ES2688883T3 - Fragmentos mutantes de OspA y métodos y usos relacionados con los mismos - Google Patents

Fragmentos mutantes de OspA y métodos y usos relacionados con los mismos Download PDF

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Abstract

Un polipéptido que comprende el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186; o cualquier variante funcional de dicha secuencia de aminoácidos - con una identidad de secuencia de al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 %, mucho más preferiblemente al menos el 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 186, y - con una diferencia en la capacidad protectora (Δpc) entre la variante funcional y el placebo (negativo) de control de al menos el 50 %, especialmente al menos el 60 %, preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, incluso más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente 95 %, mucho más preferiblemente al menos el 95 %.

Description

Fragmentos mutantes de OspA y métodos y usos relacionados con los mismos
5 CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la prevención y tratamiento de la infección por Borrelia Particularmente, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento mutante de una proteína A de la superficie externa (OspA), un ácido nucleico que codifica la misma, una composición
10 farmacéutica (particularmente para su uso como medicamento en un método para tratar o prevenir una infección por Borrelia) que comprende el polipéptido y/o el ácido nucleico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
15 La borreliosis de Lyme, o enfermedad de Lyme, es la enfermedad transmitida por garrapatas más común en Europa y América del Norte. La enfermedad es causada por la espiroqueta de tipo gram-negativo transmitida por artrópodos, Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi s.l.), y es una infección que puede afectar a múltiples órganos o tejidos, dando como resultado trastornos cutáneos, cardíacos, musculoesqueléticos y neurológicos. En la mayoría de los países, la borreliosis de Lyme no es una enfermedad de notificación obligatoria y no hay disponibles datos
20 exactos relacionados con las tasas anuales de incidentes. En Estados Unidos, el agente causal es B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi s.s.) y la borreliosis de Lyme se localiza en estados del noreste, el Atlántico central y la región superior norcentral. En 2010, se notificaron en Estados Unidos un total de aproximadamente 30.000 casos de borreliosis de Lyme a los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC). En Europa, B. afzelii y B. garinii son los principales agentes causales de la borreliosis de Lyme, así como B. burgdorferi s.s. y B. bavariensis, que
25 contribuyen en menor grado, dependiendo de la ubicación geográfica. La prevalencia de la borreliosis de Lyme varía de manera considerable en distintos países europeos con un aumento generalizado de la prevalencia del oeste al este. En gran parte de Europa, la cantidad de casos informados de borreliosis de Lyme aumentó desde principios de los años 1990 (por ejemplo, República Checa, Estonia, Lituania; véase borreliosis de Lyme en Europa, informe de la OMS de 2006) y la distribución geográfica de los casos también se ha ampliado.
30 Borrelia pertenece a la familia Spirochaetaceae, la cual se subdivide en los géneros de importancia médica Treponema, Leptospira y Borrelia. B. burgdorferi s.l. es una bacteria con forma de espiral, vigorosamente mótil y gram-negativa, con una longitud de aproximadamente 10-20 µm y una anchura de 0,2-0,5 µm, que crece en condiciones microaerófilas. La pared celular espiroquetal consiste en una membrana citoplásmica rodeada por
35 peptidoglucano y varios flagelos, y después por una membrana exterior asociada holgadamente.
La borreliosis de Lyme generalmente tiene lugar en fases caracterizadas por diferentes manifestaciones clínicas, con remisiones y exacerbaciones. La fase 1, infección temprana, consiste en una infección localizada de la piel, seguida en pocos días o semanas de la etapa 2, infección diseminada, y en meses a años después por la fase 3, infección 40 persistente. No obstante, la infección es variable; algunos pacientes tienen únicamente infecciones cutáneas localizadas, mientras que otros presentan únicamente manifestaciones posteriores de la enfermedad, tal como artritis. Los diferentes síndromes clínicos de la borreliosis de Lyme también son causados mediante infección con diversas especies de B. burgdorferi s.l. B. burgdorferi s.s. causa más frecuentemente manifestaciones de las articulaciones (artritis) y problemas cardíacos, B. afzelii causa principalmente síntomas dérmicos (eritema migrans;
45 EM y acrodermatitis crónica atrófica; ACA), mientras que B. garinii está implicado en la mayoría de los casos de neuroborreliosis.
Infección localizada - El síntoma más común de la fase 1 de una infección es eritema migrans, que ocurre en el 7080 % de las personas infectadas. Esta lesión cutánea a menudo viene seguida de síntomas similares a la gripe, tales
50 como mialgia, artralgia, dolor de cabeza y fiebre. Estos síntomas no específicos ocurren en el 50 % de los pacientes con eritema migrans.
Infección diseminada - Durante la fase 2, las bacterias se mueven hacia el torrente sanguíneo desde el sitio de la infección a órganos y tejidos distales. Los síntomas neurológicos, cardiovasculares y artríticos que se producen en
55 esta etapa incluyen meningitis, neuropatía craneal y artritis inflamatoria intermitente.
Infección persistente - La fase 3 de la infección es crónica y se produce de meses a años después de la picadura de garrapata. El síntoma más común en Norteamérica es la artritis reumatoide, causada por una infección con B. burgdorferi s.s. La infección persistente del sistema nervioso central con B. garinii causa síntomas neurológicos más
severos durante la fase 3 y una infección persistente de la piel con B. afzelii da como resultado acrodermatitis crónica atrófica.
En algunos grupos de riesgo, tales como granjeros, trabajadores forestales, senderistas, corredores, turistas, han
5 aumentado las tasas de seroprevalencia y de incidencia de la enfermedad, así como en niños menores a 15 años y adultos entre 39 y 59 años, sin preferencia de género. Este aumento en la incidencia de la borreliosis de Lyme está vinculado a los cambios en los hábitats forestales, así como los factores sociales. Los cambios medioambientales, tal como la fragmentación de bosques, han llevado a una reducción brusca de depredadores roedores tales como zorros y aves de carroña, lo cual ha llevado a una disminución en la población de ratones, con un aumento posterior
10 en la población de garrapatas. Más recientemente, la reforestación irregular ha aumentado la cantidad de venados y, por consiguiente, la cantidad de garrapatas. La expansión suburbana y el aumento del uso de superficies forestales para recreación tal como el camping y senderismo ha llevado a los seres humanos a tener mayor contacto con la mayor cantidad de vectores de Borrelia de garrapatas. Todos estos factores en conjunto han contribuido a una mayor distribución de Borrelia y una mayor incidencia de borreliosis de Lyme.
15 Los agentes antimicrobianos son el método principal de tratamiento de la infección por Borrelia. El antibiótico usado depende de la fase de la enfermedad, síntomas y las alergias del paciente a la medicación. La duración de la aplicación del antibiótico también depende de la fase de la enfermedad y la gravedad de los síntomas. La borreliosis de Lyme temprana típicamente se trata con tetraciclinas orales, tales como doxiciclina y penicilinas semisintéticas,
20 tales como amoxicilina o penicilina V. Los trastornos artríticos y neurológicos se tratan con ceftriaxona o penicilina G intravenosa de dosis altas. Hasta el 30 % de los pacientes de borreliosis de Lyme no presentan los síntomas tempranos característicos o la infección con Borrelia, lo que hace que el diagnóstico y el tratamiento sean problemáticos. La aplicación del antibiótico puede ser prolongada (hasta varios meses) y a veces ineficaz y, por lo tanto, tema de debate en el campo de la Borrelia, especialmente durante las fases posteriores de la enfermedad.
25 Incluso en el caso de tratamiento ineficaz de Borrelia, los pacientes pueden terminar con fatiga debilitante, dolor o síntomas neurológicos durante años, posteriormente denominados síndrome postratamiento de la enfermedad de Lyme. En general, el uso de antibióticos puede tener consecuencias no deseadas, tales como el desarrollo de resistencia a los microorganismos diana. Finalmente, la terapia antibiótica puede curar la borreliosis de Lyme de manera eficaz, pero no proporciona protección contra infecciones posteriores.
30 Se aprobó y se comercializó una vacuna monovalente basada en OspA de serotipo 1 (LYMErix™) en Estados Unidos para la prevención de la enfermedad de Lyme causada por Borrelia burgdorferi s.s. Sin embargo, la heterogeneidad en secuencias de OspA en diferentes serotipos en Europa y otros lugares descarta la protección eficaz con una vacuna basada en OspA de un único serotipo.
35 Pueden usarse moléculas quiméricas de OspA que comprenden la porción proximal de un serotipo de OspA, junto con la porción distal de otro serotipo de OspA, al mismo tiempo que conservan propiedades antigénicas de ambos polipéptidos precursores, en la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Lyme o borreliosis (documentos WO2011/143617, WO2011/143623). Además, se ha informado sobre la introducción de residuos de cisteína para la
40 inmovilización de fragmentos de OspA y el posterior análisis del mecanismo intramolecular de las subestructuras de proteínas (Hertadi et al., 2003, J. Mol. Biol. 333: 993-1002).
Actualmente, no hay un medicamento preventivo para la borreliosis de Lyme en el mercado y, por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un desarrollo de tal medicamento que pueda proporcionar una protección eficaz contra
45 Borrelia y que esté presente en Estados Unidos, Europa y otros lugares, especialmente para el desarrollo de un medicamento que pueda proporcionar protección eficaz contra varios serotipos de Borrelia de manera simultánea.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
50 La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende fragmentos mutantes de la proteína A de la superficie externa (OspA) de Borrelia, un ácido nucleico que codifica la misma, un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, y una célula huésped que comprende dicho vector como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un proceso para producir dicho polipéptido y un proceso para producir una célula que expresa dicho polipéptido. Además, la presente invención proporciona una composición
55 farmacéutica que comprende dicho polipéptido, molécula de ácido nucleico, o vector (particularmente para su uso como una vacuna o en un método para el tratamiento o la prevención de una infección por Borrelia).
Los esfuerzos para desarrollar una vacuna de subunidad para la prevención de la borreliosis de Lyme se han enfocado en gran parte en el uso de la proteína A de la superficie externa (OspA) borrelial como antígeno. La
proteína OspA se expresa por Borrelia únicamente cuando está en los intestinos de la garrapata vector. Por lo tanto, los anticuerpos de OspA producidos mediante vacunación no combaten la infección en el cuerpo, sino que ingresan al intestino de la garrapata cuando consume la sangre. Allí, los anticuerpos neutralizan las espiroquetas y bloquean la migración de bacterias del intestino medio a las glándulas salivales de la garrapata, la ruta a través de la cual
5 Borrelia se introduce en el huésped vertebrado. Por lo tanto, los anticuerpos específicos de OspA impiden la transmisión de Borrelia de la garrapata vector al huésped humano.
La forma lipidada de OspA de B. burgdorferi s.s., cepa ZS7, junto con hidróxido de aluminio, se desarrolló comercialmente como una vacuna contra Borrelia (LYMErix™) por SmithKline Beecham, ahora GlaxoSmithKline 10 (GSK) para el mercado de Estados Unidos. Fueron necesarias tres dosis de LYMErix™ durante un período de un año para ofrecer una protección óptima. Después de las primeras dos dosis, la eficacia de la vacuna contra la borreliosis de Lyme fue del 49 %, y tras la tercera dosis fue del 76 %. Sin embargo, poco tiempo después de que LYMErix™ estuvo disponible en el mercado, se retiró de éste en 2002. Las razones citadas fueron asuntos de administración práctica de la vacuna, por ejemplo, la necesidad de inyecciones de refuerzo cada año o cada dos
15 años, así como el coste relativamente alto de este enfoque preventivo en comparación con el tratamiento antibiótico de la infección temprana. Además, preocupaba que LYMErix™ pudiera desencadenar reacciones autoinmuntarias en un subgrupo de población debido a la homología de secuencia con la proteína humana, aunque esto nunca se probó. Además, esta vacuna no proporcionó protección cruzada contra otras especies clínicamente importantes de Borrelia.
20 Por consiguiente, en una realización, fue un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna mejorada para la prevención de la borreliosis de Lyme. Preferiblemente, la vacuna se produce fácilmente mientras que brinda protección, es segura y más eficaz que las terapias existentes y/o proporciona protección contra más de una especie de Borrelia.
25 El problema subyacente de la presente invención se soluciona mediante un polipéptido que comprende un heterodímero que comprende dos fragmentos mutantes de una proteína A de la superficie externa (OspA), en donde cada fragmento mutante consiste en un dominio C-terminal de una proteína OspA de Borrelia y difiere del fragmento de tipo salvaje correspondiente al menos en la introducción de al menos un enlace disulfuro. Específicamente, la
30 presente invención se refiere a un polipéptido que comprende el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186; o cualquier variante funcional de dicha secuencia de aminoácidos (i) con una identidad de secuencia de al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 %, mucho más preferiblemente al menos el 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 186, y (ii) con una diferencia en la capacidad protectora (∆pc) entre la variante funcional y el placebo (negativo) de control de al menos el 50 %,
35 especialmente al menos el 60 %, preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, incluso más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente 95 %, mucho más preferiblemente al menos el 95 %.
Sorprendentemente, se encontró que la introducción de al menos un enlace disulfuro en un fragmento mutante aumenta la capacidad protectora del polipéptido que comprende el fragmento mutante de OspA con respecto a un 40 polipéptido que comprende el fragmento de OspA de tipo salvaje, como se muestra en un modelo in vivo de infección. Como se muestra en los Ejemplos, la introducción de al menos un enlace disulfuro en el fragmento Cterminal de OspA de B. afzelii aumentó su capacidad protectora con respecto al fragmento de OspA de tipo salvaje sin un enlace disulfuro. Las Tablas 2 y 3 proporcionan datos que demuestran la capacidad protectora de los fragmentos mutantes con un enlace disulfuro introducido ("S2D1-5") en comparación con el fragmento de OspA de
45 tipo salvaje ("S2D0"), dado que una cantidad menor de animales se infectaron después de la inmunización con fragmentos mutantes de OspA en comparación con fragmentos de OspA de tipo salvaje. Algunos de los fragmentos mutantes de OspA ensayados proporcionaron una protección comparable a la otorgada por el antígeno de control positivo, la proteína OspA no lipidada de longitud completa.
50 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un heterodímero que comprende dos fragmentos mutantes de una proteína A de la superficie externa (OspA), en donde cada fragmento mutante consiste en un dominio C-terminal de una OspA de Borrelia y difiere del fragmento de tipo 55 salvaje correspondiente al menos en la introducción de al menos un enlace disulfuro. Específicamente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186; o cualquier variante funcional de dicha secuencia de aminoácidos (i) con una identidad de secuencia de al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 %, mucho más preferiblemente al menos el 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 186, y (ii) con una
diferencia en la capacidad protectora (∆pc) entre la variante funcional y el placebo (negativo) de control de al menos el 50 %, especialmente al menos el 60 %, preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, incluso más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente 95 %, mucho más preferiblemente al menos el 95 %. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186 se denomina Lip-S1D1-S2D1 y comprende una proteína de
5 fusión de heterodímero de un fragmento mutante de serotipo 1 de OspA y un fragmento mutante de serotipo 2 de OspA, teniendo cada fragmento un enlace disulfuro de tipo 1 (véase a continuación). Pueden estar presentes en el polipéptido uno o más fragmentos de OspA mutantes adicionales.
El término B. burgdorferi s.l. incluye al menos 13 especies de Borrelia (Tabla A-1). Estas especies se encuentran en
10 diferentes regiones geográficas y viven en la naturaleza en ciclos enzoóticos que implican garrapatas del complejo Ixodes ricinus (también llamado complejo Ixodes persulcatus) y una amplia gama de huéspedes animales. Cuatro especies de Borrelia son responsables de la mayoría de las infecciones en seres humanos: B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii. Otras tres especies, B. lusitaniae, B. bissettii y B. spielmanii, se han detectado ocasionalmente en seres humanos, pero su papel en la borreliosis de Lyme es incierto en la actualidad. Aún se
15 informa de nuevas especies de Borrelia.
Tabla A-1.
Especie patógena (4)
Garrapata vector principal Ubicación
Borrelia burgdorferi (Borrelia burgdorferi s.s.)
