 청구항 29에 있어서,
    각각의 원자 에너지는 독립적으로 2개의 원자 사이의 쌍쌍 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 반발 에너지, 원자 레벨 용매화 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 하전된 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 수소 결합 인력 에너지, 또는 비공유 결합 에너지인 조작된 펩티드.
  31. 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 화학적 기술어인 조작된 펩티드.
  32. 청구항 31에 있어서,
    각각의 화학적 기술어는 독립적으로 소수성, 극성, 부피, 순 전하, logP, 고성능 액체 크로마토그래피 보유, 또는 반 데르 발스 반지름인 조작된 펩티드.
  33. 청구항 1 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 생물정보 기술어인 조작된 펩티드.
  34. 청구항 33에 있어서,
    각각의 생물정보 기술어는 독립적으로 BLOSUM 유사도, pKa, zScale, Cruciani Properties, Kidera Factors, VHSE-스케일, ProtFP, MS-WHIM 스코어, T-스케일, ST-스케일, 막관통 경향, 단백질 매립 면적, 나선 성향, 시트 성향, 코일 성향, 회전 성향, 면역원성 성향, 항체 에피토프 발생, 또는 단백질 계면 발생인 조작된 펩티드.
  35. 청구항 1 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 용매 노출인 조작된 펩티드.
  36. 청구항 1 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 GPCR 세포외 도메인인 조작된 펩티드.
  37. 청구항 1 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 이온 채널 세포외 도메인인 조작된 펩티드.
  38. 청구항 1 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 단백질-단백질 또는 펩티드-단백질 계면 접합부인 조작된 펩티드.
  39. 청구항 1 내지 청구항 38 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 상기 표적의 다형성 영역으로부터 유래되는 조작된 펩티드.
  40. 청구항 1 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연련된 하나 이상의 원자를 포함하고, 상기 하나 이상의 원자 각각은 탄소, 산소, 질소, 수소, 황, 인, 나트륨, 칼륨, 아연, 망간, 마그네슘, 구리, 철, 몰리브덴, 및 니켈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 조작된 펩티드.
  41. 청구항 1 내지 청구항 40 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 각각은 독립적으로 단백질원성 자연 발생 아미노산, 비-단백질원성 자연 발생 아미노산, 또는 화학적으로 합성된 비-천연 아미노산인 조작된 펩티드.
  42. 청구항 1 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 펩티드는 상기 참조 표적과 비교할 때 적어도 하나의 구조적 차이를 갖는 조작된 펩티드.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 적어도 하나의 구조적 차이는 서열의 차이, 아미노산 잔기의 수, 총 원자 수, 총 친수성, 총 소수성, 총 양전하, 총 음전하, 하나 이상의 이차 구조, 형상 인자, Zernike의 기술어, 반 데르 발스 표면, 구조 그래프 노드 및 가장자리, 체적 표면, 정전기 전위 표면, 소수성 전위 표면, 국소 직경, 국소 표면 특징부, 골격 모형, 전하 밀도, 친수성 밀도, 표면 대 부피 비율, 양친매성 밀도, 및 표면 조도로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 조작된 펩티드.
  44. 청구항 16에 있어서,
    상기 하나 이상의 이차 구조에서의 차이는 상기 참조 표적과 비교하여 상기 조작된 펩티드에서 하나 이상의 추가 이차 구조 요소의 존재이고, 여기서 각각의 추가 이차 구조 요소는 알파 나선, 베타-시트, 루프, 회전 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 조작된 펩티드.
  45. 청구항 1 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노산의 10% 내지 90%는 하나 이상의 비-참조 표적-유래 위상 제약조건을 충족시키는 조작된 펩티드.
  46. 청구항 45에 있어서,
    상기 하나 이상의 비-참조 표적-유래 위상 제약조건은 미리 지정된 기능을 강화하는 조작된 펩티드.
