CN107365383B - 一种人源化抗人pd-1单克隆抗体及其制备方法、用途与药物 - Google Patents

一种人源化抗人pd-1单克隆抗体及其制备方法、用途与药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种人源化抗人PD‑1单克隆抗体，重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，制备上述抗体的方法，包括(1)提取杂交瘤细胞的cDNA；(2)克隆重链可变区VH和轻链可变区VL；(3)VH和VL分别与克隆载体连接；(4)菌落进行基因序列测序鉴定；(5)保留比对正确的重轻链可变区序列；(6)扩大培养；(7)转染真核表达细胞株293；(8)去除上清液中杂质并过滤除菌；还公开了抗体的用途及药物，抑制活化T细胞体外增殖，和/或抑制活化T细胞分泌相关细胞因子。本发明的优点在于，丰富了抗体的类型，该抗体可以用于阻断PD‑1/PD‑L1负性信号，促进T细胞增值，激活T细胞生物学功能。

Description

一种人源化抗人PD-1单克隆抗体及其制备方法、用途与药物
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种人源化抗人PD-1单克隆抗体及其制备方法、用途与药物。
背景技术
PD-1(CD279)作为负性共刺激分子受体，诱导性表达在活化的T、B和NK等细胞，PD-1有PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)两个配体。虽然PD1具有与CTLA-4相似的结构，但是二者生物学功能及特异性不同。CTLA-4在T细胞活化初期调控其功能，而PD-1则抑制活化后期T细胞的免疫应答。研究发现，PD-1/PD-L1抑制途径与肿瘤的发生、发展密切相关。肺癌、肝癌、乳腺癌、鳞状细胞癌及卵巢癌等肿瘤细胞株和肿瘤组织组成性高表达PD-1的配体PD-L1，PD-1/PD-L1抑制途径对CD8+T细胞的活化增殖有明显的抑制作用，肿瘤细胞可通过诱导此类抑制性受体逃避CTL杀伤作用，减弱机体抗肿瘤免疫应答。通过特异性阻断PD-1/PD-L1抑制信号可使机体中失能的效应性免疫细胞恢复生物学功能，促进肿瘤和病毒特异性CD8+T细胞的活化增殖与细胞因子的分泌，增强淋巴细胞对肿瘤抗原、外来入侵的病毒等的杀伤力，提高机体免疫力及时清除肿瘤细胞和病毒。PD-1/PD-L1有望成为肿瘤免疫治疗的有效靶分子。在针对晚期黑色素瘤的研究中，PD-1单抗联合百时美施贵宝已上市的Yervoy(Ipilimumab)治疗12周，可使患者黑色素瘤缩小80％以上，联合用药的疗效明显优于单独使用Yervoy。目前，很多学者都在积极研究抗PD-1抗体对癌症的治疗作用，但抗人PD-1抗体在国内仍处于临床试验阶段，从国外购买成本较高，且有一定的适应症范围。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种人源化抗人PD-1单克隆抗体及其制备方法、用途与药物，实现的目的为，提供一种能产生所述抗人PD-1单克隆抗体的重链、轻链可变区序列，丰富抗人PD-1抗体的类型，使之在商业市场上流通，打破人源化抗人PD-1抗体行业领域发展的瓶颈，同时也为抗人PD-1抗体对各种癌症的治疗作用提供试验材料，推动治疗癌症疾病行业的发展。
为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明提供的一种人源化抗人PD-1单克隆抗体，所述人源化抗人PD-1单克隆抗体的重链可变区VH，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述人源化抗人PD-1单克隆抗体的轻链可变区VL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。流式检测表达单抗与L929/PD-1转基因细胞结合良好，阳性率达95％以上。
进一步的，所述重链可变区VH具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
所述轻链可变区VL具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了制备上述单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
(1)提取XGMHc5.1杂交瘤细胞的cDNA；
(2)设计上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞基因序列中重链可变区VH和轻链可变区VL；
(3)VH和VL分别与克隆载体连接，连接产物转化至感受态细菌DH5a，得到转化菌液A，将转化菌液涂在AMP抗性的LB培养基上培养；
(4)待LB培养基平板上长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，对这些菌落进行基因序列测序鉴定；