Ixodes scapularis Noreste/norte-centro de Estados Unidos
Ixodes pacificus
Oeste de Estados Unidos
Ixodes ricinus
Europa
Ixodes persulcatus
Asia
Borrelia garinii
Ixodes ricinus Europa
Ixodes persulcatus
Asia
Borrelia afzelii
Ixodes ricinus Europa
Ixodes persulcatus
Asia
Borrelia bavariensis
Ixodes ricinus Europa
Ixodes persulcatus
Asia
Especie mínimamente patógena o no patógena (9)
Garrapata vector principal Ubicación
Borrelia andersonii
Ixodes dentatus Este de Estados Unidos
Ixodes spinipalpis
Oeste de Estados Unidos
Borrelia bissettii
Ixodes pacificus
Ixodes ricinus
Europa
Borrelia valaisiana
Ixodes ricinus Europa y Asia
Ixodes columnae
Borrelia lusitaniae
Ixodes ricinus Europa
Borrelia spielmanii
Ixodes ricinus Europa
Borrelia japonica
Ixodes ovatus Japón
Borrelia tanukii
Ixodes tanuki Japón
Borrelia turdi
Ixodes turdus Japón
Borrelia sinica
Ixodes persulcatus China
Según se detalló anteriormente, la proteína A de la superficie externa (OspA) de Borrelia es una lipoproteína
20 inmunogénica abundante de Borrelia de interés particular dado su potencial como vacuna candidata. La OspA de B. burgdorferi s.l. es una lipoproteína básica que tiene una masa molecular de aproximadamente 30 kDa y está codificada en un plásmido lineal. Un aspecto importante de la proteína OspA es su lipidación N-terminal; es decir, el residuo de cisteína N-terminal se sustituye con ácidos grasos con una longitud de cadena de entre C14 y C19 con o sin dobles enlaces, una característica que potencia la inmunogenicidad de la proteína OspA. Se ha demostrado que
25 los péptidos sintéticos poco inmunogénicos inducen respuestas mayores de anticuerpos al lipidarse; por ejemplo, al acoplarse covalentemente a Pam3Cys (Bessler y Jung, Research Immunology (1992) 143:548-552), una sustitución de ácidos grasos encontrada en el extremo amino de muchas lipoproteínas bacterianas que se sintetizan con una secuencia señal que especifica la unión lipídica. Adicionalmente, se mostró que el resto Pam3Cys potenciaba respuestas inmunitarias a OspA en ratones, parcialmente a través de su interacción con TLR-2 (Yoder, et al. (2003)
30 Infection and Immunity 71:3894-3900). Por lo tanto, se esperaría que la lipidación de un fragmento C-terminal de OspA potenciara la inmunogenicidad y capacidad protectora del fragmento.
El análisis de aislados de B. burgdorferi s.l. obtenidos en Norteamérica y Europa ha revelado que OspA tiene una variabilidad antigénica y que pueden definirse varios grupos distintos basándose en la serología. Se han observado mAb anti-OspA que se unen a determinantes antigénicos específicos N y C-terminales. Se ha usado cristalografía de 5 rayos X y análisis por RMN para identificar dominios hipervariables con relevancia inmunológica en OspA y se ha mapeado el epítopo LA-2 con respecto a los aminoácidos C-terminales 203-257 (Ding et al., Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000). Estudios anteriores han demostrado que la producción de anticuerpos contra el epítopo C-terminal LA-2 se correlaciona con la inmunidad protectora después de la vacunación con OspA (Van Hoecke et al. Vaccine (1996) 14(17-18):1620-6 y Steere et al., N Engl J Med (1998) 339:209-215). Se mostró que los anticuerpos contra LA-2
10 bloquean la transmisión de Borrelia de la garrapata al huésped (Golde et al., Infect Immun (1997) 65(3):882-889). Estos estudios sugirieron que la porción C-terminal de la proteína OspA puede ser suficiente para inducir la inmunidad protectora. Debería apreciarse que la secuencia de la porción C-terminal de OspA está menos conservada entre serotipos de Borrelia que la porción N-terminal (véase la Figura 1).
15 Basándose en información de los estudios descritos anteriormente, junto con otros, se usaron en la presente invención formas truncadas de OspA que comprendían la porción C-terminal (también denominada en el presente documento "fragmento de OspA" o "monómero Estas formas truncadas de OspA probaron ser menos protectoras que le proteína OspA de longitud completa. De manera sorprendente, sin embargo, se encontró en el transcurso de la presente invención que la introducción de un enlace disulfuro en la forma truncada (también denominada en el
20 presente documento "fragmento mutante de OspA" o "fragmento mutante") supera esta desventaja. Sin desear quedar limitado a un mecanismo específico, se considera que la mejora de la protección se debe a un aumento en la estabilidad del fragmento de OspA, como se muestra en ensayos que miden la estabilidad térmica.
Debido a su relevancia en el campo de la medicina, particularmente para seres humanos, B. burgdorferi s.s., B.
25 afzelii, B. bavariensis y B. garinii son de interés particular. En este sentido, estas cuatro especies de Borrelia pueden clasificarse adicionalmente de acuerdo con sus serotipos de OspA, los cuales se han determinado mediante análisis con anticuerpos monoclonales específicos de la proteína OspA respectiva. Se muestran en la Tabla A-2 a continuación los serotipos 1-7, los cuales componen la mayoría de las infecciones por Borrelia en seres humanos, junto con sus tasas de prevalencia.
30 Tabla A-2. Designación de serotipo y prevalencia de B. burdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii. Se serotipó Borrelia aislada de líquido cefalorraquídeo o piel de ser humano o de garrapatas vectores sondando lisados de células enteras con anticuerpos monoclonales de ratón, cada uno específico de un epítopo particular de OspA (como se describe por Wilske et al., J. of Clin Microbiol (1993) 31(2):340-350, y se presenta por Baxter Bioscience en
35 "Climate change effect on ticks and tick-borne diseases", Bruselas, 06 de febrero de 2009).
Borrelia sp.
Serotipo de OspA definido por pruebas de mAb Prevalencia en enfermedad humana Cepa de origen para secuencia Seq ID No:
B. burgdorferi s.s.
1 11 % B31 20
B. afzelii
2 63 % K78 19
B. garinii
3 1,5 % PBr 21
B. bavariensis
4 4 % PBi 22
B. garinii
5 6 % PHEi 23
B. garinii
6 13 % DK29 24
B. garinii
7 0,5 % T25 25
La estructura de la proteína OspA de la cepa de B. burgdorferi s.s. B31 se determinó por Li et al. (Proc Natl Acad Sci (1997) 94:3584-3589). Se compone por láminas β N-terminales (cepas β 1 a 4) y centrales (cepas β 5 a 14n [parte N-terminal]), lámina barril 1 (cepas β 14c [parte C-terminal] a 16), lámina barril 2 (cepas β 17 a 21) y una hélice α C
40 terminal. El término "dominio C-terminal de OspA" o "dominio C-terminal" o "fragmento de tipo salvaje" o "porción Cterminal" con respecto a OspA como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva significará la secuencia de aminoácidos C-terminal de OspA, es decir, OspA que carece al menos de la lámina β N-terminal (incluyendo las cepas β 1 a 4). En OspA de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s., la lámina N-terminal consiste en los aminoácidos 17 a 70 (tras la escisión postraduccional del péptido señal de lipidación de 16 aa de longitud).
De acuerdo con la presente invención, el fragmento C-terminal de OspA también incluye una secuencia señal de lipidación en el extremo N, por ejemplo, secuencia señal de lipidación de los aminoácidos 1 a 16 de OspA (SEQ ID NO: 14) u OspB (SEQ ID NO: 15) de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s., una secuencia señal de lipidación de E. coli, denominada en el presente documento "señal de lipidación lpp" (SEQ ID NO: 16), o cualquier otra secuencia señal,
por ejemplo, como se define a continuación.
La lipidación de una proteína con una secuencia señal de lipidación N-terminal, tal como las presentes en un polipéptido OspA naciente, se produce en el vector de expresión de E. coli mediante la acción por etapas de la 5 diacilgliceril transferasa de las enzimas, peptidasa señal II y transacilasa, respectivamente. La primera etapa es la transferencia de un diacilglicérido al grupo sulfhidrilo de cisteína de la polipoproteína no modificada seguida de la escisión del péptido señal por la peptidasa señal II y, finalmente, la acilación del grupo α-amino de la cisteína Nterminal de la apolipoproteína. El resultado es la colocación de un lípido y un grupo glicerol sustituido con dos lípidos adicionales en el residuo de cisteína N-terminal del polipéptido. La secuencia señal de lipidación, que se elimina por
10 escisión durante la lipidación, no está presente en la secuencia polipeptídica final.
De acuerdo con la presente invención, el fragmento mutante de OspA puede ser una proteína lipidada, también lipoproteína, en donde los restos lipídicos, junto con el grupo glicerol, también se denominan "Lip". De acuerdo con la invención, Lip comprende de uno a tres lípidos, tales como alquilo C14-20 y/o alquenilo C14-20 unidos a un glicerol y
15 la cisteína N-terminal del polipéptido de la invención o, preferiblemente, en donde Lip es un resto de la fórmula (I) a continuación,
20 en la que uno de R1, R2 o R3 es alquilo o alquenilo C14-C20, y cada uno de los otros, independientemente, es alquilo C14-C20 o alquenilo C14-C20, y X es una secuencia de aminoácidos unida al residuo de cisteína que se muestra en la Fórmula (I). Más preferiblemente, Lip más la cisteína N-terminal del polipéptido es N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis(palmitoiloxi)propil cisteína (denominada en el presente documento "Pam3Cys") y está conectada mediante el carbonilo C de la cisteína de dicha secuencia de aminoácidos de la invención. En la Fórmula (I) anterior, R1, R2 y R3
25 serán restos de palmitoílo y X es una secuencia de aminoácidos unida al residuo de cisteína.
De acuerdo con la presente invención, y a menos que se defina otra cosa, el dominio C-terminal de una OspA de una cepa distinta de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s. se define por (i) carecer de al menos los aminoácidos 17 a 70 y/o (ii) carecer de al menos el dominio N-terminal homólogo a los aminoácidos 17 a 70 de OspA de B31 de B. 30 burgdorferi s.s. Adicionalmente, el dominio C-terminal de OspA, de acuerdo con la presente invención, puede también carecer de porciones adicionales de la lámina central, como se define por Li y sus colaboradores (Li et al., anteriormente), particularmente cepas adicionales, tales como las porciones de aminoácidos de los aminoácidos 17 a 82, 93, 105, 118 o 119, preferiblemente 17 a 129, más preferiblemente 1 a 12 5, 1 a 129 o 1 a 130 de cualquier Borrelia, particularmente B31 de B. burgdorferi s.s., o porciones homologas de una proteína OspA de una Borrelia
35 sp. distinta de B31 de B. burgdorferi s.s.
En el contexto de la presente invención, el domino C-terminal de OspA también se denomina "fragmento OspA" o "fragmento de OspA".
40 El "fragmento mutante", en el contexto del polipéptido de la presente invención y como se utiliza a lo largo de la presente memoria descriptiva, significará el fragmento C-terminal de OspA, según se definió anteriormente, el cual difiere del fragmento de tipo salvaje en al menos dos cisteínas introducidas que pueden formar un enlace disulfuro. Sin limitarse a esa teoría, se asume que el enlace disulfuro estabiliza el fragmento en una conformación propicia para la inducción de la unión a anticuerpos. El pliegue del fragmento C-terminal de tipo salvaje de OspA muestra una
45 estabilidad reducida de la temperatura en comparación con la proteína de longitud completa (Koide et al., Structurebased Design of a Second-generation Lyme Disease Vaccine Based on a C-terminal Fragment of Borrelia burgdorferi OspA, J. Mol. Biol. (2005) 350:290-299). Para la presente invención, la secuencia del dominio C-terminal de la OspA de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s. se ha analizado in silico para determinar posiciones de puentes disulfuro introducidos que puedan potenciar la estabilidad del pliegue de este dominio C-terminal. Los resultados del análisis
50 se han transferido a fragmentos homólogos de OspA de otras especies de Borrelia bajo la premisa de que el pliegue se conserva a través de las especies.
Típicamente, el enlace disulfuro puede introducirse insertando uno o más residuos de cisteína, en donde un enlacedisulfuro (puente S-S) se forma entre los grupos tiol de dos residuos de cisteína. Únicamente es necesario introducir un residuo de cisteína si se forma un enlace disulfuro con un residuo de cisteína presente en el fragmento de tipo salvaje. Una o, preferiblemente, dos cisteínas pueden introducirse mediante adición o, preferiblemente, sustitución
5 de aminoácidos.
El fragmento mutante de OspA puede también comprender mutaciones adicionales relativas al tipo salvaje. Según
se ha detallado anteriormente, la estructura y el dominio superficial de OspA se conocen en la técnica. Por
consiguiente, el fragmento mutante puede comprender mutaciones adicionales, particularmente en sitios que no se 10 encuentran en la superficie de la proteína y/o no están involucrados en la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, no
afectan a la capacidad antigénica. Estos pueden incluir una o más eliminaciones de aminoácidos, particularmente
eliminaciones pequeñas (por ejemplo, hasta 10 aminoácidos), una o más adiciones de aminoácidos (particularmente
en el extremo N o C), una o más sustituciones de aminoácidos, particularmente una o más sustituciones
conservadoras de aminoácidos. Los ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, pero sin
15 limitación, las enumeradas a continuación:
Ala
Ser Leu Ile; Val
Arg
Lys Lys Arg; Gln; Asn
Asn
Gln; His Met Leu; Ile
Asp
Glu Phe Met; Leu; Tyr
Cys
Ser Ser Thr
Gln
Asn Thr Ser
Glu
Asp Trp Tyr
His
Asn; Gln Tyr Trp; Phe
Ile
Leu, Val Val Ile; Leu
Las mutaciones preferidas incluyen cambios en porciones seleccionadas del fragmento, por ejemplo, en las que se
modifica la secuencia con similitud de secuencia con respecto antígeno humano asociado a la función leucocitaria
(hLFA-1), que existe en B. burgdorferi s.s., por ejemplo, se reemplaza por una secuencia homologa de una proteína
20 OspA de otra Borrelia sp. La lógica de esta modificación es disminuir el riesgo de la inducción de reacciones inmunológicas cruzadas con proteínas humanas. También es posible la adición de una secuencia señal para la lipidación en el fragmento final, o un fragmento intermedio, o la adición de una proteína marcadora (por ejemplo, para identificación o purificación).
25 En algunas realizaciones, el fragmento mutante de OspA tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un 60 %, preferiblemente al menos un 70 %, más preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con el fragmento de tipo salvaje. En otra realización, la secuencia difiere en un máximo del 10 %, un máximo del 9 %, un máximo del 8 %, un máximo del 7 %, un máximo del 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, mucho más preferiblemente un máximo del 1 % debido a
30 una adición, eliminación o sustitución de secuencia.
La identidad, como se conoce en la técnica y como se usa en el presente documento, es la relación entre dos o más
secuencias de polipéptidos, según se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, identidad
también implica el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea
35 el caso, determinada por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. La identidad puede calcularse fácilmente. Aunque existe una cantidad de métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos, el término se conoce bien por los expertos en la técnica (por ejemplo, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos
40 para determinar la identidad se codifican en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux, J. et al., 1984), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. et al., 1990).
En oposición al fragmento mutante de OspA, el "fragmento de tipo salvaje" en el contexto de la presente invención
45 se refiere a un fragmento de una OspA de origen natural de Borrelia. El fragmento de tipo salvaje se obtiene mediante eliminaciones N-terminal, pero no comprende eliminaciones internas (salvo de secuencias señal, como se detalla en el presente documento) o mutaciones. Con relación al fragmento mutante de OspA, el fragmento de tipo salvaje consiste en una parte idéntica de la OspA (longitud idéntica y misma cepa de OspA, etc.) y difiere únicamente en la mutación o mutaciones detalladas anteriormente, particularmente en la introducción de al menos
50 un enlace disulfuro o el reemplazo de una secuencia con homología humana, por ejemplo hLFA-1 (véase lo
anterior).
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el polipéptido de la presente invención no comprende o consiste en el polipéptido de OspA de longitud completa que tiene al menos un enlace disulfuro 5 introducido.
