JP2024020215A - 腫瘍標的化アゴニストcd28抗原結合分子 - Google Patents
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Abstract
【課題】CD28への一価結合を特徴とする腫瘍標的化二重特異性アゴニスト抗原結合分子、それらの製造方法、これらの抗体を含有する薬学的組成物、及びそれらを使用する方法を提供する。【解決手段】CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、CD28への一価結合を特徴とする腫瘍標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、それらの製造方法、これらの分子を含有する薬学的組成物、及びがんの処置における免疫調節剤としてのそれらの使用に関する。
がん免疫療法は、メラノーマ、非小細胞肺がん及び腎細胞癌などのがん型において劇的かつ持続的な応答をもたらし得る、ますます有効な治療選択肢になりつつある。これは主に、抗PD-1(例えば、Merckのキイトルーダ;BMSのオプジーボ)、抗CTLA-4(例えば、BMSのヤーボイ)及び抗PD-L1(例えば、Rocheのテセントリク)を含むいくつかの免疫チェックポイント遮断の成功によって推進される。これらの薬剤は、多くのがん型の標準治療として、又は併用療法の骨格として役立つ可能性が高いが、患者のごく一部(25%未満)がそのような療法から利益を得るにすぎない。更に、様々ながん(前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肉腫、非トリプルネガティブ乳がんなど)は、これらの免疫調節物質に対する一次耐性を示す。いくつかの報告は、既存の抗腫瘍T細胞の非存在が一部の患者の不応答又は不十分な応答に寄与することを示している。要約すると、既存の免疫療法の印象的な抗がん効果にもかかわらず、大きながん患者集団に対処すること、並びに新規な腫瘍特異的T細胞応答を誘導及び増強することを目的とする治療法を開発することに対する明確な医学的必要性が存在する。
CD28は、重要なシグナル伝達モチーフ(Carreno and Collins,2002)を含有する単一の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに結合した対Vセット免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインを特徴とする共刺激分子のサブファミリーの確立メンバーである。サブファミリーの他のメンバーとしては、ICOS、CTLA-4、PD1、PD1H、TIGIT及びBTLA(Chen and Flies,2013)が挙げられる。CD28発現はT細胞に限定され、PD-1又はCTLA-4を発現するものを含む、全てのナイーブ及び抗原経験サブセットの大部分で一般的である。CD28及びCTLA-4は高度に相同であり、樹状細胞、B細胞、マクロファージ及び腫瘍細胞上に発現される同じB7分子CD80及びCD86への結合について競合する(Linsley et al.,1990)。リガンドのB7ファミリーに対するCTLA-4のより高い親和性は、CTLA-4がリガンド結合についてCD28を打ち負かすこと、及びエフェクターT細胞応答を抑制することを可能にする(Engelhardt et al.,2006)。対照的に、PD-1は、CD28の細胞質ドメインを部分的に脱リン酸化することによってCD28シグナル伝達を阻害することが示された(Hui et al.,2017)。プロフェッショナル抗原提示細胞の表面上のCD80又はCD86によるCD28のライゲーションは、ナイーブT細胞の機能的デノボプライミング、その後のクローン増殖、サイトカイン産生、標的細胞溶解、及び長寿命メモリーの形成に厳密に必要とされる。CD28リガンドの結合はまた、OX-40、ICOS、及び4-1BBなどの誘導性共刺激受容体の発現を促進する(Acuto and Michel,2003に概説)。CD28のライゲーション時に、ジスルフィド結合ホモ二量体、膜近位YMNMモチーフ及び遠位PYAPモチーフは、いくつかのキナーゼ及びアダプタータンパク質と複合体を形成することが示されている(Boomer and Green,2010)。これらのモチーフは、NFAT、AP-1及びNFκBファミリー転写因子のCD28依存的活性化によって媒介されるIL2転写の誘導に重要である(Fraser et al.,1991)(June et al.,1987)(Thompson et al.,1989)。しかしながら、リン酸化及びユビキチン化のための更なる十分に特徴付けられていない部位が、CD28の細胞質ドメイン内に見出される。(Esensten et al.,2016)によって概説されるように、CD28によって開始される経路は、従来のT細胞の増殖及びエフェクター機能の促進において重要な役割を有する。CD28ライゲーションはまた、制御性T細胞の抗炎症機能を促進する。CD28は、T細胞受容体からのシグナルを部分的に増強することによってT細胞を共刺激するが、固有のシグナル伝達事象を媒介することも示された(Acuto and Michel,2003;Boomer and Green,2010;June et al.,1987)。CD28によって特異的に引き起こされるシグナルは、下流タンパク質のリン酸化及び他の翻訳後修飾(例えば、PI3K媒介性リン酸化)、転写変化(例えば、Bcl-xL発現)、エピジェネティック変化(例えばIL-2プロモーター)、細胞骨格リモデリング(例えば、微小管形成中心の配向)及び解糖速度の変化(例えば、解糖流量)を含む、T細胞機能の多くの重要な側面を制御する。CD28欠損マウスは、感染性病原体、同種移植片抗原、移植片対宿主病、接触過敏症及び喘息に対する応答が低下している(Acuto and Michel,2003)。CD28媒介性共刺激の欠如は、インビトロ及びインビボでのT細胞増殖の減少、胚中心形成及び免疫グロブリンアイソタイプクラスの切り替えの重度の阻害、Tヘルパー(Th)細胞分化の減少並びにTh2型サイトカインの発現をもたらす。CD4依存性細胞傷害性CD8+T細胞応答も影響を受ける。重要なことに、CD28欠損ナイーブT細胞は、特により低い抗原濃度で増殖応答の低下を示した。文献の増加は、T細胞上のCD28を係合させることが抗腫瘍能を有するという考えを裏付けている。最近の証拠は、PD-L1/PD-1及びCTLA-4チェックポイント阻害剤の抗がん効果がCD28に依存することを実証している(Kamphorst et al.,2017;Tai et al.,2007)。CTLA-4及びPD-1遮断の治療効果を調査する臨床研究は、進行したメラノーマ及び他のがんを有する患者において非常に有望な結果を示している。更に、細胞内TCRシグナル伝達ドメイン(CD3z)及び細胞内共刺激ドメイン(CD28及び/又は4-1BBドメイン)に融合した細胞外抗原認識ドメインを含む人工キメラT細胞受容体を発現する遺伝子操作されたT細胞の注入は、B細胞がん及び他のがんにおける高い応答率及び持続性を示した。
CD28アゴニスト抗体を、(i)CD28スーパーアゴニスト抗体及び(ii)CD28従来のアゴニスト抗体の2つのカテゴリーに分けることができる。通常、ナイーブT細胞の活性化には、T細胞抗原受容体(TCR、シグナル1)の関与とCD28による共刺激シグナル伝達(シグナル2)の両方が必要である。CD28スーパーアゴニスト(CD28SA)は、明白なT細胞受容体関与なしにT細胞を自律的に活性化することができるCD28特異的モノクローナル抗体である(Huenig,2012)。齧歯類では、CD28SAは、従来の制御性T細胞を活性化する。CD28SA抗体は、自己免疫、炎症及び移植の複数のモデルにおいて治療上有効である。しかしながら、ヒトCD28SA抗体TGN1412の第I相研究は、2006年に生命を脅かすサイトカインストームをもたらした。追跡調査は、毒性が、前臨床動物モデルのヒトT細胞及びT細胞のCD28応答性の違いによる投薬誤差によって引き起こされたことを示唆している。TGN1412は現在、RA患者及び転移性又は切除不能な進行性固形悪性腫瘍を有する患者における非盲検多施設用量漸増試験で再評価されている。CD28の従来のアゴニスト抗体、例えばクローン9.3は、CD28天然リガンドを模倣し、T細胞受容体シグナルの存在下でのみT細胞活性化を増強することができる(シグナル1)。公開された見識は、抗体の結合エピトープが、アゴニスト抗体がスーパーアゴニストであるか従来のアゴニストであるかに大きな影響を及ぼすことを示している(Beyersdorf et al.,2005)。スーパーアゴニストTGN1412はCD28の側方モチーフに結合するが、従来のアゴニスト分子9.3はリガンド結合エピトープの近くに結合する。異なる結合エピトープの結果として、スーパーアゴニスト抗体及び従来のアゴニスト抗体は、T細胞の表面上にCD28分子の線状複合体を形成する能力が異なる。正確には、TGN1412はCD28の線形アレイを効率的に形成することができ、これはおそらくT細胞活性化の閾値を超えるのに十分な凝集したシグナル伝達成分をもたらす。一方、従来のアゴニスト9.3は、構造が直鎖状ではない複合体をもたらす。9.3クローンに基づく従来のアゴニスト結合因子を変換する試みは、メラノーマ関連プロテオグリカン及びCD28に対する組換え二重特異性一本鎖抗体を使用して以前に発表されている(Otz et al.,2009)。報告された二重特異性一本鎖抗体は、多量体コンストラクトを形成する二重特異性一本鎖抗体の固有の傾向に基づいて、従来のCD28アゴニスト結合因子9.3の使用にもかかわらず、「超アゴニスト」活性を発揮することが報告された。
限界量の抗CD3二重特異性抗体、すなわちCEA-TCBなどのT細胞二重特異性抗体(TCB)を作動性抗CD28分子と組み合わせると、より良好なT細胞活性化が達成されることが分かった。CD28が様々な腫瘍適応症(Lavin et al.,2017;Tirosh et al.,2016,Zheng et al.,2017)においてT細胞上のベースラインで発現され、CD28シグナル伝達の活性化がT細胞受容体シグナルを増強することを考えると、TCB分子と腫瘍標的化CD28分子との組み合わせは相乗的に作用して強力で長期持続性の抗腫瘍応答を誘導すると予想される。したがって、本発明者らは、本明細書において、TCBとの相乗効果を示し、TCBシグナルの存在下での厳密な腫瘍標的依存性のためにCD28結合一価を必要とする新規な腫瘍標的化アゴニストCD28分子を記載する。
固形腫瘍の免疫療法
固形腫瘍の処置は進行中の課題であり、ここ数年にわたってほとんど進歩は見られていない。典型的には、処置は、手術と化学療法及び/又は放射線療法との併用である。ごく少数の新たな処置が最近開発されているが、固形腫瘍に罹患している患者の生存率を高め、その生活の質を改善するために、更なる改善が依然として必要とされている。固形腫瘍は、1つの腫瘍特異的抗原を発現することは稀である。ほとんどの固形腫瘍では、腫瘍上に濃縮されているが、正常組織上でも非常に低レベルで発現される腫瘍関連抗原(TAA)を見出すことがより一般的である。TAAは、好ましくは、固形腫瘍細胞の表面又は腫瘍間質の細胞上に提示される。これは、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、癌胎児性抗原(CEA)、葉酸受容体アルファ(FolR1)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮成長因子受容体(EGFR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)及びp95HER2を含む、固形腫瘍のための多くの頻繁に標的化されるTAAの場合である。更なるTAAとしては、HER3、EpCAM、TPBG(5T4)、メソテリン、MUC1及びPSMAが挙げられる。したがって、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、主に腫瘍表面又は腫瘍微小環境に向けられ、全身活性化が回避され得る間に腫瘍の近傍のT細胞を特異的に活性化する。
固形腫瘍の処置は進行中の課題であり、ここ数年にわたってほとんど進歩は見られていない。典型的には、処置は、手術と化学療法及び/又は放射線療法との併用である。ごく少数の新たな処置が最近開発されているが、固形腫瘍に罹患している患者の生存率を高め、その生活の質を改善するために、更なる改善が依然として必要とされている。固形腫瘍は、1つの腫瘍特異的抗原を発現することは稀である。ほとんどの固形腫瘍では、腫瘍上に濃縮されているが、正常組織上でも非常に低レベルで発現される腫瘍関連抗原(TAA)を見出すことがより一般的である。TAAは、好ましくは、固形腫瘍細胞の表面又は腫瘍間質の細胞上に提示される。これは、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、癌胎児性抗原(CEA)、葉酸受容体アルファ(FolR1)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮成長因子受容体(EGFR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)及びp95HER2を含む、固形腫瘍のための多くの頻繁に標的化されるTAAの場合である。更なるTAAとしては、HER3、EpCAM、TPBG(5T4)、メソテリン、MUC1及びPSMAが挙げられる。したがって、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、主に腫瘍表面又は腫瘍微小環境に向けられ、全身活性化が回避され得る間に腫瘍の近傍のT細胞を特異的に活性化する。
B細胞悪性腫瘍に対するCD28アゴニズムを標的とする理由
非ホジキンリンパ腫(NHL)は、米国及び欧州におけるがん死の主因の1つである。濾胞性リンパ腫(FL)は、その経過が緩徐であり、進行速度が遅く、生存期間の中央値は8~10年であり、進行した臨床段階の患者は、通常、治癒することができない。同様に、毎年2%~3%の患者において、FLの表現型は、疾患の経過における重大な事象であり、リンパ腫関連死亡率の増加に関連する、侵襲性大細胞リンパ腫に転換する可能性がある。マントル細胞リンパ腫及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)はより侵攻性であり、未処置の場合、生存率の中央値はわずか6ヶ月である。無増悪生存期間を延長した免疫療法の著しい進歩にもかかわらず、低悪性度NHLサブタイプ及び侵襲性NHLサブタイプの両方を有する多くの患者の治癒的転帰の欠如は、依然として満たされていない医学的必要性を残している。過去数年の間に、特に抗CD20モノクローナル抗体であるリツキシマブ(リツキサン(登録商標)、MabThera(登録商標))を強力な細胞傷害性化学療法レジメンに追加することにより、DLBCLにおける有意な長期生存が観察されている。しかしながら、以前に未処置のDLBCLのための従来の処置は治癒的であることを意図しているにもかかわらず、患者の大部分は最終的に再発するであろう。同様に、進行したFLは、現在のSoCではほとんど治癒しないままであり、再発の繰り返し及び徐々に寛解が短くなることを特徴とする。現在、多くの新世代モノクローナル抗体は、NHL患者の転帰を更に改善し、リツキシマブ耐性の機構を克服するための評価の異なる前臨床及び臨床段階にある。自己幹細胞支持又は同種異系幹細胞移植を伴う高用量化学療法は、再発性/難治性(r/r)DLBCLを有する患者のごく一部(10%)に対して治癒的選択肢を提供し、実質的な処置関連死亡率を伴う。現在開発中のNHLの処置のための他のアプローチには、ベネトクラックス及びBET阻害剤のような分子標的化合物が含まれる。最近承認された新規薬剤には、レナリドミド、イデラリシブ及びコパンリシブが含まれる。キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、r/r B-NHLの侵襲的な形態の処置に承認されているが、この療法は限られた状況でのみ利用可能であり、致死的な神経学的事象及びサイトカイン放出症候群(CRS)に関連し得る。細胞傷害性細胞の溶解を悪性B細胞に向け直す二重特異性抗体コンストラクトは現在開発中であり、NHLに対する非常に有望な有効性を示している。無化学療法処置は、NHLの将来のために想定されており、おそらく二重特異性抗体又はキメラ抗原受容体T細胞(CAR T細胞)に基づくであろう。免疫療法と組み合わせてB細胞表面抗原に対して標的化されたCD28アゴニストは、B細胞悪性腫瘍を有する患者の生活の質を損なうことなく、B細胞悪性腫瘍を有する患者の生存率及び/又は治癒率を高める。
非ホジキンリンパ腫(NHL)は、米国及び欧州におけるがん死の主因の1つである。濾胞性リンパ腫(FL)は、その経過が緩徐であり、進行速度が遅く、生存期間の中央値は8~10年であり、進行した臨床段階の患者は、通常、治癒することができない。同様に、毎年2%~3%の患者において、FLの表現型は、疾患の経過における重大な事象であり、リンパ腫関連死亡率の増加に関連する、侵襲性大細胞リンパ腫に転換する可能性がある。マントル細胞リンパ腫及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)はより侵攻性であり、未処置の場合、生存率の中央値はわずか6ヶ月である。無増悪生存期間を延長した免疫療法の著しい進歩にもかかわらず、低悪性度NHLサブタイプ及び侵襲性NHLサブタイプの両方を有する多くの患者の治癒的転帰の欠如は、依然として満たされていない医学的必要性を残している。過去数年の間に、特に抗CD20モノクローナル抗体であるリツキシマブ(リツキサン(登録商標)、MabThera(登録商標))を強力な細胞傷害性化学療法レジメンに追加することにより、DLBCLにおける有意な長期生存が観察されている。しかしながら、以前に未処置のDLBCLのための従来の処置は治癒的であることを意図しているにもかかわらず、患者の大部分は最終的に再発するであろう。同様に、進行したFLは、現在のSoCではほとんど治癒しないままであり、再発の繰り返し及び徐々に寛解が短くなることを特徴とする。現在、多くの新世代モノクローナル抗体は、NHL患者の転帰を更に改善し、リツキシマブ耐性の機構を克服するための評価の異なる前臨床及び臨床段階にある。自己幹細胞支持又は同種異系幹細胞移植を伴う高用量化学療法は、再発性/難治性(r/r)DLBCLを有する患者のごく一部(10%)に対して治癒的選択肢を提供し、実質的な処置関連死亡率を伴う。現在開発中のNHLの処置のための他のアプローチには、ベネトクラックス及びBET阻害剤のような分子標的化合物が含まれる。最近承認された新規薬剤には、レナリドミド、イデラリシブ及びコパンリシブが含まれる。キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、r/r B-NHLの侵襲的な形態の処置に承認されているが、この療法は限られた状況でのみ利用可能であり、致死的な神経学的事象及びサイトカイン放出症候群(CRS)に関連し得る。細胞傷害性細胞の溶解を悪性B細胞に向け直す二重特異性抗体コンストラクトは現在開発中であり、NHLに対する非常に有望な有効性を示している。無化学療法処置は、NHLの将来のために想定されており、おそらく二重特異性抗体又はキメラ抗原受容体T細胞(CAR T細胞)に基づくであろう。免疫療法と組み合わせてB細胞表面抗原に対して標的化されたCD28アゴニストは、B細胞悪性腫瘍を有する患者の生活の質を損なうことなく、B細胞悪性腫瘍を有する患者の生存率及び/又は治癒率を高める。
B細胞悪性腫瘍の標的としてのB細胞表面抗原
B細胞悪性腫瘍に関連するTAAは、B細胞表面抗原である。ヒトCD19抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する95KDa膜貫通糖タンパク質である。CD19は、単一の膜貫通ドメイン、細胞質C末端及び細胞外N末端を有するI型膜貫通タンパク質として分類される。正常細胞では、それはBリンパ球系統において最も遍在的に発現されるタンパク質である。CD19発現は、新生物形質転換を受けたB系統細胞において維持され、したがって、CD19は、モノクローナル抗体(mAb)及びフローサイトメトリーを使用した白血病及びリンパ腫の診断において有用であり、CD20抗原も同様である。B系統白血病及びリンパ腫はCD19発現を失うことはまれであり、多能性幹細胞では発現されないため、免疫毒素を含む様々な免疫療法剤の標的となっている。CD79は、CD79a(Igα、mb-1)及びCD79b(Igβ、B29)を含有する共有結合ヘテロ二量体からなる、B細胞受容体のシグナル伝達構成要素である。CD79a及びCD79bはそれぞれ、CD3又は活性化Fcγ受容体などの他のシグナル伝達タンパク質と同様に、細胞外免疫グロブリン(Ig)ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメイン、免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)ドメインを含有する。したがって、CD79a及びCD79bは、B細胞受容体(BCR)のシグナル伝達サブユニットを構成する膜貫通タンパク質である。CD79bは、B細胞上に排他的に発現される39KDaのタンパク質であり、CD79aと協働して、BCRの下流のシグナル伝達カスケードを開始させ、BCR複合体の内部移行、エンドソームへのその移行、及び抗原提示をもたらす。B細胞において、抗原誘導性BCRクラスター形成は、SrcキナーゼによるCD79a及びCD79bのITAMのチロシンリン酸化を引き起こす。これは、最も注目すべきSYK及びBLNKを含む、BCRシグナル伝達カスケードに属する一連のエフェクター分子の動員及び活性化をもたらす。更に下流では、PLCg2、Btk及びERKの動員は、カルシウム流動を促進し、B細胞を活性化し、次いで、B細胞は、それらの増殖及びメモリー細胞又はエフェクター細胞への分化を駆動する更なる共活性化シグナルを受け取る準備ができている。この過程の間、B細胞は堅牢なAPCになり、免疫応答の結果及び質に影響を及ぼし得るサイトカインを放出する。CD79サブユニットは、BCRシグナル伝達における役割に加えて、小胞体から細胞表面への膜結合Igの輸送及び提示にも不可欠である。NHL上でのCD79bの平均表面発現は、正常なB細胞上でのそれと同様であるが、範囲がより大きい。CD79bの発現を考慮すると、特に慢性処置のために、患者に投与した場合に抗原性を最小限にするか又は全く生じないCD79b抗原に対する治療用抗体を産生することが有益である。
B細胞悪性腫瘍に関連するTAAは、B細胞表面抗原である。ヒトCD19抗原は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する95KDa膜貫通糖タンパク質である。CD19は、単一の膜貫通ドメイン、細胞質C末端及び細胞外N末端を有するI型膜貫通タンパク質として分類される。正常細胞では、それはBリンパ球系統において最も遍在的に発現されるタンパク質である。CD19発現は、新生物形質転換を受けたB系統細胞において維持され、したがって、CD19は、モノクローナル抗体(mAb)及びフローサイトメトリーを使用した白血病及びリンパ腫の診断において有用であり、CD20抗原も同様である。B系統白血病及びリンパ腫はCD19発現を失うことはまれであり、多能性幹細胞では発現されないため、免疫毒素を含む様々な免疫療法剤の標的となっている。CD79は、CD79a(Igα、mb-1)及びCD79b(Igβ、B29)を含有する共有結合ヘテロ二量体からなる、B細胞受容体のシグナル伝達構成要素である。CD79a及びCD79bはそれぞれ、CD3又は活性化Fcγ受容体などの他のシグナル伝達タンパク質と同様に、細胞外免疫グロブリン(Ig)ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメイン、免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)ドメインを含有する。したがって、CD79a及びCD79bは、B細胞受容体(BCR)のシグナル伝達サブユニットを構成する膜貫通タンパク質である。CD79bは、B細胞上に排他的に発現される39KDaのタンパク質であり、CD79aと協働して、BCRの下流のシグナル伝達カスケードを開始させ、BCR複合体の内部移行、エンドソームへのその移行、及び抗原提示をもたらす。B細胞において、抗原誘導性BCRクラスター形成は、SrcキナーゼによるCD79a及びCD79bのITAMのチロシンリン酸化を引き起こす。これは、最も注目すべきSYK及びBLNKを含む、BCRシグナル伝達カスケードに属する一連のエフェクター分子の動員及び活性化をもたらす。更に下流では、PLCg2、Btk及びERKの動員は、カルシウム流動を促進し、B細胞を活性化し、次いで、B細胞は、それらの増殖及びメモリー細胞又はエフェクター細胞への分化を駆動する更なる共活性化シグナルを受け取る準備ができている。この過程の間、B細胞は堅牢なAPCになり、免疫応答の結果及び質に影響を及ぼし得るサイトカインを放出する。CD79サブユニットは、BCRシグナル伝達における役割に加えて、小胞体から細胞表面への膜結合Igの輸送及び提示にも不可欠である。NHL上でのCD79bの平均表面発現は、正常なB細胞上でのそれと同様であるが、範囲がより大きい。CD79bの発現を考慮すると、特に慢性処置のために、患者に投与した場合に抗原性を最小限にするか又は全く生じないCD79b抗原に対する治療用抗体を産生することが有益である。
限界量の抗CD3二重特異性抗体、すなわち、例えばCD20/CD3二重特異性抗体などのT細胞二重特異性抗体(TCB)をアゴニスト抗CD28分子と組み合わせると、より良好なT細胞活性化が達成されることが見出された。CD28が様々な腫瘍適応症(Lavin et al.,2017;Tirosh et al.,2016,Zheng et al.,2017)においてT細胞上のベースラインで発現され、CD28シグナル伝達の活性化がT細胞受容体シグナルを増強することを考えると、T細胞二重特異性抗体とB細胞表面抗原を標的とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子との組み合わせは、強力かつ長期持続性の抗腫瘍応答を誘導するために相乗的に作用すると予想される。したがって、本発明者らは、本明細書において、TCBとの相乗効果を示し、TCBシグナルの存在下での厳密な腫瘍標的依存性のためにCD28結合の一価性を必要とする、B細胞表面抗原を標的とする新規な二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を記載する。
多発性骨髄腫における免疫療法
多発性骨髄腫(MM)は、EU及び米国で毎年約75,000人の新しい患者に罹患しており、依然として満たされていない医学的必要性が高い、最も一般的な血液悪性腫瘍の1つである。多発性骨髄腫は、非機能性モノクローナル免疫グロブリンを分泌する最終分化形質細胞を特徴とする。短期的には、レナリドミド及びポマリドミドなどの免疫調節薬、並びにカルフィルゾミブ又はボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤は、多発性骨髄腫の第一選択療法の骨格のままであり得る(Moreau et al,2016)。しかしながら、これらの薬物は、疾患腫瘍細胞、例えば疾患形質細胞(PC)を特異的に標的としない。多発性骨髄腫において形質細胞を選択的に枯渇させるための努力がなされてきた。形質細胞を特異的にマークする表面タンパク質の欠如は、多発性骨髄腫のための抗体又は細胞療法の開発を妨げてきた。これまでのところ、ダラツムマブ(抗CD38)及びエロツズマブ(抗CD319)を含む成功した生物製剤の事例はほとんどなく、両方の抗原が造血系及び免疫エフェクター細胞を含む他の正常組織でも発現され、その長期臨床使用を制限する可能性があるという警告がある。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー17(TNFRSF17)中の膜貫通糖タンパク質であるB細胞成熟抗原(BCMA)は、全ての患者MM細胞において有意に高いレベルで発現されるが、正常形質細胞を除く他の正常組織では発現されない。BCMA-キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、プロテアソーム阻害剤及び免疫調節剤を含む少なくとも3つの以前の処置を受けたRRMM患者において有意な臨床活性を既に示している。抗BCMA抗体-薬物抱合体を含む更なるモダリティはまた、抗CD38抗体、プロテアソーム阻害剤、及び免疫調節剤(Cho et al,2018)を含む少なくとも3つの先行治療に失敗した患者において有意な臨床応答を達成した。例えば、BCMA又はCD38を標的とする治療の1つの課題は、MM患者の血清中の高レベルの可溶性BCMA又はCD38の存在にあり、これは患者の活性薬物の量を減少させ得る。代替法は、健康なドナー由来の形質細胞に対して多発性骨髄腫における形質細胞によって差次的に発現され、可溶性形態を有しない、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD(GPRC5D)などの新たな標的であり得る。GPRC5Dは、多発性骨髄腫患者の予後及び腫瘍量に関連することが報告されている(Atamaniuk,J.et al.,2012;and Cohen,Y.,et al.,2013)。GPRC5Dは、一般的に男性において、及びがん特異的に男性において、リガンドが知られておらず、生物学がほとんど知られていないオーファン受容体である。染色体12p13.3にマッピングされるGPRC5Dコード遺伝子は、3つのエクソンを含み、約9.6kbに及ぶ(Brauner-Osborne,H.et al.2001)。大きな第1のエクソンは、7回膜貫通ドメインをコードする。GPRC5Dは、動物の毛包のケラチン形成に関与することが示されているGao,Y.et al.,2016,and Inoue,S.et al.,2004)。国際公開第2018/017786号A2は、GPRC5D特異的抗体又は抗原結合断片を開示している。
多発性骨髄腫(MM)は、EU及び米国で毎年約75,000人の新しい患者に罹患しており、依然として満たされていない医学的必要性が高い、最も一般的な血液悪性腫瘍の1つである。多発性骨髄腫は、非機能性モノクローナル免疫グロブリンを分泌する最終分化形質細胞を特徴とする。短期的には、レナリドミド及びポマリドミドなどの免疫調節薬、並びにカルフィルゾミブ又はボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤は、多発性骨髄腫の第一選択療法の骨格のままであり得る(Moreau et al,2016)。しかしながら、これらの薬物は、疾患腫瘍細胞、例えば疾患形質細胞(PC)を特異的に標的としない。多発性骨髄腫において形質細胞を選択的に枯渇させるための努力がなされてきた。形質細胞を特異的にマークする表面タンパク質の欠如は、多発性骨髄腫のための抗体又は細胞療法の開発を妨げてきた。これまでのところ、ダラツムマブ(抗CD38)及びエロツズマブ(抗CD319)を含む成功した生物製剤の事例はほとんどなく、両方の抗原が造血系及び免疫エフェクター細胞を含む他の正常組織でも発現され、その長期臨床使用を制限する可能性があるという警告がある。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー17(TNFRSF17)中の膜貫通糖タンパク質であるB細胞成熟抗原(BCMA)は、全ての患者MM細胞において有意に高いレベルで発現されるが、正常形質細胞を除く他の正常組織では発現されない。BCMA-キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、プロテアソーム阻害剤及び免疫調節剤を含む少なくとも3つの以前の処置を受けたRRMM患者において有意な臨床活性を既に示している。抗BCMA抗体-薬物抱合体を含む更なるモダリティはまた、抗CD38抗体、プロテアソーム阻害剤、及び免疫調節剤(Cho et al,2018)を含む少なくとも3つの先行治療に失敗した患者において有意な臨床応答を達成した。例えば、BCMA又はCD38を標的とする治療の1つの課題は、MM患者の血清中の高レベルの可溶性BCMA又はCD38の存在にあり、これは患者の活性薬物の量を減少させ得る。代替法は、健康なドナー由来の形質細胞に対して多発性骨髄腫における形質細胞によって差次的に発現され、可溶性形態を有しない、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD(GPRC5D)などの新たな標的であり得る。GPRC5Dは、多発性骨髄腫患者の予後及び腫瘍量に関連することが報告されている(Atamaniuk,J.et al.,2012;and Cohen,Y.,et al.,2013)。GPRC5Dは、一般的に男性において、及びがん特異的に男性において、リガンドが知られておらず、生物学がほとんど知られていないオーファン受容体である。染色体12p13.3にマッピングされるGPRC5Dコード遺伝子は、3つのエクソンを含み、約9.6kbに及ぶ(Brauner-Osborne,H.et al.2001)。大きな第1のエクソンは、7回膜貫通ドメインをコードする。GPRC5Dは、動物の毛包のケラチン形成に関与することが示されているGao,Y.et al.,2016,and Inoue,S.et al.,2004)。国際公開第2018/017786号A2は、GPRC5D特異的抗体又は抗原結合断片を開示している。
多発性骨髄腫における疾患形質細胞に対するCD28アゴニズムを標的とする理由
多発性骨髄腫におけるCD28アゴニズムは、免疫性のそれぞれのMM形質細胞に対して異なる生物学的機能を発揮し得る。CD28を介したT細胞の共活性化は、抗腫瘍応答を駆動すると予想されるが、MM細胞に対するCD28アゴニズムは、PI3K/Akt、FoxO3a及びBimmの調節を介して生存促進シグナル伝達を媒介し、これは、多発性骨髄腫において化学療法抵抗性を誘導すると記載されている(Murray M.E.et al,2014)。新たに診断された多発性骨髄腫形質細胞上のCD28の過剰発現は、より悪い臨床転帰と相関すると記載されている(Bahlis et al.,2007)。しかしながら、CD28活性化は骨髄腫細胞の生存を増強するが、その活性化は骨髄腫細胞増殖を阻害する。T細胞のT細胞二重特異的活性化などの強い免疫細胞媒介性応答の存在下でCD28をアゴナイズすることにより、効率的な抗腫瘍応答を更に高めることができる。本発明者らは、本明細書において、ヒト多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原に特異的に結合する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。特に、T細胞上に発現されるBCMA、CD38及びGPRC5Dから選択されるTAAを標的とする本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子並びにCD28は、単剤として、又はヒトMM細胞表面抗原を標的とするT細胞二重特異性抗体(TCB)などの他の薬剤と組み合わせて、多発性骨髄腫を処置する効力を有する。
多発性骨髄腫におけるCD28アゴニズムは、免疫性のそれぞれのMM形質細胞に対して異なる生物学的機能を発揮し得る。CD28を介したT細胞の共活性化は、抗腫瘍応答を駆動すると予想されるが、MM細胞に対するCD28アゴニズムは、PI3K/Akt、FoxO3a及びBimmの調節を介して生存促進シグナル伝達を媒介し、これは、多発性骨髄腫において化学療法抵抗性を誘導すると記載されている(Murray M.E.et al,2014)。新たに診断された多発性骨髄腫形質細胞上のCD28の過剰発現は、より悪い臨床転帰と相関すると記載されている(Bahlis et al.,2007)。しかしながら、CD28活性化は骨髄腫細胞の生存を増強するが、その活性化は骨髄腫細胞増殖を阻害する。T細胞のT細胞二重特異的活性化などの強い免疫細胞媒介性応答の存在下でCD28をアゴナイズすることにより、効率的な抗腫瘍応答を更に高めることができる。本発明者らは、本明細書において、ヒト多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原に特異的に結合する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。特に、T細胞上に発現されるBCMA、CD38及びGPRC5Dから選択されるTAAを標的とする本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子並びにCD28は、単剤として、又はヒトMM細胞表面抗原を標的とするT細胞二重特異性抗体(TCB)などの他の薬剤と組み合わせて、多発性骨髄腫を処置する効力を有する。
本発明は、多量体を形成することを必要とせずに腫瘍依存性T細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を達成する腫瘍標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を記載する。本発明の二重特異性CD28抗原結合分子は、CD28への一価結合、及び腫瘍関連抗原(例えば、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)、CD19又はGPRC5D)に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むことを特徴とする。更に、それらは、Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインを持つ。それにより、Fc受容体媒介性架橋が抑止され、腫瘍特異的活性化が、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインのその抗原への結合による架橋によって達成される。
したがって、本発明は、CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。
一態様では、FcドメインがIgG、特にIgG1 Fcドメイン又はIgG4 Fcドメインである、以下に定義する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインはIgG1 Fcドメインである。一態様では、Fcドメインは、アミノ酸置換L234A及びL235A(Kabat EUインデックスによるナンバリング)を含む。一態様では、FcドメインはヒトIgG1サブクラスのFcドメインであり、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(Kabat EUインデックスによるナンバリング)を含む。
一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号36の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28);又は
(ii)配列番号20のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23のCDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号36の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28);又は
(ii)配列番号20のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23のCDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号20のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23のCDR-L1、配列番号24のCDR-L2及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。
更には、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、本明細書において先に規定される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50及び配列番号51からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号27、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60及び配列番号61からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の特定の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが癌胎児性抗原(CEA)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号188のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号189のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号190のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号191のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号192のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号193のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号185のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号130のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号131のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号132のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iv)配列番号507のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号508のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号509のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号510のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号511のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号512のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)と、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号188のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号189のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号190のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号191のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号192のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号193のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号185のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号130のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号131のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号132のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iv)配列番号507のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号508のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号509のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号510のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号511のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号512のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)と、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号133のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号134のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。特に、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。
別の態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号194のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号195のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(b)配列番号196のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(c)配列番号198のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号199のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(d)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(e)配列番号202のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号203のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(f)配列番号204のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(g)配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(h)配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(i)配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(j)配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号194のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号195のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(b)配列番号196のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(c)配列番号198のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号199のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(d)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(e)配列番号202のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号203のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(f)配列番号204のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(g)配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(h)配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(i)配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(j)配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特に、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)(i)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は(b)(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)とを含む、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特に、FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(i)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)とを含む。一態様では、FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(a)配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号19のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は(b)配列番号10のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくはFAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)を含む。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、EpCAMに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(i)配列番号515のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号516のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号517のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)と、(iv)配列番号518のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号519のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号520のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、EpCAMに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)配列番号521のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)及び配列番号522のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。より具体的には、EpCAMに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号521のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)及び配列番号522のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む。
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがHER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(i)配列番号523のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号524のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号525のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHHER3)と、(iv)配列番号526のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号527のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号528のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLHER3)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)配列番号529のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。より具体的には、HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号529のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号531のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号532のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号533のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD30)と、(iv)配列番号534のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号535のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号536のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD30)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)配列番号537のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特に、CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号537のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む。
更に、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがTBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号539のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号540のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号541のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHTBPG)と、(iv)配列番号542のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号543のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号544のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLTBPG)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)配列番号545のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTBPG)及び配列番号546のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTBPG)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。より具体的には、TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号545のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTBPG)及び配列番号546のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTBPG)を含む。
更なる態様では、本発明は、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定した会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含む、CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD38、BCMA及びGPRC5Dからなる群から選択される多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原。
したがって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがGPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)(i)配列番号563のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号564のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号565のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)と、(iv)配列番号566のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号567のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号568のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は(b)(i)配列番号579のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号580のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号581のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)と、(iv)配列番号582のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号583のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号584のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号569のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特に、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号547のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号548のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号549のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD38)と、(iv)配列番号550のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号551のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号552のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD38)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号553のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特に、CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号553のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがBCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号555のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号556のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号557のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHBCMA)と、(iv)配列番号558のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号559のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号560のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号559のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び配列番号560のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特に、BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号561のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び配列番号562のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む。
更なる態様では、本発明は、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定した会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含む、CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、B細胞表面抗原は、CD19、CD79b、CD20、CD22及びCD37からなる群から選択される。
したがって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)(i)配列番号406のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号407のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号408のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号409のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号410のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号411のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は(b)(i)配列番号414のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号415のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号416のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号417のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号418のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号419のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)を含む、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(a)配列番号412のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は(b)配列番号420のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特に、CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号412のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)を含む。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号422のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号423のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号424のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD79b)と、(iv)配列番号425のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号426のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号427のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号428のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特に、CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号428のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)を含む。
更なる態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがFab断片又はクロスFab断片である、本明細書において先に定義した二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能なFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能なFab断片が、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第1のFcドメインサブユニットのC末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第2のFcドメインサブユニットのC末端に融合される、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能なFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能なFab断片が、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第1のFcドメインサブユニットのC末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第2のFcドメインサブユニットのC末端に融合される、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
本発明の別の態様によれば、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子をコードする1つ以上の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は更に、1つ以上のベクター、特に、本発明の単離ポリヌクレオチド(複数可)を含む発現ベクター(複数可)、単離ポリヌクレオチド(複数可)又は本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の製造方法が提供される。必要に応じて、この方法はまた、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を回収することを含む。本発明は、本発明の方法により作製した二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子もまた包含する。
本発明は更に、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子及び少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、がんの処置に用いるためのものである。
二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子及び本発明の薬学的組成物を使用する方法も本発明に包含される。一態様では、本発明は、医薬として使用するための本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は薬学的組成物を提供する。一態様では、(a)細胞活性化の増強又は(b)T細胞エフェクター機能の増強に使用するための、本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、疾患の処置に使用するための本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。具体的な態様では、疾患は、がんである。別の態様では、がんにおける処置で使用するための本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は薬学的組成物が提供され、該二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、化学療法剤、放射線療法及び/又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される。更なる態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又はがんの処置において使用するための薬学的組成物が提供され、ここで、その二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて投与される。更に別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又はがんの処置に使用するための薬学的組成物が提供され、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体と組み合わせて投与される。
疾患を処置するための医薬の製造における本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の使用、並びに個体における疾患を処置する方法であって、前記個体に、治療有効量の本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与することを含む、方法も提供される。具体的な態様では、疾患は、がんである。一態様では、個体における(a)細胞活性化を増強するか又は(b)T細胞エフェクター機能を増強する方法であって、本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を当該個体に投与することを含む、方法が提供される。別の態様では、疾患を処置するための医薬の製造における本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の使用であって、該処置が化学療法剤、放射線療法及び/又はがん免疫療法に使用するための他の薬剤との同時投与を含む、使用が提供される。更なる態様では、個体における疾患を処置する方法であって、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を当該個体に投与することを含み、化学療法剤、放射線療法及び/又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤との同時投与を含む、方法が提供される。更なる態様では、個体における疾患を処置する方法であって、当該個体に、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与することを含み、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体を同時投与することを含む、方法が提供される。別の態様では、個体における疾患を処置する方法であって、当該個体に、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与することを含み、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体を同時投与することを含む、方法が提供される。個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該個体に、有効量の、本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法も提供される。上の態様のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数系で使用される用語は、単数形も含む。
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数系で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「腫瘍関連抗原に特異的に結合することができる部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様では、抗原結合ドメインは、標的部位、例えば、特定の種類の腫瘍細胞、又は抗原決定基を有する腫瘍間質に結合する構成要素(例えばCD28抗体)を指令することができる。標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。更に、標的細胞抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン(例えば、国際公開第2002/020565号を参照されたい)を含む。
抗原結合分子、すなわち抗体又はその断片に関して、「標的細胞抗原に結合する抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、抗原の一部又は全部に相補的である領域を含む分子の一部を指す。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは例えば、1つ以上の抗体可変ドメイン(抗体可変領域とも呼ばれる)により、提供されることができる。具体的には、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖可変領域(VH)を含む。別の態様では、「腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」は、Fab断片又はクロスFab断片であってもよい。別の態様では、「腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」は、Fab断片又はクロスFab断片であってもよい。本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどに関する「第1」、「第2」又は「第3」という用語は、各タイプの部分が2つ以上存在する場合の区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、部分の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。
本明細書で使用される場合、「B細胞表面抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「B細胞表面抗原に特異的に結合可能な部分」という用語は、B細胞表面の抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが結合している実体(例えば、CD28アゴニスト)を標的部位、例えばB細胞上に向けることができる。B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。更に、B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン(例えば、国際公開第2002/020565号を参照されたい)を含む。
「多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原に特異的に結合可能な部分」という用語は、多発性骨髄腫(MM)細胞上の抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが結合している実体(例えば、CD28アゴニスト)を標的部位、例えばMM細胞上に向けることができる。多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインとしては、本明細書中で更に定義される抗体及びその断片が挙げられる。更に、B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン(例えば、国際公開第2002/020565号を参照されたい)を含む。
本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体断片を含む。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び/又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する突然変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能な変異体抗体は除く。このような変異体は、一般的に、少量存在する。異なる決定基(エピトープ)に対して異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体の調製と比べて、モノクローナル抗体の調製における各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。
「単一特異性」抗体という用語は、本明細書で使用される場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する1つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、少なくとも2つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、2つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。しかしながら、二重特異性抗原結合分子は、更なる抗原決定基に結合する更なる抗原結合部位も含み得る。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、2つの抗原決定基、特に2つの異なる細胞又は同じ細胞上に発現される2つの抗原決定基に同時に結合することができる。したがって、本発明による「二重特異性」という用語は、三重特異性分子、例えばCD28抗体及び2つの異なる標的細胞抗原に向けられた2つの抗原結合ドメインを含む二重特異性分子も含み得る。
本出願の中で用いられる「-価」という用語は、1つの異なる抗原決定基に対して特異的である抗原結合分子内で、1つの異なる抗原決定基に対して特異的な結合部位が特定の数、存在することを意味する。そのため、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗原結合分子においてそれぞれ、特定の抗原決定基に対して特異的な、2つの結合部位、4つの結合部位、及び6つの結合部位が存在することを意味する。本発明の特定の態様では、本発明に従った二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができ、このことは、これらが、上記抗原決定基に対して1つのみの結合部位を有することを意味する。又は、これらは特定の抗原決定基に対して二価若しくは四価であることができ、このことは、これらが、上記抗原決定基に対してそれぞれ、2つの結合部位、若しくは4つの結合部位を有することを意味する。
「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」とは、様々な構造を有する、天然に発生する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、ネイティブIgGクラス抗体は、約150,000ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した2つの軽鎖と2つの重鎖から構成される。N末端からC末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン(VH)(可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる)と、その後に3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)(重鎖定常領域とも呼ばれる)を有する。同様に、N末端からC末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン(VL)(可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる)と、その後に軽鎖定常ドメイン(CL)(軽鎖定常領域とも呼ばれる)を有する。抗体の重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)又はμ(IgM)と呼ばれる5種類の1つに割り当てられてもよく、これらのいくつかは、例えば、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及びα2(IgA2)などのサブタイプへ更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2種類の1つに分けられてもよい。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2;ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスFab断片;直鎖抗体;一本鎖抗体分子(例えばscFv);及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説としては、Hudsonら、「Nat Med」第9巻、第129~134頁(2003年)を参照されたい。scFv断片の総説としては、例えば、Pluckthun、「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies」第113巻、Rosenburg及びMoore編、Springer-Verlag、ニューヨーク、第269~315頁(1994年)を参照されたく、また、国際公開第93/16185号並びに米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボでの半減期が長くなったFab及びF(ab’)2断片の説明については、米国特許第5,869,046号を参照。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい2つの抗原結合ドメインを含む抗体断片であり、例えば、EP 404,097号;国際公開第1993/01161号;Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)、及びHollinger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディも、Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)に説明されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(Domantis,Inc.(マサチューセッツウォルサム)例えば、米国特許第6,248,516B1号を参照)。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞(例えば、大腸菌又はファージ)による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
インタクト抗体のパパイン消化により、2つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)を含む「Fab」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Fab断片」という用語は、軽鎖(CL)の可変軽鎖(VL)ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖の可変重鎖(VH)ドメイン及び第1の定常ドメイン(CH1)を含む抗体断片を指す。Fab’断片は、抗体ヒンジ領域由来の1つ以上のシステインを含め、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Fab断片とは異なる。Fab’-SHとは、定常ドメインのシステイン残基(複数可)が遊離チオール基を保持するFab’断片である。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位(2つのFab断片)と、Fc領域の一部とを含む、F(ab’)2断片が得られる。
「クロスFab断片」又は「xFab断片」又は「クロスオーバーFab断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたFab断片を指す。クロスオーバーFab分子の2つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Fab重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーFab分子は、軽鎖可変(VL)ドメインと重鎖定常ドメイン(CH1)とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメイン(VH)と軽鎖定常ドメイン(CL)とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーFab分子は、クロスFab(VLVH)とも呼ばれる。一方、Fab重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーFab分子は、重鎖可変ドメイン(VH)と軽鎖定常ドメイン(CL)とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変ドメイン(VL)と重鎖定常ドメイン(CH1)とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーFab分子は、クロスFab(CLCH1)とも呼ばれる。
「一本鎖Fab断片」又は「scFab」は、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常ドメイン1(CH1)、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体軽鎖定常ドメイン(CL)、及びリンカーからなるポリペプチドであって、ここで、該抗体ドメイン及び該リンカーは、N末端からC末端への方向で、以下の順序の1つを有する:(a)VH-CH1-リンカー-VL-CL、(b)VL-CL-リンカー-VH-CH1、(c)VH-CL-リンカー-VL-CH1、又は(d)VL-CH1-リンカー-VH-CL。ここで、上記リンカーは、少なくとも30アミノ酸、好ましくは32~50アミノ酸のポリペプチドである。上記一本鎖Fab断片は、CLドメインとCH1ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。更に、これらの一本鎖Fab分子は、システイン残基の挿入(例えば、Kabatナンバリングによれば、可変重鎖の44位及び可変軽鎖の100位)による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「クロスオーバー一本鎖Fab断片」又は「x-scFab」は、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常ドメイン1(CH1)、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、抗体軽鎖定常ドメイン(CL)及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、N末端からC末端への方向で、以下の順序の1つを有する。(a)VH-CL-リンカー-VL-CH1及び(b)VL-CH1-リンカー-VH-CL。VHとVLは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、また上記リンカーは、少なくとも30アミノ酸のポリペプチドである。更に、これらのx-scFab分子は、システイン残基の挿入(例えば、Kabatナンバリングによれば、可変重鎖の44位及び可変軽鎖の100位)による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるだろう。
「一本鎖可変断片(scFv)」は、10~約25アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて連結された、抗体の重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、VHのN末端とVLのC末端とを、又はその逆で接続することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。scFv抗体は、例えば、Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)に記載されている。これに加え、抗体断片は、VHドメインに特徴的な(すなわち、VLドメインと共に集合させることが可能な)、又はVLドメインに特徴的な(すなわち、機能的抗原結合部位にVHドメインと共に集合させることが可能な)一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、全長抗体の抗原結合特性を与える。
