JP2022535511A - メソスケール操作されたペプチドおよび選択方法 - Google Patents

メソスケール操作されたペプチドおよび選択方法 Download PDF

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Abstract

空間的に関連する位相的制約の組み合わせを含む操作されたペプチド（少なくとも１つの制約は、参照標的に由来する）、および当該操作されたペプチドを選択する方法が本明細書に提供される。結合分子のライブラリをスクリーニングする方法における正および／または負の選択分子としてを含む、操作されたペプチドを使用する方法がさらに提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月３１日に出願され、「メソスケール操作されたペプチドおよび選択方法」と題する米国特許出願第６２／８５５，７６７号の優先権および利益を主張するものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
治療の場における基礎研究の大部分は、新しいペプチド治療薬または新しいペプチド免疫原（それから新しい治療抗体を開発するための）など、望ましい特性を有する新規の分子の特定および開発に向けられる。しかしながら、標準的な分子発見パラダイムは、有望な機能的分子を特定するために、確率過程を使用するランダムサンプリングに依存する。次いで、これらの分子候補は、特定の使用に対して所望の活性、機能、薬物動態、および／または他の必要な特性を有することを期待して、複数回の評価および試験に通される。このシステムは、ランダムな群のスクリーニングから始まり、多くの場合、１つ以上の必要な特性が満たされず、失敗に終わる。したがって、必要とされるのは、計算、化学、および生物学の設計の要素を組み込む操作されたペプチドを開発する方法である。
いくつかの態様では、操作されたペプチドが本明細書に提供され、操作されたペプチドは、１ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有し、最大５０個のアミノ酸を含み、空間的に関連する位相的制約の組み合わせを含み、制約のうちの１つ以上は、参照標的由来の制約であり、操作されたペプチドのアミノ酸の１０％～９８％が、１つ以上の参照標的由来の制約を満たし、１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸は、参照標的と８．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）構造相同性を有する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸は、参照標的と１０％～９０％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、それらは、３０Å２～３０００Å２の基準とのファンデルワールス表面積重複を有する。特定の実施形態では、組み合わせは、少なくとも２つ、または少なくとも５つの参照標的由来の制約を含む。いくつかの実施形態では、制約の組み合わせは、参照標的に由来しない１つ以上の制約を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非参照標的由来の制約は、所望の構造的、動力学的、化学的、もしくは機能的な特性、またはそれらの任意の組み合わせを記述する。なおさらなる実施形態では、１つ以上の制約は、独立して、生物学的応答または生物学的機能に関連している。いくつかの実施形態では、生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の原子の少なくとも一部分は、ベータ－シートまたはアルファヘリックスなど、参照標的中の二次構造要素に位相的に制約される。
他の態様では、操作されたペプチドを選択する方法が本明細書に提供され、方法は、
参照標的の１つ以上の位相的特性を特定することと、
参照標的に由来する空間的に関連する位相的制約の組み合わせを生成するように、各位相的特性に対して空間的に関連する制約を設計することと、
候補ペプチドの空間的に関連する位相的特性を、参照標的に由来する空間的に関連する位相的制約の組み合わせと比較することと、
参照標的に由来する空間的に関連する位相的制約の組み合わせと重複する、空間的に関連する位相的特性を有する候補ペプチドを選択して、操作されたペプチドを生成することと、を含む。
いくつかの実施形態では、各特性間の重複は、独立して、総位相的制約距離（ＴＣＤ）、位相的クラスタリング係数（ＴＣＣ）、ユークリッド距離、パワー距離、ソアーゲル距離、キャンベラ距離、ソーレンセン距離、ジャッカード距離、マハラノビス距離、ハミング距離、らしさの定量的評価（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｅｓｔｉｍａｔｅ ｏｆ Ｌｉｋｅｎｅｓｓ、ＱＥＬ）、または鎖位相パラメータ（ＣＴＰ）のうちの１つ以上によって決定されるとき、７５％以下の平均誤差率（ＭＰＥ）である。特定の実施形態では、１つ以上の制約は、残基当たりのエネルギー、残基当たりの相互作用、残基当たりの変動、残基当たりの原子間距離、残基当たりの化学記述子、残基当たりの溶媒曝露、残基当たりのアミノ酸配列類似性、残基当たりの生物情報記述子、残基当たりの非共有結合傾向、残基あたりファイ／プサイ角、残基当たりのファンデルワールス半径、残基当たりの二次構造傾向、残基当たりのアミノ酸隣接性、または残基当たりのアミノ酸接触に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の候補ペプチドの特性は、コンピュータシミュレーションによって決定される。なおさらなる実施形態では、１つ以上の制約は、独立して、生物学的応答または生物学的機能に関連している。いくつかの実施形態では、生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の原子の少なくとも一部分は、ベータ－シートまたはアルファヘリックスなど、参照標的中の二次構造要素に位相的に制約される。
なおさらなる態様では、２つ以上の選択誘導ポリペプチドを含む組成物が本明細書に提供され、各ポリペプチドは、独立して、１つ以上の正の誘導特性を含む正の選択分子、または１つ以上の負の誘導特性を含む負の選択分子であり、各特性タイプは、独立して、アミノ酸配列、ポリペプチド二次構造、分子動力学、化学的特徴、生物学的機能、免疫原性、参照標的（複数可）の多重特異性、異種間参照標的反応性、望ましくない参照標的（複数可）に対する所望の参照標的（複数可）の選択性、配列および／または構造的に相同なファミリー内の参照標的（複数可）の選択性、類似のタンパク質機能を有する参照標的（複数可）の選択性、高配列および／または構造的に相同性を有する望ましくない標的のより大きいファミリーからの、別個の所望の参照標的（複数可）の選択性、別個の参照標的対立遺伝子または変異に対する選択性、別個の参照標的残基レベルの化学修飾に対する選択性、細胞型に対する選択性、組織型に対する選択性、組織環境に対する選択性、参照標的（複数可）の構造多様性に対する耐性、参照標的（複数可）の配列多様性に対する耐性、ならびに参照標的（複数可）の動態多様性に対する耐性からなる群から選択され、２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つは、本明細書に記載される操作されたペプチドである。
いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つは、正の選択分子であり、２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つは、負の選択分子である。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つは、天然タンパク質である。特定の実施形態では、少なくとも１つの共有の特性タイプを含む、対応する正の選択分子および負の選択分子の少なくとも１つの対であり、正の選択分子は、正の特性を含み、負の選択分子は、負の特性を含む。
さらに追加の態様では、本明細書に記載される２つ以上の選択誘導分子を含む組成物を用いて、結合分子のライブラリをスクリーニングする方法が本明細書に提供され、方法は、候補結合分子のプールを少なくとも１回の選択ラウンドに供することを含み、各選択ラウンドは、
プールの少なくとも一部分を負の選択分子に不利に、スクリーニングする負の選択ステップと、
プールの少なくとも一部分を正の選択分子に有利に、スクリーニングする正の選択ステップと、を含み、
各ラウンド内の選択ステップの順序、およびラウンドの順序は、代替の順序とは異なるプールのサブセットの選択をもたらす。
いくつかの実施形態では、結合分子のライブラリは、ファージライブラリ、またはＢ細胞ライブラリもしくはＴ細胞ライブラリなどの細胞ライブラリである。いくつかの実施形態では、方法は、２回以上の選択ラウンドまたは３回以上の選択ラウンドを含む。特定の実施形態では、各ラウンドは、異なる選択分子のセットを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２ラウンドが、同じ負の選択分子、または同じ正の選択分子、またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、次の選択ラウンドに進む前に、ある選択ラウンドから得られたプールのサブセットを分析することを含む。
特許または出願ファイルは、カラーで作成される少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求して必要な料金を支払えば特許庁によって提供される。本出願は、添付図面と併せて以下の説明を参照することによって理解され得る。
図１は、本明細書に記載される操作されたペプチドの選択で使用するための、３つの空間的に関連する位相的制約の例示的な組み合わせの構築を示す概略図を提供する。
図２は、参照由来の空間的に関連する位相的制約を決定するためのいくつかの例示的方法に関与するステップ、および操作されたペプチド（メソスケール分子、ＭＥＭ）の選択におけるそれらの使用の概略図を提供する。
図３Ａ～３Ｃは、本明細書に記載される方法を使用した、操作されたペプチドの群の選択を示す概略図を提供する。図３Ａは、参照における対象となる界面に関する空間的に関連する位相情報の抽出、および操作されたペプチドの選択で使用するための位相的制約の定義におけるその使用を示す。 図３Ｂは、インシリコスクリーンステップを詳述する概略図を提供し、位相に一致する候補が保持される一方で、不一致の候補がどのように破棄されるかを示す。 図３Ｃは、特定された上位１２個の候補の操作されたペプチドを示す。
図４Ａ～４Ｂは、本明細書に記載される方法を使用した、異なる参照パラメータのセットに基づく、異なる操作されたペプチドの群の選択を示す、第２の概略図のセットを提供する。図４Ａは、空間的に関連する位相情報の抽出、および位相行列の構築を示す。 図４Ｂは、候補を位相的制約とインシリコで比較することによって選択された、上位８つの候補の操作されたペプチドのリストを提供する。
図５は、本明細書に記載される操作されたペプチドを使用し、かつ天然タンパク質も正（Ｔ）または負（Ｘ）の選択分子として使用した、例示的なプログラム可能なインビトロ選択の設計の概要を示す概略図である。
図６Ａ～６Ｈは、５つの操作されたペプチドの選択、およびファージパニングのためのプログラム可能なインビトロ選択プロトコルにおけるそれらの使用の概要を提供する。図６Ａは、参照標的としてのＶＥＧＦの選択、および空間的に関連する位相情報が由来し、空間的に関連する位相的制約の組み合わせを構築するために使用されるＶＥＧＦの部分の特定を示す（ステップ１）。次いで、この組み合わせを、候補の操作されたペプチドのインシリコスクリーニングに使用して、正の選択分子および負の選択分子を特定した（ステップ２）。選択された候補を、架橋選択肢を安定化するためにインシリコでさらにスクリーニングした。特定され、安定化した操作されたペプチドが得られると、次いで、それらを使用して、ファージパニングのためのプログラム可能なインビトロ選択プロトコルを構築した。 図６Ｂは、操作されたペプチドの選択で使用される参照標的（ＶＥＧＦの一部分）に基づく、空間的に関連する位相的制約の分析および特定を示す。 図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅは、第１、第２、および第３の候補の操作されたペプチドのそれぞれの構築、ならびに図６Ｂで作成された制約の組み合わせと比較するためのパラメータの導出を示す。 同上 同上 図６Ｆは、参照標的と比較した各ＭＥＭの平均誤差率（ＭＰＥ）、およびＭＰＥに基づくそれらのランクを列挙する。 図６Ｇは、参照標的に基づいて、追加の制約セットがどのように組み合わせに追加されたかを示す。 図６Ｈ中、この追加の制約セットは、候補ＭＥＭ１を評価するために使用される。この比較のＭＰＥは、３６．６％であった。
図７Ａは、ＶＥＧＦのリボンダイアグラムであり、参照セクションを使用して、操作されたペプチドを選択する（Ｒ８２－Ｈ９０）。図７Ｂは、図７Ａの標的参照から作成された制約に基づき選択された、５つの候補の操作されたペプチドのリボンダイアグラムである。配列および二乗平均平方根ＲＭＳＩＰを表１に列挙する。 図７Ｄは、参照標的中のエピトープの２つの最も主要な運動を記述する２つの固有ベクトルを示し、エピトープ中の１０個のＣａ原子のｘ、ｙ、およびｚ成分、ならびに固有ベクトルの固有値を集計し、構造は、固有ベクトル１（矢印）および固有ベクトル２（矢印）に沿ったエピトープ中の各Ｃａ原子の投影を示す。固有ベクトルは、定義によって正規直交である。 図７Ｅは、参照標的（左）およびＭＥＭ（右）のエピトープ中の最も主要な運動（モード）を記述する固有ベクトルである。エピトープ上に重ね合わされたＭＥＭの構造が、ＭＥＭバリアントＩＤおよびＲＭＳＩＰとともに示される。 図７Ｆは、参照標的（左）およびＭＥＭ（右）のエピトープ中の２番目に主要な運動（モード）を記述する固有ベクトルを提供する。エピトープ上に重ね合わされたＭＥＭの構造が、ＭＥＭバリアントＩＤおよびＲＭＳＩＰとともに示される。 図７Ｇは、３つの最も主要な運動（モード、固有ベクトル１～３）に沿った関連する投影を伴う参照標的およびＭＥＭの構造を、ＲＭＳＩＰをコンピュータ計算するために使用される内積行列内のそれらの位置に関連して提供する。使用したＲＭＳＩＰ方程式が参照のために示される。
図８は、実験データまたはコンピュータシミュレーションから生成された、参照標的（上）およびＭＥＭ（下）の構造アンサンブルおよび座標共分散行列を示す。エピトープは、参照標的の右上にあるより暗い部分である。
図９は、正または負の選択のための４つの操作されたペプチド（メソスケール操作された分子、またはＭＥＭとも呼ばれる）を使用した、インビトロでプログラム可能な選択設計の概要である。ＭＥＭの原子運動および位相スコアが参照のために含まれる。配列は、配列番号１～４として提供される。
図１０Ａ～Ｄは、ベバシズマブに対する図９からの異なる操作されたペプチドを使用した結合バイオセンサーアッセイのグラフである。 同上
図１１は、８つの異なるパニングプログラムの記述であり、７つは、操作されたペプチドを１つ以上の選択分子として含み、８つのプログラムは、従来の天然タンパク質を選択のために使用する。ナイーブなＨｕ ｓｃＦＶライブラリを、各プログラムで別々にパンした。
図１２Ａおよび１２Ｂは、図１１に記載される異なるパニングプログラムを使用して選択された結合パートナーに対するＶＥＧＦ結合応答を比較する、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ応答グラフである。図１２Ａに示されるように、ＭＥＭがプログラムされたインビトロ選択は、すべての入力ではなく、特定のＭＥＭプログラム入力で、完全長標的結合傾向を著しく低減しない。横棒は、平均を示し、Ｐ１２とＰ７との間の有意差：ｐ値は、０．０００１未満である。 図１２Ｂに示されるように、ＭＥＭがプログラムされたインビトロ選択は、統計的に有意な様式で推定のエピトープ選択的クローンに向けられる。横棒は、平均を示し、Ｐ１２対Ｐ６：ｐ値は、０．０２４であり、Ｐ１２対Ｐ９：ｐ値は、０．０００４であり、Ｐ１２対Ｐ１０：ｐ値は、０．０４９である。
図１３Ａ～１３Ｈは、図１１に記載される異なるパニングプログラムを使用して選択された結合パートナーの、ｓＭＥＭ操作されたペプチド対ＶＥＧＦ（参照）との結合を示すグラフである。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図１４Ａ～１４Ｉは、ベバシズマブ（０ｎＭ、６７ｐＭ、６７０ｐＭ、６．７ｎＭ）での用量反応性競合を用いたＶＥＧＦの交差遮断アッセイにおける、図１１に記載される異なるパニングプログラムを使用して選択された結合パートナーの結合を示すグラフである。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図１５は、図１１で概説される異なる選択プログラムの各々から得られた、確認された交差遮断特性を有する別個のクローンのグラフである。
図１６は、図１１で概説される選択プログラムから生成されたすべてのＦａｂについての結合、交差遮断、ＣＤＲ配列、および生殖細胞系列使用の要約である。
図１７および図１８は、図１７に列挙されるＦａｂのすべてについてのＥＬＩＳＡ結合結果である。 同上
図１９は、ランダムクローン対図１１で概説される選択プログラムから選択されるものに対する、ベバシズマブ遮断傾向スコアを示す（０ｎＭ、６７ｐＭ、６７０ｐＭ、６．７ｎＭ）。ＥＬＩＳＡ Ｚスコア（ｓＭＥＭ＋ＶＥＧＦ－ｉＭＥＭ）＋ベバシズマブ遮断Ｚスコア。
図２０は、図１１に記載されるパニングプログラム全体からのクローンのランダム－均一選択のための交差遮断濃縮を要約する。
図２１は、選択されたクローンの次世代シーケンシングサンプルがどのように調製されたかを示す概略図である。発現ベクターの定常部分における個々の重鎖配列および軽鎖配列を、２×２５０のペアエンドシーケンシングランを使用してクローニングした。次いで、末端を結合し、読み取りに注釈を付けた（例えば、ＰｙＩｇを使用して）。各選択プログラムを使用して選択されたクローンから得られた読み取りは、棒グラフに示される。
図２２は、異なるパニングラウンドのクローン性分析（別個の抗体の数）、および正規化シャノン分析を示す。
図２３は、図１１に記載される異なるスクリーニングプログラムのクローン性を示す。
図２４Ａ～２４Ｌは、ラウンド１（図２４Ａ～２４Ｄ）、ラウンド２（図２４Ｅ～２４Ｈ）、およびラウンド３（図２４Ｉ～２４Ｌ）のための異なるスクリーニングラウンドおよびプログラムが、結果として生じる選択されたプールの多様性をどのように形作るかを分析する、生殖細胞系列使用ヒートマップおよび次元削減プロットである。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図２５Ａ～２５Ｂは、各選択プログラムから単離されたクローン（ｘ軸のＳ＃）、ならびにＶＥＧＦおよび操作されたペプチドｓＭＥＭへのそれらの結合を要約する。 同上
図２６は、ＶＥＧＦに結合し、ベバシズマブを交差遮断することが確認され、かつ操作されたペプチドを使用しない従来のパニング（プログラム１２）では特定されなかった、各プログラムの各ラウンドから得られた固有のｍＡｂヒットの濃縮速度の要約である。
図２７は、ＶＥＧＦに結合することが確認されたが、推定のエピトープ選択的ｍＡｂヒットではない、従来のパニングプログラム（１２）から得られたｍＡｂヒットの濃縮速度の要約である。
図２８は、異なるパニングプログラムから得られた異なるクローンのｓＭＥＭまたはＶＥＧＦへの結合を要約する。
図２９は、ＰＤ－Ｌ１上の提案された治療用エピトープ参照部位を標的とする、プログラムされたインビトロ選択プロトコルの第２の例示的なセットの概略図である。空間的に関連する位相的制約は、この推定部位に由来し、組み合わせ、制約の組み合わせと重複する特性を有した操作されたペプチドについて、インシリコでスクリーニングするために使用した。次いで、これらを、ナイーブなＨｕ ｓｃＦｖライブラリのファージパニングにおける選択ラウンドで使用した。
図３０は、図２９の概略図に従って選択された３つの操作されたペプチドのモデリングされた構造およびペプチド配列を提供する。配列は、配列番号５～７として提供される。
図３１Ａ～３１Ｄは、参照（図３１Ａ）、ならびに操作されたペプチドｓＭＥＭ（図３１Ｂ）、ｎＭＥＭ（図３１Ｃ）、およびｉＭＥＭ（図３１Ｄ）に由来する原子間距離およびアミノ酸記述子行列である。参照位相と比較すると、ｓＭＥＭ、ｎＭＥＭ、およびｉＭＥＭ位相の平均誤差率は、それぞれ、３．５８％、０．８４％、および１９．３％であった。 同上 同上 同上
図３１Ｅ～３１Ｇは、図３０に記載される操作されたペプチドとアベルマブとの間の結合を示すバイオセンサー結合グラフである。アベルマブとのｎＭＥＭ結合のＫＤは、４３．４ｕＭであった。 同上 同上
図３２Ａ～３２Ｃは、図３０に記載される操作されたペプチドとデュルバルマブとの間の結合を示すバイオセンサー結合グラフである。 同上 同上
図３３は、図３０に記載される操作されたペプチドのうちの１つ以上を使用した、プログラムされたインビトロ選択パニングプログラム、および天然タンパク質（Ｃ１）を使用した従来のパニング方法の差の要約である。図３０中の操作されたペプチドｓＭＥＭ、ｎＭＥＭ、およびｉＭＥＭは、図３３のｓＭＥＭ ＃１、ｓＭＥＭ ＃５、およびｉＭＥＭである。
図３４は、図３３に記載される各パニングプログラムを使用して選択されたクローンについての、ＰＤ－Ｌ１ ＥＬＩＳＡ結合応答のグラフおよび要約である。
図３５は、図３３に記載される各パニングプログラムを使用して選択されたクローンについての、ｓＭＥＭ ＃１に対するＥＬＩＳＡ結合応答のグラフおよび要約である。
図３６は、図３３に記載される各パニングプログラムを使用して選択されたクローンについての、ｎＭＥＭ ＃５に対するＥＬＩＳＡ結合応答のグラフおよび要約である。
図３７は、図３３に記載される各パニングプログラムを使用して選択されたクローンについての、ＰＤ－Ｌ１およびｓＭＥＭ ＃１に対するＥＬＩＳＡエピトープ選択性応答のグラフおよび要約である。
図３８は、図３３に記載される各パニングプログラムを使用して選択されたクローンについての、ＰＤ－Ｌ１およびｎＭＥＭ ＃５に対するＥＬＩＳＡエピトープ選択性応答のグラフおよび要約である。
図３９Ａ～３９Ｕは、図３４～３８の異なるＥＬＩＳＡ結合応答を比較する図であり、異なるプログラムを使用して選択された結合パートナーの選択性を示す。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上
図４０は、図３３に記載される選択プログラムから得られたクローンを分析するために使用される、抗ＰＤ－Ｌ１パニングＥＬＩＳＡヒット特定基準を要約した表である。
図４１Ａ～４１Ｃは、図３３に記載される異なるパニングプログラムを使用して選択された結合パートナーについての、ＰＤ－Ｌ１と比較したｓＭＥＭ ＃１およびｎＭＥＭ＃５（それぞれ、図４１Ａおよび４２Ｂ）、ならびにｎＭＥＭ＃５と比較したｓＭＥＭ ＃１（図４１Ｃ）に対する異なるＥＬＩＳＡ結合応答を比較した図である。 同上 同上
図４２Ａ～４２Ｆは、図３３に記載されるプログラムのすべてについての、異なるＥＬＩＳＡ応答および確認されたＴｘ ｍＡｂ Ｘ遮断薬を比較した図である。 同上 同上
図４３は、交差遮断ヒットから特定される、図３３に記載されるプログラムからの２３個の別個のクローン、およびそれらの配列を要約した。
図４４は、図３３に記載されるプログラムの各々から得られた、確認された交差遮断する別個のクローンのチャートである。
図４５Ａは、図３３に記載されるプログラムの各々から得られた、ランダムに選択されたクローンの遮断傾向のグラフである。遮断を、ＰＤ－Ｌ１のアベルマブまたはデュルバルマブへの結合のクローンによる遮断として評価した。遮断傾向を、ＥＬＩＳＡ Ｚスコア（ｓＭＥＭ１＋ｓＭＥＭ５＋ＰＤ－Ｌ１－ｉＭＥＭ）＋ＭＡＸ（アベルマブ遮断Ｚスコア、デュルバルマブ遮断Ｚスコア）として評価した。
図４５Ｂおよび４５Ｃは、図４５Ａで評価される異なるプログラムから得られたクローンの遮断傾向を要約する。図４５Ｃ中の影付きの入力は、天然タンパク質を使用した従来の選択アプローチを使用して得られた。 同上
図４６は、対照（従来のアプローチ）と比較して、図３３に記載されるプログラムを使用して得られたクローンのプールにおいて観察された、交差遮断濃縮の要約である。
図４７は、本明細書に記載される操作されたペプチドの選択で使用され得る位相行列の例である。
図４８は、本明細書に記載される操作されたペプチドの選択で使用され得る、位相的制約化学記述子ベクトルの例である。
図４９は、本明細書に記載される操作されたペプチドの選択で使用され得る、例示的なＬ×２ファイ／プサイ行列である。
図５０は、本明細書に記載される操作されたペプチドの選択で使用され得る、二次構造相互作用記述子の例示的なＳ×Ｓ×Ｍ行列である。
図５１は、本明細書に記載される操作されたペプチドの選択で使用され得る例示的な操作されたペプチドのクラスタおよびＴＣＣベクトルを示す、例示的な図である。
図５２は、本明細書に記載される操作されたペプチドの選択で使用され得る、例示的なＬ×Ｍ位相的制約行列である。
図５３は、本明細書に記載される操作されたペプチドの選択で使用され得る、例示的な二次構造指数およびルックアップテーブルである。
図５４は、ＶＥＧＦパニングプログラムから得られたデータの別の表現である。Ｓ１は、抗ＶＥＧＦパニングプログラム６を指し、Ｓ２は、抗ＶＥＧＦパニングプログラム１３を指し、Ｃは、従来の完全長ＶＥＧＦプログラムである。
図５５は、図２４Ｉで提供されるデータの別の表現である。Ｓ１は、抗ＶＥＧＦパニングプログラム６を指し、Ｓ２は、抗ＶＥＧＦパニングプログラム１３を指し、Ｃは、従来の完全長ＶＥＧＦプログラムである。
図５６は、図２６で提供されるデータの別の表現である。Ｓ１は、抗ＶＥＧＦパニングプログラム６を指し、Ｓ２は、抗ＶＥＧＦパニングプログラム１３を指し、Ｃは、従来の完全長ＶＥＧＦプログラムである。