(5)抗体数据库IMGT分析步骤(4)中的基因序列测序结果，保留比对正确的重轻链可变区序列，以克隆载体为模板进行PCR，将扩增出的重轻链可变区序列与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化至感受态细菌DH5a中，得到转化菌液B，再将转化菌液B涂在Kana抗性的LB固体培养基上培养；
(6)采用步骤(4)的方法对步骤(5)得到的菌落进行基因序列测序测定，对比两次测序结果，挑选出两次测序结果相同的转化菌，扩大培养后进行质粒抽提；
(7)连接步骤(6)得到含有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293，293细胞采用悬浮培养，培养时采用SFM4Transfx-293without L-glutamine liquid无血清培养基传代扩增，转染时用FreeStyleTM 293ExpressionMedium无血清培养基替换；
(8)将步骤(7)转染后的细胞株293培养后，离心去除上清液中杂质，再用滤器过滤除菌，最后收集上清液得到人源化抗人PD-1单克隆抗体。
所述步骤(2)中扩增VH重链可变区基因的简并上游引物序列如SEQ ID NO.9所示；下游简并引物序列如SEQ ID NO.10所示；扩增VL轻链可变区基因的简并上游引物如SEQ IDNO.11所示；下游简并引物序列如SEQ ID NO.12所示。
进一步的，所述步骤(3)中所述克隆载体为pJET cloning vector。由于pJET载体带有氨苄(Amp+)抗性基因，故可将得到的转化菌液直接涂于培养基上，简化操作步骤。
进一步的，所述步骤(3)中培养的温度为37℃、培养的时间为12h。
进一步的，所述步骤(5)中将PCR扩增出的PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接中所使用的酶为BmtI和FspI，线性表达载体pCMV。
进一步的，所述步骤(5)中培养的温度为37℃、培养的时间为12h。
进一步的，所述步骤(6)中培养的温度为37℃、培养的时间为7天。
进一步的，所述步骤(8)中将步骤(7)转染后的细胞株293连续培养7d后，再进行离心处理。
进一步的，所述步骤(8)中过滤除菌的滤器滤径为0.20um。本发明还公开了上述抗人PD-1单克隆抗体的用途，将人源化抗人PD-1单克隆抗体用于促进活化T细胞体外增殖，和/或促进活化T细胞分泌相关细胞因子。
本发明还公开了含有上述抗人PD-1单克隆抗体的药物，除了含有PD-1单克隆抗体外，还包括药物可接受的载体，该药物可用于促进活化T细胞体外增殖，和/或促进活化T细胞分泌相关细胞因子。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供了人源化PD-1单克隆抗体的重链、轻链可变区，丰富了抗体的类型，该抗体可以用于阻断PD-1/PD-L1负性信号，促进T细胞增值，激活T细胞生物学功能，表现为体外培养T细胞数量增加，其分泌IFN-g水平提高。
附图说明
图1为以流式细胞术分析本发明人源化PD-1单克隆抗体huXGMHc5.1对转基因细胞上PD-1分子的识别图；
图2为本发明PD-1鼠/人嵌合抗体重链和轻链真核表达载体构建、体外培养流程图；
图3为本发明人源化PD-1单克隆抗体构建示意图；
图4为本发明人源化PD-1单克隆抗体huXGMHc5.1与活化PBMC体外共培养对PD-1/PD-L1负性通路下调T细胞分泌细胞因子IFN-g具有阻断作用图谱；
图5为Biacore鉴定本发明人源化PD-1单克隆抗体huXGMHc5.1与其配体PD-L1蛋白的亲和力图谱，从上至下的曲线依次为加入不同浓度梯度的单克隆抗体huXGMHc5.1(0.09nM，0.18nM，0.375nM，0.75625nM，1.5625nM，3.125nM，6.25nM，12.5nM，25nM，50nM)。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术。
所述术语“PD-1”是指抗原活化的T细胞表面上表达的蛋白质；术语“PD-L1”是指某些哺乳动物细胞上表达的可与PD-1受体特异结合的蛋白质。
实施例中所用生物材料来源如下：
产生PD-1单克隆抗体的杂交瘤的获得
(一)免疫小鼠
用融合蛋白或转基因细胞免疫小鼠，免疫四次，每次间隔21天，第四次免疫7-10后测小鼠眼眶血效价，效价测定好则加强免疫。
(二)细胞培养
1.于融合前1d，取6～7周龄BALB/c小鼠1只，置于75％乙醇溶液中2min。
2.无菌取出小鼠脾脏，置于200目的不锈钢筛网中，研磨获得单个细胞悬液。用1640基础培养基洗涤两遍(1400rpm，5min)备用。用15％FBS的1640培养基，调整细胞浓度为2×105/ml，滴加入96孔培养板中，每孔100μL，37℃、5％CO2培养箱中培养。
3.过夜培养，第二天在低倍显微镜下观察，并铺亚克隆细胞150ul。