「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質(DARPin)は、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されてきた。例えば、Gebauer and Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin Chem Biol 13:245-255(2009)and Stumpp et al.,Darpins:A new generation of protein therapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)を参照されたい。本発明の一態様では、スキャフォールド抗原結合タンパク質は、CTLA-4(エビボディ)、リポカリン(アンチカリン)、プロテインA由来分子、例えば、プロテインAのZ-ドメイン(アフィボディ)、A-ドメイン(アビマー/マキシボディ)、血清トランスフェリン(トランスボディ);設計されたアンキリンリピートタンパク質(DARPin)、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン(単一ドメイン抗体、sdAb)、抗体重鎖の可変ドメイン(ナノボディ、aVH)、VNAR断片、フィブロネクチン(アドネクチン)、C型レクチンドメイン(テトラネクチン);新規抗原受容体β-ラクタマーゼの可変ドメイン(VNAR断片)、ヒトγ-クリスタリン又はユビキチン(アフィリン分子);ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン(アドネクチン)からなる群から選択される。CTLA-4(細胞毒性Tリンパ球関連抗原4)は、主にCD4+T細胞で発現するCD28ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のIg折りたたみを有する。抗体のCDRに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたCTLA-4分子も、エビボディとして知られている(例えば、米国特許第7166697号B1)。エビボディは、抗体(例えば、ドメイン抗体)の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Journal of Immunological Methods 248(1-2)、31-45(2001)を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、160~180アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、米国特許第7250297号B1及び米国特許出願公開第20070224633号を参照。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、Staphylococcus aureusのプロテインAに由来する足場である。ドメインは、約58アミノ酸の3つのラセン形の束からなる。ライブラリは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細については、Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462及び欧州特許出願公開第1641818号A1を参照されたい。アビマーは、Aドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約35アミノ酸のネイティブドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、A-ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Nature Biotechnology 23(12)、1556-1561(2005)及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16(6)、909-917(2007年6月)を参照されたい。トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、J.Biol.Chem 274、24066-24073(1999)を参照。設計されたアンキリンリピートタンパク質(DARPin)は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、2つのαらせんとβターンとからなる33残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第1のαらせん及びβターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる(親和性成熟方法)。更なる詳細については、J.Mol.Biol.332、489-503(2003)、PNAS 100(4)、1700-1705(2003)及びJ.Mol.Biol.369、1015-1028(2007)及び米国特許出願公開第20040132028号A1を参照。一本鎖ドメイン抗体は、一本の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第1の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した(ナノボディ又はVHH断片)。更に、単一ドメイン抗体という用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン(aVH)又はサメ由来VNAR断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンIII型(FN3)の15反復単位の10番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。ベータ-サンドイッチの片方の端にある3つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細については、Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、米国特許出願公開第20080139791号、国際公開第2005056764号及び米国特許第6818418号B1を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン(TrxA)からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Expert Opin.Biol.Ther.5、783-797(2005)を参照されたい。ミクロボディは、3~4のシステイン架橋を含む、25~50アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、KalataBI、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、25アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第2008098796号を参照されたい。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を50%以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を50%以上ブロックする。
「抗原結合ドメイン」という用語は、ある抗原の一部又は全てに特異的に結合し、ある抗原の一部又は全てに対して相補的な抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、1つ以上の可変ドメイン(可変領域とも呼ばれる)によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と、抗体重鎖可変ドメイン(VH)とを含む。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分-抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位(例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成)を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び/又は細胞外マトリックス(ECM)内に認めることができる。本発明の抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類(例えばヒト)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブ形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)又は当該技術分野で知られた他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)技術(BIAcore装置で分析される)(Liljeblad et al.,Glyco J 17、323-329(2000))、及び従来の結合アッセイ(Heeley、Endocr Res 28、217-229(2002))によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばSPRによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約10%未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数(Kd)が、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM又は≦0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M~10-13M、例えば、10-9M~10-13M)である。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位(例えば、抗体)と、その結合対(例えば、抗原)との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対(例えば、抗体と抗原)のメンバー間の1:1相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Xのその結合対Yに対する親和性は、一般的に、解離定数(Kd)によって表すことができ、脱離速度定数と会合速度定数(それぞれkoff及びkon)の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)である。
「腫瘍関連抗原」又はTAAは、本明細書で使用する場合、標的細胞、例えばがん細胞、腫瘍間質の細胞、悪性Bリンパ球又はメラノーマ細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。ある特定の態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一態様では、TAAは、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、癌胎児性抗原(CEA)、葉酸受容体アルファ(FolR1)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮成長因子受容体(EGFR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)、p95HER2、EpCAM、HER3、CD30又はTPBG(5T4)、CD19、CD79b、CD20、CD22、CD37、CD38、BCMA及びGPRC5Dからなる群から選択される。特定の一態様では、TAAは、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、癌胎児性抗原(CEA)、葉酸受容体アルファ(FolR1)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮成長因子受容体(EGFR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)及びp95HER2からなる群から選択される。別の特定の態様では、TAAは、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、癌胎児性抗原(CEA)、EpCAM、HER3、CD30又はTPBG(5T4)からなる群から選択される。特定の一態様では、腫瘍関連抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)である。一態様では、TAAは、CD19、CD79b、CD20、CD22及びCD37、特にCD19及びCD79bからなる群から選択されるB細胞表面抗原である。一態様では、TAAは、CD38、BCMA及びGPRC5Dからなる群から選択される多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原である。
プロリルエンドペプチダーゼFAP又はセプラーゼ(EC 3.4.21)としても知られている、「線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)」という用語は、特に断りのない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)、並びに齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然FAPを意味する。この用語は、「全長」のプロセシングされていないFAP、及び細胞におけるプロセシングから生じるFAPの任意の形態を包含する。この用語は、FAPの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び/又はカニクイザルFAPに特異的に結合可能である。ヒトFAPのアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)受託番号Q12884(バージョン149、配列番号2)、又はNCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2にて示されている。ヒトFAPの細胞外ドメイン(ECD)は、アミノ酸位置26から760まで伸びている。Hisタグ化したヒトFAP ECDのアミノ酸配列は、配列番号135に示されている。マウスFAPのアミノ酸配列は、UniProt受託番号P97321(バージョン126、配列番号136)、又はNCBI RefSeq NP_032012.1に示されている。マウスFAPの細胞外ドメイン(ECD)は、アミノ酸位置26から761まで伸びている。配列番号137は、Hisタグ化されたマウスFAP ECDのアミノ酸配列を示す。配列番号138は、Hisタグ化されたカニクイザルFAP ECDのアミノ酸配列を示す。好ましくは、抗本発明のFAP結合分子はFAPの細胞外ドメインに結合する。
癌胎児性抗原関連細胞接着分子5(CEACAM5)としても知られている、「癌胎児性抗原(CEA)」という用語は、特に断りのない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)、並びに齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然CEAを意味する。ヒトCEAのアミノ酸配列は、UniProt受託番号P06731(バージョン151、配列番号3)に示されている。CEAは長らく、腫瘍関連抗原として識別されている(Gold and Freedman,J Exp Med.,121:439-462,1965;Berinstein N.L.,J Clin Oncol.,20:2197-2207,2002)。元は、胎児組織のみで発現するタンパク質として分類されていたCEAは現在、いくつかの健常な成人組織にて同定されている。これらの組織は主に、胃腸、呼吸、及び泌尿器管の細胞、並びに、結腸、子宮頸、汗腺、及び前立腺の細胞を含む、元々上皮に存在する(Nap et al.,Tumour Biol.,9(2-3):145-53,1988;Nap et al.,Cancer Res.,52(8):2329-23339,1992)。上皮由来の腫瘍、及びこれらの転移物は、腫瘍関連抗原としてCEAを含有する。CEA自身が存在することは、がん性細胞への形質転換を意味するものではないものの、CEAが分布していることを示している。健常な組織において、CEAは一般的に、細胞の先端面にて発現し(Hammarstroem S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))、血流にて抗体に接近できなくなる。健常な組織とは対照的に、CEAは、がん性細胞の全面にわたって発現する(Hammarstroem S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))。発現パターンのこの変化により、CEAが、がん性細胞内で抗体結合をしやすくなる。更に、CEAの発現は、がん性細胞にて増加する。更に、CEAの発現が増加することにより、細胞間の接着性が増加し、転移につながり得る(Marshall J.,Semin Oncol.,30(a Suppl.8):30-6,2003)。様々な腫瘍構成要素におけるCEA発現の有症率は一般的に、非常に高い。公開されたデータに一致して、組織試料にて実施した自身の分析により、その高い有症率が確認され、結腸癌(CRC)において約95%、膵がんにおいて90%、胃がんにおいて80%、非小細胞肺がん(HER3と同時発現するNSCLC)において60%、及び乳がんにおいて40%であり、小細胞肺がん及びグリア芽腫においては低い発現が確認された。
CEAは速やかに細胞表面から切断され、腫瘍から直接、又は、リンパ系を介してのいずれかにより、血流に入る。この性質から、血清CEAの濃度は、がん診断のための臨床マーカー、及びがん、特に結腸直腸がんの再発のためのスクリーニングとして使用されてきた(Goldenberg D M.,The International Journal of Biological Markers,7:183-188,1992;Chau I.,et al.,J Clin Oncol.,22:1420-1429,2004;Flamini et al.,Clin Cancer Res;12(23):6985-6988,2006)。
「上皮細胞接着分子(EpCAM)」という用語は、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物が供給源の任意の天然EpCAMを指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないEpCAM、及び細胞におけるプロセシングから生じるEpCAMの任意の形態を包含する。この用語はまた、EpCAMの天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び/又はカニクイザルEpCAMに特異的に結合可能である。ヒトEpCAMのアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)受託番号P16422(バージョン167、配列番号68)、又はNCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_002345.2に示されている。マウスEpCAMのアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)受託番号Q99JW5(バージョン111、配列番号75)又はNCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_032558.2に示されている。腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質1(TACSTD1)、17-1A及びCD326としても知られる、上皮細胞接着分子(EpCAM)は、上皮起源のがんにおいて及びがん幹細胞によって頻繁に過剰発現されるI型約40kDa膜貫通糖タンパク質であり、したがって、治療及び診断のための重要な関心対象の分子である。細胞外ドメインEpCAMを切断して、可溶性細胞外ドメイン分子EpEX及び細胞内分子EpICDを得ることができる。EpICDは、他のタンパク質と会合して、細胞増殖を促進する遺伝子の発現を上方制御する核複合体を形成することが示されている。EpCAMはまた、上皮から間葉細胞への移行(EMT)に関与し得、大きな転移の形成に寄与し得る。
「CD30」又は「TNFRSF8」は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。これは、とりわけ、未分化大細胞リンパ腫及びホジキンリンパ腫を含む特定の造血性悪性腫瘍において特徴的に発現される。正常リンパ系細胞及び悪性リンパ系細胞の両方におけるCD30の可変的な発現は、CD30上方制御の病因、抗アポトーシス機構を介したリンパ球形成へのその寄与、及び細胞生存に対するその効果を理解することに研究努力を集中させてきた。特定の腫瘍型に対するCD30の制限を考えると、これの論理的拡張は、治療標的としてそれを利用しようと試みることであった。CD30は、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーに属する120kD膜貫通糖タンパク質受容体であり、細胞内、膜貫通及び細胞外ドメインを有し、ヒトCD30のアミノ酸配列は、UniProt受託番号P28908(配列番号472)に示されている。
「TPBG」という用語は、「5T4」とも呼ばれる栄養芽細胞糖タンパク質を指す。TBPGは、細胞接着に関与するロイシンリッチ膜貫通糖タンパク質である。成人では、このタンパク質は多くの腫瘍細胞で高度に発現され、多くのがんにおける臨床転帰不良に関連する。この用語は、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然TPBGを指す。ヒトTPBGのアミノ酸配列は、UniProt受託番号Q13641(配列番号473)に示されている。
「FolR1」という用語は、葉酸受容体アルファを指し、いくつかのがんにおける潜在的な予後及び治療標的として同定されている。この用語は、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然FolR1を指す。ヒトFolR1のアミノ酸配列は、UniProt受託番号P15328(配列番号139)に示され、マウスFolR1は、UniProt受託番号P35846(配列番号140)のアミノ酸配列を有し、カニクイザルFolR1は、UniProt受託番号G7PR14(配列番号141)に示されるアミノ酸配列を有する。FolR1は、細胞の原形質膜上に発現されるN-グリコシル化タンパク質である。FolR1は、葉酸及びいくつかの還元型葉酸誘導体に対して高い親和性を有し、生理学的葉酸塩である5-メチルテトラヒドロ葉酸塩の細胞内部への送達を媒介する。FOLR 1は、卵巣がんの大部分、並びに多くの子宮がん、子宮内膜がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん及び乳がんで過剰発現されるが、正常組織でのFOLR1の発現は、腎臓近位尿細管、肺の肺胞肺細胞、膀胱がん、精巣がん、脈絡叢及び甲状腺の上皮細胞の頂端膜に制限されるため、FOLR1指向性がん治療の望ましい標的である。最近の研究では、FolR1発現がトリプルネガティブ乳がんにおいて特に高いことが同定されている(Necela et al.PloS One 2015,10(3),e0127133)。
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4(CSPG4)としても知られている、「メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)」という用語は、特に断りのない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)、並びに齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然MCSPを意味する。ヒトMCSPのアミノ酸配列は、UniProt受託番号Q6UVK1(バージョン103、配列番号142)に示されている。MCSPは、N結合型280 kDa糖タンパク質成分及び細胞膜上に発現される450 kDaコンドロイチン硫酸プロテオグリカン成分からなる高グリコシル化内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである(Ross et al.,Arch.Biochem.Biophys.1983,225:370-38)。MCSPは、多くの正常細胞及び形質転換細胞においてより広く分布している。特に、MCSPは表皮のほとんど全ての基底細胞に見られる。MCSPは、メラノーマ細胞において差次的に発現され、分析された良性母斑及びメラノーマ病変部の90%超において発現されることが見出された。MCSPはまた、基底細胞癌、神経堤起源の様々な腫瘍を含む非色素細胞起源の腫瘍、及び乳癌において発現されることが見出されている。
原型がん遺伝子c-ErbB-1又は受容体チロシン-プロテインキナーゼerbB-1という名も付いている、「上皮成長因子受容体(EGFR)」という用語は、特に断りのない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)、並びに齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然EGFRを意味する。ヒトEGFRのアミノ酸配列は、UniProt受託番号P00533(バージョン211、配列番号143)に示されている。がん原遺伝子「HER2」(ヒト上皮増殖因子受容体2)は、ヒト上皮増殖因子受容体に関連し、ある程度相同であるタンパク質チロシンキナーゼ(p185HER2)をコードする。HER2は、この分野ではc-erbB-2としても知られており、ラットホモログ、neuと呼ばれることもある。HER2の増幅及び/又は過剰発現は、複数のヒト悪性腫瘍に関連し、ヒト乳がん及び卵巣がんの25~30%の進行に一体的に関与していると思われる。更に、増幅の程度は、観察された患者生存期間の中央値と逆相関している(Slamon,D.J.et al.,Science 244:707-712(1989))。ヒトHER2のアミノ酸配列は、UniProt受託番号P04626(バージョン230、配列番号144)に示されている。本明細書で使用される場合、「p95HER2」という用語は、「611-CTF」又は「100~115 kDa p95HER2」としても知られるHER2受容体タンパク質のカルボキシ末端断片(CTF)を指す。p95HER2断片は、全長HER2分子のコドン位置611(Anido et al,EMBO J 25;3234-44(2006))でのHER2 mRNAの翻訳開始によって細胞内で生成される。これは100~115kDaの分子量を有し、細胞膜で発現され、そこで分子間ジスルフィド結合によって維持されるホモ二量体を形成することができる(Pedersen et al.,Mol Cell Biol 29,3319-31(2009))。ヒトp95HER2の例示的な配列は、配列番号145において与えられる。
「HER3」又は「ErbB3」(ヒト上皮成長因子受容体3)は、ErbB受容体チロシンキナーゼファミリーの他のメンバーと同様に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインからなる。細胞外ドメインは、4つのサブドメイン(I~IV)を含む。サブドメインI及びIIIはロイシンリッチであり、主にリガンド結合に関与する。サブドメインII及びIVはシステインリッチであり、ジスルフィド結合の形成を通じてタンパク質の立体配座及び安定性に寄与する可能性が最も高い。サブドメインIIはまた、二量体形成に必要な二量体化ループを含む。細胞質ドメインは、膜近傍セグメント、キナーゼドメイン及びC末端ドメインを含む。ErbB3の過剰発現、構成的活性化、又は突然変異のみが発がん性であるという証拠は見出されていないが、https://en.wikipedia.org/wiki/ERBB3-cite_note-pmid8632008-18ErbB2と最も決定的に関係するヘテロ二量体化パートナーとしてのタンパク質は、成長、増殖、化学療法抵抗性、並びに浸潤及び転移の促進に関与する。ErbB3は、多数のがんにおける標的治療耐性に関連する。ヒトHER3のアミノ酸配列は、UniProt受託番号P21860(バージョン224、配列番号471)に示されている。
本明細書で使用される場合「B細胞表面抗原」は、Bリンパ球、特に悪性Bリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す(その場合、抗原は「悪性B細胞表面抗原」とも呼ばれる)。いくつかのB細胞表面抗原は、血液悪性新生物の免疫療法に関して興味深い。一態様では、B細胞表面抗原は、CD19、CD79b、CD20、CD22及びCD37からなる群から選択される。
「CD19」という用語は、Bリンパ球表面抗原B4、又はT細胞表面抗原Leu-12としても知られている、Bリンパ球抗原CD19を意味し、特に断りのない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)、並びに齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然CD19を含む。ヒトCD19のアミノ酸配列は、Uniprot受託番号P15391(バージョン160、配列番号434)に示されている。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないヒトCD19、並びに本明細書に掲載する抗体がそれに結合する限り、細胞におけるプロセシングから生じる任意の形態のヒトCD19を包含する。CD19は、プレB細胞、初期発生のB細胞(すなわち、未成熟B細胞)、形質細胞への最終分化を通した成熟B細胞、及び悪性B細胞を含むがこれらに限定されない、ヒトB細胞の表面上に発現される構造的に異なる細胞表面受容体である。CD19は、ほとんどのプレB急性リンパ芽球性白血病(ALL)、非ホジキンリンパ腫、B細胞慢性リンパ性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及びいくつかのヌル急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞上のCD19の発現は、それが多発性骨髄腫などの分化B細胞腫瘍上に発現され得ることを更に示唆する。したがって、CD19抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病及び/又は急性リンパ芽球性白血病の処置における免疫療法の標的である。
「CD79b」は、Ig-β又はB細胞特異的糖タンパク質B29としても公知のB細胞抗原受容体複合体関連タンパク質β鎖を指し、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然CD79bを含む。ヒトCD79bのアミノ酸配列は、Uniprot受託番号P40259(バージョン180、配列番号435)に示されている。CD79bは、B細胞上に排他的に発現される39KDaのタンパク質であり、CD79aと協働して、BCRの下流のシグナル伝達カスケードを開始させ、BCR複合体の内部移行、エンドソームへのその移行、及び抗原提示をもたらす。CD79(サブユニットCD79a及びCD79bから構成される)は、B細胞受容体のヘテロ二量体シグナル伝達成分であり、成熟B細胞リンパ腫において遍在的に発現され、免疫グロブリンμの発現前に最も早く拘束されたB細胞前駆細胞によって細胞表面に配置される。「CD79b」という用語は、「完全長」のプロセシングされていないCD79b、並びに細胞内のプロセシングから得られるCD79bの任意の形態を包含する。この用語は、CD79bの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「CD20」は、Bリンパ球表面抗原B1又は白血球表面抗原Leu-16としても知られているBリンパ球抗原CD20を指し、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然CD20を含む。ヒトCD20のアミノ酸配列は、Uniprot受託番号P11836(バージョン149、配列番号436)に示されている。CD20は、プレBリンパ球及び成熟Bリンパ球上に発現される約35 kDの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。対応するヒト遺伝子は、MS4A1としても知られる膜貫通4ドメイン、サブファミリーA、メンバー1である。この遺伝子は、膜貫通4A遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン/エクソンスプライス境界によって特徴付けられ、造血細胞及び非リンパ組織の間で固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、B細胞の形質細胞への発達及び分化において役割を果たすBリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中で11q12に局在している。この遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする2つの転写バリアントをもたらす。「CD20」という用語は、「完全長」のプロセシングされていないCD20、並びに細胞内のプロセシングから得られるCD20の任意の形態を包含する。この用語は、CD20の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「CD22」は、Bリンパ球細胞接着分子又はSIGLEC2としても知られているB細胞受容体CD22を指し、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然CD22を含む。ヒトCD22のアミノ酸配列は、Uniprot受託番号P20273(バージョン209、配列番号437)に示されている。CD22は、レクチンのSIGLECファミリーに属する分子であり、成熟B細胞の表面に見られ、一部の未成熟B細胞にはあまり見られない。したがって、CD22は、130~150kDaのB細胞制限細胞表面ホスホグリコタンパク質であり、Bリンパ球抗原受容体(BCR)媒介シグナル、並びにBCR非依存性シグナルの生成を調節することができる。「CD22」という用語は、「完全長」のプロセシングされていないCD22、並びに細胞内のプロセシングから得られるCD22の任意の形態を包含する。この用語は、CD22の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
「CD37」は、テトラスパニン-26(Tspan-26)としても公知の白血球抗原CD37を指し、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然CD37を含む。ヒトCD37のアミノ酸配列は、Uniprot受託番号P11049(バージョン162、配列番号438)に示されている。CD37発現は免疫系の細胞に限定され、成熟B細胞上で最も豊富であり、T細胞及び骨髄細胞上ではより低い発現が見られる。糖タンパク質CD37は、膜貫通4スーパーファミリーのメンバーであり、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を制御する。「CD37」という用語は、「完全長」のプロセシングされていないCD37、並びに細胞内のプロセシングから得られるCD37の任意の形態を包含する。この用語は、CD37の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
本明細書で使用される場合、「多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原」は、多発性骨髄腫(MM)細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。いくつかのMM細胞表面抗原は、多発性骨髄腫の免疫療法に関して興味深い。一態様では、MM細胞表面抗原は、CD38、BCMA及びGPRC5Dからなる群から選択される。
分化抗原群38又は環状ADPリボース加水分解酵素としても知られる「CD38」という用語は、CD4+、CD8+、Bリンパ球及びナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫細胞(白血球)の表面に見られる糖タンパク質である。CD38はまた、細胞接着、シグナル伝達及びカルシウムシグナル伝達においても機能する。正常条件下では、CD38は、骨髄細胞及びリンパ系細胞並びにいくつかの非造血組織において比較的低レベルで発現される。対照的に、正常な形質細胞及び多発性骨髄腫(MM)細胞は、高レベルのCD38発現を有し、これにより、CD38は、MMにおいて細胞表面分子を標的化するための興味深い標的となる。本明細書で使用されるCD38は、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のCD38タンパク質を指す。ヒトCD38のアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)受託番号P28907(配列番号474)に示されている。
「BCMA」という用語は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(TNFRS17)とも呼ばれるB細胞成熟抗原を指し、シグナルペプチドを有さず、システインリッチ細胞外ドメインを含有するIII型膜貫通タンパク質である。BCMAは、全ての患者MM細胞において有意に高いレベルで発現されるが、正常形質細胞を除く他の正常組織では発現されない。BCMAは、2つの関連するTNFRスーパーファミリーB細胞活性化因子受容体(BAFF-R)並びに膜貫通活性化因子及びカルシウム調節因子及びシクロフィリンリガンドインターアクター(TACI)と共に、B細胞の増殖及び生存、並びに形質細胞への成熟及び分化を決定的に調節する。これらの3つの機能的に関連する受容体は、それらの同族リガンドであるBAFF及び/又はAPRILに結合することによって、発生の異なる段階におけるB細胞の長期生存を支援する。本明細書で使用される場合、BCMAは、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のBCMAタンパク質を指す。ヒトBCMAのアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)受託番号Q02223(配列番号475)に示される。
「GPRC5D」という用語は、RNAシーケンシングを使用して多発性骨髄腫の形質細胞から同定された標的である、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーDを指す。GPRC5Dは、多発性骨髄腫患者の予後不良及び腫瘍量に関連することが報告されている。GPRC5Dは、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のGPRC5Dタンパク質を指す。ヒトGPRC5Dのアミノ酸配列をUniProt(www.uniprot.org)受託番号Q9NZD1(配列番号476)に示す。
「CD28」(分化クラスター28、Tp44)という用語は、特に明記しない限り、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のCD28タンパク質を指す。CD28はT細胞上で発現され、T細胞の活性化及び生存に必要な共刺激シグナルを提供する。T細胞受容体(TCR)に加えてCD28によるT細胞刺激は、様々なインターロイキンの産生のための強力なシグナルを提供することができる。CD28は、CD80(B7.1)及びCD86(B7.2)タンパク質の受容体であり、ナイーブT細胞上に構成的に発現される唯一のB7受容体である。ヒトCD28のアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)受託番号P10747(配列番号1)に示されている。
「アゴニスト抗体」とは、所与の受容体に対するアゴニスト機能を含む抗体を指す。一般に、アゴニストリガンド(因子)が受容体に結合すると、受容体タンパク質の三次構造が変化し、受容体が活性化される(受容体が膜タンパク質である場合、細胞増殖シグナルなどは、通常、形質導入される)。受容体が二量体形成型である場合、アゴニスト抗体は受容体を適切な距離及び角度で二量体化することができ、したがってリガンドと同様に作用する。適切な抗受容体抗体は、リガンドによって行われる受容体の二量体化を模倣することができ、したがって、アゴニスト抗体になり得る。
「CD28アゴニスト抗原結合分子」又は「CD28従来のアゴニスト抗原結合分子」は、T細胞受容体シグナル(「シグナル2」)の存在下でT細胞活性化を増強する役割においてCD28天然リガンド(CD80又はCD86)を模倣する抗原結合分子である。T細胞は、完全に活性化されるために2つのシグナルを必要とする。生理学的条件下では、「シグナル1」は、T細胞受容体(TCR)分子と抗原提示細胞(APC)上のペプチド/主要組織適合遺伝子複合体(MHC)複合体との相互作用から生じ、「シグナル2」は共刺激受容体、例えばCD28の係合によって提供される。CD28アゴニスト抗原結合分子は、T細胞を共刺激することができる(シグナル2)。CD28アゴニスト抗原結合分子はまた、TCR複合体に対する特異性を有する分子と組み合わせてT細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導することができるが、CD28アゴニスト抗原結合分子は、TCRの更なる刺激なしにT細胞を完全に活性化することができない。しかしながら、CD28特異的抗原結合分子のサブクラス、いわゆるCD28スーパーアゴニスト抗原結合分子が存在する。「CD28スーパーアゴニスト抗原結合分子」は、TCRを更に刺激することなくT細胞を完全に活性化することができるCD28抗原結合分子である。CD28スーパーアゴニスト抗原結合分子は、事前のT細胞活性化なしにT細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導することができる(シグナル1)。
「可変ドメイン」又は「可変領域」という用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と、3つの超可変領域(HVR)とを含む。例えば、Kindt et al.,Kuby Immunology,第6版 W.H.Freeman and Co.,第91頁(2007)を参照。抗原結合特異性を与えるために、単一のVH又はVLドメインで十分な場合がある。
本明細書で使用する場合、「超可変領域」又は「HVR」という用語は、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗原結合可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」(CDR)のそれぞれを意味する。一般的に、抗原結合ドメインは、6個のCDRを含み、VHに3個(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)、VLに3個(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)含む。本明細書における例示的なCDRとしては、
(a)アミノ酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及び96-101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));
(b)アミノ酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及び95-102(H3)に存在するCDR(Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」第5版、Public Health Service、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991年));並びに
(c)アミノ酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及び93-101(H3)で生じる抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))が挙げられる。
(a)アミノ酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及び96-101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987));
(b)アミノ酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及び95-102(H3)に存在するCDR(Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」第5版、Public Health Service、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991年));並びに
(c)アミノ酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及び93-101(H3)で生じる抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))が挙げられる。
特に指示がない限り、CDRは、上記Kabat et al.に従い決定される。当業者は、CDRの表記は、上記Chothia、上記McCallum、又は、任意の他の、科学的に認可された命名に従い決定することができることを理解するであろう。Kabat et al.はまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のナンバリングシステムも定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「Kabatナンバリング」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Kabatナンバリング」は、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,’’Sequence of Proteins of Immunological Interest’’(1983)に記載されるナンバリングシステムを指す。特に明記されない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングに関する言及は、Kabatナンバリングシステムに従う。
本明細書で使用される場合、抗原結合分子(例えば、抗体)に関連して「親和性成熟」という用語は、参照抗原結合分子に由来する、例えば突然変異によって、参照抗体と同じ抗原に結合する、好ましくは同じエピトープに結合する抗原結合分子を指し、参照抗原結合分子よりも抗原に対して高い親和性を有する。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の1つ以上のCDR中の1以上のアミノ酸残基の改変を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、初期参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
「フレームワーク」又は「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、概して、FR1、FR2、FR3及びFR4の4つのFRドメインからなる。したがって、HVR及びFR配列は、一般的に、VH(又はVL)中において以下の配列で現れる。FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変更の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、又は2以下である。いくつかの実施形態では、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び/又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の5種類の主要なクラスがあり、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基と、ヒトFR由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、HVR(例えば、CDR)の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、FRの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、C1q結合及び/又はFc受容体(FcR)結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。
「ヒト」抗体とは、ヒト若しくはヒト細胞により作製した、又はヒト抗体レパートリ若しくは他のヒト抗体コード化配列を利用した、非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、詳細には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
「CH1ドメイン」という用語は、おおよそEU位置118からEU位置215まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す(KabatによるEUナンバリングシステム)。一態様では、CH1ドメインは、ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV(配列番号477)のアミノ酸配列を有する。通常、EPKSC(配列番号480)のアミノ酸配列を有するセグメントは、続いてCH1ドメインをヒンジ領域に連結する。
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてCH1ドメインとCH2ドメインとを結合する抗体重鎖ポリペプチドの一部(例えば、KabatのEUナンバーシステムにより、約216の位置から約230の位置まで、又は約226の位置から約230の位置まで)を表す。他のIgGサブクラスのヒンジ領域は、IgG1サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることによって決定することができる。ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する2つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般に、25個までのアミノ酸残基を含み、柔軟であり、関連する標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、上部、中央、及び下部ヒンジドメイン(例えば、Roux,et al.,J.Immunol.161(1998)4083を参照されたい)の3つのドメインに細分することができる。
一態様では、ヒンジ領域は、アミノ酸配列DKTHTCPXCP(配列番号481)を有し、XはS又はPのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域は、アミノ酸配列HTCPXCP(配列番号482)を有し、XはS又はPのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列CPXCP(配列番号483)を有し、XはS又はPのいずれかである。
「Fcドメイン」又は「Fc領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のC末端領域を定義するために使用される。本用語は、天然配列Fc領域と変異体Fc領域とを含む。IgG Fc領域は、IgG CH2ドメインと、IgG CH3ドメインとを含む。
ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」は、通常、約EU位置231のアミノ酸残基から約EU位置340のアミノ酸残基(KabatによるEUナンバリングシステム)まで延在する。一態様では、CH2ドメインは、APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK(配列番号478)のアミノ酸配列を有する。CH2ドメインは、他のドメインと密接に対になっていないという点でユニークである。むしろ、インタクトネイティブFc領域の2つのCH2ドメインの間には、2つのN-linked分岐炭水化物鎖が介在している。炭水化物は、ドメインとドメインのペアリングの代わりを提供し、CH2ドメインの安定化を助けることが推測されている。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206.一実施形態では、炭水化物鎖は、CH2ドメインに接続している。本発明のCH2ドメインは、ネイティブ配列CH2ドメイン又は変異体CH2ドメインであってもよい。
「CH3ドメイン」は、Fc領域中のCH2ドメインのC末端側の残基のストレッチを含み、およそEU位置341からEU位置446まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す(KabatによるEUナンバリングシステム)。一態様では、CH3ドメインは、GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG(配列番号479)のアミノ酸配列を有する。本発明のCH3領域は、ネイティブ配列CH3ドメイン又は変異体CH3ドメインであってもよい(例えば、その1つの鎖に導入された「突起部」(「ノブ」)を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」(「ホール」)を有するCH3ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第5,821,333号を参照)。そのような変異体CH3ドメインを使用して、本明細書に記載される2つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。一実施形態では、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226から、又はPro230から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Fc領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991に記載されるEUナンバリングシステム(EUインデックスとも呼ばれる)に従う。
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第5,731,168号、米国特許第7,695,936号、Ridgway et al.,Prot Eng 9,617-621(1996)及びCarter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)に記載されている。一般的に、この方法は、第1のポリペプチドの界面にある突起(「ノブ」)と、第2のポリペプチドの界面にある空洞(「ホール」)とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第1のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えば、チロシン又はトリプトファン)と交換することによって構築される。突起部と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニン又はトレオニン)と置き換えることによって、第2のポリペプチドの界面に作られる。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ修飾は、Fcドメインの2つのサブユニットのうち1つにアミノ酸置換T366Wを含み、ホール修飾は、Fcドメインの2つのサブユニットのうち他方の1つにアミノ酸置換T366S、L368A及びY407Vを含む。更なる具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むFcドメインのサブユニットは、アミノ酸置換S354Cを更に含み、ホール修飾を含むFcドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Y349Cを更に含む。これら2つのシステイン残基の導入によって、Fc領域の2つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、ダイマーを更に安定化する(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
「免疫グロブリンのFc領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのFc領域の対立遺伝子変異体及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能(例えば、抗体依存性細胞傷害)に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有する変異体を含むことが意図される。例えば、1種以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのFc領域のN末端又はC末端から欠失されていてもよい。そのような変異体は、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる(例えば、Bowie,J.U.et al.、Science 247:1306-10(1990)を参照)。
「野生型Fcドメイン」という用語は、自然界で見出されるFcドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。野生型ヒトFcドメインには、天然ヒトIgG1 Fc領域(非A及びAアロタイプ)、天然ヒトIgG2 Fc領域、天然ヒトIgG3 Fc領域及び天然ヒトIgG4 Fc領域並びにその天然起源の変異体が含まれる。野生型Fc領域は、配列番号484(IgG1、白人型アロタイプ)、配列番号485(IgG1、アフロアメリカン型アロタイプ)、配列番号486(IgG2)、配列番号487(IgG3)及び配列番号488(IgG4)に示される。
「変異体(ヒト)Fcドメイン」という用語は、少なくとも1つの「アミノ酸変異」によって「野生型」(ヒト)Fcドメインアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を示す。一態様では、変異体Fc領域は、天然Fc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸変異、例えば約1~約10個のアミノ酸変異、一態様では天然Fc領域中に約1~約5個のアミノ酸変異を有する。一態様では、(変異体)Fc領域は、野生型Fc領域と少なくとも約95%の相同性を有する。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のFc領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる。C1q結合及び補体依存性細胞傷害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介障害(ADCC)、抗体依存性細胞食作用(ADCP)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方制御、及びB細胞活性化。
Fc受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のFc領域と、造血細胞における専用の細胞表面受容体である、Fc受容体(FcR)との相互作用により媒介されることができる。Fc受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で覆われた病原体の除去、並びに、抗体依存性細胞傷害(ADCC)による、赤血球、及び対応する抗体で覆われた他の細胞標的(例えば腫瘍細胞)の溶解の両方を媒介することが示されている(例えば、Van de Winkel,J.G.and Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524を参照されたい)。FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性により定義される:IgG抗体に対するFc受容体は、FcγRと呼ばれる。Fc受容体結合は、例えばRavetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492;Capel,P.J.,et al.,Immunomethods 4(1994)25-34;de Haas,M.,et al.,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341;及びGessner,J.E.,et al.,Ann.Hematol.76(1998)231-248に記載されている。
IgG抗体(FcγR)のFc領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエータの放出、並びに、免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の制御を含む、多種多様のエフェクター機能を誘発する。ヒトにおいて、3クラスのFcγRが特性決定されており、これらは以下のとおりである。
-FcγRI(CD64)は、単量体IgGに高い親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球にて発現する。アミノ酸残基E233~G236、P238、D265、N297、A327、及びP329(KabatのEUインデックスに従ったナンバリング)の少なくとも1つにおける、Fc領域内での修飾によって、FcγRIへの結合が低下する。IgG1及びIgG4に置換された、位置233~236におけるIgG2残基は、FcγRIへの結合を103倍低下させ、抗体により感作される赤血球に対するヒト単核細胞応答を取り除いた(Armour,K.L.,et al.,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。
-FcγRII(CD32)は、複合体化IgGに中程度から低度の親和性で結合し、幅広く発現する。受容体は、2つのサブタイプ:FcγRIIA及びFcγRIIBに分けることができる。FcγRIIAは主に、死滅に関与する多くの細胞(例えばマクロファージ、単球、好中球)にて発見され、死滅プロセスを活性化可能であるようである。FcγRIIBは、阻害プロセスで役割を果たすようであり、B細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球で発見されている。B細胞上では、FcγRIIBは、免疫グロブリン産生、及び、例えばIgEクラスへのアイソタイプ切り替えを更に抑制する機能を有するようである。マクロファージ上では、FcγRIIBは、FcγRIIAによって媒介されるように、ファゴサイトーシスを阻害する役割を果たす。好酸球及び肥満細胞上において、B形態は、IgEの、その個別の受容体への結合による、これらの細胞の活性化の抑制を補助し得る。FcγRIIAに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基E233~G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292、及びK414(KabatのEUインデックスに従ったナンバリング)の1つにおいて突然変異を有するIgG Fc領域を含む抗体に対して発見されている。
-FcγRIII(CD16)はIgGに、中程度~低度の親和性で結合し、2つの種類として存在する。FcγRIIIAはNK細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びT細胞上で発見されており、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは好中球上に高度に発現する。FcγRIIIAに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基E233~G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338、及びD376(KabatのEUインデックスに従ったナンバリング)の1つにおいて突然変異を有するIgG Fc領域を含む抗体に対して発見されている。
Fc受容体に対する、ヒトIgG1上での結合部位のマッピング、上述した突然変異部位、並びにFcγRI及びFcγRIIAへの結合を測定する方法は、Shields,R.L.,et al.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604に記載されている。
「ADCC又は「抗体依存性細胞傷害性」という用語は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Fc領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にFc領域に対してN末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「減少したADCC」という用語は、上記で定義されたADCCの機構による、標的細胞を取り囲む培地中の所与の濃度の抗体で所与の時間に溶解される標的細胞の数の減少、及び/又はADCCの機構による、所与の時間に所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増加のいずれかとして定義される。ADCCの減少は、同じ標準的な産生、精製、製剤化及び保存方法(当業者に知られている)を使用して、同じ種類の宿主細胞によって産生される同じ抗体によって媒介されるが、操作されていないADCCと比較している。例えば、そのFcドメインを含む抗体によって媒介されるADCCの低下である、ADCCを低下させるアミノ酸置換は、Fcドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるADCCに対するものである。ADCCを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である(例えば、PCT出願国際公開第2006/082515号又はPCT出願国際公開第2012/130831号を参照)。例えば、ADCCを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、FcγRI及び/若しくはFcγRIIA又は(本質的にFcγRIIIAを発現する)NK細胞を組み換えにより発現する細胞といった、Fcγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。具体的には、NK細胞上でのFcγRへの結合が測定される。
「活性化Fc受容体」は、抗体のFc領域による結合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するFc受容体である。活性化Fc受容体として、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)が挙げられる。特定の活性化Fc受容体は、ヒトFcγRIIIaである(UniProt受託番号P08637、バージョン141を参照)。
「外部ドメイン」は、細胞外空間(すなわち、標的細胞の外側の空間)に伸長する膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、シグナル伝達をもたらす表面との接触を開始するタンパク質の部分である。
「ペプチドリンカー」という用語は、1種以上のアミノ酸、典型的には、約2~20のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。好適な、非免疫原性リンカーペプチドは例えば、(G4S)n,(SG4)n又はG4(SG4)nペプチドリンカーであり、式中、「n」は一般に、1~5、典型的には2~4、特に2の数字であり、すなわち、ペプチドは、GGGGS(配列番号146)、GGGGSGGGGS(配列番号147)、SGGGGSGGGG(配列番号148)及びGGGGSGGGGSGGGG(配列番号149)からなる群から選択されるが、配列GSPGSSSSGS(配列番号150)、(G4S)3(配列番号151)、(G4S)4(配列番号152)、GSGSGSGS(配列番号153)、GSGSGNGS(配列番号154)、GGSGSGSG(配列番号155)、GGSGSG(配列番号156)、GGSG(配列番号157)、GGSGNGSG(配列番号158)、GGNGSGSG(配列番号159)及びGGNGSG(配列番号160)もまた含む。特に目的のペプチドリンカーは、(G4S)(配列番号146)、(G4S)2又はGGGGSGGGGS(配列番号147)、(G4S)3(配列番号151)及び(G4S)4(配列番号152)である。
「アミノ酸」という用語は、本明細書中で使用される場合、アラニン(三文字表記:ala、一文字表記:A)、アルギニン(arg、R)、アスパラギン(asn、N)、アスパラギン酸(asp、D)、システイン(cys、C)、グルタミン(gln、Q)、グルタミン酸(glu、E)、グリシン(gly、G)、ヒスチジン(his、H)、イソロイシン(ile、I)、ロイシン(leu、L)、リジン(lys、K)、メチオニン(met、M)、フェニルアラニン(phe、F)、プロリン(pro、P)、セリン(ser、S)、トレオニン(thr、T)、トリプトファン(trp、W)、チロシン(tyr、Y)及びバリン(val、V)を含む、天然に存在するカルボキシα-アミノ酸の群を示す。
「融合した」又は「接続した」とは、構成要素(例えば、上記TNFリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及び外部ドメイン)がペプチド結合によって直接又は1つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていることを意味する。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」は、最大パーセントの配列同一性を達成するために配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮しないで、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、SAWI又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性(%)の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.の著作であり、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁(U.S.Copyright Office、ワシントンD.C.、20559)に提出されて、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech,Inc.(カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)から公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルされてもよい。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含めたUNIXオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルするべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。ALIGN-2がアミノ酸配列比較に採用されている状況においては、(あるいは所与のアミノ酸配列Bに対する、配列Bとの、又は配列Bに対向するある特定のアミノ酸配列同一%を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Aとして購入することができる)所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bに対する、配列Bとの、又は配列Bに対向するアミノ酸配列同一%は、次のように計算される。割合X/Yの100倍(Xは、そのプログラムのAとBのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムALIGN-2によって同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AからBの%アミノ酸配列同一性は、BからAの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されるであろう。特に明記されない限り、本明細書で使用される全ての%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載されているように得られる。
特定の実施形態では、本明細書において提供する、CD28抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が想到される。例えば、CD28抗原結合分子の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。CD28抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び/又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終コンストラクトが、所望の特徴(例えば、抗原結合)を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。置換による突然変異生成のための目的部位として、HVR及びフレームワーク(FR)が挙げられる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Bに与えられており、アミノ酸側鎖クラス(1)~(6)を参照しつつ、以下に更に記載される。アミノ酸置換は、目的の分子及び所望の活性(例えば、抗原結合の保持/向上、免疫原性の低下、又はADCC又はCDCの向上)についてスクリーニングされた産物に導入されていてもよい。
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
「アミノ酸配列変異体」という用語は、親抗原結合分子(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)の1つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的に、更なる研究のために選択され、得られた変異体(複数可)は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾(例えば、改良)(例えば、親和性の増加、免疫原性の低下)を有し、及び/又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用い、簡便に生成されてもよい。簡単に言うと、1つ以上のHVR残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされた変異体抗原結合分子である。特定の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、1つ以上のHVR内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更(例えば、本明細書に提供される保存的置換)が、HVR中に作られてもよい。変異を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells(1989)Science、244:1081-1085によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群(例えば、荷電残基、例えば、Arg、Asp、His、Lys及びGlu)が同定され、中性又は負に荷電したアミノ酸(例えば、アラニン又はポリアラニン)によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又は更に、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原-抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。変異体は、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入として、1個の残基から100個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び/又はカルボキシル末端の融合、並びに1個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。挿入の例としては、CD28抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのN末端又はC末端への融合を有するCD28抗原結合分子が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書において提供するCD28抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。1つ以上のグリコシル化部位が作製される、又は取り除かれるように、アミノ酸配列を改変することにより、分子のグリコシル化変異体を便利に入手することができる。アゴニストICOS結合分子がFcドメインを含む場合において、Fcドメインに付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、N結合によってFc領域のCH2ドメインのAsn297に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al.TIBTECH 15:26-32(1997)を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のGlcNAcに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、アゴニスト性ICOS結合分子におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する変異体を作製するために行われ得る。一態様では、Fc領域に(直接的又は間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有するアゴニスト性ICOS結合分子の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改良されたADCC機能を有していてもよく、例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号(Presta,L.)又は米国特許出願公開第2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)を参照されたい。本発明のCD28抗原結合分子の更なる変異体は、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Fc領域に接続した二分岐オリゴ糖がGlcNAcによって二分されているものを含む。このような変異体は、フコシル化の低下及び/又はADCC機能の向上を有していてもよく、例えば、国際公開第2003/011878号(Jean-Mairet et al.)、米国特許第6,602,684号(Umana et al.)及び米国特許出願公開第2005/0123546号(Umana et al)を参照されたい。Fc領域に接続したオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。このような抗体変異体は、改良されたCDC機能を有する場合があり、例えば、国際公開第1997/30087号(Patelら)、国際公開第1998/58964号(Raju、S.)及び国際公開第1999/22764号(Raju、S.)に記載される。
一定の実施形態では、本発明のCD28抗原結合分子のシステイン操作変異体、例えば、分子の1つ以上の残基がシステイン残基で置換された「チオMAb」を作製することが望ましい場合がある。特定的な実施形態では、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基は、抗体の接近可能な部位に位置しており、これを使用し、抗体を他の部分(例えば、薬物部分又はリンカー-薬物部分)に対して抱合させ、免疫抱合体を作製してもよい。特定の実施形態では、以下の残基のうちの任意の1つ以上がシステインで置換されていてもよい:軽鎖のV205(Kabatナンバリング)、重鎖のA118(EUナンバリング)、及び重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるように作製されてもよい。
ある特定の態様では、本明細書中に提供されるCD28抗原結合分子は、当該分野で公知であり、容易に入手可能である更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない:ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体。ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(N-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキサイド/エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため、製造上の利点があるかもしれない。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は、様々であってもよく、1つより多いポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又は種類は、限定されないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が規定の条件下で使用されるかなどを含む限定事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質性部分との抱合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである(Kam,N.W.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。放射線は、任意の波長を有していてもよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書において提供するCD28抗原結合分子の免疫抱合体を得ることができる。「免疫抱合体」は、限定されないが、細胞毒性薬剤を含め、1つ以上の異種分子に抱合される抗体である。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)、ウイルス由来RNA、又はプラスミドDNA(pDNA)を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合(例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸(PNA)中に見出されるもの)を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の1つ以上の核酸セグメント、例えばDNA又はRNA断片を指す。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基(すなわち、シトシン(C)、グアニン(G)、アデニン(A)、チミン(T)又はウラシル(U))、糖(すなわち、デオキシリボース又はリボース)、及びホスフェート基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、上記塩基は、核酸分子の一次構造(線形構造)を表す。塩基の配列は、典型的には、5’から3’へと表される。本明細書では、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、例えば、相補性DNA(cDNA)及びゲノムDNA、リボ核酸(RNA)、特に、メッセンジャーRNA(mRNA)、DNA又はRNAの合成形態、及びこれらの分子の2つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、及び一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。更に、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び/又はインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したDNA分子及びRNA分子も包含する。このようなDNA(例えば、cDNA)又はRNA(例えば、mRNA)ベクターは、改変されていなくてもよく、又は改変されていてもよい。例えば、mRNAは、RNAベクターの安定性及び/又はコードされた分子の発現を増強するために化学的に修飾することができ、その結果、mRNAを対象に注射して、インビボで抗体を生成することができる(例えば、Stadler et al.(2017)Nature Medicine 23:815-817、又は欧州特許第2 101 823号B1を参照されたい)。
「単離」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、DNA、又はRNAを意図している。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種性宿主細胞において維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された(部分的に又は実質的に)、ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたRNA分子は、インビボ又はインビトロでの本発明のRNA転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成によって産生されるこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの調節要素であってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば95%「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチドあたり5個までの点突然変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列に対して同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの5%までが、欠失していてもよく、もしくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列内の全ヌクレオチドの5%までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の5’末端位置もしくは3’末端位置で、又は、それらの末端位置の間の、参照配列内の残基間で個々のもしくは参照配列内での1つ以上の連続した基においてかのいずれかに点在しているどこかで起こってもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの(例えば、ALIGN-2)を用いて、従来通りに決定することができる。
「発現カセット」という用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列、及びプロモーターを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞中で作用可能に会合した特異的遺伝子の発現を導入及び誘導するのに使用されるDNA分子を意味する。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したmRNAの多量の転写が可能となる。いったん発現ベクターが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子又は遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞の転写機構及び/又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は同じ意味で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を意味し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数に関わらず、初代の形質転換された細胞、及び初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体の後代は、本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
ある薬剤(例えば、薬学的組成物)の「治療有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。治療有効量の作用剤は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、齧歯類(例えば、マウス及びラット)が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
「薬学的組成物」という用語は、そこに含有される有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容可能な賦形剤」は、薬学的組成物中の成分であって、有効成分以外であり、対象にとって毒性ではない成分を指す。薬学的に許容可能な賦形剤として、限定されないが、緩衝液、安定剤、又は防腐剤が挙げられる。
「パッケージ添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び/又は警告に関する情報を含む。
本明細書で使用される場合、「処置」(及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」)は、処置される個体において本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用して、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
本明細書で述べる「併用処置」又は「同時投与」という用語は、併用投与(2つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる場合)及び別個の投与を包含し、その場合、本明細書で報告する抗体の投与は、1つ以上の追加の治療剤、好ましくは1つ以上の抗体の投与の前、同時に及び/又は後に起こり得る。
「B細胞増殖性障害」とは、患者のB細胞の数が健常対象のB細胞の数と比較して増加している疾患、特にB細胞の数の増加が疾患の原因又は特徴である疾患を意味する。
「血液がん」という用語は、典型的には調節されていない細胞増殖/増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、又はそれを説明する。したがって、本明細書で使用されるがんという用語は、癌、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫、及び白血病などの増殖性疾患を指す。特に、がんという用語は、B細胞増殖性障害を指す。一態様では、がんは、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫(MZL)、多発性骨髄腫(MM)、及びホジキンリンパ腫(HL)からなる群から選択される。
「がん」という用語は、典型的には調節されていない細胞増殖/増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、又はそれを説明する。したがって、本明細書で使用されるがんという用語は、癌、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫、及び白血病などの増殖性疾患を指す。特に「がん」という用語は、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺(NSCL)がん、肺胞細胞性肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、消化器がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、頸部の癌、膣の癌、陰門の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫尿道のがん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系(CNS)の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫(上述のいずれかのがんの難治性態様を含む)、又は上述のがんの1つ以上の組合せを含む。一態様では、がんは固形腫瘍である。別の態様では、がんは血液がん、特に白血病、最も特に急性リンパ芽球性白血病(ALL)又は急性骨髄性白血病(AML)である。
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性などの、特に有利な特性を有する新規の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。新規の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能(Fcサイレント)を低下させ、したがってFc受容体を介した非特異的架橋が回避される、1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含む。代わりに、それらは、腫瘍部位で架橋を引き起こす線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)などの腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む。したがって、腫瘍特異的T細胞活性化が達成される。
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性などの、特に有利な特性を有する新規の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。新規の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能(Fcサイレント)を低下させ、したがってFc受容体を介した非特異的架橋が回避される、1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含む。代わりに、それらは、腫瘍部位で架橋を引き起こす線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)などの腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む。したがって、腫瘍特異的T細胞活性化が達成される。
CD28への一価結合を有する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が本明細書において提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が本明細書において提供される。