En una realización de la presente invención, el fragmento mutante de OspA puede diferir del fragmento respectivo de tipo salvaje únicamente en la introducción de al menos un, preferiblemente exactamente un, enlace disulfuro.
10 Un polipéptido es un polímero lineal único de aminoácidos unido mediante enlaces peptídicos, en algunos casos también por enlaces disulfuro. De acuerdo con la presente invención, el polipéptido también puede comprometer una
o más modificaciones postraduccionales; es decir, un grupo funcional bioquímico adjunto, tal como un acetato, fosfato, lípido o carbohidrato adjunto, preferiblemente un lípido o lípidos adjuntos a la cisteína N-terminal, junto con un glicerol, más preferiblemente 1 a 3 restos alquilo o alquenilo C14-C20, incluso más preferiblemente 1 a 3 grupos
15 palmitoílo, mucho más preferiblemente tres grupos palmitoílo (Pam3).
De acuerdo con la presente invención, el polipéptido de la presente invención comprende el fragmento mutante de OspA como se define en las reivindicaciones. De acuerdo con la presente invención, no comprende (i) la lámina Nterminal según se ha definido anteriormente y (ii) opcionalmente una o más cepas adicionales de la lámina central
20 según se ha definido anteriormente. Sin embargo, el polipéptido puede comprender una o más secuencias funcionales tales como una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal de lipidación o una modificación postraduccional, tal como una lipidación.
En una realización adicional de la presente invención, el polipéptido de la presente invención consiste en (i) dos o
25 más fragmentos mutantes de OspA, opcionalmente unidos por enlazadores, por ejemplo, como se define a continuación, y (ii) opcionalmente uno o más aminoácidos heterólogos a OspA, particularmente una secuencia señal, y (iii) opcionalmente una modificación postraduccional, tal como una lipidación.
El polipéptido de la presente invención tiene capacidad protectora. Como se ha detallado anteriormente, la
30 introducción de un enlace disulfuro en el fragmento mutante de OspA aumenta la capacidad protectora del polipéptido con respecto a un polipéptido que comprende el fragmento respectivo sin el enlace o enlaces disulfuro. En algunas realizaciones, la capacidad protectora aumenta en al menos el 10 %, más preferiblemente en al menos el 20 %, más preferiblemente en al menos el 30 %, más preferiblemente en al menos el 40 %, más preferiblemente en al menos el 50 %, más preferiblemente en al menos el 60 %, más preferiblemente en al menos el 70 %, más
35 preferiblemente en al menos el 80 %, incluso más preferiblemente en al menos el 90 % con respecto a un polipéptido que comprende el fragmento respectivo sin el enlace o enlaces disulfuro.
El término capacidad protectora describe la capacidad de proteger un sujeto contra una infección por Borrelia. Con respecto al polipéptido de la invención, la capacidad protectora se refiere a la capacidad del polipéptido de inducir 40 una respuesta inmunitaria que protege a un sujeto contra una infección por Borrelia. La capacidad protectora puede ensayarse administrando a un sujeto el polipéptido de manera que se induzca una reacción inmunitaria contra el polipéptido. Posteriormente, el sujeto puede exponerse a Borrelia. Se supervisa la reacción del sujeto a la infección. Particularmente, puede determinarse la presencia de Borrelia en el sujeto. Por ejemplo, el polipéptido es protector si no puede detectarse Borrelia en el sujeto. La presencia de Borrelia puede determinarse detectando ácidos nucleicos
45 específicos de Borrelia (por ejemplo, mediante PCR) o anticuerpos específicos de Borrelia (por ejemplo, mediante ELISA o transferencia Western), o detectando la propia Borrelia (por ejemplo, cultivando órganos o tejidos en medio de cultivo y verificando la presencia de Borrelia con un microscopio). En particular, la capacidad protectora ("pc"), indicada como un porcentaje, para una dosis particular se define de la siguiente manera:
50 pc (%) = [(número de sujetos ensayados totales - número de sujetos infectados por Borrelia)/número de sujetos ensayados totales] x 100
Las diferencias en la capacidad protectora (∆pc) pueden determinarse mediante, por ejemplo, comparando la capacidad protectora (pc) de un fragmento mutante de OspA con uno o varios enlaces disulfuro (pc [con enlace]) con
55 respecto a la capacidad protectora de un fragmento de OspA sin uno o más enlaces disulfuro (pc [sin enlace]). De acuerdo con la presente invención, los polipéptidos a comparar difieren únicamente en la introducción de al menos un enlace disulfuro. El cambio en la capacidad protectora (∆pc) por la introducción del enlace o enlaces disulfuro se determina de la siguiente manera:
∆pc = (pc [muestra] - pc [control]) por ejemplo, ∆pc = (pc [con enlace] - pc [con/sin enlace])
Si ∆pc es mayor de cero (>0), asumiendo que todos los demás parámetros (por ejemplo, dosis y ensayo) son
5 iguales, entonces la capacidad protectora de la muestra (por ejemplo, el fragmento mutante de OspA con uno o más enlaces disulfuro) es mejor que la capacidad protectora del control (por ejemplo, el fragmento de OspA sin uno o más enlaces disulfuro). Por el contrario, si ∆pc es menor de cero (<0), y asumiendo que todos los demás parámetros (por ejemplo, dosis y ensayo) son iguales, entonces la capacidad protectora de la muestra (por ejemplo, el fragmento mutante de OspA con uno o más enlaces disulfuro) es peor que la capacidad protectora de la
10 comparación (por ejemplo, el fragmento de OspA sin uno o más enlaces disulfuro).
Preferiblemente, se evalúa la capacidad protectora del polipéptido de la presente invención mediante un ensayo de exposición in vivo en el que los ratones inmunizados con el polipéptido de la invención o con un placebo de control se exponen a Borrelia introducida en los sujetos inmunizados con una aguja hipodérmica (método de exposición con
15 aguja) o mediante la introducción con una garrapata vector (método de exposición por garrapatas).
El método de exposición con aguja se realiza para la cepa de Borrelia deseada (por ejemplo, B. burgdorferi, cepa N40) mediante la introducción subcutánea de Borrelia en una dosis entre 20 y 50 veces la dosis infecciosa (ID)50 a ratones inmunizados con dicho primer polipéptido del primer aspecto o de un placebo de control (negativo) 20 adecuado, tal como un tampón o adyuvante en solitario y por la comparación de las tasas de infección en los ratones expuestos. La ID50 se define como la dosis a la que se infectan el 50 % de los ratones expuestos. La dosis de Borrelia se mide en cantidad de bacterias. La dosis de exposición puede variar en gran medida y depende de la cepa; por lo tanto, debe calificarse primero la virulencia de la cepa mediante experimentos de exposición para la determinación de la ID50. Cuatro semanas después de la exposición por aguja, se recolecta sangre y tejidos para
25 que los métodos de lectura determinen el estado infeccioso. Estos métodos de lectura pueden ser, por ejemplo, VlsE ELISA en sueros o qPCR en tejidos recolectados para la identificación de Borrelia, como se describe en el presente documento, u otros métodos.
El método de exposición por garrapata se lleva a cabo aplicando al menos una ninfa de garrapata (por ejemplo, I.
30 ricinus) infectada con Borrelia (por ejemplo, B. afzelii, cepa IS1), a un ratón inmunizado con dicho primer polipéptido del primer aspecto; y (b) aplicando al menos una ninfa de garrapata infectada a un segundo ratón inmunizado con dicho segundo polipéptido del primer aspecto; y (c) comparando las tasas de infección en ambos ratones, generalmente seis semanas después de la exposición. Preferiblemente, el ensayo o prueba se realizan con un grupo de ratones por polipéptido a ensayar. En los Ejemplos también se describe y se ilustra una prueba adecuada. Puede
35 realizarse una evaluación del estado infeccioso con VlsE ELISA en sueros o por qPCR en tejidos recolectados, o mediante otros métodos adecuados.
En una realización preferida de la presente invención, los productos de la invención tales como, por ejemplo, los polipéptidos de la invención que comprenden los fragmentos mutantes de OspA con uno o más enlaces disulfuro 40 administrados 3 veces a un sujeto en una dosis de 30 µg, preferiblemente 10 µg, preferiblemente 5,0 µg, preferiblemente 1,0 µg, preferiblemente 0,3 µg, o menos tienen una capacidad protectora del 50 % o más, preferiblemente del 60 % o más, más preferiblemente del 70 % o más, más preferiblemente del 80 % o más, más preferiblemente del 90 % o más, incluso más preferiblemente del 95 % o más, mucho más preferiblemente del 99 %
o más. En una realización, la capacidad protectora se evalúa en un método de exposición in vivo, preferiblemente un
45 método de exposición por garrapatas, más preferiblemente un método de exposición por aguja, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos. Se ha observado, de manera sorprendente, que la inmunización con un fragmento mutante de OspA de un serotipo puede proporcionar protección cruzada contra otros serotipos (Ejemplo 4, Tabla 4). Basándose en este hallazgo, se podría anticipar que la dosis del polipéptido de la presente invención podría incluso reducirse adicionalmente.
50 En una realización preferida, la diferencia en la capacidad protectora (∆pc) entre los polipéptidos de la invención que comprenden los fragmentos mutantes de OspA con uno o más enlaces disulfuro y el placebo de control (negativo) es al menos del 50 %, especialmente al menos del 60 %, preferiblemente al menos del 70 %, más preferiblemente al menos del 80 %, incluso más preferiblemente del 90 %, incluso más preferiblemente del 95 %, mucho más
55 preferiblemente al menos del 95 %, al administrarse 3 veces a un sujeto en una dosis de 30 µg, preferiblemente 10 µg, preferiblemente 5,0 µg, preferiblemente 1,0 µg, preferiblemente 0,3 µg o inferior.
En una realización preferida de la presente invención, el dominio C-terminal se define como un fragmento que consiste en al menos los 150 aminoácidos C-terminal de la proteína OspA. En una realización, el dominio C-terminal
tiene entre 140 y 152 aminoácidos de longitud. En una realización adicional, el dominio C-terminal consiste en no más de los últimos 152 aminoácidos de la proteína OspA, preferiblemente los últimos 151 aminoácidos, más preferiblemente los últimos 150 aminoácidos. En una realización alternativa, el dominio C-terminal consiste en no menos de los últimos 140 aminoácidos de la proteína OspA, preferiblemente los últimos 141 aminoácidos,
5 preferiblemente los últimos 142 aminoácidos, más preferiblemente los últimos 143 aminoácidos. Los últimos aminoácidos de la proteína OspA se definen en el presente documento como la secuencia de aminoácidos más contigua al extremo C de la proteína OspA.
En otra realización, el dominio C-terminal de una proteína OspA de Borrelia comprende, esencialmente consiste en o 10 consiste en (i) los aminoácidos de la posición 126, 131 o 130 a la posición 273 de la OspA de B. afzelii, cepa K78, o
(ii) el dominio homólogo a los aminoácidos de OspA de una cepa de Borrelia distinta de B. afzelii, cepa K78.
El polipéptido de la presente invención puede comprender, consistir esencialmente o consistir en (i) dos o más de estos fragmentos mutantes, opcionalmente unidos por enlazadores, por ejemplo, como se define a continuación y (ii)
15 opcionalmente uno o más aminoácidos heterólogos a OspA, particularmente una secuencia señal o sitio para una modificación postraduccional tal como lipidación, y (iii) opcionalmente una modificación postraduccional, tal como una lipidación.
De acuerdo con la presente invención, el polipéptido de la presente invención puede comprender o esencialmente
20 consiste en o consiste en los elementos descritos en el presente documento, particularmente los dos o más fragmentos mutantes de OspA y opcionalmente uno o más elementos adicionales tales como un dominio homólogo, un péptido enlazador, una secuencia señal o un sitio para la lipidación. "Esencialmente consiste" en este contexto significa que el elemento o elementos pueden tener cambios menores de aminoácidos con respecto a las secuencias anteriores, tales como adiciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácidos, preferiblemente
25 relacionadas con un máximo del 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o el 1 % de los aminoácidos de los elementos definidos en el presente documento.
De acuerdo con la presente invención, se introduce al menos un enlace disulfuro en un fragmento de OspA. Esto se puede conseguir preferiblemente mediante la introducción al fragmento de al menos 1 o 2 cisteínas, particularmente
30 2 cisteínas, con el fin de permitir la formación del al menos un enlace disulfuro. Únicamente puede introducirse una cisteína si hay otra cisteína disponible en el fragmento para un enlace disulfuro. No obstante, preferiblemente se introducen dos cisteínas. La una o más cisteínas se introducen mediante una adición o sustitución de aminoácidos, preferiblemente mediante sustitución. En el caso de la adición, la cisteína se inserta en la secuencia de aminoácidos entre dos aminoácidos, mientras que en el caso de la sustitución, se reemplaza un aminoácido con la cisteína.
35 La OspA puede ser de cualquier cepa de Borrelia, particularmente de las especificadas en el presente documento, tales como B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii,
B. japonica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, B. bavariensis, preferiblemente de B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis o B. garinii. Preferiblemente, la OspA es de B. afzelii, particularmente la cepa K78, serotipo 2 de OspA
40 (SEQ ID NO: 19); B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1 de OspA (SEQ ID NO: 20); B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3 de OspA (SEQ ID NO: 21); B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4 de OspA (SEQ ID NO: 22); B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5 de OspA (SEQ ID NO: 23);
B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6 de OspA (SEQ ID NO: 24) o B. garinii, particularmente la cepa
T25, serotipo 7 de OspA (SEQ ID NO: 25). Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas OspA (longitud 45 completa) se proporcionan a continuación.