図５７Ａ～５７Ｅは、プログラムされたインビトロ選択からの選択されたエピトープ上のクローンについての、ＶＥＧＦ（灰色の実線）および交差遮断（点線）結合データのグラフである。 同上 同上 同上 同上
図５８Ａ～５８Ｃは、完全長インビトロ選択からのエピトープ外の選択されたクローンについての、ＶＥＧＦ結合データのグラフである。 同上 同上
図５９Ａ～５９Ｂは、抗体クローンが、抗ＶＥＧＦがプログラムされたインビトロ選択（赤色）および従来のインビトロ選択（灰色）について、ＣＤＲループ配列多様性にヒットすることを要約する。 同上
図６０は、本明細書に記載される例示的な操作されたペプチドを使用した、本明細書に記載されるプログラム可能なインビトロ選択方法を使用して選択されたクローンの配列アラインメントである。一番上の列は、すべてのプログラムされたインビトロ選択プログラムにわたって選択された、上位５つのエピトープ上のクローンの重鎖配列のアラインメントであり、２列目は、ＶＥＧＦおよびＢＳＡを選択分子として使用した従来のアプローチを使用して選択された、上位５つのエピトープ外のクローンの重鎖配列のアラインメントであり、３列目は、すべてのプログラムされたインビトロ選択プログラムにわたって選択された、上位５つのエピトープ上のクローンの軽鎖配列のアラインメントであり、一番下の列は、ＶＥＧＦおよびＢＳＡを用いた従来のアプローチを使用して選択された、クローンの軽鎖配列のアラインメントである。
図６１は、操作されたポリペプチド設計の例示的な方法の概略図である。
図６２は、操作されたポリペプチド設計のための機械学習モデルを使用する例示的な方法の概略図である。
メソスケール操作されたペプチドを選択する方法、および当該操作されたペプチドを含む組成物、および当該操作されたペプチドを使用する方法が、本明細書に提供される。例えば、抗体のインビトロ選択において操作されたペプチドを使用する方法が、本明細書に提供される。
本開示の操作されたペプチドは、１ｋＤａ～１０ｋＤａであり、本明細書において「メソスケール」と称される。このサイズの操作されたペプチドは、いくつかの実施形態では、タンパク質様機能性、候補を選択するための大きい理論的空間、細胞透過性、ならびに／または構造および動力学的変動性などの特定の利点を有し得る。
本明細書に提供される方法は、複数の空間的に関連する位相的制約（それらの一部は、参照標的に由来してもよい）を特定することと、当該制約の組み合わせを構築することと、候補ペプチドを当該組み合わせと比較することと、組み合わせと重複する制約を有する候補を選択することとを含む。空間的に関連する位相的制約を使用することによって、操作されたペプチドの異なる態様が、意図される用途、または所望の機能、または別の所望の特性に応じて組み合わせに含まれ得る。さらに、いくつかの実施形態では、すべての制約が参照標的に由来する必要はない。そのような方法を通して、いくつかの実施形態では、選択された操作されたペプチドは、単に参照標的の変形（例えば、単一の参照のペプチド変異誘導または漸進的修飾を通して得られ得るような）ではなく、むしろ、所望の機能的特性および／または重要な部分構造を保持しながらも、参照ペプチドとは異なる全体的構造を有し得る。
１つ以上の操作されたペプチドを使用したプログラム可能なインビトロ選択の方法を含む、当該操作されたペプチドを使用する方法が、本明細書にさらに提供される。そのような選択は、例えば、抗体の特定で使用され得る。
これらの方法および操作されたペプチドは、以下により詳細に記載される。
Ｉ．操作されたペプチドを選択する方法
いくつかの態様では、操作されたペプチドを選択する方法が本明細書に提供され、方法は、
参照標的の１つ以上の位相的特性を特定することと、
参照標的由来の制約の組み合わせを生成するように、各位相的特性に対して空間的に関連する制約を設計することと、
候補ペプチドの空間的に関連する位相的特性を、参照標的に由来する組み合わせと比較することと、
参照標的に由来する制約の組み合わせと重複する、空間的に関連する位相的特性を有する候補ペプチドを選択することとを含む。
いくつかの実施形態では、参照標的に由来しない１つ以上の追加の空間的に関連する位相的制約が、組み合わせに含まれる。
ａ．空間的に関連する位相的制約
本明細書に記載される操作されたペプチドは、それらが空間的に関連する位相的制約の組み合わせとどれほど厳密に一致するかに基づいて選択される。この組み合わせはまた、「テンソル」の数学的概念を使用して記述されてもよい。そのような組み合わせ（またはテンソル）では、各制約は、独立して、三次元空間で記述され（例えば、空間的に関連している）、三次元空間におけるこれらの制約の組み合わせは、例えば、異なる所望の特性および位置に対するそれらの所望のレベル（該当する場合）の表象「マップ」を提供する。このマップは、いくつかの実施形態では、線形またはそうでなければ所定のアミノ酸骨格に基づくものではなく、したがって、記載されるように、所望の組み合わせを満たすことができる構造における柔軟性を可能にし得る。例えば、いくつかの実施形態では、「マップ」は、既定の制約制限が２つの隣接するアミノ酸によって十分に満たされ得る空間領域を含み、いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸が直接結合され得る（例えば、２つの連続するアミノ酸）一方、他の実施形態では、アミノ酸は、互いに直接結合されないが、ペプチドの折り畳みによって空間内で結合され得る（例えば、連続するアミノ酸ではない）。別々の制約自体も、必ずしも構造に基づくものではないが、例えば、化学記述子および／または機能記述子を含み得る。いくつかの実施形態では、制約は、所望の二次構造またはアミノ酸残基などの構造記述子を含む。特定の実施形態では、各制約は、独立して選択される。
例えば、図１は、空間的に関連する位相的制約の代表的な組み合わせの構築を示す概略図である。図１の３つの制約は、配列、最近隣距離、および原子運動であり、最近隣距離および原子運動が１つのグラフィックに組み合わされる。示されるように、いくつかの制約は、骨格の位置（例えば、特定の側鎖の原子運動）とは無関係にマッピングされ、したがって、参照スキャフォールド上の１つ以上の位置を単に変化させるよりも、はるかに多様な構造構成が試みられることを可能にする。３つの異なる制約およびそれらの空間的記述は、行列（例えば、テンソル）に組み合わされ、次いで、一連の候補ペプチドがこの組み合わせと比較されて、所望の基準を満たす新しい操作されたペプチドを特定することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の非参照由来の制約も、組み合わせに含まれる。候補ペプチドと定義された組み合わせとの比較は、例えば、所望の組み合わせに対する各候補ペプチドの制約を評価し、候補がどれほど良好に一致するかを評価するために、インシリコ方法を使用して行われてもよい。次いで、既定の組み合わせとの所望のレベルの重複を有する当該候補は、当業者に既知の標準ペプチド合成方法を使用して合成され、評価され得る。
いくつかの実施形態では、制約の組み合わせは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、３～１２、３～１０、３～８、３～６、または３、または４、または５、または６つの独立して選択される空間的に関連する位相的制約を含む。制約のうちの１つ以上は、参照標的に由来する。いくつかの実施形態では、制約の各々は、参照標的に由来する。他の実施形態では、少なくとも１つの制約は、参照標的に由来し、残りの制約は、参照標的に由来しない。例えば、いくつかの実施形態では、１～９つの制約、１～７つの制約、１～５つの制約、または１～３つの制約が、参照標的に由来し、１～９つの制約、１～７つの制約、１～５つの制約、または１～３つの制約が、参照標的に由来しない。
制約の組み合わせが構築されると、一連の候補ペプチドは、当該組み合わせと比較されて、所望の基準を満たす１つ以上の新しい操作されたペプチドを特定する。いくつかの実施形態では、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、または少なくとも２５０個以上の候補ペプチドが、組み合わせと比較されて、所望の基準を満たす１つ以上の新しい操作されたペプチドを特定する。いくつかの実施形態では、例えば、２５０個を超える候補ペプチド、３００個を超える候補ペプチド、４００個を超える候補ペプチド、５００個を超える候補ペプチド、６００個を超える候補ペプチド、または７５０個を超える候補ペプチドが比較される。いくつかの実施形態では、制約の組み合わせと比較して、候補ペプチドの位相的特性の重複（存在する場合）を評価するために、位相的特性シミュレーションが使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の候補ペプチドも参照標的と比較され、参照標的位相的特性を有する候補ペプチドの位相的特性の重複（存在する場合）が評価される。いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、５つを超える、１０個を超える、２０個を超える、３０個を超える、４０個を超える、５０個を超える、６０個を超える、７０個を超える、８０個個を超える、９０個を超える、または１００個を超える別個のペプチドおよび位相的特性シミュレーションのコンピュータ計算サンプルから特定され、操作されたペプチドが選択され、選択された操作されたペプチドは、参照標的と比較して、全サンプル集団のうち最も高い位相的特性の重複を有する。
所望の組み合わせ（例えば、所望のテンソル）を構築するために使用される空間的に関連する位相的制約は、各々、考えられる特性の広範な群から独立して選択されてもよい。これらには、例えば、構造的、動力学的、化学的、もしくは機能的な特性、またはそれらの任意の組み合わせを記述する制約が含まれ得る。
構造的制約には、例えば、原子間距離、アミノ酸配列類似性、溶媒曝露、ファイ角、プサイ角、二次構造、もしくはアミノ酸接触、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
動力学的制約には、例えば、原子変動、原子エネルギー、ファンデルワールス半径、アミノ酸隣接性、または非共有結合性傾向が含まれ得る。原子エネルギーには、例えば、２つの原子間のペアワイズ引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ反発エネルギー、原子レベルの溶媒和エネルギー、２つの原子間のペアワイズ荷電引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ水素結合引力エネルギー、もしくは非共有結合エネルギー、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
化学的特性には、例えば、化学記述子が含まれ得る。そのような化学記述子には、例えば、疎水性、極性、原子体積、原子半径、正味電荷、ｌｏｇＰ、ＨＰＬＣ保持、ファンデルワールス半径、電荷パターン、もしくはＨ結合パターン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
機能的特性には、例えば、生物情報記述子、生物学的応答、または生物学的機能が含まれ得る。生物情報記述子には、例えば、ＢＬＯＳＵＭ類似性、ｐＫａ、ｚＳｃａｌｅ、クルチアーニ特性、キデラ因子、ＶＨＳＥスケール、ＰｒｏｔＦＰ、ＭＳ－ＷＨＩＭスコア、Ｔスケール、ＳＴスケール、膜貫通傾向、タンパク質が埋まった領域、ヘリックス傾向、シート傾向、コイル傾向、ターン傾向、免疫原性傾向、抗体エピトープ発生、および／もしくはタンパク質界面発生、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、制約を設計することは、残基当たりのエネルギー、残基当たりの相互作用、残基当たりの変動、残基当たりの原子間距離、残基当たりの化学記述子、残基当たりの溶媒曝露、残基当たりのアミノ酸配列類似性、残基当たりの生物情報記述子、残基当たりの非共有結合傾向、残基あたりファイ／プサイ角、残基当たりのファンデルワールス半径、残基当たりの二次構造傾向、残基当たりのアミノ酸隣接性、または残基当たりのアミノ酸接触についての情報を組み込む。いくつかの実施形態では、これらの特性は、参照標的中の全残基のサブセット、もしくは制約の全組み合わせの全残基のサブセット、またはそれらの組み合わせに使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の異なる特性が、１つ以上の異なる残基に使用される。すなわち、いくつかの実施形態では、１つ以上の特性が、残基のサブセットに使用され、少なくとも１つの異なる特性が、異なる残基のサブセットに使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の制約を設計するために使用される当該特性のうちの１つ以上は、コンピュータシミュレーションによって決定される。好適なコンピュータシミュレーション方法には、例えば、分子動力学シミュレーション、モンテカルロシミュレーション、粗視化シミュレーション、ガウスネットワークモデル、機械学習、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、複数の制約が、１つのカテゴリーから選択される。例えば、いくつかの実施形態では、組み合わせは、独立してあるタイプの生物学的応答である２つ以上の制約を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の制約は、独立してあるタイプの二次構造である。特定の実施形態では、２つ以上の制約は、独立してあるタイプの化学記述子である。他の実施形態では、組み合わせは、重複する制約のカテゴリーを含まない。
いくつかの実施形態では、１つ以上の制約は、独立して、生物学的応答または生物学的機能に関連している。いくつかの実施形態では、当該制約は、空間的に定義された原子（複数可）レベルの制約、または空間的に定義された形状／面積／体積レベルの制約（いくつかの異なる原子組成物によって満たされ得る特徴的な形状／面積／体積など）、または空間的に定義された動力学的レベルの制約（いくつかの異なる原子組成物によって満たされ得る特徴的な動態または動態のセットなど）である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の制約は、生物学的機能または生物学的応答に関連するタンパク質構造またはペプチド構造に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上の制約は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）細胞外ドメイン、またはイオンチャネル細胞外ドメインなどの細胞外ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の制約は、タンパク質－タンパク質界面接合に由来する。いくつかの実施形態では、１つ以上の制約は、ＭＨＣ－ペプチドまたはＧＰＣＲ－ペプチド界面などのタンパク質－ペプチド界面接合に由来する。特定の実施形態では、そのようなタンパク質またはペプチド構造に制約される原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答に関連する原子またはアミノ酸である。いくつかの実施形態では、そのようなタンパク質またはペプチド構造に制約される操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸は、参照標的に由来する原子またはアミノ酸である。いくつかの実施形態では、１つ以上の制約は、参照標的の多型領域（例えば、個人間の対立遺伝子変化の対象となる領域）に由来する。
いくつかの実施形態では、生物学的応答または生物学的機能は、遺伝子発現、代謝活性、タンパク質発現、細胞増殖、細胞死、サイトカイン分泌、キナーゼ活性、エピジェネティック修飾、細胞死滅活性、炎症シグナル、走化性、組織浸潤、免疫細胞系統の拘束、組織微小環境修飾、免疫シナプス形成、ＩＬ－２分泌、ＩＬ－１０分泌、成長因子分泌、インターフェロンガンマ分泌、形質転換成長因子ベータ分泌、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ活性、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ活性、抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害、生物学的経路アゴニスト作用、生物学的経路アンタゴニスト作用、生物学的経路再配向、キナーゼカスケード修飾、タンパク質分解経路修飾、タンパク質恒常性経路修飾、タンパク質折り畳み／経路、翻訳後修飾経路、代謝経路、遺伝子転写／翻訳、ｍＲＮＡ分解経路、遺伝子メチル化／アセチル化経路、ヒストン修飾経路、エピジェネティック経路、免疫依存性クリアランス、オプソニン化、ホルモンシグナル伝達、インテグリン経路、膜タンパク質シグナル伝達、イオンチャネルフラックス、およびｇ－タンパク質共役受容体応答からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、生物学的機能または生物学的応答に関連する１つ以上の原子は、炭素、酸素、窒素、水素、硫黄、リン、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マンガン、マグネシウム、銅、鉄、モリブデン、およびニッケルからなる群から選択される。特定の実施形態では、原子は、酸素、窒素、硫黄、および水素からなる群から選択される。
制約のうちの１つが、生物学的機能または生物学的応答に関連する１つ以上のアミノ酸であり、かつ／または操作されたペプチドが、生物学的機能または生物学的応答に関連する１つ以上のアミノ酸を含む、いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、独立して、２０個のタンパク質を作る天然アミノ酸、タンパク質を作らない天然アミノ酸、および非天然アミノ酸からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、化学的に合成される。特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、２０個のタンパク質を作る天然アミノ酸から選択される。他の実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、タンパク質を作らない天然アミノ酸から選択される。なおさらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、非天然アミノ酸から選択される。なおさらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、２０個のタンパク質を作る天然アミノ酸、タンパク質を作らない天然アミノ酸、および非天然アミノ酸の組み合わせから選択される。
本明細書に記載される操作されたペプチドを選択するために使用される制約の組み合わせは、参照標的に由来する少なくとも１つの制約を含むが、いくつかの実施形態では、組み合わせの１つ以上の制約は、参照標的に由来しない。したがって、特定の実施形態では、選択された操作されたペプチドは、参照標的と共有されない１つ以上の特性を含む。
いくつかの実施形態では、参照標的に由来し、組み合わせで使用される１つ以上の制約は、参照標的で観察される特性の逆を記述する。したがって、例えば、参照標的は、正電荷の特定のパターンを有してもよく、電荷に関連する制約は、当該参照標的に由来し、得られた制約は、類似しているが中性電荷または負電荷のパターンを記述する。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の逆制約は、参照標的に由来し、組み合わせに含まれる。そのような逆制約は、例えば、特定のアッセイまたはパニング方法のための対照分子として、または本明細書に記載されるプログラム可能なインビトロ選択方法における負の選択分子として、操作されたペプチドを選択する際に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、空間的に定義された位相的制約の組み合わせは、１つ以上の非参照由来の位相的制約を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非参照由来の位相的制約は、１つ以上の二次構造要素を強化もしくは安定化するか、原子変動を強化するか、ペプチド総疎水性を改変するか、ペプチド溶解性を改変するか、ペプチド総電荷を改変するか、標識アッセイもしくは標識フリーアッセイにおける検出を可能にするか、インビトロアッセイにおける検出を可能にするか、インビボアッセイにおける検出を可能にするか、複雑な混合物からの捕捉を可能にするか、酵素処理を可能にするか、細胞膜透過性を可能にするか、二次標的への結合を可能にするか、または免疫原性を改変する。特定の実施形態では、１つ以上の非参照由来の位相的制約は、参照標的に由来した制約（またはその後に選択されたペプチド）の組み合わせにおいて、１つ以上の原子またはアミノ酸を制約する。例えば、いくつかの実施形態では、制約の組み合わせは、参照標的に由来した二次構造を含み、制約の組み合わせはまた、（例えば、追加の水素結合、または疎水性相互作用、または側鎖スタッキング、または塩架橋、またはジスルフィド結合を通して）二次構造要素を安定化する制約を含み、安定化制約は、参照標的中に存在しない。別の実施形態では、いくつかの実施形態では、制約の組み合わせ（またはその後に選択されたペプチド）は、参照標的に由来した１つ以上の原子またはアミノ酸を含み、制約の組み合わせはまた、標的参照に由来する原子またはアミノ酸の少なくとも一部分における原子変動を強化する制約を含み、制約は、標的参照中に存在しない。いくつかの実施形態では、１つ以上の非参照由来の制約は、逆制約である。例えば、いくつかの実施形態では、制約の２つの組み合わせは、逆特性を有する操作されたペプチドを選択するよう構築される。いくつかのそのような実施形態では、制約の第１の組み合わせは、参照標的に由来する１つ以上の制約、および参照標的に由来しない１つ以上の制約を含み、制約の第２の組み合わせは、参照標的に由来する同じ１つ以上の制約、および第１の組み合わせの非参照標的制約のうちの１つ以上の逆を含む。
ｄ．参照標的
任意の好適な参照標的を使用して、本明細書に提供される方法で使用するための１つ以上の空間的に関連する位相的制約を得てもよい。いくつかの実施形態では、参照標的は、完全長天然タンパク質である。他の実施形態では、参照標的は、完全長天然タンパク質である。なおさらなる実施形態では、参照標的は、非天然タンパク質、またはその一部分である。
例えば、いくつかの実施形態では、参照標的は、細胞表面受容体、または膜貫通タンパク質、またはシグナル伝達タンパク質、または多タンパク質複合体、またはタンパク質－ペプチド複合体、またはそれらの一部分である。いくつかの実施形態では、参照標的は、対象となるタンパク質の一部分であり、対象となるタンパク質は、ヒトなどの生物の疾患プロセスに関与する。いくつかの実施形態では、対象となるタンパク質は、がんの成長もしくは転移、または炎症性障害に関与し、参照標的は、推定エピトープである対象となる当該タンパク質の一部分である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、免疫原として役立ち得る１つ以上の操作されたペプチドを選択するために使用されてもよく、対象となるタンパク質の抗体を作るために使用されてもよい。対象となり得るタンパク質の例として、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ２、ＭＩＦ、ＣＸＣＲ４、またはＶＥＧＦが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、参照標的は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ２、ＭＩＦ、ＣＸＣＲ４、もしくはＶＥＧＦ、またはエピトープなどのそれらの一部分である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、免疫原であり、かつ標的参照が得られるタンパク質に特異的に結合する１つ以上の抗体を作るために使用され得る、１つ以上の操作されたペプチドを選択するために使用されてもよい。なおさらなる実施形態では、本明細書に提供される方法は、１つ以上の操作されたペプチドを選択するために使用されてもよく、１つ以上の操作されたペプチドは、抗体またはＦａｂ提示ファージなどの対象となるタンパク質の１つ以上の結合パートナーを選択するために使用されてもよい。
ｃ．制約の比較
いくつかの実施形態では、１つ以上の制約（例えば、参照由来または非参照由来）は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）、もしくは実験室測定（例えば、ＮＭＲ）、またはそれらの組み合わせによって決定される。制約が得られ、組み合わされると、候補の操作されたペプチドは、いくつかの実施形態では、コンピュータ計算タンパク質設計（例えば、ロゼッタ）を使用して生成される。いくつかの実施形態では、ペプチド空間をサンプリングする他の方法が使用される。次いで、選択された制約のパラメータを得るために、候補の操作されたペプチドに対して動力学シミュレーションが実施されてもよい。原子変動の共分散行列が、参照標的に対して生成され、共分散行列が、候補の操作されたペプチドの各々の残基に対して生成され、これらの共分散行列は、重複を判定するために比較される。各共分散行列、すなわち、参照標的に対する１つの共分散行列、および候補の操作されたペプチドの各々に対する１つの共分散についての固有ベクトルおよび固有値をコンピュータ計算するために、主成分分析が実施され、最大の固有値を有する固有ベクトルは、保持される。