一態様では、FcドメインがIgG、特にIgG1 Fcドメイン又はIgG4 Fcドメインである、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインはIgG1 Fcドメインである。Fcドメインは、Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる、及び/又はエフェクター機能を低下させるもしくは消失させる1つ以上のアミノ酸置換を含む。一態様では、Fcドメインは、アミノ酸置換L234A及びL235A(Kabat EUインデックスによるナンバリング)を含む。一態様では、FcドメインはヒトIgG1サブクラスのFcドメインであり、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(Kabat EUインデックスによるナンバリング)を含む。一態様では、安定な会合が可能な第一及び第二のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、第一のサブユニットが配列番号176のアミノ酸配列を含み、第二のサブユニットが配列番号177のアミノ酸配列を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号20の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号20の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号20のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23のCDR-L1、配列番号24のCDR-L2及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。
更には、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、本明細書において先に規定される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号489のCDR-H1、配列番号490のCDR-H2及び配列番号491のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号492のCDR-L1、配列番号493のCDR-L2及び配列番号494のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。
別の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号495のCDR-H1、配列番号496のCDR-H2及び配列番号497のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号498のCDR-L1、配列番号499のCDR-L2及び配列番号500のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。
別の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のCDR(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のCDR(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号501のCDR-H1、配列番号502のCDR-H2及び配列番号503のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号504のCDR-L1、配列番号505のCDR-L2及び配列番号506のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。
更なる態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50及び配列番号51からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号27、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60及び配列番号61からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む抗原結合ドメインと比較して、低いアフィニティーでCD28に結合する、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。親和性は、CD28を発現するCHO細胞への結合としてフローサイトメトリーによって測定される。一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む抗原結合ドメインと比較して、低下したアフィニティーでCD28に結合し、配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)のCDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3と、配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)のCDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3とを含む。一態様では、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む抗原結合ドメインと比較して、低い親和性でCD28に特異的に結合することができる抗原結合ドメインは、配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む。
特定の一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の特定の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
CEA標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが癌胎児性抗原(CEA)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが癌胎児性抗原(CEA)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号188のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号189のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号190のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号191のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号192のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号193のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号185のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号130のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号131のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号132のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iv)配列番号507のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号508のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号509のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号510のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号511のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号512のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結結合分子が提供される。
(i)配列番号188のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号189のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号190のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号191のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号192のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号193のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号185のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号130のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号131のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号132のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iv)配列番号507のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号508のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号509のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号510のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号511のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号512のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結結合分子が提供される。
特定の一態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号188のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号189のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号190のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号191のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号192のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号193のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)とを含む。
特に、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号133のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号134のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。一態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号133のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号134のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。
別の態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号186のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。一態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。
別の態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号513のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号514のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。一態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号513のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号514のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。
別の態様では、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号194のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号195のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(b)配列番号196のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(c)配列番号198のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号199のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(d)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(e)配列番号202のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号203のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(f)配列番号204のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(g)配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(h)配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(i)配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(j)配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号194のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号195のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(b)配列番号196のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(c)配列番号198のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号199のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(d)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(e)配列番号202のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号203のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(f)配列番号204のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(g)配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(h)配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(i)配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(j)配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特に、CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む。
FAP標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)と、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)(i)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)と、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特に、FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(i)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)とを含む。一態様では、FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(a)配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号19のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は(b)配列番号10のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号11のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)を含む。
EpCAM標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、EpCAMに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(i)配列番号515のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号516のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号517のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)と、(iv)配列番号518のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号519のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号520のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、EpCAMに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号521のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)及び配列番号522のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、EpCAMに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(a)配列番号521のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)、及び配列番号522のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む。
HER3標的二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがHer3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがHer3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(i)配列番号523のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号524のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号525のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHHER3)と、(iv)配列番号526のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号527のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号528のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLHER3)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号529のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号529のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む。
CD30標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号531のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号532のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号533のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD30)と、(iv)配列番号534のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号535のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号536のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD30)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号537のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号537のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む。
TBPG(5T4)標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがTBPG(5T4)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがTBPG(5T4)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号539のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号540のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号541のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHTBPG)と、(iv)配列番号542のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号543のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号544のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLTBPG)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号545のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTBPG)及び配列番号546のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTBPG)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号545のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTBPG)及び配列番号546のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTBPG)を含む。
MM標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
本発明はまた、多発性骨髄腫の処置において特に有用である新規な二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。分子は、多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原発現細胞の存在下で架橋を引き起こすMM細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、Fc受容体及び/又はエフェクター機能(Fcサイレント)に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含む。したがって、Fc受容体を介した非特異的架橋が回避され、MM細胞表面抗原発現細胞の存在下での特異的T細胞活性化が達成される。
本発明はまた、多発性骨髄腫の処置において特に有用である新規な二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。分子は、多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原発現細胞の存在下で架橋を引き起こすMM細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、Fc受容体及び/又はエフェクター機能(Fcサイレント)に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含む。したがって、Fc受容体を介した非特異的架橋が回避され、MM細胞表面抗原発現細胞の存在下での特異的T細胞活性化が達成される。
したがって、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、Fc受容体及び/又はエフェクター機能に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が本明細書において提供される。一態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、CD28への一価結合を特徴とする。更なる態様では、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原への一価結合を特徴とする。
一態様では、FcドメインがIgG、特にIgG1 Fcドメイン又はIgG4 Fcドメインである、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインはIgG1 Fcドメインである。Fcドメインは、Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる、及び/又はエフェクター機能を低下させるもしくは消失させる1つ以上のアミノ酸置換を含む。一態様では、Fcドメインは、アミノ酸置換L234A及びL235A(Kabat EUインデックスによるナンバリング)を含む。一態様では、FcドメインはヒトIgG1サブクラスのFcドメインであり、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(Kabat EUインデックスによるナンバリング)を含む。
一態様では、MM細胞表面抗原がCD38、BCMA及びGPRC5Dからなる群から選択される、本明細書において先に定義した二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号547のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号548のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号549のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD38)と、(iv)配列番号550のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号551のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号552のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD38)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号553のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号553のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む。
更に別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがBCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号555のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号556のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号557のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHBCMA)と、(iv)配列番号558のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号559のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号560のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号561のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び配列番号562のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号561のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び配列番号562のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む。
GPRC5D標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがGPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがGPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号563のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号564のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号565のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)と、(iv)配列番号566のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号567のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号568のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号569、配列番号571、配列番号572及び配列番号573からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)と、配列番号570、配列番号574、配列番号575、配列番号576、配列番号577及び配列番号578からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号569のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む。
別の態様では、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号579のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号580のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号581のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)と、(iv)配列番号582のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号583のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号584のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号585、配列番号586、配列番号587、配列番号588、配列番号589及び配列番号590からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)と、配列番号591、配列番号592、配列番号593、配列番号594及び配列番号595からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(b)配列番号573のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号576のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(c)配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号572のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(d)配列番号586のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号593のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(e)配列番号587のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号592のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(b)配列番号573のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号576のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(c)配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号572のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(d)配列番号586のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号593のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(e)配列番号587のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号592のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
CD28に結合するための一価及び腫瘍関連抗原に結合するための一価の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(1+1フォーマット)
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号65のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号66のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号87のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号88のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子M)が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)FAPに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)FAPに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号65のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号66のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号67のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号68のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子C)が提供される。
更なる態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号77のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号78のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖と、配列番号75のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号79のアミノ酸配列を含む第2の重鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子H)が提供される。
更なる態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能なFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能なFab断片が、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第1のFcドメインサブユニットのC末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第2のFcドメインサブユニットのC末端に融合される、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能なFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能なFab断片が、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第1のFcドメインサブユニットのC末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第2のFcドメインサブユニットのC末端に融合される、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、ペプチドリンカーは、配列番号146、配列番号147、配列番号151及び配列番号152から選択されるアミノ酸配列を含む。より詳しくは、ペプチドリンカーは、配列番号152を含む。
特定の一態様では、配列番号62のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号72のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号80のアミノ酸配列を含む第2の重鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子I)が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号513のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号514のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、
を含む、クロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号513のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号514のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、
を含む、クロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、配列番号352のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号351のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号353のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号354のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11A)が提供される。一態様では、配列番号352のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号351のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号355のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号356のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11B)が提供される。一態様では、配列番号352のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号351のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号357のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号358のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11C)が提供される。一態様では、配列番号352のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号351のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号359のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号354のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11D)が提供される。一態様では、配列番号370のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号369のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号353のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号356のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11I)が提供される。一態様では、配列番号370のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号369のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号359のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号354のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11J)が提供される。一態様では、配列番号370のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号369のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号357のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号358のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11K)が提供される。一態様では、配列番号370のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号369のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号359のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号356のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11L)が提供される。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号376のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号375のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号357のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号358のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11R)。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号376のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号375のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号355のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号356のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11S)。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号376のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号375のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号355のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号354のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11T)。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号376のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号375のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号355のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号356のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11S)。別の一態様では、配列番号352のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号351のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号355のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号356のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子11B)が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号513のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号514のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、
を含む、クロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号513のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号514のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、
を含む、クロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号361のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号360のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号362のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号363のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11E)。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号361のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号360のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号364のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号365のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11F)。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号361のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号360のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号366のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号367のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11G)。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号361のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号360のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号368のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号363のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11H)。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号372のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号371のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号368のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号363のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11M)。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号372のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号371のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号366のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号367のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11N)。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号372のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号371のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号364のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号365のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子11O)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)EpCAMに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)EpCAMに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号521のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)及び配列番号522のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む、EpCAMに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号521のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)及び配列番号522のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む、EpCAMに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)EpCAMに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)EpCAMに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号521のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)及び配列番号522のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む、EpCAMに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号521のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)及び配列番号522のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む、EpCAMに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号367のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号366のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号390のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号391のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子14A)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)HER3に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)HER3に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号529のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む、HER3に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号529のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む、HER3に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号357のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号358のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号392のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号393のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子14B)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)HER3に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)HER3に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号529のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む、HER3に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号529のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む、HER3に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)CD30に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)CD30に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号537のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む、CD30に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号537のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む、CD30に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号357のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号358のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号394のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号395のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子14C)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CD30に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CD30に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号537のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む、CD30に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号537のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む、CD30に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)TPBGに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)TPBGに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号545のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTPBG)及び配列番号546のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTPBG)を含む、TPBGに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号545のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTPBG)及び配列番号546のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTPBG)を含む、TPBGに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号357のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号358のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号396のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号397のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子14D)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)TPBGに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)TPBGに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号545のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTPBG)及び配列番号546のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTPBG)を含む、TPBGに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号545のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTPBG)及び配列番号546のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTPBG)を含む、TPBGに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)CD38に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)CD38に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号553のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む、CD38に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号553のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む、CD38に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号357のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号358のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号400のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号401のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子16C)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CD38に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CD38に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号553のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む、CD38に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号553のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む、CD38に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)BCMAに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)BCMAに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号561のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び配列番号562のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む、BCMAに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号561のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び配列番号562のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む、BCMAに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)BCMAに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)BCMAに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号561のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び及び配列番号562のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む、BCMAに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号561のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び及び配列番号562のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む、BCMAに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号367のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号366のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号402のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号403のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子16D)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)GPRC5Dに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)GPRC5Dに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む、GPRC5Dに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、Fab断片と、
(b)配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む、GPRC5Dに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号365のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号364のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号398のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号399のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子16B)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)GPRC5Dに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)GPRC5Dに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む、GPRC5Dに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む、GPRC5Dに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号367のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号366のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号398のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号399のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む(分子16A)。
CD28に結合するための一価及び腫瘍関連抗原に結合するための二価の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(1+2フォーマット)
別の態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、2本の軽鎖を含む二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供され、各々が配列番号78のアミノ酸配列を含み、1本の軽鎖は配列番号77のアミノ酸配列を含み、第1の重鎖は配列番号75のアミノ酸配列を含み、第2の重鎖は配列番号76のアミノ酸配列を含む(分子G)。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な断片に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片であって、
(i)配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号513のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号514のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、
を含む、Fab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)CEAに特異的に結合可能な断片に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片であって、
(i)配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(ii)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(iii)配列番号513のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号514のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、
を含む、Fab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、2本の軽鎖を含む二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供され、各々が配列番号361のアミノ酸配列を含み、1本の軽鎖は配列番号368のアミノ酸配列を含み、第1の重鎖は配列番号362のアミノ酸配列を含み、第2の重鎖は配列番号373のアミノ酸配列を含む(分子11P)。
特定の一態様では、2本の軽鎖を含む二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供され、各々が配列番号361のアミノ酸配列を含み、1本の軽鎖は配列番号368のアミノ酸配列を含み、第1の重鎖は配列番号360のアミノ酸配列を含み、第2の重鎖は配列番号374のアミノ酸配列を含む(分子11Q)。
FAP及びCEA標的化アゴニストCD28抗原結合分子
CD28への一価結合を有する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)第1の腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインであって、第2の腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な1つの抗原結合ドメインを更に含むことを特徴とする、Fcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子も本明細書において提供される。
CD28への一価結合を有する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)第1の腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインであって、第2の腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な1つの抗原結合ドメインを更に含むことを特徴とする、Fcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子も本明細書において提供される。
特定の一態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメイン及びFAPに特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、CD28への一価結合を有する三重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)CEAに特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメイン及びFAPに特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、CD28への一価結合を有する三重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号88のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号87のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号388のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号389のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子Y)が提供される。
B細胞表面抗原標的化二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性などの、特に有利な特性を有する新規の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。新規の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能(Fcサイレント)を低下させ、したがってFc受容体を介した非特異的架橋が回避される、1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含む。代わりに、それらは、CD19又はCD79b発現B細胞の存在下で架橋を引き起こすCD19又はCD79bなどのB細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む。したがって、CD19又はCD79b発現B細胞の存在下での特異的T細胞活性化が達成される。
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性などの、特に有利な特性を有する新規の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を提供する。新規の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能(Fcサイレント)を低下させ、したがってFc受容体を介した非特異的架橋が回避される、1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含む。代わりに、それらは、CD19又はCD79b発現B細胞の存在下で架橋を引き起こすCD19又はCD79bなどのB細胞表面抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む。したがって、CD19又はCD79b発現B細胞の存在下での特異的T細胞活性化が達成される。
CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、Fc受容体及び/又はエフェクター機能に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が本明細書において提供される。一態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、CD28への一価結合を特徴とする。更なる態様では、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、B細胞表面抗原への一価結合を特徴とする。
一態様では、FcドメインがIgG、特にIgG1 Fcドメイン又はIgG4 Fcドメインである、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインはIgG1 Fcドメインである。Fcドメインは、Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる、及び/又はエフェクター機能を低下させるもしくは消失させる1つ以上のアミノ酸置換を含む。一態様では、Fcドメインは、アミノ酸置換L234A及びL235A(Kabat EUインデックスによるナンバリング)を含む。一態様では、FcドメインはヒトIgG1サブクラスのFcドメインであり、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(Kabat EUインデックスによるナンバリング)を含む。
一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号20の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(i)配列番号20の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号20のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23のCDR-L1、配列番号24のCDR-L2及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、本明細書において先に規定される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号28のCDR-H1、配列番号29のCDR-H2及び配列番号30のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号31のCDR-L1、配列番号32のCDR-L2及び配列番号33のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号34のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号35のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、本明細書において先に規定される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号35のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のCD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む。
更なる態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50及び配列番号51からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号27、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60及び配列番号61からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含む。特定の一態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。別の特定の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。更なる態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。更に別の特定の態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)(i)配列番号406のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号407のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号408のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号409のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号410のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号411のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は(b)(i)配列番号414のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号415のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号416のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号417のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号418のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号419のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)とを含む、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。詳しくは、CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、(a)配列番号412のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は(b)配列番号420のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)を含む。特定の一態様では、CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号412のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)を含む。
別の態様では、B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがCD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号422のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号423のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号424のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD79b)と、(iv)配列番号425のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号426のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号427のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)とを含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特に、CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号428のアミノ酸配列と少なくとも約95%、98%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列と少なくとも約95%、98%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)とを含む。一態様では、CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号428のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)を含む。
更なる態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがFab断片又はクロスFab断片である、本明細書において先に定義した二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。一特定態様では、CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインはFab断片であり、B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインはクロスFab断片である。
CD28に結合するための一価及びB細胞表面抗原に結合するための一価の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(1+1フォーマット)
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号412のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(ii)配列番号420のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、
を含む、クロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号412のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(ii)配列番号420のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、
を含む、クロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、配列番号65のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号118のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号430のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号431のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子18A)が提供される。
特定の一態様では、配列番号121のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号116のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号430のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号431のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子18B)が提供される。
別の一態様では、配列番号122のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号114のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号430のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号431のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子18C)が提供される。
更なる一態様では、配列番号65のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号114のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号430のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号431のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子18D)が提供される。
更に別の態様では、配列番号123のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号118のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号430のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号431のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子18E)が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号412のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(ii)配列番号420のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、