Tabla A-3. Números de acceso de secuencias de OspA de las cepas seleccionadas de especies de Borrelia. Abreviaturas: Baf = Borrelia afzelii, Bbu = Borrelia burgdorferi s.s., Bga = Borrelia garinii, Bsp = Borrelia spielmanii, Bbi = Borrelia bissettii,Bva = Borrelia valaisiana, Btu = Borrelia turicatae, Bdu = Borrelia duttonii, Blu = Borrelia lusitaniae, Bja = Borrelia japonica, gb = GenBank, emb = EMBL, tr = UniProt/tremble, sp = UniProt/Swissprot, prf = Fundación de investigación de proteínas, dbj = Banco de datos de ADN de Japón (DDBJ), pdb = Banco de datos de proteínas, db = base de datos
Cepa del organismo
db|versión de acceso Organismo_Cepa db|versión de acceso Organismo_Cepa db|versión de acceso
Bbu_156a (serotipo 1)
gb|ACL33776.1 Bbu_K48 emb|CAA44492.1 Bga_Mng4702 gb|ABF29559.1
Baf_K78 (serotipo 2)
emb|CAA49828.1 Bbu_N40 gb|ACS94765.1 Bga_N34 emb|CAB64763.1
Bga_PBr (serotipo 3)
emb|CAA56549.1 Bbu_P0A3N6.1 sp|P0A3N6.1 Bga_Nov1006 gb|ACD02016.1
Bga_PBi (serotipo 4)
emb|CAA56550.1 Bbu_PBo emb|CAA56468.1 Bga_Nov105 gb|ABF29551.1
Bbu_PHei (serotipo 5)
tr|Q06228 Bbu_PBre emb|CAA59742.1 Bga_Nov14506 gb|ACD02013.1
Bbu_DK29 (serotipo 6)
emb|CAA45010.1 Bbu_PHei emb|CAA56544.1 Bga_Nov14606 gb|ACD02017.1
Bga_T25 (serotipo 7)
emb|CAA56547.1 Bbu_PKa emb|CAA56467.1 Bga_Nov2005 gb|ABF29553.1
Baf_ACA-1
gb|ACJ73559.1 Bbu_PKo emb|CAA46550.1 Bga_Nov2006 gb|ACD02018.1
Baf_K78
(secuenciada) Bbu_Poti_B1 emb|CAB64754.1 Bga_Nov3305 gb|ABF29554.1
Baf_Khab_625
gb|AAR96311.1 Bbu_Poti_B2 emb|CAB64755.1 Bga_Nov405 gb|ABF29552.1
Baf_Khab2-Sakh
gb|AAP94134.1 Bbu_Poti_B3 emb|CAB64756.1 Bga_Nov7006 gb|ACD02014.1
Baf_Khab470
gb|AAO91923.1 Bbu_PTro emb|CAA56471.1 Bga_Nov9906 gb|ACD02015.1
Baf_Khab505
gb|AAO91925.1 Bbu_PWudl emb|CAA56469.1 Bga_PBi gb|AAT93773.1
Baf_LU192
(secuenciada, parcial) Bbu_PWudl/6 emb|CAA56470.1 Bga_PBr emb|CAA56549.1
Baf_Mng3602
gb|ABF29573.1 Bbu_PWudll emb|CAA56546.1 Bga_Q1HLH6 gb|ABF29564.1
Baf_Mng4302
gblABF29574.1 Bbu_Q04851.1 sp|Q04851.1 Bga_T25 emb|CAA56547.1
Baf_Mng6702
gb|ABF29578.1 Bbu_Q04968.1 sp|Q04968.1 Bga_Tlsl emb|CAA59727.1
Baf_Mng702
gb|ABF29572.1 Bbu_Q09086.1 sp|Q09086.1 Bga_TN emb|CAA56545.1
Baf_Nov1105
gb|ABF29569.1 Bbu_Q09087.1 sp|Q09087.1 Bga_Tom1003 gb|ABF29564.1
Baf_Nov11506
gb|ACD02019.1 Bbu_Q44738 tr|Q44738 Bga_Tom1805 gb|ABF29567.1
Baf_Nov3005
gb|ABF29570.1 Bbu_Q44956 emb|CAA56937.1 Bga_Tom203 gb|ABF29562.1
Baf_P0A3N7.1
sp|P0A3N7.1 Bbu_Q44962 dbj|BAA06133.1 Bga_Tom2903 gb|ABF29565.1
Baf_PHo
emb|CAA59724.1 Bbu_Q45039 emb|CAR95556.1 Bga_Tom3005 gb|ABF29568.1
Baf_PKo
gb|ABH02138.1 Bbu_Q45040 tr|Q45040 Bga_Tom303 gb|ABF29563.1
Baf_PLe
emb|CAA59970.1 Bbu_S-1-10 gb|AAB96354.1 Bga_Tom3101 gb|ABF29557.1
Baf_PLj7
emb|CAA59725.1 Bbu_T.R.O. emb|CAA46549.1 Bga_Tom3803 gb|ABF29566.1
Baf_PLud
emb|CAA59726.1 Bbu_T255 emb|CAA59730.1 Bga_Tom5102 gb|ABF29560.1
Baf_Tom1103
gb|ABF29581.1 Bbu_UK emb|CAB64758.1 Bga_Tom5202 gb|ABF29561.1
12
Baf_Tom1303
gb|ABF29582.1 Bbu_VS116 emb|CAB64757.1 Bga_Tom7105 gb|ABF29556.1
Baf_Tom1503
gb|ABF29583.1 Bbu_VS461 emb|CAA82329.1 Bga_VS100 emb|CAB64765.1
Baf_Tom2303
gb|ABF29584.1 Bbu_WI91-23 ref| ZP_03091138.1 Bga_VS307 emb|CAB64764.1
Baf_Tom2403
gb|ABF29585.1 Bbu_ZQ1 emb|CAA01704.1 Bga_WABSou emb|CAA59728.1
Baf_Tom2504
gb|ABF29577.1 Bbu_ZS7 gb|ACK74228.1 Bja_Cow611 emb|CAB64759.1
Baf_Tom2803
gb|ABF29586.1 Bga_BgVir-1 gb|ABF29555.1 Bja_F63 emb|CAB64760.1
Baf_Tom3401
gb|ABF29571.1 Bga_Far04 ref| ZP_03328706.1 Bja_HO14 emb|CAB64762.1
Baf_Tom3703
gb|ABF29587.1 Bga_FujiP2 gb|AAA92301.1 Bja_IKA2 emb|CAB64761.1
Baf_Tom4703
gb|ABF29588.1 Bga_IP90 emb|CAJ75754.1 Blu_A8D057 gb|ABR22627.1
Baf_Tom5403
gb|ABF29575.1 Bga_Ip90 emb|CAJ75754.1 Blu_A8D060 gb|ABR22625.1
Baf_Tom603
gb|ABF29579.1 Bga_JEM1 gb|AAB81567.1 Blu_A8D075 gb|ABR22628.1
Baf_Tom6303
gb|ABF29576.1 Bga_JEM2 gb|AAB81569.1 Blu_A8D079 gb|ABR22629.1
Baf_Tom703
gb|ABF29580.1 Bga_JEM3 gb|AAB81571.1 Blu_ABR22624.l gb|ABR22624.1
Baf_XJ23
gb|AAB95225.1 Bga_JEM4 dbj| BAA19222.1 Blu_ABR22626.1 gb|ABR22626.1
Bbu_118a
ref| ZP_02720644.1 Bga_JEM5 gb|AAB81573.1 Bsp_A14S gb|AAD16455.1
Bbu_156a
gb|ACL33776.1 Bga_JEM6 gb|AAB81575.1 Btu_Ya501 dbj| BAA32513.1
Bbu_19857
emb|CAA48196.1 Bga_JEM7 gb|AAB81577.1 Bva_AR-2 gb|AAF00571.1
Bbu_2005348A
prf|2005348A Bga_JEM8 gb|AAB81579.1 Bva_M19 gb|AAF00573.1
Bbu_2005348B
prf|2005348B Bga_Khab3155 gb|AAR96310.1 Bva_M49 gb|AAF00574.1
Bbu_297
emb|CAA59729.1 Bga_Khab550 gb|AAR96306.1 Bva_M52 gb|AAF00575.1
Bbu_29805
ref| ZP_03092996.1 Bga_Khab616 gb|AAR96307.1 Bva_M53 gb|AAF00576.1
Bbu_64b
ref| ZP_03097520.1 Bga_Khab648 gb|AAR96308.1 Bva_M7 gb|AAF00572.1
Bbu_72a
ref| ZP_02724465.1 Bga_Khab722 gb|AAR96309.1 Bva_Q9RM88 emb|CAB56150.1
Bbu_80a
ref|ZP_03088001.1 Bga_Khab23 gb|AAP94125.1 Bva_QLZSP1 gb|ACA13516.1
Bbu_94a
ref| ZP_02725946.1 Bga_Khab24 gb|AAP94126.1 Bva_QSDS4 gb|ACA13517.1
Bbu_AAB23809.1
gb|AAB23809.1 Bga_Khab31 gb|AAP94127.1 Bva_QSYSP3 gb|ACA13518.1
Bbu_AAB23810.1
gb|AAB23810.1 Bga_Khab31a gb|AAP94128.1 Bva_QSYSP4 gb|ACA13519.1
Bbu_B29
gb|AAA18508.1 Bga_Khab-466 gb|AAP94129.1 Bva_QTMP2 gb|ACA13520.1
Bbu_B31
gb|AAC66260.1 Bga_Khab489 gb|AAP94130.1 Bva_QX-S13 gb|ACA13521.1
Bbu_Bol26
ref|ZP_02531917.1 Bga_Khab5-Sakh gb|AAO91932.1 Bva_UK gb|AAF00570.1
Bbu_C-1-11
gb|AAB96351.1 Bga_Khab506 gb|AAP94132.1 Bva_VS116 gb|AAF00569.1
Bbu_CA-11.2a_1
ref|ZP_03094587.1 Bga_Khab516 gb|AAP94133.1 Bsp_10MT dbj | BAA32516.1
Bbu_CA-11.2a_2
ref| ZP_03094587.1 Bga_Khab721 gb|AAP94131.1 Bsp_5MT dbj| BAA32515.1
13
Bbu_CA-11.2a_CA-112a
ref| ZP_03094587.1 Bga_Khab2119 gb|AAO91928.1 Bsp_Am501 dbj| BAA32514.1
Bbu_CAA00316.1
emb|CAA00316.1 Bga_Khab2559 gb|AAO91929.1 Bsp_LV5 gb|AAB96353.1
Bbu_CAA42842.1
emb|CAA42842.1 Bga_Khab2560 gb|AAO91930.1 Bsp_PAnz emb|CAJ43585.1
Bbu_CAA44258.1
emb|CAA44258.1 Bga_Khab2594 gb|AAO91931.1 Bsp_PHaP_PHap emb|CAJ43582.1
Bbu_CAR95597.1
emb|CAR95597.1 Bga_Khab430 gb|AAO91919.1 Bsp_PJes emb|CAJ43586.1
Bbu_DK1
gb|AAA22955.1 Bga_Khab448 gb|AAO91920.1 Bsp_PMai emb|CAJ43584.1
Bbu_DK29
emb|CAA45010.1 Bga_Khab457 gb|AAO91921.1 Bsp_PMew emb|CAJ43583.1
Bbu_DK6_Danish_isolate
emb|CAA58601.1 Bga_Khab468 gb|AAO91922.1 Bsp_PSigII emb|CAJ43581.1
Bbu_G2
gb|AAA88846.1 Bga_Khab492 gb|AAO91924.1 Bsp_SV1 ref|ZP_03095680.1
Bbu_G25
emb|CAA82328.1 Bga_Khab511 gb|AAO91926.1 Bbi_25015 gb|AAB21761.1
Bbu_H.E.
emb|CAA46551.1 Bga_Khab560 gb|AAO91927.1 Bbi_DN127 emb|CAB64766.1
Bbu_HB19
gb|AAC18776.1 Bga_LV4 gb|AAB96352.1 Bbi_Q09087.1 gb|AAB21761.1
14
El enlace disulfuro puede formarse entre cisteínas que se han introducido en cualquier posición del fragmento de OspA, lo que permite o soporta el pliegue adecuado del fragmento. Pueden seleccionarse las posiciones, como se ha detallado anteriormente, basándose en la estructura conocida de la OspA. El polipéptido puede contener al menos un enlace disulfuro entre cualquiera de las posiciones 182 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 269 +/- 3 5 (enlace disulfuro de tipo 1); cualquiera de las posiciones 182 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 272 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 2); cualquiera de las posiciones 244 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 259 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 3); cualquiera de las posiciones 141 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 241 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 4); cualquiera de las posiciones 165 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 265 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 5); cualquiera de las posiciones 185 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 272 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 6); cualquiera de las 10 posiciones 199 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 223 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 7); cualquiera de las posiciones 243 +/-3 y cualquiera de las posiciones 262 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 8); cualquiera de las posiciones 184 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 204 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 9); cualquiera de las posiciones 201 +/- 3 y cualquiera de las posiciones 214 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 10); cualquiera de las posiciones 246 +/-3 y cualquiera de las posiciones 259 +/- 3 (enlace disulfuro de tipo 11); y/o cualquiera de las posiciones 167 +/- 3 y 15 cualquiera de las posiciones 178 +/-3 (enlace disulfuro de tipo 12) de una B. afzelii, particularmente OspA de serotipo 2 de B. afzelii K78, o los aminoácidos homólogos de una OspA de una Borrelia sp. distinta de B. afzelii, tal como B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1; B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3;
B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4; B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5; B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6, o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7.
20 El polipéptido puede contener el al menos un enlace disulfuro entre cualquiera de las posiciones 182 y 269 (enlace disulfuro de tipo 1); posiciones 182 y 272 (enlace disulfuro de tipo 2); posiciones 244 y 259 (enlace disulfuro de tipo 3); posiciones 141 y 241 (enlace disulfuro de tipo 4); posiciones 165 y 265 (enlace disulfuro de tipo 5); posiciones 185 y 272 (enlace disulfuro de tipo 6); posiciones 199 y 223 (enlace disulfuro de tipo 7); posiciones 243 y 262
25 (enlace disulfuro de tipo 8); posiciones 184 y 204 (enlace disulfuro de tipo 9); posiciones 201 y 214 (enlace disulfuro de tipo 10); posiciones 246 y 259 (enlace disulfuro de tipo 11); y/o las posiciones 167 y 178 (enlace disulfuro de tipo 12) de una B. afzelii, particularmente OspA de serotipo 2 de B. afzelii K78, o los aminoácidos homólogos de una OspA de una Borrelia distinta de B. afzelii, tal como B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1; B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3; B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4; B. garinii,
30 particularmente la cepa PHei, serotipo 5; B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6, o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7.
Tabla A-4. Tipos de enlace disulfuro con nomenclatura y la posición de las sustituciones de cisteína en la proteína OspA de serotipo 2.
Tipo de enlace disulfuro
Nomenclatura Posición de las cisteínas en OspA de serotipo 2 de B. afzelii K78
secuencia de tipo salvaje
D0 Sin sustituciones de cisteína
1
D1 182 y 269
2
D2 182 y 272
3
D3 244 y 259
4
D4 141 y 241
5
D5 165 y 265
6
D6 185 y 272
7
D7 199 y 223
8
D8 243 y 262
9
D9 184 y 204
10
D10 201 y 214
11
D11 246 y 259
12
D12 167 y 178
35 Son incluso más preferidos los enlaces disulfuro de tipos 1 a 5, especialmente los enlaces disulfuro de tipos 1 a 4.
Se aprecia que:
40 La posición 182 +/- 3 es una abreviatura para la posición 179, 180, 181, 182, 183, 184 o 185, preferiblemente 182. La posición 269 +/- 3 es una abreviatura para la posición 266, 267, 268, 269, 270, 271 o 272, preferiblemente 269. La posición 272 +/- 3 es una abreviatura para la posición 269, 270, 271, 272, 273, 274 o 275,
preferiblemente 272. La posición 244 +/- 3 es una abreviatura para la posición 241, 242, 243, 244, 245, 246 o 247, preferiblemente 244. La posición 259 +/- 3 es una abreviatura para la posición 256, 257, 258, 259, 260, 261 o 262,
5 preferiblemente 259. La posición 141 +/- 3 es una abreviatura para la posición 138, 139, 140, 141, 142, 143 o 144, preferiblemente 141. La posición 241 +/- 3 es una abreviatura para la posición 238, 239, 240, 241, 242, 243 o 244, preferiblemente 241.
10 La posición 165 +/- 3 es una abreviatura para la posición 162, 163, 164, 165, 166, 167 o 168, preferiblemente 165. La posición 265 +/- 3 es una abreviatura para la posición 262, 263, 264, 265, 266, 267 o 268, preferiblemente 265. La posición 185 +/- 3 es una abreviatura para la posición 182, 183, 184, 185, 186, 187 o 188,
15 preferiblemente 185. La posición 199 +/- 3 es una abreviatura para la posición 196, 197, 198, 199, 200, 201 o 202, preferiblemente 199. La posición 223 +/- 3 es una abreviatura para la posición 220, 221, 222, 223, 224, 225 o 226, preferiblemente 223.
20 La posición 243 +/- 3 es una abreviatura para la posición 240, 241, 242, 243, 244, 245 o 246, preferiblemente 143. La posición 262 +/- 3 es una abreviatura para la posición 259, 260, 261, 262, 263, 264 o 265, preferiblemente 262. La posición 184 +/- 3 es una abreviatura para la posición 181, 182, 183, 184, 185, 186 o 187,
25 preferiblemente 184. La posición 204 +/- 3 es una abreviatura para la posición 201, 202, 203, 204, 205, 206 o 207, preferiblemente 204. La posición 201 +/- 3 es una abreviatura para la posición 198, 199, 200, 201, 202, 203 o 204, preferiblemente 201.
30 La posición 214 +/- 3 es una abreviatura para la posición 211, 212, 213, 214, 215, 216 o 217, preferiblemente 214. La posición 246 +/- 3 es una abreviatura para la posición 243, 244, 245, 246, 247, 248 o 249, preferiblemente 246. La posición 167 +/- 3 es una abreviatura para la posición 164, 165, 166, 167, 168, 169 o 170,
35 preferiblemente 167. La posición 178 +/- 3 es una abreviatura para la posición 175, 176, 177, 178, 179, 180 o 181, preferiblemente 178.