固有ベクトルは、シミュレーションされた分子構造のセットで観察された１番目、２番目、３番目、Ｎ番目に主要な運動を記述する。いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、候補の操作されたペプチドが参照標的のように運動する場合、その固有ベクトルは、参照標的の固有ベクトルと類似しているであろう。固有ベクトルの類似性は、アラインされ、同じ方向を指しているそれらの成分（各ＣＡ原子を中心とする３Ｄベクトル）に相当する。参照標的と候補の操作されたペプチドとの間の例示的な固有ベクトル比較が、図７Ｄ～７Ｇに示される。
いくつかの実施形態では、候補の操作されたペプチドと参照標的との固有ベクトル間のこの類似性は、２つの固有ベクトルの内積を使用してコンピュータ計算される。内積値は、２つの固有ベクトルが互いに９０度である場合、０であるか、または２つの固有ベクトルが正確に同じ方向を指す場合、１である。理論によって束縛されることを望まないが、固有ベクトルの順序は、それらの固有値に基づくため、かつ固有値は、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションがそれらの異なる分子の根底にあるエネルギー地形をサンプリングする確率的性質により、２つの異なる分子間で必ずしも同一ではない可能性があるため、複数の個別にランク付けされた固有ベクトル間の内積が、いくつかの実施形態では必要とされる（例えば、参照標的の固有ベクトル２、３、４などを掛けた、操作されたペプチドの固有ベクトル１）。さらに、分子運動は複雑であり、２つ以上の（または数個以上の）主要／重要な運動モードを伴い得る。したがって、いくつかの実施形態では、候補の操作されたペプチドおよび参照標的中の固有ベクトルのすべての対間の内積は、コンピュータ計算される。これは、内積の行列をもたらし、その次元は、分析される固有ベクトルの数によって決定される。例えば、１０個の固有ベクトルについて、内積の行列は、１０×１０である。内積のこの行列は、１００（１０×１０の場合）の内積の二乗平均平方根値をコンピュータ計算することによって、単一の値にまとめられ得る。これは、二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である。ＲＭＳＩＰの方程式が、図７Ｇに示される。この比較から、制約の定義された組み合わせとの類似性を有する１つ以上の候補の操作されたペプチドが選択される。
ｅ．追加のステップ
いくつかの実施形態では、１つ以上の操作されたペプチドの選択は、１つ以上の追加のステップを含む。例えば、いくつかの実施形態では、候補の操作されたペプチドは、本明細書に記載されるように、空間的に関連する位相的制約の定義された組み合わせとの類似性に基づいて選択され、次いで、１つ以上の追加の特性を決定するための１つ以上の分析、および糖合所望の特性を付与または強化するための１つ以上の構造調整を受ける。例えば、いくつかの実施形態では、選択された候補は、分子動力学シミュレーションなどを通して分析されて、分子の全体的な安定性および／または特定の折り畳まれた構造の傾向を決定する。いくつかの実施形態では、所望のレベルの安定性、または所望の折り畳まれた構造の所望の傾向を付与または強化するために、操作されたペプチドに１つ以上の修飾が行われる。そのような修飾は、例えば、１つ以上の架橋（ジスルフィド結合など）、塩架橋、水素結合相互作用、もしくは疎水性相互作用、またはそれらの任意の組み合わせの導入を含み得る。
本明細書に提供される方法は、所望の結合相互作用または活性などの１つ以上の所望の特性について、１つ以上の選択された操作されたペプチドをアッセイすることをさらに含み得る。所望の特性を測定するために、必要に応じて、任意の好適なアッセイが使用され得る。
ＩＩ．選択された操作されたペプチド
他の態様では、本明細書に記載される方法を通して選択される操作されたペプチドなどの操作されたペプチドが、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、１ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有し、最大５０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、操作されたペプチドは、２ｋＤａ～１０ｋＤａ、２ｋＤａ～１０ｋＤａ、３ｋＤａ～１０ｋＤａ、４ｋＤａ～１０ｋＤａ、５ｋＤａ～１０ｋＤａ、６ｋＤａ～１０ｋＤａ、７ｋＤａ～１０ｋＤａ、８ｋＤａ～１０ｋＤａ、９ｋＤａ～１０ｋＤａ、１ｋＤａ～９ｋＤａ、１ｋＤａ～８ｋＤａ、１ｋＤａ～７ｋＤａ、１ｋＤａ～６ｋＤａ、１ｋＤａ～５ｋＤａ、１ｋＤａ～４ｋＤａ、１ｋＤａ～３ｋＤａ、または１ｋＤａ～２ｋＤａの分子量を有する。特定の実施形態では、操作されたペプチドは、最大４５個のアミノ酸、最大４０個のアミノ酸、最大３５個のアミノ酸、最大３０個のアミノ酸、最大２５個のアミノ酸、最大２０個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、または少なくとも４０個のアミノ酸を含む。
特定の実施形態では、操作されたペプチドは、空間的に関連する位相的制約の組み合わせを含み、制約のうちの１つ以上が、参照標的由来の制約である。本明細書に記載される任意の制約は、いくつかの実施形態では、組み合わせで使用され得る。なおさらなる実施形態では、操作されたペプチドのアミノ酸の１０％～９８％が、１つ以上の参照標的由来の制約を満たす（例えば、操作されたペプチドが５０個のアミノ酸を含む場合、５～４９個のアミノ酸が、１つ以上の参照標的由来の制約を満たす）。いくつかの実施形態では、操作されたペプチドのアミノ酸の２０％～９８％、３０％～９８％、４０％～９８％、５０％～９８％、６０％～９８％、７０％～９８％、８０％～９８％、９０％～９８％、１０％～９０％、１０％～８０％、１０％～７０％、１０％～６０％、１０％～５０％、１０％～４０％、１０％～３０％、または１０％～２０％が、１つ以上の参照標的由来の制約を満たす。なおさらなる実施形態では、１つ以上の参照標的由来の制約を満たす１つ以上のアミノ酸は、参照標的と８．０Å未満、７．５Å未満、７．０Å未満、６．５Å未満、６．０Å未満、５．５Å未満、または５．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）構造相同性を有する。いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、１ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有し、最大５０個のアミノ酸を含み、空間的に関連する位相的制約の組み合わせを含み、制約のうちの１つ以上が、参照標的由来の制約であり、操作されたペプチドのアミノ酸の１０％～９８％が、１つ以上の参照標的由来の制約を満たし、１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸は、参照標的と８．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）構造相同性を有する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の参照標的由来の制約を満たす操作されたペプチドのアミノ酸は、参照標的と１０％～９０％の配列相同性、２０％～９０％の配列相同性、３０％～９０％の配列相同性、４０％～９０％の配列相同性、５０％～９０％の配列相同性、６０％～９０％の配列相同性、７０％～９０％の配列相同性、または８０％～９０％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸は、３０Å２～３０００Å２、または１００Å２～３０００Å２、または２５０Å２～３０００Å２、または５００Å２～３０００Å２、または７５０Å２～３０００Å２、または１０００Å２～３０００Å２、または１２５０Å２～３０００Å２、または１５００Å２～３０００Å２、または１７５０Å２～３０００Å２、または２０００Å２～３０００Å２、または２２５０Å２～３０００Å２、または２５００Å２～３０００Å２、または２７５０Å２～３０００Å２の参照とのファンデルワールス表面積重複を有する。
操作されたペプチドが満たす制約の組み合わせは、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上の参照標的由来の制約を含み得る。組み合わせは、本開示の他の箇所に記載されるように、参照標的に由来しない１つ以上の制約を含んでもよい。これらの参照由来の制約、および非参照由来の制約（存在する場合）は、独立して、本明細書に記載される構造的、動力学的、化学的、もしくは機能的な特性、またはそれらの任意の組み合わせなど、本明細書に記載される制約のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、参照標的と比較したとき、少なくとも１つの構造差を含む。そのような構造差には、例えば、配列、アミノ酸残基の数、原子の総数、総親水性、総疎水性全正電荷、全負電荷、１つ以上の二次構造、形状因子、ゼルニケ記述子、ファンデルワールス表面、構造グラフノードおよびエッジ、体積表面、静電電位表面、疎水性電位表面、局所直径、局所表面特徴、骨格モデル、電荷密度、親水性密度、表面対体積比、両親媒性密度、もしくは表面粗さの差、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の特性（本明細書に記載される１つ以上の特性など）の差は、特性のタイプに適用できる場合、基準標的の特性と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または１００％超である。例えば、いくつかの実施形態では、差は、原子の総数であり、操作されたペプチドは、参照標的よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、もしくは少なくとも３０％多い原子、または参照標的よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、もしくは少なくとも３０％少ない原子を有する。いくつかの実施形態では、差は、全正電荷であり、操作されたペプチドの全正電荷は、参照標的よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％大きい（例えば、より正である）一方、他の実施形態では、操作されたペプチドの全正電荷は、参照標的よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％小さい（例えば、あまり正ではない）。
いくつかの実施形態では、空間的に定義された位相的制約の組み合わせは、参照標的中に存在しない１つ以上の二次構造要素を含む。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、参照標的中に存在しない１つ以上の二次構造要素を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせおよび／または操作されたペプチドは、参照標的中に存在しない１つの二次構造要素、２つの二次構造要素、３つの二次構造要素、４つの二次構造要素、または５つ以上の二次構造要素を含む。いくつかの実施形態では、各二次構造要素は、独立して、ヘリックス、シート、ループ、ターン、およびコイルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、参照標的中に存在しない各二次構造要素は、独立して、α－ヘリックス、β－ブリッジ、β－ストランド、３１０ヘリックス、π－ヘリックス、ターン、ループ、またはコイルである。
いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子、もしくは１つ以上のアミノ酸、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、生物学的応答または生物学的機能は、遺伝子発現、代謝活性、タンパク質発現、細胞増殖、細胞死、サイトカイン分泌、キナーゼ活性、エピジェネティック修飾、細胞死滅活性、炎症シグナル、走化性、組織浸潤、免疫細胞系統の拘束、組織微小環境修飾、免疫シナプス形成、ＩＬ－２分泌、ＩＬ－１０分泌、成長因子分泌、インターフェロンガンマ分泌、形質転換成長因子ベータ分泌、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ活性、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ活性、抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害、生物学的経路アゴニスト作用、生物学的経路アンタゴニスト作用、生物学的経路再配向、キナーゼカスケード修飾、タンパク質分解経路修飾、タンパク質恒常性経路修飾、タンパク質折り畳み／経路、翻訳後修飾経路、代謝経路、遺伝子転写／翻訳、ｍＲＮＡ分解経路、遺伝子メチル化／アセチル化経路、ヒストン修飾経路、エピジェネティック経路、免疫依存性クリアランス、オプソニン化、ホルモンシグナル伝達、インテグリン経路、膜タンパク質シグナル伝達、イオンチャネルフラックス、およびｇ－タンパク質共役受容体応答からなる群から選択される。
特定の実施形態では、参照標的は、生物学的応答または生物学的機能（本明細書に記載されるものなど）に関連する１つ以上の原子を含み、操作されたペプチドは、生物学的応答または生物学的機能（本明細書に記載されるものなど）に関連する１つ以上の原子を含み、操作されたペプチド中の当該原子の原子変動は、参照標的中の当該原子の原子変動と重複する。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、原子自体は異なる原子であるが、それらの原子変動は重複する。他の実施形態では、原子は同じ原子であり、それらの原子変動は重複する。なおさらなる実施形態では、原子は独立して、同一であるかまたは異なる。いくつかの実施形態では、重複は、０．２５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である。いくつかの実施形態では、重複は、０．３より大きい、０．３５より大きい、０．４より大きい、０．４５より大きい、０．５より大きい、０．５５より大きい、０．６より大きい、０．６５より大きい、０．７より大きい、０．７５より大きい、０．８より大きい、０．８５より大きい、０．９より大きい、または０．９５より大きいＲＭＳＩＰである。特定の実施形態では、ＲＭＳＩＰは、以下によって計算され、
Figure 2022535511000002
 式中、ｎは、操作されたペプチドの位相的制約の固有ベクトルであり、ｖは、参照標的位相的制約の固有ベクトルである。
いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、生物学的応答または生物学的機能に関連する原子もしくはアミノ酸（またはそれらの組み合わせ）を含み、当該原子もしくはアミノ酸または組み合わせの少なくとも一部分は、参照標的に由来し、操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸のセットおよび参照標的中のセットの特定の制約は、行列によって記述され得る。いくつかの実施形態では、行列は、Ｌ×Ｌ行列である。他の実施形態では、行列は、Ｓ×Ｓ×Ｍ行列である。なおさらなる実施形態では、行列は、Ｌ×２ファイ／プサイ角行列である
例えば、いくつかの実施形態では、生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸の原子変動は、Ｌ×Ｌ行列によって記述され、当該原子またはアミノ酸の一部分は、参照標的に由来し、当該部分の参照標的中の原子変動は、Ｌ×Ｌ行列によって記述される。いくつかの実施形態では、各セットの隣接性（アミノ酸位置に関連する）は、対応するＬ×Ｌ行列によって記述される。特定の実施形態では、操作されたペプチドのＬ×Ｌ原子変動または隣接性行列のすべての行列要素（ｉ、ｊ）にわたる平均誤差率（ＭＰＥ）は、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合について、参照標的原子変動または隣接性行列中の対応する（ｉ、ｊ）要素に対して７５％以下である。いくつかの実施形態では、ＭＰＥは、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合について、参照標的行列中の対応する要素に対して７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満である。行列が原子変動を表すいくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸位置の数であり、原子変動行列要素の（ｉ、ｊ）値は、（ｉ、ｊ）原子間距離が７Å以下の場合、それぞれ、ｉ番目およびｊ番目のアミノ酸についての分子内原子変動の総和であるか、または（ｉ、ｊ）原子間距離が７Åより大きい場合、もしくは（ｉ、ｊ）が対角線上にある場合、ゼロである。あるいは、いくつかの実施形態では、原子間距離は、０または１の乗数の代わりに、原子変動行列要素（ｉ、ｊ）の重み係数としての機能を果たし得る。特定の実施形態では、ｉ番目およびｊ番目の原子変動および距離は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。行列が原子変動を表す他の実施形態では、Ｌは、アミノ酸位置の数であり、隣接性行列要素の（ｉ、ｊ）の値は、原子間距離が７Å以下の場合、それぞれ、ｉ番目およびｊ番目のアミノ酸についての分子内原子間距離であるか、または原子間距離が７Åより大きい場合、もしくは（ｉ、ｊ）が対角線上にある場合、ゼロである。あるいは、いくつかの実施形態では、原子間距離は、０または１の乗数の代わりに、隣接性行列要素（ｉ、ｊ）の重み係数としての機能を果たし得る。特定の実施形態では、ｉ番目およびｊ番目の原子間距離は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。
特定の実施形態では、操作されたペプチド中の応答または機能に関連する原子またはアミノ酸は、位相的制約化学記述子ベクトル、および参照標的に由来する操作されたペプチドの割合について、同じ化学記述子によって記述される参照に対して７５％未満の平均誤差率（ＭＰＥ）を有し、化学記述子ベクトル中の各ｉ番目の要素は、アミノ酸位置指数に対応する。いくつかの実施形態では、ＭＰＥは、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合について、同じ化学記述子によって記述される参照に対して７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満である。例示的なベクトルが、図４８に示される。
なおさらなる実施形態では、行列は、Ｌ×２ファイ／プサイ角行列であり、操作されたペプチド中の応答または機能に関連する原子またはアミノ酸は、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合において、参照ファイ／プサイ角行列に対して７５％未満のＭＰＥを有し、Ｌは、アミノ酸位置の数であり、ファイ、プサイ値は、それぞれ、次元（Ｌ，１）および（Ｌ，２）にある。いくつかの実施形態では、ＭＰＥは、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合において、参照ファイ／プサイ角行列に対して７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満である。いくつかの実施形態では、ファイ／プサイ値は、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）、知識ベースの構造予測、または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定される。例示的なＬ×２ファイ／プサイ行列が、図４９に示される。
いくつかの実施形態では、行列は、Ｓ×Ｓ×Ｍ二次構造要素相互作用行列であり、操作されたペプチド中の応答または機能に関連する原子またはアミノ酸は、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合において、参照二次構造要素関係行列に対して７５％未満の平均誤差率（ＭＰＥ）を有し、Ｓは、二次構造要素の数であり、Ｍは、相互作用記述子の数である。いくつかの実施形態では、ＭＰＥは、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合について、参照二次構造要素関係行列に対して７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満である。相互作用記述子は、例えば、水素結合、疎水性パッキング、ファンデルワールス相互作用、イオン相互作用、共有結合架橋、キラリティ、配向、もしくは距離、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。二次構造要素相互作用行列指数では、（ｉ、ｊ、ｍ）は、ｉ番目とｊ番目の二次構造要素間のｍ番目の相互作用記述子値である。例示的なＳ×Ｓ×Ｍ行列が、図５０に示される。
本明細書に記載される異なる行列についての平均誤差率（ＭＰＥ）は、以下によって計算され得、
Figure 2022535511000003
 式中、ｎは、ベクトルまたは行列位置ｎに合計される、操作されたペプチド（ｅｎｇｎ）および対応する参照（参照ｎ）についての位相的制約ベクトルまたは行列位置指数である。位相行列の例示的な例が、図４７に提供される。
いくつかの実施形態では、操作されたペプチドは、参照標的と比較して７５％未満のＭＰＥを有する。特定の実施形態では、操作されたペプチドは、参照標的と比較して７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満のＭＰＥを有する。いくつかの実施形態では、ＭＰＥは、総位相的制約距離（ＴＣＤ）、位相的クラスタリング係数（ＴＣＣ）、ユークリッド距離、パワー距離、ソアーゲル距離、キャンベラ距離、ソーレンセン距離、ジャッカード距離、マハラノビス距離、ハミング距離、らしさの定量的評価（ＱＥＬ）、または鎖位相パラメータ（ＣＴＰ）によって決定される。
ａ．二次構造要素
いくつかの実施形態では、操作されたペプチドの少なくとも一部分は、１つ以上の二次構造要素に位相的に制約される。いくつかの実施形態では、操作されたペプチド中の生物学的応答または生物学的機能に関連する原子またはアミノ酸は、１つ以上の二次構造要素に対して位相的に制約される。いくつかの実施形態では、二次構造要素は、独立して、シート、ヘリックス、ターン、ループ、またはコイルである。いくつかの実施形態では、二次構造要素は、独立して、α－ヘリックス、β－ブリッジ、β－ストランド、３１０ヘリックス、π－ヘリックス、ターン、ループ、またはコイルである。特定の実施形態では、操作されたペプチドの少なくとも一部が位相的に制約される二次構造要素のうちの１つ以上が、参照標的中に存在する。いくつかの実施形態では、操作されたペプチドの少なくとも一部分は、二次構造要素の組み合わせに位相的に制約され、各要素は、独立して、シート、ヘリックス、ターン、ループ、およびコイルからなる群から選択される。なおさらなる実施形態では、各要素は、独立して、α－ヘリックス、β－ブリッジ、β－ストランド、３１０ヘリックス、π－ヘリックス、ターン、ループ、およびコイルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、二次構造要素は、平行または逆平行シートである。いくつかの実施形態では、シート二次構造は、２つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、シート二次構造は、５０個以下の残基を含む。なおさらなる実施形態では、シート二次構造は、２～５０個の残基を含む。シートは、平行または逆平行であり得る。いくつかの実施形態では、平行シート二次構造は、平行な２つのストランドｉ、ｊ（ｉおよびｊストランドの対向する配向のＮ末端）、および残基ｉ：ｊの水素結合のパターンを有するものとして記述され得る。いくつかの実施形態では、逆平行シート二次構造はまた、逆平行な２つのストランドｉ、ｊ（ｉおよびｊストランドの同じ配向のＮ末端）、および残基ｉ：ｊ－１、ｉ：ｊ＋１の水素結合のパターンを有するものとして記述され得る。特定の実施形態では、ストランドの配向および水素結合は、知識ベースのシミュレーションもしくは分子動力学シミュレーション、および／または実験室測定によって決定され得る。
いくつかの実施形態では、二次構造要素は、ヘリックスである。ヘリックスは、右巻きでも左巻きであってもよい。いくつかの実施形態では、ヘリックスは、２．５～６．０のターン当たりの残基（残基／ターン）値、および３．０Å～９．０Åのピッチを有する。いくつかの実施形態では、残基／ターンおよびピッチは、知識ベースのシミュレーションもしくは分子動力学シミュレーション、および／または実験室測定によって決定される。
いくつかの実施形態では、二次構造要素は、ターンである。いくつかの実施形態では、ターンは、２～７つの残基、および１つ以上の残基間水素結合を含む。いくつかの実施形態では、ターンは、２、３、または４つの残基間水素結合を含む。特定の実施形態では、ターンは、知識ベースのシミュレーションもしくは分子動力学シミュレーション、および／または実験室測定によって決定される。
なおさらなる実施形態では、二次構造要素は、コイルである。特定の実施形態では、コイルは、２～２０個の残基、およびゼロの予測された残基間水素結合を含む。いくつかの実施形態では、これらのコイルパラメータは、知識ベースのシミュレーションもしくは分子動力学シミュレーション、および／または実験室測定によって決定される。