を含む、1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、クロスFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号412のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(ii)配列番号420のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、
を含む、1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)CD79bに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)CD79bに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、1つのFab断片と、
(b)配列番号428のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)を含む、CD79bに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、1つのFab断片と、
(b)配列番号428のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)を含む、CD79bに特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、配列番号121のアミノ酸配列を含む第1の軽鎖と、配列番号116のアミノ酸配列を含む第1の重鎖と、配列番号432のアミノ酸配列を含む第2の重鎖と、配列番号433のアミノ酸配列を含む第2の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(分子18F)が提供される。
別の態様では、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(b)CD19に特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、1つのクロスFab断片と、
(b)配列番号428のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)を含む、CD79bに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片であって、
(i)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、1つのクロスFab断片と、
(b)配列番号428のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)を含む、CD79bに特異的に結合可能な1つのFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
CD28に結合するための一価及びB細胞表面抗原に結合するための二価の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子(1+2フォーマット)
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、B細胞表面抗原への二価結合を特徴とする。
一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、B細胞表面抗原への二価結合を特徴とする。
別の態様では、
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、本明細書に開示される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。
Fc受容体結合及び/又はエフェクター機能を下げるFcドメイン改変
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、CH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの2つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。Fcドメインは、本発明の抗原結合分子に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織-血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。一方、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Fc受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のFcドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンG(IgG)分子のFcドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、CH2及びCH3 IgG重鎖定常ドメインを含む。Fcドメインの2つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。Fcドメインは、本発明の抗原結合分子に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織-血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。一方、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Fc受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。
したがって、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のFcドメインは、ネイティブIgG1Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する結合アフィニティーの低下及び/又はエフェクター機能の低下を示す。一態様では、FcはFc受容体に実質的に結合せず、及び/又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Fc受容体は、Fcγ受容体である。一態様では、Fc受容体は、ヒトFc受容体である。具体的な態様では、Fc受容体は、活性化ヒトFcγ受容体であり、より特定的には、ヒトFcγRIIIa、FcγRI又はFcγRIIaであり、最も特定的には、ヒトFcγRIIIaである。一態様では、Fcドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下のうちの1つ以上が挙げられる:補体依存性細胞傷害(CDC)の低下、抗体依存性細胞傷害(ADCC)の低下、抗体依存性細胞傷害(ADCP)の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込みの低下、NK細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低下、樹状細胞の成熟の低下、又は減少したT細胞プライミング。
特定の態様では、1つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のFc領域に導入されてもよく、それにより、Fc領域変異体を作製する。Fc領域変異体は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4 Fc領域)を含み得る。
一特定態様では、本発明は、Fc領域が、Fc受容体に対する、特にFcγ受容体への結合を減少させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、抗原結合分子を提供する。一態様では、本発明は、Fc領域が1つ以上のアミノ酸置換を含み、抗体によって誘導されるADCCが、野生型ヒトIgG1 Fc領域を含む抗体によって誘導されるADCCの0~20%に減少する抗体を提供する。
一態様では、本発明の抗原結合分子のFcドメインは、Fc受容体に対するFcドメインの結合親和性及び/又はエフェクター機能を下げる1つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Fcドメインの2つのサブユニットそれぞれに、同じ1つ以上のアミノ酸変異が存在する。特に、Fcドメインは、E233、L234、L235、N297、P331及びP329の位置(EUナンバリング)にアミノ酸置換を含む。特に、Fcドメインは、IgG重鎖の234及び235(EUナンバリング)及び/又は329(EUナンバリング)の位置にアミノ酸置換を含む。より詳しくは、IgG重鎖中にアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(「P329GLALA」、EUナンバリング)を有するFcドメインを含む、本発明による抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換L234A及びL235Aは、いわゆるLALA変異をいう。アミノ酸置換の「P329GLALA」の組み合わせは、ヒトIgG1 FcドメインのFcγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、国際特許出願の国際公開第2012/130831号A1に記載され、そのような変異型Fcドメインを調製する方法及びFc受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定する方法も記載されている。
Fc受容体結合及び/又はエフェクター機能が低下したFcドメインには、Fcドメイン残基238、265、269、270、297、327及び329のうちの1つ以上が置換されたものも含まれる(米国特許第6,737,056号)。このようなFc突然変異体には、残基265及び297のアラニンへの置換を有するいわゆる「DANA」Fc突然変異体を含む、アミノ酸265位、269位、270位、297位、及び327位の2つ以上での置換を有するFc突然変異体が含まれる(米国特許第7,332,581号)。
別の態様では、Fcドメインは、IgG4 Fcドメインである。IgG4抗体は、IgG1抗体と比較して、Fc受容体に対する結合アフィニティーの低下と、エフェクター機能の低下を示す。取り具体的な態様では、Fcドメインは、位置S228にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換S228Pを含むIgG4 Fcドメインである(Kabatナンバリング)。より具体的な態様では、Fcドメインは、アミノ酸置換L235E及びS228P及びP329G(EUナンバリング)を含むIgG4 Fcドメインである。そのようなIgG4 Fcドメイン変異体及びそれらのFcγ受容体結合特性は、国際公開第2012/130831号にも記載されている。
変異体Fcドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は改変によって調製することができる。遺伝的方法は、コードDNA配列の部位特異的変異導入法、PCR、遺伝子合成などを含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。
Fc受容体に対する結合は、例えば、ELISAによって、又はBIAcore装置(GE Healthcare)などの標準的な装置と組換え発現によって得られ得るFc受容体を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)によって、容易に決定することができる。又は、Fc受容体に対するFcドメイン又はFcドメインを含む細胞活性化抗体の結合親和性は、特定のFc受容体を発現することが知られている細胞株(例えば、FcγIIIa受容体を発現するヒトNK細胞)を用いて評価されてもよい。
Fcドメイン、又はFcドメインを含む本発明の抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野において既知の方法により測定することができる。ADCCを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のADCC活性を評価するためのin vitroアッセイの他の例は、米国特許第5,500,362号、Hellstrom et al.Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及びHellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)、米国特許第5,821,337号、Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361(1987)に記載される。又は、非放射性アッセイ方法を使用してもよい(例えば、フローサイトメトリー(CellTechnology、Inc.Mountain View、CA)のためのACTI(商標)非放射性細胞毒性アッセイ、及びCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイ(Promega、Madison、WI))。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球(peripheral blood mononuclear cell:PBMC)及びナチュラルキラー(Natural Killer:NK)細胞が挙げられる。これに代えて、又は更に、目的の分子のADCC活性は、インビボで、例えば、Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
いくつかの態様では、相補性構成要素に対する(特定的にはC1qに対する)Fcドメインの結合が低下する。したがって、Fcドメインが低減されたエフェクター機能を有するように操作されるいくつかの態様では、当該低減されたエフェクター機能は、低減されたCDCを含む。C1q結合アッセイを実施して、本発明の二重特異性抗体がC1qに結合することができ、したがってCDC活性を有するかどうかを判断することができる。例えば、国際公開第2006/029879号及び国際公開第2005/100402号のC1q及びC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行ってもよい(例えば、Gazzano-Santoro et al.、J Immunol Methods 202、163(1996);Cragg et al.、Blood 101、1045-1052(2003);及びCragg and Glennie、Blood 103、2738-2743(2004)を参照されたい)。
特定の一態様では、ネイティブIgG1 Fcドメインと比較して、Fc受容体に対する結合アフィニティーの低下及び/又はエフェクター機能の低下を示すFcドメインは、アミノ酸置換L234A、L235A及び必要に応じてP329Gを含むヒトIgG1 Fcドメイン、又はアミノ酸置換S228P、L235E及び必要に応じてP329Gを含むヒトIgG4 Fcドメインである(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。より詳しくは、それは、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)を含むヒトIgG1 Fcドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するFcドメイン改変
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、Fcドメインの2つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Fcドメインの2つのサブユニットは、2つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、2つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のFcドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、Fcドメインの2つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Fcドメインの2つのサブユニットは、2つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、2つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のFcドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
したがって、特定の態様では、本発明は、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第1のサブユニット及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインとを含み、Fcドメインは、Fcドメインの第1のサブユニット及び第2のサブユニットの会合を促進させる改変を含む、CD28への一価結合を有する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子に関する。ヒトIgG Fcドメインの2つのサブユニット間の最も長いタンパク質-タンパク質相互作用の部位は、FcドメインのCH3ドメイン内にある。したがって、一態様では、上記改変は、FcドメインのCH3ドメインの中にある。
具体的な態様では、上記改変は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」改変であり、Fcドメインの2つのサブユニットの1つに「ノブ」改変と、Fcドメインの2つのサブユニットの他の1つに「ホール」改変とを含む。したがって、本発明は、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含み、ノブからホールへの方法に従ってFcドメインの第1のサブユニットがノブを含み、Fcドメインの第2のサブユニットがホールを含む、CD28への一価結合を有する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子に関する。特定の態様では、Fcドメインの第1のサブユニットは、アミノ酸置換S354C及びT366W(EUナンバリング)を含み、Fcドメインの第2のサブユニットは、アミノ酸置換Y349C、T366S及びY407Vを含む(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第5,731,168号、米国特許第7,695,936号、Ridgway et al.,Prot Eng 9,617-621(1996)及びCarter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)に記載される。一般的に、この方法は、第1のポリペプチドの界面にある突起(「ノブ」)と、第2のポリペプチドの界面にある空洞(「ホール」)とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第1のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えば、チロシン又はトリプトファン)と交換することによって構築される。突起部と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニン又はトレオニン)と置き換えることによって、第2のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のFcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第1のサブユニットのCH3ドメイン内に突起を生成し、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第2のサブユニットのCH3ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が位置換え可能である。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な態様では、Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインにおいて、位置366のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており(T366W)、Fcドメインの第2のサブユニット(のCH3ドメイン)において、位置407のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている(Y407V)。一態様では、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、更に、位置366のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており(T366S)、位置368のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている(L368A)。
なお更なる態様では、Fcドメインの第1のサブユニットにおいて、更に、位置354のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており(S354C)、Fcドメインの第2のサブユニットにおいて、更に、位置349のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている(Y349C)。これら2つのシステイン残基の導入によって、Fcドメインの2つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、二量体を更に安定化する(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。特定の態様では、Fcドメインの第1のサブユニットは、アミノ酸置換S354C及びT366W(EUナンバリング)を含み、Fcドメインの第2のサブユニットは、アミノ酸置換Y349C、T366S及びY407Vを含む(Kabat EUインデックスによるナンバリング)。
代替的な態様では、Fcドメインの第1のサブユニット及び第2のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、PCT出願国際公開第2009/089004号に記載されるように、静電操縦効果に介在する改変を含む。一般的に、この方法は、2つのFcドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による1つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。
本明細書に報告される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の重鎖のC末端は、アミノ酸残基PGKで終わる完全なC末端であり得る。重鎖のC末端は、C末端アミノ酸残基のうち1つ又は2つが除去された、短くなったC末端であってもよい。1つの好ましい態様では、重鎖のC末端は短縮C末端末端Pである。1つの好ましい態様では、重鎖のC末端は短縮C末端末端PGである。一態様では、本明細書に報告される全ての態様のうちの1つの態様では、本明細書に明記されるC末端のCH3ドメインを含む重鎖を含むCD28抗原結合分子は、C末端グリシン-リシンジペプチドを含む(G446及びK447、Kabat EUインデックスによるナンバリング)。一態様では、本明細書に報告される全ての態様のうちの1つの態様では、本明細書に明記されるC末端のCH3ドメインを含む重鎖を含むCD28抗原結合分子は、C末端グリシン残基を含む(G446、Kabat EUインデックスによるナンバリング)。
Fabドメイン内の改変
一態様では、本発明は、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第1のサブユニット及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインとを含む、CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインがFab断片であり、Fab断片において、可変ドメインVH及びVL又は定常ドメインCH1及びCLのいずれかが、Crossmab技術に従って交換される、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子に関する。
一態様では、本発明は、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第1のサブユニット及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインとを含む、CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインがFab断片であり、Fab断片において、可変ドメインVH及びVL又は定常ドメインCH1及びCLのいずれかが、Crossmab技術に従って交換される、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子に関する。
1つの結合アームにドメインの置き換え/交換を伴う多特異性抗体(CrossMabVH-VL又はCrossMabCH-CL)は、国際公開第2009/080252号及びSchaefer,W.et al、PNAS、108(2011)11187-1191に記載される。これらの多特異性抗体は、明確に、第1の抗原に対する軽鎖と、第2の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす(このようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合)。
一態様では、本発明は、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第1のサブユニット及び第2のサブユニットから構成されるFcドメインとを含む、CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なFab断片において、定常ドメインCL及びCH1が、CH1ドメインが軽鎖の一部であり、CLドメインが重鎖の一部であるように互いに置き換えられている、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子に関する。
別の態様では、正しい対合を更に改善するために、(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定して会合することができる第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含み、CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、種々の荷電アミノ酸置換(いわゆる「荷電残基」)を含むことができる。これらの改変は、クロスしているか、又はクロスしていないCH1ドメイン及びCLドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、CLドメインの1つにおいて、位置123(EUナンバリング)のアミノ酸がアルギニン(R)で置換されており、位置124(EUナンバリング)のアミノ酸がリジン(K)で置換されており、CH1ドメインの1つにおいて、位置147(EUナンバリング)、及び位置213(EUナンバリング)のアミノ酸がグルタミン酸(E)で置換されている、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子に関する。特定の一態様では、CD28に特異的に結合可能なFab断片のCLドメインでは、位置123のアミノ酸(EUナンバリング)がアルギニン(R)によって置換されており、位置124のアミノ酸(EUナンバリング)がリジン(K)によって置換されており、CD28に特異的に結合可能なFab断片のCH1ドメインでは、位置147のアミノ酸(EUナンバリング)及び位置213のアミノ酸(EUナンバリング)がグルタミン酸(E)によって置換されている。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載した二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子をコードする1つ以上の単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の(例えば、2つ以上の)ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子全体をコードする。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、DNAである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、RNAであり、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の形態である。本発明のRNAは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
本発明は更に、本明細書に記載した二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子をコードする1つ以上の単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の(例えば、2つ以上の)ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子全体をコードする。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明による二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、DNAである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、RNAであり、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)の形態である。本発明のRNAは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、例えば、固体ペプチド合成(例えば、Merrifield固相合成)又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上記のような二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び/又は発現のために1つ以上のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。本発明の一態様では、本発明の1種以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写/翻訳制御シグナルと共に、抗体(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えDNA技術、合成技術及びインビボ組換え/遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Maniatis et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);及びAusubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片(即ちコード領域)をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び/又は他の転写若しくは翻訳調節要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」(TAG、TGA又はTAA)は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’未翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。2つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば別個の(異なる)ベクター上に存在していてもよい。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は2つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、1種以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物(例えばポリペプチド)のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、1つ以上の制御配列と会合する。2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター)は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写が起こる場合、2つのDNA断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はDNAテンプレートを転写する能力卯を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのDNAの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、例えば、固体ペプチド合成(例えば、Merrifield固相合成)又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上記のような二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び/又は発現のために1つ以上のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。本発明の一態様では、本発明の1種以上のポリヌクレオチドを含む、ベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写/翻訳制御シグナルと共に、抗体(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えDNA技術、合成技術及びインビボ組換え/遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Maniatis et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989);及びAusubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片(即ちコード領域)をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び/又は他の転写若しくは翻訳調節要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」(TAG、TGA又はTAA)は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’未翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。2つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に例えば別個の(異なる)ベクター上に存在していてもよい。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は2つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、1種以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物(例えばポリペプチド)のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、1つ以上の制御配列と会合する。2つのDNA断片(例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター)は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写が起こる場合、2つのDNA断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はDNAテンプレートを転写する能力卯を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのDNAの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えば最初期プロモーター、イントロン-Aと組み合わせる)、シミアンウイルス40(例えば初期プロモーター)及びレトロウイルス(例えばラウス肉腫ウイルス)が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa-グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。追加の適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター(例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン)が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素(特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちIRES、CITE配列とも呼ばれる)が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び/又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復(LTR)、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)末端逆位配列(ITR)などの他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするDNAを、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのN末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから切断されることを知っている。特定の実施形態では、ネイティブシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分裂を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。又は、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター(TPA)又はマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製(例えばヒスチジンタグ)を容易にするために、又は二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の標識化を補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするDNAは、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
本発明の更なる態様では、本発明の1種以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、本発明の1つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む(例えば、以下で形質転換又はトランスフェクトされている)。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物(例えば大腸菌)又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞などが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)及びLi et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)を参照されたい。
(グリコシル化)ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と併せて(特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションに)使用することができる、多数のバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、及び同第6,417,429号(トランスジェニック植物で抗体を産生するためのPLANTIBODIES(商標)技術を記載している)を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40(COS-7)によって形質転換されたサル腎臓CV1株、ヒト胚腎臓株(例えば、Graham et al.、J Gen Virol 36、59(1977)に記載されるような293細胞又は293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather、Biol Reprod 23、243-251(1980)に記載されるようなTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリサル腎臓細胞(VERO-76)、ヒト頸部癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス乳房腫瘍細胞(MMT 060562)、TRI細胞(例えば、Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)に記載される)、MRC5細胞、及びFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、dhfr-CHO細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))、骨髄腫細胞株、例えば、YO、NS0、P3X63及びSp2/0が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚腎臓(HEK)細胞又はリンパ球細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を組み換えて、他方の免疫グロブリン鎖を発現して、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンとなるようにすることができる。
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書で提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から回収することを含む、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供される。
特定の態様では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原(例えば、Fab断片)に特異的に結合可能な部分は、少なくとも、抗原に結合能を有する免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成し得、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Harlow and Lane,’’Antibodies,a laboratory manual’’,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を参照されたい。)。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ(例えば、米国特許第4,186,567号に記載されるように)、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって(例えば、McCaffertyに対する米国特許第5,969,108号を参照されたい)。
免疫グロブリンの任意の動物種を本発明で使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトへの使用を意図したものである場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ形態の免疫グロブリンを使用してもよい。免疫グロブリンのヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる(例えば、Winterに対する米国特許第5,565,332号を参照されたい)。ヒト化は、限定されないが、(a)重要なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合アフィニティー又は抗体機能を維持するのに重要なもの)を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト(例えば、ドナー抗体)のCDRをヒト(例えば、レシピエント抗体)のフレームワーク領域及び定常領域に接合すること、(b)非ヒト特異性決定領域(SDR又はa-CDR;抗体-抗原相互作用にとって重要な残基)のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト接合すること、又は(c)全非ヒト可変ドメインを翻訳するが、表面残基を置き換えることによって、これらとヒト様部分とを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びこれを製造する方法は、例えば、Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)に記載され、更に、例えば、Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988);Queen et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989);米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号及び同第7,087,409号;Jones et al.,Nature 321,522-525(1986);Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984);Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988);Verhoeyen et al.,Science 239,1534-1536(1988);Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994);Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(特異性決定領域(SDR)のグラフト接合を記載する);Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(「リサーフェシング」を記載する);Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(「FRシャッフリング」を記載する);及びOsbourn et al.,Methods36:61-68(2005)及びKlimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(FRシャッフリングに対する「ガイド付き選択」手法を記載する)に記載される。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk and van de Winkel、Curr Opin Pharmacol 5、368-74(2001)及びLonberg、Curr Opin Immunol 20、450-459(2008)に記載される。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し得、そのヒトモノクローナル抗体に由来し得る(例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(1987年ニューヨークのMarcel Dekker,Inc.)を参照されたい)。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る(例えば、Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)を参照されたい)。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリ(例えば、Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001);及びMcCafferty et al.,Nature 348,552-554;Clackson et al.,Nature 352,624-628(1991)を参照されたい)から選択されるFvクローン可変領域配列を単離することによって作製され得る。ファージは、典型的には、抗体断片を一本鎖Fv(scFv)断片又はFab断片のいずれかとしてディスプレイする。
特定の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、例えば、PCT出願国際公開第2012/020006号(親和性成熟に関する実施例を参照されたい)又は米国特許第2004/0132066号に開示される方法に従って、結合親和性が増強されるように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明の抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)又は当業者によく知られている他の手法、例えば表面プラズモン共鳴技法(Liljeblad,et al.,Glyco J 17,323-329(2000))、及び従来の結合アッセイ(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))のいずれかによって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施形態では、そのような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ(例えば、線状エピトープ又は立体配座エピトープ)に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris(1996)’’Epitope Mapping Protocols’’,in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press、ニュージャージー州トトワ)に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定された抗原は、抗原に結合する第1の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第1の抗原結合分子と競合する能力について試験されている第2の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化抗原を、第1の標識抗原結合分子を含むが第2の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートする。第1の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化された抗原に関連する標識の量を測定する。固定された抗原に関連する標識の量が対照試料と比較して試験試料で実質的に減少している場合、それは、第2の抗原結合分子が抗原への結合について第1の抗原結合分子と競合していることを示す。Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)を参照されたい。
本明細書に記載のとおりに調製される本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィー精製のために、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗原結合分子を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインA又はプロテインGを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインA又はGの親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗原結合分子を単離することができる。CD28抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例にて記載のとおりに発現するCD28抗原結合分子は、還元型、及び非還元型SDS-PAGEにより示されるように、インタクトであり、適切にアセンブルしたことが示された。
アッセイ
本明細書において提供する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の物理的/化学的性質、及び/又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。
本明細書において提供する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の物理的/化学的性質、及び/又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。
1.親和性アッセイ
対応する標的に対する本明細書で提供される抗原結合分子の親和性は、Proteon機器(Bio-rad)などの標準的な機器、及び組換え発現によって得られ得るものなどの受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって実施例に記載の方法に従って決定することができる。標的細胞抗原に対するTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の親和性はまた、Proteon機器(Bio-rad)などの標準的な機器を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定することができ、受容体又は標的タンパク質などは組換え発現によって得ることができる。結合アフィニティーを測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態は、実施例4に記載される。一態様によれば、KDは、Proteon(登録商標)装置(Bio-Rad)を用いて25℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
対応する標的に対する本明細書で提供される抗原結合分子の親和性は、Proteon機器(Bio-rad)などの標準的な機器、及び組換え発現によって得られ得るものなどの受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって実施例に記載の方法に従って決定することができる。標的細胞抗原に対するTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の親和性はまた、Proteon機器(Bio-rad)などの標準的な機器を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定することができ、受容体又は標的タンパク質などは組換え発現によって得ることができる。結合アフィニティーを測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態は、実施例4に記載される。一態様によれば、KDは、Proteon(登録商標)装置(Bio-Rad)を用いて25℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
2.結合アッセイ及び他のアッセイ
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の、対応する受容体を発現する細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、ヒトCD28(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を発現するCHO細胞を結合アッセイに使用する。
本明細書において提供する二重特異性抗原結合分子の、対応する受容体を発現する細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー(FACS)により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、ヒトCD28(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を発現するCHO細胞を結合アッセイに使用する。
更なる態様では、標的細胞抗原、例えばFAP又はCEA、CD19又はCD79bを発現するがん細胞株を使用して、標的細胞抗原への二重特異性抗原結合分子の結合を実証した。
3.活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するCD28抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性としては、例えば、実施例6に記載の方法で測定したT細胞増殖及びサイトカイン分泌、又は実施例7で測定した腫瘍細胞死滅を挙げることができる。かかる生物活性をインビボ及び/又はインビトロで有する抗体も提供される。
一態様では、生物学的活性を有するCD28抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性としては、例えば、実施例6に記載の方法で測定したT細胞増殖及びサイトカイン分泌、又は実施例7で測定した腫瘍細胞死滅を挙げることができる。かかる生物活性をインビボ及び/又はインビトロで有する抗体も提供される。
薬学的組成物、製剤、及び投与経路
更なる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提示される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子及び少なくとも1種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書において提供する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、及び、例えば後述する少なくとも1種の追加の治療剤を含む。
更なる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書において提供する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に提示される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子及び少なくとも1種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書において提供する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、及び、例えば後述する少なくとも1種の追加の治療剤を含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤に溶解又は分散した、治療的有効量の1種以上の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的又は薬理学的に許容可能な」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物(例えばヒト)に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。少なくとも1種の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、及び必要に応じて追加の有効成分を含有する薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれているRemington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990により例示されているように、本開示の見地から当業者に既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」としては、当業者には知られているであろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組み合わせが挙げられる。
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射により投与されるように設計されているものが挙げられる。注射のために、本発明のTNFファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Hanks溶液、Ringer溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。あるいは、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱性物質除去水と共に構成するための、粉末形態であることができる。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び/又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌フィルタにかけた液体媒体から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、0.5ng/mgのタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、バッファー、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド;ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン;単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む;キレート化剤、例えば、EDTA;糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物(例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど)を含んでいてもよい。必要に応じて、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。更に、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油(例えば、ゴマ油)、又は合成脂肪酸エステル(例えば、エチルクリート(ethyl cleat)又はトリグリセリド)又はリポソームが挙げられる。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル)内、又はマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成型物品の形態である。具体的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ)の組成物での使用によってもたらされてもよい。本発明の例示的な薬学的に許容可能な賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、ヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)を含む。特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、rHuPH20を含め、米国特許出願公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号に記載される。一態様では、sHASEGPを、1種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ(例えば、コンドロイチナーゼ)と合わせる。例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第6,171,586号及び国際公開第2006/044908号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。上述した組成物に加えて、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。このような長く作用する製剤は、埋め込みによって(例えば、皮下又は筋肉内)、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、適切なポリマー又は疎水性材料(例えば、許容可能な油中のエマルションとして)又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、1種以上の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を薬学的に使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸などの無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。本発明の組成物は、処置される特定の徴候に必要な1種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。インビボ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。
治療方法及び組成物
本明細書において提供する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のいずれかを、単独で又は組み合わせて、治療方法にて使用することができる。
本明細書において提供する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のいずれかを、単独で又は組み合わせて、治療方法にて使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。更なる態様では、がんの処置に使用するための二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特定の態様では、処置の方法において使用するための二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書において、がんを有する個体の処置方法であって、有効量の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を個体に投与することを含む、方法で使用するための、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。そのような一実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも1つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
一態様では、B細胞増殖性障害の処置に使用するための二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。特定の態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫(MZL)、多発性骨髄腫(MM)及びホジキンリンパ腫(HL)からなる群から選択されるB細胞増殖性障害の処置における使用のためのものである。1つの特定の態様では、B細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。特定の態様では、処置の方法において使用するための二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書において、がんを有する個体の処置方法であって、有効量の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を個体に投与することを含む、方法で使用するための、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。別の態様では、B細胞増殖障害、特に、非ホジキンリンパ腫(NHL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、辺縁帯リンパ腫(MZL)、多発性骨髄腫(MM)及びホジキンリンパ腫(HL)からなる群から選択されるB細胞増殖障害を有する個体を処置する方法であって、有効量の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を個体に投与することを含む、方法において使用するための、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。そのような一実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも1つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。
更なる態様では、がん免疫療法に使用するための本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。特定の実施形態では、がん免疫療法の方法において使用するための二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が提供される。上記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
更なる態様では、本明細書において、医薬の製造又は調製における、本明細書中に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の使用のために提供される。一実施形態では、医薬は、がんの処置のためのものである。更なる態様では、医薬は、がんを処置する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法における使用のためのものである。そのような一つの態様では、該方法は、有効量の少なくとも1つの更なる治療剤、例えば、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。別の態様では、医薬は、B細胞増殖性障害の処置のためのものである。更なる態様では、医薬は、がん又はB細胞増殖性障害を処置する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法における使用のためのものである。
更なる態様では、本明細書では、がんを処置するための方法を提供する。一態様では、本方法は、がんを有する個体に有効量の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を投与する工程を含む。そのような一つの態様では、該方法は、有効量の少なくとも1つの更なる治療剤、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
更なる態様では、例えば上記の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書に掲載する二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のいずれかを含む医薬製剤を本明細書において提供する。一態様では、医薬製剤は、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容可能な担体とを含む。別の態様では、医薬製剤は、本明細書中に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子のいずれかと、少なくとも1つの更なる治療剤とを含む。
本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて治療に使用することができる。例えば、本明細書中に記載されるような二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、少なくとも1つの更なる治療剤と同時投与され得る。
上述したそのような併用療法は、併用投与(ここでは、2つ以上の治療剤が同一又は別個の製剤中に含まれる)及び別個の投与を包含し、この場合、本明細書に報告される抗体の投与は、追加の治療剤又は薬剤の投与に先立って、同時に、及び/又はそれに続いて、行われ得る。一態様では、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の投与、及び追加の治療剤の投与は互いに、約1ヶ月以内、又は約1、2、若しくは3週間以内、又は約1、2、3、4、5、若しくは6日以内に生じる。
本明細書に報告される抗原結合分子(及び任意の追加の治療剤)は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所処置のために所望される場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与することができる。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与などがある。投薬は、任意の適切な経路によるもの、例えば、一部には、投与が一時的であるか慢性的であるかに依存して、注射によって、例えば、静脈又は皮下への注射によるものであってもよい。限定されないが、種々の時間点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、パルス注入を含む種々の投薬計画が本明細書で想定される。
本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の疾患、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、必ずしもではないが、必要に応じて、問題の障害を予防又は処置するために同時に使用する1つ以上の作用物質と共に、製剤化される。このような他剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患の種類又は処置など、上述した他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載されている投与量と同じ投与量で、又は本明細書に記載されている投与量の約1~99%、又は経験的/臨床的に適切であると判断される任意の投与量で、及び任意の投与経路で使用される。
疾患の予防又は処置のため、本明細書に記載される二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の適切な投薬量は(単独で又は1つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき)、治療対象の疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の病歴、抗体への反応、並びに主治医の裁量によって決定されることになる。二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、一度に、又は一連の処置にまたがり、患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、例えば、1回又は複数回の個別投与、又は連続点滴に関わらず、約1μg/kg~15mg/kg(例えば0.5mg/kg~10mg/kg)の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となることができる。典型的な1日投薬量は、上述の因子に依存して、約1μg/kg~100mg/kgの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の1つの例示的な投与量は、約0.05mg/kgから約10mg/kgの範囲であろう。したがって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、又は10mg/kg(又はこれらの任意の組合せ)のうちの1つ以上の用量が、患者に投与され得る。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は3週間毎(例えば、患者が約2~約20回、又は例えば約6回の用量の抗体を受容するように)投与されてもよい。最初の多めの投与量、それに続く1回又は複数回の量の少ない用量を投与してよい。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
他の薬剤及び処置
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、1種以上の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗原結合分子は、少なくとも1つの追加の治療剤と共投与されてもよい。「治療剤」という用語は、このような処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような更なる治療剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、更なる治療剤は、別の抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。特定の態様では、更なる治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤若しくは細胞増殖抑制、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。
本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、1種以上の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗原結合分子は、少なくとも1つの追加の治療剤と共投与されてもよい。「治療剤」という用語は、このような処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような更なる治療剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、更なる治療剤は、別の抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。特定の態様では、更なる治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤若しくは細胞増殖抑制、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。
したがって、提供されるのは、がんの処置に使用するための本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又はそれらを含む薬学的組成物であり、二重特異性抗原結合分子が、がん免疫療法に使用するための化学療法剤、放射線及び/又は他の薬剤と組み合わせて投与される、二重特異性抗原結合分子である。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。有効量のこのような他の薬剤は、使用される融合タンパク質の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、若しくは本明細書で記載される1~99%の用量、又は実験的/臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。上記のそのような併用療法は、併用投与(2つ以上の治療剤が同じ又は別個の組成物に含まれる場合)、及び別個の投与を含み、その場合、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与は、追加の治療薬及び/又はアジュバントの投与の前、同時、及び/又は後に、起こり得る。
更なる態様では、提供されるのは、がんの処置に使用するための、本明細書で上述した二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であり、二重特異性抗原結合分子は、別の免疫調節剤と組み合わせて投与される。「免疫調節剤」という用語は、免疫系に影響を与えるモノクローナル抗体を含む任意の物質を指す。本発明の分子は、免疫調節剤と見なすことができる。免疫調節剤は、がんの処置のための抗腫瘍剤として使用することができる。一態様では、免疫調節剤には、抗CTLA4抗体(例えば、イピリムマブ)、抗PD1抗体(例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ)、PD-L1抗体(例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブ)、OX-40抗体、4-1BB抗体及びGITR抗体が挙げられる。上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与(2つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる)、及び別個の投与を包含し、この場合、二重特異性抗原結合分子の投与は、更なる治療剤及び/又はアジュバントの投与前、投与と同時及び/又は投与後に行われてもよい。
T細胞二重特異性抗体との組合せ
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なT細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体又は抗MCSP/抗CD3二重特異性抗体である。特定の一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なT細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体である。
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なT細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体又は抗MCSP/抗CD3二重特異性抗体である。特定の一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なT細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体である。
一態様では、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、癌胎児性抗原(CEA)、葉酸受容体アルファ(FolR1)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮成長因子受容体(EGFR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)及びp95 HER2からなる群から選択される腫瘍関連抗原(TAA)への特異的結合が可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて投与するのに適している。別の特定の態様では、TAAは、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、癌胎児性抗原(CEA)、EpCAM、HER3、CD30又はTPBG(5T4)からなる群から選択される。
特定の態様では、組合せにおける使用のための抗CD3二重特異性抗体は、配列番号439のCDR-H1配列、配列番号440のCDR-H2配列及び配列番号441のCDR-H3配列を含む重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号442のCDR-L1配列、配列番号443のCDR-L2配列、及び配列番号444のCDR-L3配列を含む軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗CD3二重特異性は、配列番号445のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号446のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗CD3二重特異性抗体は、配列番号445のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号446のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD3)を含む。
別の態様では、組合せにおける使用のための抗CD3二重特異性抗体は、配列番号596のCDR-H1配列、配列番号597のCDR-H2配列及び配列番号598のCDR-H3配列を含む重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号599のCDR-L1配列、配列番号600のCDR-L2配列、及び配列番号601のCDR-L3配列を含む軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗CD3二重特異性は、配列番号602のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号603のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号602のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号603のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD3)を含む。
別の態様では、組合せにおける使用のための抗CD3二重特異性抗体は、配列番号604のCDR-H1配列、配列番号605のCDR-H2配列及び配列番号606のCDR-H3配列を含む重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号607のCDR-L1配列、配列番号608のCDR-L2配列、及び配列番号609のCDR-L3配列を含む軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗CD3二重特異性は、配列番号610のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号611のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号610のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号611のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD3)を含む。
特定の一態様では、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号161の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、配列番号162の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、配列番号163の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、及び配列番号164の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号161のポリペプチド配列、配列番号162のポリペプチド配列、配列番号163のポリペプチド配列及び配列番号164のポリペプチド配列を含む(CEA CD3 TCB)。
別の特定の態様では、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号165の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、配列番号166の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、配列番号167の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、及び配列番号168の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号165のポリペプチド配列、配列番号166のポリペプチド配列、配列番号167のポリペプチド配列及び配列番号168のポリペプチド配列を含む(CEACAM5 CD3 TCB)。
特定の二重特異性抗体は、PCT出願国際公開第2014/131712号A1に更に記載されている。更なる態様では、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体はまた、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE(商標))を含み得る。更なる態様では、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体は、国際公開第2007/071426号又は国際公開第2014/131712号に記載される二重特異性抗体である。
別の態様では、B細胞表面抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメインを含む本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。一態様では、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、B細胞表面抗原に特異的であり、特に抗CD20/抗CD3二重特異性抗体である。
本明細書で使用される抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、CD3に結合する第1の抗原結合ドメインと、CD20に結合する第2の抗原結合ドメインとを含む、二重特異性抗体である。したがって、本明細書で使用される抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、重鎖可変領域(VHCD3)及び軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域(VHCD20)及び軽鎖可変領域(VLCD20)を含む第2の抗原結合ドメインとを含む。
特定の態様では、組合せにおける使用のための抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号439のCDR-H1配列、配列番号440のCDR-H2配列及び配列番号441のCDR-H3配列を含む重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号442のCDR-L1配列、配列番号443のCDR-L2配列、及び配列番号444のCDR-L3配列を含む軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗CD20/抗CD3二重特異性は、配列番号445のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号446のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である軽鎖可変領域(VLCD3)を含む第1の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号445のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD3)、及び/又は配列番号446のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD3)を含む。
一態様では、CD3に特異的に結合する抗体は完全長抗体である。一態様では、CD3に特異的に結合する抗体は、ヒトIgGクラスの抗体、特にヒトIgG1クラスの抗体である。一態様では、CD3に特異的に結合する抗体は、抗体断片、特にFab分子又はscFv分子、より具体的にはFab分子である。特定の態様では、CD3に特異的に結合する抗体は、Fab重鎖及びFab軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている(すなわち、互いに置き換えられる)クロスオーバーFab分子である。一態様では、CD3に特異的に結合する抗体はヒト化抗体である。