  47. 청구항 46에 있어서,
    비-참조 유래 위상 제약조건은 상기 펩티드의 참조 유래 분획에서 이차 구조 요소를 강화하거나 안정화시키고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 상기 펩티드의 참조 유래 분획에서 원자 요동을 강화하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 총 소수성을 변경시키고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 용해도를 변경시키고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 총 전하를 변경시키고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 표지된 또는 표지가 없는 검정에서 검출을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 시험관 내 검정에서 검출을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 생체 내 검정에서 검출을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 복합 혼합물로부터의 포획을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 효소 처리를 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 세포막 투과성을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 이차 표적에 대한 결합을 가능하게 하고; 및/또는
    비-참조 유래 위상 제약조건은 면역원성을 변경시키는 조작된 펩티드.
  48. 참조 표적의 하나 이상의 위상 특징을 식별하는 단계;
    각각의 위상 특징에 대해 공간적으로-연관된 제약조건을 설계해서 상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합을 생산하는 단계;
    후보 펩티드의 공간적으로-연관된 위상 특징을 상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합과 비교하는 단계; 및
    상기 참조 표적으로부터 유래된 공간적으로-연관된 위상 제약조건의 조합과 중첩되는 공간적으로-연관된 위상 특징을 갖는 후보 펩티드를 선택해서 상기 조작된 펩티드를 생산하는 단계;를 포함하는 조작된 펩티드를 선택하는 방법.
  49. 청구항 48에 있어서,
    상기 각각의 특징 사이의 중첩은 독립적으로 총 위상 제약조건 거리(Total Topological Constraint Distance, TCD), 위상 클러스터링 계수(topological clustering coefficient, TCC), 유클리드 거리(Euclidean distance), 전력 거리, 수르겔 거리(Soergel distance), 캔버라 거리(Canberra distance), 소렌슨 거리(Sorensen distance), 자카드 거리(Jaccard distance), 마할라노비스 거리(Mahalanobis distance), 해밍 거리(Hamming distance), 유사도의 정량적 추정치(Quantitative Estimate of Likeness, QEL) 또는 체인 위상 파라미터(Chain Topology Parameter, CTP) 중 하나 이상에 의해 결정되는 75% 이하의 평균 백분율 오차(MPE)인 방법.
  50. 청구항 48 또는 청구항 49에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 잔기별 에너지, 잔기별 상호작용, 잔기별 요동, 잔기별 원자 거리, 잔기별 화학 기술어, 잔기별 용매 노출, 잔기별 아미노산 서열 유사도, 잔기별 생물정보 기술어, 잔기별 비공유 결합 경향, 잔기별 phi/psi 각도, 잔기별 반 데르 발스 반지름, 잔기별 이차 구조 성향, 잔기별 아미노산 인접도, 또는 잔기별 아미노산 접촉에 관한 정보로부터 유래되는 방법.
  51. 청구항 48 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 후보 펩티드의 특징은 컴퓨터 시뮬레이션에 의해 결정되는 방법.
  52. 청구항 51에 있어서,
    상기 컴퓨터 시뮬레이션은 분자 역학 시뮬레이션, 몬테 카를로(Monte Carlo) 시뮬레이션, 거친 입자(coarse-grained) 시뮬레이션, 가우시안 네트워크 모델(Gaussian network model), 머신 러닝(machine learning), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  53. 청구항 48 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 후보 펩티드의 특징은 실험적 특징화에 의해 결정되는 방법.
  54. 청구항 48 내지 청구항 53 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조 표적과 10% 내지 90%의 서열 상동성을 갖는 방법.
  55. 청구항 48 내지 청구항 54 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건을 충족시키는 아미노산은 상기 참조와 30 Å2 내지 3000 Å2의 반 데르 발스 표면적 중첩을 갖는 방법.
  56. 청구항 48 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조합은 적어도 2개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함하는 방법.
  57. 청구항 48 내지 청구항 56 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조합은 적어도 5개의 참조 표적-유래 제약조건을 포함하는 방법.