なおさらなる実施形態では、操作されたペプチドは、参照標的に由来する１つ以上の原子またはアミノ酸を含み、当該原子またはアミノ酸は、二次構造を有する。いくつかの実施形態では、これらの原子またはアミノ酸は、生物学的応答または生物学的機能と関連している。いくつかの実施形態では、操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸の二次構造モチーフベクトルは、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合について、参照標的二次構造モチーフベクトルに対して０．２５より大きいコサイン類似度を有し、ベクトルの長さは、二次構造モチーフの数であり、ｉ番目のベクトル位置の値は、ルックアップテーブルに由来する二次構造モチーフ（例えば、ヘリックス、シート）の同一性を定義する。いくつかの実施形態では、各モチーフは、２つ以上のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、モチーフは、例えば、α－ヘリックス、β－ブリッジ、β－ストランド、３１０ヘリックス、π－ヘリックス、ターン、およびループを含む。いくつかの実施形態では、コサイン類似度は、参照標的に由来する操作されたペプチドの割合について、参照標的二次構造モチーフベクトルに対して０．３より大きい、０．３５より大きい、０．４より大きい、０．４５より大きい、または０．５より大きい。例示的な二次構造指数およびルックアップテーブルが、図５３に提供される。コサイン類似度は、以下によって計算され得、
Figure 2022535511000004
 式中、Ａは、二次構造モチーフ識別子のペプチドベクトルであり、Ｂは、二次構造モチーフ識別子の参照ベクトルであり、ｎは、二次構造モチーフベクトルの長さであり、ｉは、ｉ番目の二次構造モチーフである。
いくつかの実施形態では、参照標的に由来する操作されたペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、総位相的制約距離（ＴＣＤ）を使用して、対応する参照標的原子またはアミノ酸と比較され得る。いくつかの実施形態では、参照標的に由来する当該操作されたペプチド原子またはアミノ酸の総ＴＣＤは、参照標的中の対応する原子のＴＣＤ距離に対して＋／－７５％であり、２つの分子内位相的制約は、それらのペアワイズ距離が７Å以下である場合に相互作用している。いくつかの実施形態では、比較されている操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答に関連している。２つの原子またはアミノ酸のｉ番目、ｊ番目のペアワイズ距離は、いくつかの実施形態では、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。総位相的制約距離（ＴＣＤ）を計算するための例示的な方程式は、以下であり、
Figure 2022535511000005
 式中、ｉ、ｊは、アミノ酸（ｉ、ｊ）の分子内位置指数であり、Ｓｉｊは、制約Ｓ（ｉ）とＳ（ｊ）との間の差であり、Δ（ｉ、ｊ）は、アミノ酸（ｉ、ｊ）が７Åの相互作用閾値内にある場合、１であり、Ｌは、ペプチドまたは対応する参照標的中のアミノ酸位置の数である。あるいは、いくつかの実施形態では、Δ（ｉ、ｊ）は、０または１の乗数の代わりに、Ｓｉｊ差の重み係数としての機能を果たし得る。
いくつかの実施形態では、参照標的に由来する操作されたペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、鎖位相パラメータ（ＣＴＰ）を使用して、対応する参照標的原子またはアミノ酸と比較され得る。いくつかの実施形態では、当該操作されたペプチド原子またはアミノ酸のＣＴＰは、参照標的中の対応する原子またはアミノ酸のＣＴＰに対して＋／－５０％であり、鎖内位相的相互作用は、７Å以下のペアワイズ距離である。いくつかの実施形態では、比較されている操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答に関連している。いくつかの実施形態では、ｉ番目、ｊ番目のペアワイズ距離は、いくつかの実施形態では、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。ＣＴＰを評価するための例示的な方程式は、以下であり、
Figure 2022535511000006
 式中、ｉ、ｊは、アミノ酸（ｉ、ｊ）の位置指数であり、Ｓｉｊは、位相的制約Ｓ（ｉ）とＳ（ｊ）との間の差であり、Δ（ｉ、ｊ）は、アミノ酸（ｉ、ｊ）が７Åの鎖位相的相互作用閾値内にある場合、１であり、Ｌは、ペプチドまたは対応する参照標的中のアミノ酸位置の数であり、Ｎは、操作されたペプチドまたは参照標的中の７Åの位相的相互作用閾値を満たす鎖内接触の総数である。あるいは、いくつかの実施形態では、Δ（ｉ、ｊ）は、０または１の乗数の代わりに、Ｓｉｊ差の重み係数としての機能を果たし得る。
いくつかの実施形態では、参照標的に由来する操作されたペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、らしさの定量的評価（ＱＥＬ）を使用して、対応する参照標的原子またはアミノ酸と比較され得る。いくつかの実施形態では、当該操作されたペプチド原子またはアミノ酸のＱＥＬは、参照標的中の対応する原子またはアミノ酸のＱＥＬに対して＋／－５０％である。いくつかの実施形態では、比較されている操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連している。ＱＥＬを決定するための例示的な方程式は、以下であり、
Figure 2022535511000007
 式中、ｄｉは、ｉ番目のアミノ酸または原子位置に対する位相的制約、またはｉ番目のアミノ酸または原子位置に対する複数の位相的制約を組み合わせた合成関数（例えば、線形回帰関数）であり、ｎは、ペプチドまたは参照標的中のアミノ酸または原子位置の数である。
いくつかの実施形態では、参照標的に由来する操作されたペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、位相的クラスタリング係数（ＴＣＣ）ベクトルおよび平均誤差率（ＭＰＥ）を使用して、対応する参照標的原子またはアミノ酸と比較され得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＣベクトルおよびＭＰＥは、参照標的中の対応する原子またはアミノ酸のＴＣＣに対して７５％未満であり、ベクトルの各要素（ｉ）は、ｉ番目のアミノ酸位置の位相的クラスタリング係数であり、分子内クラスタは、ｉ番目のアミノ酸位置からの７Å以下の相互作用エッジ距離、および２つのエッジ：ｉ－ｊ、ｊ－ｌによって定義される。いくつかの実施形態では、比較されている操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連している。いくつかの実施形態では、ｉ番目、ｊ番目、およびｌ番目のエッジ距離は、いくつかの実施形態では、分子シミュレーション（例えば、分子動力学）および／または実験室測定（例えば、ＮＭＲ）によって決定され得る。ｉ番目の位置の位相的クラスタリング係数を評価するための例示的な方程式は、以下であり、
Figure 2022535511000008
 式中、分子内アミノ酸位置：（ｉ、ｊ）、（ｉ、ｌ）、（ｊ、ｌ）が、それぞれ、７Åの相互作用するエッジ閾値内にある場合、Δ（ｉ、ｊ）＝１、Δ（ｉ、ｌ）＝１、Δ（ｊ、ｌ）＝１であり、Ｓｉｊｌは、ｉ番目、ｊ番目、およびｌ番目のアミノ酸の位相的制約の組み合わせ（例えば、合計）であり、Ｌは、ペプチドベクトルまたは対応する参照標的ベクトル中のアミノ酸位置の数であり、Ｎｃは、ｉ番目のアミノ酸の分子内相互作用アミノ酸位置の数であり、ｉ番目のアミノ酸からの７Åのエッジ閾値および２つのエッジ：ｉ－ｊ、ｊ－ｌを満たす。あるいは、いくつかの実施形態では、Δ（ｉ、ｊ）、Δ（ｉ、ｌ）、およびΔ（ｊ、ｌ）は、０または１の乗数の代わりに、クラスタリング係数ベクトル要素（ｉ）の重み係数としての機能を果たし得る。例示的な操作されたペプチドのクラスタおよびＴＣＣベクトルを示す例示的な図が、図５１に示される。
なおさらなる実施形態では、参照標的に由来する操作されたペプチドの１つ以上の原子またはアミノ酸は、Ｌ×Ｍ位相的制約行列、およびユークリッド距離、パワー距離、ソアーゲル距離、キャンベラ距離、ソーレンセン距離、ジャッカード距離、マハラノビス距離、またはすべてのＭ次元にわたるハミング距離の平均誤差率（ＭＰＥ）を使用して、対応する参照標的原子またはアミノ酸と比較され得る。Ｌ×Ｍ行列要素（ｌ、ｍ）は、ｌ番目のアミノ酸位置に対するｍ番目の制約値を含み、Ｌは、アミノ酸位置の数であり、Ｍは、別個の位相的制約の数である。いくつかの実施形態では、操作されたペプチドＬ×Ｍ行列のＭＰＥは、対応する参照標的原子またはアミノ酸の行列に対して７５％未満である。いくつかの実施形態では、ＭＰＥは、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、または４５％未満である。いくつかの実施形態では、比較されている操作されたペプチド中の原子またはアミノ酸は、生物学的機能または生物学的応答と関連している。例示的なＬ×Ｍ行列が、図５２に示される。
ＩＩＩ．プログラム可能なインビトロ選択
他の態様では、一連のプログラムされた選択ステップを使用して結合パートナーを選択する際に、本明細書に記載される操作されたペプチドを使用する方法がさらに本明細書に提供され、少なくとも１つの選択ステップは、操作されたペプチドとの潜在的な結合パートナーのプールの相互作用を評価することを含む。
いくつかの実施形態では、２つ以上の選択分子を使用して結合分子の選択を誘導する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、候補結合分子のプールを少なくとも１回の選択ラウンドに供することを含み、各ラウンドは、プールの少なくとも一部分が負の選択分子に対してスクリーニングされる、少なくとも１つの負の選択ステップと、プールの少なくとも一部分が正の選択分子に対してスクリーニングされる、少なくとも１つの正の選択ステップとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも２ラウンド、少なくとも３ラウンド、少なくとも４ラウンド、少なくとも５ラウンド、少なくとも５ラウンド、少なくとも６ラウンド、少なくとも７ラウンド、少なくとも８ラウンド、少なくとも９ラウンド、少なくとも１０ラウンド、またはそれ以上を含み、各ラウンドは、独立して、少なくとも１つの負の選択ステップと少なくとも１つの正の選択ステップとを含む。いくつかの実施形態では、各ラウンドは、独立して、２つ以上の負の選択ステップ、もしくは２つ以上の正の選択ステップ、またはそれらの組み合わせを含む。図５は、３回の選択ラウンドを説明する例示的な概略図を提供し、第１および第３のラウンドは、２つ以上の負の選択ステップを含み、第１のラウンドは、２つ以上の正の選択ラウンドをさらに含む。スキームに示されるように、２つの負の選択分子（ベイト）が、第１のラウンドで使用され、３つの負の選択分子が、第３のラウンドで使用される。さらに、２つの正の選択分子が、第１のラウンドで使用される。
方法が２回以上のラウンドを含むいくつかの実施形態では、各負および正の選択分子が独立して選択される。他の実施形態では、同じ負の選択分子、もしくは同じ正の選択分子、またはそれらの組み合わせが、２回以上のラウンドで使用されてもよい。例えば、図５中、ラウンド１で使用されるのと同じ負の選択分子が、ラウンド３で再び使用され、追加の第３の負の選択分子もラウンド３に含まれる。負および正の選択ステップの順序は、特定の実施形態では、各選択ラウンド内で独立して選択されてもよい。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、方法は、１回以上の選択ラウンドを含み、各ラウンドは、最初に負の選択ステップ、次いで正の選択ステップを含む。他の実施形態では、方法は、１回以上の選択ラウンドを含み、各ラウンドは、最初に正の選択ステップ、次いで負の選択ステップを含む。なおさらなる実施形態では、方法は、１回以上の選択ラウンドを含み、各ラウンドは、独立して、負の選択ステップおよび正の選択ステップを含み、各ラウンドにおいて、負の選択ステップは、独立して、正の選択ステップの前または正の選択ステップの後である。
選択のそのような方法は、結合特異性または結合親和性などの特定の所望の特性に向かって、およびそれらから離れて、候補結合分子のライブラリを誘導するために、正（＋）および負（－）のステップを使用する。正および負の選択分子の両方を用いる複数のステップを使用することによって、候補のプールは、望ましい特性に有利に、かつ望ましくない特性に不利に選択するように段階的に方向付けられ得る。さらに、いくつかの実施形態では、各ラウンド内の各ステップの順序、および互いに対するラウンドの順序は、選択を異なる方向に方向付けることができる。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、（＋）選択、続いて（－）選択を有する１ラウンドを含む方法は、（－）選択が最初であり、（＋）選択が後に続く場合とは異なる候補の最終プールをもたらす。これを複数のラウンドを含む方法に当てはめると、選択ステップの順序は、同じ正および負の選択分子が全体で使用されたとしても、選択された候補の異なる最終プールをもたらし得る。
いくつかの実施形態では、別の選択分子の逆特性を有する選択分子が使用される。これは、例えば、正の選択分子を使用して特定された（または負の選択分子のために除外された）候補結合パートナーが、別個の無関係な結合相互作用のためではなく、所望の形質（または望ましくない形質）のために特定された（または除外された）ことを確実にするのに有用であり得る。無関係な相互作用を通して結合している結合パートナーを除去するために、所望の形質（または望ましくない形質）を伝達する残基／構造を除いて、選択分子と類似または同一の構造および特性を有する逆の選択分子が使用され得る。例えば、正の選択分子中の特定の電荷パターンとの相互作用が所望される場合、その電荷パターンを提供する残基を、非荷電残基および／または反対の電荷の残基で置き換えた逆の負の選択分子が使用されてもよい。したがって、特定の選択分子については、複数の異なる対応する逆の選択分子が可能であり得る。
本明細書に提供される選択方法では、選択分子の少なくとも１つは、本明細書に記載される操作されたペプチドである。いくつかの実施形態では、２つ以上の操作されたペプチドが使用される。いくつかの実施形態では、各操作されたペプチドは、独立して、正または負の選択分子である。特定の実施形態では、１回以上の選択ラウンドで使用される各選択分子は、独立して、操作されたペプチドである。他の実施形態では、操作されたペプチドではない少なくとも１つの分子が、選択分子として使用される。操作されたペプチドではないそのような選択分子は、例えば、天然ポリペプチド、またはその一部分を含んでもよい。他の実施形態では、操作されたペプチドではない１つ以上の選択分子は、例えば、非天然ポリペプチド、またはその一部分を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上の選択分子（例えば、正の選択分子または負の選択分子）は、免疫原、抗体、細胞表面受容体、または膜貫通タンパク質、もしくはシグナル伝達タンパク質、もしくは多タンパク質複合体、またはペプチド－タンパク質複合体、またはそれらの任意の部分、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、１つ以上の選択分子は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２５、ＩＬ２、ＭＩＦ、ＣＸＣＲ４、もしくはＶＥＧＦ、またはこれらのいずれかの一部分、またはこれらのいずれかに対する抗体（ベバシズマブ、アベルマブ、もしくはデュルバルマブなど）である。
各ステップで有利または不利に選択されている正および負の特性は、様々な形質から選択されてもよく、得られた最終の１つ以上の結合分子の所望の特徴に応じて調整されてもよい。そのような所望の特徴は、例えば、１つ以上の結合分子の使用目的に依存し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法を使用して、抗体候補を、高特異性などの１つ以上の正の特性に有利に、かつ交差反応性などの１つ以上の負の特性に不利にスクリーニングする。ある状況において正の特性とみなされるものは、別の状況において負の特性である可能性があり、その逆も同様であることが理解されるべきである。したがって、ある一連の選択ラウンドにおける正の選択分子は、いくつかの実施形態では、異なる一連の選択ラウンドにおいて、または異なるタイプの結合分子の選択において、または同じタイプの結合分子であるが異なる目的での選択において、負の選択分子であり得る。
いくつかの実施形態では、各選択特性は、独立して、アミノ酸配列、ポリペプチド二次構造、分子動力学、化学的特徴、生物学的機能、免疫原性、参照標的（複数可）の多重特異性、異種間参照標的反応性、望ましくない参照標的（複数可）に対する所望の参照標的（複数可）の選択性、配列および／または構造的に相同なファミリー内の参照標的（複数可）の選択性、類似のタンパク質機能を有する参照標的（複数可）の選択性、高配列および／または構造的に相同性を有する望ましくない標的のより大きいファミリーからの、別個の所望の参照標的（複数可）の選択性、別個の参照標的対立遺伝子または変異に対する選択性、別個の参照標的残基レベルの化学修飾に対する選択性、細胞型に対する選択性、組織型に対する選択性、組織環境に対する選択性、参照標的（複数可）の構造多様性に対する耐性、参照標的（複数可）の配列多様性に対する耐性、ならびに参照標的（複数可）の動態多様性に対する耐性からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、各選択特性は、異なるタイプの選択特性である。他の実施形態では、２つ以上の選択特性は、異なる特性であるが、同じタイプである。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上の選択特性は、ポリペプチド二次構造であり、１つは、所望のポリペプチド二次構造に対する正の選択であり、１つは、望ましくないポリペプチド二次構造に対する負の選択である。いくつかの実施形態では、２つ以上の選択特性は、細胞型に対する選択性であり、正の選択特性は、特定の所望の細胞型に対する選択性であり、負の選択特性は、特定の望ましくない細胞型に対する選択性である。いくつかの実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上の選択特性は、同じタイプのものである。
さらに別の態様では、２つ以上の選択誘導ポリペプチドを含む組成物が本明細書に提供され、各ポリペプチドは、独立して、１つ以上の正の誘導特性を含む正の選択分子、または１つ以上の負の誘導特性を含む負の選択分子である。そのような特性は、いくつかの実施形態では、アミノ酸配列、ポリペプチド二次構造、分子動力学、化学的特徴、生物学的機能、免疫原性、参照標的（複数可）の多重特異性、異種間参照標的反応性、望ましくない参照標的（複数可）に対する所望の参照標的（複数可）の選択性、配列および／または構造的に相同なファミリー内の参照標的（複数可）の選択性、類似のタンパク質機能を有する参照標的（複数可）の選択性、高配列および／または構造的に相同性を有する望ましくない標的のより大きいファミリーからの、別個の所望の参照標的（複数可）の選択性、別個の参照標的対立遺伝子または変異に対する選択性、別個の参照標的残基レベルの化学修飾に対する選択性、細胞型に対する選択性、組織型に対する選択性、組織環境に対する選択性、参照標的（複数可）の構造多様性に対する耐性、参照標的（複数可）の配列多様性に対する耐性、ならびに参照標的（複数可）の動態多様性に対する耐性からなる群から選択され得る。
したがって、さらなる態様では、本明細書に記載される選択誘導組成物を用いて結合分子のライブラリをスクリーニングする方法が本明細書に提供され、各選択ラウンドは、プールの少なくとも一部分を負の選択分子に不利にスクリーニングする負の選択ステップと、プールの少なくとも一部分を正の選択分子に有利にスクリーニングする正の選択ステップとを含み、各ラウンド内の選択ステップの順序、およびラウンドの順序は、代替の順序とは異なるプールのサブセットの選択をもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される選択誘導ポリペプチドの組成物、または本明細書に記載されるスクリーニング方法を使用して評価されている結合パートナーは、ファージライブラリ、例えば、Ｆａｂ含有ファージライブラリ、または細胞ライブラリ、例えば、Ｂ細胞ライブラリもしくはＴ細胞ライブラリである。
本明細書に提供されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、方法は、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、または７回以上の選択ラウンドを含む。２回以上のラウンドが存在するいくつかの実施形態では、各ラウンドは、異なる選択分子のセットを含む。２回以上のラウンドが存在する他の実施形態では、少なくとも２回のラウンドは、同じ負の選択分子、同じ正の選択分子、またはその両方を含む。
スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、方法は、次の選択ラウンドに進む前に、プールのサブセットを分析することを含む。特定の実施形態では、各サブセットプール分析は、独立して、ペプチド／タンパク質バイオセンサー結合、ペプチド／タンパク質ＥＬＩＳＡ、ペプチドライブラリ結合、細胞抽出物結合、細胞表面結合、細胞活性アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、酵素活性アッセイ、遺伝子発現プロファイル、タンパク質修飾アッセイ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、次世代シーケンシングなどのサブセットプールの完全配列レパートリー分析を含む。いくつかの実施形態では、統計および／もしくは情報スコアリング、または機械学習訓練を使用して、１つ以上の選択ラウンドにおけるプールの１つ以上のサブセットを評価する。
いくつかの実施形態では、後続のラウンドに対する正および／または負の選択分子の同一性および／または順序は、１つの選択ラウンドからのサブセットプールを分析することによって決定される。いくつかの実施形態では、統計および／もしくは情報スコアリング、または機械学習訓練を使用して、１つ以上の選択ラウンドにおけるプールの１つ以上のサブセットを評価して、後続のラウンド（例えば、次のラウンド、またはプログラム内のさらに先のラウンドなど）に対する正および／または負の選択分子の同一性および／または順序を決定する。
なおさらなる実施形態では、選択方法は、次の選択ラウンドに進む前に、ある選択ラウンドから得られたサブセットプールを修飾することを含む。そのような修飾には、例えば、サブセットプールの遺伝子変異、サブセットプールの遺伝子枯渇（例えば、選択において先に進むためにサブセットプールのサブセットを選択すること）、サブセットプールの遺伝子濃縮（例えば、プールのサイズを増大させること）、サブセットプールの少なくとも一部分の化学修飾、もしくはサブセットプールの少なくとも一部分の酵素修飾、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態では、統計および／もしくは情報スコアリング、または機械学習訓練を使用して、サブセットプールを評価し、選択において修飾されたサブセットプールを先に進める前に行う１つ以上の修飾を決定する。特定の実施形態では、また、そのような統計および／もしくは情報スコアリング、または機械学習訓練を使用して、後続の選択ラウンドに対する正および／または負の選択分子の同一性および／または順序を決定する。
任意の好適なアッセイを使用して、各ステップにおける選択分子との結合パートナープールの結合を評価し得る。いくつかの実施形態では、結合は、例えば、結合パートナー上の標識を直接検出することによって、直接評価される。そのような標識には、例えば、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質などの蛍光標識が含まれ得る。他の実施形態では、例えば、サンドイッチアッセイを使用して、結合が間接的に評価される。サンドイッチアッセイでは、結合パートナーは、選択分子に結合し、次いで、二次標識された試薬が、結合した結合パートナーを標識するために添加される。次いで、この二次標識試薬が検出される。サンドイッチアッセイ成分の例としては、抗Ｈｉｓタグ抗体もしくはＨｉｓタグ特異的蛍光プローブで検出されたＨｉｓタグ結合パートナー、標識されたストレプトアビジンもしくは標識されたアビジンで検出されたビオチン標識結合パートナー、または抗結合パートナー抗体で検出された非標識結合パートナーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、各ステップで選択されている結合パートナーは、任意の数の利用可能な検出方法を使用して、結合シグナルまたは用量応答に基づいて特定される。これらの検出方法には、例えば、画像化、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、質量分析、またはバイオセンサーが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒット閾値（例えば、シグナル中央値について）が定義され、そのシグナルを上回るシグナルを有する任意のものは、推定ヒットモチーフとしてフラグ付けされる。
ＩＶ．抗体を生成するための操作されたペプチドの使用