別の態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号447のCDR-H1配列、配列番号448のCDR-H2配列及び配列番号449のCDR-H3配列を含む重鎖可変領域(VHCD20)、及び/又は配列番号450のCDR-L1配列、配列番号451のCDR-L2配列、及び配列番号452のCDR-L3配列を含む軽鎖可変領域(VLCD20)を含む第2の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗CD20/抗CD3二重特異性は、配列番号453のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である重鎖可変領域(VHCD20)、及び/又は配列番号454のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である軽鎖可変領域(VLCD20)を含む第2の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性は、配列番号453のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD20)、及び/又は配列番号454のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD20)を含む、第2の抗原結合ドメインを含む。
別の特定の態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、CD20に結合する第3の抗原結合ドメインを含む。特に、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号447のCDR-H1配列、配列番号448のCDR-H2配列及び配列番号449のCDR-H3配列を含む重鎖可変領域(VHCD20)、及び/又は配列番号450のCDR-L1配列、配列番号451のCDR-L2配列、及び配列番号452のCDR-L3配列を含む軽鎖可変領域(VLCD20)を含む第3の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗CD20/抗CD3二重特異性は、配列番号453のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である重鎖可変領域(VHCD20)、及び/又は配列番号454のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一である軽鎖可変領域(VLCD20)を含む第3の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性は、配列番号453のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD20)、及び/又は配列番号454のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD20)を含む、第3の抗原結合ドメインを含む。
更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は二重特異性抗体であり、第1の抗原結合ドメインは、Fab重鎖及びFab軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されたクロスFab分子であり、第2及び第3の抗原結合ドメインは、存在する場合、従来のFab分子である。
別の態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は二重特異性抗体であり、(i)第2の抗原結合ドメインはFab重鎖のC末端において第1の抗原結合ドメインのFab重鎖のN末端に融合されており、第1の抗原結合ドメインはFab重鎖のC末端においてFcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合されており、第3の抗原結合ドメインはFab重鎖のC末端においてFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されており、又は(ii)第1の抗原結合ドメインはFab重鎖のC末端において第2の抗原結合ドメインのFab重鎖のN末端に融合されており、第2の抗原結合ドメインはFab重鎖のC末端でFcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合されており、第3の抗原結合ドメインはFab重鎖のC末端でFcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されている。
複数のFab分子はFcドメインに、又は互いに、直接、又は、典型的には約2~20個のアミノ酸を含む、1個以上のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーを介して、融合することができる。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であり、本明細書に説明される。一態様では、上記ペプチドリンカーは、(G4S)2(配列番号147)である。別の好適なそのようなリンカーは、配列(G4S)4(配列番号152)を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域(の一部)を含んでいてもよい。特に、Fab分子が、FcドメインサブユニットのN末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介し、更なるペプチドリンカーを伴い、又は伴わずに融合してもよい。更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、Fc受容体に対する結合及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含むFcドメインを含む。特に、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329Gを含むIgG1 Fcドメインを含む。
特定の態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号455の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、配列番号456の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、配列番号457の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、及び配列番号458の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号455のポリペプチド配列、配列番号456のポリペプチド配列、配列番号457のポリペプチド配列及び配列番号458のポリペプチド配列を含む(CD20 TCB)。
特定の二重特異性抗体は、PCT公開番号国際公開第2016/020309号A1又は国際公開第2015/095392号A1に記載されている。更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体はまた、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE(登録商標))を含み得る。更なる態様では、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体はXmAb(登録商標)13676である。別の態様では、二重特異性抗体はREGN1979である。別の態様では、二重特異性抗体はFBTA05(Lymphomun)である。
本発明の別の態様では、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、がんを処置するため又はがんの進行を遅延させるための方法において使用するためのものであり、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて使用され、更に、それらはPD-L1/PD-1相互作用を遮断する作用物質と組み合わせられる。PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、PD-L1結合アンタゴニスト又はPD-1結合アンタゴニストである。特に、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体である。
別の態様では、MM細胞表面抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメインを含む本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。一態様では、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、MM細胞表面抗原に特異的であり、特に抗GPRC5D/抗CD3二重特異性抗体である。
特定の一態様では、抗GPRC5D/抗CD3二重特異性抗体は、配列番号398の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、配列番号399の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、配列番号404の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチド、及び配列番号405の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一のポリペプチドを含む。更に特定の態様では、二重特異性抗体は、配列番号398のポリペプチド配列、配列番号399のポリペプチド配列、配列番号404のポリペプチド配列及び配列番号405のポリペプチド配列を含む(GPRC5D CD3 TCB)。
別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子と、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体とを含む組み合わせ製品が提供される。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なT細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体又は抗MCSP/抗CD3二重特異性抗体である。特定の一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なT細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、抗CEA/抗CD3二重特異性抗体である。別の態様では、腫瘍関連抗原に特異的なT細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体である。更なる態様では、腫瘍関連抗原に特異的なT細胞活性化抗CD3二重特異性抗体は、抗GPRC5D/抗CD3二重特異性抗体である。
PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤との組合せ
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤、例えばPD-L1結合アンタゴニスト又はPD-1結合アンタゴニスト、特に抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体と組み合わせて投与され得る。
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子は、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤、例えばPD-L1結合アンタゴニスト又はPD-1結合アンタゴニスト、特に抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体と組み合わせて投与され得る。
一態様では、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、抗PD-L1抗体である。CD274又はB7-H1としても知られている「PD-L1」という用語は、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)、並びに齧歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然PD-L1(特に、「ヒトPD-L1」)を意味する。完全ヒトPD-L1のアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)受託番号Q9NZQ7(配列番号459)に示されている。「PD-L1結合アンタゴニスト」という用語は、PD-L1とその結合パートナーのうちのいずれか1つ以上、例えば、PD-1、B7-1との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する分子を指す。いくつかの態様では、PD-L1結合拮抗剤は、PD-L1の結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、PD-L1結合アンタゴニストは、PD-L1のPD-1及び/又はB7-1への結合を阻害する。いくつかの態様では、PD-L1結合拮抗剤は、抗PD-L1抗体、その抗原結合断片、免疫アデシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びPD-L1とPD-1、B7-1などの1つ以上の結合パートナーとの相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、侵害、又は妨害する他の分子を含む。一態様では、PD-L1結合拮抗剤は、機能不全T細胞をより機能不全に陥らないように(例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強するように)するために、PD-L1を介してシグナル伝達を媒介するTリンパ球上に発現された細胞表面タンパク質によって媒介される、又はそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを減少させる。特に、PD-L1結合拮抗剤は、抗PD-L1抗体である。「抗PD-L1抗体」、又は「ヒトPD-L1に結合する抗体」、又は「ヒトPD-L1に特異的に結合する抗体」、又は「アゴニスト抗PD-L1」という用語は、1.0×10-8mol/l以下のKD値、一態様ではは、1.0×10-9mol/l以下のKD値の結合親和性で、ヒトPD-L1抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術(BIAcore(登録商標),GE-Healthcare Uppsala,Sweden)などの標準的な結合アッセイを用いて測定される。特定の態様では、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、抗PD-L1抗体である。具体的な態様では、抗PD-L1抗体は、アテゾリズマブ(MPDL3280A、RG7446)、デュルバルマブ(MEDI4736)、アベルマブ(MSB0010718C)及びMDX-1105からなる群から選択される。具体的な態様では、抗PD-L1抗体は、本明細書に記載のYW243.55.S70である。別の具体的な態様では、抗PD-L1抗体は、本明細書に記載のMDX-1105である。更に別の具体的な態様では、抗PD-L1抗体は、MEDI4736(デュルバルマブ)である。なお更なる態様では、抗PD-L1抗体は、MSB0010718C(アベルマブ)である。より詳しくは、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブ(MPDL3280A)である。別の態様では、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、配列番号460の重鎖可変ドメインVH(PDL-1)及び配列番号461の軽鎖可変ドメインVL(PDL-1)を含む抗PD-L1抗体である。、、別の態様では、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、配列番号462の重鎖可変ドメインVH(PDL-1)及び配列番号463の軽鎖可変ドメインVL(PDL-1)を含む抗PD-L1抗体である。
CD279、PD1又はプログラム細胞死タンパク質1としても知られる「PD-1」という用語は、霊長類(例えばヒト)、非ヒト霊長類(例えばカニクイザル)及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然PD-L1、特にUniProt(www.uniprot.org)受託番号Q15116(配列番号464)に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質PD-1を指す。「PD-1結合アンタゴニスト」という用語は、PD-1のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施形態では、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1のPD-L1への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1のPD-L2への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1のPD-L1及びPD-L2の両方への結合を阻害する。特に、PD-L1結合拮抗剤は、抗PD-L1抗体である。「抗PD-1抗体」、又は「ヒトPD-1に結合する抗体」、又は「ヒトPD-1に特異的に結合する抗体」、又は「アゴニスト抗PD-1」という用語は、1.0×10-8mol/l以下のKD値、一態様では、1.0×10-9mol/l以下のKD値の結合親和性で、ヒトPD1抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術(BIAcore(登録商標),GE-Healthcare Uppsala,Sweden)などの標準的な結合アッセイを用いて測定される。一態様では、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、抗PD-1抗体である。具体的な態様では、抗PD-1抗体は、MDX1106(ニボルマブ)、MK-3475(ペンブロリズマブ)、CT-011(ピディリズマブ)、MEDI-0680(AMP-514)、PDR001、REGN2810、及びBGB-108からなる群から、特にペンブロリズマブ及びニボルマブから選択される。別の態様では、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、配列番号465の重鎖可変ドメインVH(PD-1)及び配列番号466の軽鎖可変ドメインVL(PD-1)を含む抗PD-1抗体である。別の態様では、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤は、配列番号467の重鎖可変ドメインVH(PD-1)及び配列番号468の軽鎖可変ドメインVL(PD-1)を含む抗PD-1抗体である。
別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子と、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤、例えばPD-L1結合アンタゴニスト又はPD-1結合アンタゴニスト、特に抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体とを含む組み合わせ製品が提供される。
上述したそのような併用療法は、併用投与(ここでは、2つ以上の治療剤が同一又は別個の製剤中に含まれる)及び別個の投与を包含し、この場合、治療剤の投与は、追加の治療剤又は薬剤の投与に先立って、同時に、及び/又はそれに続いて、行われ得る。一実施形態では、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに約1か月以内、又は約1、2、3週間以内、又は約1、2、3、4、5、若しくは6日以内に発生する。
製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防、及び/又は診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル若しくはパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液バッグなどが挙げられる。容器を、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から作ることができる。容器は、組成物をそれ自身で、又は症状を処置し、予防し、及び/又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい(例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1種の活性剤は、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を処置するために使用されることを示す。更に、製造物品は、(a)製造物品中に含有され、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を含む組成物を含む第1の容器、及び(b)製造物品中に含有され、更なる細胞毒性又は別の治療剤を含む組成物を含む第2の容器を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が特定の症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、又は加えて、製造物品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第2の(又は第3の)容器を更に備えていてもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防、及び/又は診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル若しくはパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液バッグなどが挙げられる。容器を、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から作ることができる。容器は、組成物をそれ自身で、又は症状を処置し、予防し、及び/又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい(例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1種の活性剤は、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を処置するために使用されることを示す。更に、製造物品は、(a)製造物品中に含有され、本発明の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を含む組成物を含む第1の容器、及び(b)製造物品中に含有され、更なる細胞毒性又は別の治療剤を含む組成物を含む第2の容器を含んでよい。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が特定の症状を処置するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、又は加えて、製造物品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液及びデキストロース溶液を含む第2の(又は第3の)容器を更に備えていてもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991)に提供されている。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなKabat(Kabat,E.A.,et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th ed.、Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))によるナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、参照される。
以下のナンバリングされた項は、本発明の態様を記載する。
1.CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
2.FcドメインがIgG、特にIgG1 Fcドメイン又はIgG4 Fcドメインである、項1に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
3.FcドメインがヒトIgG1サブクラスのものであり、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)を含む、項1又は2に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
4.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号20の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、項1~3のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(i)配列番号20の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、項1~3のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
5.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号20のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23のCDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む、項1~4のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
6.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、項1~5のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
7.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50及び配列番号51からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号27、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60及び配列番号60からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む、項1~4のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
8.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、項1~4又は7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、項1~4又は7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
9.腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原(CEA)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、項1~8のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
10.CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、(iv)配列番号130のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号131のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号132のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)とを含む、項1~9のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
11.CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号133のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号134のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む、項1~10のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
12.腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、項1~8のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
13.FAPに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)と、
を含む、項1~8又は12のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(a)(i)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)と、
を含む、項1~8又は12のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
14.FAPに特異的に結合することができる抗原結合ドメインが、
(a)配列番号18のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号19のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)配列番号10のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号11のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、
を含む、項1~8又は12又は13のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(a)配列番号18のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号19のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)配列番号10のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号11のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、
を含む、項1~8又は12又は13のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
15.FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)を含む、項1~8又は12から14のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
16.CD28への特異的結合が可能な抗原結合ドメインがFab断片又はクロスFab断片である、項1~15のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
17.(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、項1~16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、項1~16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
18.(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、項1~16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、項1~16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
19.(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、項1~16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、項1~16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
20.(a)CD28に特異的に結合可能なFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能なFab断片が、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第1のFcドメインサブユニットのC末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第2のFcドメインサブユニットのC末端に融合される、項1~16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能なFab断片が、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの一方が、ペプチドリンカーを介して第1のFcドメインサブユニットのC末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なVHドメイン及びVLドメインの他方が、ペプチドリンカーを介して第2のFcドメインサブユニットのC末端に融合される、項1~16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
21.項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子をコードする、ポリヌクレオチド。
22.項21に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
23.項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の製造方法であって、二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下にて、請求項22に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
24.項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、及び少なくとも1種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
25.がんの処置に使用するための、項24に記載の薬学的組成物。
26.医薬として使用するための、項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は項24に記載の薬学的組成物。
27.がんの処置に使用するための、項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は項24に記載の薬学的組成物。
28.二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、化学療法剤、放射線療法、及び/又はがん免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて投与される、がんの処置に使用するための、項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
29.がんの処置に使用するための医薬の製造における、項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は項24に記載の薬学的組成物の使用。
30.個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該個体に、有効量の、項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は項24に記載の薬学的組成物を投与し、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
31.個体に、治療有効量の、項1~20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は項24に記載の薬学的組成物を投与することを含む、がんの処置方法。
32.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、Fc受容体及び/又はエフェクター機能に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインとを含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
33.CD28への一価結合を特徴とする、項32の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
34.B細胞表面抗原への一価結合を更に特徴とする、項32の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
35.前記FcドメインがヒトIgG1サブクラスのものであり、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)を含む、項32~34のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
36.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号20の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、項32~35のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(i)配列番号20の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(ii)配列番号36のCDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39のCDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、項32~35のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
37.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号20のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23のCDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む、項32~36のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
38.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、項32~37のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
39.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50及び配列番号51からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号27、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60及び配列番号61からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)とを含む、項32~36のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
40.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、項32~36又は39のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、
を含む、項32~36又は39のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
41.CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は配列番号16のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、項32~36又は39又は40のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、
42.B細胞表面抗原が、CD19、CD79b、CD20、CD22及びCD37からなる群から選択される、項32~41のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
43.B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、項32~42のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
44.CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号406のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号407のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号408のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号409のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号410のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号411のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(b)(i)配列番号414のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号415のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号416のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号417のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号418のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号419のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)と、
を含む、項32~43のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(a)(i)配列番号406のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号407のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号408のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号409のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号410のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号411のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(b)(i)配列番号414のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号415のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号416のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号417のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号418のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号419のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)と、
を含む、項32~43のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
45.CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号412のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(b)配列番号420のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、
を含む、項32~44のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(a)配列番号412のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(b)配列番号420のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、
を含む、項32~44のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
46.CD19に特異的に結合能可能な抗原結合ドメインが、配列番号412のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)を含む、項32~45のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
47.B細胞表面抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、項32~43のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
48.CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号422のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号423のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号424のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD79b)と、(iv)配列番号425のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号426のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号427のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)とを含む、項32~43又は47のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
49.CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号428のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列に少なくとも約95%、98%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)を含む、項32~43又は47又は48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
50.(a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、項32~49のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、項32~49のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
51.(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、項32~49のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、項32~49のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
52.(a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、項32~49のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
(b)B細胞表面抗原に特異的に結合可能な第2及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、項32~49のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
53.項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、及び少なくとも1種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物。
54.項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子をコードする、ポリヌクレオチド。
55.項54に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
56.項55に記載のベクター又は項54に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
57.項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の製造方法であって、二重特異性抗原結合分子の発現に好適な条件下にて、項25に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
58.医薬として使用するための、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は項53に記載の薬学的組成物。
59.がんの処置に使用するための、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は項53に記載の薬学的組成物。
60.二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、化学療法剤、放射線療法、及び/又はがん免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置に使用するための、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
60.二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置に使用するための、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
61.二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、抗CD20/抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置に使用するための、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
62.二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、PD-L1/PD-1相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置に使用するための、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
63.がんの処置に使用するための医薬の製造における、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は項53に記載の薬学的組成物の使用。
64.個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該個体に、有効量の、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は項53に記載の薬学的組成物を投与し、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
65.個体に、治療有効量の、項32~52のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は項53に記載の薬学的組成物を投与することを含む、がんの処置方法。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
組換えDNA技術
Sambrook et al.,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されるように、標準的な方法を使用してDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる:Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242に示されている。
Sambrook et al.,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されるように、標準的な方法を使用してDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる:Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242に示されている。
DNA配列決定
DNA配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
DNA配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子の合成
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してPCRにより生成したか、又はGeneart AG(レーゲンスブルク、ドイツ)又はGenscript(ニュージャージー州、米国)で合成オリゴヌクレオチドとPCR産物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング/配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、濃度をUV分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする5’末端DNA配列を用いて設計した。
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してPCRにより生成したか、又はGeneart AG(レーゲンスブルク、ドイツ)又はGenscript(ニュージャージー州、米国)で合成オリゴヌクレオチドとPCR産物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング/配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、濃度をUV分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする5’末端DNA配列を用いて設計した。
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術は、Current Protocols in Cell Biology(2000)、Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott-Schwartz,J.及びYamada,K.M.(編集)、John Wiley&Sons,Inc.に記載されているように使用した。
標準的な細胞培養技術は、Current Protocols in Cell Biology(2000)、Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott-Schwartz,J.及びYamada,K.M.(編集)、John Wiley&Sons,Inc.に記載されているように使用した。
タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Protein A Sepharoseカラム(GE healthcare)に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶離は、pH 2.8で達成され、その後、試料を即時中和した。凝集したタンパク質は、PBS中での、又は20mM ヒスチジン、150mM NaCl(pH 6.0)中でのサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体フラクションをプールし、例えば、MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)遠心分離濃縮器を用いて濃縮し(必要な場合)、凍結させ、-20℃又は-80℃で保存した。試料の一部を、例えば、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために提供した。
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Protein A Sepharoseカラム(GE healthcare)に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶離は、pH 2.8で達成され、その後、試料を即時中和した。凝集したタンパク質は、PBS中での、又は20mM ヒスチジン、150mM NaCl(pH 6.0)中でのサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200、GE Healthcare)によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体フラクションをプールし、例えば、MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)遠心分離濃縮器を用いて濃縮し(必要な場合)、凍結させ、-20℃又は-80℃で保存した。試料の一部を、例えば、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために提供した。
SDS-PAGE
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造元の説明書により使用した。特に、10%又は4~12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH 6.4)、及びNuPAGE(登録商標)MES(還元型ゲル、NuPAGE(登録商標)酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加)又はMOPS(非還元型ゲル)ランニングバッファーを使用した。
NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen)を、製造元の説明書により使用した。特に、10%又は4~12%のNuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)Bis-TRIS Pre-Castゲル(pH 6.4)、及びNuPAGE(登録商標)MES(還元型ゲル、NuPAGE(登録商標)酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加)又はMOPS(非還元型ゲル)ランニングバッファーを使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、HPLCクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインA精製抗体を、Agilent HPLC 1100システムの300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7.5)におけるTosoh TSKgel G3000SWカラムに、又はDionex HPLC-Systemの2×PBSにおけるSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に適用した。溶離したタンパク質をUV吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準物質として供した。
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、HPLCクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインA精製抗体を、Agilent HPLC 1100システムの300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7.5)におけるTosoh TSKgel G3000SWカラムに、又はDionex HPLC-Systemの2×PBSにおけるSuperdex 200カラム(GE Healthcare)に適用した。溶離したタンパク質をUV吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準物質として供した。
質量分析法
この章は、その正しいアセンブリに重点をおいて、VH/VL置き換え(VH/VL CrossMab)を有する多重特異性抗体の特性決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなCrossMab及び脱グリコシル化した/消化したプラスミン、又は脱グリコシル化した/制限されたLysC消化したCrossMabのエレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)によって分析した。
この章は、その正しいアセンブリに重点をおいて、VH/VL置き換え(VH/VL CrossMab)を有する多重特異性抗体の特性決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなCrossMab及び脱グリコシル化した/消化したプラスミン、又は脱グリコシル化した/制限されたLysC消化したCrossMabのエレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)によって分析した。
VH/VL CrossMabsを、リン酸バッファー又はTrisバッファー中、タンパク質濃度1mg/mlで、37℃で17時間までの時間、N-グリコシダーゼFを用いて脱グリコシル化した。プラスミン又は制限されたLysC(Roche)消化を、100μgの脱グリコシル化したVH/VL CrossMabを用い、Tris緩衝液(pH 8)中、それぞれ、室温で120時間、また、37℃で40分間行った。質量分析の前に、試料を、Sephadex G25カラム(GE Healthcare)でのHPLCによって脱塩した。合計質量は、TriVersa NanoMate source(Advion)が取り付けられたmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム(Bruker Daltonik)でのESI-MSによって決定された。
表面プラズモン共鳴(SPR)(BIACORE)を用い、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合アフィニティーの決定。
それぞれの抗原に対する、生成した抗体の結合は、BIACORE装置(GE Healthcare Biosciences AB、ウプサラ、スウェーデン)を用い、表面プラズモン共鳴によって観察された。簡潔には、親和性測定のために、ヤギ抗ヒトIgG、JIR 109-005-098抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにアミンカップリングを介してCM5チップ上に固定化する。結合を、HBS緩衝液(HBS-P(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005%Tween20、ph7.4)、25℃(又は代替的に37℃)中で測定する。抗原(R&D Systems又は社内精製)を溶液中に様々な濃度で添加した。80秒~3分の抗原注入により会合を測定し、チップ表面をHBS緩衝液で3~10分間洗浄して解離を測定し、1:1ラングミュア結合モデルを用いてKD値を推定した。システム固有のベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル低減のために、試料曲線から陰性対照データ(例えば、緩衝曲線)を差し引く。それぞれのBiacore Evaluation Softwareを、センサーグラムの分析及びアフィニティーデータの計算に使用する。
それぞれの抗原に対する、生成した抗体の結合は、BIACORE装置(GE Healthcare Biosciences AB、ウプサラ、スウェーデン)を用い、表面プラズモン共鳴によって観察された。簡潔には、親和性測定のために、ヤギ抗ヒトIgG、JIR 109-005-098抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにアミンカップリングを介してCM5チップ上に固定化する。結合を、HBS緩衝液(HBS-P(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005%Tween20、ph7.4)、25℃(又は代替的に37℃)中で測定する。抗原(R&D Systems又は社内精製)を溶液中に様々な濃度で添加した。80秒~3分の抗原注入により会合を測定し、チップ表面をHBS緩衝液で3~10分間洗浄して解離を測定し、1:1ラングミュア結合モデルを用いてKD値を推定した。システム固有のベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル低減のために、試料曲線から陰性対照データ(例えば、緩衝曲線)を差し引く。それぞれのBiacore Evaluation Softwareを、センサーグラムの分析及びアフィニティーデータの計算に使用する。
実施例1
CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成及び産生
1.1 CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
抗原のクローニング:
ヒトCD28(Uniprot:P10747)の細胞外ドメイン(成熟タンパク質のアミノ酸1から134)をコードするDNA断片を、溶解性及び精製タグとしての役割を果たすhum IgG1 Fc断片をコードする断片の上流の2つの異なる哺乳動物レシピエントベクターにインフレームで挿入した。発現ベクターの1つはFc領域に「ホール」変異を含み、もう1つは「ノブ」変異、並びにBir Aビオチンリガーゼとの同時発現中に特異的ビオチン化を可能にするC末端aviタグ(GLNDIFEAQKIEWHE、配列番号387)を含んでいた。また、両Fc断片はPG-LALA変異を含んでいた。Fcノブ鎖のC末端に一価ビオチン化アビタグを有する二量体CD28-Fcコンストラクトを得るために、両方のベクターを、BirAビオチンリガーゼをコードするプラスミドと組み合わせて同時トランスフェクトした。
CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成及び産生
1.1 CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
抗原のクローニング:
ヒトCD28(Uniprot:P10747)の細胞外ドメイン(成熟タンパク質のアミノ酸1から134)をコードするDNA断片を、溶解性及び精製タグとしての役割を果たすhum IgG1 Fc断片をコードする断片の上流の2つの異なる哺乳動物レシピエントベクターにインフレームで挿入した。発現ベクターの1つはFc領域に「ホール」変異を含み、もう1つは「ノブ」変異、並びにBir Aビオチンリガーゼとの同時発現中に特異的ビオチン化を可能にするC末端aviタグ(GLNDIFEAQKIEWHE、配列番号387)を含んでいた。また、両Fc断片はPG-LALA変異を含んでいた。Fcノブ鎖のC末端に一価ビオチン化アビタグを有する二量体CD28-Fcコンストラクトを得るために、両方のベクターを、BirAビオチンリガーゼをコードするプラスミドと組み合わせて同時トランスフェクトした。
FAPクローン4B9、CEA結合因子並びにCD28クローンSA及びmAb 9.3の可変ドメインを、種々の腫瘍標的化CD28コンストラクトの作製のために使用した。FAPクローン4B9の生成及び調製は、国際公開第2012/020006号A2に開示されており、参照により本明細書に組み込まれている。分子に使用されるCEAクローンは国際公開第2007/071422号に記載されており、配列番号26のアミノ酸配列を含むVH及び配列番号27のアミノ酸配列を含むVLを有するCD28スーパーアゴニスト抗体(SA)は国際公開第2006/050949号に記載されている。抗体mAb 9.3の説明は、Tan et al..J.Immunology 2002,169,1119-1125に見出すことができる。それぞれの発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。得られた分子の概略説明を図1A~図1Mに示す。示される場合、Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。非対称二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するために「ノブ」又は「ホール」突然変異のいずれかを含有した。二重及び多重特異性抗体コンストラクトにおける軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図1A~図1Mに示す:
分子A:CD28(SA)(hu IgG4)、TGN1412、ヒトIgG4アイソタイプにおけるCD28(SA)抗体(図1A)は、配列番号62及び配列番号63(P1AE1975)のアミノ酸配列を含む。
分子B:CD28(SA)(PG-LALA)、huIgG1 PG-LALAアイソタイプにおけるCD28(SA)抗体(図1B)は、配列番号62及び配列番号64(P1AD9289)のアミノ酸配列を含む。
分子C:FAP(4B9)-CD28(SA)1+1フォーマット、配列番号65、66、67及び68(P1AD4492)のアミノ酸配列を含む、CD28(SA)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びFAP(4B9)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図1C)。
分子D:FAP(4B9)-CD28(SA)1+4フォーマット、二重特異性四価抗CD28(SA)及び一価抗FAP huIgG1 PG-LALAコンストラクト。FAPクローン4B9のVHドメイン及びVLドメインを、Fcドメインのそれぞれの鎖のC末端に融合した(VH:ノブ鎖、VLホール鎖)(図1F)。分子は、配列番号62、69及び70(P1AD9018)のアミノ酸配列を含む。
分子E:FAP(4B9)-CD28(SA)1+2フォーマット、二重特異性二価抗CD28(SA)及び一価抗FAP huIgG1 PG-LALAコンストラクト。FAPクローン4B9のVHドメイン及びVLドメインを、Fcドメインのそれぞれの鎖のC末端に融合した(VH:ノブ鎖、VL:ホール鎖)(図1D)。分子は、配列番号62、71及び72(P1AD9011)のアミノ酸配列を含む。
分子F:FAP(4B9)-CD28(SA)2+2、二重特異性の二価の抗CD28(SA)及び二価の抗FAP huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、抗CD28 Fab断片中の荷電修飾、Fc断片のC末端へのCH1/Cカッパ交換を伴う抗FAP クロスFab断片のVH融合(図1E)。分子は、配列番号65、73及び74(P1AD4493)のアミノ酸配列 を含む。
分子G:FAP(4B9)-CD28(SA)2+1、二重特異性一価抗CD28(SA)及び二価抗FAP huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、「古典的配向」、抗CD28クロスFab断片中のVH/VL交換、抗FAP Fab断片中の荷電修飾(図1L)。分子は、配列番号75、76、77、及び78(P1AD5231)のアミノ酸配列を含む。
分子H:FAP(4B9)-CD28(SA)C-01、1+1二重特異性一価抗CD28(SA)及び一価抗FAP huIgG1 PG-LALA クロスFab分子、「ヘッドトゥーテイル」、抗CD28 クロスFab断片中のVH/VL交換、抗FAP結合因子中の荷電修飾(図1M)。分子は、配列番号75、77、78及び79(P1AE2021)のアミノ酸配列を含む。
分子I:FAP(4B9)-CD28(SA)C-04、1+1二重特異性二価抗CD28(SA)及び一価抗FAP huIgG1 PG-LALAコンストラクト。FAP結合因子4B9のVHドメイン及びVLドメインを、Fc断片(VH:ノブ鎖、VL:ホール鎖)のそれぞれの鎖のC末端に融合した(図1K)。分子は、配列番号62、72及び80(P1AE2236)のアミノ酸配列を含む。
分子J:CEA-CD28(SA)2+2、二重特異性の二価の抗CD28(SA)及び二価の抗CEA huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、抗CD28 Fab断片中の荷電修飾、Fc断片のC末端へのCH1/Cカッパ交換を伴う抗CEA クロスFab断片のVH融合(図1H).。分子は、配列番号65、81及び82(P1AE1195)のアミノ酸配列を含む。
分子K:CEA-CD28(SA)1+2、二重特異性二価抗CD28(SA)及び一価抗CEA huIgG1 PG-LALAコンストラクト。CEA結合因子のVHドメイン及びVLドメインをFc断片のそれぞれの鎖のC末端に融合した(VH:ノブ鎖、VL:ホール鎖)(図1G)。分子は、配列番号62、83及び84(P1AE1194)のアミノ酸配列を含む。
分子L:一価IgG CD28(SA)、一価抗CD28(SA)huIgG1 PG-LALAコンストラクトであって、CD28重鎖は、Fc(ノブ)断片と組み合わせて「ホール」Fc鎖として発現される(図1I)。分子は、配列番号65、85及び86(P1AD8944)のアミノ酸配列を含む。
分子M:CEA-CD28(SA)1+1フォーマット、配列番号65、66、87及び88のアミノ酸配列を含む、CD28(SA)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA クロスFab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALAクロスFab分子(P1AE3127)(図1J)。
分子N:mab 9.3(PG-LALA)、ヒトIgG1 PG-LALAアイソタイプ中のmAb9.3クローン(図1Bのとおり)。分子は、配列番号89及び90(P1AD5142)の アミノ酸配列を含む。
分子O:FAP(4B9)-CD28(mAb9.3)C-03、mAb9.3 Fab断片(ノブ)における荷電修飾及び抗FAP断片(ホール)におけるVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト(図1Cのとおり)。分子は、配列番号67、68、91及び92(P1AE2238)のアミノ酸配列を含む。
分子P:FAP(4B9)-CD28(mAb9.3)1+4、二重特異性四価抗CD28 mAb9.3及び抗FAP huIgG1 PG-LALAコンストラクト。FAP結合因子のVHドメイン及びVLドメインは、Fc断片のそれぞれの鎖のC末端に融合される(VH:ノブ鎖、VL:ホール鎖)(図1Fのとおり)。分子は、配列番号89、93及び94(P1AD8969)のアミノ酸配列を含む。
分子Q:FAP(4B9)-CD28(mAb9.3)1+2、二重特異性二価抗CD28 mAb9.3及び一価抗FAP huIgG1 PG-LALA コンストラクト。FAP結合因子のVHドメイン及びVLドメインは、Fc断片のそれぞれの鎖のC末端に融合された(VH:ノブ鎖、VL:ホール鎖)(図1Dのとおり)。分子は、配列番号89、95及び96(P1AD8962)のアミノ酸配列を含む。
分子R:FAP(4B9)-CD28(mAb9.3)2+2、二重特異性の二価の抗CD28 mAb9.3及び二価の抗FAP huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、抗mAb9.3FAP断片中の荷電修飾、Fc断片のC末端へのCH1/Cカッパ クロスFab交換を伴う抗FAP Fab断片のVH融合(図1Eのとおり).。分子は、配列番号97、98及び99(P1AD8968)のアミノ酸配列を含む。
分子S:FAP(4B9)-CD28(mAb9.3)2+1、二重特異性一価抗CD28(mAb9.3)及び二価抗FAP huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、「古典的配向」、抗CD28(mAb9.3)クロスFab断片中のVH/VL交換、抗FAP Fab断片中の荷電修飾(図1Lのとおり)。分子は、配列番号76、77、100及び101(P1AD5560)の アミノ酸配列を含む。
分子T:FAP(4B9)-CD28(mAb9.3)C-02、二重特異性一価抗CD28(mAb9.3)及び一価抗FAP huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、「ヘッドトゥーテイル」、抗CD28(mAb9.3)クロスFab断片中のVH/VL交換、抗FAP断片中の荷電修飾(図1Mのとおり)。分子は、配列番号78、79、100及び101(P1AE2022)のアミノ酸配列を含む。
分子U:FAP(4B9)-CD28(mAb9.3)C-05、二重特異性一価抗CD28(mAb9.3)及び一価抗FAP huIgG1 PG-LALA コンストラクト。FAP結合因子4B9のVHドメイン及びVLドメインを、Fc断片(VH:Fcノブ鎖、VL:Fcホール鎖)のそれぞれの鎖のC末端に融合した(図1Kのとおり)。分子は、配列番号80、89及び96(P1AE2237)のアミノ酸配列を含む。
分子V:CEA-CD28(mAb9.3)2+2、二重特異性の二価の抗CD28(mAb9.3)及び二価の抗CEA huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、抗mAb9.3Fab断片中の荷電修飾、Fc断片のC末端へのCH1/Cカッパ交換を伴う抗CEA クロスFab断片のVH融合(図1Hのとおり)。分子は、配列番号82、89及び102(P1AE1193)の アミノ酸配列を含む。
分子W:CEA-CD28(mAb9.3)1+2、二重特異性二価抗CD28(mAb9.3)及び一価抗CEA huIgG1 PG-LALAコンストラクト。CEA結合因子のVHドメイン及びVLドメインをFc断片のそれぞれの鎖のC末端に融合した(VH:ノブ鎖、VL:ホール鎖)(図1Gのとおり)。分子は、配列番号89、103及び104(P1AE1192)のアミノ酸配列を含む。
分子X:一価IgG CD28(mAb9.3)、CD28重鎖は、Fc(ノブ)断片と組み合わせて「ホール」Fc鎖として発現される(図1Iのとおり)。分子は、配列番号86、105及び106((P1AD8938)のアミノ酸配列を含む。
更に、三重特異性分子を調製した:
分子Y、FAP(4B9)-CD28(TGN1412)-CEA 1+1+1、三重特異性一価抗CD28(TGN1412)、一価抗FAP及び一価抗CEA huIgG1 PG-LALAクロスFabコンストラクト、抗CEA クロスFab断片(ホール)中のVH/VL交換、抗FAP Fab断片(ノブ)及び抗CD28断片(ノブ)中の荷電修飾(図1Nのとおり)。分子は、配列番号87、88、388及び389(P1AE4064)のアミノ酸配列を含む。
1.2 CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子の産生
上記の分子の発現は、キメラMPSVプロモーター又はCMVプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
上記の分子の発現は、キメラMPSVプロモーター又はCMVプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
コンストラクトC~Wの産生のために、懸濁状態で成長するHEK293-EBNA細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを使用してそれぞれの発現ベクターで同時トランスフェクトした。HEK293 EBNA細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたCD CHO培地と交換した。CD CHO培地中で発現ベクターを混合し、PEIを添加し、溶液をボルテックスして室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合して、振蕩フラスコに移し、5%CO2雰囲気のインキュベータ内で、3時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むExcell培地を添加した(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing、編者:Weichang Zhou,Anne Kantardjieff)。トランスフェクションの1日後、サプリメント(フィード)を添加した(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing、編者:Weichang Zhou,Anne Kantardjieff)。細胞上清を遠心分離及びその後、フィルタにかけ(0.2μmフィルタ)によって7日後に回収し、標準的な方法によって精製した。
従来の(非PCRベースの)クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、(元は、ATCCより受託し、Evitriaにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した)懸濁適応性CHO K1細胞を用い、Evitriaにより、コンストラクトA、B及びXを調製した。産生のために、Evitriaは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地(eviGrow及びeviMake2)、並びに、専有のトランスフェクション試薬(eviFect)を用いた。遠心分離、及びその後の濾過(0.2μmフィルタ)により上清を回収し、標準的な方法により精製した。
1.3 CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
1.4 CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗体又は三重特異性抗体の分析データ
精製されたコンストラクトのタンパク質濃度は、Pace、et al、Protein Science、1995、4、2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づいて計算される質量吸光係数を用い、280nmでの光学密度(OD)を測定することによって決定された。LabChipGXII(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表1に示す。
精製されたコンストラクトのタンパク質濃度は、Pace、et al、Protein Science、1995、4、2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づいて計算される質量吸光係数を用い、280nmでの光学密度(OD)を測定することによって決定された。LabChipGXII(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表1に示す。
実施例2
CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子の二重特異性抗体の結合及び動態解析
2.1 FAP発現細胞又はCEA発現細胞及びCD28発現細胞に対する、CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を標的とする二重特異性抗体の結合
二重特異性FAP-CD28分子の結合を、3T3-huFAP細胞(クローン19)を発現するヒト線維芽細胞活性化タンパク質(huFAP)を使用して試験した。この細胞株を、1.5μg/mLのピューロマイシン選択のもとでhuFAPを発現するための発現ベクターpETR4921によるマウス胚性線維芽細胞NIH/3T3細胞株(ATCC CRL-1658)のトランスフェクションによって作製した。ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。CEA発現MKN45細胞(胃がん細胞株、DSMZ#ACC 409)を用いて、ヒトCEACAM5への結合を試験した。
CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子の二重特異性抗体の結合及び動態解析
2.1 FAP発現細胞又はCEA発現細胞及びCD28発現細胞に対する、CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を標的とする二重特異性抗体の結合
二重特異性FAP-CD28分子の結合を、3T3-huFAP細胞(クローン19)を発現するヒト線維芽細胞活性化タンパク質(huFAP)を使用して試験した。この細胞株を、1.5μg/mLのピューロマイシン選択のもとでhuFAPを発現するための発現ベクターpETR4921によるマウス胚性線維芽細胞NIH/3T3細胞株(ATCC CRL-1658)のトランスフェクションによって作製した。ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。CEA発現MKN45細胞(胃がん細胞株、DSMZ#ACC 409)を用いて、ヒトCEACAM5への結合を試験した。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、FACS緩衝液(eBioscience、カタログ番号00-4222-26)に2.5E5/mlで再懸濁した。5×104個の細胞を、漸増濃度のFAP標的化CD28コンストラクト(1pM~100nM)と共に4℃で2時間、丸底96ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で3回洗浄し、PE抱合体化ヤギ抗ヒトPE(Jackson ImmunoReserach、カタログ番号109-116-098)と共に4℃で更に60分間インキュベートし、冷FACS緩衝液で1回洗浄し、遠心分離し、100μlのFACS緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗DP47 IgGを陰性対照として含めた。結合を、FACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism6を用いて結合曲線を得た。
FAP-CD28分子は、濃度依存的様式で細胞上のヒトFAPとヒトCD28の両方に結合することができた(所定の実施例については図2B及び図2C)。予想されたように、抗DP47 IgGでは結合が検出されず、このことは、結合の検出が、それぞれの標的化部分による特異的なCD28結合及びFAP結合に起因することを示している。
CEA-CD28分子はまた、細胞上のヒトCEA及びヒトCD28の両方に結合することができた。
2.2 CD28及びCEAを標的とする二重特異性抗体又は三重特異性抗体の速度論的分析
抗CEA(Medi-565)及び抗CD28を含む二重特異性又は三重特異性抗体の両方の結合部分の親和性(KD)を、ビオチン化huCD28-Fc抗原及びニュートラアビジン捕捉によってNLCチップ上に固定化されたビオチン化Hu N(A2-B2)A-avi-Hisを用いてProteOn XPR36装置(Biorad)を使用して25℃でSPRによって測定した。
抗CEA(Medi-565)及び抗CD28を含む二重特異性又は三重特異性抗体の両方の結合部分の親和性(KD)を、ビオチン化huCD28-Fc抗原及びニュートラアビジン捕捉によってNLCチップ上に固定化されたビオチン化Hu N(A2-B2)A-avi-Hisを用いてProteOn XPR36装置(Biorad)を使用して25℃でSPRによって測定した。
CEAのエピトープ(Medi-565)を含むCEACAM5ベースの抗原を生成するために、2つのCEACAM1及び2つのCEACAM5 Igドメインからなるキメラタンパク質を生成した。CEACAM1の配列に基づいて、CEACAM1の第2及び第3のドメインをCEACAM5ドメインA2及びB2で置き換えた。C末端のaviタグ及びHisタグを部位特異的ビオチン化及び精製のために融合した。得られたタンパク質をHu N(A2-B2)A-avi-His(配列番号169)と命名した。
組換え抗原(リガンド)の固定:抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウム pH 7.4、0.005%Tween20)で10μg/mlに希釈し、次いでさまざまな接触時間で30μl/分で注入して、垂直方向で約400、800及び1600の応答単位(RU)の固定化レベルを達成した。分析物の注入:ワンショット速度論測定のため、注入方向を水平方向に変え、精製された二重特異性CEA標的化抗CD28二重特異性抗体の二倍希釈系列(50~3.125nMの様々な濃度範囲)を、150秒の会合時間及び450秒の解離時間で、別々のチャネル1~5に沿って50μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)を、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)を、koff/konの比として計算した。1つの抗CD28抗原結合ドメイン及び1つの抗CEA抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体(分子M)の計算されたKD値は、それぞれの単一特異性コンストラクトの測定値と一致する。動力学的及び熱力学的データを下表2に要約する。
実施例3
ホットスポットを欠き、親和性が低下したCD28(SA)変異体の作製及び特性評価
3.1 不対システイン残基、トリプトファン残基、脱アミド部位の除去及び親和性低下CD28(SA)変異体の生成
発明者らの詳細な結合因子の特性評価の一部として、CD28(SA)可変ドメイン配列の計算分析を行った。この分析により、VHのCDR2領域の不対システイン(位置50、Kabatナンバリング)、VHのCDR3のトリプトファン残基(位置100a、Kabatナンバリング)及びVLのCDR1(位置32、Kabatナンバリング)、並びにVHのCDR2の潜在的なアスパラギン脱アミド部位(位置56、Kabatナンバリング)が明らかになった。トリプトファンの酸化はかなり遅いプロセスであり、還元化合物を添加することによって防止することができるが、抗体可変ドメイン中の不対システインの存在は重要な可能性がある。遊離システインは反応性であり、他のタンパク質又は細胞もしくは培地の成分の他の不対システインと安定な結合を形成することができる。結果として、これは、潜在的に免疫原性であり、したがって患者にリスクをもたらし得る未知の修飾を有する不均一で不安定な生成物をもたらし得る。更に、アスパラギンの脱アミド化並びに結果として生じるイソアスパラギン酸及びスクシンイミドの形成は、インビトロ安定性及びインビボ生物学的機能の両方に影響を及ぼし得る。親マウス結合因子5.11Aの結晶構造分析により、C50はヒトCD28への結合に関与せず、したがってCD28に対する親和性に影響を与えることなくセリンなどの類似のアミノ酸で置換できることが明らかになった(表6、変異体29)。しかしながら、位置50のトリプトファン残基及びアスパラギンの両方は、結合界面に近いか又はそれに関与し、したがって、類似のアミノ酸による置換は、結合親和性の低下をもたらし得る。この実施例では、本発明者らは、以下の理由のために、ヒトCD28に対するCD28(SA)の親和性を低下させることを特に目的とした:CD28(SA)の親和性は1~2nMの範囲内であり、結合半減期は約32分である。この強い親和性は、患者に静脈内注射した場合、血液及びリンパ組織などの大量のCD28発現細胞を含有する組織においてシンク効果をもたらし得る。結果として、標的化成分(複数可)FAP及び/又はCEAを介した化合物の部位特異的標的化が低下し得、コンストラクトの有効性が低下し得る。そのような効果を最小限に抑えるために、いくつかのVH及びVL変異体を生成して、親和性を種々の程度に低下させた((図3A及び図3C)。潜在的な安定性ホットスポットを表す前述の位置に加えて、ヒトCD28への結合に直接的又は間接的に関与する更なる残基は、元のマウス生殖系列アミノ酸又は類似のアミノ酸のいずれかによって置き換えられた。更に、CD28(SA)VL及びVHの両方のCDRも、トラスツズマブのそれぞれのフレームワーク配列にグラフトした(図3B及び3D)。次いで、VH及びVL変異体のいくつかの組み合わせを一価の1アーム抗CD28 IgG様コンストラクトとして発現させ、結合をSPRによって特徴付けた。