  58. 청구항 48 내지 청구항 57 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제약조건의 조합은 참조 표적으로부터 유래되지 않은 하나 이상의 제약조건을 포함하는 방법.
  59. 청구항 58에 있어서,
    상기 하나 이상의 비-참조 표적-유래 제약조건은 원하는 구조적, 역학적, 화학적, 또는 기능적 특징, 또는 이들의 임의의 조합을 기술하는 방법.
  60. 청구항 48 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제약조건은 다음으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법:
    원자 거리;
    원자 요동;
    원자 에너지;
    화학적 기술어;
    용매 노출;
    아미노산 서열 유사도;
    생물정보 기술어;
    비공유 결합 성향;
    phi 각도;
    psi 각도;
    반 데르 발스 반지름;
    이차 구조 성향;
    아미노산 인접도; 및
    아미노산 접촉.
  61. 청구항 48 내지 청구항 60 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 원자 요동인 방법.
  62. 청구항 48 내지 청구항 61 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 화학적 기술어인 방법.
  63. 청구항 48 내지 청구항 62 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 원자 거리인 방법.
  64. 청구항 48 내지 청구항 63 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 이차 구조인 방법.
  65. 청구항 48 내지 청구항 64 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 독립적으로 반 데르 발스 표면인 방법.
  66. 청구항 48 내지 청구항 65 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 제약조건은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 독립적으로 연관된 방법.
  67. 청구항 48 내지 청구항 66 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 펩티드는 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 관련된 하나 이상의 원자를 포함하는 방법.
  68. 청구항 48 내지 청구항 66 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 펩티드는 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 방법.
  69. 청구항 66 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 반응 또는 생물학적 기능은 유전자 발현, 대사 활성, 단백질 발현, 세포 증식, 세포 사멸, 사이토카인 분비, 키나아제 활성, 후성적 변형, 세포 사멸 활성, 염증 신호, 화학주성, 조직 침윤, 면역 세포 계통 약속, 조직 미세환경 변형, 면역 시냅스 형성, IL-2 분비, IL-10 분비, 성장 인자 분비, 인터페론 감마 분비, 형질전환 성장 인자 베타 분비, 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 활성, 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 활성, 항체 유도 세포 세포독성, 보체 유도 세포독성, 생물학적 경로 작용, 생물학적 경로 길항작용, 생물학적 경로 방향전환, 키나아제 연쇄 변형, 단백질분해 경로 변형, 단백질 정체 경로 변형, 단백질 접힘/경로, 번역 후 변형 경로, 대사 경로, 유전자 전사/번역, mRNA 분해 경로, 유전자 메틸화/아세틸화 경로, 히스톤 변형 경로, 후성유전학적 경로, 면역 지향성 제거, 옵소닌화, 호르몬 신호 전달, 인테그린 경로, 막 단백질 신호 전달, 이온 채널 플럭스, 및 g-단백질 결합 수용체 반응으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  70. 청구항 66에 있어서,
    상기 참조 표적은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 하나 이상의 원자를 포함하고,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 하나 이상의 원자의 원자 요동은 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 참조 표적 내의 하나 이상의 원자의 원자 요동과 중첩되는 방법.
  71. 청구항 70에 있어서,
    상기 중첩은 0.25 초과의 평균 제곱근 내적(RMSIP)인 방법.
  72. 청구항 71에 있어서,
    상기 중첩은 0.75 초과의 평균 제곱근 내적(RMSIP)을 갖는 방법.
  73. 청구항 67 내지 청구항 69 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 상기 참조 표적 내의 이차 구조 요소에 위상적으로 제약되는 방법.
  74. 청구항 73에 있어서,
    상기 이차 구조 요소는 베타-시트인 방법.
  75. 청구항 73에 있어서,
    상기 이차 구조 요소는 알파 나선인 방법.
  76. 청구항 73에 있어서,
    상기 이차 구조 요소는 회전이고, 여기서 상기 회전은 2 내지 7개의 잔기를 포함하고, 적어도 하나의 잔기-간 수소 결합을 포함하는 방법.