(三)融合与筛选
准备：
1.器材：泡老鼠杯；简易解剖台；杂交瘤包；保温水浴杯；温度计；96孔培养板。
2.试剂：75％乙醇溶液；37℃预热1640基础培养基；37℃预热PEG1ml；37℃预热1640基础培养基14ml(PEG终止液)；37℃预热1640选择培养基(含15％FBS，并计算加入HAT的量，使得最终96孔培养板中培养基的HAT终浓度为1％)。
步骤：
1.将免疫小鼠，用流水冲洗，置于75％乙醇溶液中2min。
2.无菌取出小鼠脾脏，置于200目的不锈钢筛网中，研磨获得单个细胞悬液。用预热1640基础培养基洗涤两遍(1400rpm，5min)备用。
3.收集生长良好、处于对数生长期的SP2/0细胞,用预热1640基础培养基洗涤两遍(1400rpm，5min)备用。
4.将SP2/0细胞或Ag8细胞与脾脏细胞混合于50ml透明塑料离心管中，一般脾细胞:骨髓瘤细胞比例为5:1，预热1640基础培养基洗涤一遍(1400rpm，5min)，弃尽上清(以避免对PEG产生不必要的稀释)并用掌心搓管底(或手指轻轻弹击管底)，使两种细胞充分混匀成悬浮细胞状。
5.将离心管置于37℃保温水浴杯中预热，吸取1ml经37℃预温的50％的PEG溶液，在1min内匀速加完，且边加边轻轻震荡离心管，加完后在37℃水浴中轻晃60s。(3秒滴一滴)
6.沿管壁轻柔加入14ml 37℃预温的1640基础培养基终止(第1mi n加1ml，3min加3ml，最后缓慢加入10ml)。(匀速滴加)
7.37℃静止5min后离心(800rpm，5min)，弃去上清(将离心管倾斜，吸去上清)。
8.将沉淀细胞轻轻用37℃预热的1640选择培养基重悬(不可吹打)，加入到事先准备好的预热培养基中后，混匀后滴加在上述含有滋养细胞的96孔培养板中，100μl/孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，3-4d后半量换液，10d后改用HT培养基培养，2周后转用含10％FBS的1640培养基培养。
9.期间每天观察96孔板中克隆生长情况，一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。对于有特异性分泌抗体的细胞应及时克隆培养并冻存。通常需3-5次亚克隆才能获得稳定基因型和稳定分泌表型的细胞，且培养一段时间后需再次亚克隆。
实施例一：本发明提供的人源化抗人PD-1单克隆抗体，所述蛋白是人源化抗人PD-1单克隆抗体的重链可变区VH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述重链可变区VH具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示。
所述蛋白是人源化抗人PD-1单克隆抗体的轻链可变区VL，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
所述轻链可变区VL具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
本发明单克隆抗体对转基因细胞L929/PD-1表面PD-1分子的标记和流式分析：
1.将生长良好的L929/PD-1细胞消化后用PBS洗涤并用PBS调整其浓度，分于流式管中(5×105/管)；
2.加入10ng/ul PD-1单抗(100μl/管)，同时阳性对照加相同浓度的PD-1商品化抗体，阴性组加相同浓度的间标人IgG，振荡混匀，检测组和阴性组于4℃反应40min，阳性组于4℃反应20min，用含5％小牛血清的PBS洗涤，1800rpm离心5min，终止反应；
3.小心弃去上清，用吸水纸吸去残留的PBS。检测组与阴性组加入羊抗人PE标记抗体，振荡混匀；置于4℃反应20min，PBS终止二抗，方法同上；
4.最后以0.5ml PBS重悬细胞，流式检测抗体表达。
其结果见图1所示，图1显示以流式细胞术分析人源化PD-1单克隆抗体XGMHc5.1对转基因细胞上PD-1分子的识别，其中白色峰为阴性，A为加入商品化PD-1单抗的阳性对照组，一抗为商品化PE标记的抗人PD-1单抗；B为实验组，一抗为人源化PD-1单抗XGMHc5.1，二抗为荧光素PE标记的羊抗人IgG。单抗XGMHc5.1能较好地结合转基因细胞表明的PD-1分子。
实施例二：本发明提供的人源化抗人PD-1单克隆抗体，所述蛋白是人源化抗人PD-1单克隆抗体的重链可变区VH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述重链可变区VH具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示。
所述蛋白是人源化抗人PD-1单克隆抗体的轻链可变区VL，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
所述轻链可变区VL具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