ホットスポットを欠き、親和性が低下したCD28(SA)変異体の作製及び特性評価
3.1 不対システイン残基、トリプトファン残基、脱アミド部位の除去及び親和性低下CD28(SA)変異体の生成
発明者らの詳細な結合因子の特性評価の一部として、CD28(SA)可変ドメイン配列の計算分析を行った。この分析により、VHのCDR2領域の不対システイン(位置50、Kabatナンバリング)、VHのCDR3のトリプトファン残基(位置100a、Kabatナンバリング)及びVLのCDR1(位置32、Kabatナンバリング)、並びにVHのCDR2の潜在的なアスパラギン脱アミド部位(位置56、Kabatナンバリング)が明らかになった。トリプトファンの酸化はかなり遅いプロセスであり、還元化合物を添加することによって防止することができるが、抗体可変ドメイン中の不対システインの存在は重要な可能性がある。遊離システインは反応性であり、他のタンパク質又は細胞もしくは培地の成分の他の不対システインと安定な結合を形成することができる。結果として、これは、潜在的に免疫原性であり、したがって患者にリスクをもたらし得る未知の修飾を有する不均一で不安定な生成物をもたらし得る。更に、アスパラギンの脱アミド化並びに結果として生じるイソアスパラギン酸及びスクシンイミドの形成は、インビトロ安定性及びインビボ生物学的機能の両方に影響を及ぼし得る。親マウス結合因子5.11Aの結晶構造分析により、C50はヒトCD28への結合に関与せず、したがってCD28に対する親和性に影響を与えることなくセリンなどの類似のアミノ酸で置換できることが明らかになった(表6、変異体29)。しかしながら、位置50のトリプトファン残基及びアスパラギンの両方は、結合界面に近いか又はそれに関与し、したがって、類似のアミノ酸による置換は、結合親和性の低下をもたらし得る。この実施例では、本発明者らは、以下の理由のために、ヒトCD28に対するCD28(SA)の親和性を低下させることを特に目的とした:CD28(SA)の親和性は1~2nMの範囲内であり、結合半減期は約32分である。この強い親和性は、患者に静脈内注射した場合、血液及びリンパ組織などの大量のCD28発現細胞を含有する組織においてシンク効果をもたらし得る。結果として、標的化成分(複数可)FAP及び/又はCEAを介した化合物の部位特異的標的化が低下し得、コンストラクトの有効性が低下し得る。そのような効果を最小限に抑えるために、いくつかのVH及びVL変異体を生成して、親和性を種々の程度に低下させた((図3A及び図3C)。潜在的な安定性ホットスポットを表す前述の位置に加えて、ヒトCD28への結合に直接的又は間接的に関与する更なる残基は、元のマウス生殖系列アミノ酸又は類似のアミノ酸のいずれかによって置き換えられた。更に、CD28(SA)VL及びVHの両方のCDRも、トラスツズマブのそれぞれのフレームワーク配列にグラフトした(図3B及び3D)。次いで、VH及びVL変異体のいくつかの組み合わせを一価の1アーム抗CD28 IgG様コンストラクトとして発現させ、結合をSPRによって特徴付けた。
3.2 SPRによる還元型1アーム抗CD28変異体の解離速度定数(koff)の分析
第1の工程で抗CD28結合因子変異体を特徴付けるために、全ての結合因子を一価の1アームIgG様コンストラクトとして発現させた(図4A)。このフォーマットを、1:1モデルにおいてCD28への結合を特徴付けるために選択した。HEK細胞へのトランスフェクションの5日後、上清を回収し、発現したコンストラクトの力価を決定した。
第1の工程で抗CD28結合因子変異体を特徴付けるために、全ての結合因子を一価の1アームIgG様コンストラクトとして発現させた(図4A)。このフォーマットを、1:1モデルにおいてCD28への結合を特徴付けるために選択した。HEK細胞へのトランスフェクションの5日後、上清を回収し、発現したコンストラクトの力価を決定した。
抗CD28結合因子変異体の解離速度を、ニュートラアビジン捕捉によってNLCチップ上に固定化されたビオチン化huCD28-Fc抗原を用いて25℃でProteOn XPR36装置(Biorad)を使用して表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定した。組換え抗原(リガンド)の固定化のために、huCD28-FcをPBST(10mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウムpH 7.4、0.005%Tween20からなるTween20を含むリン酸緩衝生理食塩水)で100~500nMの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で25μl/分で注射した。これにより、垂直方向で1000~3000応答単位(RU)の間の固定化レベルが得られた。
ワンショット反応速度測定では、注入方向を水平方向に変更した。産生された上清の力価に基づいて、一価の1アームIgGをPBSTで希釈して、100nM~6.25nMの範囲の2倍希釈系列を得た。注入は、120秒の会合時間及び300秒の解離時間で、別々のチャネル1~5に沿って50μl/分で同時に行った。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。結合相互作用は、精製及び生化学的特徴付けなしで上清からの一価の1アームIgGを用いて測定されたので、タンパク質:タンパク質相互作用のオフレートのみを更なる結論のために使用した。解離センサーグラムを適合させることによって、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1対1ラングミュア結合モデルを使用して、解離速度を計算した。全てのクローンの解離速度定数(koff)値を表3に要約する。産生された変異体の比較により、koff値が親配列と比較して最大30倍減少することが明らかになった。
ヒトCD28に対する結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。この結合アッセイは、以下の実施例4に記載されている。図4A~図4Cから分かるように、一価の1アームIgG様CD28変異体コンストラクトは、結合の違いを示した。
3.3 二重特異性FAP標的化抗CD28親和性変異体の調製及び速度論的分析
オフレート分析及びCD28発現細胞に対する結合研究に基づいて、異なる結合強度を有する抗CD28 VH及びVL変異体のいくつかの組合せを選択し、FAP標的化二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子として発現させた(配列番号の組み合わせについては表4を参照されたい。)。1+1フォーマットで得られたコンストラクト(図4B)を精製し、生化学的分析を行った(表5)。
オフレート分析及びCD28発現細胞に対する結合研究に基づいて、異なる結合強度を有する抗CD28 VH及びVL変異体のいくつかの組合せを選択し、FAP標的化二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子として発現させた(配列番号の組み合わせについては表4を参照されたい。)。1+1フォーマットで得られたコンストラクト(図4B)を精製し、生化学的分析を行った(表5)。
作製した二重特異性抗原結合分子のCD28に対する親和性(KD)は、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上にビオチン化huCD28-Fc抗原を固定化したProteOn XPR36装置(Biorad社)を用いて、25℃でSPRにより測定した。組換え抗原(リガンド)の固定:抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウム pH 7.4、0.005%Tween20)で10μg/mlに希釈し、次いでさまざまな接触時間で30μl/分で注入して、垂直方向で約200、400又は800の応答単位(RU)の固定化レベルを達成した。分析物の注入:ワンショット速度論測定のため、注入方向を水平方向に変え、精製された二重特異性FAP標的化抗CD28親和性変異体の二倍希釈系列(50~3.125nMの様々な濃度範囲)を、150秒の会合時間及び450秒の解離時間で、別々のチャネル1~5に沿って50μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として計算した。分析されたクローンにより、広い範囲(1~25nM)のKD値が明らかになった。動力学的及び熱力学的データを表6に要約する。
実施例4
CD28発現細胞及びFAP発現細胞に対する一価CD28アゴニスト性IgG及びFAP標的化CD28アゴニスト性抗体の結合
ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、FACS緩衝液(eBioscience、カタログ番号00-4222-26)に2.5x105/mlで再懸濁した。5x104個の細胞を、漸増濃度のCD28結合因子(1pM~100nM)と共に4℃で2時間、丸底96ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で3回洗浄し、PE抱合体化ヤギ抗ヒトPE(Jackson ImmunoReserach、カタログ番号109-116-098)と共に4℃で更に60分間インキュベートし、冷FACS緩衝液で1回洗浄し、遠心分離し、100ulのFACS緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗DP47 IgGを陰性対照として含めた。結合を、FACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism 6を用いて結合曲線を得た。
CD28発現細胞及びFAP発現細胞に対する一価CD28アゴニスト性IgG及びFAP標的化CD28アゴニスト性抗体の結合
ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、FACS緩衝液(eBioscience、カタログ番号00-4222-26)に2.5x105/mlで再懸濁した。5x104個の細胞を、漸増濃度のCD28結合因子(1pM~100nM)と共に4℃で2時間、丸底96ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で3回洗浄し、PE抱合体化ヤギ抗ヒトPE(Jackson ImmunoReserach、カタログ番号109-116-098)と共に4℃で更に60分間インキュベートし、冷FACS緩衝液で1回洗浄し、遠心分離し、100ulのFACS緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗DP47 IgGを陰性対照として含めた。結合を、FACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism 6を用いて結合曲線を得た。
一価の1アーム型IgG様CD28変異体コンストラクトは、図4A~図4Cから分かるように、結合における違いを示した。更に、ヒトCD28を発現するCHO細胞に対する1+1フォーマットの二重特異性FAP標的化抗CD28抗体の結合を決定した。選択されたCD28変異体を有する種々の1+1コンストラクトのKD値を以下の表7又は図4D及び4Eの対応するグラフに示す。
FAP発現3T3-huFAP細胞(クローン19)に対する1+1フォーマットの二重特異性FAP標的化抗CD28抗体の結合もまた、実施例2.1に記載されるように求められ、図4F及び図4Gの対応するグラフに示される。
実施例5
CD28発現細胞へのCEA標的CD28アゴニスト抗体の結合
ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞を用いて試験した(結合を、実施例4に記載されるようにFACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism 6を用いて結合曲線を得た。選択されたCD28変異体を有する種々の1+1コンストラクトの結合曲線を図16に示す。
CD28発現細胞へのCEA標的CD28アゴニスト抗体の結合
ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞を用いて試験した(結合を、実施例4に記載されるようにFACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism 6を用いて結合曲線を得た。選択されたCD28変異体を有する種々の1+1コンストラクトの結合曲線を図16に示す。
実施例6
CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とするインビトロ機能的特性評価
初代ヒトPBMCを用いていくつかの細胞ベースのインビトロアッセイを実施して、T細胞二重特異性(TCB)抗体によって提供されるTCRシグナルの存在下及び非存在下におけるCD28(SA)及び二重特異性FAP標的化CD28抗原結合分子の活性を評価した。フローサイトメトリー、サイトカインELISA及び生細胞イメージングによって決定されるT細胞増殖、サイトカイン分泌及び腫瘍細胞死滅を読み取りとして得た。
CD28及び線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)又は癌胎児性抗原(CEA)を標的とするインビトロ機能的特性評価
初代ヒトPBMCを用いていくつかの細胞ベースのインビトロアッセイを実施して、T細胞二重特異性(TCB)抗体によって提供されるTCRシグナルの存在下及び非存在下におけるCD28(SA)及び二重特異性FAP標的化CD28抗原結合分子の活性を評価した。フローサイトメトリー、サイトカインELISA及び生細胞イメージングによって決定されるT細胞増殖、サイトカイン分泌及び腫瘍細胞死滅を読み取りとして得た。
1.元のスーパーアゴニストCD28(SA)IgG4の活性を、CD28媒介スーパーアゴニズムに対する末梢血由来T細胞の応答性を回復させるために以前に記載された高密度前培養系を使用して評価した(Roemer et al.,2011)。
2.TCRシグナルの非存在下での標的化CD28分子の機能性を、初代ヒトPBMC共培養アッセイにおいて評価し、FAP又はCEA標的化CD28分子を、T細胞上のヒトCD28及びヒトFAPへの同時結合によって架橋し、3T3-huFAP細胞(ヒトFAPを安定的に過剰発現するように改変される親細胞株ATCC#CCL-92)もしくはMCSP及びFAPを発現するMV3メラノーマ細胞、又はCEAを発現するMKN45胃がん細胞のいずれかでそれぞれ発現させた。
3.TCRシグナルの存在下でのFAP標的化CD28分子の機能性を、T細胞上のCD3、及びMKN45胃がん細胞上のヒトCEA、Lovo結腸がん細胞、HT-29結腸がん細胞、又はMV3メラノーマ細胞上に発現されるMCSPのいずれかへの同時結合によって架橋されたTCB分子の更なる存在を伴って、上記のように評価した。
PBMCの単離
末梢血単核細胞(PBMC)を、バフィーコート(Blutspende Zuerich)から得たヘパリン処理した血液の濃縮リンパ球調製物から密度勾配遠心分離によって調製した。25mlの血液(PBSで1:2に希釈)を15mlのlymphoprep(STEMCELL technologies、カタログ番号07851)の上に重層し、室温で25分間、845×gでブレーキなしで遠心分離した。PBMC含有界面を、10mlピペットを用いて50mlチューブに回収した。細胞をPBSで洗浄し、611×gで5分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを50mlのPBSに再懸濁し、304×gで5分間遠心分離した。洗浄工程を繰り返し、171×gで遠心分離した。細胞をRPMI 1640 Glutamax(5%ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、50μM 2-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有)に再懸濁し、それぞれのアッセイプロトコルに従って更なる機能分析のために処理した。
末梢血単核細胞(PBMC)を、バフィーコート(Blutspende Zuerich)から得たヘパリン処理した血液の濃縮リンパ球調製物から密度勾配遠心分離によって調製した。25mlの血液(PBSで1:2に希釈)を15mlのlymphoprep(STEMCELL technologies、カタログ番号07851)の上に重層し、室温で25分間、845×gでブレーキなしで遠心分離した。PBMC含有界面を、10mlピペットを用いて50mlチューブに回収した。細胞をPBSで洗浄し、611×gで5分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを50mlのPBSに再懸濁し、304×gで5分間遠心分離した。洗浄工程を繰り返し、171×gで遠心分離した。細胞をRPMI 1640 Glutamax(5%ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、50μM 2-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有)に再懸濁し、それぞれのアッセイプロトコルに従って更なる機能分析のために処理した。
PBMCの高密度前培養及びCD28スーパーアゴニストCD28(SA)によるT細胞活性化のインビトロ評価
TGN1412媒介CD28スーパーアゴニズムに対するヒトT細胞の応答性を回復させるために、PBMCを高密度(HD)で前培養し(Roemer et al,2011)、その後、CD28スーパーアゴニスト抗体の影響を評価した。簡潔に言えば、PBMCを完全培地(RPMI 1640 Glutamax、5%ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、50uM 2-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシン)中で1E7細胞/mlに調整し、24ウェルプレート中で1.5ml/ウェルで37℃、5%CO2で48時間培養した。次いで、細胞を再採取し、完全培地で洗浄し、550×gで5分間遠心分離し、機能的特性評価に必要な所望の細胞密度に調整した。T細胞増殖を評価するために、PBMCをCFSEで標識し、CFSE希釈を刺激の5日後にT細胞増殖の代用として測定した。簡潔に言えば、細胞をPBS中2×107/mlに調整し、2.5μM CFSE増殖色素(LifeTechnologies、カタログ番号65-0850-84)で37℃、5%CO2で6分間標識した。細胞を完全培地中で1回洗浄し、続いてPBS中で2回洗浄した。TGN1412による刺激のために、PBMCを完全培地中で2×106/mlに調整し、1×105細胞を平底96ウェルプレートの各ウェルに分配し、漸増濃度のTGN1412(0.0002nM~10nM、三連)で刺激した。CFSE希釈をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を550×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。CFSE希釈をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を550×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。CD8(BV711抗ヒトCD8a、BioLegend#301044)、CD4(PE-Cy7抗ヒトCD4、BioLegend#344612)についての表面染色を供給業者の指示に従って実施した。次いで、細胞を150μl/ウェルのPBSで2回洗浄し、200μl/ウェルのFACS緩衝液に再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析した。サイトカイン分泌を、培養上清からのサイトカインELISA(huTNFα、DuoSet#DY210-05及びhuIFNγ、DuoSet#DY285-05)又はサイトカイン多重(ヒトサイトカイン17プレックスアッセイ、Bio-Rad#M5000031YV)分析によって活性化後5日目に測定した。
TGN1412媒介CD28スーパーアゴニズムに対するヒトT細胞の応答性を回復させるために、PBMCを高密度(HD)で前培養し(Roemer et al,2011)、その後、CD28スーパーアゴニスト抗体の影響を評価した。簡潔に言えば、PBMCを完全培地(RPMI 1640 Glutamax、5%ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、50uM 2-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシン)中で1E7細胞/mlに調整し、24ウェルプレート中で1.5ml/ウェルで37℃、5%CO2で48時間培養した。次いで、細胞を再採取し、完全培地で洗浄し、550×gで5分間遠心分離し、機能的特性評価に必要な所望の細胞密度に調整した。T細胞増殖を評価するために、PBMCをCFSEで標識し、CFSE希釈を刺激の5日後にT細胞増殖の代用として測定した。簡潔に言えば、細胞をPBS中2×107/mlに調整し、2.5μM CFSE増殖色素(LifeTechnologies、カタログ番号65-0850-84)で37℃、5%CO2で6分間標識した。細胞を完全培地中で1回洗浄し、続いてPBS中で2回洗浄した。TGN1412による刺激のために、PBMCを完全培地中で2×106/mlに調整し、1×105細胞を平底96ウェルプレートの各ウェルに分配し、漸増濃度のTGN1412(0.0002nM~10nM、三連)で刺激した。CFSE希釈をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を550×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。CFSE希釈をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を550×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。CD8(BV711抗ヒトCD8a、BioLegend#301044)、CD4(PE-Cy7抗ヒトCD4、BioLegend#344612)についての表面染色を供給業者の指示に従って実施した。次いで、細胞を150μl/ウェルのPBSで2回洗浄し、200μl/ウェルのFACS緩衝液に再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析した。サイトカイン分泌を、培養上清からのサイトカインELISA(huTNFα、DuoSet#DY210-05及びhuIFNγ、DuoSet#DY285-05)又はサイトカイン多重(ヒトサイトカイン17プレックスアッセイ、Bio-Rad#M5000031YV)分析によって活性化後5日目に測定した。
TCBシグナルの非存在下及び存在下における二重特異性FAP標的化CD28抗原結合分子によるT細胞増殖及びサイトカイン分泌のインビトロ評価
Pan T細胞をエフェクター細胞として使用し、製造業者の指示に従ってPan T細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用して、MACSによってPBMCから単離した。
Pan T細胞をエフェクター細胞として使用し、製造業者の指示に従ってPan T細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用して、MACSによってPBMCから単離した。
TCBの非存在下における二重特異性FAP-CD28抗原結合分子によるT細胞活性化を測定するために、CFSE標識されたpan T細胞を、3×104/ウェルの3T3-huFAP又はFAP発現を欠く親3T3細胞(3T3-WT)と共培養し、前日に平底96ウェルプレートに播種した。二重特異性FAP-CD28抗原結合分子を漸増濃度(0.0002nM~10nM、三連)で加えた。
TCBシグナルの存在下でT細胞増殖を測定するために、CFSE標識されたpan T細胞を3×104/ウェルのFAP及びMCSP発現MV3細胞とインキュベーションし、漸増濃度の二重特異性FAP-CD28抗原結合分子(0.0002nM~10nM、三連)、及び固定濃度のMCSP-TCB(5pM、P1AD2189)で前日に平底96ウェルプレートに播種した。。対照として、TCBのみを含むウェルを含めた。
CFSE希釈をフローサイトメトリーによって評価し、サイトカイン分泌を、培養上清からのサイトカインELISA(huTNFα、DuoSet#DY210-05及びhuIFNγ、DuoSet#DY285-05)又はサイトカイン多重(ヒトサイトカイン17プレックスアッセイ、Bio-Rad#M5000031YV)分析によって活性化後5日目に測定した。
この実験で使用される抗MCSP/抗CD3二重特異性抗体(MCSP-TCB)の調製は、国際公開第2014/131712号A1に記載される。
CD28(SA)のスーパーアゴニズムはFcγRIIb架橋を必要とする
PBMCの高密度前培養はCD28(SA)スーパーアゴニズムを回復させる
CD28(SA)の作用機序を理解するために、本発明者らは、PBMC由来T細胞がTGN1412媒介CD28スーパーアゴニズム(Roemer et al.,2011)に応答する能力を回復させるための以前に記載されたプロトコルとしてPBMCの高密度(HD)前培養を検証した。図5A及び5Bに示されるように、CD28(SA)IgG4(P1AE1975)は、HD前培養に供されたPBMCにおいてのみ刺激の5日後に濃度依存的様式でPBMC T細胞増殖(図5A)及びサイトカイン産生(図5B)を誘導するが、新鮮なPBMCは無応答のままであった。発明者らは、インビトロ(Roemer et al.,2011)でCD28(SA)に対するT細胞の応答性を回復させるための以前に公開されたプロトコルを発明者らの手で再現することができると結論付けた。
PBMCの高密度前培養はCD28(SA)スーパーアゴニズムを回復させる
CD28(SA)の作用機序を理解するために、本発明者らは、PBMC由来T細胞がTGN1412媒介CD28スーパーアゴニズム(Roemer et al.,2011)に応答する能力を回復させるための以前に記載されたプロトコルとしてPBMCの高密度(HD)前培養を検証した。図5A及び5Bに示されるように、CD28(SA)IgG4(P1AE1975)は、HD前培養に供されたPBMCにおいてのみ刺激の5日後に濃度依存的様式でPBMC T細胞増殖(図5A)及びサイトカイン産生(図5B)を誘導するが、新鮮なPBMCは無応答のままであった。発明者らは、インビトロ(Roemer et al.,2011)でCD28(SA)に対するT細胞の応答性を回復させるための以前に公開されたプロトコルを発明者らの手で再現することができると結論付けた。
CD28(SA)スーパーアゴニスト活性はFcγRIIbを介した架橋を必要とする-FcγRIIbの遮断はCD28(SA)機能性を消失させる
以前に公開された文献は、TGN1412が潜在的にFcγRIIb架橋に依存することを示している。PBMCのHD前培養とCD28(SA)機能性のFc依存性との関連性を理解するために、HD前培養の前後にフローサイトメトリーによってPBMC上のFcγRIIbの発現レベルを評価した。図5Cに示すように、FcγRIIb発現は新鮮なPBMC単球には存在せず、一方、単球の96.8%がHD前培養の2日後にFcγRIIbを発現した。その後のT細胞増殖アッセイにおけるFcγRIIbの抗体媒介遮断は、培養5日後に測定されたCD28(SA)での刺激時にT細胞増殖を完全に無効にした(図5D)。別のアプローチでは、P329G-LALA変異(CD28(SA)IgG1 PG-LALA:P1AD9289)を有するCD28(SA)のFcサイレンシング変異体は、スーパーアゴニスト機能を示さなかった(図 6A)。これらのデータは、CD28(SA)媒介CD28スーパーアゴニズムがFcγRIIbを介した架橋に依存することを確認する。
以前に公開された文献は、TGN1412が潜在的にFcγRIIb架橋に依存することを示している。PBMCのHD前培養とCD28(SA)機能性のFc依存性との関連性を理解するために、HD前培養の前後にフローサイトメトリーによってPBMC上のFcγRIIbの発現レベルを評価した。図5Cに示すように、FcγRIIb発現は新鮮なPBMC単球には存在せず、一方、単球の96.8%がHD前培養の2日後にFcγRIIbを発現した。その後のT細胞増殖アッセイにおけるFcγRIIbの抗体媒介遮断は、培養5日後に測定されたCD28(SA)での刺激時にT細胞増殖を完全に無効にした(図5D)。別のアプローチでは、P329G-LALA変異(CD28(SA)IgG1 PG-LALA:P1AD9289)を有するCD28(SA)のFcサイレンシング変異体は、スーパーアゴニスト機能を示さなかった(図 6A)。これらのデータは、CD28(SA)媒介CD28スーパーアゴニズムがFcγRIIbを介した架橋に依存することを確認する。
FAP標的化のための腫瘍標的化部分をFc-サイレントCD28(SA)に加えることにより、スーパーアゴニズムが回復し、スーパーアゴニズムはその後、腫瘍標的の存在に依存する。
TGN1412によるCD28スーパーアゴニズムがFcγRIIb架橋に依存することを考えると、本発明者らは、(i)FcサイレンシングP329G-LALA変異及び(ii)表面発現腫瘍抗原に架橋する標的化部分の導入によって、FcR依存性が腫瘍に再指向され得ると仮定した。この仮説を試験するために、FAP標的化部分を、FcサイレンシングされたTGN1412(FAP-CD28 1+2 SA:P1AD9011)にC末端融合物として加えた。FcR架橋はこのアプローチに必要とされなかったので、PBMCをHD前培養に供しなかった。代わりに、新鮮なPBMCを、漸増濃度のFAP-CD28(P1AD9011)の存在下で5日間、3T3-huFAP又は3T3-WTと共培養し、T細胞増殖を、フローサイトメトリーによるCFSE希釈によって評価した。図6Bに示されるように、FAP結合部分の導入は、もっぱらFAPの存在下でのT細胞増殖を可能にした。本発明者らは、スーパーアゴニズムが、Fcサイレンシング及び腫瘍標的化部分の付加によって腫瘍抗原に対して選択的に標的化され得ると結論づけた。
TGN1412によるCD28スーパーアゴニズムがFcγRIIb架橋に依存することを考えると、本発明者らは、(i)FcサイレンシングP329G-LALA変異及び(ii)表面発現腫瘍抗原に架橋する標的化部分の導入によって、FcR依存性が腫瘍に再指向され得ると仮定した。この仮説を試験するために、FAP標的化部分を、FcサイレンシングされたTGN1412(FAP-CD28 1+2 SA:P1AD9011)にC末端融合物として加えた。FcR架橋はこのアプローチに必要とされなかったので、PBMCをHD前培養に供しなかった。代わりに、新鮮なPBMCを、漸増濃度のFAP-CD28(P1AD9011)の存在下で5日間、3T3-huFAP又は3T3-WTと共培養し、T細胞増殖を、フローサイトメトリーによるCFSE希釈によって評価した。図6Bに示されるように、FAP結合部分の導入は、もっぱらFAPの存在下でのT細胞増殖を可能にした。本発明者らは、スーパーアゴニズムが、Fcサイレンシング及び腫瘍標的化部分の付加によって腫瘍抗原に対して選択的に標的化され得ると結論づけた。
従来のCD28アゴニスト抗体(クローン9.3)は、腫瘍標的化二重特異性フォーマットにおいてスーパーアゴニスト的に挙動しない
2つのタイプのCD28アゴニスト抗体が文献に報告されており、TGN1412などのスーパーアゴニストCD28抗体は、TCRによって提供される更なるシグナルを必要とせずにT細胞を自律的に活性化することができる。これらの抗体は、T細胞機能を増強するためにTCRシグナルの存在に厳密に依存する天然のCD28アゴニストリガンドCD80及びCD86の機能性を超えるので、スーパーアゴニストと呼ばれる。TGN1412などのスーパーアゴニスト抗体とは対照的に、クローンmab 9.3などの従来のアゴニスト抗体はT細胞を自律的に活性化することができないが、天然のCD28リガンドと同様に、T細胞活性を増強するために追加のTCRシグナルを必要とする。CD28アゴニストを腫瘍抗原に標的化する効果をより詳細に評価するために、本発明者らは、更なるFAP-CD28分子を作製した:(i)2つのCD28結合部分(TGN1412)及び2つのFAP結合部分=2+2 SAフォーマット(P1AD4493)を有するスーパーアゴニスト(SA)分子、(ii)2つのCD28結合部分(クローン9.3)及び1つ又は2つのFAP結合部分をそれぞれ有する従来のアゴニスト(CA):2+2 CA(P1AD8968)、1+2 CA(P1AD8962).新鮮なPBMCを、増大する濃度のFAP標的化分子の存在下において5日間、3T3-huFAP又は3T3-WTと共培養し、T細胞増殖を、フローサイトメトリーによるCFSE希釈によって評価した。図7A~7Dに示されるように、スーパーアゴニスト結合因子のみがT細胞を活性化することができた。更に、記載されるスーパーアゴニストコンストラクトによるT細胞活性化は、FAPの非存在下におけるT細胞活性化の非存在によって実証されるように(図7D)、FAPの存在に厳密に依存する(図7B)。これらのデータと一致して、サイトカイン分泌もまた、スーパーアゴニストCD28(SA)抗体を有するコンストラクトについてのみ観察されたが、従来のアゴニスト9.3抗体については観察されなかった(図7E)。本発明者らは、スーパーアゴニストCD28抗体のみが、二重特異性腫瘍標的化抗体フォーマットにおいて自律的T細胞活性化を誘発するが、従来の9.3結合因子と同じフォーマットはスーパーアゴニストではないと結論付けた。
2つのタイプのCD28アゴニスト抗体が文献に報告されており、TGN1412などのスーパーアゴニストCD28抗体は、TCRによって提供される更なるシグナルを必要とせずにT細胞を自律的に活性化することができる。これらの抗体は、T細胞機能を増強するためにTCRシグナルの存在に厳密に依存する天然のCD28アゴニストリガンドCD80及びCD86の機能性を超えるので、スーパーアゴニストと呼ばれる。TGN1412などのスーパーアゴニスト抗体とは対照的に、クローンmab 9.3などの従来のアゴニスト抗体はT細胞を自律的に活性化することができないが、天然のCD28リガンドと同様に、T細胞活性を増強するために追加のTCRシグナルを必要とする。CD28アゴニストを腫瘍抗原に標的化する効果をより詳細に評価するために、本発明者らは、更なるFAP-CD28分子を作製した:(i)2つのCD28結合部分(TGN1412)及び2つのFAP結合部分=2+2 SAフォーマット(P1AD4493)を有するスーパーアゴニスト(SA)分子、(ii)2つのCD28結合部分(クローン9.3)及び1つ又は2つのFAP結合部分をそれぞれ有する従来のアゴニスト(CA):2+2 CA(P1AD8968)、1+2 CA(P1AD8962).新鮮なPBMCを、増大する濃度のFAP標的化分子の存在下において5日間、3T3-huFAP又は3T3-WTと共培養し、T細胞増殖を、フローサイトメトリーによるCFSE希釈によって評価した。図7A~7Dに示されるように、スーパーアゴニスト結合因子のみがT細胞を活性化することができた。更に、記載されるスーパーアゴニストコンストラクトによるT細胞活性化は、FAPの非存在下におけるT細胞活性化の非存在によって実証されるように(図7D)、FAPの存在に厳密に依存する(図7B)。これらのデータと一致して、サイトカイン分泌もまた、スーパーアゴニストCD28(SA)抗体を有するコンストラクトについてのみ観察されたが、従来のアゴニスト9.3抗体については観察されなかった(図7E)。本発明者らは、スーパーアゴニストCD28抗体のみが、二重特異性腫瘍標的化抗体フォーマットにおいて自律的T細胞活性化を誘発するが、従来の9.3結合因子と同じフォーマットはスーパーアゴニストではないと結論付けた。
実施例7
TCBの非存在下又は存在下での腫瘍標的化CD28分子による腫瘍細胞死滅のインビトロ評価
二重特異性FAP-CD28又はCEA-CD28抗原結合分子が腫瘍細胞死滅を達成するか又はTCB媒介性腫瘍細胞死滅を支持する能力を評価するために、精製されたpan T細胞はエフェクター細胞としての役割を果たし、RFP発現MV3細胞及びMKN45細胞はそれぞれ腫瘍標的としての役割を果たした。
TCBの非存在下又は存在下での腫瘍標的化CD28分子による腫瘍細胞死滅のインビトロ評価
二重特異性FAP-CD28又はCEA-CD28抗原結合分子が腫瘍細胞死滅を達成するか又はTCB媒介性腫瘍細胞死滅を支持する能力を評価するために、精製されたpan T細胞はエフェクター細胞としての役割を果たし、RFP発現MV3細胞及びMKN45細胞はそれぞれ腫瘍標的としての役割を果たした。
MV3腫瘍細胞の死滅を評価するために、前日に播種した5000個のMV3標的細胞を、5pM MCSP-TCB(P1AD2189)単独の存在下又は10nM二重特異性FAP-CD28抗原結合分子との組合せの下で、平底96ウェルプレート(E:T 20:1)において1×105pan T細胞/ウェルで共培養した。MV3腫瘍細胞の死滅を評価するために、前日に播種した5000個のMV3標的細胞を、2nMのFAP-CD28の存在下、平底96ウェルプレート(E:T 20:1)において1×105 pan T細胞/ウェルで共培養した。MKN45腫瘍細胞の死滅を評価するために、前日に播種した5000個のMKN45を、2nM CEA-CD28の存在下、平底96ウェルプレート中、ウェルあたり1×105個のpan T細胞と共培養した。IncuCyte生細胞イメージングシステム(Essen Biosciences)を使用して、3時間毎にウェルあたり4つの画像をキャプチャして、標的細胞の死滅を90時間にわたって監視した。経時的な画像あたりのRFP+物体数(IncuCyte ZOOMソフトウェア、Essen Biosciencesを介して評価)は、標的細胞死の代用として機能した。抗体媒介性標的細胞死滅を、エフェクターT細胞単独の存在下で標的細胞の数を経時的にモニタリングすることによって自発的な標的細胞死と区別した(=ベースライン対照)。死滅は100-xとして計算され、xはベースライン対照に対する%標的である。スチューデントのt検定を使用して統計分析を行い、経時的な%死滅の曲線下面積(AUC)を比較した。
FAP-CD28は、1+2形式で標的細胞死滅を誘導するが、従来のCD28アゴニスト結合因子ではなく、スーパーアゴニストCD28結合因子のみで誘導する。
FAP-CD28分子が腫瘍細胞死滅を誘導する能力を評価した。図8A~8Dに示されるように、PBMC由来T細胞をFAP-CD28の存在下において90時間にわたってFAP発現MV3メラノーマ細胞と共培養することにより、1+2フォーマット(P1AD9011)でのFAP CD28(SA)のみによるMV3細胞の死滅がもたらされ、また、FAP標的化TCB(7)によって達成される死滅の誘導に匹敵した。2+2フォーマットのFAP-CD28(SA)(P1AD4493)、同様にまた、従来のCD28アゴニスト性9.3抗体(P1AD8968及びP1AD8962)を用いたFAP-CD28では死滅は全く認められなかった。本発明者らは、T細胞増殖及びサイトカイン分泌に加えて、スーパーアゴニスト結合因子を含む1+2フォーマットのFAP-CD28もまた、TCBに匹敵する標的細胞死滅を誘発し得ると結論付ける。
FAP-CD28分子が腫瘍細胞死滅を誘導する能力を評価した。図8A~8Dに示されるように、PBMC由来T細胞をFAP-CD28の存在下において90時間にわたってFAP発現MV3メラノーマ細胞と共培養することにより、1+2フォーマット(P1AD9011)でのFAP CD28(SA)のみによるMV3細胞の死滅がもたらされ、また、FAP標的化TCB(7)によって達成される死滅の誘導に匹敵した。2+2フォーマットのFAP-CD28(SA)(P1AD4493)、同様にまた、従来のCD28アゴニスト性9.3抗体(P1AD8968及びP1AD8962)を用いたFAP-CD28では死滅は全く認められなかった。本発明者らは、T細胞増殖及びサイトカイン分泌に加えて、スーパーアゴニスト結合因子を含む1+2フォーマットのFAP-CD28もまた、TCBに匹敵する標的細胞死滅を誘発し得ると結論付ける。
CEA-CD28は、1+2及び2+2形式で標的細胞死滅を誘導するが、従来のCD28アゴニスト抗体ではなく、スーパーアゴニスト抗体でのみ誘導する。
別のアプローチでは、本発明者らは、2+2 SA(P1AE1195)、1+2 SA(P1AE1194)、2+2 CA(P1AE1193)、及び2+1 CA(P1AE1192)フォーマットのCEA標的CD28アゴニスト分子を使用して、標的細胞死滅を誘導する能力を評価した。PBMC T細胞を、上記フォーマットのCEA-CD28の存在下でCEA発現MKN45細胞と90時間共培養した。スーパーアゴニストCD28結合因子を含む両フォーマットは、CEA発現MKN45細胞の死滅を誘導することができた(図9A及び9B)。本発明者らは、FAP-CD28(SA)2+2とCEA-CD28(SA)2+2のそれぞれの標的細胞を死滅させる能力との間の不一致が、MKN45細胞対MV3細胞における標的発現レベルの不一致の範囲内にあると推測する。正確には、社内データでは、MV3細胞のFAP発現レベルがMKN45細胞のCEA発現レベルよりも10倍低いことが確認された。したがって、MV3細胞では、腫瘍標的結合部位が制限的であるかもしれず、MV3細胞の死滅には、CD28に対するFAPの効率的な占有が必要であり、これは、2+2(すなわち、2つのCD28結合部位の架橋に必要な2つのFAP結合部位)と比較して1+2フォーマット(すなわち、1つのFAP結合部位が2つのCD28結合部位を架橋する)において有利である。
別のアプローチでは、本発明者らは、2+2 SA(P1AE1195)、1+2 SA(P1AE1194)、2+2 CA(P1AE1193)、及び2+1 CA(P1AE1192)フォーマットのCEA標的CD28アゴニスト分子を使用して、標的細胞死滅を誘導する能力を評価した。PBMC T細胞を、上記フォーマットのCEA-CD28の存在下でCEA発現MKN45細胞と90時間共培養した。スーパーアゴニストCD28結合因子を含む両フォーマットは、CEA発現MKN45細胞の死滅を誘導することができた(図9A及び9B)。本発明者らは、FAP-CD28(SA)2+2とCEA-CD28(SA)2+2のそれぞれの標的細胞を死滅させる能力との間の不一致が、MKN45細胞対MV3細胞における標的発現レベルの不一致の範囲内にあると推測する。正確には、社内データでは、MV3細胞のFAP発現レベルがMKN45細胞のCEA発現レベルよりも10倍低いことが確認された。したがって、MV3細胞では、腫瘍標的結合部位が制限的であるかもしれず、MV3細胞の死滅には、CD28に対するFAPの効率的な占有が必要であり、これは、2+2(すなわち、2つのCD28結合部位の架橋に必要な2つのFAP結合部位)と比較して1+2フォーマット(すなわち、1つのFAP結合部位が2つのCD28結合部位を架橋する)において有利である。
TGN1412結合因子によるCD28スーパーアゴニズムはCD28結合因子多価性に依存する-一価結合因子はスーパーアゴニスト性ではない
CD28スーパーアゴニズムの性質を更に調べるために、本発明者らは、一価のCD28 TGN1412結合因子が腫瘍標的化二重特異性フォーマットにおいてスーパーアゴニスト性の挙動を示すかどうかを評価した。PBMC T細胞を3T3-huFAP細胞と共培養し、漸増濃度の、CD28二価を有するFAP-CD28 1+2 SA(P1AD9011)及びCD28一価を有するFAP-CD28 1+1 SA(P1AD4492)とインキュベーションした。図10Aに示されるように、一価のCD28結合を有するFAP-CD28(P1AD4492)は、CD28二価コンストラクト(P1AD9011)とは対照的に、T細胞増殖を誘導することができなかった。一貫して、T細胞活性化マーカーCD69及びCD25の上方制御は、CD28二価でのみ観察された(それぞれ、図10B、10C)。結論として、TGN1412媒介性スーパーアゴニズムは、Fc受容体を介した架橋に依存するだけでなく、CD28結合因子多価性も必要とする。
CD28スーパーアゴニズムの性質を更に調べるために、本発明者らは、一価のCD28 TGN1412結合因子が腫瘍標的化二重特異性フォーマットにおいてスーパーアゴニスト性の挙動を示すかどうかを評価した。PBMC T細胞を3T3-huFAP細胞と共培養し、漸増濃度の、CD28二価を有するFAP-CD28 1+2 SA(P1AD9011)及びCD28一価を有するFAP-CD28 1+1 SA(P1AD4492)とインキュベーションした。図10Aに示されるように、一価のCD28結合を有するFAP-CD28(P1AD4492)は、CD28二価コンストラクト(P1AD9011)とは対照的に、T細胞増殖を誘導することができなかった。一貫して、T細胞活性化マーカーCD69及びCD25の上方制御は、CD28二価でのみ観察された(それぞれ、図10B、10C)。結論として、TGN1412媒介性スーパーアゴニズムは、Fc受容体を介した架橋に依存するだけでなく、CD28結合因子多価性も必要とする。
結論として、CD28スーパーアゴニズムは、Fcサイレンシング及び腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインの導入によって腫瘍抗原に特異的に標的化され得ることが確立され得る。更に、腫瘍標的化二重特異性抗体は、それらがCD28(SA)ベースの結合因子を含む場合にのみスーパーアゴニスト性であり、それらが従来のアゴニスト性結合因子を含む場合にはスーパーアゴニスト性ではない(クローン9.3)。更に、スーパーアゴニズムは、CD28(SA)結合因子の多価性を必要とし、二重特異性コンストラクトにおける一価のCD28(SA)結合は、スーパーアゴニストT細胞活性化を抑止する。
FAP-CD28は、TCB媒介性の標的細胞死滅を支持し、腫瘍標的依存性を持続させるためにCD28結合因子の一価性を必要とする
CD28シグナル伝達は、T細胞受容体媒介T細胞応答を増強することが十分に説明されている。したがって、T細胞二重特異性抗体(TCB)は、CD28アゴニズムの有望な組み合わせパートナーである。標的CD28アゴニズムとTCBとの組み合わせにより、本発明者らは、TCB媒介エフェクター機能を増強し、効率的なTCB媒介T細胞活性化のためのCEA発現の閾値を低下させ、生存合図を提供し、PD-1及びCTLA4を介したT細胞抑制に対する耐性を支持することを想定している。
CD28シグナル伝達は、T細胞受容体媒介T細胞応答を増強することが十分に説明されている。したがって、T細胞二重特異性抗体(TCB)は、CD28アゴニズムの有望な組み合わせパートナーである。標的CD28アゴニズムとTCBとの組み合わせにより、本発明者らは、TCB媒介エフェクター機能を増強し、効率的なTCB媒介T細胞活性化のためのCEA発現の閾値を低下させ、生存合図を提供し、PD-1及びCTLA4を介したT細胞抑制に対する耐性を支持することを想定している。
標的CD28アゴニストがTCBを増強することができるかどうかを調べるために、本発明者らは、FAP-CD28(SA)1+2(P1AD9011)及びFAP-CD28(SA)1+1(P1AD4492)がTCB媒介性の標的細胞死滅を支援する能力を評価した。漸増濃度のFAP-CD28及び固定された限界濃度のMCSP-TCB(5pM)の存在下で5日間、PBMC由来T細胞をMCSP-及びFAPを共発現するMV3細胞と共培養することにより、FAP-CD28の濃度依存的様式でMV3標的細胞の増大した死滅がもたらされた(図11A)。しかしながら、刺激の5日後のCEA発現FAP陰性MKN45腫瘍細胞の存在下におけるCEACAM5-TCB媒介性標的細胞死滅の濃度依存的増加によって実証されるように(図11B)、TCBの存在はCD28二価フォーマットP1AD9011)におけるFAP-CD28のFAP依存性を無効にし、一方、FAP依存性はCD8一価フォーマット(P1AD4492)において維持された。
別のアプローチでは、本発明者らは、FAP-CD28 1+2 SA(P1AD9011)によって誘導されるT細胞増殖を、TCBの存在下又は非存在下において、また、FAPの存在下又は非存在下においてそれぞれ評価した。図12A及び前の実施例に示されるように、FAP-CD28(SA)2+1は、TCBの非存在下におけるT細胞活性化のためのFAPの存在に厳密に依存する。しかしながら、TCBの存在下では、図12Bに示されるように、FAP-CD28(SA)1+2は、FAPの非存在下においてさえ、T細胞活性化の増強を誘導する。
本発明者らは、TCB誘導TCRシグナルが、TCRシグナル伝達成分の十分なプレクラスタリングを潜在的にもたらし、したがって、共刺激を誘発するのに十分な二価CD28分子によるT細胞上のCD28受容体の表面架橋をもたらすと仮定する。本発明者らは、TCB組み合わせアプローチでは、標的CD28アゴニスト抗原結合分子の腫瘍-標的依存性を維持するためにCD28結合因子の一価性が厳密に必要であると結論する。
種々の一価FAP-CD28フォーマットの比較により、古典的な1+1フォーマットについて最も高い効力を有する一連の種々の機能的FAP-CD28フォーマットが明らかにされる。
TCB媒介T細胞活性化を増強するその能力に対するFAP-CD28の特異的抗体フォーマットの影響を評価するために、一価のCD28結合を有するFAP-CD28抗原結合分子の種々のフォーマットを作製し、図1C、1K、1L及び1Mに示す。CD28二価を有するFAP-CD28 1+2を参照として使用した。これらのフォーマットの機能性を評価するために、PBMC T細胞を、漸増濃度のFAP-CD28フォーマット及び固定された限界濃度のMCSP-TCB(5pM)の存在下で5日間、MCSP-及びFAPを共発現するMV3細胞と共にインキュベートした。全てのフォーマットは、CD8 T細胞増殖(図13A)、CD4 T細胞増殖(図13B)及び標的細胞死滅(図13C)を有意に増加させることができた。注目すべきことに、分子C(P1AD4492)の効力は最も高く、二価CD28参照フォーマット1+2 SA(P1AD9011)の効力に匹敵した。全ての分子のCD28及びFAPに対する結合をそれぞれ図2F及び2Gに示す。
TCB媒介T細胞活性化を増強するその能力に対するFAP-CD28の特異的抗体フォーマットの影響を評価するために、一価のCD28結合を有するFAP-CD28抗原結合分子の種々のフォーマットを作製し、図1C、1K、1L及び1Mに示す。CD28二価を有するFAP-CD28 1+2を参照として使用した。これらのフォーマットの機能性を評価するために、PBMC T細胞を、漸増濃度のFAP-CD28フォーマット及び固定された限界濃度のMCSP-TCB(5pM)の存在下で5日間、MCSP-及びFAPを共発現するMV3細胞と共にインキュベートした。全てのフォーマットは、CD8 T細胞増殖(図13A)、CD4 T細胞増殖(図13B)及び標的細胞死滅(図13C)を有意に増加させることができた。注目すべきことに、分子C(P1AD4492)の効力は最も高く、二価CD28参照フォーマット1+2 SA(P1AD9011)の効力に匹敵した。全ての分子のCD28及びFAPに対する結合をそれぞれ図2F及び2Gに示す。
実施例8
腫瘍標的化CD28分子とCEA標的化TCBの組み合わせの腫瘍細胞死滅のインビトロ評価
T細胞二重特異性(TCB)抗体の調製
TCB分子を、国際公開第2014/131712号A1又は国際公開第2016/079076号A1に記載される方法に従って調製した。この実験で使用される抗CEA/抗CD3二重特異性抗体(CEA CD3 TCB又はCEA TCB)の調製は、国際公開第2014/131712号A1の実施例3に記載される。CEA CD3 TCBは、「2+1 IgG クロスFab」抗体であり、2つの異なる重鎖と、2つの異なる軽鎖とで構成される。2つの異なる重鎖のアセンブリを促進するために、CH3ドメイン中の点変異(「ホールにノブを入れる」)を導入した。2つの異なる軽鎖の正しいアセンブリを促進するために、CD3結合FabにおけるVHドメインとVLドメインの交換を行った。2+1は、その分子が、CEAに特異的な2つの抗原結合ドメインと、CD3に特異的な1つの抗原結合ドメインを有することを意味する。CEACAM5 CD3 TCBは、同じフォーマットを有するが、別のCEA結合因子を含み、軽鎖の正しい対形成を補助するために、CD3結合因子のCHドメイン及びCLドメインに点変異を含む。CEA CD3 TCBは、配列番号161、配列番号162、配列番号163及び配列番号164のアミノ酸配列を含む。CEACAM5 CD TCBは、配列番号165、配列番号166、配列番号167及び配列番号168のアミノ酸配列を含む。
腫瘍標的化CD28分子とCEA標的化TCBの組み合わせの腫瘍細胞死滅のインビトロ評価
T細胞二重特異性(TCB)抗体の調製
TCB分子を、国際公開第2014/131712号A1又は国際公開第2016/079076号A1に記載される方法に従って調製した。この実験で使用される抗CEA/抗CD3二重特異性抗体(CEA CD3 TCB又はCEA TCB)の調製は、国際公開第2014/131712号A1の実施例3に記載される。CEA CD3 TCBは、「2+1 IgG クロスFab」抗体であり、2つの異なる重鎖と、2つの異なる軽鎖とで構成される。2つの異なる重鎖のアセンブリを促進するために、CH3ドメイン中の点変異(「ホールにノブを入れる」)を導入した。2つの異なる軽鎖の正しいアセンブリを促進するために、CD3結合FabにおけるVHドメインとVLドメインの交換を行った。2+1は、その分子が、CEAに特異的な2つの抗原結合ドメインと、CD3に特異的な1つの抗原結合ドメインを有することを意味する。CEACAM5 CD3 TCBは、同じフォーマットを有するが、別のCEA結合因子を含み、軽鎖の正しい対形成を補助するために、CD3結合因子のCHドメイン及びCLドメインに点変異を含む。CEA CD3 TCBは、配列番号161、配列番号162、配列番号163及び配列番号164のアミノ酸配列を含む。CEACAM5 CD TCBは、配列番号165、配列番号166、配列番号167及び配列番号168のアミノ酸配列を含む。
CEA-CD28は、標的細胞の死滅においてCEACAM5-TCBと相乗作用する
代替的なアプローチでは、本発明者らは、CEA-CD28(SA)1+1二重特異性抗原結合分子(分子M、P1AE3127)を生成し、CEACAM5-TCB媒介標的細胞滅を増強するその能力を評価した。この目的のために、CEA発現MKN45結腸直腸がん細胞を、最適以下のCEACAM5-TCB(10nM)の存在下又は非存在下でPBMC T細胞及びCEA-CD28(分子M、P1AE3127)又は非標的一価CD28(分子L、P1AD8944)と共培養し、MKN45細胞死滅を経時的に評価した。図14に示すように、CEACAM5-TCBとCEA-CD28の組み合わせのみが標的細胞死滅をもたらしたが、化合物単独では標的細胞死滅を達成せず、相乗効果を示した。更に、CEACAM5-TCBと組み合わせた非標的CD28も死滅を誘導せず、架橋及びそれによる腫瘍標的への持続的依存に対する一価CD28アゴニストの必要性をもう一度強調した。
代替的なアプローチでは、本発明者らは、CEA-CD28(SA)1+1二重特異性抗原結合分子(分子M、P1AE3127)を生成し、CEACAM5-TCB媒介標的細胞滅を増強するその能力を評価した。この目的のために、CEA発現MKN45結腸直腸がん細胞を、最適以下のCEACAM5-TCB(10nM)の存在下又は非存在下でPBMC T細胞及びCEA-CD28(分子M、P1AE3127)又は非標的一価CD28(分子L、P1AD8944)と共培養し、MKN45細胞死滅を経時的に評価した。図14に示すように、CEACAM5-TCBとCEA-CD28の組み合わせのみが標的細胞死滅をもたらしたが、化合物単独では標的細胞死滅を達成せず、相乗効果を示した。更に、CEACAM5-TCBと組み合わせた非標的CD28も死滅を誘導せず、架橋及びそれによる腫瘍標的への持続的依存に対する一価CD28アゴニストの必要性をもう一度強調した。
CEA-CD28はCEA-TCB及びCEACAM5-TCBを増強し、TCBがT細胞を活性化するためのがん細胞上のCEA発現閾値を低下させる
CEA-TCB及びCEACAM5-TCBは、T細胞活性化及び標的細胞死滅のために、標的細胞上で一定の発現レベルのCEAを必要とする。本発明者らは、CEA-CD28がTCBのCEA発現閾値を低下させて効率的な標的細胞死滅を誘導できるかどうかを評価した。この目的のために、様々なCEA発現レベルを有する標的細胞株の存在下で、PBMC T細胞を、漸増濃度のCEA-TCB(P1AD4646)又はCEACAM5-TCB(P1AD5299)及び固定濃度のCEA-CD28(分子M、P1AE3127)のいずれかと共にインキュベートした:(i)MKN45(高発現、約400000のCEA結合部位/細胞)、(ii)Lovo(中程度の発現、およそ60000のCEA結合部位/細胞)、(iii)HT-29(低発現、約6000のCEA結合部位/細胞)。T細胞増殖をT細胞活性化の代用として測定した。図15に示すように、CEA-CD28は、CEA-TCB及びCEACAM5-TCBの効力を有意に増加させることができた。最も注目すべきことに、TCBは低CEA発現HT-29細胞のみではT細胞活性化を達成しなかったが、CEA-CD28の添加はTCBの活性を強く増強した。本発明者らは、CEA-CD2がCEA-TCB及びCEACAM5-TCBを増強し、TCBがT細胞を活性化するためのがん細胞上のCEA発現閾値を低下させると結論づける。
CEA-TCB及びCEACAM5-TCBは、T細胞活性化及び標的細胞死滅のために、標的細胞上で一定の発現レベルのCEAを必要とする。本発明者らは、CEA-CD28がTCBのCEA発現閾値を低下させて効率的な標的細胞死滅を誘導できるかどうかを評価した。この目的のために、様々なCEA発現レベルを有する標的細胞株の存在下で、PBMC T細胞を、漸増濃度のCEA-TCB(P1AD4646)又はCEACAM5-TCB(P1AD5299)及び固定濃度のCEA-CD28(分子M、P1AE3127)のいずれかと共にインキュベートした:(i)MKN45(高発現、約400000のCEA結合部位/細胞)、(ii)Lovo(中程度の発現、およそ60000のCEA結合部位/細胞)、(iii)HT-29(低発現、約6000のCEA結合部位/細胞)。T細胞増殖をT細胞活性化の代用として測定した。図15に示すように、CEA-CD28は、CEA-TCB及びCEACAM5-TCBの効力を有意に増加させることができた。最も注目すべきことに、TCBは低CEA発現HT-29細胞のみではT細胞活性化を達成しなかったが、CEA-CD28の添加はTCBの活性を強く増強した。本発明者らは、CEA-CD2がCEA-TCB及びCEACAM5-TCBを増強し、TCBがT細胞を活性化するためのがん細胞上のCEA発現閾値を低下させると結論づける。
実施例9
CD28(SA)の親和性低減変異体のインビトロ機能的特性評価
元のCD28(SA)結合因子(TGN1412)について、KD=1nMの親和性を決定した。このような高親和性結合因子は、特にCD28の場合のように標的が末梢血で高度に発現される場合、末梢シンク効果を受けるリスクを有する。(i)末梢性シンク効果を低下させ、(ii)T細胞に対する二重特異性腫瘍標的化CD28抗体の腫瘍外結合を通して末梢性T細胞活性化のリスクを低下させるために、本発明者らは、CDRに点変異を導入することによって親和性が低下した一連の31個のCD28結合因子を作製した(実施例3を参照されたい)。図4A、4B及び4Cは、上清からのCD28単一特異的一価IgGのCHO細胞上のCD28への結合を示し、点変異の添加が様々な結合特性を有する広範囲の結合因子を生成したことを確認する。これらのデータに基づいて、11個の候補の最終リストを更なる特徴付けのためにFAP-CD28二重特異性フォーマット(実施例4、表6を参照されたい)への変換のために選択した。結合アッセイにより、細胞上のFAPに対する正の結合(図4F及び図4G)、同様にまた、選択された変異体のCD28に対する正の結合及び変化する結合(図4D及び4E)が確認された。
CD28(SA)の親和性低減変異体のインビトロ機能的特性評価
元のCD28(SA)結合因子(TGN1412)について、KD=1nMの親和性を決定した。このような高親和性結合因子は、特にCD28の場合のように標的が末梢血で高度に発現される場合、末梢シンク効果を受けるリスクを有する。(i)末梢性シンク効果を低下させ、(ii)T細胞に対する二重特異性腫瘍標的化CD28抗体の腫瘍外結合を通して末梢性T細胞活性化のリスクを低下させるために、本発明者らは、CDRに点変異を導入することによって親和性が低下した一連の31個のCD28結合因子を作製した(実施例3を参照されたい)。図4A、4B及び4Cは、上清からのCD28単一特異的一価IgGのCHO細胞上のCD28への結合を示し、点変異の添加が様々な結合特性を有する広範囲の結合因子を生成したことを確認する。これらのデータに基づいて、11個の候補の最終リストを更なる特徴付けのためにFAP-CD28二重特異性フォーマット(実施例4、表6を参照されたい)への変換のために選択した。結合アッセイにより、細胞上のFAPに対する正の結合(図4F及び図4G)、同様にまた、選択された変異体のCD28に対する正の結合及び変化する結合(図4D及び4E)が確認された。
親和性低下CD28結合因子変異体は、FAP-CD28二重特異性フォーマットにおいてインビトロで機能的である
親和性が低下したCD28結合因子変異体が依然として機能的であり、TCB媒介エフェクター機能を支持することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、TCBの組み合わせにおけるT細胞増殖を評価した。この目的のために、PBMC T細胞を、漸増濃度のFAP-CD28及び固定された限界濃度のMCSP-TCB(5pM)の存在下で5日間、MCSP-及びFAPを共発現するMV3細胞と共培養した。図4Hに示すように、CD28結合因子の全ての変異体は機能的であり、濃度依存的にTCB媒介T細胞増殖を増加させることができた。注目すべきことに、最も低い親和性変異体8(P1AE3131)は、親CD28クローンと比較して親和性の約20倍の減少を示すが、その効力の約86%を回復する(図4I)。これらの知見と一致して、全ての変異体は、MV3標的細胞のTCB媒介性死滅を更に増強することができた(図4J)。対応するEC50値を、下表8に示す。
親和性が低下したCD28結合因子変異体が依然として機能的であり、TCB媒介エフェクター機能を支持することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、TCBの組み合わせにおけるT細胞増殖を評価した。この目的のために、PBMC T細胞を、漸増濃度のFAP-CD28及び固定された限界濃度のMCSP-TCB(5pM)の存在下で5日間、MCSP-及びFAPを共発現するMV3細胞と共培養した。図4Hに示すように、CD28結合因子の全ての変異体は機能的であり、濃度依存的にTCB媒介T細胞増殖を増加させることができた。注目すべきことに、最も低い親和性変異体8(P1AE3131)は、親CD28クローンと比較して親和性の約20倍の減少を示すが、その効力の約86%を回復する(図4I)。これらの知見と一致して、全ての変異体は、MV3標的細胞のTCB媒介性死滅を更に増強することができた(図4J)。対応するEC50値を、下表8に示す。
これらの結果に基づいて、インビトロでの更なる特性評価及びインビボでの試験のために変異体8(最も低い親和性、23nM)、15(中間親和性:7.1nM)及び29(除去されたホットスポット、ほとんど親和性低下なし、KD=1.1nM)を選択し、有効性及び腫瘍への改善された生体内分布によって判断した。
親和性低下CD28結合因子変異体は、CEA-CD28二重特異性フォーマットにおいてインビトロで機能的である
別のアプローチでは、本発明者らは、3つの選択された変異体8、15及び29をCEA標的二重特異性フォーマットに変換し、CEACAM5-TCB媒介T細胞活性化及び標的細胞死滅を増強する能力を評価した。これらの分子のCD28への結合を図16に示す。機能性を評価するために、PBMC T細胞を、CEA発現MKN45標的細胞の存在下で、漸増濃度のCEACAM5-TCB及び固定濃度のCEA-CD28変異体と共にインキュベートした。図17A、17B及び17Cに示されるように、全ての変異体は、5日後にTCB媒介CD8 T細胞増殖を増強することができ(図17A)、5日後にCD4 T細胞増殖を増強することができ(図17B)、90時間で細胞を死滅させることを標的とすることができた(図17C)。対応するEC50値を以下の表9に要約する。
別のアプローチでは、本発明者らは、3つの選択された変異体8、15及び29をCEA標的二重特異性フォーマットに変換し、CEACAM5-TCB媒介T細胞活性化及び標的細胞死滅を増強する能力を評価した。これらの分子のCD28への結合を図16に示す。機能性を評価するために、PBMC T細胞を、CEA発現MKN45標的細胞の存在下で、漸増濃度のCEACAM5-TCB及び固定濃度のCEA-CD28変異体と共にインキュベートした。図17A、17B及び17Cに示されるように、全ての変異体は、5日後にTCB媒介CD8 T細胞増殖を増強することができ(図17A)、5日後にCD4 T細胞増殖を増強することができ(図17B)、90時間で細胞を死滅させることを標的とすることができた(図17C)。対応するEC50値を以下の表9に要約する。
実施例10
新規抗CEA抗体の作製及び作製
10.1 抗CEA抗体A5B7のヒト化変異体の作製
10.1.1 方法論
抗CEA抗体A5B7は例えば、M.J.Banfield et al,Proteins 1997,29(2),161-171により開示されており、その構造は、タンパク質構造データベースPDB(www.rcsb.org,H.M.Berman et al,The Protein Data Bank,Nucleic Acids Research,2000,28,235-242)においてPDB ID:1CLOとして見つけることができる。このエントリーは、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。抗CEA結合因子A5B7のヒト化の間に、好適なヒトアクセプターフレームワークを識別するために、高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを検索し、このフレームワークのCDRをグラフトし、復帰突然変異が予想可能なものを評価することによる、古典的なアプローチを利用した。より明示的には、親抗体に対する、識別したフレームワークの各アミノ酸の違いの、結合因子に対する構造的完全性の影響を判断し、適切な場合はいつでも、親配列に対する逆突然変異を導入した。構造評価は、親抗体と、Biovia Discovery Studio Environment,バージョン4.5を使用して実装した、社内で抗体構造相同性モデリングツールにより作製したそのヒト化バージョンとの両方のFv領域相同性モデルに基いた。
新規抗CEA抗体の作製及び作製
10.1 抗CEA抗体A5B7のヒト化変異体の作製
10.1.1 方法論
抗CEA抗体A5B7は例えば、M.J.Banfield et al,Proteins 1997,29(2),161-171により開示されており、その構造は、タンパク質構造データベースPDB(www.rcsb.org,H.M.Berman et al,The Protein Data Bank,Nucleic Acids Research,2000,28,235-242)においてPDB ID:1CLOとして見つけることができる。このエントリーは、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。抗CEA結合因子A5B7のヒト化の間に、好適なヒトアクセプターフレームワークを識別するために、高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを検索し、このフレームワークのCDRをグラフトし、復帰突然変異が予想可能なものを評価することによる、古典的なアプローチを利用した。より明示的には、親抗体に対する、識別したフレームワークの各アミノ酸の違いの、結合因子に対する構造的完全性の影響を判断し、適切な場合はいつでも、親配列に対する逆突然変異を導入した。構造評価は、親抗体と、Biovia Discovery Studio Environment,バージョン4.5を使用して実装した、社内で抗体構造相同性モデリングツールにより作製したそのヒト化バージョンとの両方のFv領域相同性モデルに基いた。
10.1.2 アクセプターフレームワークの選択及びその適合
アクセプターフレームワークを、下表10に記載のとおりに選択した。
重鎖に関しては、ヒトJエレメント生殖細胞系IGJH6、及び、軽鎖に関しては、カッパJエレメントIGKJ2に類似した配列から、ポストCDR3フレームワーク領域を適合させた。
アクセプターフレームワークを、下表10に記載のとおりに選択した。
構造の考察に基づき、親結合因子における、ヒトアクセプターフレームワークからアミノ酸への復帰突然変異を、重鎖の位置93及び94に導入した。
10.1.3 得られるヒト化CEA抗体のVH及びVL領域
ヒト化CEA抗体の得られたVHドメインは、下表11に見いだすことができ、ヒト化CEA抗体の得られたVLドメインは、下表12に列挙されている。
ヒト化CEA抗体の得られたVHドメインは、下表11に見いだすことができ、ヒト化CEA抗体の得られたVLドメインは、下表12に列挙されている。
重鎖に関して、最初の変異体3-23A5-1は、結合アッセイにおいて好適であることが発見され(しかし、親マウス抗体よりわずかに低い結合を示した)、更なる修飾のための起点として選択した。IGHV3-15に基づく変異体は、ヒト化変異体3-23A5-1と比較して、低い結合活性を示した。
親キメラ抗体の完全な結合活性を復元するために、変異体3-23A5-1A、3-23A5-1C、及び3-23A5-1Dを作製した。CDR-H2の長さがヒトアクセプター配列に適合可能であるか否か、変異体3-23A5-1を試験したが、このコンストラクトは完全に結合活性を失っていた。推定では、アミド分解ホットスポットはCDR-H2(Asn53-Gly54)に存在したため、このモチーフをAsn53-Ala54に変更した。可能性のある別のホットスポットAsn73-Ser74を、Lys73-Ser74に復帰突然変異させた。このように、変異体3-23A5-1Eを作製した。
ヒトIGKV3-11アクセプターフレームワークに基づき、軽鎖をヒト化した。連続したA5-L1からA5-L4において、変異体A5-L1は良好な結合活性を示す(しかし、親抗体をわずかに下回る)ことが分かった。CDR-L1(変異体A5-L2;Kabat位置30及び31)の部分的なヒト化により、結合が完全に失われる。同様に、CDR-H2(変異体A5-L3;Kabat位置50~56)のヒト化によってもまた、結合が完全に失われる。位置90(変異体A5-L4)は、結合特性に対する著しい寄与を示す。この位置におけるヒスチジンは、結合に重要である。したがって、変異体A5-L1を更なる修飾のために選択した。
連続したA5-L1A~A5-L1Dは、親キメラ抗体の完全な結合能力を復元するために、どの復帰突然変異が必要であるかの問いを解決した。Kabat位置1、2、全体フレームワーク2、並びにKabat位置71における復帰突然変異は、どのような更なる結合活性も添加しないことを、変異体A5-L1Aは示した。変異体A5-L1B、及びA5-L1Cは、これらの位置のサブセットを解決し、そのサブセットは結合特性を変化させないことを確認する。Kabat位置46及び47において復帰突然変異を有する変異体A5-L1Dは、最良の結合活性を示した。
10.1.4 ヒト化A5B7抗体の選択
VH及びVLの新規のヒト化変異体に基づき、国際公開第2012/130831A1号に記載の方法に従い、新規のCEA抗体を、エフェクターサイレントFc(P329G;L234、L235A)を有するhuIgG1抗体として発現させてFcγ受容体への結合をなくし、MKN45細胞上で発現したCEAへの結合を試験し、それぞれの親マウスA5B7抗体と比較した。
VH及びVLの新規のヒト化変異体に基づき、国際公開第2012/130831A1号に記載の方法に従い、新規のCEA抗体を、エフェクターサイレントFc(P329G;L234、L235A)を有するhuIgG1抗体として発現させてFcγ受容体への結合をなくし、MKN45細胞上で発現したCEAへの結合を試験し、それぞれの親マウスA5B7抗体と比較した。
MKN45(DSMZ ACC 409)は、CEAを発現するヒトの胃腺癌細胞株である。細胞を、高度RPMI+2%FCS+1%Glutamaxで培養した。MKN-45細胞の生存能を確認し、細胞を再懸濁し、1Mio細胞/mLの密度に調節した。100μLのこの細胞懸濁液(0.1Mio細胞を含有)を、96ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを4分間400×gで遠心分離し、上清を取り除いた。次に、40μLの希釈抗体又はFACS緩衝液を細胞に添加し、30分間4℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり150μLのFACS緩衝液で2回洗浄した。次いで、20μLの希釈した二次PE抗ヒトFc特異性二次抗体(109-116-170,Jackson ImmunoResearch)を細胞に加えた。細胞を更に30分間、4℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり150μLのFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を固定するために、1% PFAを含有する100μLのFACS緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を150μLのFACS緩衝液に再懸濁した。BDフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。
図18に、ヒト化A5B7変異体の結合曲線を示す。試験した結合因子は全て、MKN45細胞に結合することができたが、結合能力は、親A5B7抗体と比較してわずかに低下した。クローンP1AE2167は、試験した全ての変異体に最良の結合を有したので、更なる開発のために選択した。
10.1.5表面プラズモン共鳴(BIACORE)を使用した、マウスCEA抗体A5B7のヒト化変異体のFab断片の、ヒトCEAに対する親和性の測定
マウスCEA抗体A5B7のヒト化変異体のFab断片の、ヒトCEAに対する親和性を、BIACORE T200機器を用いる表面プラズモン共鳴により評価した。CM5チップ上で、ヒトCEA(hu N(A2-B2)A-avi-His B)を、フローセル2上での30秒間の、約100RUに対する標準的なアミンカップリングにより、40nMの濃度で不動態化した。マウスCEA抗体A5B7のヒト化変異体のFab断片を、120秒の接触時間、250又は1000秒の解離時間、及び30μL/分の流速に対して、500~0.656nMの範囲の3倍希釈で、分析物としてその後注入した。ヒトCEA(hu N(A2-B2)A-avi-His B)の濃度における再生は、2パルスの、10mMグリシン/HCl pH 2.0(60秒間)により達成された。不動態化フローセル1、及び分析物のゼロ濃度に対して、データを二重参照した。分析物の前記を、単純な1:1ラングミュア相互作用モデルに適合させた。ヒトCEA(A2ドメイン)に対する親和性定数[KD]を、下表14に要約する。
マウスCEA抗体A5B7のヒト化変異体のFab断片の、ヒトCEAに対する親和性を、BIACORE T200機器を用いる表面プラズモン共鳴により評価した。CM5チップ上で、ヒトCEA(hu N(A2-B2)A-avi-His B)を、フローセル2上での30秒間の、約100RUに対する標準的なアミンカップリングにより、40nMの濃度で不動態化した。マウスCEA抗体A5B7のヒト化変異体のFab断片を、120秒の接触時間、250又は1000秒の解離時間、及び30μL/分の流速に対して、500~0.656nMの範囲の3倍希釈で、分析物としてその後注入した。ヒトCEA(hu N(A2-B2)A-avi-His B)の濃度における再生は、2パルスの、10mMグリシン/HCl pH 2.0(60秒間)により達成された。不動態化フローセル1、及び分析物のゼロ濃度に対して、データを二重参照した。分析物の前記を、単純な1:1ラングミュア相互作用モデルに適合させた。ヒトCEA(A2ドメイン)に対する親和性定数[KD]を、下表14に要約する。
マウスCEA抗体A5B7のヒト化変異体は、親マウス抗体よりも低い親和性を有する。P1AE2167(VH変異体3-23A5-1Aを有する重鎖、及びVL変異体A5-L1Dを有するCカッパ軽鎖)に由来するFab断片P1AE4138を、最終のヒト化変異体として選択した。更に、アミド分解部位を取り除くために、Kabat位置54における、グリシンからアラニンへの変異(G54A)をVHドメインに導入し、VL変異体3-23A5-1Eをもたらした。最終のヒト化抗体(VH変異体3-23A5-1Eを有する重鎖、及びVL変異体A5-L1Dを有するCカッパ軽鎖)の名前を、A5H1EL1D又はhuA5B7とした。
10.2 A5H1EL1D由来の親和性成熟抗CEA抗体の作製
10.2.1ファージディスプレイキャンペーンのための抗原の調製、精製及び特性評価
マウス抗体A5B7及びそのヒト化誘導体A5H1EL1Dは、CEACAM5(CEA)のA2ドメインに、それぞれ約0.8及び約2.5nMの親和性で結合する。ファージディスプレイによるA5H1EL1Dの親和性成熟変異体の生成のために、3つの異なる組換え可溶性抗原を生成した。各タンパク質は、部位特異的ビオチン化のためのC末端aviタグ及び精製のためのhisタグを含んでいた:第1のタンパク質は、4つのIg様ドメインN、A1、B、A2(NABA-avi-His、配列番号238、表15)からなるCEACAM1の細胞外部分からなっていた。第2のタンパク質は、2つのCEACAM5及び2つのCEACAM1 Igドメインからなるキメラタンパク質であった。CEACAM1の4つのドメインの配列に基づいて、CEACAM1の第2及び第3のドメインをコードするDNA(A1及びBドメイン)を、CEACAM5のA2及びB2ドメインをコードするDNA(N(A2B2)A-avi-His、配列番号239、表15)で置き換えた。第3のタンパク質は、1つのCEACAM5及び3つのCEACAM1 Igドメインからなるキメラタンパク質であった。CEACAM1の4つのドメインの配列に基づいて、CEACAM1の第3のドメイン(Bドメイン)をコードするDNAを、CEACAM5のB2ドメイン(NA(B2)A-avi-His、配列番号240、表15)をコードするDNAで置き換えた。3つのコンストラクトの概略説明を図19A、19B及び19Cに示す。
10.2.1ファージディスプレイキャンペーンのための抗原の調製、精製及び特性評価
マウス抗体A5B7及びそのヒト化誘導体A5H1EL1Dは、CEACAM5(CEA)のA2ドメインに、それぞれ約0.8及び約2.5nMの親和性で結合する。ファージディスプレイによるA5H1EL1Dの親和性成熟変異体の生成のために、3つの異なる組換え可溶性抗原を生成した。各タンパク質は、部位特異的ビオチン化のためのC末端aviタグ及び精製のためのhisタグを含んでいた:第1のタンパク質は、4つのIg様ドメインN、A1、B、A2(NABA-avi-His、配列番号238、表15)からなるCEACAM1の細胞外部分からなっていた。第2のタンパク質は、2つのCEACAM5及び2つのCEACAM1 Igドメインからなるキメラタンパク質であった。CEACAM1の4つのドメインの配列に基づいて、CEACAM1の第2及び第3のドメインをコードするDNA(A1及びBドメイン)を、CEACAM5のA2及びB2ドメインをコードするDNA(N(A2B2)A-avi-His、配列番号239、表15)で置き換えた。第3のタンパク質は、1つのCEACAM5及び3つのCEACAM1 Igドメインからなるキメラタンパク質であった。CEACAM1の4つのドメインの配列に基づいて、CEACAM1の第3のドメイン(Bドメイン)をコードするDNAを、CEACAM5のB2ドメイン(NA(B2)A-avi-His、配列番号240、表15)をコードするDNAで置き換えた。3つのコンストラクトの概略説明を図19A、19B及び19Cに示す。
各プラスミドをHEK293細胞に一過性トランスフェクトし、EBV由来タンパク質EBNA(HEK EBNA)を安定して発現させた。ビオチンリガーゼBirAをコードする同時に共トランスフェクトされたプラスミドが、in vivoでのaviタグ特異的なビオチン化を可能にした。タンパク質を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)とその後のゲル濾過を使用した標準プロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養上清から精製した。単量体タンパク質画分をプールし、濃縮し(必要に応じて)、凍結し、-80℃で保存した。試料の一部を、例えば、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために提供した。
10.2.2 親和性成熟A5H1EL1D由来抗体の選択
抗体A5B7のヒト化は、SPRによって測定したCEAに対する親和性の約3~4倍の低下をもたらした。A5B7に対する親和性は約0.8nMであったが、A5H1EL1Dについては約2.5nMの親和性が測定された。異なるCEA発現レベルを有する細胞株を用いたFACS実験により、この知見が確認された。ヒト化クローンA5H1EL1Dの親和性を改善するために、3つの異なる親和性成熟ライブラリを作製し、ファージディスプレイによる親和性が改善されたクローンの選択に使用した。
抗体A5B7のヒト化は、SPRによって測定したCEAに対する親和性の約3~4倍の低下をもたらした。A5B7に対する親和性は約0.8nMであったが、A5H1EL1Dについては約2.5nMの親和性が測定された。異なるCEA発現レベルを有する細胞株を用いたFACS実験により、この知見が確認された。ヒト化クローンA5H1EL1Dの親和性を改善するために、3つの異なる親和性成熟ライブラリを作製し、ファージディスプレイによる親和性が改善されたクローンの選択に使用した。
10.2.2.1 A5H1EL1D親和性成熟ライブラリの作製
親和性成熟A5H1EL1D由来抗体の作製を、標準的なプロトコル(Silacci et al,2005)を使用してファージディスプレイによって行った。第1の工程では、ヒト化親クローンA5H1EL1D(配列番号186及び187のアミノ酸配列)のVH及びVLをコードするDNA配列をファージミドにクローニングし、次いでこれをランダム化のための鋳型として使用した。次の工程では、ファージディスプレイによる好ましいクローンの選択のために3つのライブラリを作製した。成熟ライブラリ1及び2を、重鎖のCDR1及びCDR2又は軽鎖のCDR1及びCDR2のいずれかにランダム化した。第3の成熟化ライブラリを、重鎖及び軽鎖の両方のCDR3領域においてランダム化した。それぞれのCDR領域におけるランダム化された位置を図20A及び20Bに示す。重鎖のCDR1及び2においてランダム化された成熟ライブラリ1を作製するために、「重複伸長によるスプライシング」(SOE)PCRによって2つの断片を構築し、ファージベクターにクローニングした(図21A)。以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリ断片を生成した:断片1(LMB3(配列番号243、表16)及びA5H1EL1D_H1_rev_TN(配列番号241、表16)及び断片2(A5H1EL1D_H2_for_TN(配列番号242、表7)及びHCDR3-rev-constant(配列番号244、表16)。
親和性成熟A5H1EL1D由来抗体の作製を、標準的なプロトコル(Silacci et al,2005)を使用してファージディスプレイによって行った。第1の工程では、ヒト化親クローンA5H1EL1D(配列番号186及び187のアミノ酸配列)のVH及びVLをコードするDNA配列をファージミドにクローニングし、次いでこれをランダム化のための鋳型として使用した。次の工程では、ファージディスプレイによる好ましいクローンの選択のために3つのライブラリを作製した。成熟ライブラリ1及び2を、重鎖のCDR1及びCDR2又は軽鎖のCDR1及びCDR2のいずれかにランダム化した。第3の成熟化ライブラリを、重鎖及び軽鎖の両方のCDR3領域においてランダム化した。それぞれのCDR領域におけるランダム化された位置を図20A及び20Bに示す。重鎖のCDR1及び2においてランダム化された成熟ライブラリ1を作製するために、「重複伸長によるスプライシング」(SOE)PCRによって2つの断片を構築し、ファージベクターにクローニングした(図21A)。以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリ断片を生成した:断片1(LMB3(配列番号243、表16)及びA5H1EL1D_H1_rev_TN(配列番号241、表16)及び断片2(A5H1EL1D_H2_for_TN(配列番号242、表7)及びHCDR3-rev-constant(配列番号244、表16)。
重鎖のCDR1及び2においてランダム化された成熟ライブラリ2を作製するために、「重複伸長によるスプライシング」(SOE)PCRによって2つの断片を構築し、ファージベクターにクローニングした(図21B)。以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリ断片を生成した:断片1(LMB3(配列番号:243、表17)及びA5H1EL1D_L1_rev_TN(配列番号:断片245、表17)及び断片2(A5H1EL1D_L2_for_TN(配列番号:246、表17)及びHCDR3-rev-constant(配列番号:244、表17)。
重鎖及び軽鎖のCDR3においてランダム化された成熟ライブラリ3を作製するために、「重複伸長によるスプライシング」(SOE)PCRによって2つの断片を構築し、ファージベクターにクローニングした(図21C)。以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリ断片を生成した:断片1(LMB3(配列番号:243、表18)及びLCDR3-rev-constant(配列番号:249、表18)及び断片2(A5H1EL1D_L3_for_TN(配列番号:247、表18)及びA5H1EL1D_H3_rev_TN(配列番号:248、表18)。
各ライブラリの断片のアセンブリのために、等モル量の各断片を使用し、それぞれの外側プライマーで増幅した。HCDR3及びLCDR3にランダム化した第3のライブラリの断片のアセンブリのために、プライマーLMB3(配列番号243、表18)をプライマー「HCDR3増幅」(配列番号250、表18)と組み合わせて使用した。このプライマーを、VHのC末端をKpnI部位を含む配列で伸長するために使用した。十分な量の完全長ランダム化断片の組立て後、それらを同様に処理した受容体ファージミドベクターと共にNcoI/KpnIで消化した。3倍モル過剰のライブラリインサートを20μgのファージミドベクターと連結した。精製したライゲーションを20回の形質転換に使用し、約0.7×109から2×109の形質転換体を得た。A5H1EL1D親和性成熟ライブラリを示すファージミド粒子をレスキューし、PEG/NaCl精製によって精製して選択に使用した。
10.2.2.2 親和性成熟A5H1EL1D由来クローンの選択
親和性成熟クローンの選択のために、3つ全てのライブラリを用いたファージディスプレイ選択を、組換え可溶性抗原を用いて行った。パニングラウンドを、以下のパターンに従って溶液中で行った:1.200nMビオチン化NA(B2)A-avi-His及びNABA-avi-hisと0.5時間インキュベートすることによる非特異的ファージミド粒子の前除去、2.5.4×107ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを10分間添加することによるビオチン化NA(B2)A-avi-His、NABA-avi-his及び結合ファージミド粒子の捕捉、3.更なる選択のための上清からの非結合ファージミド粒子の単離、4.総体積1mlでの20nMビオチン化N(A2B2)A-avi-Hisへのファージミド粒子の0.5時間の結合、5.ビオチン化N(A2B2)A-avi-Hisタンパク質の捕捉、及び5.4×107ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加による特異的に結合したファージ粒子の10分間の捕捉、6.5×1ml PBS/Tween20及び5×1ml PBSを使用したビーズの洗浄、7.1mlの100mM TEAの添加によるファージ粒子の10分間の溶出、及び500μlの1M Tris/HCl pH 7.4ファージを添加することによる中和、8.指数関数的に増殖する大腸菌TG1細菌の感染、9.ヘルパーVCSM13による感染、及び10.続くファージミド粒子(その後の選択ラウンドで使用する)のPEG/NaCl沈殿。減少する抗原濃度(20×10-9M、10×10-9M、及び2×10-9M)を使用して3回にわたって選択を行った。第3ラウンドでは、ストレプトアビジンビーズを20×1mlのPBS/Tween20及び5×1mlのPBSで洗浄した。
親和性成熟クローンの選択のために、3つ全てのライブラリを用いたファージディスプレイ選択を、組換え可溶性抗原を用いて行った。パニングラウンドを、以下のパターンに従って溶液中で行った:1.200nMビオチン化NA(B2)A-avi-His及びNABA-avi-hisと0.5時間インキュベートすることによる非特異的ファージミド粒子の前除去、2.5.4×107ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを10分間添加することによるビオチン化NA(B2)A-avi-His、NABA-avi-his及び結合ファージミド粒子の捕捉、3.更なる選択のための上清からの非結合ファージミド粒子の単離、4.総体積1mlでの20nMビオチン化N(A2B2)A-avi-Hisへのファージミド粒子の0.5時間の結合、5.ビオチン化N(A2B2)A-avi-Hisタンパク質の捕捉、及び5.4×107ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加による特異的に結合したファージ粒子の10分間の捕捉、6.5×1ml PBS/Tween20及び5×1ml PBSを使用したビーズの洗浄、7.1mlの100mM TEAの添加によるファージ粒子の10分間の溶出、及び500μlの1M Tris/HCl pH 7.4ファージを添加することによる中和、8.指数関数的に増殖する大腸菌TG1細菌の感染、9.ヘルパーVCSM13による感染、及び10.続くファージミド粒子(その後の選択ラウンドで使用する)のPEG/NaCl沈殿。減少する抗原濃度(20×10-9M、10×10-9M、及び2×10-9M)を使用して3回にわたって選択を行った。第3ラウンドでは、ストレプトアビジンビーズを20×1mlのPBS/Tween20及び5×1mlのPBSで洗浄した。
特異的結合因子を、ELISAによって以下のように同定した:ウェルあたり100μlの10nMビオチン化N(A2B2)A-avi-Hisタンパク質又は40nMビオチン化NA(B2)A-avi-Hisタンパク質のいずれかをニュートラビジンプレート上にコーティングした。Fabを含む細菌の上清を加え、抗Flag/HRP二次抗体を使用して結合FabをそれらのFlagタグを介して検出した。NA(B2)A-avi-Hisタンパク質上ではなく、組換えN(A2B2)A-avi-Hisタンパク質上でELISA陽性であったクローンを、SPRによって更に試験した。
10.2.2.3 SPRによる親和性成熟A5H1EL1D由来変異体の同定
ELISA陽性クローンを更に特性評価するために、Proteon XPR36装置を使用して表面プラズモン共鳴によってオフレートを測定し、結果を親ヒト化クローンA5H1EL1Dと比較した。
ELISA陽性クローンを更に特性評価するために、Proteon XPR36装置を使用して表面プラズモン共鳴によってオフレートを測定し、結果を親ヒト化クローンA5H1EL1Dと比較した。
この実験のために、約2000、1000及び500 RUのビオチン化N(A2B2)A-avi-Hisを、ストレプトアビジン被覆NLCチップを垂直配向で使用して3つのチャネルに固定化した。非特異的結合の対照として、2000RUのビオチン化NA(B2)A-avi-Hisタンパク質をチャネル4に固定化した。同定されたELISA陽性クローンのオフレート分析のために、注入方向を水平配向に変更した。注射前に、各Fab含有細菌上清をフィルタにかけ、PBSで3倍希釈した。会合時間は100μl/分で100秒であり、解離時間は600秒又は1200秒のいずれかであった。Fab断片を含まない細菌上清を参照に使用した。再生を、50μl/分(垂直配向)で35秒間、10mMグリシンpH 1.5で行った。
解離速度定数(koff)を、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。最も遅い解離速度定数を有するFabを発現するクローンを同定し、候補を挙げた。以下に列挙したクローンを、同じ条件下で追加のSPR実験で再評価した。このとき、各注射中に、4つの親和性成熟クローンを親クローンA5H1EL1Dと並行して直接比較した。Fab断片を含まない細菌上清を参照に使用した。N(A2B2)A-avi-His上でA5H1EL1Dよりも遅い解離速度を示し、NA(B2)A-avi-Hisに結合しなかったクローンを選択し、対応するファージミドの可変ドメインを配列決定した。最良のクローンの測定された解離速度を表19に示し、それぞれの可変ドメインの配列を表20に列挙する。
10.2.2.4 親和性成熟A5H1EL1DクローンのFab精製