  77. 청구항 73에 있어서,
    상기 이차 구조 요소는 코일이고, 상기 코일은 2 내지 20개의 잔기를 포함하는 방법.
  78. 청구항 73에 있어서,
    상기 코일은 잔기-간 수소 결합을 포함하지 않는 방법.
  79. 청구항 67 내지 청구항 69 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연관된 조작된 펩티드 내의 원자의 적어도 일부분은 베타-시트, 알파 나선, 회전, 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 2개 이상의 이차 구조 요소의 조합에 위상적으로 제약되는 방법.
  80. 청구항 48 내지 청구항 79 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 원자 거리인 방법.
  81. 청구항 48 내지 청구항 80 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 원자 에너지인 방법.
  82. 청구항 81에 있어서,
    각각의 원자 에너지는 독립적으로 2개의 원자 사이의 쌍쌍 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 반발 에너지, 원자 레벨 용매화 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 하전된 인력 에너지, 2개의 원자 사이의 쌍쌍 수소 결합 인력 에너지, 또는 비공유 결합 에너지인 방법.
  83. 청구항 48 내지 청구항 82 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 화학적 기술어인 방법.
  84. 청구항 83에 있어서,
    각각의 화학적 기술어는 독립적으로 소수성, 극성, 부피, 순 전하, logP, 고성능 액체 크로마토그래피 보유, 또는 반 데르 발스 반지름인 방법.
  85. 청구항 48 내지 청구항 84 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 생물정보 기술어인 방법.
  86. 청구항 85에 있어서,
    각각의 생물정보 기술어는 독립적으로 BLOSUM 유사도, pKa, zScale, Cruciani Properties, Kidera Factors, VHSE-스케일, ProtFP, MS-WHIM 스코어, T-스케일, ST-스케일, 막관통 경향, 단백질 매립 면적, 나선 성향, 시트 성향, 코일 성향, 회전 성향, 면역원성 성향, 항체 에피토프 발생, 또는 단백질 계면 발생인 방법.
  87. 청구항 48 내지 청구항 86 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 공간적으로-연관된 위상 제약조건은 용매 노출인 방법.
  88. 청구항 48 내지 청구항 87 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 GPCR 세포외 도메인인 방법.
  89. 청구항 48 내지 청구항 88 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 이온 채널 세포외 도메인인 방법.
  90. 청구항 48 내지 청구항 89 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 단백질-단백질 또는 펩티드-단백질 계면 접합부인 방법.
  91. 청구항 48 내지 청구항 90 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 참조 표적-유래 제약조건 중 적어도 하나는 상기 표적의 다형성 영역으로부터 유래되는 방법.
  92. 청구항 48 내지 청구항 91 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 펩티드는 생물학적 반응 또는 생물학적 기능과 연련된 하나 이상의 원자를 포함하고, 상기 하나 이상의 원자 각각은 탄소, 산소, 질소, 수소, 황, 인, 나트륨, 칼륨, 아연, 망간, 마그네슘, 구리, 철, 몰리브덴, 및 니켈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  93. 청구항 48 내지 청구항 92 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 펩티드는 생물학적 기능 또는 생물학적 반응과 연관된 하나 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 각각은 독립적으로 단백질원성 자연 발생 아미노산, 비-단백질원성 자연 발생 아미노산, 또는 화학적으로 합성된 비-천연 아미노산인 방법.
  94. 청구항 48 내지 청구항 93 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 펩티드는 상기 참조 표적과 비교할 때 적어도 하나의 구조적 차이를 갖는 방법.