人源化抗人PD-1单克隆抗体制备方法，过程参见图2、图3所示，
1.提取杂交瘤细胞的cDNA：从该杂交瘤细胞株中提取RNA，并使用RT-PCR技术，将获得的RNA反转录为cDNA；利用特定设计的上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)；
2.VH和VL分别与克隆载体(pJET cloning vector)连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于pJET载体带有氨苄(Amp+)抗性基因，可将转化菌液涂在Amp抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；
3.待涂板细菌长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，进一步测序鉴定；
4.抗体数据库IMGT分析步骤测序结果，保留比对正确的重轻链可变区序列，以克隆载体为模板进行PCR，将PCR扩增出的重轻链可变区序列，保留原序列的三个抗原结合区重链CDR1，CDR2，CDR3，轻链CDR1，CDR2，CDR3，将原序列的四个框架区(FR1，FR2，FR3，FR4)用人抗体的框架区序列替代，并将其与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化感受态细菌DH5a，由于表达载体带有卡那霉素(Kana+)抗性基因，可将转化菌液涂在Kana抗性的LB固体培养基上，37°过夜培养；
5.测序方法参照4.对比两次测序结果，挑选两次测序结果相同的转化菌，扩大培养后进行质粒抽提；
6.连接有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293。293细胞为悬浮培养，SFM4Transfx-293without L-glutamine(liquid)无血清培养基传代扩增，转染时用FreeStyleTM293Expression Medium无血清培养基替换。通过7天连续培养后收获上清，4000g离心30min，去除上清中细胞等杂质，并用0.20um滤器过滤除菌；
7.收获的上清含有目的抗体，流式检测表达单抗与L929/PD-1转基因细胞结合良好，阳性率达95％以上，此时获得人源化抗人PD-1单克隆抗体。
还公开了该抗体的用途，将人源化抗人PD-1单克隆抗体用于促进活化T细胞体外增殖，和/或促进活化T细胞分泌相关细胞因子。
抗人PD-1单克隆抗体XGMHc5.1体外影响T细胞活化增殖和细胞因子IFN-g分泌的试验：
1.PBMC的分离提取和T细胞的制备
取正常志愿者外周血100ml，淋巴细胞分离液(Ficoll)分离得到单个核细胞(PBMC)。PBS洗细胞后，用含10％小牛血清的RPMI1640培养基稀释并计数。调整细胞浓度为2×106/ml。利用EasySep Human Tcell Enrichment Kit(STEMCELL，加拿大)进行T细胞阴性选择分离，获得的人T细胞CD3+T>90％。
2.T细胞体外增殖和细胞因子分泌的检测
用可溶的激发型抗人CD3单抗(100ng/ml)和抗人CD28单抗(200ng/ml)激发T细胞。96孔内加入T细胞，每孔细胞数为2x105，并分为3组：(1)为T细胞与人IgG共培养(阴性对照组)；(2)T细胞与5.0μg/ml商品化单克隆抗体hu5C4共培养(阳性对照组)；(3)为T细胞与5.0μg/ml单克隆抗体XGMHc5.1。刺激96h后ELISA法检测培养上清中细胞因子的含量。由图4所示的数据可以看出，本发明的单克隆抗体XGMHc5.1与T细胞体外共培养，ELISA检测培养上清中IFN-g分泌，结果显示该细胞因子的表达明显上调，表明该抗体可阻断淋巴细胞表面PD-1/PD-L1信号通路，促进淋巴细胞分泌相关细胞因子。
所以，根据本发明抗体的功能，可将该抗体与药物可接受的载体组合，形成一种药物，用于促进活化T细胞体外增殖，和/或促进活化T细胞分泌相关细胞因子。
实施例三：本发明提供的人源化抗人PD-1单克隆抗体，所述蛋白是人源化抗人PD-1单克隆抗体的重链可变区VH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述重链可变区VH具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示。
所述蛋白是人源化抗人PD-1单克隆抗体的轻链可变区VL，其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。
所述轻链可变区VL具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
制备上述抗体的方法包括如下步骤：
(1)提取XGMHc5.1杂交瘤细胞的cDNA；