本明細書に提供され、本明細書に提供される方法によって特定される操作されたペプチドは、例えば、１つ以上の抗体を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。したがって、いくつかの実施形態では、免疫原を用いて動物を免疫化することによって生成される抗体が本明細書に提供されて、免疫原は、本明細書に提供される操作されたペプチドである。いくつかの実施形態では、動物は、ヒト、ウサギ、マウス、ハムスター、サルなどである。特定の実施形態では、サルは、カニクイザル、マカクザル、またはアカゲザルである。操作されたペプチドを用いて動物を免疫化することは、例えば、ペプチドおよび任意にアジュバントを含む組成物の少なくとも１回の用量を動物に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、動物から抗体を生成することは、抗体を発現するＢ細胞を単離することを含む。いくつかの実施形態は、Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させて、抗体を発現するハイブリドーマを作ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、操作されたペプチドを使用して生成された抗体は、ヒトおよびサル、例えば、カニクイザルと交差反応することができる。
本明細書に提供される説明は、多数の例示的な構成、方法、パラメータなどを記載する。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲に対する制限として意図されるものではなく、代わりに、例示的な実施形態の説明として提供されることが認識されるべきである。
例示的な実施形態
実施形態Ｉ－１．操作されたペプチドであって、操作されたペプチドが、１ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有し、最大５０個のアミノ酸を含み、操作されたペプチドが、
空間的に関連する位相的制約の組み合わせを含み、制約のうちの１つ以上が、参照標的由来の制約であり、
操作されたペプチドのアミノ酸の１０％～９８％が、１つ以上の参照標的由来の制約を満たし、
１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸が、参照標的と８．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）構造相同性を有する、操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２．１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸が、参照標的と１０％～９０％の配列相同性を有する、実施形態Ｉ－１に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３．１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸が、３０Å２～３０００Å２の参照とのファンデルワールス表面積重複を有する、実施形態Ｉ－１またはＩ－２に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４．組み合わせが、少なくとも２つの参照標的由来の制約を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－５．組み合わせが、少なくとも５つの参照標的由来の制約を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－４のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－６．制約の組み合わせが、参照標的に由来しない１つ以上の制約を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－５のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－７．１つ以上の非参照標的由来の制約が、所望の構造的、動力学的、化学的、もしくは機能的な特性、またはそれらの任意の組み合わせを記述する、実施形態Ｉ－６に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－８．制約が、独立して、以下からなる群から選択される、実施形態Ｉ－１～Ｉ－７のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
原子間距離、
原子変動、
原子エネルギー、
化学記述子、
溶媒曝露、
アミノ酸配列類似性、
生物情報記述子、
非共有結合傾向、
ファイ角、
プサイ角、
ファンデルワールス半径、
二次構造傾向、
アミノ酸隣接性、および
アミノ酸接触。
実施形態Ｉ－９．１つ以上の制約が、独立して、原子変動である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－８のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１０．１つ以上の制約が、独立して、化学記述子である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－９のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１１．１つ以上の制約が、独立して、原子間距離である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１０のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１２．１つ以上の制約が、独立して、二次構造である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１１のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１３．１つ以上の制約が、独立して、ファンデルワールス表面である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１２のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１４．１つ以上の制約が、独立して、生物学的応答または生物学的機能に関連する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１３のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１５．生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１４のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１６．生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－１～Ｉ－１５のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１７．生物学的応答または生物学的機能が、遺伝子発現、代謝活性、タンパク質発現、細胞増殖、細胞死、サイトカイン分泌、キナーゼ活性、エピジェネティック修飾、細胞死滅活性、炎症シグナル、走化性、組織浸潤、免疫細胞系統の拘束、組織微小環境修飾、免疫シナプス形成、ＩＬ－２分泌、ＩＬ－１０分泌、成長因子分泌、インターフェロンガンマ分泌、形質転換成長因子ベータ分泌、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ活性、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ活性、抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害、生物学的経路アゴニスト作用、生物学的経路アンタゴニスト作用、生物学的経路再配向、キナーゼカスケード修飾、タンパク質分解経路修飾、タンパク質恒常性経路修飾、タンパク質折り畳み／経路、翻訳後修飾経路、代謝経路、遺伝子転写／翻訳、ｍＲＮＡ分解経路、遺伝子メチル化／アセチル化経路、ヒストン修飾経路、エピジェネティック経路、免疫依存性クリアランス、オプソニン化、ホルモンシグナル伝達、インテグリン経路、膜タンパク質シグナル伝達、イオンチャネルフラックス、およびｇ－タンパク質共役受容体応答からなる群から選択される、実施形態Ｉ－１４～Ｉ－１６のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１８．参照標的が、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含み、
生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の１つ以上の原子の原子変動が、生物学的応答または生物学的機能に関連する参照標的中の１つ以上の原子の原子変動と重複する、実施形態Ｉ－１５に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－１９．重複が、０．２５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である、実施形態Ｉ－１８に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２０．重複が、０．７５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）を有する、実施形態Ｉ－１９に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２１．生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の原子の少なくとも一部分が、参照標的中の二次構造要素に位相的に制約される、実施形態Ｉ－１８～Ｉ－２０のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２２．二次構造要素が、ベータ－シートである、実施形態Ｉ－２１に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２３．二次構造要素が、アルファヘリックスである、実施形態Ｉ－２１に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２４．二次構造要素が、ターンであり、ターンが、２～７個の残基を含み、少なくとも１つの残基間水素結合を含む、実施形態Ｉ－２１に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２５．二次構造要素が、コイルであり、コイルが、２～２０個の残基を含む、実施形態Ｉ－２１に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２６．コイルが、残基間水素結合を含まない、実施形態Ｉ－２５に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２７．生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の原子の少なくとも一部分が、ベータ－シート、アルファヘリックス、ターン、およびコイルからなる群から独立して選択される２つ以上の二次構造要素の組み合わせに位相的に制約される、実施形態Ｉ－２１～Ｉ－２６のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２８．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、原子間距離である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２７のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－２９．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、原子エネルギーである、実施形態Ｉ－１～Ｉ－２８のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３０．各原子エネルギーが、独立して、２つの原子間のペアワイズ引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ反発エネルギー、原子レベルの溶媒和エネルギー、２つの原子間のペアワイズ荷電引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ水素結合引力エネルギー、または非共有結合エネルギーである、実施形態Ｉ－２９に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３１．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、化学記述子である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３０のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３２．各化学記述子が、独立して、疎水性、極性、体積、正味電荷、ｌｏｇＰ、高速液体クロマトグラフィー保持、またはファンデルワールス半径である、実施形態Ｉ－３１に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３３．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、生物情報記述子である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３２のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３４．各生物情報記述子が、独立して、ＢＬＯＳＵＭ類似性、ｐＫａ、ｚＳｃａｌｅ、クルチアーニ特性、キデラ因子、ＶＨＳＥスケール、ＰｒｏｔＦＰ、ＭＳ－ＷＨＩＭスコア、Ｔスケール、ＳＴスケール、膜貫通傾向、タンパク質が埋まった領域、ヘリックス傾向、シート傾向、コイル傾向、ターン傾向、免疫原性傾向、抗体エピトープ発生、またはタンパク質界面発生である、実施形態Ｉ－３３に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３５．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、溶媒曝露である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３４のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３６．１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、ＧＰＣＲ細胞外ドメインである、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３５のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３７．１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、イオンチャネル細胞外ドメインである、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３６のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３８．１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、タンパク質－タンパク質またはペプチド－タンパク質の界面接合である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３７のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－３９．１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、標的の多型領域に由来する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３８のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４０．生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含み、１つ以上の原子の各々が、独立して、炭素、酸素、窒素、水素、硫黄、リン、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マンガン、マグネシウム、銅、鉄、モリブデン、およびニッケルからなる群から選択される、実施形態Ｉ－１～Ｉ－３９のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４１．生物学的機能または生物学的応答に関連する１つ以上のアミノ酸を含み、１つ以上のアミノ酸の各々が、独立して、タンパク質を作る天然アミノ酸、タンパク質を作らない天然アミノ酸、または化学的に合成された非天然アミノ酸である、実施形態Ｉ－１～Ｉ－４０のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４２．操作されたペプチドが、参照標的と比較して、少なくとも１つの構造差を有する、実施形態Ｉ－１～Ｉ－４１のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４３．少なくとも１つの構造差が、独立して、配列、アミノ酸残基の数、原子の総数、総親水性、総疎水性全正電荷、全負電荷、１つ以上の二次構造、形状因子、ゼルニケ記述子、ファンデルワールス表面、構造グラフノードおよびエッジ、体積表面、静電電位表面、疎水性電位表面、局所直径、局所表面特徴、骨格モデル、電荷密度、親水性密度、表面対体積比、両親媒性密度、ならびに表面粗さからなる群から選択される、実施形態Ｉ－４２に記載の操作されたペプチド
実施形態Ｉ－４４．１つ以上の二次構造における差が、参照標的と比較して、操作されたペプチド中の１つ以上の追加の二次構造要素の存在であり、各追加の二次構造要素が、独立して、アルファヘリックス、ベータ－シート、ループ、ターン、およびコイルからなる群から選択される、実施形態Ｉ－１６に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４５．アミノ酸の１０％～９０％が、１つ以上の非参照標的由来の位相的制約を満たす、実施形態Ｉ－１～Ｉ－４４のいずれか１つに記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４６．１つ以上の非参照標的由来の位相的制約が、予め指定された機能を強化する、実施形態Ｉ－４５に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４７．
非参照由来の位相的制約が、ペプチドの参照由来の画分中の二次構造要素を強化もしくは安定化する、
非参照由来の位相的制約が、ペプチドの参照由来の画分中の原子変動を強化する、
非参照由来の位相的制約が、ペプチド総疎水性を改変する、
非参照由来の位相的制約が、ペプチド溶解性を改変する、
非参照由来の位相的制約が、ペプチド総電荷を改変する、
非参照由来の位相的制約が、標識アッセイまたは標識フリーアッセイにおける検出を可能にする、
非参照由来の位相的制約が、インビトロアッセイにおける検出を可能にする、
非参照由来の位相的制約が、インビボアッセイにおける検出を可能にする、
非参照由来の位相的制約が、複雑な混合物からの捕捉を可能にする、
非参照由来の位相的制約が、酵素処理を可能にする、
非参照由来の位相的制約が、細胞膜透過性を可能にする、
非参照由来の位相的制約が、二次標的への結合を可能にする、かつ
非参照由来の位相的制約が、免疫原性を改変する、実施形態Ｉ－４６に記載の操作されたペプチド。
実施形態Ｉ－４８．操作されたペプチドを選択する方法であって、
参照標的の１つ以上の位相的特性を特定することと、
参照標的に由来する空間的に関連する位相的制約の組み合わせを生成するように、各位相的特性に対して空間的に関連する制約を設計することと、
候補ペプチドの空間的に関連する位相的特性を、参照標的に由来する空間的に関連する位相的制約の組み合わせと比較することと、
参照標的に由来する空間的に関連する位相的制約の組み合わせと重複する、空間的に関連する位相的特性を有する候補ペプチドを選択して、操作されたペプチドを生成することと、を含む、方法。
実施形態Ｉ－４９．各特性間の重複が、独立して、総位相的制約距離（ＴＣＤ）、位相的クラスタリング係数（ＴＣＣ）、ユークリッド距離、パワー距離、ソアーゲル距離、キャンベラ距離、ソーレンセン距離、ジャッカード距離、マハラノビス距離、ハミング距離、らしさの定量的評価（ＱＥＬ）、または鎖位相パラメータ（ＣＴＰ）のうちの１つ以上によって決定されるとき、７５％以下の平均誤差率（ＭＰＥ）である、実施形態Ｉ－４８に記載の方法。
実施形態Ｉ－５０．１つ以上の制約が、残基当たりのエネルギー、残基当たりの相互作用、残基当たりの変動、残基当たりの原子間距離、残基当たりの化学記述子、残基当たりの溶媒曝露、残基当たりのアミノ酸配列類似性、残基当たりの生物情報記述子、残基当たりの非共有結合傾向、残基あたりファイ／プサイ角、残基当たりのファンデルワールス半径、残基当たりの二次構造傾向、残基当たりのアミノ酸隣接性、残基当たりのアミノ酸接触に由来する、実施形態Ｉ－４８またはＩ－４９に記載の方法。
実施形態Ｉ－５１．１つ以上の候補ペプチドの特性が、コンピュータシミュレーションによって決定される、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－５２．コンピュータシミュレーションが、分子動力学シミュレーション、モンテカルロシミュレーション、粗視化シミュレーション、ガウスネットワークモデル、機械学習、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態Ｉ－５１に記載の方法。
実施形態Ｉ－５３．１つ以上の候補ペプチドの特性が、実験的特性評価によって決定される、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－５４．１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸が、参照標的と１０％～９０％の配列相同性を有する、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－５５．１つ以上の参照標的由来の制約を満たすアミノ酸が、３０Å２～３０００Å２の参照とのファンデルワールス表面積重複を有する、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－５６．組み合わせが、少なくとも２つの参照標的由来の制約を含む、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－５７．組み合わせが、少なくとも５つの参照標的由来の制約を含む、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－５８．制約の組み合わせが、参照標的に由来しない１つ以上の制約を含む、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－５９．１つ以上の非参照標的由来の制約が、所望の構造的、動力学的、化学的、もしくは機能的な特性、またはそれらの任意の組み合わせを記述する、実施形態Ｉ－５８に記載の方法。
実施形態Ｉ－６０．制約が、独立して、以下からなる群から選択される、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－５９のいずれか１つに記載の方法。
原子間距離、
原子変動、
原子エネルギー、
化学記述子、
溶媒曝露、
アミノ酸配列類似性、
生物情報記述子、
非共有結合傾向、
ファイ角、
プサイ角、
ファンデルワールス半径、
二次構造傾向、
アミノ酸隣接性、および
アミノ酸接触。
実施形態Ｉ－６１．１つ以上の制約が、独立して、原子変動である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－６２．１つ以上の制約が、独立して、化学記述子である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－６３．１つ以上の制約が、独立して、原子間距離である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－６２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－６４．１つ以上の制約が、独立して、二次構造である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－６５．１つ以上の制約が、独立して、ファンデルワールス表面である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－６６．１つ以上の制約が、独立して、生物学的応答または生物学的機能に関連する、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－６７．操作されたペプチドが、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含む、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－６８．操作されたペプチドが、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上のアミノ酸を含む、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－６６のいずれか１つに記載の方法