Se describen fragmentos mutantes derivados de los aminoácidos de la posición 126, 130 o 131 a la posición 273 de
40 la secuencia de tipo salvaje de la OspA de B. afzelii cepa K78, serotipo 2 (SEQ ID NO: 18) y que difieren solamente en la introducción de al menos un enlace disulfuro, particularmente en donde el al menos un enlace disulfuro está entre las posiciones 182 y 269 (enlace disulfuro de tipo 1); posiciones 182 y 272 (enlace disulfuro de tipo 2); posiciones 244 y 259 (enlace disulfuro de tipo 3); posiciones 141 y 241 (enlace disulfuro de tipo 4); posiciones 165 y 265 (enlace disulfuro de tipo 5); posiciones 185 y 272 (enlace disulfuro de tipo 6); posiciones 199 y 223 (enlace
45 disulfuro de tipo 7); posiciones 243 y 262 (enlace disulfuro de tipo 8); posiciones 184 y 204 (enlace disulfuro de tipo 9); posiciones 201 y 214 (enlace disulfuro de tipo 10); posiciones 246 y 259 (enlace disulfuro de tipo 11); y/o las posiciones 167 y 178 (enlace disulfuro de tipo 12), o los fragmentos homólogos y posiciones de una OspA de una Borrelia sp. distinta de B. afzelii, tal como B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1; B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3; B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4; B. garinii,
50 particularmente la cepa PHei, serotipo 5; B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6, o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7.
El fragmento mutante puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173,
55 SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178 y una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias con SEQ ID NOs: 2 a 13, en donde las cisteínas no se reemplazan. Se han proporcionado anteriormente detalles adicionales sobre mutaciones e identidad de secuencia.
Como se ha detallado anteriormente, el polipéptido de la presente invención puede comprender secuencias señal. Se ha mostrado que la lipidación confiere propiedades de adyuvante a OspA. Por consiguiente, las formas lipidadas del polipéptido de la invención o polipéptidos que comprenden una señal de lipidación son preferidos. En una 5 realización preferida, el polipéptido de la presente invención comprende una señal de lipidación, preferiblemente una señal de lipidación de una proteína de la superficie externa, OspA o OspB de Borrelia (SEQ ID NOs: 14 y 15, respectivamente) o más preferiblemente una secuencia señal de lipidación lpp de E. coli (SEQ ID NO: 16). El fragmento de OspA de la invención que comprende una señal de lipidación, se lipida durante el procesamiento, y el péptido señal de lipidación se elimina por escisión. Por lo tanto, el péptido señal ya no está presente en la proteína
10 lipidada madura.
Las proteínas lipidadas de acuerdo con la presente invención se marcan con "Lip" en el extremo N para indicar la adición de 3 grupos ácidos grasos y un glicerol al polipéptido (véase la Fig. 4). Las señales de lipidación adecuadas, como se han descrito anteriormente, incluyen MKKYLLGIGLILALIA (SEQ ID NO: 14), MRLLIGFALALALIG (SEQ ID 15 NO: 15) y MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 16). Dado que los restos lipídicos y un glicerol están unidos al residuo de cisteína N-terminal, que está presente en la proteína OspA de tipo salvaje de longitud completa, los fragmentos C-terminal de OspA para la lipidación pueden comprender adicionalmente un péptido que comprende un residuo de cisteína seguido de aminoácidos adicionales, mencionados en el presente documento como "péptido de lipidación" o "LP" (véanse las Figs. 1 y 2). Por ejemplo, las secuencias tales como CSS o CKQN (SEQ ID NO: 211)
20 inmediatamente C-terminales con respecto a la secuencia señal de lipidación proporcionan un residuo de cisteína Nterminal para la lipidación, después de la escisión del péptido señal de lipidación. Los péptidos lipidados que contienen cisteína están presentes en el polipéptido lipidado final de la invención.
Se ha encontrado con la proteína OspA de B. burgdorferi s.s. comprende una secuencia con la capacidad de unirse
25 a un receptor de linfocitos T que también tiene la capacidad de unirse a un antígeno humano asociado a función leucocitaria (hLFA-1) (mencionada en el presente documento como "secuencia de tipo hLFA-1"). La similitud de esta región de OspA con hLFA-1 puede dar como resultado una respuesta inmunitaria con reactividad cruzada después de la administración de OspA de B. burgdorferi s.s. a un sujeto humano y puede inducir enfermedades autoinmunitarias, particularmente artritis autoinmune, en sujetos susceptibles. Por consiguiente, en una realización
30 preferida, el polipéptido de la presente invención no comprende una secuencia con capacidad de unión al receptor de linfocitos T que tiene una capacidad de unión al antígeno humano asociado con la función leucocitaria (hLFA-1) y, particularmente, no comprende la secuencia de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17). Para este fin, la secuencia de tipo hLFA-1, particularmente la secuencia de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17), puede reemplazarse con una secuencia homóloga de una proteína OspA de otra Borrelia sp., particularmente con
35 NFTLEGKVAND (SEQ ID NO: 18).
El polipéptido que comprende al menos un enlace disulfuro establece esencialmente la misma capacidad protectora con dicho polipéptido contra una infección por Borrelia en relación con al menos una de las proteínas OspA de longitud completa de tipo salvaje derivadas de al menos una cepa de Borrelia, particularmente B. afzelii K78, OspA
40 de serotipo 2 (SEQ ID NO: 19); B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1 (SEQ ID NO: 20); B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3 (SEQ ID NO: 21); B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4 (SEQ ID NO: 22); B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5 (SEQ ID NO: 23); B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6 (SEQ ID NO: 24), o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7 (SEQ ID NO: 25).
45 Para proporcionar protección cruzada contra diferentes de especies de Borrelia o serotipos de OspA, es deseable el desarrollo de una vacuna multivalente. Como se ha detallado anteriormente, el polipéptido del primer aspecto comprende al menos dos fragmentos mutantes de dos serotipos de Borrelia diferentes, como se ha definido anteriormente. También se divulgan polipéptidos que comprenden al menos dos fragmentos mutantes de OspA que
50 se seleccionan del grupo que consiste en
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 2;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 3;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 4; 55 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 5;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 6;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 7;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 8;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 9;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 3; 5 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 4;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 5;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 6;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 7;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 8; 10 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 9;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 4; 15 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 5;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 6;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 7;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 8;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 9; 20 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 5;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 6; 25 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 7;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 8;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 9;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11; 30 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 6;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 7;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 8;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 9; 35 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 7;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 8; 40 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 9;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 8; 45 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 9;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 8 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 9; 50 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 8 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 8 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 8 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 9 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 10;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 9 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11; 55 - fragmento con enlace disulfuro de tipo 9 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 10 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 11;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 10 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12;
-
fragmento con enlace disulfuro de tipo 11 y fragmento con enlace disulfuro de tipo 12; y
particularmente en donde
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o una
5 secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, en donde las cisteínas no se reemplazan;
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente
10 un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, en donde las cisteínas no se reemplazan;
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, en donde
15 las cisteínas no se reemplazan;
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 4 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5, en donde las cisteínas no se reemplazan;
20 - el fragmento con enlace disulfuro de tipo 5 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, en donde las cisteínas no se reemplazan;
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 6 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o una
25 secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, en donde las cisteínas no se reemplazan;
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 7 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente
30 un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8, en donde las cisteínas no se reemplazan;
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 8 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9, en donde
35 las cisteínas no se reemplazan;
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 9 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, en donde las cisteínas no se reemplazan;
40 - el fragmento con enlace disulfuro de tipo 10 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11, en donde las cisteínas no se reemplazan;
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 11 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o una
45 secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12, en donde las cisteínas no se reemplazan; y/o
-
el fragmento con enlace disulfuro de tipo 12 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, más preferiblemente un 85 %, más preferiblemente
50 un 90 %, incluso más preferiblemente un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 13, en donde las cisteínas no se reemplazan.
Cabe destacar que se han proporcionado anteriormente detalles adicionales sobre mutaciones e identidad de secuencia. 55 Tabla A-5. Nomenclatura y SEQ ID NOs. de heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA, no lipidados y
S1D4-S2D4
43 Lip-S1D4-S2D4 185
S1D1-S2D1
47 Lip-S1D1-S2D1 186
S3D4-S4D4
51 Lip-S3D4-S4D4 187
S3D1-S4D1
55 Lip-S3D1-S4D1 188
S5D4-S6D4
59 Lip-S5D4-S6D4 189
S5D1-S6D1
63 Lip-S5D1-S6D1 190
S2D4-S1D4
67 Lip-S2D4-S1D4 191
S2D1-S1D1
71 Lip-S2D1-S1D1 192
S4D4-S3D4
75 Lip-S4D4-S3D4 193
S4D1-S3D1
79 Lip-S4D1-S3D1 194
S6D4-S5D4
83 Lip-S6D4-S5D4 195
S6D1-S5D1
87 Lip-S6D1-S5D1 196
S1D4-S2D1
91 Lip-S1D4-S2D1 197
S1D1-S2D4
95 Lip-S1D1-S2D4 198
S3D4-S4D1
99 Lip-S3D4-S4D1 199
S3D1-S4D4
103 Lip-S3D1-S4D4 200
S5D4-S6D1
107 Lip-S5D4-S6D1 201
S5D1-S6D4
111 Lip-S5D1-S6D4 202
S2D4-S1D1
115 Lip-S2D4-S1D1 203
S2D1-S1D4
119 Lip-S2D1-S1D4 204
S4D4-S3D1
123 Lip-S4D4-S3D1 205
S4D1-S3D4
127 Lip-S4D1-S3D4 206
S6D4-S5D1
131 Lip-S6D4-S5D1 207
S6D1-S5D4
135 Lip-S6D1-S5D4 208
*S = Serotipo (1-6) (véanse la Tabla A-2); D = Tipo de enlace disulfuro (véase la Tabla A-4); Lip = lipidación: la adición N-terminal de glicerol y residuos de ácidos grasos.
El polipéptido de acuerdo con el primer aspecto puede comprender al menos dos o tres fragmentos mutantes que están conectados a través de uno o más enlazadores. Un enlazador es una secuencia de aminoácidos bastante corta empleada para conectar dos fragmentos. Debería ser diseñada para evitar cualquier impacto negativo en los 5 fragmentos, su interacción en los sujetos a tratar o vacunar, o sobre su capacidad protectora. Se prefieren los enlazadores cortos de como máximo 21 aminoácidos, particularmente como máximo 15 aminoácidos, especialmente como máximo 12 u 8 aminoácidos. Más preferiblemente, el uno o más enlazadores están compuestos por aminoácidos pequeños para reducir o minimizar las interacciones con los fragmentos, tales como glicina, serina y alanina. Los ejemplos de enlazadores preferidos incluyen enlazadores que comprenden o que consiste en poliG,
10 tales como (G)8 (SEQ ID NO: 36) (G)12 (SEQ ID NO: 37), GAGA (SEQ ID NO: 38), (GAGA)2 (SEQ ID NO: 39), (GAGA)3 (SEQ ID NO: 40), (GGGS)2(SEQ ID NO: 41), o (GGGS)3 (SEQ ID NO: 42). Un enlazador más preferido es el enlazador peptídico "LN1", una fusión de dos regiones de bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (aa 65-74 y aa 42-53, con un intercambio de aminoácidos en la posición 53 de D53S) que tiene la siguiente secuencia: GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID NO: 184).
15 En otra realización preferida, el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto comprende un polipéptido con un tamaño total de un máximo de 500 aminoácidos, que comprende dos o tres diferentes fragmentos mutantes, como se define en el primer aspecto; o un polipéptido que consiste esencialmente en dos o tres fragmentos mutantes diferentes, uno o dos enlazadores y, opcionalmente, una cisteína N-terminal; y/o un polipéptido que consiste
20 esencialmente en dos o tres fragmentos mutantes diferentes, una extensión N-terminal del fragmento consiste en un máximo de 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 u 11 aminoácidos, preferiblemente un máximo de 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos, todavía más preferiblemente un máximo de 5, 4, 3, 2 o 1 amino ácidos, en donde la extensión N-terminal está ubicada directamente junto al extremo N a partir del fragmento en la OspA de Borrelia respectiva y, opcionalmente, una cisteína N-terminal. La cisteína N-terminal puede ir seguida opcionalmente de un enlazador
25 peptídico corto de 1-10 aminoácidos de longitud, y preferiblemente adopta la forma de un péptido CSS N-terminal o un péptido CKQN (SEQ ID NO: 211).
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto.
30 La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Para los fines de la invención, el término "ácido(s) nucleico(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o
polidesoxirribonucleótido, que puede ser un ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado, incluidas las regiones/formas monocatenarias y bicatenarias.
El término "ácido nucleico que codifica un polipéptido", como se usa en el presente documento, comprende
5 polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un péptido o polipéptido de la invención. El término también incluye polinucleótidos que incluyen una región continua individual o regiones discontinuas que codifican el péptido o polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos mediante fagos integrados, una secuencia de inserción integrada, una secuencia integrada de vector, una secuencia integrada de transposones, o debido a la edición de ARN o reorganización de ADN genómico) junto con regiones adicionales, que también pueden contener secuencias
10 codificantes y/o no codificantes.
Los expertos en la técnica apreciarán, como resultado de la degeneración del código genético, que hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en el presente documento. Algunos de estos polinucleótidos poseen una similitud mínima a la secuencia de nucleótidos de cualquier gen natural (es decir,
15 de origen natural). No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones se contemplan específicamente por la presente invención, por ejemplo, los polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones humanos y/o de primate y/o de E. coli.
Las secuencias que codifican un polipéptido deseado pueden sintetizarse, en su totalidad o en parte, usando
20 métodos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers, M. H. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. págs. 215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. págs. 225-232 (1980)). Como alternativa, la propia proteína puede producirse usando métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o una porción de la misma. Por ejemplo, la síntesis peptídica puede realizarse usando diversas técnicas de fase sólida (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)) y la síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando el
25 sintetizador de péptidos ASI 431 A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).
Además, las secuencias de polinucleótidos de la presente invención se pueden modificar genéticamente usando métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican polipéptidos con una diversidad de razones, incluyendo, pero sin limitación, alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento y/o
30 la expresión del producto genético. Por ejemplo, se puede utilizar la transposición de ADN mediante fragmentación aleatoria, y reagrupación por PCR de fragmentos genéticos y oligonucleótidos sintéticos para modificar genéticamente las secuencias de nucleótidos. Además, puede utilizarse mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de corte y empalme, o introducir mutaciones, etc.
35 En un aspecto adicional de la invención, la presente invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la invención unido a un promotor inducible, de manera que cuando el promotor es inducido, se expresa un polipéptido codificado por el ácido nucleico. En una realización preferida, el vector es pET28b(+).
40 Un aspecto adicional de la invención comprende dicho vector, en el que el promotor inducible se activa mediante la adición de una cantidad suficiente de IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido) preferiblemente al medio de cultivo. Opcionalmente, éste está a una concentración de entre 0,1 y 10 mM, 0,1 y 5 mM, 0,1 y 2,5 mM, 0,2 y 10 mM, 0,2 y 5 mM, 0,2 y 2,5 mM, 0,4 y 10 mM, 1 y 10 mM, 1 y 5 mM, 2,5 y 10 mM, 2,5 y 5 mM, 5 y10 mM. Como alternativa, el promotor puede ser inducido mediante un cambio en la temperatura o el pH.
45 La molécula de ácido nucleico, como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a cualquier molécula de ácido ribonucleico o molécula de ácido desoxirribonucleico, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. Por lo tanto, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico, como se usa en el presente documento, se refiere a al menos ADN monocatenario o bicatenario, moléculas híbridas que comprenden ADN y
50 ARN que pueden ser de monocatenario, o más comúnmente, bicatenario, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Como se usa en el presente documento, el término molécula de ácido nucleico incluye moléculas de ADN o ARN, como se ha descrito anteriormente, que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, las moléculas de ADN o ARN con esqueletos modificados para la estabilidad o por otros motivos son "moléculas de ácido nucleico", con el significado previsto para este término en el presente documento. Además, las especies de
55 ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tal como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar solamente dos ejemplos, también son moléculas de ácido nucleico, como se define en el presente documento. Se apreciará que se ha realizado una gran diversidad de modificaciones a las moléculas de ADN y ARN que tienen varios fines útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término molécula de ácido nucleico, como se usa en el presente documento, comprende dichas formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de
moléculas de ácido nucleico, así como formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células simples y complejas, entre otras. El término ácido nucleico también incluye moléculas de ácido nucleico cortas a menudo mencionadas como oligonucleótidos. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se usan en el presente documento de manera intercambiable.