(2)设计上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞基因序列中重链可变区VH和轻链可变区VL；
(3)VH和VL分别与克隆载体连接，连接产物转化至感受态细菌DH5a，得到转化菌液A，将转化菌液涂在AMP抗性的LB培养基上培养；
(4)待LB培养基平板上长出分散菌落，选择边缘清晰、生长良好的菌落，对这些菌落进行基因序列测序鉴定；
(5)抗体数据库IMGT分析步骤(4)中的基因序列测序结果，保留比对正确的重轻链可变区序列，以克隆载体为模板进行PCR，将扩增出的重轻链可变区序列与双酶切预先处理的线性表达载体连接，连接产物转化至感受态细菌DH5a中，得到转化菌液B，再将转化菌液B涂在Kana抗性的LB固体培养基上培养；
(6)采用步骤(4)的方法对步骤(5)得到的菌落进行基因序列测序测定，对比两次测序结果，挑选出两次测序结果相同的转化菌，扩大培养后进行质粒抽提；
(7)连接步骤(6)得到含有目的单抗重链和轻链可变区基因的表达载体共转染真核表达细胞株293，293细胞采用悬浮培养，培养时采用SFM4Transfx-293without L-glutamine liquid无血清培养基传代扩增，转染时用FreeStyleTM293ExpressionMedium无血清培养基替换；
(8)将步骤(7)转染后的细胞株293培养后，离心去除上清液中杂质，再用滤器过滤除菌，最后收集上清液得到人源化抗人PD-1单克隆抗体。
所述步骤(2)中扩增VH重链可变区基因的简并上游引物序列如SEQ ID NO.9所示；下游简并引物序列如SEQ ID NO.10所示；扩增VL轻链可变区基因的简并上游引物如SEQ IDNO.11所示；下游简并引物序列如SEQ ID NO.12所示。
进一步的，所述步骤(3)中所述克隆载体为pJET cloning vector。所述步骤(3)中培养的温度为37℃、培养的时间为12h。所述步骤(5)中将PCR扩增出的PCR产物与双酶切预先处理的线性表达载体连接中所使用的酶为BmtI和FspI，线性表达载体pCMV。所述步骤(5)中培养的温度为37℃、培养的时间为12h。所述步骤(6)中培养的温度为37℃、培养的时间为7天。所述步骤(8)中将步骤(7)转染后的细胞株293连续培养7d后，再进行离心处理。所述步骤(8)中过滤除菌的滤器滤径为0.20um。
采用Biacore检测本发明单克隆抗体huXGMHc5.1亲和力
1.打开程序——Application Wizards，选择Surface Preparation—Immobilization，选择CM5Chip和Amine coupling；
2.选择Specify Flow Rate和Injection Time；
3.以PD-L1Ig蛋白为包被抗原，选择Run Sensorgram，于第二通道开始。(flow 1为对照)对照通道不要包被蛋白。
4.设定单抗流速5ul/min，在Command Inject下级选择Manual Inject.输入体积50ul，以及溶液放置位置：5ug/ml抗体，选择加样体积5ul，确定结合水平。
5.确定所需抗体溶液量后，再生芯片。将流速调整至50ul/min。选择Quickinject，注入10mM Glycine-HCl,pH 1.7,2min。然后再将流速调回5ul/min。
6.所有程序完成后，软件动力分析生成亲和常数KD。
其结果见图5所示，人源化抗体huXGMHc5.1KD系数为2.04X10-10，显示其具有较高的亲和力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种人源化抗人PD-1单克隆抗体，其特征在于，所述人源化抗人PD-1单克隆抗体的重链可变区VH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述人源化抗人PD-1单克隆抗体的轻链可变区VL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的人源化抗人PD-1单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区VH具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的一种人源化抗人PD-1单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区VL具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
4.一种权利要求1至3任一项所述的人源化抗人PD-1单克隆抗体的用途，其特征在于，将人源化抗人PD-1单克隆抗体用于在体外促进活化T细胞增殖，和/或在体外促进活化T细胞分泌相关细胞因子。
5.一种药物，其特征在于，该药物包括权利要求1-3任一项所述的人源化抗人PD-1单克隆抗体和药物可接受的载体。
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