実施形態Ｉ－６９．生物学的応答または生物学的機能が、遺伝子発現、代謝活性、タンパク質発現、細胞増殖、細胞死、サイトカイン分泌、キナーゼ活性、エピジェネティック修飾、細胞死滅活性、炎症シグナル、走化性、組織浸潤、免疫細胞系統の拘束、組織微小環境修飾、免疫シナプス形成、ＩＬ－２分泌、ＩＬ－１０分泌、成長因子分泌、インターフェロンガンマ分泌、形質転換成長因子ベータ分泌、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ活性、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ活性、抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害、生物学的経路アゴニスト作用、生物学的経路アンタゴニスト作用、生物学的経路再配向、キナーゼカスケード修飾、タンパク質分解経路修飾、タンパク質恒常性経路修飾、タンパク質折り畳み／経路、翻訳後修飾経路、代謝経路、遺伝子転写／翻訳、ｍＲＮＡ分解経路、遺伝子メチル化／アセチル化経路、ヒストン修飾経路、エピジェネティック経路、免疫依存性クリアランス、オプソニン化、ホルモンシグナル伝達、インテグリン経路、膜タンパク質シグナル伝達、イオンチャネルフラックス、およびｇ－タンパク質共役受容体応答からなる群から選択される、実施形態Ｉ－６６～Ｉ－６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－７０．参照標的が、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含み、
生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の１つ以上の原子の原子変動が、生物学的応答または生物学的機能に関連する参照標的中の１つ以上の原子の原子変動と重複する、実施形態Ｉ－６６に記載の方法。
実施形態Ｉ－７１．重複が、０．２５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である、実施形態Ｉ－７０に記載の方法。
実施形態Ｉ－７２．重複が、０．７５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）を有する、実施形態Ｉ－７１に記載の方法。
実施形態Ｉ－７３．生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の原子の少なくとも一部分が、参照標的中の二次構造要素に位相的に制約される、実施形態Ｉ－６７～Ｉ－６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－７４．二次構造要素が、ベータ－シートである、実施形態Ｉ－７３に記載の方法。
実施形態Ｉ－７５．二次構造要素が、アルファヘリックスである、実施形態Ｉ－７３に記載の方法。
実施形態Ｉ－７６．二次構造要素が、ターンであり、ターンが、２～７個の残基を含み、少なくとも１つの残基間水素結合を含む、実施形態Ｉ－７３に記載の方法。
実施形態Ｉ－７７．二次構造要素が、コイルであり、コイルが、２～２０個の残基を含む、実施形態Ｉ－７３に記載の方法。
実施形態Ｉ－７８．コイルが、残基間水素結合を含まない、実施形態Ｉ－７３に記載の方法。
実施形態Ｉ－７９．生物学的応答または生物学的機能に関連する操作されたペプチド中の原子の少なくとも一部分が、ベータ－シート、アルファヘリックス、ターン、およびコイルからなる群から独立して選択される２つ以上の二次構造要素の組み合わせに位相的に制約される、実施形態Ｉ－６７～Ｉ－６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－８０．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、原子間距離である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－７９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－８１．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、原子エネルギーである、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－８０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－８２．各原子エネルギーが、独立して、２つの原子間のペアワイズ引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ反発エネルギー、原子レベルの溶媒和エネルギー、２つの原子間のペアワイズ荷電引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ水素結合引力エネルギー、または非共有結合エネルギーである、実施形態Ｉ－８１に記載の方法。
実施形態Ｉ－８３．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、化学記述子である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－８２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－８４．各化学記述子が、独立して、疎水性、極性、体積、正味電荷、ｌｏｇＰ、高速液体クロマトグラフィー保持、またはファンデルワールス半径である、実施形態Ｉ－８３に記載の方法。
実施形態Ｉ－８５．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、生物情報記述子である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－８４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－８６．各生物情報記述子が、独立して、ＢＬＯＳＵＭ類似性、ｐＫａ、ｚＳｃａｌｅ、クルチアーニ特性、キデラ因子、ＶＨＳＥスケール、ＰｒｏｔＦＰ、ＭＳ－ＷＨＩＭスコア、Ｔスケール、ＳＴスケール、膜貫通傾向、タンパク質が埋まった領域、ヘリックス傾向、シート傾向、コイル傾向、ターン傾向、免疫原性傾向、抗体エピトープ発生、またはタンパク質界面発生である、実施形態Ｉ－８５に記載の方法。
実施形態Ｉ－８７．１つ以上の空間的に関連する位相的制約が、溶媒曝露である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－８８．１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、ＧＰＣＲ細胞外ドメインである、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－８９．１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、イオンチャネル細胞外ドメインである、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－８８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－９０．１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、タンパク質－タンパク質またはタンパク質－ペプチドの界面接合である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－８９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－９１．１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、標的の多型領域に由来する、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－９０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－９２．操作されたペプチドが、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含み、１つ以上の原子の各々が、独立して、炭素、酸素、窒素、水素、硫黄、リン、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マンガン、マグネシウム、銅、鉄、モリブデン、およびニッケルからなる群から選択される、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－９１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－９３．操作されたペプチドが、生物学的機能または生物学的応答に関連する１つ以上のアミノ酸を含み、１つ以上のアミノ酸の各々が、独立して、タンパク質を作る天然アミノ酸、タンパク質を作らない天然アミノ酸、または化学的に合成された非天然アミノ酸である、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－９２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－９４．操作されたペプチドが、参照標的と比較して、少なくとも１つの構造差を有する、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－９５．少なくとも１つの構造差が、独立して、配列、アミノ酸残基の数、原子の総数、総親水性、総疎水性全正電荷、全負電荷、１つ以上の二次構造、形状因子、ゼルニケ記述子、ファンデルワールス表面、構造グラフノードおよびエッジ、体積表面、静電電位表面、疎水性電位表面、局所直径、局所表面特徴、骨格モデル、電荷密度、親水性密度、表面対体積比、両親媒性密度、ならびに表面粗さからなる群から選択される、実施形態Ｉ－９４に記載の方法
実施形態Ｉ－９６．１つ以上の二次構造における差が、参照標的と比較して、操作されたペプチド中の１つ以上の追加の二次構造要素の存在であり、各追加の二次構造要素が、独立して、アルファヘリックス、ベータ－シート、ループ、ターン、およびコイルからなる群から選択される、実施形態Ｉ－９５に記載の方法。
実施形態Ｉ－９７．操作されたペプチドのアミノ酸の１０％～９０％が、１つ以上の非参照標的由来の位相的制約を満たす、実施形態Ｉ－４８～Ｉ－９６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－９８．１つ以上の非参照標的由来の位相的制約が、予め指定された機能を強化する、実施形態Ｉ－９７に記載の方法。
実施形態Ｉ－９９．
非参照由来の位相的制約が、ペプチドの参照由来画分中の二次構造要素を実行または安定化させるか、
非参照由来の位相的制約が、ペプチドの参照由来の画分中の原子変動を強化するか、
非参照由来の位相的制約が、ペプチド総疎水性を改変するか、
非参照由来の位相的制約が、ペプチド溶解性を改変するか、
非参照由来の位相的制約が、ペプチド総電荷を改変するか、
非参照由来の位相的制約が、標識アッセイもしくは標識フリーアッセイにおける検出を可能にするか、
非参照由来の位相的制約が、インビトロアッセイにおける検出を可能にするか、
非参照由来の位相的制約が、インビボアッセイにおける検出を可能にするか、
非参照由来の位相的制約が、複雑な混合物からの捕捉を可能にするか、
非参照由来の位相的制約が、酵素処理を可能にするか、
非参照由来の位相的制約が、細胞膜透過性を可能にするか、
非参照由来の位相的制約が、二次標的への結合を可能にするか、もしくは
非参照由来の位相的制約が、免疫原性を改変するか、
またはそれらの任意の組み合わせである、実施形態Ｉ－９８に記載の方法。
実施形態Ｉ－１００．２つ以上の選択誘導ポリペプチドを含む組成物であって、各ポリペプチドが、独立して、１つ以上の正の誘導特性を含む正の選択分子、または１つ以上の負の誘導特性を含む負の選択分子であり、各特性タイプが、独立して、
アミノ酸配列、
ポリペプチド二次構造、
分子動力学、
化学的特徴、
生物学的機能、
免疫原性、
参照標的（複数可）の多重特異性、
異種間参照標的反応性、
望ましくない参照標的（複数可）に対する所望の参照標的（複数可）の選択性、
配列および／または構造的に相同なファミリー内の参照標的（複数可）の選択性、
類似のタンパク質機能を有する参照標的（複数可）の選択性、
高配列および／または構造的に相同性を有する望ましくない標的のより大きいファミリーからの、別個の所望の参照標的（複数可）の選択性、
別個の参照標的対立遺伝子または変異に対する選択性、
別個の参照標的残基レベルの化学修飾に対する選択性、
細胞型に対する選択性、
組織型に対する選択性、
組織環境に対する選択性、
参照標的（複数可）の構造多様性に対する耐性、
参照標的（複数可）の配列多様性に対する耐性、ならびに
参照標的（複数可）の動態多様性に対する耐性、からなる群から選択され、
２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、実施形態Ｉ－１に記載の操作されたペプチドである、組成物。
実施形態Ｉ－１０１．２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、正の選択分子であり、２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、負の選択分子である、実施形態Ｉ－１００に記載の組成物。
実施形態Ｉ－１０２．２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然タンパク質である、実施形態Ｉ－１００またはＩ－１０１に記載の組成物。
実施形態Ｉ－１０３．少なくとも１つの共有の特性タイプを含む、対応する正の選択分子および負の選択分子の少なくとも１つの対を含み、正の選択分子が、正の特性を含み、負の選択分子が、負の特性を含む、実施形態Ｉ－１００～Ｉ－１０２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態Ｉ－１０４．実施形態Ｉ－１００に記載の組成物を用いて結合分子のライブラリをスクリーニングする方法であって、候補結合分子のプールを少なくとも１回の選択ラウンドに供することを含み、各選択ラウンドが、
プールの少なくとも一部分を負の選択分子に不利に、スクリーニングする負の選択ステップと、
プールの少なくとも一部分を正の選択分子に有利に、スクリーニングする正の選択ステップと、を含み、
各ラウンド内の選択ステップの順序、およびラウンドの順序が、代替の順序とは異なるプールのサブセットの選択をもたらす、方法。
実施形態Ｉ－１０５．結合分子のライブラリが、ファージライブラリである、実施形態Ｉ－１０４に記載の方法。
実施形態Ｉ－１０６．結合分子のライブラリが、細胞ライブラリである、実施形態Ｉ－１０５に記載の方法。
実施形態Ｉ－１０７．結合分子のライブラリが、Ｂ細胞ライブラリである、実施形態Ｉ－１０６に記載の方法。
実施形態Ｉ－１０８．結合分子のライブラリが、Ｔ細胞ライブラリである、実施形態Ｉ－１０６に記載の方法。
実施形態Ｉ－１０９．２回以上の選択ラウンドを含む、実施形態Ｉ－１０４～Ｉ－１０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１０．３回以上の選択ラウンドを含む、実施形態Ｉ－１０４～Ｉ－１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１１．各ラウンドが、異なる選択分子のセットを含む、実施形態Ｉ－１０９またはＩ－１１０に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１２．少なくとも２ラウンドが、同じ負の選択分子、または同じ正の選択分子、またはその両方を含む、実施形態Ｉ－１０９またはＩ－１１０に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１３．次の選択ラウンドに進む前に、ある選択ラウンドから得られたプールのサブセットを分析することを含む、実施形態Ｉ－１０９～Ｉ－１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１４．サブセットプール分析が、１つ以上の後続の選択ラウンドで使用される、正および／または負の選択分子のセットを決定する、実施形態Ｉ－１１３に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１５．各サブセットプール分析が、独立して、ペプチド／タンパク質バイオセンサー結合、ペプチド／タンパク質ＥＬＩＳＡ、ペプチドライブラリ結合、細胞抽出物結合、細胞表面結合、細胞活性アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、酵素活性アッセイ、遺伝子発現プロファイル、タンパク質修飾アッセイ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学からなる群から選択される、実施形態Ｉ－１１３またはＩ－１１４に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１６．１つ以上の後続の選択ラウンドで使用される正、負、または正および負の両方の選択分子が、サブセットプール分析の統計／情報スコアリングまたは機械学習訓練によって決定される、実施形態Ｉ－１１３～Ｉ－１１５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１７．ある選択ラウンドから得られたサブセットプールが、次の選択ラウンドに移動する前に修飾される、実施形態Ｉ－１０９～Ｉ－１１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ｉ－１１８．サブセットプール分析が、１回以上の後続の選択ラウンドで使用される、正、負、または正および負の両方の選択分子を決定し、次の選択ラウンドに移動する前にサブセットプールを修飾する、実施形態Ｉ－１１７に記載の方法。
実施形態Ｉ－１１９．各修飾が、独立して、遺伝子変異、遺伝子枯渇、遺伝子濃縮、化学修飾、および酵素修飾から選択される群から選択される、実施形態Ｉ－１１７またはＩ－１１８に記載の方法。
以下の実施例は、単に例示的なものであり、本開示のいかなる態様をいかなる方法で制限することも意図するものではない。
実施例１：参照標的としてのＶＥＧＦエピトープを使用した、操作されたペプチドの選択
図６Ａおよび７Ａに示されるように、ＶＥＧＦの推定治療用エピトープを、操作されたペプチド選択の参照標的として特定し、原子間距離およびアミノ酸記述子位相を決定した（図６Ｂ）。参照標的の原子間距離およびアミノ酸記述子位相を、動力学シミュレーションを使用して得て、参照標的中のエピトープに対して原子変動の共分散行列を生成した。次に、異なる操作されたペプチド候補を、コンピュータ計算タンパク質設計（例えば、ロゼッタ）を使用して生成し、動力学シミュレーションを候補に対して実行し、原子間距離およびアミノ酸記述子位相を決定した（図６Ｃ～６Ｅ）。これらの位相のこれらの平均誤差率（ＭＰＥ）を比較した（図６Ｇ～６Ｈ）。ＭＰＥ値は、参照位相対候補１位相：６．０３％、参照位相対候補２位相：６．００％、および参照位相対候補３位相：２２．８％であった。
１つの候補の操作されたペプチドの評価のために、組み合わせに追加の制約、原子変動を加えた（図６Ｇ～６Ｈ）。この候補とＶＥＧＦ由来の参照標的との間の高次元位相類似性を比較すると、ＭＰＥは、３６．６％であった。
実施例２：参照標的としてのＶＥＧＦエピトープを使用した、操作されたペプチドの選択
上記の実施例１で特定されたのと同じ参照標的を使用して、操作されたペプチドの第２のセットを作成した。候補の操作されたペプチドを、コンピュータ計算タンパク質設計（例えば、ロゼッタ）または他のペプチド空間をサンプリングする方法を使用して生成し、動力学シミュレーションを候補に対して実行した。原子変動の共分散行列を、参照標的エピトープに対して、および参照標的のエピトープ中の残基に対応する候補中の残基に対して生成した。
各共分散行列、すなわち、参照標的に対する１つの共分散行列、および候補の各々に対する１つの共分散についての固有ベクトルおよび固有値をコンピュータ計算するために、主成分分析を実施し、最大の固有値を有する固有ベクトルのみを保持する（図８）。固有ベクトルは、シミュレーションされた分子構造のセットで観察された１番目、２番目、３番目、Ｎ番目に主要な運動を記述する。候補が参照エピトープのように運動する場合、その固有ベクトルは、参照標的（エピトープ）の固有ベクトルと類似しているであろう。固有ベクトルの類似性は、アラインされ、同じ方向を指しているそれらの成分（各ＣＡ原子を中心とする３Ｄベクトル）に相当する（図７Ｄ～７Ｇ）。候補と参照標的との固有ベクトル間のこの類似性を、２つの固有ベクトルの内積を使用してコンピュータ計算した。内積値は、２つの固有ベクトルが互いに９０度である場合、０であるか、または２つの固有ベクトルが正確に同じ方向を指す場合、１であった。
固有ベクトルの順序は、それらの固有値に基づくため、かつ固有値は、分子動力学シミュレーションがそれらの異なる分子の根底にあるエネルギー地形をサンプリングする確率的性質により、２つの異なる分子間で必ずしも同一ではない可能性があるため、複数の個別にランク付けされた固有ベクトル間の内積が必要であった（例えば、参照標的の固有ベクトル２、３、４などを掛けた、候補の固有ベクトル１）。さらに、いかなる理論によっても束縛されることを望まないが、分子運動は複雑であり、２つ以上の（または数個以上の）主要／重要な運動モードを伴い得る。
これら２つの課題を解決するため、候補および参照標的中の固有ベクトルのすべての対間の内積をコンピュータ計算した。これは、内積の行列をもたらし、その次元は、分析される固有ベクトルの数によって決定され、１０個の固有ベクトルに対して、内積の行列は、１０×１０である。内積のこの行列を、内積の二乗平均平方根値をコンピュータ計算することによって単一の値にまとめた。これは、二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である。
主成分分析（ＰＣＡ）は、３Ｌ×３Ｌ次元座標共分散行列（Ｌは、原子数である）を、固有ベクトル、Φ（参照標的）、およびΨ（ＭＥＭ）、ならびに固有値Λに換算する。セットΦは、参照標的に対してＮ個の固有ベクトルφｉを含み、セットΨは、ＭＥＭに対してＮ個の固有ベクトルψｊを有し、固有ベクトルは、それらの関連する固有値によってそれらの個々のセット内で順序付けられる。最大の固有値を有する固有ベクトルは、全座標共変量の最大の部分を占める。参照標的とＭＥＭとの間の運動の類似性を比較するために、各φｉおよびψｊ固有ベクトルの内積をコンピュータ計算する。φｉおよびψｊ固有ベクトルのすべての内積組み合わせの二乗平均平方根は、参照標的（ＲＭＳＩＰ）に対する候補の操作されたペプチド（ＭＥＭ）の運動の全類似性を提供する（図８）。
５つの候補の操作されたペプチド対ＶＥＧＦ参照エピトープからのＲＭＳＩＰ結果が、表１に示される。これらのデータを、候補対参照静的構造ＲＭＳＤカットオフを用いたロゼッタ設計を使用して生成された１０００個の候補の全シミュレーションからサンプリングした。１０００個の候補のうち、ＸＴＲ－１０００－Ｔ０は、最も低いロゼッタ（静的構造）エネルギー（低い方がより望ましい）を有したが、中間のＲＭＳＩＰ動態一致を有した。候補ＸＴＲ－１０００－Ｂ１およびＢ２は、最も高い動態一致スコアを有した（例えば、それらの運動は、ＲＭＳＩＰによってコンピュータ計算される参照標的の運動と最も厳密に一致した）。候補ＸＴＲ－１０００－Ｗ１およびＷ２は、この１０００個の候補データセットにおけるＲＭＳＩＰ動的範囲、ＲＭＳＩＰ範囲０．７７２～０．５４５を実証することが示された、最も低い動態一致スコアを有した。ＶＥＧＦ参照エピトープにアラインされた候補の構造が、図７Ｂに示される。
Figure 2022535511000009
実施例３：ＶＥＧＦ推定エピトープのための、操作されたペプチドを使用したファージのプログラムされたインビトロ選択
実施例１に記載される３つの操作されたペプチド、および類似の手順後に作成された追加の第４の操作されたペプチドを、一連のファージパニング手順で使用した。これらのペプチドは、図９に示される。ペプチドのうちの２つは、正の選択分子（ｕＭＥＭおよびｓＭＥＭ）であり、２つは、負の選択分子（ｉＭＥＭ２およびｉＭＥＭ１）であった。ｓＭＥＭペプチドは、高い位相参照一致であり、ｕＭＥＭは、より低い位相参照一致であった。２つのｉＭＥＭペプチドは、ゼロの位相参照一致であり、所望の結合相互作用以外の理由で、ｓＭＥＭまたはｕＭＥＭに結合する結合パートナーに不利に選択するために、ｓＭＥＭおよびｕＭＥＭの逆バージョンとして含まれた。バイオセンサーアッセイを使用したビオチン結合ペプチドの分析は、ベバシズマブへの結合を確認し、これは、参照標的に対する候補位相の類似性によって予測された。
Ｏｃｔｅｔ／バイオセンサースクリーニング：異なる操作されたペプチドの親和性を、単一サイクルの動力学アッセイ設計を使用して、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ３８４機器上で評価した。ペプチドを別々に評価し、ビオチンリンカーを介してバイオセンサーのストレプトアビジンコーティングチップに固定した。残りのストレプトアビジンで覆われていない部位を、ビオシチンで遮断した。分析物を、センサー先端上で洗浄し、ペプチドへの分析物中の分子の結合を記録した。このアッセイについては、分析物は、０．１９ｕＭ～１．５ｕＭのベバシズマブの段階希釈であった。各アッセイを、２連で実行した。対照もまた、緩衝液（センサードリフトの制御用）のみ、およびヒトＮＤ血清からの精製されたＩｇＧの別個の対照（非特異的ＩｇＧ結合の制御用）を使用して実行した。
７つの異なるパニングプログラムを考案し、各々は、３ラウンドを含み、各ラウンドは、正の選択ステップと負の選択ステップとを含む（図１１）。各プログラムは、選択分子として少なくとも１つの操作されたペプチドを使用した。従来の方法（正の標的としてのＶＥＧＦ、および非特異的結合に不利に選択する負の標的としてのＢＳＡ）を使用して、従来の選択も含んだ。７３８個のクローンを、３回のパニングラウンド後にＥＬＩＳＡ応答分析のために選択した。