5 Los ácidos nucleicos, de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse químicamente. Como alternativa, los ácidos nucleicos pueden aislarse a partir de Borrelia y modificarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Lo mismo se aplica a los polipéptidos de acuerdo con la presente invención.
10 Además, el ácido nucleico de la presente invención puede unirse de manera funcional utilizando técnicas estándar, tales como clonación, a cualquier secuencia deseada, ya sea una secuencia reguladora de Borrelia o una secuencia reguladora heteróloga, secuencia líder heteróloga, secuencia marcadora heteróloga, o una secuencia codificante heteróloga para crear un gen de fusión.
15 Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm o ARNc,
o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genómico obtenido mediante clonación o producido por medio de técnicas de síntesis química o mediante una combinación de las mismas El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario. El ADN monocatenario puede ser la cadena codificante, también conocida como cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, también mencionada como cadena antisentido.
20 El ácido nucleico de la presente invención puede estar compuesto por un vector o en una célula. El vector puede comprender el ácido nucleico mencionado anteriormente de tal manera que el vector sea replicable y pueda expresar la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos en una célula huésped.
25 Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células huésped pueden modificarse genéticamente para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o ácido nucleico de la invención. La introducción de un ácido nucleico en la célula huésped puede realizarse mediante los métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tal como Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor
30 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tal como, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, conjugación, transducción, carga de raspado, introducción balística e infección.
Los ejemplos representativos de huéspedes adecuados incluyen células bacterianas gram negativas, tales como
35 células de E. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Cyanobacteria, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Yersinia. En una realización, la célula huésped es una célula es una célula de Escherichia coli. En una realización preferida, la célula huésped es una célula de E. coli BL21 (DE3) o una célula de E. coli BL21 Star™ (DE3).
40 Como alternativa, pueden también usarse células bacterianas gram positivas. Puede usarse una gran diversidad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. En una realización, el vector se deriva de plásmidos bacterianos. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un huésped pueden usarse para la expresión en este sentido. La
45 secuencia de ADN adecuada puede insertarse en un sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (anteriormente).
En una realización de la presente invención, las células se cultivan a presión selectiva, tal como en presencia de 50 antibióticos, preferiblemente kanamicina. En otra realización, las células se cultivan en ausencia de antibióticos.
Puede usarse una gran diversidad de vectores de expresión para expresar los polipéptidos de acuerdo con la presente invención. Generalmente, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar ácidos nucleicos para expresar un polipéptido en un huésped puede usarse para la expresión en este sentido. De acuerdo con este
55 aspecto de la invención, el vector puede ser, por ejemplo, un vector de plásmido, un vector de fagos monocatenario
o bicatenario, o un vector viral de ADN o ARN monocatenario o bicatenario. Los plásmidos de partida divulgados en el presente documento están disponibles comercialmente, disponibles públicamente o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles mediante la aplicación de rutina de procedimientos publicados bien conocidos. Entre los vectores preferidos, en determinados aspectos, están aquellos para la expresión de moléculas de ácido nucleico
y los polipéptidos de acuerdo con la presente invención. Pueden usarse construcciones de ácido nucleico en células huésped de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden producirse sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales.
5 Además, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende este vector. Los ejemplos representativos de células huésped adecuadas incluyen bacterias, tales como estreptococos y estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; hongos, tales como levadura y Aspergillus; células de insectos, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de mamífero, tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 o
10 células de melanoma de Bowes; y células vegetales. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir dichas proteínas usando ARN derivado de la construcción de ADN de la presente invención.
Para poder expresar la secuencia de aminoácidos deseada de manera práctica mediante la introducción del vector de acuerdo con la presente invención en una célula huésped, el vector puede contener, además de la secuencia de 15 ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, otras secuencias para controlar la expresión (por ejemplo, secuencias promotoras, secuencias de terminación y secuencias potenciadoras) y marcadores genéticos para seleccionar microorganismos, células de insecto, células de cultivo animales, o similares (por ejemplo, genes de resistencia a la neomicina y genes de resistencia a la kanamicina). Además, el vector puede contener la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en una forma repetida (por ejemplo, en tándem). El vector
20 puede construirse basándose en procedimientos y maneras que se usan convencionalmente en el campo de la ingeniería genética.
Las células huésped pueden cultivarse en un medio adecuado, y la proteína de acuerdo con la presente invención puede obtenerse a partir del producto de cultivo. La proteína de acuerdo con la presente invención puede 25 recuperarse del medio de cultivo y purificarse de la manera convencional.
El problema que subyacente de la presente invención se resuelve adicionalmente mediante un método para producir un polipéptido, como se ha definido anteriormente, caracterizado por las siguientes etapas:
30 a) introducir un vector que codifica el polipéptido en una célula huésped, b) cultivar la célula huésped en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido, c) homogeneizar dicha célula huésped, y d) someter el homogenado de la célula huésped a etapas de purificación.
35 Como alternativa, el polipéptido como se ha definido anteriormente, puede producirse por un método caracterizado por las siguientes etapas:
a) introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector, b) introducir dicho vector en una célula huésped,
40 c) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permiten la expresión de polipéptidos, d) homogeneizar dicha célula huésped, e) enriquecer el polipéptido en la fase lipídica mediante separación de fases, y f) purificar adicionalmente sobre una columna de filtración en gel.
45 También se divulga un método para producir un polipéptido como se ha definido anteriormente, caracterizado por las siguientes etapas:
a) introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector, b) introducir dicho vector en una célula huésped,
50 c) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permiten la expresión de polipéptidos, d) homogeneizar dicha célula huésped, e) enriquecer el polipéptido en la fase lipídica mediante separación de fases, g) purificar sobre una columna de filtración en gel, y h) opcionalmente, procesar adicionalmente sobre una columna de intercambio de tampón.
55 Se divulga en el presente documento un anticuerpo, o al menos una parte eficaz del mismo, que se une específicamente a al menos una parte selectiva de un polipéptido, como se ha definido anteriormente.
El anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
La parte eficaz comprende un fragmento Fab, un fragmento F(ab), un fragmento F(ab)N, un fragmento F(ab)2 o un fragmento Fv.
5 El anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
El anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
Los anticuerpos pueden unirse específicamente a la porción de fragmento mutante de OspA de los polipéptidos de la
10 invención, pero no a los polipéptidos de fragmento de OspA de tipo salvaje correspondientes. El anticuerpo puede unirse específicamente al enlace disulfuro del fragmento mutante de OspA.
El término "especificidad" se refiere a la cantidad de tipos diferentes de antígenos o determinantes antigénicos a los cuales se puede unir una molécula particular de unión a antígenos o molécula de proteína de unión a antígenos (tal 15 como un Nanocuerpo o un polipéptido de la invención). La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse basándose en la afinidad y/o la avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión al antígeno (KD) , es una medida para la potencia de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión al antígeno en la proteína de unión a antígenos: cuanto menor sea el valor de KD, más potente será la potencia de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión a
20 antígeno (como alternativa, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (KA), que es 1/KD).
Como será evidente para un experto (por ejemplo, en base a la divulgación adicional en el presente documento), la afinidad puede determinarse de una manera conocida per se, dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la potencia de unión entre una molécula de unión a antígeno (tal como un anticuerpo o una 25 parte eficaz del mismo de la invención) y un antígeno pertinente. La avidez se relaciona tanto con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión al antígeno en la molécula de unión a antígeno y la cantidad de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antígeno. Típicamente, las proteínas de unión a antígeno (tal como un anticuerpo o una parte eficaz del mismo de la invención) se unirán a su antígeno con una constante de disociación (KD) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menos, y preferiblemente 10-7 a 10-12 moles/litro o menos, y más 30 preferiblemente 10-8 a 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de asociación (KA) de 105 a 1012 litros/moles o más, y preferiblemente 107 a 1012 litros/moles o más y más preferiblemente 108 a 1012 litros/moles). Cualquier valor de KD mayor de 104 moles/litro (o cualquier valor de KA menor de 104 M-1) litros/moles se considera generalmente como indicación de unión no específica. Preferiblemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la invención se unirá al antígeno deseado con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, más
35 preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida per se, incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tal como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos de enzimas (EIA) y ensayos de competición tipo sándwich, y las variantes diferentes de los mismos conocidas en la técnica, así como las demás técnicas mencionadas en el presente documento.
40 La constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente, como será evidente para un experto en la técnica. Los métodos para determinar la constante de disociación serán evidentes para el experto en la técnica e incluyen, por ejemplo, las técnicas mencionadas en el presente documento A este respecto, será también evidente que puede no ser posible medir las constantes de disociación de más de 10-4 moles/litro o 10-3 moles/litro
45 (por ejemplo, de 10-2 moles/litro). Opcionalmente, será evidente también para el experto en la técnica que la constante de disociación (real o aparente) puede calcularse en base a la constante de asociación (real o aparente) (KA), por medio de la relación [KD = 1/KA].
La afinidad representa la potencia o estabilidad de una interacción molecular. La afinidad se proporciona
50 comúnmente por la KD, o constante de disociación, que tiene unidades de mol/litro (o M). La afinidad también puede expresarse como una constante de asociación, KA, que equivale a 1/KD y tiene unidades de (mol/litro)-1 (o M-1). En la presente memoria descriptiva, la estabilidad de la interacción entre dos moléculas (tales como una secuencia de aminoácidos, Nanocuerpo o polipéptido de la invención y su diana pretendida) se expresará principalmente en términos del valor de KD de su interacción; será evidente para el experto en la técnica que, a la vista de la relación
55 KA = 1/KD, especificar la potencia de la interacción molecular mediante su valor de KD también puede usarse para calcular el valor de KA correspondiente. El valor de KD también caracteriza la potencia de una interacción molecular en un sentido termodinámico, ya que se relaciona con la energía libre (DG) de unión mediante la relación ya conocida DG = RT.ln(KD) (de manera equivalente DG = -RT.ln(KA)), donde R equivale a la constante de gas, T equivale a la temperatura absoluta, y ln representa el logaritmo natural.
Las KD para interacciones biológicas que se consideran significativas (por ejemplo, específicas) están típicamente en el intervalo de 10-10 M (0,1 nM) a 10-5 M (10000 nM). Cuando mayor sea la interacción, menor será su KD.
5 La KD del anticuerpo puede estar entre 10-12 M y 10-5 M, preferiblemente es menor de 10-6, preferiblemente menor de 10-7, preferiblemente menor de 10-8 M, preferiblemente menor de 10-9 M, más preferiblemente menor de 10-10 M, incluso más preferiblemente menor de 10-11 M, mucho más preferiblemente menor de 10-12 M.
La KD también puede expresarse como la relación de la constante de la tasa de disociación de un complejo,
10 representada como koff, con respecto a la tasa de su asociación, representada kon (de manera que KD = koff/kon y KA = kon/koff). La tasa de disociación koff tiene las unidades s-1 (donde s es la notación para la unidad internacional de segundo). La tasa de asociación kon tiene las unidades M-1 s-1. La tasa de asociación puede variar entre 102 M-1 s-1 a aproximadamente 107 M-1s-1, que se acerca a la constante de tasa de asociación limitada por difusión para interacciones moleculares. La tasa de disociación se refiere a la semivida de una interacción molecular dada
15 mediante la relación t1/2 = ln(2)/koff. La tasa de disociación puede variar entre 10-6 s-1 (complejo casi irreversible con una t1/2 de múltiples días) a 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s).
La afinidad de una interacción molecular entre dos moléculas puede medirse mediante diferentes técnicas conocidas per se, tal como la técnica de biosensor de resonancia de plasmones superficiales (SPR) ya conocida (véase, por
20 ejemplo, Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001) donde una molécula se inmoviliza en el chip del biosensor y la otra molécula se pasa sobre la molécula inmovilizada en condiciones de flujo, lo que produce mediciones de kon, koff y, por lo tanto, valores de KD (o KA). Esto puede realizarse, por ejemplo, usando los instrumentos BIACORE ya conocidos.
25 También será evidente para el experto en la técnica que la KD medida puede corresponder a la KD aparente si el proceso de medición de alguna manera influye en la afinidad de unión intrínseca de las moléculas implicadas, por ejemplo, mediante artefactos relacionados con el recubrimiento en el biosensor de una molécula. También puede medirse una KD aparente si una molécula contiene más de un sitio de reconocimiento para la otra molécula. En dicha situación, la afinidad medida puede verse afectada por la avidez de la interacción por las dos moléculas.
30 Otro enfoque que puede usarse para evaluar la afinidad es un procedimiento de ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) de 2 etapas de Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985). Este método establece una medición de equilibrio de unión de fase en solución y evita los posibles artefactos relacionados con la adsorción de una de las moléculas en un soporte, tal como plástico.
35 Sin embargo, la medición precisa de la KD puede requerir mucho trabajo; por lo tanto, los valores de KD aparente a menudo se determinan para evaluar la potencia de unión de dos moléculas. Cabe destacar que siempre que las mediciones se realicen de una manera consistente (por ejemplo, al mantener las condiciones de ensayo inalteradas), las mediciones de KD aparente pueden usarse como una aproximación de la KD verdadera y, por lo
40 tanto, en el presente documento KD y KD aparente deberían tratarse como de igual importancia o relevancia.
Finalmente, cabe destacar que en muchas situaciones el científico experimentado puede considerar conveniente la determinación de la afinidad de unión en relación con alguna molécula de referencia. Por ejemplo, para evaluar la potencia de unión entre moléculas A y B, se puede usar, por ejemplo, una molécula de referencia C que se sabe que
45 se une a B y que está marcada de manera adecuada con un grupo fluoróforo o cromóforo u otro resto químico, tal como biotina para la fácil detección por medio de ELISA o citometría de flujo u otro formato (el fluoróforo para la detección por fluorescencia, el cromóforo para la detección de absorción de luz, la biotina para la detección por ELISA mediada por estreptavidina). Típicamente, la molécula de referencia C se mantiene a una concentración fija y la concentración de A varía para una concentración o cantidad de B dada. Como resultado, se obtiene un valor de
50 concentración inhibidora (IC)50 correspondiente a la concentración de A a la que la señal medida para C en ausencia de A disminuye a la mitad. Siempre que se conozca KD ref, la KD de la molécula de referencia, así como la concentración total cref de la molécula de referencia, la KD aparente para la interacción A-B puede obtenerse a partir de la siguiente fórmula: KD = IC50/(1 + cref/KDref). Ha de apreciarse que si Cref << KDref, KD ≈ IC50. Siempre que la medición de la IC50 se realice de una manera consistente (por ejemplo, manteniendo la cref fija) para los aglutinantes
55 que se están comparando, la potencia o estabilidad de una interacción molecular puede evaluarse mediante la IC50 y esta medición se considera como equivalente a la KD o a la KD aparente a lo largo de este texto.
También se describe una línea celular de hibridoma, que produce un anticuerpo como se ha definido anteriormente.
El anticuerpo como se ha definido anteriormente, puede producirse por un método caracterizado por las siguientes etapas:
a) iniciar una respuesta inmune en un animal no humano mediante la administración de un polipéptido,
5 como se ha definido anteriormente, a dicho animal, b) extraer fluido corporal que contiene anticuerpo de dicho animal, y c) producir el anticuerpo sometiendo dicho fluido corporal que contiene anticuerpo a etapas posteriores de purificación
10 o mediante las siguientes etapas:
a) iniciar una respuesta inmune en un animal no humano mediante la administración de un polipéptido, como se ha definido anteriormente, a dicho animal, b) extraer el bazo o células esplénicas de dicho animal,
15 c) producir células de hibridoma de dicho bazo o células esplénicas, d) seleccionar y clonar células de hibridoma específicas para dicho polipéptido, e) producir el anticuerpo mediante cultivo de dichas células de hibridoma clonadas, y f) opcionalmente realizar etapas adicionales de purificación.
20 También se describe una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, como se ha definido anteriormente.
La descripción divulga un anticuerpo, como se ha definido anteriormente, o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se ha definido anteriormente, para el tratamiento o prevención de una infección con
25 especies de Borrelia, más preferiblemente especies patógenas de Borrelia como se divulga en el presente documento, que comprenden, más preferiblemente, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii.