親和性成熟クローンを更に特性評価するために、動態パラメータの正確な分析のためにそれぞれのFab断片を精製した。各クローンについて、500mlの培養物に、対応するファージミドを有する細菌を接種し、600nmで測定した光学密度(OD600)が0.9の1mM IPTGで誘導した。その後、培養物を25℃で一晩インキュベートし、遠心分離により回収した。再懸濁したペレットを25mlのPPB緩衝液(30mM Tris-HCl pH8、1mM EDTA、20%ショ糖)で20分間インキュベートした後、細菌を再度遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーション工程を、25mlの5mM MgSO4溶液で1回繰り返した。両方のインキュベーション工程の上清をプールし、フィルタにかけ、IMACカラム(His gravitrap、GE Healthcare)にロードした。続いて、カラムを40mlの洗浄緩衝液(500mM NaCl、20mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH 7.4)で洗浄した。溶出後(500mM NaCl、500mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH 7.4)、PD10カラム(GE Healthcare)を使用して溶出液を再緩衝化した。精製タンパク質の収量は300~500μg/Lの範囲であった。
親和性成熟クローンを更に特性評価するために、動態パラメータの正確な分析のためにそれぞれのFab断片を精製した。各クローンについて、500mlの培養物に、対応するファージミドを有する細菌を接種し、600nmで測定した光学密度(OD600)が0.9の1mM IPTGで誘導した。その後、培養物を25℃で一晩インキュベートし、遠心分離により回収した。再懸濁したペレットを25mlのPPB緩衝液(30mM Tris-HCl pH8、1mM EDTA、20%ショ糖)で20分間インキュベートした後、細菌を再度遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーション工程を、25mlの5mM MgSO4溶液で1回繰り返した。両方のインキュベーション工程の上清をプールし、フィルタにかけ、IMACカラム(His gravitrap、GE Healthcare)にロードした。続いて、カラムを40mlの洗浄緩衝液(500mM NaCl、20mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH 7.4)で洗浄した。溶出後(500mM NaCl、500mMイミダゾール、20mM NaH2PO4 pH 7.4)、PD10カラム(GE Healthcare)を使用して溶出液を再緩衝化した。精製タンパク質の収量は300~500μg/Lの範囲であった。
10.2.2.5 精製された親和性成熟A5H1EL1D Fab断片のSPR分析
精製されたFab断片の親和性(KD)を、先に記載されたものと同じ設定を使用して、Proteon XPR36装置を使用する表面プラズモン共鳴によって測定した。
精製されたFab断片の親和性(KD)を、先に記載されたものと同じ設定を使用して、Proteon XPR36装置を使用する表面プラズモン共鳴によって測定した。
約2000、1000、500、及び250 RUのビオチン化N(A2B2)A-avi-Hisを、ストレプトアビジン被覆NLCチップの4つのチャネルに垂直配向で固定化した。非特異的結合の対照として、2000RUのビオチン化NA(B2)A-avi-Hisタンパク質をチャネル5に固定化した。精製クローンの親和性(KD)を決定するために、注射方向を水平配向に変更した。2倍希釈系列の精製Fab断片(100nM~3nMの様々な濃度範囲)を、100秒の会合時間及び1200秒の解離時間で、別々のチャネル1~5に沿って100μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。再生を、50μl/分(垂直配向)で35秒間、10mMグリシンpH 1.5で行った。
会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)を、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)を、比率koff/konとして計算した。動力学的及び熱力学的データを表21に列挙する。
10.2.2.6 親和性成熟クローンのCDR位置の組み合わせ
CEAに対する親和性を更に増加させる試みにおいて、いくつかの以前に同定された親和性成熟結合因子のCDR位置を互いに組み合わせた。これには、CDR内の特定の位置だけでなく、異なる結合因子からのCDRの組み合わせも含まれる。全てのクローン、ファージディスプレイ由来クローン及びコンビナトリアルクローンのアラインメントを図22A及び22Bに示す。全ての重鎖及び軽鎖のCDRをそれぞれ表22及び23に列挙する。VHドメイン及びVLドメインを表20に要約する。
CEAに対する親和性を更に増加させる試みにおいて、いくつかの以前に同定された親和性成熟結合因子のCDR位置を互いに組み合わせた。これには、CDR内の特定の位置だけでなく、異なる結合因子からのCDRの組み合わせも含まれる。全てのクローン、ファージディスプレイ由来クローン及びコンビナトリアルクローンのアラインメントを図22A及び22Bに示す。全ての重鎖及び軽鎖のCDRをそれぞれ表22及び23に列挙する。VHドメイン及びVLドメインを表20に要約する。
10.3 親和性成熟A5H1EL1D由来二重特異性抗体の作製及び特性評価
10.3.1 二重特異性抗体のクローニング、作製及び精製
全てのクローンの可変ドメインを合成し、ノブ・イントゥ・ホール変異及びPG-LALA変異と組み合わせたcrossmab技術に基づいて二重特異性1+1 IgG分子をコードするプラスミドにクローニングした。第2の結合部分はCD28に特異的であった。最終分子の概略説明を図1Jに示す。得られた分子は、表24に列挙された配列から構成される。親和性成熟結合因子(配列番号323~348)のVL及びVH配列を発現する全ての鎖の組み合わせを、CD28に特異的な2本の鎖(配列番号349及び350)と組み合わせた。
10.3.1 二重特異性抗体のクローニング、作製及び精製
全てのクローンの可変ドメインを合成し、ノブ・イントゥ・ホール変異及びPG-LALA変異と組み合わせたcrossmab技術に基づいて二重特異性1+1 IgG分子をコードするプラスミドにクローニングした。第2の結合部分はCD28に特異的であった。最終分子の概略説明を図1Jに示す。得られた分子は、表24に列挙された配列から構成される。親和性成熟結合因子(配列番号323~348)のVL及びVH配列を発現する全ての鎖の組み合わせを、CD28に特異的な2本の鎖(配列番号349及び350)と組み合わせた。
従来の(非PCRベースの)クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、(元は、ATCCより受託し、Evitriaにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した)懸濁適応性CHO K1細胞を用い、Evitriaにより、得られたコンストラクトを調製した。産生のために、Evitriaは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地(eviGrow及びeviMake2)、並びに、専有のトランスフェクション試薬(eviFect)を用いた。タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐに中和した。タンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
10.3.2 SPRによる選択された抗体の親和性決定
親抗体A5H1EL1D及びその親和性成熟誘導体の親和性(KD)を、ProteOn XPR36装置(Biorad)を用いて25℃でSPRによって測定した。
親抗体A5H1EL1D及びその親和性成熟誘導体の親和性(KD)を、ProteOn XPR36装置(Biorad)を用いて25℃でSPRによって測定した。
約2000、1000、500、及び250 RUのビオチン化N(A2B2)A-avi-His を、ストレプトアビジン被覆NLCチップの4つのチャネルに垂直配向で固定化した。非特異的結合の対照として、2000RUのビオチン化NA(B2)A-avi-Hisタンパク質をチャネル5に固定化した。精製二重特異性コンストラクトの親和性(KD)を決定するために、注射方向を水平配向に変更した。精製二重特異性IgGの2倍希釈系列(25~1.56nMの様々な濃度範囲)を、180秒の会合時間及び1200秒の解離時間で、別々のチャネル1~5に沿って100μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。再生を、50ul/分(垂直配向)で20秒間、10mMグリシンpH 1.5で行った。
会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)を、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)を、koff/konの比として計算した。全ての動力学的及び熱力学的データを表25に列挙する。ファージディスプレイ選択によって同定された親和性成熟クローンについて、より高い親和性(より低いKD値)が観察された。更に、交換されたCDR及びCDR位置との組み合わせを試験した。いくつかの組み合わせ(例えば、クローン「P005.103-combo2」及び「P005.102-combo1」)は、非常に遅い解離速度、結果として非常に高い親和性をもたらしたが、2つのコンビナトリアルクローン(クローンP006.038-combo1」及び「P006.038-combo2」)では親和性が有意に低下した。
実施例11
CD28及び癌胎児性抗原(CEA)を標的とする更なる二重特異性抗原結合分子の作製
11.1 二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。得られた分子の概略説明を図23に示す。Fcドメインにおいて、国際特許出願国際公開第2012/130831に記載の方法に従い、Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異(S354C/T366W変異、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)又は「ホール」変異(Kabat EUインデックスによるY349C/T366S/L368A/Y407V突然変異)のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。国際特許出願の国際公開第2015/150447号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。抗CEAクローンT84.66の生成及び調製は、国際公開第2016/075278号A2に記載されている。
CD28及び癌胎児性抗原(CEA)を標的とする更なる二重特異性抗原結合分子の作製
11.1 二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。得られた分子の概略説明を図23に示す。Fcドメインにおいて、国際特許出願国際公開第2012/130831に記載の方法に従い、Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異(S354C/T366W変異、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)又は「ホール」変異(Kabat EUインデックスによるY349C/T366S/L368A/Y407V突然変異)のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。国際特許出願の国際公開第2015/150447号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。抗CEAクローンT84.66の生成及び調製は、国際公開第2016/075278号A2に記載されている。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図23A~23Dに示す:
分子11A:CEA(A5H1EL1D)-CD28(SA)1+1フォーマット、配列番号351、352、353及び354のアミノ酸配列を含む、CD28(SA)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(A5H1EL1D)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE4773)(図23A)。
分子11B:CEA(A5H1EL1D)-CD28(SA_変異体8)1+1フォーマット、配列番号351、352、355及び356のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体8)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(A5H1EL1D)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE4774)(図23A)。
分子11C:CEA(A5H1EL1D)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号351、352、357及び358のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(A5H1EL1D)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE4775)(図23A)。
分子11D:CEA(A5H1EL1D)-CD28(SA_変異体29)1+1フォーマット、配列番号351、352、359及び354のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体29)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(A5H1EL1D)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE4776)(図23A)。
分子11E:CEA(A5H1EL1D)-CD28(SA)1+1フォーマット、CD28(SA)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及び配列番号360、361、362及び363(P1AE4777)のアミノ酸配列を含むCEA(A5H1EL1D)Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図23B)。
分子11F:CEA(A5H1EL1D)-CD28(変異体8)1+1フォーマット、CD28(変異体8)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及び配列番号360、361、364及び365(P1AE4780)のアミノ酸配列を含むCEA(A5H1EL1D)Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図23B)。
分子11G:CEA(A5H1EL1D)-CD28(変異体15)1+1フォーマット、CD28(変異体15)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及び配列番号360、361、366及び367(P1AE4791)のアミノ酸配列を含むCEA(A5H1EL1D)Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図23B)。
分子11H:CEA(A5H1EL1D)-CD28(変異体29)1+1フォーマット、CD28(変異体29)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及び配列番号360、361、368及び363(P1AE4793)のアミノ酸配列を含むCEA(A5H1EL1D)Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図23B)。
分子11I:CEA(T84.66)-CD28(SA)1+1フォーマット、配列番号369、370、353及び354のアミノ酸配列を含む、CD28(SA)Fabフラグメント(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(T84.66)Fabフラグメント(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1PG-LALAクロスFab分子(P1AE6488)(図23A)。
分子11J:CEA(T84.66)-CD28(SA_変異体29)1+1フォーマット、配列番号369、370、359及び354のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体29)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(T.84.66)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE6495)(図23A)。
分子11K:CEA(T84.66)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号369、370、357及び358のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(T84.66)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE6557)(図23A)。
分子11L:CEA(T84.66)-CD28(SA_変異体8)1+1フォーマット、配列番号369、370、355及び356のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体8)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(T84.66)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE6556)(図23A)。
分子11M:CEA(T84.66)-CD28(変異体29)1+1フォーマット、CD28(変異体29)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及び配列番号371、372、368及び363(P1AE9605)のアミノ酸配列を含むCEA(T84.66)Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図23B)。
分子11N:CEA(T84.66)-CD28(変異体8)1+1フォーマット、CD28(変異体8)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及び配列番号371、372、366及び367(P1AE9606)のアミノ酸配列を含むCEA(T84.66)Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図23B)。
分子11O:CEA(T84.66)-CD28(変異体15)1+1フォーマット、配列番号371、372、364及び365のアミノ酸配列を含む、CD28(変異体15)Fab断片(ノブ)中のVH/VL交換及びCEA(T84.66)Fab断片(ホール)中の荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE9607)(図23B)。
分子11P:CEA(A5H1EL1D)-CD28(SA-変異体29)2+1、二重特異性一価抗CD28(SA_変異体29)及び二価抗CEA huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、頭部と尾部が互いに融合した両方の抗CEA Fab断片における荷電修飾(ホール)、抗CD28クロスFab断片におけるVH/VL交換(ノブ)(図23)。分子は、配列番号368、362、361及び373(P1AE6924)のアミノ酸配列を含む。
分子11Q:CEA(A5H1EL1D)-CD28(SA_変異体29)2+1、二重特異性一価抗CD28(SA)及び二価抗CEA huIgG1 PG-LALA クロスFabコンストラクト、「古典的配向」、抗CD28クロスFab断片におけるVH/VL交換、両方の抗CEA FAP Fab断片における荷電修飾(図23D)。分子は、配列番号368、374、361及び360(P1AE6925)のアミノ酸配列を含む。
分子11R:CEA(P002.139)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号375、376、357及び358のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(P002.139)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AE8371)(図23A)。
分子11S:CEA(P002.139)-CD28(SA_変異体8)1+1フォーマット、配列番号375、376、355及び356のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体8)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(P002.139)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AF1115)(図23A)。
分子11T:CEA(P002.139)-CD28(SA_変異体11)1+1フォーマット、配列番号375、376、355及び354のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体11)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びCEA(P002.139)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AF1116)(図23A)。
比較のため、以下の抗CD28抗体変異体を作製した:
比較のため、以下の抗CD28抗体変異体を作製した:
分子11U:CD28(SA_変異体8)(PG-LALA)、huIgG1 PG-LALAアイソタイプ(図1B)におけるCD28(SA_変異体8)抗体は、配列番号377及び配列番号378のアミノ酸配列を含む(P1AE7035)。
分子11V:CD28(SA_変異体11)(PG-LALA)、huIgG1 PG-LALAアイソタイプ(図1B)におけるCD28(SA_変異体11)抗体は、配列番号379及び配列番号380のアミノ酸配列を含む(P1AE7036)。
分子11W:CD28(SA_変異体15)(PG-LALA)、huIgG1 PG-LALAアイソタイプ(図1B)におけるCD28(SA_変異体15)抗体は、配列番号381及び配列番号382のアミノ酸配列を含む(P1AE7037)。
分子11X:CD28(SA_変異体27)(PG-LALA)、huIgG1 PG-LALAアイソタイプ(図1B)におけるCD28(SA_変異体27)抗体は、配列番号383及び配列番号384のアミノ酸配列を含む(P1AE7038)。
分子11Y:CD28(SA_変異体29)(PG-LALA)、huIgG1 PG-LALAアイソタイプ(図1B)におけるCD28(SA_変異体29)抗体は、配列番号385及び配列番号386のアミノ酸配列を含む(P1AE7039)。
11.2 分子の製造
上記の分子の発現は、キメラMPSVプロモーター又はCMVプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
上記の分子の発現は、キメラMPSVプロモーター又はCMVプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
分子11A~11D及び11I~11Tの産生のために、懸濁状態で成長するHEK293-EBNA細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを使用してそれぞれの発現ベクターで同時トランスフェクトした。HEK293 EBNA細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたCD CHO培地と交換した。CD CHO培地中で発現ベクターを混合し、PEIを添加し、溶液をボルテックスして室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合して、振蕩フラスコに移し、5%CO2雰囲気のインキュベータ内で、3時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むExcell培地を添加した(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing、編者:Weichang Zhou,Anne Kantardjieff)。トランスフェクションの1日後、サプリメント(フィード)を添加した(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing、編者:Weichang Zhou,Anne Kantardjieff)。細胞上清を遠心分離及びその後、フィルタにかけ(0.2μmフィルタ)によって7日後に回収し、標準的な方法によって精製した。
従来の(非PCRベースの)クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、(元は、ATCCより受託し、Evitriaにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した)懸濁適応性CHO K1細胞を用い、Evitriaにより、分子11U、11V、11W、11X及び11Yを調製した。産生のために、Evitriaは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地(eviGrow及びeviMake2)、並びに、専有のトランスフェクション試薬(eviFect)を用いた。遠心分離、及びその後の濾過(0.2μmフィルタ)により上清を回収し、標準的な方法により精製した。分子11E、11F、11G及び11Hを、それらの標準的な方法及びプロトコルに従ってProterosによって生成及び精製した。
11.3 分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(平衡化緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.5;溶出緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、pH 3.0)によって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐにpH 中和した。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(物品番号:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(平衡化緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.5;溶出緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、pH 3.0)によって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐにpH 中和した。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(物品番号:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
11.4 CD28及び癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子の分析データ
Pace,et al.,Protein Science,1995,4,2411-1423に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、280nmにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。LabChipGXII(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表26に示す。
Pace,et al.,Protein Science,1995,4,2411-1423に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、280nmにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。LabChipGXII(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表26に示す。
11.5 SPRによるCD28及び癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子の結合解析
抗CEA抗体A5H1EL1D及び抗CD28結合因子変異体8、11及び29並びに元の結合因子CD28(SA)を有する分子10A~10DのCD28に対する親和性(KD)を、Proteon XPR36装置を使用して表面プラズモン共鳴によって測定した。組換え抗原(リガンド)の固定化のために、huCD28-FcをPBST(10mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウムpH 7.4、0.005%Tween20)で100~500nMの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で25μl/分で注射した。これにより、垂直方向で500~3000応答単位(RU)の間の固定化レベルが得られた。
抗CEA抗体A5H1EL1D及び抗CD28結合因子変異体8、11及び29並びに元の結合因子CD28(SA)を有する分子10A~10DのCD28に対する親和性(KD)を、Proteon XPR36装置を使用して表面プラズモン共鳴によって測定した。組換え抗原(リガンド)の固定化のために、huCD28-FcをPBST(10mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウムpH 7.4、0.005%Tween20)で100~500nMの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で25μl/分で注射した。これにより、垂直方向で500~3000応答単位(RU)の間の固定化レベルが得られた。
精製分子の親和性(KD)を決定するために、注射方向を水平配向に変更した。2倍希釈系列の精製コンストラクト(100~6.25nMの様々な濃度範囲)を、150秒の会合時間及び400秒の解離時間で、別々のチャネル1~5に沿って100μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。再生を、50μl/分(垂直配向)で35秒間、10mMグリシンpH 1.5で行った。会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)を、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)を、比率koff/konとして計算した。動力学的及び熱力学的データを表27に列挙する。
11.6 抗CD28 IgG変異体及び選択された1+1二重特異性CEA標的化抗CD28抗原結合分子の生化学的特性評価
それらの生化学的及び生物物理学的特性を特性評価し、比較するために、以下の分子を詳細に分析した:CEA標的化抗CD28二重特異性変異体分子10A~10D及び抗CD28 IgG変異体分子10U~10Y。結果を表27及び28に要約する。
それらの生化学的及び生物物理学的特性を特性評価し、比較するために、以下の分子を詳細に分析した:CEA標的化抗CD28二重特異性変異体分子10A~10D及び抗CD28 IgG変異体分子10U~10Y。結果を表27及び28に要約する。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)
見かけの疎水性は、20μgの試料を25mMリン酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウム、pH 7.0で平衡化したHIC-Ether-5PW(Tosoh)カラムに注入することにより決定した。溶出は、0~100%の緩衝液B(25mMリン酸ナトリウム、pH 7.0)の直線勾配で60分以内に行った。保持時間を、既知の疎水性を有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、0~0.35の相対保持時間を示す。
見かけの疎水性は、20μgの試料を25mMリン酸ナトリウム、1.5M硫酸アンモニウム、pH 7.0で平衡化したHIC-Ether-5PW(Tosoh)カラムに注入することにより決定した。溶出は、0~100%の緩衝液B(25mMリン酸ナトリウム、pH 7.0)の直線勾配で60分以内に行った。保持時間を、既知の疎水性を有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、0~0.35の相対保持時間を示す。
熱安定性
試料を、20mM ヒスチジン/ヒスチジンクロリド、140mM NaCl中、pH 6.0で1mg/mLの濃度にて調製し、0.4μmフィルタプレートで遠心分離して光学384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学的半径を、試料を25℃から80℃まで0.05℃/分の速度で加熱しながら、DynaProプレートリーダー(ワイアット)で動的光散乱法によって繰り返し測定した。
試料を、20mM ヒスチジン/ヒスチジンクロリド、140mM NaCl中、pH 6.0で1mg/mLの濃度にて調製し、0.4μmフィルタプレートで遠心分離して光学384ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学的半径を、試料を25℃から80℃まで0.05℃/分の速度で加熱しながら、DynaProプレートリーダー(ワイアット)で動的光散乱法によって繰り返し測定した。
FcRnアフィニティークロマトグラフィー
Cymer,Schlothauer et al.,Bioanalysis 2017,9(17),doi.org/10.4155/bio-2017-0109に記載されているように、FcRnを発現させ、精製し、ビオチン化した。カップリングのために、調製した受容体をストレプトアビジン-セファロース(GE Healthcare)に加えた。得られたFcRn-セファロースマトリックスをカラムハウジングに充填した。カラムを20mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)、140mM NaCl、pH 5.5(溶離液A)で0.5ml/分の流速で平衡化した。30μgの抗体試料を溶離液Aで1:1の容量比で希釈し、FcRnカラムにアプライした。カラムを5カラム容量の溶離液Aで洗浄し、続いて20~100%の直線勾配で35カラム容量の20mM Tris/HCl、140mM NaCl、pH 8.8(溶離液B)で溶出した。分析を25℃のカラムオーブンを用いて行った。溶出プロファイルを、280nmでの吸光度の連続測定によって監視した。保持時間を、既知のアフィニティーを有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、0~1の相対保持時間を示す。
Cymer,Schlothauer et al.,Bioanalysis 2017,9(17),doi.org/10.4155/bio-2017-0109に記載されているように、FcRnを発現させ、精製し、ビオチン化した。カップリングのために、調製した受容体をストレプトアビジン-セファロース(GE Healthcare)に加えた。得られたFcRn-セファロースマトリックスをカラムハウジングに充填した。カラムを20mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)、140mM NaCl、pH 5.5(溶離液A)で0.5ml/分の流速で平衡化した。30μgの抗体試料を溶離液Aで1:1の容量比で希釈し、FcRnカラムにアプライした。カラムを5カラム容量の溶離液Aで洗浄し、続いて20~100%の直線勾配で35カラム容量の20mM Tris/HCl、140mM NaCl、pH 8.8(溶離液B)で溶出した。分析を25℃のカラムオーブンを用いて行った。溶出プロファイルを、280nmでの吸光度の連続測定によって監視した。保持時間を、既知のアフィニティーを有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、0~1の相対保持時間を示す。
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ヘパリン親和性を、50mM Tris(pH 7.4)で平衡化したTSKgelヘパリン-5PW(Tosoh)カラムに30~50μgの試料を注入することによって決定した。溶出は、37分以内に0から100%の緩衝液B(50mMトリス、1M NaCl、pH 7.4mM)の直線勾配で行った。保持時間を、既知のアフィニティーを有するタンパク質標準と比較した。
ヘパリン親和性を、50mM Tris(pH 7.4)で平衡化したTSKgelヘパリン-5PW(Tosoh)カラムに30~50μgの試料を注入することによって決定した。溶出は、37分以内に0から100%の緩衝液B(50mMトリス、1M NaCl、pH 7.4mM)の直線勾配で行った。保持時間を、既知のアフィニティーを有するタンパク質標準と比較した。
試験した配列変異体はいずれも、全ての基準を満たし、試験した全ての生物物理学的及び生化学的特性に関して互いに有意に異ならない(表28及び29)。
実施例12
CD28及び癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
12.1 CEA発現MV3細胞上のCEACAM5への結合
A5H1EL1Dの親和性成熟がCEACAM5への結合の改善をもたらしたかどうかを評価するために、CEAを発現するように遺伝子改変されたMV3細胞に対するFACS結合アッセイを行った。図24に示すように、親和性成熟抗CEAクローンP002.139を有するCEA-CD28二重特異性抗体(分子11R、P1AE8371)EC50=4.1nM)は、A5H1EL1Dクローン(分子11C、P1AE4775)(EC50=20.4nM)よりもCEACAM5に対して優れた結合を示した。
CD28及び癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
12.1 CEA発現MV3細胞上のCEACAM5への結合
A5H1EL1Dの親和性成熟がCEACAM5への結合の改善をもたらしたかどうかを評価するために、CEAを発現するように遺伝子改変されたMV3細胞に対するFACS結合アッセイを行った。図24に示すように、親和性成熟抗CEAクローンP002.139を有するCEA-CD28二重特異性抗体(分子11R、P1AE8371)EC50=4.1nM)は、A5H1EL1Dクローン(分子11C、P1AE4775)(EC50=20.4nM)よりもCEACAM5に対して優れた結合を示した。
12.2 CEA標的化TCBと組み合わせたCEA-CD28二重特異性抗体のインビトロ機能性を分析するためのIL-2レポーターアッセイ
IL-2レポーター細胞(J1631,Promega)は、IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子操作されたJurkat T細胞である。TCB媒介性T細胞エフェクター機能を増強するCEA標的化CD28アゴニストの能力を評価するために、10000個のMKN45細胞/ウェルを、固定濃度のCEA-TCB(5nM)及び濃度範囲のCEA-CD28二重特異性抗体(14pM~10nM)と共に105個のIL-2レポーター細胞(E:T比10:1)と共にインキュベートした。37℃、5%CO2で6時間インキュベートした後、製造業者の指示に従って、OneGlo(E6120、Promega)を使用して発光を評価した。プレートをTecan Spark 10M Plate Readerによって読み取った。
IL-2レポーター細胞(J1631,Promega)は、IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子操作されたJurkat T細胞である。TCB媒介性T細胞エフェクター機能を増強するCEA標的化CD28アゴニストの能力を評価するために、10000個のMKN45細胞/ウェルを、固定濃度のCEA-TCB(5nM)及び濃度範囲のCEA-CD28二重特異性抗体(14pM~10nM)と共に105個のIL-2レポーター細胞(E:T比10:1)と共にインキュベートした。37℃、5%CO2で6時間インキュベートした後、製造業者の指示に従って、OneGlo(E6120、Promega)を使用して発光を評価した。プレートをTecan Spark 10M Plate Readerによって読み取った。
親和性成熟抗CEAクローンP002.139(分子11R、P1AE8371)又はクローンA5H1EL1D(分子11C、P1AE4775)のいずれかを担持するCEA-CD28二重特異性抗体の機能性を、CEA-TCB(5nM)と組み合わせてCEA発現MKN45細胞の存在下でIL-2レポーター細胞アッセイを用いて評価した。図25A及び25Bに示すように、親和性成熟クローンP002.139の改善された親和性は、クローンA5H1EL1Dと比較して、共刺激能力においてより高い効力に変換された。
実施例13
CEA TCBと組み合わせた、CD28及び癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビボ機能的特性評価
13.1 ヒト化マウスにおけるMKN45異種移植片におけるCEA-TCBと組み合わせた異なるCEA抗原結合ドメインを有するCEA-CD28二重特異性抗原結合分子を用いた有効性試験
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化NSGマウスにおける腫瘍退縮に関して、CEA-TCBと組み合わせたCEA-CD28二重特異性抗原結合分子のCEA-クローン依存的効力を理解することを目的とした。
CEA TCBと組み合わせた、CD28及び癌胎児性抗原(CEA)を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビボ機能的特性評価
13.1 ヒト化マウスにおけるMKN45異種移植片におけるCEA-TCBと組み合わせた異なるCEA抗原結合ドメインを有するCEA-CD28二重特異性抗原結合分子を用いた有効性試験
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化NSGマウスにおける腫瘍退縮に関して、CEA-TCBと組み合わせたCEA-CD28二重特異性抗原結合分子のCEA-クローン依存的効力を理解することを目的とした。
ヒトMKN45細胞(ヒト胃癌)は、ATCCから最初に得られ、増殖後、Glycart内部細胞バンクに寄託された。細胞を、5%CO2の水飽和雰囲気中、37℃で10%FCSを含有するDMEM中で培養した。インビトロ継代12を97%の生存率で皮下注射に使用した。50マイクロリットルのマトリゲルと混合した50マイクロリットルの細胞懸濁液(1×106個のMKN45細胞)を、22G~30Gの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に4~5週齢の雌NSGマウス(Jackson Laboratory)を、特定の病原体のいない条件に維持し、1日のサイクルは、関連するガイドライン(GV-Solas;Felasa;TierschG)に従って、12時間明状態/12時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された(ZH225-17)。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために1週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌性NSGマウスに、15mg/kgのブスルファンを腹腔内注射し、1日後、臍帯血から単離した1x105個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から14~16週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトT細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。その時点で、記載されているように(図26、0日目)マウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ150mm3(13日目)に達したときに化合物又はヒスチジン緩衝液(ビヒクル)で処理した。全てのマウスに、200μlの適切な溶液を静脈内注射した。200μl当たり適切な量の化合物を得るために、原液(表30)を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。
CEA-CD28及びCEA-TCBとの併用療法(群C及びD、図26)のために、二重特異性分子を同時に注射した。ノギスを用いて腫瘍増殖を週2回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した:
Tv:(W2/2)×L(W:幅、L:長さ)
Tv:(W2/2)×L(W:幅、L:長さ)
インビボ効力の測定値としての腫瘍増殖阻害値を、以下のようにRoche内部統計プログラムを用いて計算した:
試験は39日目に終了した。図27Aは、腫瘍増殖速度論(平均、+SEM)並びに群及びマウスあたりの個々の腫瘍増殖速度論を示す(図27B~27E)。本明細書に記載されるようにCEA-TCBは、単剤として、腫瘍増殖阻害をほとんど誘導しなかった。しかしながら、両方のCEA-CD28分子との組み合わせは、改善された腫瘍増殖阻害を示した。特に、CEAに対する親和性がより低い結合因子(A5H1EL1D)を含むCEA-TCBとCEA-CD28との組み合わせは、優れた腫瘍増殖退縮をもたらした。表31に示すように、CEA-TCBとCEA-CD28(huA5B7)との組み合わせ群について、最も高いTGI値(TGI:116%)を計算し、最も強い抗腫瘍効果を示した。TGIは腫瘍増殖阻害を意味し、TGI>100は腫瘍退縮を意味し、TGI=100を腫瘍静止(tumor stasis)と定義する。
13.2 ヒト化マウスにおけるBXPC3異種移植片におけるCEACAM5-TCB及び抗PDL1抗体と組み合わせた3つの異なるCD28抗原結合ドメインを有するCEA-CD28二重特異性抗原結合分子を用いた有効性試験
この有効性研究は、完全ヒト化NSGマウスにおける腫瘍退縮及びImmunoPDパターンに関して、CEACAM5-TCB及び抗PD-L1と組み合わせたCEA-CD28分子のCD28抗原結合ドメインの親和性の影響を理解することを目的とした。本研究では、3つの異なる親和性変異体を試験した(変異体8<変異体15<変異体29)。
この有効性研究は、完全ヒト化NSGマウスにおける腫瘍退縮及びImmunoPDパターンに関して、CEACAM5-TCB及び抗PD-L1と組み合わせたCEA-CD28分子のCD28抗原結合ドメインの親和性の影響を理解することを目的とした。本研究では、3つの異なる親和性変異体を試験した(変異体8<変異体15<変異体29)。
ヒトBXPC3細胞(ヒト膵臓がん細胞株)は、元々、ECACC(European Collection of Cell Culture)から得られ、増殖後、Roche Glycart internal cell bankに寄託された。BXPC3細胞を、1%Glutamaxと共に10%FCS(PAA Laboratories、Austria)を含有するRPMI中で培養した。細胞を37°C、水飽和雰囲気、5%CO2で培養した。インビトロ継代20を、95%を超える生存率で皮下注射に使用した。50マイクロリットルのマトリゲルと混合した50マイクロリットルの細胞懸濁液(1×106個のBXPC3細胞)を、22G~30Gの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に4~5週齢の雌NSGマウス(Jackson Laboratory)を、特定の病原体のいない条件に維持し、1日のサイクルは、関連するガイドライン(GV-Solas;Felasa;TierschG)に従って、12時間明状態/12時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された(ZH225-17)。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために1週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌性NSGマウスに、15mg/kgのブスルファンを腹腔内注射し、1日後、臍帯血から単離した1x105個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から14~16週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスを、そのヒトT細胞の頻度に従って、異なる処置群A~Fに無作為に分けた。その時点で、図28記載されているようにマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ150mm3(20日目)に達したときに化合物又はヒスチジン緩衝液(ビヒクル)で処理した。全てのマウスに、200μlの適切な溶液を静脈内注射した。200μl当たり適切な量の化合物を得るために、原液(表32)を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。
終了時(52日目)に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出し、秤量し、その後のFACS分析のためにコラゲナーゼV及びDNAseによる酵素消化によって単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞を、ヒトCD45、CD3、CD8及びCD4について染色し、FACS BDFortessaで分析した。
図29は、全ての処置群についての腫瘍増殖速度論(平均、+SEM)を示し、各処置群の対応するTGI値を以下の表33に示す。本明細書に記載されるように、CEACAM5 TCB単独療法並びにa-PD-L1との組み合わせは、腫瘍増殖阻害をほとんど誘導しなかった。CEACAM5-TCBとa-PD-L1との組み合わせへのCEA-CD28(SA_変異体8)の添加のみが腫瘍増殖阻害の増加をもたらした(TGI:75%)。変異体15も変異体29も抗腫瘍効果を増加させなかった。興味深いことに、試験終了時に屠殺した動物由来の腫瘍のImmuno-PDデータ(図30A~D)は、CEA-CD28変異体8によって誘導される更なる腫瘍増殖阻害も腫瘍内T細胞頻度の増加によって反映されることを明らかにした。図30Aは、各処置アームの染色された腫瘍単一細胞懸濁液の代表的なドットプロットを示す。CD3、CD8及びCD4 T細胞浸潤の概要をそれぞれ図30B、図30C及び30Dに示す。腫瘍におけるT細胞浸潤に関して、CEACAM5-TCBのみ又はa-PD-L1との組み合わせと比較して、CEA-CD28(SA_変異体15)又はCEA-CD28(SA_変異体29)で処置した群において統計的差異は観察されなかった。最も強いImmunoPD効果は、CEA-CD28(SA_変異体8)で検出されている。
13.3 ヒト化NSGマウスにおけるMKN45異種移植片におけるCEA TCBと組み合わせたCEA-CD28二重特異性抗原結合分子による有効性試験
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化NSGマウスにおける腫瘍退縮及びImmunoPDパターンに関して、第2のヒト異種移植モデルにおいてCEA-TCBとCEA-CD28(SA_変異体8)との組み合わせを試験することを目的とした。
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化NSGマウスにおける腫瘍退縮及びImmunoPDパターンに関して、第2のヒト異種移植モデルにおいてCEA-TCBとCEA-CD28(SA_変異体8)との組み合わせを試験することを目的とした。
ヒトMKN45細胞(ヒト胃癌)は、ATCCから最初に得られ、増殖後、Glycart内部細胞バンクに寄託された。細胞を、5%CO2の水飽和雰囲気中、37℃で10%FCSを含有するDMEM中で培養した。インビトロ継代12を>95%の生存率で皮下注射に使用した。50マイクロリットルのマトリゲルと混合した50マイクロリットルの細胞懸濁液(1×106個のMKN45細胞)を、22G~30Gの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。実験開始時に4~5週齢の雌NSGマウス(Jackson Laboratory)を、特定の病原体のいない条件に維持し、1日のサイクルは、関連するガイドライン(GV-Solas;Felasa;TierschG)に従って、12時間明状態/12時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された(ZH225-17)。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために1週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌性NSGマウスに、15mg/kgのブスルファンを腹腔内注射し、1日後、臍帯血から単離した1x105個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から14~16週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトT細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。その時点で、図31に記載されるようにマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ150mm3(13日目)に達したときに分子又はヒスチジン緩衝液(ビヒクル)で処理した。全てのマウスに、200μlの適切な溶液を静脈内注射した。200μl当たり適切な量の化合物を得るために、原液(表34)を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。
併用療法(群C、図31)のために、コンストラクトを同時に注射した。ノギスを用いて腫瘍増殖を週2回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した:
Tv:(W2/2)×L(W:幅、L:長さ)
Tv:(W2/2)×L(W:幅、L:長さ)
インビボ効力の測定値としての腫瘍増殖阻害値を、先の実施例12.1に記載されるようにRoche内部統計プログラムを用いて計算した。
終了時(48日目)に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出し、秤量し、その後のFACS分析のためにコラゲナーゼV及びDNAseによる酵素消化によって単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞を、ヒトCD45及びCD3について染色し、FACS BDFortessaで分析した。
図32は、全ての処置群についての腫瘍増殖速度論(平均、+SEM)を示し、各処置群の対応するTGI値を以下の表35に示す。本明細書に記載されるように、CEA-TCB単独療法は、84%のTGI値で腫瘍増殖阻害を誘導した。しかしながら、CEA-CD28(SA_変異体8)との併用処置は、優れた腫瘍増殖阻害をもたらした(TGI:101%)。更に、試験終了時に屠殺した動物由来の腫瘍のImmuno-PDデータ(図3)は、CEA-TCBと組み合わせたCEA-CD28(SA_変異体8)によって誘導される強力な腫瘍増殖阻害も腫瘍内T細胞頻度の増加によって反映されることを明らかにした。図33Aは、各処置アームの染色された腫瘍単一細胞懸濁液の代表的なドットプロットを示す。CD3+T細胞浸潤の概要を図33Bに示す。
実施例14
CD28及び上皮細胞接着分子(EpCAM)、HER3、CD30又は栄養膜細胞糖タンパク質(TPBG)を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成及び産生
14.1 CD28及びEpCAM、HER3、CD30又はTPBGを標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。Fcドメインにおいて、国際特許出願国際公開第2012/130831に記載の方法に従い、Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異(S354C/T366W変異、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)又は「ホール」変異(Kabat EUインデックスによるY349C/T366S/L368A/Y407V突然変異)のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。国際特許出願の国際公開第2015/150447号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。
CD28及び上皮細胞接着分子(EpCAM)、HER3、CD30又は栄養膜細胞糖タンパク質(TPBG)を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成及び産生
14.1 CD28及びEpCAM、HER3、CD30又はTPBGを標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。Fcドメインにおいて、国際特許出願国際公開第2012/130831に記載の方法に従い、Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異(S354C/T366W変異、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)又は「ホール」変異(Kabat EUインデックスによるY349C/T366S/L368A/Y407V突然変異)のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。国際特許出願の国際公開第2015/150447号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。
抗EpCAM抗体MT201(アデカツムマブ)の作製及び調製は、米国特許第7,632,925号B2に記載されている。抗HER3抗体(ルムレツズマブ)の産生は、国際公開第2011/076683号A1に記載されている。抗CD30抗体ブレンツキシマブは、国際公開第02/34661号A2に開示されている。抗TPBG抗体、例えばFAB091の作製及び調製は、国際公開第2017/072207号A1に記載されている。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図34A~図34Dに示す:
分子14A:EpCAM(MT201)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号366、367、390及び391(P1AE9051)のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及びEpCAM(MT201)Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図34A)。
分子14B:HER3(ルムレツズマブ)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号357、358、392及び393(P1AF0151)のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及び抗HER3 Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を有する二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図34B)。
分子14C:CD30(ブレンツキシマブ)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号357、358、394及び395のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及び抗CD30 Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AF1751)(図34C)。
分子14D:TPBG(FAB091)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号357、358、396及び397のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及び抗TPBG Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AF1752)(図34D)。
14.2 分子の製造
上記の分子の発現は、キメラMPSVプロモーター又はCMVプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
上記の分子の発現は、キメラMPSVプロモーター又はCMVプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
HEK293 EBNA細胞、又はCHO EBNA細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたCD CHO培地(Thermo Fisher,カタログ番号10743029)に交換した。CD CHO培地中で発現ベクターを混合し、PEI(ポリエチレンイミン、Polysciences,Inc,カタログ番号23966-1)を添加し、溶液をボルテックスして室温で10分間インキュベートした。その後、細胞(2Mio/mL)をベクター/PEI溶液と混合して、フラスコに移し、5% CO2雰囲気の振盪インキュベータ内で、3時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、補充液(全体積の80%)を含むExcell培地を添加した(W.Zhou and A.Kantardjieff,Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing,DOI:10.1007/978-3-642-54050-9;2014)。トランスフェクションの1日後に、補充液(Feed、全体積の12%)を添加した。7日後に、遠心分離、及びその後の濾過(0.2μmフィルタ)により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
14.3 分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(平衡化緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.5;溶出緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、pH 3.0)によって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐにpH 中和した。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(物品番号:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(平衡化緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.5;溶出緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、pH 3.0)によって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐにpH 中和した。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(物品番号:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
14.4 二重特異性CD28抗原結合分子の分析データ
Pace,et al.,Protein Science,1995,4,2411-1423に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、280nmにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。LabChipGXII(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表36に示す。
Pace,et al.,Protein Science,1995,4,2411-1423に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、280nmにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。LabChipGXII(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表36に示す。
実施例15
CD28及びEpCAM、HER3、CD30又はTPBGを標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
15.1 EpCAM-CD28のEpCAM及びCD28発現細胞への結合
中間親和性CD28クローン変異体15(P1AE9051)を担持するEpCAM-CD28(分子14A)のEpCAMへの結合を、HT-29細胞(ATCC#HTB-38)を用いて試験し、ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。
CD28及びEpCAM、HER3、CD30又はTPBGを標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
15.1 EpCAM-CD28のEpCAM及びCD28発現細胞への結合
中間親和性CD28クローン変異体15(P1AE9051)を担持するEpCAM-CD28(分子14A)のEpCAMへの結合を、HT-29細胞(ATCC#HTB-38)を用いて試験し、ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、FACS緩衝液(eBioscience、カタログ番号00-4222-26)に0.5 Mio細胞/mlで再懸濁した。5E4個の細胞を、漸増濃度のEpCAM-CD28コンストラクト(10pM~500nM)と共に4℃で1時間、丸底96ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で2回洗浄し、PE抱合体化ヤギ抗ヒトPE(Jackson ImmunoReserach、カタログ番号109-116-098)と共に4℃で更に30分間インキュベートし、冷FACS緩衝液で2回洗浄し、遠心分離し、1:10000に希釈したDAPI(Roche、カタログ番号10236276001)を含む85ul FACS緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗DP47 IgGを陰性対照として含めた。結合を、FACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism7を用いて結合曲線を得た。
インビトロ細胞結合アッセイにより、EpCAM-CD28(P1AE9051)二重特異性アゴニスト抗体が、HT-29細胞上のヒトCD28(図35A)及びヒトEpCAM(図35B)に濃度依存的様式で結合することが確認される。予想されたように、抗DP47 IgGでは結合が検出されず、このことは、結合の検出が、それぞれの標的化部分による特異的なCD28結合及びEpCAM結合に起因することを示している。
15.2 IL-2レポーターアッセイに基づくEpCAM-CD28分子のインビトロ機能的特性評価
EpCAM-CD28(分子14A)が抗CD3媒介T細胞活性化を支援する能力を評価するために、IL-2レポーター細胞(Promega、カタログ番号J1651)はエフェクター細胞(IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat T細胞株)としての役割を果たし、HT-29は腫瘍標的としての役割を果たした。1E4腫瘍標的細胞を、10nMの抗CD3(eBioscience#16-0037-85)単独の存在下又は濃度を増加させるEpCAM-CD28コンストラクト(24pM~100nM)と組み合わせた存在下、5E4 IL-2レポーター細胞(E:T 5:1)と共に、白色平底96ウェルプレート中、37°Cで6時間インキュベートした。測定の前に、プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで、100μlの基質(ONE-Glo溶液、Promega、カタログ番号E6120)を細胞に添加した。暗所での室温での10分間のインキュベーション後、Tecan Spark 10Mを用いて発光(カウント/秒)を測定した。
EpCAM-CD28(分子14A)が抗CD3媒介T細胞活性化を支援する能力を評価するために、IL-2レポーター細胞(Promega、カタログ番号J1651)はエフェクター細胞(IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat T細胞株)としての役割を果たし、HT-29は腫瘍標的としての役割を果たした。1E4腫瘍標的細胞を、10nMの抗CD3(eBioscience#16-0037-85)単独の存在下又は濃度を増加させるEpCAM-CD28コンストラクト(24pM~100nM)と組み合わせた存在下、5E4 IL-2レポーター細胞(E:T 5:1)と共に、白色平底96ウェルプレート中、37°Cで6時間インキュベートした。測定の前に、プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで、100μlの基質(ONE-Glo溶液、Promega、カタログ番号E6120)を細胞に添加した。暗所での室温での10分間のインキュベーション後、Tecan Spark 10Mを用いて発光(カウント/秒)を測定した。
一定の最適以下の抗CD3刺激と組み合わせたT細胞活性化を評価した。この目的のために、IL-2レポーターJurkat細胞を、漸増濃度のEpCAM-CD28(P1AE9051)及び固定された限界濃度の抗CD3 IgGクローンOKT3(10nM)の存在下において、EpCAM発現HT29細胞と6時間共培養した。図35Cに示されるように、EpCAM-CD28は、濃度依存的様式で最適以下のCD3刺激に曝露されたT細胞におけるIL-2産生の増加によって判断されるように、T細胞活性化を増強することができた。
15.3 HER3-及びCD28発現細胞へのHER3-CD28の結合
HER3に対する中間親和性CD28クローン変異体15(P1AF0151)を有するHER3-CD28(分子14B)の結合を、T-47D細胞(ATCC#HTB-133)を用いて試験し、ヒトCD28に対する結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。
HER3に対する中間親和性CD28クローン変異体15(P1AF0151)を有するHER3-CD28(分子14B)の結合を、T-47D細胞(ATCC#HTB-133)を用いて試験し、ヒトCD28に対する結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、FACS緩衝液(eBioscience、カタログ番号00-4222-26)に0.5 Mio細胞/mlで再懸濁した。5E4個の細胞を、漸増濃度のHER3-CD28コンストラクト(10pM~500nM)と共に4℃で1時間、丸底96ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で2回洗浄し、PE抱合体化ヤギ抗ヒトPE(Jackson ImmunoReserach、カタログ番号109-116-098)と共に4℃で更に30分間インキュベートし、冷FACS緩衝液で2回洗浄し、遠心分離し、1:10000に希釈したDAPI(Roche、カタログ番号10236276001)を含む85ul FACS緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗DP47 IgGを陰性対照として含めた。結合を、FACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism7を用いて結合曲線を得た。
FACS分析
T-47Dの表面におけるHER3の相対レベルを評価するために、2E5細胞を480×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。HER3(APC抗ヒト、BioLegend#324708)の表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を150ul/ウェルのPBSで1回洗浄し、150μl/ウェルのPBSに再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析した。
T-47Dの表面におけるHER3の相対レベルを評価するために、2E5細胞を480×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。HER3(APC抗ヒト、BioLegend#324708)の表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を150ul/ウェルのPBSで1回洗浄し、150μl/ウェルのPBSに再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析した。
インビトロ細胞結合アッセイにより、HER3-CD28(分子14B)二重特異性アゴニスト抗体が、細胞上のヒトCD28(図36A)及びヒトHER3(図36B)に濃度依存的様式で結合することが確認される。予想されたように、抗DP47 IgGでは結合が検出されず、このことは、結合の検出が、それぞれの標的化部分による特異的なCD28結合及びHER3結合に起因することを示している。
15.4 IL-2レポーターアッセイに基づくHER3-CD28分子のインビトロ機能的特性評価
HER3-CD28(分子14B)が抗CD3媒介T細胞活性化を支援する能力を評価するために、IL-2レポーター細胞(Promega、カタログ番号J1651)はエフェクター細胞(IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat T細胞株)としての役割を果たし、T-47Dは腫瘍標的としての役割を果たした。1E4腫瘍標的細胞を、10nMの抗CD3(eBioscience#16-0037-85)単独の存在下又は濃度を増加させるHER3-CD28コンストラクト(24pM~100nM)と組み合わせた存在下、5E4 IL-2レポーター細胞(E:T 5:1)と共に、白色平底96ウェルプレート中、37°Cで6時間インキュベートした。測定の前に、プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで、100ulの基質(ONE-Glo溶液、Promega、カタログ番号E6120)を細胞に添加した。暗所での室温での10分間のインキュベーション後、Tecan Spark 10Mを用いて発光(カウント/秒)を測定した。
HER3-CD28(分子14B)が抗CD3媒介T細胞活性化を支援する能力を評価するために、IL-2レポーター細胞(Promega、カタログ番号J1651)はエフェクター細胞(IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat T細胞株)としての役割を果たし、T-47Dは腫瘍標的としての役割を果たした。1E4腫瘍標的細胞を、10nMの抗CD3(eBioscience#16-0037-85)単独の存在下又は濃度を増加させるHER3-CD28コンストラクト(24pM~100nM)と組み合わせた存在下、5E4 IL-2レポーター細胞(E:T 5:1)と共に、白色平底96ウェルプレート中、37°Cで6時間インキュベートした。測定の前に、プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで、100ulの基質(ONE-Glo溶液、Promega、カタログ番号E6120)を細胞に添加した。暗所での室温での10分間のインキュベーション後、Tecan Spark 10Mを用いて発光(カウント/秒)を測定した。
一定の最適以下の抗CD3刺激と組み合わせたT細胞活性化を評価した。この目的のために、IL-2レポーターJurkat細胞を、漸増濃度のHER3-CD28(P1AF0151)及び固定された限界濃度の抗CD3 IgGクローンOKT3(10nM)の存在下において、EpCAM発現HT29細胞と6時間共培養した。図36Cに示されるように、EpCAM-CD28は、T細胞活性化、すなわち。濃度依存的様式で最適以下のCD3刺激に曝露されたT細胞におけるIL-2産生の増加を増強することができた。
15.5 PBMCアッセイにおけるTPBG-CD28及びCD30-CD28アゴニスト抗体のインビトロ機能的特性評価
抗CD3刺激によって媒介されるT細胞活性化を増強するTPBG(5T4)-CD28(分子14D)及びCD30-CD28(分子14C)の能力を、エフェクター細胞としての健常ドナー由来の初代PBMC T細胞、並びにJIMT-1、NCI-H1975、NCI-N87及びCalu-1細胞などの5T4発現標的細胞、又はKARPAS-299などのCD30発現標的細胞をそれぞれ用いて評価することになる。そのようなアッセイでは、1E4腫瘍標的細胞を、丸底96ウェルプレート中、37℃で5日間、最適以下の濃度の抗CD3(eBioscience#16-0037-85、クローンOKT3)単独の存在下、又は漸増濃度のCD28アゴニストコンストラクト(24pM~100nM)と組み合わせて、1E5(E:T 10:1)と共にインキュベートする。CD28標的分子の機能性をフローサイトメトリーによって評価し、T細胞活性化マーカー(CD25、CD69)及びT細胞増殖(CFSE希釈)を測定する。
抗CD3刺激によって媒介されるT細胞活性化を増強するTPBG(5T4)-CD28(分子14D)及びCD30-CD28(分子14C)の能力を、エフェクター細胞としての健常ドナー由来の初代PBMC T細胞、並びにJIMT-1、NCI-H1975、NCI-N87及びCalu-1細胞などの5T4発現標的細胞、又はKARPAS-299などのCD30発現標的細胞をそれぞれ用いて評価することになる。そのようなアッセイでは、1E4腫瘍標的細胞を、丸底96ウェルプレート中、37℃で5日間、最適以下の濃度の抗CD3(eBioscience#16-0037-85、クローンOKT3)単独の存在下、又は漸増濃度のCD28アゴニストコンストラクト(24pM~100nM)と組み合わせて、1E5(E:T 10:1)と共にインキュベートする。CD28標的分子の機能性をフローサイトメトリーによって評価し、T細胞活性化マーカー(CD25、CD69)及びT細胞増殖(CFSE希釈)を測定する。
実施例16
CD28及び多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子の作製
16.1 CD28及び多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。Fcドメインにおいて、国際特許出願国際公開第2012/130831に記載の方法に従い、Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異(S354C/T366W変異、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)又は「ホール」変異(Kabat EUインデックスによるY349C/T366S/L368A/Y407V突然変異)のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。国際特許出願の国際公開第2015/150447号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。
CD28及び多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子の作製
16.1 CD28及び多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。Fcドメインにおいて、国際特許出願国際公開第2012/130831に記載の方法に従い、Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異(S354C/T366W変異、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)又は「ホール」変異(Kabat EUインデックスによるY349C/T366S/L368A/Y407V突然変異)のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。国際特許出願の国際公開第2015/150447号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。
抗GPRC5D抗体5E11は、国際公開第2019/154890号A1に記載されているクローン5E11のヒト化バージョンである。抗CD38抗体、例えば、ダラツムマブは、国際公開第2006/99875号A1に開示されている。抗BCMA抗体の生成及び調製は、国際公開第2016/166629号A1に記載されている。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図37A~図37Cに示す:
分子16A:GPRC5D(5E11)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号366、367、398及び399のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及びGPRC5D(5E11)Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AF1272)(図37A)。
分子16B:GPRC5D(5E11)-CD28(SA_変異体8)1+1フォーマット、配列番号364、365、398及び399のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)中の荷電修飾及びGPRC5D(5E11)Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を有する二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(P1AF2954)(図37A)。
分子16C:CD38(ダラツムマブ)-CD28(SA_変異体15)1+1フォーマット、配列番号357、358、400及び401のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab中の荷電修飾及び抗CD38 Fab断片(ホール)中のVH/VL交換を有する二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図37B)(P1AE9038)。
分子16D:抗BCMA-CD28(SA_変異体15)1+1 フォーマット、配列番号366、367、402及び403のアミノ酸配列を含む、CD28(SA_変異体15)Fab断片(ノブ)におけるVH/VL交換及び抗BCMA Fab断片(ホール)における荷電修飾を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図34A)(P1AE9053)。
16.2 分子の製造
上記の分子の発現は、キメラMPSVプロモーター又はCMVプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
上記の分子の発現は、キメラMPSVプロモーター又はCMVプロモーターのいずれかによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
HEK293 EBNA細胞、又はCHO EBNA細胞を一過性トランスフェクションすることにより、抗体及び二重特異性抗体を生成した。細胞を遠心分離にかけて、培地を、予め暖めたCD CHO培地(Thermo Fisher,カタログ番号10743029)に交換した。CD CHO培地中で発現ベクターを混合し、PEI(ポリエチレンイミン、Polysciences,Inc,カタログ番号23966-1)を添加し、溶液をボルテックスして室温で10分間インキュベートした。その後、細胞(2Mio/mL)をベクター/PEI溶液と混合して、フラスコに移し、5% CO2雰囲気の振盪インキュベータ内で、3時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、補充液(全体積の80%)を含むExcell培地を添加した(W.Zhou and A.Kantardjieff,Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing,DOI:10.1007/978-3-642-54050-9;2014)。トランスフェクションの1日後に、補充液(Feed、全体積の12%)を添加した。7日後に、遠心分離、及びその後の濾過(0.2μmフィルタ)により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
あるいは、従来の(非PCRベースの)クローニング技術を伴う、専有のベクターシステムを使用し、(元は、ATCCより受託し、Evitriaにて懸濁培養液中での無血清増殖に適合した)懸濁適応性CHO K1細胞を用い、Evitriaにより、本明細書で記載される抗体及び二重特異性抗体を調製した。産生のために、Evitriaは、専有の動物構成成分非含有・無血清培地(eviGrow及びeviMake2)、並びに、専有のトランスフェクション試薬(eviFect)を用いた。遠心分離、及びその後の濾過(0.2μmフィルタ)により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
16.3 分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(平衡化緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.5;溶出緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、pH 3.0)によって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐにpH 中和した。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(物品番号:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(平衡化緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.5;溶出緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、pH 3.0)によって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐにpH 中和した。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(物品番号:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
16.4 二重特異性CD28抗原結合分子の分析データ
Pace,et al.,Protein Science,1995,4,2411-1423に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、280nmにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。LabChipGXII又はLabChip GX Touch(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。分子の精製パラメータの概要を表37に示す。
Pace,et al.,Protein Science,1995,4,2411-1423に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、280nmにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。LabChipGXII又はLabChip GX Touch(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。分子の精製パラメータの概要を表37に示す。
実施例17
CD28及び多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
17.1 指定の標的を過剰発現する、CD28及び多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子の細胞への結合
GPRC5D、BCMA、CD38又はCD28への結合を測定するために、本発明者らは、ヒトGPRC5D又はヒトCD28のいずれかを安定に過剰発現するように形質導入された報告された多発性骨髄腫細胞株(Lombardi et al.,Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics:insights into the biology of the diseas;Genes Chromosomes Cancer.2007,46(3),226-38)又はCHO形質移入体に対してFACSベースの結合アッセイを行い、IM-9細胞(ATCC(登録商標)CCL-159)を使用してBCMAへの結合を評価し、OCI-Ly18細胞(DSMZ ACC 699)を使用してCD38への結合を評価し、CHO-hGPRC5D細胞を使用してGPRC5Dへの結合を評価し、CHO-hCD28細胞を使用してCD28への結合を評価した。
CD28及び多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
17.1 指定の標的を過剰発現する、CD28及び多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原を標的とする二重特異性抗原結合分子の細胞への結合
GPRC5D、BCMA、CD38又はCD28への結合を測定するために、本発明者らは、ヒトGPRC5D又はヒトCD28のいずれかを安定に過剰発現するように形質導入された報告された多発性骨髄腫細胞株(Lombardi et al.,Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics:insights into the biology of the diseas;Genes Chromosomes Cancer.2007,46(3),226-38)又はCHO形質移入体に対してFACSベースの結合アッセイを行い、IM-9細胞(ATCC(登録商標)CCL-159)を使用してBCMAへの結合を評価し、OCI-Ly18細胞(DSMZ ACC 699)を使用してCD38への結合を評価し、CHO-hGPRC5D細胞を使用してGPRC5Dへの結合を評価し、CHO-hCD28細胞を使用してCD28への結合を評価した。
IM-9及びOCI-Ly18を製造者の説明書に従って培養し、安定なCHOトランスフェクタント(親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を、10%FCSを補充したF-12K中で培養した。簡潔には、懸濁細胞を回収し、計数し、生存率について確認した。接着性CHO細胞を、細胞解離緩衝液(Gibco)を使用して剥離し、計数し、生存率について確認した。その後の工程をいずれも4℃で行った。
細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し(PBS、2%ウシ胎児血清;1%0.5m EDTA pH 8;0.25%NaN3アジ化ナトリウム)、1 Mio細胞/mlでFACS緩衝液に再懸濁した。0.1 Mio細胞を丸底96ウェルプレートのウェルあたりに播種し、もう一度FACS緩衝液で洗浄し、上清を廃棄した。細胞を50ul/ウェルの総体積で染色し、表示のCD28二重特異性分子(0.07~300nM)の濃度を4℃で30分間増加させた。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、予め希釈した二次抗体(Alexa Fluor 488-AffiniPure F(ab’)2 Fragment Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific(Jackson Immunoresearch、109-546-008、FACS緩衝液で1:100に希釈、それぞれ109-606-008 PE、Jackson Immunoresearch、指示のとおりFACS緩衝液で1:100に希釈)を含む、1ウェル当たり合計25ulで4℃で30分間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、ソフトウェアFACS Divaを備えたBD Fortessaフローサイトメーターで分析した。GraphPadPrism6を用いて結合曲線及びEC50値を得た。