パニングプロトコルは、ヒトナイーブｓｃＦｖライブラリから開始し、パニングを溶液中で実行し、選択分子は、ビオチンに結合していた（ただしなおも溶液中で）。各ラウンドについて、出発プールを、最初に溶液中で負の選択分子と組み合わせ、次いで、ストレプトアビジンコーティング基質（例えば、磁気ビーズ）を混合物に適用して、負の選択分子に結合した。したがって、負の選択分子に結合したプール内の任意のファージも、ストレプトアビジンコーティング支持体に結合していた。残りの溶液を除去し、この通過画分を正の選択ステップに採用した。通過画分を正の選択分子と組み合わせ、結合させ、次いで、ストレプトアビジンコーティング固体基質を混合物に適用した。このステップでは、結合ファージを保持しながら、残りの非結合ファージを除去した。次いで、結合ファージを次いで溶出した。Ｅ．ｃｏｌｉを、３０分間の培養を使用して、溶出したファージでトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を、次世代シーケンシングおよび分析用のＤＮＡ単離のために分割し、次いで、後続のパニングラウンドで使用するためにファージを増幅した。各パニングプログラムについて、各ラウンドで、負の選択を最初に、正の選択を２番目に実行した。
次いで、７つのパニングプログラムの各々および従来のパニング方法から得られた候補プールを、ＶＥＧＦおよびｓＭＥＭ正の選択分子（補正ｉＭＥＭ）に対する応答についてＥＬＩＳＡを使用して分析して、完全長ＶＥＧＦおよび推定エピトープｓＭＥＭへの結合を評価した。これらのＥＬＩＳＡ試験の分析が、図１２Ａ～１２Ｂおよび１３Ａ～１３Ｈに示される。これらの結果は、操作されたペプチドを使用したインビトロ選択プログラムが、完全長ＶＥＧＦ結合傾向を低減せず、かつパンされたクローンにおいて推定のエピトープ選択的結合バイアスをもたらしたことを実証する。候補プールを、ベバシズマブ：ＶＥＧＦ結合の遮断について、交差遮断ＥＬＩＳＡアッセイでも試験した（０ｎＭ、６７ｐＭ、６７０ｐＭ、および６．７ｎＭでのベバシズマブとの用量応答競合）。これらの結果が、図１４Ａ～１４Ｉおよび表２に示され、各プログラムから得られた確認済みの交差遮断クローンの総数が、図１５に要約される。これらは、操作されたペプチドを使用したプログラム可能なインビトロ選択プログラムが、操作されたペプチドを得るために使用される参照標的エピトープを共有する、ベバシズマブを交差遮断する完全クローンライブラリからのクローンを単離することができたことを実証する。
Figure 2022535511000010
交差遮断挙動を示したクローンを、サンガーシーケンシングを介して配列決定し、１１個の別個のクローンが確認されたことがわかった。操作されたペプチドを使用したプログラムされたインビトロ選択から得られたものが、表３Ａに示される。ＶＥＧＦおよびＢＳＡを用いた従来の選択を介して得られたものが、表３Ｂに列挙される。図１７は、さらなる試験のために生成されたすべてのＦａｂについての結合、交差遮断、ＣＤＲ配列、および生殖細胞系列使用を要約する。図１７および図１８は、表３Ａおよび３Ｂに列挙されるＦａｂについてのＥＬＩＳＡ結合結果を示す。これらは、プログラム可能なインビトロ選択が、抗体ＣＤＲループの多様性およびＩｇ生殖細胞系利用を、従来のパニングとは異なる様式で誘導したことを実証する。
Figure 2022535511000011
Figure 2022535511000012
Figure 2022535511000013
選択プールを、以下の方程式を使用してスコアリングした。
遮断傾向＝ＳＵＭ（Ｘ遮断勾配、（ｓＭＥＭ＋ＶＥＧＦ）－ｉＭＥＭ）、式中、Ｘ遮断勾配、ｓＭＥＭ、およびＶＥＧＦは、ロバストＺスコアである。
スコアリングの論理的根拠：有意な（ロバストｚスコアによる）負の勾配を通して、遮断応答が観察される場合、遮断傾向は、ＶＥＧＦ結合およびＸ遮断勾配についてのｚスコアの組み合わせである。遮断傾向が、図１９および以下の表に要約される。
Figure 2022535511000014
（選択分子としてＶＥＧＦおよびＢＳＡのみを使用した）従来のプログラムと比較したすべてのインビトロ選択プログラムの均一でランダムなサンプリングを使用して、異なる選択プログラムを、対照（従来の）プログラムと比較した交差遮断濃縮について評価し、操作されたペプチドを使用した少なくとも４つのプログラムが、図２０に要約される濃縮を示した。交差遮断濃縮の統計的検定は、以下のように、クラスカル－ウォリス検定であった。
１．すべてのパニングプログラムからの９６個のクローンのランダム－均一なサンプル、交差遮断活性を測定する
２．すべての９６個のクローンにわたって交差遮断をランク付けする
３．クラスカル－ウォリス検定を実行して、対照に対するプログラム毎の交差遮断ランクの平均を計算する
４．Ｘ遮断濃縮＝１００％＊（プログラム交差遮断平均ランク－対照平均ランク）／（対照平均ランク）
クローンを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）にも供して、ゲノムレベルでＣＤＲループについての情報を得た。図２１は、ＮＧＳサンプルの調製の図式的概説を提供する。簡潔に述べると、発現ベクターの定常部分で個々の重鎖配列および軽鎖配列をクローニングすることによって、サンプルを調製した。２×２５０のペアエンドシーケンシングランを使用し、読み取りを結合し、ＰｙＩｇなどのツールで注釈付けした。
配列を分析して、２つの固有の配列が、「クローン性」と称されるシーケンシングエラーではなく、実際に異なる抗体であるかを判定した。図２２に示されるように、正規化シャノン評価も使用した。各プログラムの各ラウンドのクローン性の要約が、図２３に示される。
完全長タンパク質（ＶＥＧＦ）のみを使用した古典的なパニングアプローチは、多様性に焦点を合わせるが（プログラム１２）、操作されたペプチドがプログラムされたパニングアプローチは、レパートリー多様性に少なくとも２倍より効率的に焦点を合わせる。図２４Ａ～２４Ｌは、ラウンド１（図２４Ａ～２４Ｄ）、ラウンド２（図２４Ｅ～２４Ｈ）、およびラウンド３（図２４Ｉ～２４Ｌ）のための異なるスクリーニングラウンドが、結果として生じる選択されたプールの多様性をどのように形作るかを分析する、ペアリング頻度比較および次元チャートである。
操作されたペプチド（ＭＥＭ）がプログラムされたインビトロ選択は、第１の選択ラウンドにおいて、従来のアプローチと比較してより高い多様性の生殖細胞系列使用を伴う別個の抗体クローン型を単離する。ｓＭＥＭベースのインビトロ選択を使用することで、完全長抗原およびｕＭＥＭと比較して、ラウンド１においてより多様な軽鎖生殖細胞系列使用がもたらされる。ＭＥＭベースのインビトロ選択プログラムは、完全長抗原と比較して、ラウンド２において異なる重鎖生殖細胞系列使用をもたらす。インビトロ選択プログラムで使用されるＭＥＭの順序および同一性は、重鎖生殖細胞系列使用に影響を与える。ＭＥＭベースのインビトロ選択プログラムは、完全長抗原と比較して、ラウンド２において異なる軽鎖生殖細胞系列使用をもたらす。インビトロ選択プログラムで使用されるＭＥＭの順序および同一性は、軽鎖生殖細胞系列使用に影響を与える。ＭＥＭベースのインビトロ選択プログラムは、完全長抗原と比較して、ラウンド３において異なる、かつより多様な重鎖生殖細胞系列使用をもたらす。インビトロ選択プログラムで使用されるＭＥＭの順序および同一性は、重鎖生殖細胞系列使用および多様性に影響を与える。ＭＥＭベースのインビトロ選択プログラムは、完全長抗原と比較して、ラウンド３において異なる、かつより多様な軽鎖生殖細胞系列使用をもたらす。インビトロ選択プログラムで使用されるＭＥＭの順序および同一性は、軽鎖殖細胞系列使用および多様性に影響を与える。
異なるファージパニングプログラムがＦａｂヒットにどのように焦点を合わせたかの要約が、図２５Ａおよび２５Ｂに提供される。
図２６に示される各プログラムのパニングラウンド当たりのエピトープ上の（ｓＭＥＭ）ＶＥＧＦヒット頻度を要約するグラフは、操作されたペプチドのインビトロ選択プロトコルが、ＶＥＧＦに結合してベバシズマブを遮断することが確認された固有のｍＡｂヒットを特定したことを示し、これらのヒットの多くは、従来のアプローチでは特定されなかった。図２７は、各プログラムのパニングラウンド当たりのエピトープ外のＶＥＧＦヒット頻度を要約し、従来のプログラムが、ＶＥＧＦを結合することが確認されたが推定のエピトープ選択的ｍＡｂヒットではない、ｍＡｂヒットを特定したことを示す。図２８は、結合を要約する。
実施例４：ＰＤ－Ｌ１治療用エピトープのための、操作されたペプチドを使用したファージのプログラムされたインビトロ選択
ＰＤ－Ｌ１上で特定された治療用エピトープ参照標的部位を使用して、一連の操作されたペプチド（ＭＥＭ）を、図２９～３１Ｄに要約されるように、実施例２に記載されるのと類似のプロトコルに概して従って設計した。これらの３つの操作されたペプチド、ｓＭＥＭ、ｎＭＥＭ（両方の正の選択分子）、およびｉＭＥＭ（逆特性を有する負の選択分子）の能力を、バイオセンサーを使用して、２つの抗ＰＤ－Ｌ１であるアベルマブおよびデュルバルマブへの結合について評価し（両方の抗体が、参照標的エピトープに結合することが知られている）、データが、図３１Ａ～３２Ｃに示される。操作されたペプチドを使用した一連の５つの異なるパニングプログラムを、図３３に示されるように、従来の選択分子ＰＤ－Ｌ１およびＢＳＡを使用した対照プログラムのように設計し、ファージ上に提示されるナイーブヒトＩｇ ｓｃＦｖフォーマットライブラリをスクリーニングするために使用した。実施例３で上述したような類似のパニングプロトコルを使用した。各パニングプログラムについて、各ラウンドで、負の選択を最初に、正の選択を２番目に実行した。
ＰＤ－Ｌ１および異なる操作されたペプチドに対する、各プログラムを使用して選択された結果として生じるプールのＥＬＩＳＡ応答が、図３４～３８に要約され、異なるプログラムを比較する完全ＥＬＩＳＡ応答が、図３９Ａ～３９Ｕに提供される。また、選択されたプールを、図４０に要約されるように、所望の結合挙動の異なる組み合わせを有する異なる選択フィルタ基準を使用して分析した。交差遮断アッセイにさらに通したＥＬＩＳＡ結果から選択された異なるクローンの要約が、以下の表２Ａおよび２Ｂに提供される。
Figure 2022535511000015
Figure 2022535511000016
これらのＥＬＩＳＡヒットを、０ｎＭ、６７ｐＭ、６７０ｐＭ、および６．７ｎＭにおけるアベルマブまたはデュルバルマブとの用量応答ＰＤ－Ｌ１競合を用いて分析して、３４個の推定交差遮断クローンヒットを特定した。遮断傾向を、次のように計算した：ＥＬＩＳＡ Ｚスコア（ｓＭＥＭ１＋ｓＭＥＭ５＋ＰＤ－Ｌ１－ｉＭＥＭ）＋ＭＡＸ（アベルマブ遮断Ｚスコア、デュルバルマブ遮断Ｚスコア）。結果の要約が、以下の表３に提供される。
Figure 2022535511000017
ＥＬＩＳＡ応答が、図４２Ａ～４２Ｆに提供される。交差遮断ヒットから特定された２３個の別個のクローンを（サンガーシーケンシングを介して）配列決定し、図４３に列挙する。パニングプログラムにわたる交差遮断ヒットの別個のクローン数の要約が、図４４に提供される。
これらの結果を分析して、インビトロ選択プログラムのいずれかが、ＰＤ－Ｌ１：アベルマブ／デュルバルマブを交差遮断するクローンのランダム選択濃縮をもたらすかを判定した。（選択分子としてＰＤ－Ｌ１およびＢＳＡのみを使用した）従来のプログラムと比較して、すべてのインビトロ選択プログラムの均一でランダムなサンプリングからのクローンを使用したＥＬＩＳＡおよび交差遮断データに基づいて、操作されたペプチドを使用したプログラムのうちの少なくとも２つが、濃縮を示した。クローンの結果および要約が、図４５Ａ～４６に示される（図４５Ｃ中の影付きの入力は、従来のパニングからのものである）。次の論理的根拠を分析で使用した：スコアリングの論理的根拠：有意な（ロバストｚスコアによる）負の勾配を通して、遮断応答が観察される場合、遮断傾向は、ＰＤ－Ｌ１、ＭＥＭ結合、およびＸ遮断勾配のｚスコアについての組み合わせであり、使用されるＸ遮断ｚスコアは、これらのＴｘ ｍＡｂが表面上にわずかに異なるエピトープを有するため、アベルマブ対デュルバルマブの最大ｚスコアである。
実施例５：操作されたペプチドの選択のための機械学習モデル
参照標的を使用して、参照標的（配列）の位相的特性を特定し、スキャフォールドブループリント（図６１、上）にコードする。スキャフォールドブループリントは、操作されたポリペプチド中のアミノ酸の配列を、参照標的中のアミノ酸の順序に一致するように制約し得る。配列相同性は、１００％に制約され得る（参照標的中の各アミノ酸は、ブループリント中の１つのアミノ酸に対応する）か、または配列相同性は、例えば、１０～９０％の相同性など、より低いものであってもよい。スキャフォールドブループリントは、ベクトル表現（図６１、左）に変換され、空間的に関連する位相的特性が、参照標的に由来する空間的に関連する位相的制約の組み合わせと重複して、操作されたペプチドを生成する、候補ポリペプチドを生成するために使用されてもよく、各スキャフォールドブループリントには、重複のスコアリングに基づいて標識が割り当てられる（図６１、右）。
機械学習（ＭＬ）モデルは、スキャフォールドブループリントおよび対応するスコアの表現を含む訓練データで訓練され得る。表現は、例えば、数値の一次元ベクトル、英数字データの二次元行列、正規化された数値の三次元テンソルであってもよい。より具体的には、場合によっては、表現は、介在するスキャフォールド残基位置の数の順序付きリストを含むベクトルである。標的－残基の順序が標的構造から推測され得るため、そのような表現が使用されてもよく、したがって、表現は、標的－残基位置のアミノ酸同一性を特定する必要はない。スキャフォールドブループリントのスコアは、各スキャフォールドブループリントのエネルギー項を決定するコンピュータ計算タンパク質モデリング（例えば、ロゼッタリモデラー）を使用して生成され得る。次いで、スコアは、コンピュータ計算タンパク質モデリングによって生成されるエネルギー項に基づいて計算され得る。
ＭＬモデルは、例えば、ブーストされた決定木アルゴリズム、決定木のアンサンブル、極度勾配ブースト（ＸＧＢｏｏｓｔ）モデル、ランダムフォレスト、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、および／または同種のものであり得る。訓練後、ＭＬモデルを、次いで、スキャフォールドブループリントのセットから予測スコアのセットを生成するために実行する。予測スコアが所望のスコアを上回る場合、予測スコアに対応するスキャフォールドブループリントを、コンピュータ計算タンパク質モデリングによってシミュレーションして、グラウンドトゥルーススコアを生成することができる。グラウンドトゥルーススコアおよび予測スコアを比較して、ＭＬモデルの再訓練を決定することができる。いくつかの移植では、訓練および実行ステップを、所望のスコアを有する最適な／改善されたスキャフォールドブループリントが予測されるまで、図６２に示されるように反復し得る。次いで、最適な／改善されたスキャフォールドブループリントを、操作されたペプチドに変換する。

Claims (119)

  1. 操作されたペプチドであって、前記操作されたペプチドが、１ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有し、最大５０個のアミノ酸を含み、前記操作されたペプチドが、
    空間的に関連する位相的制約の組み合わせを含み、前記制約のうちの１つ以上が、参照標的由来の制約であり、
    前記操作されたペプチドの前記アミノ酸の１０％～９８％が、前記１つ以上の参照標的由来の制約を満たし、
    前記１つ以上の参照標的由来の制約を満たす前記アミノ酸が、前記参照標的と８．０Å未満の骨格平均二乗偏差（ＲＳＭＤ）構造相同性を有する、操作されたペプチド。
  2. 前記１つ以上の参照標的由来の制約を満たす前記アミノ酸が、前記参照標的と１０％～９０％の配列相同性を有する、請求項１に記載の操作されたペプチド。
  3. 前記１つ以上の参照標的由来の制約を満たす前記アミノ酸が、３０Å２～３０００Å２の前記参照とのファンデルワールス表面積重複を有する、請求項１または２に記載の操作されたペプチド。
  4. 前記組み合わせが、少なくとも２つの参照標的由来の制約を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  5. 前記組み合わせが、少なくとも５つの参照標的由来の制約を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  6. 前記制約の組み合わせが、参照標的に由来しない１つ以上の制約を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  7. 前記１つ以上の非参照標的由来の制約が、所望の構造的、動力学的、化学的、もしくは機能的な特性、またはそれらの任意の組み合わせを記述する、請求項６に記載の操作されたペプチド。
  8. 前記制約が、独立して、以下からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
    原子間距離、
    原子変動、
    原子エネルギー、
    化学記述子、
    溶媒曝露、
    アミノ酸配列類似性、
    生物情報記述子、
    非共有結合傾向、
    ファイ角、
    プサイ角、
    ファンデルワールス半径、
    二次構造傾向、
    アミノ酸隣接性、および
    アミノ酸接触。
  9. １つ以上の制約が、独立して、原子変動である、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  10. １つ以上の制約が、独立して、化学記述子である、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  11. １つ以上の制約が、独立して、原子間距離である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  12. １つ以上の制約が、独立して、二次構造である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  13. １つ以上の制約が、独立して、ファンデルワールス表面である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  14. １つ以上の制約が、独立して、生物学的応答または生物学的機能に関連する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  15. 生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  16. 生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上のアミノ酸を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  17. 前記生物学的応答または生物学的機能が、遺伝子発現、代謝活性、タンパク質発現、細胞増殖、細胞死、サイトカイン分泌、キナーゼ活性、エピジェネティック修飾、細胞死滅活性、炎症シグナル、走化性、組織浸潤、免疫細胞系統の拘束、組織微小環境修飾、免疫シナプス形成、ＩＬ－２分泌、ＩＬ－１０分泌、成長因子分泌、インターフェロンガンマ分泌、形質転換成長因子ベータ分泌、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ活性、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ活性、抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害、生物学的経路アゴニスト作用、生物学的経路アンタゴニスト作用、生物学的経路再配向、キナーゼカスケード修飾、タンパク質分解経路修飾、タンパク質恒常性経路修飾、タンパク質折り畳み／経路、翻訳後修飾経路、代謝経路、遺伝子転写／翻訳、ｍＲＮＡ分解経路、遺伝子メチル化／アセチル化経路、ヒストン修飾経路、エピジェネティック経路、免疫依存性クリアランス、オプソニン化、ホルモンシグナル伝達、インテグリン経路、膜タンパク質シグナル伝達、イオンチャネルフラックス、およびｇ－タンパク質共役受容体応答からなる群から選択される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  18. 前記参照標的が、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含み、
    生物学的応答または生物学的機能に関連する前記操作されたペプチド中の前記１つ以上の原子の前記原子変動が、生物学的応答または生物学的機能に関連する前記参照標的中の前記１つ以上の原子の前記原子変動と重複する、請求項１５に記載の操作されたペプチド。
  19. 前記重複が、０．２５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である、請求項１８に記載の操作されたペプチド。
  20. 前記重複が、０．７５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）を有する、請求項１９に記載の操作されたペプチド。
  21. 生物学的応答または生物学的機能に関連する前記操作されたペプチド中の前記原子の少なくとも一部分が、前記参照標的中の二次構造要素に位相的に制約される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  22. 前記二次構造要素が、ベータ－シートである、請求項２１に記載の操作されたペプチド。
  23. 前記二次構造要素が、アルファヘリックスである、請求項２１に記載の操作されたペプチド。
  24. 前記二次構造要素が、ターンであり、前記ターンが、２～７個の残基を含み、少なくとも１つの残基間水素結合を含む、請求項２１に記載の操作されたペプチド。
  25. 前記二次構造要素が、コイルであり、前記コイルが、２～２０個の残基を含む、請求項２１に記載の操作されたペプチド。
  26. 前記コイルが、残基間水素結合を含まない、請求項２５に記載の操作されたペプチド。
  27. 生物学的応答または生物学的機能に関連する前記操作されたペプチド中の前記原子の少なくとも一部分が、ベータ－シート、アルファヘリックス、ターン、およびコイルからなる群から独立して選択される２つ以上の二次構造要素の組み合わせに位相的に制約される、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  28. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、原子間距離である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  29. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、原子エネルギーである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  30. 各原子エネルギーが、独立して、２つの原子間のペアワイズ引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ反発エネルギー、原子レベルの溶媒和エネルギー、２つの原子間のペアワイズ荷電引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ水素結合引力エネルギー、または非共有結合エネルギーである、請求項２９に記載の操作されたペプチド。
  31. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、化学記述子である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  32. 各化学記述子が、独立して、疎水性、極性、体積、正味電荷、ｌｏｇＰ、高速液体クロマトグラフィー保持、またはファンデルワールス半径である、請求項３１に記載の操作されたペプチド。
  33. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、生物情報記述子である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  34. 各生物情報記述子が、独立して、ＢＬＯＳＵＭ類似性、ｐＫａ、ｚＳｃａｌｅ、クルチアーニ特性、キデラ因子、ＶＨＳＥスケール、ＰｒｏｔＦＰ、ＭＳ－ＷＨＩＭスコア、Ｔスケール、ＳＴスケール、膜貫通傾向、タンパク質が埋まった領域、ヘリックス傾向、シート傾向、コイル傾向、ターン傾向、免疫原性傾向、抗体エピトープ発生、またはタンパク質界面発生である、請求項３３に記載の操作されたペプチド。