El problema subyacente de la presente invención se resuelve en otro aspecto mediante el uso de un anticuerpo, como se ha definido anteriormente, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o
30 prevención de infecciones con especies de Borrelia, más preferiblemente especies patógenas de Borrelia como se divulga en el presente documento, que comprenden, más preferiblemente, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el polipéptido
35 de acuerdo con el primer aspecto y/o el ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto. La composición farmacéutica puede contener, opcionalmente, cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, tales como sustancias tamponantes, estabilizadores u otros principios activos, especialmente ingredientes conocidos relacionados con la producción de vacunas y/o composiciones farmacéuticas. Preferiblemente, la composición farmacéutica se utiliza como un medicamento, particularmente como una vacuna o para la prevención o tratamiento
40 de una infección causada por especies de Borrelia, más preferiblemente especies patógenas de Borrelia como se divulga en el presente documento, que comprenden, más preferiblemente, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii, y/u otros patógenos contra los cuales se han incluido los antígenos en la vacuna.
En una realización, la composición farmacéutica comprende adicionalmente un adyuvante. La elección de un
45 adyuvante adecuado a mezclar con toxinas bacterianas o conjugados realizados usando los procesos de la invención se encuentra en el conocimiento del experto en la técnica. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio, tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, pero también pueden ser otras sales metálicas tales como las de calcio, magnesio, hierro o cinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, sacáridos derivados de manera aniónica o catiónica, o polifosfacenos. En una realización preferida, la
50 composición farmacéutica se forma como adyuvante con hidróxido de aluminio.
En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende además una sustancia inmunoestimulante, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en polímeros policatiónicos, especialmente péptidos policatiónicos, oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes (ODN), especialmente oligo(dIdC)13 (SEQ ID NO: 32),
55 péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente el péptido KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 33), compuestos neuroactivos, especialmente la hormona de crecimiento humana, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, adyuvante completo o incompleto de Freund, o combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la sustancia inmunoestimulante es una combinación de un polímero policatiónico y desoxinucleótidos inmunoestimulantes o de un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys y desoxinucleótidos
inmunoestimulantes, preferiblemente una combinación de KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 33) y oligo(dIdC)13 (SEQ ID NO: 32). Más preferiblemente, dicho péptido policatiónico es poliarginina.
En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende fosfato de sodio, cloruro de sodio, L5 metionina, sacarosa y Tween-20 a un pH de 6,7 +/- 0,2. Preferiblemente, la composición farmacéutica también comprende hidróxido de aluminio, preferiblemente en una concentración del 0,15 %.
En una realización, la formulación comprende fosfato de sodio entre 5 mM y 50 mM, cloruro de sodio entre 100 y 200 mM, L-metionina entre 5 mM y 25 mM, sacarosa entre el 2,5 % y el 10 %, Tween 20 entre el 0,01 % y el 0,1 % e
10 hidróxido de aluminio entre el 0,1 % y el 0,2 % (p/v). Más preferiblemente, la formulación comprende fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, L-metionina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween 20 al 0,05 % e hidróxido de aluminio al 0,15 % (p/v) a pH 6,7 ± 0,2. Aun más preferiblemente, la formulación comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres heterodímeros mutantes de OspA (uno de los cuales es el polipéptido de acuerdo con la invención).
15 En una realización, la composición farmacéutica comprende 3 heterodímeros (uno de los cuales es el polipéptido de la invención), preferiblemente Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 186), Lip-S4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 194) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 190). Preferiblemente, los tres heterodímeros se mezclan en una relación molar de 1:2:1, 1:3:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:2:2, 1:2:3, 1:3:2, 1:3:3, 2:1:1, 2:1:2, 2:1:3, 2:2:3, 2:2:1, 2:3:1, 2:3:2, 2:3:3, 3:1:1, 3:1:2, 3:1:3, 3:2:1, 3:2:2, 3:2:3, 3:3:1, 3:3:2, mucho más preferiblemente 1:1:1.
20 En una realización adicional, la composición farmacéutica comprende dos heterodímeros (uno de los cuales es el polipéptido de la invención), preferiblemente Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 186) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 190), Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 186) y Lip-S4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 194) o Lip-S4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 194) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 190) en una relación molar de 1:2, 1:3, 2:1, 3:1, 2:3, 3:2, preferiblemente 1:1.
25 En una realización, la composición farmacéutica o vacuna de la invención comprende además al menos un antígeno adicional (mencionado en el presente documento de manera genérica como "vacuna de combinación"). En una realización preferida, el al menos un antígeno adicional se deriva de una especie de Borrelia causando borreliosis de Lyme. En diversos aspectos, el al menos un antígeno adicional se deriva de otro patógeno, preferiblemente un
30 patógeno transmitido por garrapatas. En un aspecto adicional, el patógeno causa la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, ehrlichiosis granulocítica humana (HGE), fiebre sennetsu, ehrlichiosis monocítica humana (HME), anaplasmosis, fiebre botonosa, Rickettsia parkeri Rickettsiosis, erupción asociada a garrapatas del sur (STARI), fiebre manchada por Rickettsia, rickettsiosis 364D, fiebre manchada africana, fiebre reincidente, tularemia, fiebre de Colorado por garrapatas, encefalitis transmitida por garrapatas (TBE, también conocida como FSME),
35 fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, fiebre Q, fiebre hemorrágica de Omsk, enfermedad de la selva de Kyasanur, encefalitis de Powassan, enfermedad del virus Heartland o babesiosis. En un aspecto adicional, la enfermedad es encefalitis japonesa.
En una realización adicional, el al menos un antígeno adicional se deriva de un patógeno transmitido por vector,
40 preferiblemente transmitido por garrapatas, seleccionado del grupo que comprende Borrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conori, Rickettsia helvetica, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Coxiella burnetii y Borrelia lonestari, virus de encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV, también conocida como virus FSME), virus de la fiebre de Colorado transmitida por garrapatas (CTFV), virus de la fiebre hemorrágica de
45 Crimea-Congo (CCHFV), virus de la fiebre hemorrágica de Omsk (OHFV), virus de la encefalitis japonesa (JEV) y Babesia spp.
En otro aspecto, una vacuna de combinación de la invención comprende cualquier composición de vacuna analizada en el presente documento en combinación con al menos una segunda composición de vacuna. En algunos
50 aspectos, la segunda composición de vacuna protege contra una enfermedad transmitida por vector, preferiblemente una enfermedad transmitida por garrapatas. En diversos aspectos, la segunda composición de vacuna tiene un programa de inmunización por estaciones compatible con la inmunización contra la infección por Borrelia o borreliosis de Lyme. En otros aspectos, las vacunas de combinación son útiles en la prevención de múltiples enfermedades para su uso en ubicaciones geográficas donde son prevalentes estas enfermedades.
55 En un aspecto, la segunda composición de vacuna es una vacuna seleccionada del grupo que consiste en una vacuna contra la encefalitis transmitida por garrapatas, una vacuna contra la encefalitis japonesa y una vacuna contra la fiebre manchada de las Montañas Rocosas. En un aspecto preferido, la composición de vacuna es FSME-IMMUN® (Baxter), Encepur® (Novartis Vaccines), EnceVir® (Microgen NPO) o TBE Moscow Vaccine® (Chumakov
Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides of Russian Academy of Medical Sciences). En otro aspecto preferido, la composición de vacuna es IXIARO®/JESPECT® (Valneva SE), JEEV® (Biological E, Ltd.) o IMOJEV® (Sanofi Pasteur).
5 Se proporciona adicionalmente una vacuna que comprende la composición farmacéutica, esta vacuna puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, el excipiente es Lmetionina.
La invención también incluye composiciones inmunogénicas. En algunos aspectos, una composición inmunogénica
10 de la invención comprende cualquiera de las composiciones analizadas en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En diversos aspectos, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que se une específicamente a una proteína A de la superficie externa (OspA). En ciertos aspectos, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que se une específicamente a Borrelia. En aspectos particulares, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir
15 la producción de un anticuerpo que neutraliza a Borrelia. En algunos aspectos, el anticuerpo es producido por un animal. En aspectos adicionales, el animal es un mamífero. Incluso en aspectos adicionales, el mamífero es un ser humano.
Las preparaciones de vacuna que contienen composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
20 utilizarse para proteger a un mamífero susceptible a infección por Borrelia o tratar a un mamífero con infección por Borrelia, mediante la administración de dicha vacuna a través de una vía sistémica o una mucosa. Estas administraciones pueden incluir la inyección mediante las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración a través de mucosas al tracto oral/alimenticio, respiratorio o genitourinario. Aunque la vacuna de la invención puede administrarse como una única dosis, los componentes de la misma pueden
25 coadministrarse también en conjunto al mismo tiempo o en diferentes momentos.
Se proporciona un kit de vacunación que comprende un vial que contiene una composición farmacéutica de la invención, opcionalmente de forma liofilizada, y que comprende además un vial que contiene un adyuvante como se describe en el presente documento. Se prevé que en este aspecto de la invención el adyuvante se usará para
30 reconstruir la composición inmunogénica liofilizada. En un aspecto adicional, la composición farmacéutica de la invención puede premezclarse en un vial, preferiblemente en una jeringa.
La descripción proporciona un método para la prevención o tratamiento de la infección por Borrelia que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición farmacéutica, vacuna o kit de la invención. Se 35 proporciona un método para la prevención o tratamiento de episodios primarios y/o recurrentes de la infección por Borrelia que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición farmacéutica, vacuna
o kit de la invención.
Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento
40 o prevención de la enfermedad de Borrelia. En una realización se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia.
También se describe el uso de la composición farmacéutica, vacuna o kit de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia. En una realización se proporciona una
45 composición farmacéutica de la invención para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia.
La descripción proporciona métodos para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto. En diversos aspectos, dichos métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones inmunogénicas o
50 composiciones de vacuna analizadas en el presente documento al sujeto en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunológica. En ciertos aspectos, la respuesta inmunológica comprende la producción de un anticuerpo anti-OspA.
La descripción proporciona métodos para la prevención o tratamiento de una infección por Borrelia o borreliosis de
55 Lyme en un sujeto. En diversos aspectos, dichos métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones de vacuna analizadas en el presente documento o cualquiera de las vacunas de combinación analizadas en el presente documento al sujeto en una cantidad eficaz para la prevención o tratamiento de la infección por Borrelia o borreliosis de Lyme.
La descripción proporciona usos de polipéptidos, ácidos nucleicos, anticuerpos, composiciones farmacéuticas o vacunas de la invención para la preparación de medicamentos. También se proporcionan en la presente invención otros aspectos relacionados.
5 Los términos "que comprende", "comprenden" y "comprende" en el presente documento pretender ser reemplazables opcionalmente por los inventores con los términos "que consiste en", "consisten en" y "consiste en", respectivamente, en cada caso. El término "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprende", y variaciones tales como "comprenden" y "que comprende" implicarán la inclusión de un compuesto o composición indicada (por ejemplo, ácido nucleico,
10 polipéptido, anticuerpo) o etapa, o grupo de compuestos o etapas, pero no implicará la exclusión de ningún otro compuesto, composición, etapa o grupo de los mismos. La abreviatura "e.g." deriva del latín exempli gratia y se utiliza en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto, la abreviatura "e.g." es sinónimo de la expresión "por ejemplo".
15 Las realizaciones de la presente relacionadas con "composiciones de vacuna" de la invención se pueden aplicar también a realizaciones relacionadas con "composiciones farmacéuticas" de la invención y viceversa.
A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación.
20 Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew ef al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8).
25 Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Además, debe entenderse que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o
30 polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para la descripción. Adicionalmente, las limitaciones numéricas proporcionadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antígeno, pueden ser aproximadas.
Un vehículo o excipiente preferible para los polipéptidos de acuerdo con la presente invención en sus distintas
35 realizaciones, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es un compuesto inmunoestimulante tal como un adyuvante para una estimulación adicional de la respuesta inmunitaria al polipéptido de acuerdo con la presente invención o una molécula codificante de ácido nucleico de la misma.
Los adyuvantes que pueden usarse en composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación: 40
A. Composiciones que contienen minerales
Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como
45 hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc., o mezclas de diferentes compuestos minerales, adoptando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y prefiriéndose la adsorción. Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal metálica.
50 Un adyuvante útil de fosfato de aluminio es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO4/Al entre 0,84 y 0,92. Otro adyuvante útil a base de aluminio es AS04, una combinación de hidróxido de aluminio + lípido monofosforilado A (MPL).
B. Emulsiones en aceite
55 Las composiciones de emulsiones en aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno en agua, tales como MF59 (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %, formulado en partículas submicrométricas con un microfluidizador), AS03 (escualeno, DL-α-tocoferol y Tween 80) y AF03 (escualeno, Montane® 80 y Eumulgon® B1 PH). También pueden utilizarse el adyuvante completo de Freund
(CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA).
Las emulsiones útiles de aceite en agua típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, donde el uno o más aceites o tensioactivos son biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotas de aceite en
5 la emulsión generalmente tienen menos de 1 µm de diámetro y se llega a estos tamaños pequeños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Son preferidas las gotas con un tamaño menor de 220 nm, dado que pueden someterse a esterilización de filtro.
La emulsión puede comprender aceites tales como aquellos de una fuente animal (tal como un pez) o vegetal. Las
10 fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. Los ejemplos de aceite de frutos secos son aceite de maní, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, los más comúnmente disponibles. Puede utilizarse el aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido del grano de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más disponible, pero puede utilizarse también el aceite de otros granos de
15 cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale y similares. Pueden prepararse ésteres de carbono 6-10 de ácidos grasos de glicerol y 1,2-propanodiol, mientras que no tienen un origen natural en los aceites de semillas, mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados, partiendo de los aceites de semillas y frutos secos. Las grasas y aceites de leche de mamíferos son metabolizables y pueden usarse, por lo tanto, en la práctica de esta invención. Se conocen en la técnica los procedimientos para la separación, purificación,
20 saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables, los cuales pueden recuperarse rápidamente. Por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón y aceite de ballena, tal como espermaceti, son ejemplos de varios de los aceites de pescado que pueden utilizarse en el presente documento. Una cantidad de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímica en unidades de 5-carbono isopreno y generalmente se denominan terpenoides. El aceite de
25 hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado e insaturado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que se prefiere particularmente en el presente documento. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también es un aceite preferido. Los aceites de pescado, incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o pueden obtenerse por métodos conocidos en la técnica. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (véase más adelante). Pueden
30 utilizarse mezclas de aceites.
Los tensioactivos pueden clasificarse por su "HLB" (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferiblemente al menos 15, y más preferiblemente al menos 16. La invención puede usarse con tensioactivos que incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de ésteres de 35 polioxietilensorbitán (denominados comúnmente Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO), a la venta con el nombre comercial DOWF AX™, tales como copolímeros de bloque lineales EO/PO; octoxinoles, que pueden variar en la cantidad de grupos de etoxi de repetición (oxi-1,2-etanodiilo), siendo octoxinol-9 (Triton X-100 o toctilfenoxipolietoxietanol) de interés particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tal 40 como fostatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tal como Tergitol™ serie NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílicos, cetílicos, estearílicos y oleílicos (conocidos como tensioactivos Brij), tales como trietilenglicol monolauril éter (Brij 30); y ésteres de sorbitán (conocidos comúnmente como SPAN), tal como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos preferidos para su inclusión en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietilen sorbitán), Span 85 (trioleato de
45 sorbitán), lecitina y Triton X-100.
Pueden usarse mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilen sorbitán, tal como monooleato de polioxietilen sorbitán (Tween 80) y un octoxinol, tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster
50 de polioxietileno sorbitán y/o un octoxinol.
Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de polioxietilen sorbitán (tal como Tween 80) del 0,01 al 1 %, en particular aproximadamente el 0,1 %; octil o nonilfenoxi polioxietanoles (tal como Triton X-100, u otros detergentes de la serie Triton) del 0,001 al 0,1 %, en particular del 0,005 al 0,02 %; éteres de polioxietileno (tal
55 como laureth 9) del 0,1 al 20 %, preferiblemente del 0,1 al 10 %, y en particular del 0,1 al 1 % o aproximadamente al 0,5 %.