図38A~図38Fは、全ての二重特異性CD28分子が、ヒトCD28(A)とそれぞれの第2の標的、すなわちヒトCD38、ヒトBCMA又はヒトGPRC5Dとの両方に濃度依存的に結合することができることを示す。簡潔には、GPRC5D-CD28分子は、ヒトCD28への結合について最も低いEC50を有するが(表37)、他の2つのCD28二重特異性分子と比較してより低い最大結合に達する。
CD38及びBCMA標的CD28分子の両方が、それぞれCD38及びBCMAに対する濃度依存的結合を示し、評価した濃度範囲で飽和に達する(EC 50結合値を表38に要約する)。対照的に、GPRC5D-CD28分子は濃度依存的に結合しているが、同じ濃度範囲では飽和に達しず、これらの分子に含まれるCD38又はBCMA結合因子に対してGPRC5Dの親和性が低いことを示している。
17.2 IL-2レポーターアッセイに基づくインビトロ機能的特性評価(T細胞活性化の機能的特性評価)
TCB媒介T細胞活性化を支持するCD38-CD28、BCMA-CD28及びGPRC5D-CD28二重特異性抗原結合分子の能力を評価するために、IL-2レポーター細胞(Promega、カタログ番号J1651)をエフェクター細胞(IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat T細胞株)として使用し、また腫瘍標的として、CD38、BCMA並びにGPRC5Dに陽性であるNCI-H929細胞を使用した。
TCB媒介T細胞活性化を支持するCD38-CD28、BCMA-CD28及びGPRC5D-CD28二重特異性抗原結合分子の能力を評価するために、IL-2レポーター細胞(Promega、カタログ番号J1651)をエフェクター細胞(IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat T細胞株)として使用し、また腫瘍標的として、CD38、BCMA並びにGPRC5Dに陽性であるNCI-H929細胞を使用した。
簡潔には、5×103個の腫瘍標的細胞を、白色平底384ウェルプレート(353988 Falcon(商標)384-Well Flat-Bottom Tissue Culture Treated Microplate)中で、1nMのGPRC5D-TCB単独又は漸増濃度のCD28二重特異性分子(12.2~50nM)と組み合わせた存在下、2.5×104個のIL-2レポーター細胞(E:T 5:1)と共に、37℃で5時間、それぞれ22時間インキュベートした。測定の前に、プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで、20ulの基質(ONE-Glo溶液、Promega、カタログ番号E6120)を細胞に添加した。暗所での室温での10分間のインキュベーション後、Tecan Spark 10Mを用いて発光(カウント/秒)を測定した。
図39A~39Fに示されるように、いずれのMM標的化CD28分子も、TCBシグナルの非存在下でIL2 Jurkatレポーター細胞活性化を誘導しない(明るい灰色の線、図39A~9F)。予想されるように、これらのIL-2レポーター細胞では、1nM GPRC5D TCBの存在下でのレポーター細胞活性化の有意な誘導も、初期時点(5時間)でも後期時点(22時間後)でもなかった。
しかしながら、全てのMM標的化分子は、1nM GPRC5D-TCBの存在下でIL-2レポーター細胞の有意な濃度依存的及び時間依存的活性化を誘導することができる。CD38-CD28及びBCMA-CD28分子は、5時間後に既にIL2レポーター細胞活性化を誘導することができるが(図39A及び39C)、GPRC5D-CD28は、評価された後の時点(22時間、図39F)でのみ同様の最大活性レベルに達し、異なる活性速度論を示す。
実験に使用した抗GPRC5D/抗CD3二重特異性抗体(GPRC5D TCB、図37D)は、実施例8及び国際公開第2016/079076号A1に記載されているCEACAM5 TCBと同様に調製した。GPRC5D TCBは、配列番号398、配列番号399、配列番号404及び配列番号405のアミノ酸配列を含む。
17.3 多発性骨髄腫細胞株のT細胞媒介性溶解
CD38-CD28、BCMA-CD28及びGPRC5D-CD28が多発性骨髄腫細胞株のGPRC5D TCB媒介溶解を促進する能力を評価するために、1.5×105個のヒトpan Tエフェクター細胞を、3×104個のNCI-H929標的細胞と共に、1:1の最終E:T比で約22時間インキュベートした。製造業者の指示に従ってPan T細胞単離キット(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-096-535)を使用して、MACSによってPBMCからPan T細胞を単離した。GPRC5D TCBを漸増濃度(0.064pM~1nM)で添加し、異なるMM標的二重特異性CD28抗原結合分子を0.2nMの固定濃度で添加した。腫瘍細胞溶解を以下のように評価した:アッセイプレートを5分間遠心分離し、ウェルあたり50ulの上清を新しい96平底ウェルプレートに移した。正規化のために、標的細胞の最大溶解(=100%)を、1% Triton X-100の最終濃度での標的細胞のインキュベーションによって誘導した。最小溶解(=0%)は、エフェクター細胞と同時インキュベートされたが、二重特異性コンストラクト又はTCBを含まない標的細胞を指す。37℃、5%CO2で約22時間の一晩のインキュベーション後、上清へのアポトーシス/壊死標的細胞のLDH放出を、LDH検出キット(Roche Applied Science,#11 644 793 001)を使用して、製造業者の指示に従って測定した。
CD38-CD28、BCMA-CD28及びGPRC5D-CD28が多発性骨髄腫細胞株のGPRC5D TCB媒介溶解を促進する能力を評価するために、1.5×105個のヒトpan Tエフェクター細胞を、3×104個のNCI-H929標的細胞と共に、1:1の最終E:T比で約22時間インキュベートした。製造業者の指示に従ってPan T細胞単離キット(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-096-535)を使用して、MACSによってPBMCからPan T細胞を単離した。GPRC5D TCBを漸増濃度(0.064pM~1nM)で添加し、異なるMM標的二重特異性CD28抗原結合分子を0.2nMの固定濃度で添加した。腫瘍細胞溶解を以下のように評価した:アッセイプレートを5分間遠心分離し、ウェルあたり50ulの上清を新しい96平底ウェルプレートに移した。正規化のために、標的細胞の最大溶解(=100%)を、1% Triton X-100の最終濃度での標的細胞のインキュベーションによって誘導した。最小溶解(=0%)は、エフェクター細胞と同時インキュベートされたが、二重特異性コンストラクト又はTCBを含まない標的細胞を指す。37℃、5%CO2で約22時間の一晩のインキュベーション後、上清へのアポトーシス/壊死標的細胞のLDH放出を、LDH検出キット(Roche Applied Science,#11 644 793 001)を使用して、製造業者の指示に従って測定した。
図40a~図40Cに示すように、GPRC5D TCBは、NCI-H929細胞の濃度依存的溶解を誘導する。評価した3つ全てのMM標的二重特異性CD28抗原結合分子は、0.2nMの固定濃度で投与した場合、TCB単剤療法と比較して有効性を有意に増強することができる。更に、いずれのMM標的二重特異性CD28抗原結合分子も、TCBの非存在下で腫瘍細胞溶解を誘導しておらず、これは、MM標的分子のTCBシグナルへの依存性を支持する。
表39は、EC50値、並びに図40A~40Cに示すデータから導出された曲線下面積を要約する。EC50値を、GraphPadPrism6を使用して計算した。
実施例18
CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子の作製及び作製
18.1 CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
CD19抗体の作製及び調製は、国際公開第2017/55541号A1又は国際公開第2017/55328号A1に開示されている。特に、CD19クローン2B11は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/55328号A1に記載されている。本明細書で使用されるCD79bクローンhuMA 79b.v28(ポラツズマブに対応する)は、国際公開第2009/012268号Aに記載されている。それぞれの発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。得られた分子の概略説明をそれぞれ図41A及び41Bに示す。Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。非対称二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するために「ノブ」又は「ホール」突然変異のいずれかを含有した。二重及び多重特異性抗体コンストラクトにおける軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。
CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子の作製及び作製
18.1 CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
CD19抗体の作製及び調製は、国際公開第2017/55541号A1又は国際公開第2017/55328号A1に開示されている。特に、CD19クローン2B11は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/55328号A1に記載されている。本明細書で使用されるCD79bクローンhuMA 79b.v28(ポラツズマブに対応する)は、国際公開第2009/012268号Aに記載されている。それぞれの発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。得られた分子の概略説明をそれぞれ図41A及び41Bに示す。Pro329Gly、Leu234Ala、及びLeu235Ala変異(PG-LALA)を、ヒトIgG1重鎖の定常領域に導入して、Fcγ受容体への結合をなくした。非対称二重特異性抗体の作製のために、Fc断片は、重鎖の誤対合を回避するために「ノブ」又は「ホール」突然変異のいずれかを含有した。二重及び多重特異性抗体コンストラクトにおける軽鎖の誤対合を回避するために、VH/VL又はCH1/Cカッパドメインの交換を1つの結合部分に導入した(クロスFab技術)。別の結合部分において、電荷をCH1ドメイン及びCカッパドメインに導入した。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図41A及び41Bに示す:
分子18A:CD19(8B8-2B11)-CD28(SA_v29)1+1、CD28 v29 Fab(ノブ)における電荷修飾及びCD19(2B11)Fab(ホール)におけるVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図41A)。分子は、配列番号118及び430の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号65及び431の軽鎖アミノ酸配列を含む(P1AE8002)。
分子18B:CD19(8B8-2B11)-CD28(SA_v15)1+1、CD28 v15 Fab(ノブ)における電荷修飾及びCD19(2B11)Fab(ホール)におけるVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図41A)。分子は、配列番号116及び430の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号121及び431の軽鎖アミノ酸配列を含む(P1AE9040)。
分子18C:CD19(8B8-2B11)-CD28(SA_v8)1+1、CD28 v8 Fab(ノブ)における電荷修飾及びCD19(2B11)Fab(ホール)におけるVH/VL交換を伴う二重特異性 huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図41A)。分子は、配列番号114及び430の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号122及び431の軽鎖アミノ酸配列を含む(P1AF0175)。
分子D:CD19(8B8-2B11)-CD28(SA_v11)1+1、CD28 v11 Fab(ノブ)における電荷修飾及びCD19(2B11)Fab(ホール)におけるVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab分子(図2B)。分子は、配列番号114及び430の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号65及び431の軽鎖アミノ酸配列を含む(P1AF0377)。
分子E:CD19(8B8-2B11)-CD28(SA_v27)1+1、CD28 v27 Fab(ノブ)における電荷修飾及びCD19(2B11)Fab(ホール)におけるVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALA クロスFab b分子(図2B)。分子は、配列番号118及び430の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号123及び431の軽鎖アミノ酸配列を含む(P1AF0378)。
分子F:CD79b(huMA79b.v28)-CD28(SA_v15)1+1、CD28 v15 Fab(ノブ)における電荷修飾及びCD79b(huMA79b.v28)Fab(ホール)におけるVH/VL交換を伴う二重特異性huIgG1 PG-LALAクロスFab(図2C)。分子は、配列番号116及び432の重鎖アミノ酸配列、並びに配列番号121及び433の軽鎖アミノ酸配列を含む(P1AE9039)。
18.2 CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子の作製
上記の分子の発現は、CMVプロモーターによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
上記の分子の発現は、CMVプロモーターによって駆動される。ポリアデニル化は、CDSの3’末端に位置する合成ポリAシグナル配列によって駆動される。更に、各ベクターは、常染色体複製のためのEBV OriP配列を含む。
全てのコンストラクトの産生のために、懸濁状態で成長するHEK293-EBNA細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを使用してそれぞれの発現ベクターで一過性に同時トランスフェクトした。細胞を遠心分離し、培地を予め温めたCD CHO培地と交換した。CD CHO培地中で発現ベクターを混合し、PEIを添加し、溶液をボルテックスして室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合して、振蕩フラスコに移し、5%CO2雰囲気のインキュベータ内で、3時間37℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むExcell培地を添加した(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing、編者:Weichang Zhou,Anne Kantardjieff)。トランスフェクションの1日後、サプリメント(フィード)を添加した(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing、編者:Weichang Zhou,Anne Kantardjieff)。細胞上清を遠心分離及びその後、フィルタにかけ(0.2μmフィルタ)によって7日後に回収し、標準的な方法によって精製した。
18.3 CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子の精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(平衡化緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.5;溶出緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、pH 3.0)によって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐにpH 中和した。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(物品番号:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔には、Fc含有タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(平衡化緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、20mMリン酸ナトリウム、pH 7.5;溶出緩衝液:20mMクエン酸ナトリウム、pH 3.0)によって細胞培養上清から精製した。溶出はpH 3.0で達成され、続いて試料をすぐにpH 中和した。遠心分離(Millipore Amicon(登録商標)ULTRA-15(物品番号:UFC903096)によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH 6.0のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
18.4 CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗体又は三重特異性抗体の分析データ
精製されたコンストラクトのタンパク質濃度は、Pace、et al、Protein Science、1995、4、2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づいて計算される質量吸光係数を用い、280nmでの光学密度(OD)を測定することによって決定された。LabChipGXII(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表40に示す。
精製されたコンストラクトのタンパク質濃度は、Pace、et al、Protein Science、1995、4、2411-1423に従って、アミノ酸配列に基づいて計算される質量吸光係数を用い、280nmでの光学密度(OD)を測定することによって決定された。LabChipGXII(Perkin Elmer)を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、CE-SDSにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。ランニング緩衝液(それぞれ、25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM Lアルギニンモノヒドロクロリド,pH 6.7、又は200mM KH2PO4,250mM KCl,pH 6.2)中で平衡化した、分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL又はUP-SW3000)を使用して、HPLCクロマトグラフィーにより25℃にて、凝集内容物の測定を実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表40に示す。
実施例19
CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子の結合及び速度論的分析
19.1 CD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子の速度論的分析
組換えCD79b-His(Sinobiological#29750-H08H)に対するhuMA79b.v28の親和性(KD)を、Biacore T200装置を使用する表面プラズモン共鳴によってSPRによって測定した。CD79b-Hisの捕捉のために、抗ペンタHIS抗体をアミンカップリングによってCM5チップのフローセルにカップリングさせた。約5000単位の固定化レベルを使用した。次いで、CD79b-Hisを1nMの濃度に希釈し、10μl/分の流速で10秒間抗ペンタHIS抗体によって捕捉した。
CD28及びCD19又はCD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子の結合及び速度論的分析
19.1 CD79bを標的とする二重特異性抗原結合分子の速度論的分析
組換えCD79b-His(Sinobiological#29750-H08H)に対するhuMA79b.v28の親和性(KD)を、Biacore T200装置を使用する表面プラズモン共鳴によってSPRによって測定した。CD79b-Hisの捕捉のために、抗ペンタHIS抗体をアミンカップリングによってCM5チップのフローセルにカップリングさせた。約5000単位の固定化レベルを使用した。次いで、CD79b-Hisを1nMの濃度に希釈し、10μl/分の流速で10秒間抗ペンタHIS抗体によって捕捉した。
精製分子F(CD79b(huMA79b.v28)-CD28(SA_変異体15)1+1)の親和性(KD)を決定するために、精製された抗原結合分子の二倍希釈系列(125nMと0.49nMとの間の様々な濃度範囲)を30μl/分で、180秒の会合時間及び400秒の解離時間で注入した。HBS-EP+緩衝液(GE-Healthcare標準緩衝液BR-1006-69 1:10希釈)を参照のために注入した。再生を、10mMグリシンpH 2.1を用いて2×60秒間行った。会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)を、単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した(図42)。平衡解離定数(KD)をkoff/kon比として計算した。結果を表41に示す。分子F(CD79b(huMA79b.v28)-CD28(SA_変異体15)1+1)のCD79b-Hisに対する親和性は76nMである。
19.2 CD28を標的とする二重特異性抗原結合分子の速度論的分析
作製した二重特異性抗原結合分子のCD28に対する親和性(KD)を、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上にビオチン化huCD28-Fc抗原を固定化したProteOn XPR36装置(Biorad)を用いて、25℃でSPRにより測定した。組換え抗原(リガンド)の固定:抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウム pH 7.4、0.005%Tween20)で10μg/mlに希釈し、次いでさまざまな接触時間で30μl/分で注入して、垂直方向で約200、400又は800の応答単位(RU)の固定化レベルを達成した。分析物の注入:ワンショット速度論測定のため、注入方向を水平方向に変え、精製された二重特異性CD19標的化抗CD28親和性変異体の二倍希釈系列(50~3.125nMの様々な濃度範囲)を、150秒の会合時間及び450秒の解離時間で、別々のチャネル1~5に沿って50μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として計算した。分析されたクローンにより、広い範囲(1~50nM)のKD値が明らかになった。
作製した二重特異性抗原結合分子のCD28に対する親和性(KD)を、ニュートラアビジン捕捉によりNLCチップ上にビオチン化huCD28-Fc抗原を固定化したProteOn XPR36装置(Biorad)を用いて、25℃でSPRにより測定した。組換え抗原(リガンド)の固定:抗原をPBST(10mMリン酸、150mM塩化ナトリウム pH 7.4、0.005%Tween20)で10μg/mlに希釈し、次いでさまざまな接触時間で30μl/分で注入して、垂直方向で約200、400又は800の応答単位(RU)の固定化レベルを達成した。分析物の注入:ワンショット速度論測定のため、注入方向を水平方向に変え、精製された二重特異性CD19標的化抗CD28親和性変異体の二倍希釈系列(50~3.125nMの様々な濃度範囲)を、150秒の会合時間及び450秒の解離時間で、別々のチャネル1~5に沿って50μl/分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、6つ目のチャネルに沿って緩衝液(PBST)を注入した。会合速度定数(kon)と解離速度定数(koff)は、ProteOn Manager v3.1ソフトウェアの単純な1:1ラングミュア結合モデルを使用して、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数(KD)は、koff/konの比として計算した。分析されたクローンにより、広い範囲(1~50nM)のKD値が明らかになった。
実施例20
CD28発現細胞及びCD19又はCD79b発現細胞への二重特異性CD28アゴニスト抗原結合分子の結合
ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、FACS緩衝液(eBioscience、カタログ番号00-4222-26)に2.5x105/mlで再懸濁した。5x104個の細胞を、漸増濃度のCD28結合因子(1pM~100nM)と共に4℃で2時間、丸底96ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で3回洗浄し、PE抱合体化ヤギ抗ヒトPE(Jackson ImmunoReserach、カタログ番号109-116-098)と共に4℃で更に60分間インキュベートし、冷FACS緩衝液で1回洗浄し、遠心分離し、100ulのFACS緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗DP47 IgGを陰性対照として含めた。結合を、FACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism 6を用いて結合曲線を得た。
CD28発現細胞及びCD19又はCD79b発現細胞への二重特異性CD28アゴニスト抗原結合分子の結合
ヒトCD28への結合を、ヒトCD28を発現するCHO細胞(ヒトCD28を安定的に過剰発現するように改変された親細胞株CHO-k1 ATCC#CCL-61)を用いて試験した。結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率について確認し、FACS緩衝液(eBioscience、カタログ番号00-4222-26)に2.5x105/mlで再懸濁した。5x104個の細胞を、漸増濃度のCD28結合因子(1pM~100nM)と共に4℃で2時間、丸底96ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で3回洗浄し、PE抱合体化ヤギ抗ヒトPE(Jackson ImmunoReserach、カタログ番号109-116-098)と共に4℃で更に60分間インキュベートし、冷FACS緩衝液で1回洗浄し、遠心分離し、100ulのFACS緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗DP47 IgGを陰性対照として含めた。結合を、FACS Fortessa(BD,ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism 6を用いて結合曲線を得た。
図4A~図4Cから分かるように、一価の1アームIgG様CD28変異体コンストラクトは、結合の違いを示した。
CD19及びCD79bへの結合を、異なるレベルのCD19及びCD79bを発現するB細胞株を使用して試験した:Nalm6(DSMZ#ACC128)、RCK8(DSMZ#ACC561)、WSUDLCC2(DSMZ#ACC575)及びZ138(レスター大学M.Dyerからの贈り物)。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、FACS緩衝液(eBioscience、カタログ番号00-4222-26)に0.5 Mio細胞/mlで再懸濁した。5E4個の細胞を、漸増濃度のCD19-CD28(又はCD79b-CD28)コンストラクト(10pM~500nM)と共に4℃で1時間、丸底96ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷FACS緩衝液で2回洗浄し、PE抱合体化ヤギ抗ヒトPE(Jackson ImmunoReserach、カタログ番号109-116-098)と共に4℃で更に30分間インキュベートし、冷FACS緩衝液で2回洗浄し、遠心分離し、1:10000に希釈したDAPI(Roche、カタログ番号10236276001)を含む85ul FACS緩衝液に再懸濁した。コンストラクトと細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗DP47 IgGを陰性対照として含めた。結合を、FACS Fortessa(BD、ソフトウェアFACS Diva)を用いたフローサイトメトリーによって評価した。GraphPadPrism7を用いて結合曲線を得た。異なるB細胞株に対するCD19-CD28 v15の結合の比較を図43A及び43Bに示す。
FACS分析
B細胞株(Nalm6,RCK8,WSU DLCL2及びZ138)の表面におけるCD19の相対レベルを評価するために、細胞を、Human Fc Block(BD、カタログ番号564220)を使用する染色の前にFcブロックし、次いで、2×105個の細胞を480×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。CD19(BV650抗ヒト、BioLegend #302238)の表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を150μl/ウェルのPBSで1回洗浄し、150μl/ウェルのPBSに再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析した。
B細胞株(Nalm6,RCK8,WSU DLCL2及びZ138)の表面におけるCD19の相対レベルを評価するために、細胞を、Human Fc Block(BD、カタログ番号564220)を使用する染色の前にFcブロックし、次いで、2×105個の細胞を480×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。CD19(BV650抗ヒト、BioLegend #302238)の表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を150μl/ウェルのPBSで1回洗浄し、150μl/ウェルのPBSに再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析した。
インビトロ細胞結合アッセイにより、全てのCD19-CD28アゴニスト抗体が、濃度依存的様式で細胞上のヒトCD19及びヒトCD28に結合することが確認された(図44A及び44B)。予想されたように、抗DP47 IgGでは結合が検出されず、このことは、結合の検出が、それぞれの標的化部分による特異的なCD28結合及びCD19結合に起因することを示している。CD28への結合についてのEC50値を表42に示し、CD19への結合についてのEC50値を表43に示す。
実施例21
CD19又はCD79bを標的とする二重特異性CD28アゴニスト抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
初代ヒトPBMCを用いていくつかの細胞ベースのインビトロアッセイを実施して、T細胞二重特異性(TCB)抗体によって提供されるTCRシグナルの存在下及び非存在下におけるCD28(SA)及び二重特異性CD19又はCD79b標的化CD28抗原結合分子の活性を評価した。フローサイトメトリー、サイトカインELISA及び生細胞イメージングによって決定されるT細胞増殖、サイトカイン分泌及び腫瘍細胞死滅を読み取りとして得た。
CD19又はCD79bを標的とする二重特異性CD28アゴニスト抗原結合分子のインビトロ機能的特性評価
初代ヒトPBMCを用いていくつかの細胞ベースのインビトロアッセイを実施して、T細胞二重特異性(TCB)抗体によって提供されるTCRシグナルの存在下及び非存在下におけるCD28(SA)及び二重特異性CD19又はCD79b標的化CD28抗原結合分子の活性を評価した。フローサイトメトリー、サイトカインELISA及び生細胞イメージングによって決定されるT細胞増殖、サイトカイン分泌及び腫瘍細胞死滅を読み取りとして得た。
PBMCの単離
末梢血単核細胞(PBMC)を、バフィーコート(Blutspende Zuerich)から得たヘパリン処理した血液の濃縮リンパ球調製物から密度勾配遠心分離によって調製した。25mlの血液(PBSで1:2に希釈)を15mlのlymphoprep(STEMCELL technologies、カタログ番号07851)の上に重層し、室温で25分間、845×gでブレーキなしで遠心分離した。PBMC含有界面を、10mlピペットを用いて50mlチューブに回収した。細胞をPBSで洗浄し、611×gで5分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを50mlのPBSに再懸濁し、304×gで5分間遠心分離した。洗浄工程を繰り返し、171×gで遠心分離した。細胞をRPMI 1640 Glutamax(5%ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、50μM 2-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有)に再懸濁し、それぞれのアッセイプロトコルに従って更なる機能分析のために処理した。
末梢血単核細胞(PBMC)を、バフィーコート(Blutspende Zuerich)から得たヘパリン処理した血液の濃縮リンパ球調製物から密度勾配遠心分離によって調製した。25mlの血液(PBSで1:2に希釈)を15mlのlymphoprep(STEMCELL technologies、カタログ番号07851)の上に重層し、室温で25分間、845×gでブレーキなしで遠心分離した。PBMC含有界面を、10mlピペットを用いて50mlチューブに回収した。細胞をPBSで洗浄し、611×gで5分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを50mlのPBSに再懸濁し、304×gで5分間遠心分離した。洗浄工程を繰り返し、171×gで遠心分離した。細胞をRPMI 1640 Glutamax(5%ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、NEAA、50μM 2-メルカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシンを含有)に再懸濁し、それぞれのアッセイプロトコルに従って更なる機能分析のために処理した。
IL-2レポーターアッセイに基づくCD19-CD28及びCD79b-CD28分子のインビトロ機能的特性評価
CD19-CD28及びCD79b-CD28がTCB媒介性T細胞活性化を支援する能力を評価するために、IL-2レポーター細胞(Promega、カタログ番号J1651)はエフェクター細胞(IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat T細胞株)と手の役割を果たし、Nalm6、RCK8、WSU DLCL2及びZ138は腫瘍標的としての役割を果たした。2×104個の腫瘍標的細胞を、白色平底96ウェルプレート中、37°Cで6時間、105個のIL-2レポーター細胞(E:T 5:1)と共に、最適以下のCD20-TCB(P1AD4071)濃度(Nalm6については10nM、又はRCK8、WSU DLCL2及びZ138については0.05nM)単独の存在下、又は漸増濃度のCD19-CD28(又はCD79b-CD28)コンストラクト(0.2pM~10nM)と組み合わせてインキュベートした。測定の前に、プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで、100ulの基質(ONE-Glo溶液、Promega、カタログ番号E6120)を細胞に添加した。暗所での室温での10分間のインキュベーション後、Tecan Spark 10Mを用いて発光(カウント/秒)を測定した。
CD19-CD28及びCD79b-CD28がTCB媒介性T細胞活性化を支援する能力を評価するために、IL-2レポーター細胞(Promega、カタログ番号J1651)はエフェクター細胞(IL-2プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するJurkat T細胞株)と手の役割を果たし、Nalm6、RCK8、WSU DLCL2及びZ138は腫瘍標的としての役割を果たした。2×104個の腫瘍標的細胞を、白色平底96ウェルプレート中、37°Cで6時間、105個のIL-2レポーター細胞(E:T 5:1)と共に、最適以下のCD20-TCB(P1AD4071)濃度(Nalm6については10nM、又はRCK8、WSU DLCL2及びZ138については0.05nM)単独の存在下、又は漸増濃度のCD19-CD28(又はCD79b-CD28)コンストラクト(0.2pM~10nM)と組み合わせてインキュベートした。測定の前に、プレートを室温で15分間インキュベートし、次いで、100ulの基質(ONE-Glo溶液、Promega、カタログ番号E6120)を細胞に添加した。暗所での室温での10分間のインキュベーション後、Tecan Spark 10Mを用いて発光(カウント/秒)を測定した。
PBMC単離T細胞活性化に基づくCD19-CD28のインビトロ機能的特性評価
CD19-CD28がTCB媒介性T細胞活性化を支援する能力を評価するために、pan T細胞をエフェクター細胞として使用し、製造業者の指示に従ってPan T Cell単離キット(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-096-535)を使用してMACSによってPBMCから単離し、Nalm6、RCK8、WSU DLCL2及びZ138を腫瘍標的とした。2×104個の腫瘍標的細胞を、平底96ウェルプレート中、37°Cで48時間、105個のpan T細胞(E:T 5:1)と共に、最適以下のCD20-TCB(P1AD4071)濃度(Nalm6については10nM、又はRCK8、WSU DLCL2及びZ138については0.05nM)単独の存在下、又は漸増濃度のCD19-CD28コンストラクト(0.2pM~10nM)と組み合わせてインキュベートした。T細胞活性化をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を480×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。CD8(BV421抗ヒト、BioLegend#301036)、CD4(PE-Cy7抗ヒト、BioLegend#344611)、CD25(BV605抗ヒト、BioLegend#302632)、CD69(PE抗ヒト、BioLegend#310906)についての表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を150ul/ウェルのPBSで1回洗浄し、150ul/ウェルのPBSに再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析した。
CD19-CD28がTCB媒介性T細胞活性化を支援する能力を評価するために、pan T細胞をエフェクター細胞として使用し、製造業者の指示に従ってPan T Cell単離キット(Miltenyi Biotec、カタログ番号130-096-535)を使用してMACSによってPBMCから単離し、Nalm6、RCK8、WSU DLCL2及びZ138を腫瘍標的とした。2×104個の腫瘍標的細胞を、平底96ウェルプレート中、37°Cで48時間、105個のpan T細胞(E:T 5:1)と共に、最適以下のCD20-TCB(P1AD4071)濃度(Nalm6については10nM、又はRCK8、WSU DLCL2及びZ138については0.05nM)単独の存在下、又は漸増濃度のCD19-CD28コンストラクト(0.2pM~10nM)と組み合わせてインキュベートした。T細胞活性化をフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、細胞を480×gで5分間遠心分離し、PBSで洗浄した。CD8(BV421抗ヒト、BioLegend#301036)、CD4(PE-Cy7抗ヒト、BioLegend#344611)、CD25(BV605抗ヒト、BioLegend#302632)、CD69(PE抗ヒト、BioLegend#310906)についての表面染色を、供給業者の指示に従って実施した。細胞を150ul/ウェルのPBSで1回洗浄し、150ul/ウェルのPBSに再懸濁し、BD FACS Fortessaを使用して分析した。
サイトカイン放出アッセイ
TCRシグナル伝達の存在下でサイトカイン放出をトリガーするCD19-CD28の能力を評価するために、5×105個のPBMCをU底96ウェルプレート中で37℃で48時間、CD19-CD28(1nM)及び最適以下のCD20-TCB(P1AD4071)濃度(0.4pM)の存在下でインキュベートした。TCRシグナル伝達の非存在下でサイトカイン放出をトリガーするCD19-CD28の能力を評価するために、5×105個のPBMCをU底96ウェルプレート中で、漸増濃度のCD19-CD28コンストラクト(0.08nM~100nM)の存在下、37℃で48時間インキュベートした。サイトカイン放出を、マルチプレックスアッセイによって評価した。供給者の指示に従って、Bio-Plex Pro Human Cytokine 17-plex Assay(Bio-rad、カタログ番号m5000031yv)を用いて、50μl/ウェルの上清を、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、MCP-1(MCAF)、MIP-1β及びTNF-α分泌についてスクリーニングした。
TCRシグナル伝達の存在下でサイトカイン放出をトリガーするCD19-CD28の能力を評価するために、5×105個のPBMCをU底96ウェルプレート中で37℃で48時間、CD19-CD28(1nM)及び最適以下のCD20-TCB(P1AD4071)濃度(0.4pM)の存在下でインキュベートした。TCRシグナル伝達の非存在下でサイトカイン放出をトリガーするCD19-CD28の能力を評価するために、5×105個のPBMCをU底96ウェルプレート中で、漸増濃度のCD19-CD28コンストラクト(0.08nM~100nM)の存在下、37℃で48時間インキュベートした。サイトカイン放出を、マルチプレックスアッセイによって評価した。供給者の指示に従って、Bio-Plex Pro Human Cytokine 17-plex Assay(Bio-rad、カタログ番号m5000031yv)を用いて、50μl/ウェルの上清を、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、MCP-1(MCAF)、MIP-1β及びTNF-α分泌についてスクリーニングした。
CD19-CD28は、様々なB細胞株においてCD20-TCB媒介T細胞活性化を増強する
CD20-TCB媒介エフェクター機能を増強するCD19-CD28抗体の能力を評価するために、TCB併用におけるT細胞活性化を評価した。この目的のために、IL-2レポーターJurkat細胞を、漸増濃度のCD19-CD28 v15(P1AE9040)及び固定した限界濃度のCD20-TCB(P1AD4071)の存在下で6時間、4つの異なるCD19発現細胞株(Nalm6、WSU DLCL2、Z138、RCK8)と共培養した。CD20 TCBは、国際公開第2016/020309号A1の実施例1に記載されているような2+1フォーマットの抗CD20/抗CD3二重特異性抗体である。図45A~45Dに示されるように、CD19-CD28は、4つ全てのB細胞株の存在下で濃度依存的にCD20-TCB媒介エフェクター機能を増加させる。
CD20-TCB媒介エフェクター機能を増強するCD19-CD28抗体の能力を評価するために、TCB併用におけるT細胞活性化を評価した。この目的のために、IL-2レポーターJurkat細胞を、漸増濃度のCD19-CD28 v15(P1AE9040)及び固定した限界濃度のCD20-TCB(P1AD4071)の存在下で6時間、4つの異なるCD19発現細胞株(Nalm6、WSU DLCL2、Z138、RCK8)と共培養した。CD20 TCBは、国際公開第2016/020309号A1の実施例1に記載されているような2+1フォーマットの抗CD20/抗CD3二重特異性抗体である。図45A~45Dに示されるように、CD19-CD28は、4つ全てのB細胞株の存在下で濃度依存的にCD20-TCB媒介エフェクター機能を増加させる。
親和性低下CD28結合因子変異体は、CD19-CD28二重特異性フォーマットにおいてインビトロで機能的である
元のCD28(SA)クローンは、KD=1nMの親和性を有する。抗親和性抗体クローンは、特にCD28の場合のように標的が末梢血で高度に発現される場合、末梢シンク効果を受けるリスクを有する。(i)末梢シンク効果を低下させ、(ii)targ.CD28アゴニストのT細胞への腫瘍外結合を介して末梢T細胞活性化のリスクを低下させるために、本発明者らは、CDRに点変異を導入することによって親和性が低下した一連の31個のCD28クローンを作製した(実施例1.1を参照されたい)。候補クローンを前述のように選択した。異なるCD28親和性を有する5つの分子をCD19標的二重特異性フォーマットで作製した:CD19-CD28 v8(P1AF0175)、CD19-CD28 v11(P1AF0377)、CD19-CD28 v15(P1AE9040)、CD19-CD28 v27(P1AF0378)及びCD19-CD28 v29(P1AE8002)。図44A及び44Bは、全ての生成されたCD19-CD28分子がヒトCD19並びにCD28に結合し、結合強度が結合因子親和性と相関することを示す。
元のCD28(SA)クローンは、KD=1nMの親和性を有する。抗親和性抗体クローンは、特にCD28の場合のように標的が末梢血で高度に発現される場合、末梢シンク効果を受けるリスクを有する。(i)末梢シンク効果を低下させ、(ii)targ.CD28アゴニストのT細胞への腫瘍外結合を介して末梢T細胞活性化のリスクを低下させるために、本発明者らは、CDRに点変異を導入することによって親和性が低下した一連の31個のCD28クローンを作製した(実施例1.1を参照されたい)。候補クローンを前述のように選択した。異なるCD28親和性を有する5つの分子をCD19標的二重特異性フォーマットで作製した:CD19-CD28 v8(P1AF0175)、CD19-CD28 v11(P1AF0377)、CD19-CD28 v15(P1AE9040)、CD19-CD28 v27(P1AF0378)及びCD19-CD28 v29(P1AE8002)。図44A及び44Bは、全ての生成されたCD19-CD28分子がヒトCD19並びにCD28に結合し、結合強度が結合因子親和性と相関することを示す。
親和性が低下したCD28クローン変異体が機能的であり、TCB媒介エフェクター機能を支持することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、TCBの組み合わせにおけるT細胞活性化を評価した。この目的のために、IL-2レポーターJurkat細胞を、漸増濃度のCD19-CD28及び固定した限界濃度のCD20-TCBの存在下で6時間、CD19発現Nalm6細胞と共培養した。図46に示すように、CD28結合因子の全ての変異体は機能的であり、濃度依存的にTCB媒介T細胞活性化を増加させることができた。Pan T細胞をエフェクター細胞として使用し、製造業者の指示に従ってPan T細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用して、MACSによってPBMCから単離した。
CD19-CD28は、TCRシグナルの非存在下でPBMC T細胞を活性化しない
CD19-CD28コンストラクトがCD20-TCBによって提供されるものなどのTCRシグナルなしで不活性であることを確認するために、本発明者らは、CD20-TCBの非存在下又は存在下でCD20発現標的細胞(Nalm6)及びCD19-CD28と共培養した後のPBMC由来T細胞の活性化状態を評価した。図47に示されるように、CD19-CD28は、PBMC T細胞におけるCD20-TCB媒介のCD69発現を用量依存的様式で増強するが、TCBの非存在下では、CD19-CD28は、高濃度(100nM)でさえ、T細胞活性化をもたらさない。この知見は、CD20-TCBの存在下又は非存在下でCD19-CD28 v8又はCD19-CD28 v15と同時インキュベートした後、CD19-CD28がPBMC由来T細胞においてサイトカイン放出をもたらさなかったという本発明者らの観察によって確認される(図48A~48D)。結論として、これらのデータは、CD19-CD28がスーパーアゴニスト抗体ではなく、T細胞活性化を増強するためにTCRシグナル、すなわちTCBによって提供されるTCRシグナルを必要とすることを確認する。
CD19-CD28コンストラクトがCD20-TCBによって提供されるものなどのTCRシグナルなしで不活性であることを確認するために、本発明者らは、CD20-TCBの非存在下又は存在下でCD20発現標的細胞(Nalm6)及びCD19-CD28と共培養した後のPBMC由来T細胞の活性化状態を評価した。図47に示されるように、CD19-CD28は、PBMC T細胞におけるCD20-TCB媒介のCD69発現を用量依存的様式で増強するが、TCBの非存在下では、CD19-CD28は、高濃度(100nM)でさえ、T細胞活性化をもたらさない。この知見は、CD20-TCBの存在下又は非存在下でCD19-CD28 v8又はCD19-CD28 v15と同時インキュベートした後、CD19-CD28がPBMC由来T細胞においてサイトカイン放出をもたらさなかったという本発明者らの観察によって確認される(図48A~48D)。結論として、これらのデータは、CD19-CD28がスーパーアゴニスト抗体ではなく、T細胞活性化を増強するためにTCRシグナル、すなわちTCBによって提供されるTCRシグナルを必要とすることを確認する。
CD79b-CD28はCD20-TCB媒介T細胞活性化を増強する
CD19標的CD28アゴニスト抗体に加えて、本発明者らはまた、CD79b標的CD28抗体を生成して、CD20-TCB媒介T細胞活性化を増強するそれらの能力を評価した。このために、CD79b陽性B細胞株Z138を使用した。図49Aに示されるように、CD79b-CD28はZ138に結合する。更に、CD79b-CD28は、0.05nM CD20-TCBの存在下でZ138と共にインキュベートした場合、IL-2 Jurkat細胞のCD20-TCB媒介性IL-2産生を増強することができた(図49B)。
CD19標的CD28アゴニスト抗体に加えて、本発明者らはまた、CD79b標的CD28抗体を生成して、CD20-TCB媒介T細胞活性化を増強するそれらの能力を評価した。このために、CD79b陽性B細胞株Z138を使用した。図49Aに示されるように、CD79b-CD28はZ138に結合する。更に、CD79b-CD28は、0.05nM CD20-TCBの存在下でZ138と共にインキュベートした場合、IL-2 Jurkat細胞のCD20-TCB媒介性IL-2産生を増強することができた(図49B)。
実施例22
CD28及びCD19を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビボ機能的特性評価
ヒト化マウスにおけるNALM6異種移植片における異なるCD28変異体を有するCD19-CD28二重特異性抗原結合分子を用いた有効性試験
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化NSGマウスのCD19陽性ヒトリンパ腫モデルにおいて、CD19-CD28二重特異性抗原結合分子中のどのCD28変異体が単剤療法においてより強い腫瘍増殖阻害をもたらすかを評価することを目的とした。
CD28及びCD19を標的とする二重特異性抗原結合分子のインビボ機能的特性評価
ヒト化マウスにおけるNALM6異種移植片における異なるCD28変異体を有するCD19-CD28二重特異性抗原結合分子を用いた有効性試験
本明細書に記載の有効性試験は、完全ヒト化NSGマウスのCD19陽性ヒトリンパ腫モデルにおいて、CD19-CD28二重特異性抗原結合分子中のどのCD28変異体が単剤療法においてより強い腫瘍増殖阻害をもたらすかを評価することを目的とした。
ヒトNALM6細胞(B細胞前駆体白血病)は、ATCCから最初に得られ、増殖後、Glycart内部細胞バンクに寄託された。細胞を、10%FCS及び1×Glutamaxを含有するRPMI中で培養した。細胞を37°C、水飽和雰囲気、5%CO2で培養した。50マイクロリットルのマトリゲルと混合した50マイクロリットルの細胞懸濁液(1×106個のNALM6細胞)を、22G~30Gの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に4~5週齢の雌NSGマウス(Jackson Laboratory)を、特定の病原体のいない条件に維持し、1日のサイクルは、関連するガイドライン(GV-Solas;Felasa;TierschG)に従って、12時間明状態/12時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された(ZH225-17)。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために1週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌性NSGマウスに、15mg/kgのブスルファンを腹腔内注射し、1日後、臍帯血から単離した1x105個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から14~16週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトT細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。その時点で、記載されているように(図50)マウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがおよそ150mm3(18日目)に達したときに化合物又はヒスチジン緩衝液(ビヒクル)で処理した。全てのマウスに、200μlの適切な溶液を静脈内注射した。200μl当たり適切な量の化合物を得るために、原液(表44)を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。
ノギスを用いて腫瘍増殖を週2回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した:
Tv:(W2/2)×L(W:幅、L:長さ)
Tv:(W2/2)×L(W:幅、L:長さ)
試験は53日目に終了した。図51Aは、腫瘍増殖速度論(平均、+SEM)を示し、図51B~51Dは、群及びマウスごとの個々の腫瘍増殖速度論を示す。本明細書に記載されるように、単剤としてのCD19-CD28変異体8は、CD19-CD28変異体15と比較してより強い腫瘍増殖阻害を誘導した。ビヒクル動物は、皮下腫瘍細胞注射による転移の形成のために早期に屠殺しなければならなかった。ヒト化マウスにおける単剤治療効果は、マウス系におけるアロ反応性ヒトT細胞のブーストによって説明することができ、これはネオ抗原認識の代用と見なすことができる。
参考文献
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Tai,X.,Van Laethem,F.,Sharpe,A.H.,and Singer,A.(2007).Induction of autoimmune disease in CTLA-4-/-mice depends on a specific CD28 motif that is required for in vivo costimulation.Proc Natl Acad Sci U S A 104,13756-13761.
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Claims (63)
- CD28への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子であって、
(a)CD28に特異的に結合可能な1つの抗原結合ドメインと、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な少なくとも1つの抗原結合ドメインと、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - 前記FcドメインがヒトIgG1サブクラスのものであり、アミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(ナンバリングはKabat EUインデックスに従う)を含む、請求項1に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号36の重鎖相補性決定領域CDR-H1、配列番号37のCDR-H2、及び配列番号38のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号39の軽鎖相補性決定領域CDR-L1、配列番号40のCDR-L2、及び配列番号41のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28);又は
(ii)配列番号20のCDR-H1、配列番号21のCDR-H2、及び配列番号22のCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号23のCDR-L1、配列番号24のCDR-L2、及び配列番号25のCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、
を含む、請求項1又は2に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - 前記CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号26のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50及び配列番号51からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)と、配列番号27、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60及び配列番号61からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)と、を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD28に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(b)配列番号47のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(c)配列番号51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(d)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(e)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(f)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(g)配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(h)配列番号43のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(i)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(j)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)、又は
(k)配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD28)及び配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD28)
を含む、請求項1~3又は5のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28結合分子。 - 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、癌胎児性抗原(CEA)、葉酸受容体アルファ(FolR1)、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、上皮成長因子受容体(EGFR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)、p95HER2、上皮細胞接着分子(EpCAM)、HER3、CD30、TPBG(5T4)、CD19、CD79b、CD20、CD22、CD37、CD38、BCMA及びGPRC5Dからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか一項記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原(CEA)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(i)配列番号188のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号189のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号190のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号191のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号192のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号193のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA);又は
(ii)配列番号180のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号181のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号182のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号183のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号184のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号185のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA);又は
(iii)配列番号127のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号128のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号129のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号130のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号131のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号132のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、
(iv)配列番号507のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号508のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び配列番号509のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCEA)と、配列番号510のアミノ酸配列を含むCDR-L1、配列番号511のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び配列番号512のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCEA)と、
を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - 前記CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号186のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号187のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)配列番号194のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号195のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(b)配列番号196のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号197のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(c)配列番号198のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号199のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(d)配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(e)配列番号202のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号203のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(f)配列番号204のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(g)配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(h)配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(i)配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)、又は
(j)配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)
を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - 前記CEAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号200のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCEA)及び配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCEA)を含む、請求項1~9又は11のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号14のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)、又は
(b)(i)配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号5のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHFAP)と、(iv)配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLFAP)と、
を含む、請求項1~7又は13のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - 前記FAPに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHFAP)及び配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLFAP)を含む、請求項1~7又は13又は14のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、上皮細胞接着分子(EpCAM)に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記EpCAMに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号515のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号516のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号517のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)と、(iv)配列番号518のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号519のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号520のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)と、を含む、含む、請求項1~7又は16のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記EpCAMに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号521のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHEpCAM)及び配列番号522のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLEpCAM)を含む、請求項1~7又は16又は17のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号523のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号524のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号525のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHHER3)と、(iv)配列番号526のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号527のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号528のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLHER3)と、を含む、請求項1~7又は19のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記HER3に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号529のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHHER3)及び配列番号530のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLHER3)を含む、請求項1~7又は19又は20のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号531のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号532のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号533のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD30)と、(iv)配列番号534のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号535のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号536のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD30)と、を含む、請求項1~7又は22のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD30に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号537のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD30)及び配列番号538のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD30)を含む、請求項1~7又は22又は23のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号539のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号540のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号541のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHTBPG)と、(iv)配列番号542のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号543のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号544のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLTBPG)と、を含む、請求項1~7又は25のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記TBPGに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号545のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHTBPG)及び配列番号546のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLTBPG)を含む、請求項1~7又は25又は26のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、CD38、BCMA及びGPRC5Dからなる群から選択される多発性骨髄腫(MM)細胞表面抗原である、請求項1~7のいずれか一項記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7又は28のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号563のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号564のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号565のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)と、(iv)配列番号566のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号567のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号568のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)、又は
(b)(i)配列番号579のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号580のアミノ酸配列を含むCDR-H2、(iii)配列番号581のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)と、(iv)配列番号582のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号583のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号584のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)と、
を含む、請求項1~7又は28又は29のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - 前記GPRC5Dに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号569のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHGPRC5D)及び配列番号570のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLGPRC5D)を含む、請求項1~7又は28~30のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7又は28のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号547のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号548のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号549のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD38)と、(iv)配列番号550のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号551のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号552のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD38)と、を含む、請求項1~7又は28又は32のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD38に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号553のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD38)及び配列番号554のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD38)を含む、請求項1~7又は28又は32又は33のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7又は28のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号555のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号556のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号557のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHBCMA)と、(iv)配列番号558のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号559のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号560のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)と、を含む、請求項1~7又は28又は35のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記BCMAに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、配列番号561のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHBCMA)及び配列番号562のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLBCMA)を含む、請求項1~7又は28又は35又は36のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、CD19、CD79b、CD20、CD22及びCD37からなる群から選択されるB細胞表面抗原である、請求項1~7のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7又は38のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
(a)(i)配列番号406のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号407のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号408のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号409のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号410のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号411のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は
(b)(i)配列番号414のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号415のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号416のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD19)と、(iv)配列番号417のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号418のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号419のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD19)と、
を含む、請求項1~7又は38又は39のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - 前記CD19に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(a)配列番号412のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)、又は(b)配列番号420のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号421のアミノ酸配列に対して少なくとも約95%、98%、若しくは100%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)を含む、請求項1~7又は38又は39又は40のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD19に特異的に結合能可能な抗原結合ドメインが、配列番号412のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD19)及び配列番号413のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VLCD19)を含む、請求項1~7又は38又は41のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインである、請求項1~7又は38のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD79bに特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、(i)配列番号422のアミノ酸配列を含むCDR-H1、(ii)配列番号423のアミノ酸配列を含むCDR-H2、及び(iii)配列番号424のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む重鎖可変領域(VHCD79b)と、(iv)配列番号425のアミノ酸配列を含むCDR-L1、(v)配列番号426のアミノ酸配列を含むCDR-L2、及び(vi)配列番号427のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む軽鎖可変領域(VLCD79b)と、を含む、請求項1~7又は38又は43のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記CD79bに結合能可能な抗原結合ドメインが、配列番号428のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VHCD79b)及び配列番号429のアミノ酸配列を含む軽鎖変領域(VLCD79b)を含む、請求項1~7又は38又は43又は44のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- (a)CD28に特異的に結合することができる1つのFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な1つのクロスFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含む、請求項1~45のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - (a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
前記CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、Fcドメインサブユニットの1つのN末端に融合されている、
請求項1~45のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - (a)CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片と、
(b)腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片及び第3のFab断片と、
(c)Fc受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び/又はエフェクター機能を低下させる1つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第1のサブユニット及び第2のサブユニットで構成されるFcドメインと、
を含み、
前記CD28に特異的に結合可能な第1のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第2のFab断片のFab重鎖のN末端に融合されており、次いで、そのC末端において、第1のFcドメインサブユニットのN末端に融合され、前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な第3のFab断片が、Fab重鎖のC末端において、第2のFcドメインサブユニットのN末端に融合されている、
請求項1~45のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。 - 請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子をコードする1つ以上の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項49に記載のポリヌクレオチド(複数可)を含む、1つ以上のベクター、特に、発現ベクター。
- 請求項49に記載のポリヌクレオチド(複数可)又は請求項50に記載のベクター(複数可)を含む宿主細胞。
- 二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を製造する方法であって、a)請求項51記載の宿主細胞を、前記二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及びb)必要に応じて、前記二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子を回収する工程を含む、方法。
- 請求項52記載の方法によって製造される、二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、及び少なくとも1種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
- がんの処置で使用するための、請求項54に記載の薬学的組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子、又は請求項54に記載の薬学的組成物。
- (a)T細胞活性化又は(b)T細胞エフェクター機能を増強するのに使用するための、請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- がんの処置に使用するための、請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、化学療法剤、放射線治療、及び/又はがん免疫治療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて投与するためのものである、がんの処置に使用するための、請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、T細胞活性化抗CD3二重特異性抗体と組み合わせて投与されるためのものである、がんの処置に使用するための、請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- 前記二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子が、抗PD-L1抗体又は抗PD-1抗体と組み合わせて投与されるためのものである、がんの処置に使用するための、請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子。
- がんの処置のための医薬の製造における、請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は請求項54に記載の薬学的組成物の使用。
- 個体における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、前記個体に有効量の、請求項1~48のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストCD28抗原結合分子又は請求項24に記載の薬学的組成物を投与し、前記腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
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