  35. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、溶媒曝露である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  36. 前記１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、ＧＰＣＲ細胞外ドメインである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  37. 前記１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、イオンチャネル細胞外ドメインである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  38. 前記１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、タンパク質－タンパク質またはペプチド－タンパク質の界面接合である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  39. 前記１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、前記標的の多型領域に由来する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  40. 生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含み、前記１つ以上の原子の各々が、独立して、炭素、酸素、窒素、水素、硫黄、リン、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マンガン、マグネシウム、銅、鉄、モリブデン、およびニッケルからなる群から選択される、請求項１～３９のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  41. 生物学的機能または生物学的応答に関連する１つ以上のアミノ酸を含み、前記１つ以上のアミノ酸の各々が、独立して、タンパク質を作る天然アミノ酸、タンパク質を作らない天然アミノ酸、または化学的に合成された非天然アミノ酸である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  42. 前記操作されたペプチドが、前記参照標的と比較して、少なくとも１つの構造差を有する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  43. 前記少なくとも１つの構造差が、独立して、配列、アミノ酸残基の数、原子の総数、総親水性、総疎水性全正電荷、全負電荷、１つ以上の二次構造、形状因子、ゼルニケ記述子、ファンデルワールス表面、構造グラフノードおよびエッジ、体積表面、静電電位表面、疎水性電位表面、局所直径、局所表面特徴、骨格モデル、電荷密度、親水性密度、表面対体積比、両親媒性密度、ならびに表面粗さからなる群から選択される、請求項４２に記載の操作されたペプチド
  44. １つ以上の二次構造における差が、前記参照標的と比較して、前記操作されたペプチド中の１つ以上の追加の二次構造要素の存在であり、各追加の二次構造要素が、独立して、アルファヘリックス、ベータ－シート、ループ、ターン、およびコイルからなる群から選択される、請求項１６に記載の操作されたペプチド。
  45. 前記アミノ酸の１０％～９０％が、１つ以上の非参照標的由来の位相的制約を満たす、請求項１～４４のいずれか一項に記載の操作されたペプチド。
  46. 前記１つ以上の非参照標的由来の位相的制約が、予め指定された機能を強化する、請求項４５に記載の操作されたペプチド。
  47. 非参照由来の位相的制約が、前記ペプチドの参照由来の画分中の二次構造要素を強化もしくは安定化する、
    非参照由来の位相的制約が、前記ペプチドの前記参照由来の画分中の原子変動を強化する、
    非参照由来の位相的制約が、ペプチド総疎水性を改変する、
    非参照由来の位相的制約が、ペプチド溶解性を改変する、
    非参照由来の位相的制約が、ペプチド総電荷を改変する、
    非参照由来の位相的制約が、標識アッセイもしくは標識フリーアッセイにおける検出を可能にする、
    非参照由来の位相的制約が、インビトロアッセイにおける検出を可能にする、
    非参照由来の位相的制約が、インビボアッセイにおける検出を可能にする、
    非参照由来の位相的制約が、複雑な混合物からの捕捉を可能にする、
    非参照由来の位相的制約が、酵素処理を可能にする、
    非参照由来の位相的制約が、細胞膜透過性を可能にする、
    非参照由来の位相的制約が、二次標的への結合を可能にする、かつ／または
    非参照由来の位相的制約が、免疫原性を改変する、請求項４６に記載の操作されたペプチド。
  48. 操作されたペプチドを選択する方法であって、
    参照標的の１つ以上の位相的特性を特定することと、
    前記参照標的に由来する空間的に関連する位相的制約の組み合わせを生成するように、各位相的特性に対して空間的に関連する制約を設計することと、
    候補ペプチドの空間的に関連する位相的特性を、前記参照標的に由来する前記空間的に関連する位相的制約の組み合わせと比較することと、
    前記参照標的に由来する前記空間的に関連する位相的制約の組み合わせと重複する、空間的に関連する位相的特性を有する候補ペプチドを選択して、前記操作されたペプチドを生成することと、を含む、方法。
  49. 各特性間の前記重複が、独立して、総位相的制約距離（ＴＣＤ）、位相的クラスタリング係数（ＴＣＣ）、ユークリッド距離、パワー距離、ソアーゲル距離、キャンベラ距離、ソーレンセン距離、ジャッカード距離、マハラノビス距離、ハミング距離、らしさの定量的評価（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｅｓｔｉｍａｔｅ ｏｆ Ｌｉｋｅｎｅｓｓ、ＱＥＬ）、または鎖位相パラメータ（ＣＴＰ）のうちの１つ以上によって決定されるとき、７５％以下の平均誤差率（ＭＰＥ）である、請求項４８に記載の方法。
  50. １つ以上の制約が、残基当たりのエネルギー、残基当たりの相互作用、残基当たりの変動、残基当たりの原子間距離、残基当たりの化学記述子、残基当たりの溶媒曝露、残基当たりのアミノ酸配列類似性、残基当たりの生物情報記述子、残基当たりの非共有結合傾向、残基あたりファイ／プサイ角、残基当たりのファンデルワールス半径、残基当たりの二次構造傾向、残基当たりのアミノ酸隣接性、残基当たりのアミノ酸接触に由来する、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. １つ以上の候補ペプチドの前記特性が、コンピュータシミュレーションによって決定される、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記コンピュータシミュレーションが、分子動力学シミュレーション、モンテカルロシミュレーション、粗視化シミュレーション、ガウスネットワークモデル、機械学習、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５１に記載の方法。
  53. １つ以上の候補ペプチドの前記特性が、実験的特性評価によって決定される、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記１つ以上の参照標的由来の制約を満たす前記アミノ酸が、前記参照標的と１０％～９０％の配列相同性を有する、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記１つ以上の参照標的由来の制約を満たす前記アミノ酸が、３０Å２～３０００Å２の前記参照とのファンデルワールス表面積重複を有する、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記組み合わせが、少なくとも２つの参照標的由来の制約を含む、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記組み合わせが、少なくとも５つの参照標的由来の制約を含む、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記制約の組み合わせが、参照標的に由来しない１つ以上の制約を含む、請求項４８～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記１つ以上の非参照標的由来の制約が、所望の構造的、動力学的、化学的、もしくは機能的な特性、またはそれらの任意の組み合わせを記述する、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記制約が、独立して、以下からなる群から選択される、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。
    原子間距離、
    原子変動、
    原子エネルギー、
    化学記述子、
    溶媒曝露、
    アミノ酸配列類似性、
    生物情報記述子、
    非共有結合傾向、
    ファイ角、
    プサイ角、
    ファンデルワールス半径、
    二次構造傾向、
    アミノ酸隣接性、および
    アミノ酸接触。
  61. １つ以上の制約が、独立して、原子変動である、請求項４８～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. １つ以上の制約が、独立して、化学記述子である、請求項４８～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. １つ以上の制約が、独立して、原子間距離である、請求項４８～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. １つ以上の制約が、独立して、二次構造である、請求項４８～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. １つ以上の制約が、独立して、ファンデルワールス表面である、請求項４８～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. １つ以上の制約が、独立して、生物学的応答または生物学的機能に関連する、請求項４８～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記操作されたペプチドが、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含む、請求項４８～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記操作されたペプチドが、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上のアミノ酸を含む、請求項４８～６６のいずれか一項に記載の方法
  69. 前記生物学的応答または生物学的機能が、遺伝子発現、代謝活性、タンパク質発現、細胞増殖、細胞死、サイトカイン分泌、キナーゼ活性、エピジェネティック修飾、細胞死滅活性、炎症シグナル、走化性、組織浸潤、免疫細胞系統の拘束、組織微小環境修飾、免疫シナプス形成、ＩＬ－２分泌、ＩＬ－１０分泌、成長因子分泌、インターフェロンガンマ分泌、形質転換成長因子ベータ分泌、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ活性、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ活性、抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害、生物学的経路アゴニスト作用、生物学的経路アンタゴニスト作用、生物学的経路再配向、キナーゼカスケード修飾、タンパク質分解経路修飾、タンパク質恒常性経路修飾、タンパク質折り畳み／経路、翻訳後修飾経路、代謝経路、遺伝子転写／翻訳、ｍＲＮＡ分解経路、遺伝子メチル化／アセチル化経路、ヒストン修飾経路、エピジェネティック経路、免疫依存性クリアランス、オプソニン化、ホルモンシグナル伝達、インテグリン経路、膜タンパク質シグナル伝達、イオンチャネルフラックス、およびｇ－タンパク質共役受容体応答からなる群から選択される、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記参照標的が、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含み、
    生物学的応答または生物学的機能に関連する前記操作されたペプチド中の前記１つ以上の原子の前記原子変動が、生物学的応答または生物学的機能に関連する前記参照標的中の前記１つ以上の原子の前記原子変動と重複する、請求項６６に記載の方法。
  71. 前記重複が、０．２５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記重複が、０．７５より大きい二乗平均平方根内積（ＲＭＳＩＰ）を有する、請求項７１に記載の方法。
  73. 生物学的応答または生物学的機能に関連する前記操作されたペプチド中の前記原子の少なくとも一部分が、前記参照標的中の二次構造要素に位相的に制約される、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記二次構造要素が、ベータ－シートである、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記二次構造要素が、アルファヘリックスである、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記二次構造要素が、ターンであり、前記ターンが、２～７個の残基を含み、少なくとも１つの残基間水素結合を含む、請求項７３に記載の方法。
  77. 前記二次構造要素が、コイルであり、前記コイルが、２～２０個の残基を含む、請求項７３に記載の方法。
  78. 前記コイルが、残基間水素結合を含まない、請求項７３に記載の方法。
  79. 生物学的応答または生物学的機能に関連する前記操作されたペプチド中の前記原子の少なくとも一部分が、ベータ－シート、アルファヘリックス、ターン、およびコイルからなる群から独立して選択される２つ以上の二次構造要素の組み合わせに位相的に制約される、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。
  80. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、原子間距離である、請求項４８～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、原子エネルギーである、請求項４８～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. 各原子エネルギーが、独立して、２つの原子間のペアワイズ引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ反発エネルギー、原子レベルの溶媒和エネルギー、２つの原子間のペアワイズ荷電引力エネルギー、２つの原子間のペアワイズ水素結合引力エネルギー、または非共有結合エネルギーである、請求項８１に記載の方法。
  83. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、化学記述子である、請求項４８～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 各化学記述子が、独立して、疎水性、極性、体積、正味電荷、ｌｏｇＰ、高速液体クロマトグラフィー保持、またはファンデルワールス半径である、請求項８３に記載の方法。
  85. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、生物情報記述子である、請求項４８～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 各生物情報記述子が、独立して、ＢＬＯＳＵＭ類似性、ｐＫａ、ｚＳｃａｌｅ、クルチアーニ特性、キデラ因子、ＶＨＳＥスケール、ＰｒｏｔＦＰ、ＭＳ－ＷＨＩＭスコア、Ｔスケール、ＳＴスケール、膜貫通傾向、タンパク質が埋まった領域、ヘリックス傾向、シート傾向、コイル傾向、ターン傾向、免疫原性傾向、抗体エピトープ発生、またはタンパク質界面発生である、請求項８５に記載の方法。
  87. １つ以上の空間的に関連する位相的制約が、溶媒曝露である、請求項４８～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、ＧＰＣＲ細胞外ドメインである、請求項４８～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、イオンチャネル細胞外ドメインである、請求項４８～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、タンパク質－タンパク質またはタンパク質－ペプチドの界面接合である、請求項４８～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記１つ以上の参照標的由来の制約のうちの少なくとも１つが、前記標的の多型領域に由来する、請求項４８～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記操作されたペプチドが、生物学的応答または生物学的機能に関連する１つ以上の原子を含み、前記１つ以上の原子の各々が、独立して、炭素、酸素、窒素、水素、硫黄、リン、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マンガン、マグネシウム、銅、鉄、モリブデン、およびニッケルからなる群から選択される、請求項４８～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記操作されたペプチドが、生物学的機能または生物学的応答に関連する１つ以上のアミノ酸を含み、前記１つ以上のアミノ酸の各々が、独立して、タンパク質を作る天然アミノ酸、タンパク質を作らない天然アミノ酸、または化学的に合成された非天然アミノ酸である、請求項４８～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記操作されたペプチドが、前記参照標的と比較して、少なくとも１つの構造差を有する、請求項４８～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記少なくとも１つの構造差が、独立して、配列、アミノ酸残基の数、原子の総数、総親水性、総疎水性全正電荷、全負電荷、１つ以上の二次構造、形状因子、ゼルニケ記述子、ファンデルワールス表面、構造グラフノードおよびエッジ、体積表面、静電電位表面、疎水性電位表面、局所直径、局所表面特徴、骨格モデル、電荷密度、親水性密度、表面対体積比、両親媒性密度、ならびに表面粗さからなる群から選択される、請求項９４に記載の方法
  96. 前記１つ以上の二次構造における前記差が、前記参照標的と比較して、前記操作されたペプチド中の１つ以上の追加の二次構造要素の存在であり、各追加の二次構造要素が、独立して、アルファヘリックス、ベータ－シート、ループ、ターン、およびコイルからなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記操作されたペプチドの前記アミノ酸の１０％～９０％が、１つ以上の非参照標的由来の位相的制約を満たす、請求項４８～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記１つ以上の非参照標的由来の位相的制約が、予め指定された機能を強化する、請求項９７に記載の方法。
  99. 非参照由来の位相的制約が、前記ペプチドの参照由来の画分中の二次構造要素を強化もしくは安定化するか、
    非参照由来の位相的制約が、前記ペプチドの前記参照由来の画分中の原子変動を強化するか、
    非参照由来の位相的制約が、ペプチド総疎水性を改変するか、
    非参照由来の位相的制約が、ペプチド溶解性を改変するか、
    非参照由来の位相的制約が、ペプチド総電荷を改変するか、
    非参照由来の位相的制約が、標識アッセイもしくは標識フリーアッセイにおける検出を可能にするか、
    非参照由来の位相的制約が、インビトロアッセイにおける検出を可能にするか、
    非参照由来の位相的制約が、インビボアッセイにおける検出を可能にするか、
    非参照由来の位相的制約が、複雑な混合物からの捕捉を可能にするか、
    非参照由来の位相的制約が、酵素処理を可能にするか、
    非参照由来の位相的制約が、細胞膜透過性を可能にするか、
    非参照由来の位相的制約が、二次標的への結合を可能にするか、もしくは
    非参照由来の位相的制約が、免疫原性を改変するか、
    またはそれらの任意の組み合わせである、請求項９８に記載の方法。
  100. ２つ以上の選択誘導ポリペプチドを含む組成物であって、各ポリペプチドが、独立して、１つ以上の正の誘導特性を含む正の選択分子、または１つ以上の負の誘導特性を含む負の選択分子であり、各特性タイプが、独立して、
    アミノ酸配列、
    ポリペプチド二次構造、
    分子動力学、
    化学的特徴、
    生物学的機能、
    免疫原性、
    参照標的（複数可）の多重特異性、
    異種間参照標的反応性、
    望ましくない参照標的（複数可）に対する所望の参照標的（複数可）の選択性、
    配列および／または構造的に相同なファミリー内の参照標的（複数可）の選択性、
    類似のタンパク質機能を有する参照標的（複数可）の選択性、
    高配列および／または構造的に相同性を有する望ましくない標的のより大きいファミリーからの、別個の所望の参照標的（複数可）の選択性、
    別個の参照標的対立遺伝子または変異に対する選択性、
    別個の参照標的残基レベルの化学修飾に対する選択性、
    細胞型に対する選択性、
    組織型に対する選択性、
    組織環境に対する選択性、
    参照標的（複数可）の構造多様性に対する耐性、
    参照標的（複数可）の配列多様性に対する耐性、ならびに
    参照標的（複数可）の動態多様性に対する耐性、からなる群から選択され、
    前記２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、請求項１に記載の操作されたペプチドである、組成物。
  101. 前記２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、正の選択分子であり、前記２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、負の選択分子である、請求項１００に記載の組成物。
  102. 前記２つ以上のポリペプチドのうちの少なくとも１つが、天然タンパク質である、請求項１００または１０１に記載の組成物。
  103. 少なくとも１つの共有の特性タイプを含む、対応する正の選択分子および負の選択分子の少なくとも１つの対を含み、前記正の選択分子が、前記正の特性を含み、前記負の選択分子が、前記負の特性を含む、請求項１００～１０２のいずれか一項に記載の組成物。
  104. 請求項１００に記載の組成物を用いて結合分子のライブラリをスクリーニングする方法であって、候補結合分子のプールを少なくとも１回の選択ラウンドに供することを含み、各選択ラウンドが、
    前記プールの少なくとも一部分を負の選択分子に不利にスクリーニングする負の選択ステップと、
    前記プールの少なくとも一部分を正の選択分子に有利にスクリーニングする正の選択ステップと、を含み、
    各ラウンド内の選択ステップの順序、およびラウンドの前記順序が、代替の順序とは異なる前記プールのサブセットの選択をもたらす、方法。
  105. 前記結合分子のライブラリが、ファージライブラリである、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記結合分子のライブラリが、細胞ライブラリである、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記結合分子のライブラリが、Ｂ細胞ライブラリである、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記結合分子のライブラリが、Ｔ細胞ライブラリである、請求項１０６に記載の方法。
  109. ２回以上の選択ラウンドを含む、請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. ３回以上の選択ラウンドを含む、請求項１０４～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 各ラウンドが、異なる選択分子のセットを含む、請求項１０９または１１０に記載の方法。
  112. 少なくとも２ラウンドが、同じ負の選択分子、または同じ正の選択分子、またはその両方を含む、請求項１０９または１１０に記載の方法。
  113. 次の選択ラウンドに進む前に、ある選択ラウンドから得られた前記プールの前記サブセットを分析することを含む、請求項１０９～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. サブセットプール分析が、１つ以上の後続の選択ラウンドで使用される、正および／または負の選択分子の前記セットを決定する、請求項１１３に記載の方法。
  115. 各サブセットプール分析が、独立して、ペプチド／タンパク質バイオセンサー結合、ペプチド／タンパク質ＥＬＩＳＡ、ペプチドライブラリ結合、細胞抽出物結合、細胞表面結合、細胞活性アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、酵素活性アッセイ、遺伝子発現プロファイル、タンパク質修飾アッセイ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学からなる群から選択される、請求項１１３または１１４に記載の方法。
  116. １つ以上の後続の選択ラウンドで使用される前記正、負、または正および負の両方の選択分子が、サブセットプール分析の統計／情報スコアリングまたは機械学習訓練によって決定される、請求項１１３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. ある選択ラウンドから得られた前記サブセットプールが、次の選択ラウンドに移動する前に修飾される、請求項１０９～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. サブセットプール分析が、１回以上の後続の選択ラウンドで使用される、正、負、または正および負の両方の選択分子を決定し、次の選択ラウンドに移動する前に前記サブセットプールを修飾する、請求項１１７に記載の方法。
  119. 各修飾が、独立して、遺伝子変異、遺伝子枯渇、遺伝子濃縮、化学修飾、および酵素修飾から選択される群から選択される、請求項１１７または１１８に記載の方法。
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