  95. 청구항 94에 있어서,
    상기 적어도 하나의 구조적 차이는 서열의 차이, 아미노산 잔기의 수, 총 원자 수, 총 친수성, 총 소수성, 총 양전하, 총 음전하, 하나 이상의 이차 구조, 형상 인자, Zernike의 기술어, 반 데르 발스 표면, 구조 그래프 노드 및 가장자리, 체적 표면, 정전기 전위 표면, 소수성 전위 표면, 국소 직경, 국소 표면 특징부, 골격 모형, 전하 밀도, 친수성 밀도, 표면 대 부피 비율, 양친매성 밀도, 및 표면 조도로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  96. 청구항 95에 있어서,
    상기 하나 이상의 이차 구조에서의 차이는 상기 참조 표적과 비교하여 상기 조작된 펩티드에서 하나 이상의 추가 이차 구조 요소의 존재이고, 여기서 각각의 추가 이차 구조 요소는 알파 나선, 베타-시트, 루프, 회전 및 코일로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  97. 청구항 48 내지 청구항 96 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 펩티드의 아미노산의 10% 내지 90%는 하나 이상의 비-참조 표적-유래 위상 제약조건을 충족시키는 방법.
  98. 청구항 97에 있어서,
    상기 하나 이상의 비-참조 표적-유래 위상 제약조건은 미리 지정된 기능을 강화하는 방법.
  99. 청구항 98에 있어서,
    비-참조 유래 위상 제약조건은 상기 펩티드의 참조 유래 분획에서 이차 구조 요소를 강화하거나 안정화시키고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 상기 펩티드의 참조 유래 분획에서 원자 요동을 강화하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 총 소수성을 변경시키고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 용해도를 변경시키고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 펩티드 총 전하를 변경시키고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 표지된 또는 표지가 없는 검정에서 검출을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 시험관 내 검정에서 검출을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 생체 내 검정에서 검출을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 복합 혼합물로부터의 포획을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 효소 처리를 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 세포막 투과성을 가능하게 하고;
    비-참조 유래 위상 제약조건은 이차 표적에 대한 결합을 가능하게 하고, 또는
    비-참조 유래 위상 제약조건은 면역원성을 변경시키거나,
    또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  100. 2개 이상의 선택 조종 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서,
    각각의 폴리펩티드는 독립적으로 하나 이상의 양성 조종 특징을 포함하는 양성 선택 분자, 또는 하나 이상의 음성 조종 특징을 포함하는 음성 선택 분자이고, 여기서 각각의 특징 유형은 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고:
    아미노산 서열,
    폴리펩티드 이차 구조,
    분자 역학,
    화학적 특징,
    생물학적 기능,
    면역원성,
    참조 표적(들) 다중특이성,
    종간 참조 표적 반응성,
    원하지 않는 참조 표적(들) 대비 원하는 참조 표적(들)의 선택성,
    서열 및/또는 구조적으로 상동성 계열 내의 참조 표적(들)의 선택성,
    유사한 단백질 기능을 갖는 참조 표적(들)의 선택성,
    높은 서열 및/또는 구조적 상동성을 갖는 원하지 않는 표적의 더 큰 계열로부터 구별되는 원하는 참조 표적(들)의 선택성,
    구별되는 참조 표적 대립유전자 또는 돌연변이에 대한 선택성,
    구별되는 참조 표적 잔기 수준 화학적 변형에 대한 선택성,
    세포 유형에 대한 선택성,
    조직 유형에 대한 선택성,
    조직 환경에 대한 선택성,
    참조 표적(들)의 구조적 다양성에 대한 내성,
    참조 표적(들) 서열 다양성에 대한 내성, 및
    참조 표적(들) 역학 다양성에 대한 내성;
    그리고 상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 청구항 1에 따른 조작된 펩티드인 조성물.
  101. 청구항 100에 있어서,
    상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 양성 선택 분자이고, 상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 음성 선택 분자인 조성물.
  102. 청구항 100 또는 청구항 101에 있어서,
    상기 2개 이상의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 천연 단백질인 조성물.
  103. 청구항 100 내지 청구항 102 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 공유된 특징 유형을 포함하는 적어도 한 쌍의 대응적인 양성 및 음성 선택 분자를 포함하며, 상기 양성 선택 분자는 상기 양성 특징을 포함하고 상기 음성 선택 분자는 상기 음성 특징을 포함하는 조성물.
  104. 후보 결합 분자의 풀이 적어도 1회의 선택 라운드를 거치게 하는 단계를 포함하는 청구항 100의 조성물로 결합 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 방법으로서,
    각각의 선택 라운드는:
    음성 선택 분자에 대해 상기 풀의 적어도 일부분을 스크리닝하는 음성 선택 단계; 및
    양성 선택 분자에 대해 상기 풀의 적어도 일부분을 스크리닝하는 양성 선택 단계;를 포함하고;
    여기서 각각의 라운드 내의 선택 단계 순서, 및 라운드 순서는 대체 순서와는 다른 풀의 서브세트를 선택하도록 하는 방법.
  105. 청구항 104에 있어서,
    상기 결합 분자의 라이브러리는 파지 라이브러리인 방법.
  106. 청구항 105에 있어서,
    상기 결합 분자의 라이브러리는 세포 라이브러리인 방법.
  107. 청구항 106에 있어서,
    상기 결합 분자의 라이브러리는 B 세포 라이브러리인 방법.
  108. 청구항 106에 있어서,
    상기 결합 분자의 라이브러리는 T 세포 라이브러리인 방법.
  109. 청구항 104 내지 청구항 108 중 어느 한 항에 있어서,
    2회 이상의 선택 라운드를 포함하는 방법.
  110. 청구항 104 내지 청구항 109 중 어느 한 항에 있어서,
    3회 이상의 선택 라운드를 포함하는 방법.
  111. 청구항 109 또는 청구항 110에 있어서,
    각각의 라운드는 상이한 선택 분자 세트를 포함하는 방법.
  112. 청구항 109 또는 청구항 110에 있어서,
    적어도 2개의 라운드는 동일한 음성 선택 분자, 동일한 양성 선택 분자, 또는 둘 다를 포함하는 방법.
  113. 청구항 109 내지 청구항 112 중 어느 한 항에 있어서,
    다음 선택 라운드로 진행하기 전에 선택 라운드로부터 수득된 풀의 서브세트를 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  114. 청구항 113에 있어서,
    상기 서브세트 풀 분석은 하나 이상의 후속 선택 라운드에 사용되는 양성 및/또는 음성 선택 분자 세트를 결정하는 방법.
  115. 청구항 113 또는 청구항 114에 있어서,
    각각의 서브세트 풀 분석은 펩티드/단백질 바이오센서 결합, 펩티드/단백질 ELISA, 펩티드 라이브러리 결합, 세포 추출물 결합, 세포 표면 결합, 세포 활성 검정, 세포 증식 검정, 세포 사멸 검정, 효소 활성 검정, 유전자 발현 프로파일, 단백질 변형 검정, 웨스턴 블롯, 및 면역조직화학으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  116. 청구항 113 내지 청구항 115 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 후속 선택 라운드에 사용되는 양성 선택 분자, 음성 선택 분자, 또는 양성 선택 분자 및 음성 선택 분자 둘 다는 서브세트 풀 분석의, 통계적 및/또는 정보적 점수화, 또는 머신 러닝 트레이닝에 의해 결정되는 방법.
  117. 청구항 109 내지 청구항 116 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 라운드로부터 수득된 서브세트 풀은 다음 선택 라운드로 이동하기 전에 변형되는 방법.
  118. 청구항 117에 있어서,
    상기 서브세트 풀 분석은 하나 이상의 후속 선택 라운드에 사용되는 양성 선택 분자, 음성 선택 분자, 또는 양성 선택 분자 및 음성 선택 분자 모두; 및 다음 선택 라운드로 이동하기 전에 상기 서브세트 풀의 변형을 결정하는 방법.
  119. 청구항 117 또는 청구항 118에 있어서,
    각각의 변형은 유전자 돌연변이, 유전자 고갈, 유전자 강화, 화학적 변형, 및 효소적 변형으로부터 선택된 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
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