Preferiblemente, sustancialmente todas (por ejemplo, al menos el 90 % en número) las gotas de aceite tienen un diámetro de menos de 1 µm, por ejemplo, <750 nm, <500 nm, <400 nm, <300 nm, <250 nm, <220 nm, <200 nm, o
inferior. Una emulsión submicrométrica útil específica consiste en escualeno, Tween 80 y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente el 5 % de escualeno, aproximadamente el 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente el 0,5 % de Span 85. En términos de peso, estas relaciones se convierten en el 4,3 % de escualeno, el 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente el 0,48 % de Span 85. La emulsión de MF59
5 incluye, de manera ventajosa, iones de citrato, por ejemplo, tampón de citrato de sodio 10 mM.
C. Formulaciones de saponina
Las formulaciones de saponina también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un
10 grupo heterogéneo de glucósidos de esteroles y glucósidos triterpenoides que se encuentran en el tronco, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies vegetales. Se ha estudiado extensivamente la saponina del tronco del árbol de la Quillaja saponaria Molina como adyuvante. La saponina también puede obtenerse en el mercado a partir de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (jabonera). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como
15 QS21, así como formulaciones de lípidos, tal como ISCOM. QS21 se comercializa como Stimulon™.
Las composiciones de saponina se han purificado mediante HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas usando estas técnicas, incluyendo QS7, QS 17, QS 18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferiblemente, la saponina es QS21. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal
20 como colesterol.
Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden utilizarse para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM). Los ISCOM típicamente incluyen también un fosfolípido tales como fosfatidiletanolamina o fostatidilcolina. Puede usarse cualquier saponina conocida en los ISCOM. Preferiblemente, el
25 ISCOM incluye uno o más de QS7, QS 17, QS 18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Opcionalmente, los ISCOM pueden carecer de detergentes adicionales.
D. Virosomas y partículas pseudovíricas
30 Los virosomas y las partículas pseudovíricas (VLP) también pueden utilizarse como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Generalmente son no patogénicos, no replicantes y generalmente no contienen nada del genoma viral natural. Las proteínas virales pueden producirse o aislarse de virus completos de manera recombinante. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la influenza
35 (tales como HA o NA), virus de la hepatitis B (tales como proteínas de cápside o nucleares), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, Rotavirus, virus de la fiebre aftosa, Retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fagos Qβ (tales como proteínas de cubierta), fagos GA, fagos fr, fagos AP205 y Ty (tal como la proteína pi del retrotransposón Ty).
40 E. Derivados bacterianos o microbianos
Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacáridos (LPS) enterobacterianos, derivados del lípido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas de ADP-ribosilante y derivados desintoxicados de las mismas.
45 Los derivados no tóxicos de LPS incluyen el lípido monofosforilado (MPL) A y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla del lípido monofosforilo A 3 des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Dichas "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para filtrarse de manera estéril a través de una membrana de 0,22 µm. Otros derivados no tóxicos de LPS incluyen miméticos de lípido A de monofosforilo, tales como derivados
50 de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por ejemplo, RC-529 y el dímero de fosfolípido sintético, E6020.
Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citosina no metilada unida por un
55 enlace fosfato a una guanosina). Los ARN y oligonucleótidos bicatenarios que contienen secuencias palíndromas o poli(dG) también han demostrado ser inmunoestimulantes.
Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. La secuencia de CpG puede estar dirigida a TLR9, tales como los
motivos GTCGTT o TTCGTT. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune de Th1, tal como un ODN de CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN de CpG-B. Preferiblemente, el CpG es un ODN de CpG-A.
5 Preferiblemente, el oligonucleótido CpG se construye de manera que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento de receptores. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos CpG pueden estar unidas por sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimulantes se conoce como IC31®. Por lo tanto, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos un (y
10 preferiblemente múltiples) motivos CpI (es decir, una citosina unida a una inosina para formar un dinucleótido), y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferiblemente múltiples) secuencias tripeptídicas Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia de 26-mer 5'-(dIdC)13-3' (SEQ ID NO: 32). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de 11-mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 33).
15 Los compuestos policatiónicos derivados de fuentes naturales incluyen HIV-REV o HIV-TAT (péptidos catiónicos derivados, péptidos antenapedia, quitosano u otros derivados de quitina) u otros péptidos derivados de estos péptidos o proteínas mediante producción bioquímica o recombinante. Otros compuestos policatiónicos preferidos son la catelina o sustancias relacionadas o derivadas de la catelina. Por ejemplo, la catelina de ratón es un péptido
20 que tiene la secuencia de aminoácidos NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE-COOH (SEQ ID NO: 31). Las sustancias relacionadas o derivadas de catelina contienen la totalidad o partes de la secuencia de catelina con al menos 15-20 residuos de aminoácidos. Los derivados pueden incluir la sustitución o modificación de los aminoácidos naturales por aminoácidos que no están entre los 20 aminoácidos estándar. Además, pueden introducirse residuos catiónicos adicionales en dichas moléculas de catelina. Se prefiere que estas moléculas de
25 catelina se combinen con el antígeno. Sorprendentemente, estas moléculas de catelina han resultado ser eficaces también como un adyuvante para un antígeno sin la adición de adyuvantes adicionales. Por lo tanto, es posible usar dichas moléculas de catelina como adyuvantes eficaces en formulaciones de vacuna con o sin sustancias adicionales de activación inmunitaria.
30 Las toxinas bacterianas ADP-ribosilantes y derivados desintoxicados de las mismas pueden utilizarse como adyuvantes en la invención. Preferiblemente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina termolábil de E. coli "LT"), Vibrio cholerae (toxina del cólera "CT"), o Bordetella pertussis (toxina Pertussis "PT"). Se conoce el uso de toxinas ADP-ribosilantes desintoxicadas como adyuvantes mucosos y adyuvantes parenterales. Preferiblemente, la toxina o toxoide se encuentra en la forma de una holotoxina, que comprende subunidades tanto A como B. Preferiblemente,
35 la subunidad A contiene una mutación desintoxicante; preferiblemente, la subunidad B no está mutada. Preferiblemente, el adyuvante es un mutante de LT desintoxicado tal como LT-K63, LT-R72, LT-G192 o dmLT. Un mutante útil de CT es CT-E29H.
F. Inmunomoduladores humanos
40 Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, interferón-y), factor estimulador de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferido es IL-12.
45 G. Bioadhesivos y mucoadhesivos
Los bioadhesivos y mucoadhesivos también pueden utilizarse como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas esterificadas de ácido hialurónico o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de ácido poliacrílico, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También
50 pueden usarse quitosano y derivados del mismo como adyuvantes en la invención.
H. Micropartículas
Las micropartículas también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una
55 partícula de ~100 nm a ~150 µm de diámetro, más preferiblemente de ~200 nm a ~30 µm de diámetro, y mucho más preferiblemente de ~500 nm a ~10 µm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no son tóxicos (por ejemplo, un poli(ácido α-hidroxi), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, un poli(láctido-co-glicólido) etc.), en donde se prefiere poli(láctido-co-glicólido), opcionalmente tratadas para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada
positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).
I. Liposomas
5 Se conocen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes.
J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno
Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno.
10 Dichas formulaciones incluyen además tensioactivos de éster polioxietilen sorbitán en combinación con un octoxinol, así como tensioactivos de alquil éteres o ésteres de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol. Los éteres de polioxietileno se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9lauril éter (laureth 9), polioxietilen-9-esteoril éter, polioxietilen-8-esteoril éter, polioxietilen-4-lauril éter, polioxietilen35-lauril éter, y polioxietilen-23-lauril éter.
K. Péptidos de muramilo
Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), y N
20 acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoil-5n-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).
L. Compuestos de imidazoquinolona.
Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la invención 25 incluyen Imiquimod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M").
La invención puede comprender también combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente.
30 Preferiblemente, el compuesto inmunoestimulante en la preparación farmacéutica de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo de sustancias policatiónicas, especialmente péptidos policatiónicos, moléculas de ácidos nucleicos inmunoestimulantes, preferiblemente desoxinucleótidos inmunoestimulantes, emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite, MF59, sales de aluminio, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, compuestos neuroactivos, especialmente la hormona de crecimiento humana, o combinaciones de los
35 mismos.
Se prefiere particularmente el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio, y los antígenos generalmente se adsorben en estas sales.
40 Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es una composición farmacéutica que comprende al menos cualquiera de los siguientes compuestos o combinaciones de los mismos: las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención en sus distintas realizaciones, el vector de acuerdo con la presente invención, las células de acuerdo con la presente invención y el anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Con respecto a esto, cualquiera de estos
45 compuestos puede emplearse en combinación con uno o más vehículos estériles o no estériles para su uso con células, tejidos u organismos, tal como un vehículo farmacéutico adecuado para su administración a un sujeto. Dichos vehículos pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debería adaptarse al modo de administración.
50 En una realización, la composición farmacéutica comprende un estabilizador. El término "estabilizador" se refiere a una sustancia o excipiente de vacuna que protege la composición inmunogénica de la vacuna de condiciones adversas, tales como aquellas que se producen durante el calentamiento o la congelación, y/o prolonga la estabilidad o semivida de la composición inmunogénica en una condición o estado estable e inmunogénico. Los ejemplos de estabilizadores incluyen, pero sin limitación, azúcares, tales como sacarosa, lactosa y manosa;
55 alcoholes de azúcar, tal como manitol; aminoácidos, tales como glicina o ácido glutámico; y proteínas, tales como albúmina sérica humana o gelatina.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas de cualquier manera eficaz y conveniente, incluyendo, por ejemplo, administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal,
intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal o intradérmica, entre otras En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas se administran por vía subcutánea o intramuscular, más preferiblemente intramuscular.
5 En terapia o como un profiláctico, el agente activo de la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.
Como alternativa, la composición, preferiblemente la composición farmacéutica, puede formularse para
10 administración tópica, por ejemplo, en forma de ungüentos, cremas, lociones, ungüentos para los ojos, gotas para los ojos, gotas para los oídos, enjuague bucal, apósitos y suturas impregnados y aerosoles, y pueden contener aditivos convencionales adecuados, incluyendo, por ejemplo, conservantes, disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, y emolientes en ungüentos y cremas. Dichas formulaciones tópicas pueden contener también vehículos convencionales compatibles, por ejemplo, bases de cremas o ungüentos, y etanol u alcohol oleílico para lociones.
15 Dichos vehículos pueden constituir de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 98 % en peso de la formulación; más usualmente constituirán hasta aproximadamente el 80 % en peso de la formulación.
Además de la terapia descrita anteriormente, las composiciones de esta invención pueden utilizarse generalmente como un agente de tratamiento de heridas para evitar la adhesión de bacterias a las proteínas de matriz expuestas
20 en el tejido de la herida y para uso profiláctico en tratamientos dentales como una alternativa a, o junto con, la profilaxis antibiótica.
En una realización preferida, la composición farmacéutica es una composición de vacuna. Preferiblemente, dicha composición de vacuna se encuentra, convenientemente, en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes
25 convencionales para potenciar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación con un antígeno de proteína es, para adultos, entre 0,02 µg y 3 µg de antígeno por kg de peso corporal, y para niños, entre 0,2 y 10 µg de antígeno por kg de peso corporal, y dicha dosis se administra preferiblemente de 1 a 3 veces en intervalos de 2 a 24 semanas.
30 En el intervalo de dosis indicado, no se esperan efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención, lo cual impediría su administración a individuos adecuados.
La descripción divulga kits que comprenden una o más formulaciones farmacéuticas para su administración a un sujeto, envasadas de forma que facilite su uso para la administración a sujetos. En una realización preferida, los kits
35 comprenden la formulación en un volumen final de 2 ml, más preferiblemente en un volumen final de 1 ml.
Los kits pueden usarse para producir una única dosis unitaria de administración. En diversos aspectos, cada kit contiene tanto un primer recipiente con una proteína seca como un segundo recipiente con una formulación acuosa. Se incluyen también dentro del alcance de esta invención los kits que contienen jeringas precargadas con cámara
40 individual y múltiple (por ejemplo, jeringas de líquido y liojeringas).
En otra realización, tal kit incluye una formulación farmacéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende una proteína o péptido terapéutico), envasada en un recipiente tal como una botella o frasco sellados, con una etiqueta pegada al recipiente o incluida en el paquete que describe el uso del compuesto o
45 composición para poner en práctica el método. En una realización, la formulación farmacéutica se envasa en el recipiente de forma que la cantidad de espacio vacío en el recipiente (por ejemplo, la cantidad de aire entre la formulación líquida y la parte superior del recipiente) sea muy pequeño. Preferiblemente, la cantidad de espacio vacío es insignificante (es decir, casi nula).
50 En un aspecto, el kit contiene un primer recipiente que tiene una composición de proteína o péptido terapéutica y un segundo recipiente que tiene una solución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición En un aspecto, la formulación farmacéutica se envasa en una forma de dosificación unitaria. El kit incluye además, opcionalmente, un dispositivo adecuado para la administración de la formulación farmacéutica de acuerdo con una vía específica de administración. En algunos aspectos, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de las
55 formulaciones farmacéuticas.
La composición farmacéutica puede contener una gama de antígenos diferentes. Los ejemplos de antígenos son organismos atenuados o eliminados en su totalidad, subfracciones de estos organismos, proteínas o, en su forma más simple, péptidos. Los antígenos también pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario en la forma de
proteínas o péptidos glucosilados y pueden también ser, o contener, polisacáridos o lípidos. Pueden utilizarse péptidos cortos, dado que los linfocitos T citotóxicos (CTL) reconocen antígenos en forma de péptidos cortos, usualmente de 8-11 aminoácidos de longitud, junto con un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los linfocitos B pueden reconocer epítopos lineales de 4 a 5 aminoácidos, así como estructuras tridimensionales
5 (epítopos conformacionales).
En una realización preferida, la composición farmacéutica del tercer aspecto comprende adicionalmente un antígeno reactivo al suero hiperinmune contra una proteína de Borrelia o un fragmento activo o variante del mismo, tales como, por ejemplo, los antígenos, fragmentos y variantes que se describen en el documento WO 2008/031133.
10 De acuerdo con la invención, la composición farmacéutica de acuerdo con un tercer aspecto puede utilizarse como un medicamento, particularmente como una vacuna, particularmente en relación con particularmente una enfermedad o patología que está causada por, vinculada a, o asociada con Borrelia.
15 La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse como un medicamento, particularmente como una vacuna, particularmente en relación con una enfermedad o patología que está causada, vinculada a, o asociada con Borrelia, más preferiblemente cualquier especie patogénica de Borrelia, y más preferiblemente para su uso en un método para el tratamiento o prevención de una infección por Borrelia, particularmente una infección por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B.
20 spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, preferiblemente una infección por B. burgdorferi s.s., B. afzelii o
B. garinii.
Con respecto a esto, debería observarse que las distintas especies de Borrelia, inclusive B. burgdorferi s.l., comprenden varias especies y cepas que incluyen las divulgadas en el presente documento. Una enfermedad 25 relacionada, causada o asociada con la infección bacteriana a prevenir y/o tratar de acuerdo con la presente invención incluye la borreliosis de Lyme (enfermedad de Lyme). Se incorporan en el presente documento por referencia aspectos, síntomas, fases y subgrupos adicionales de la borreliosis de Lyme, así como grupos específicos de pacientes que padecen dicha enfermedad como también se divulga en el presente documento, incluyendo en la parte introductoria. Más específicamente, la borreliosis de Lyme generalmente tiene lugar en fases, con remisión y
30 exacerbaciones con diferentes manifestaciones clínicas en cada fase. La fase 1 de infección temprana consiste en una infección localizada de la piel, seguida en pocos días o semanas de la etapa 2, infección diseminada, y en meses a años después por la fase 3, infección persistente. No obstante, la infección es variable; algunos pacientes tienen únicamente infecciones cutáneas localizadas, mientras que otros presentan únicamente manifestaciones posteriores de la enfermedad, tal como artritis.
35 Se describe adicionalmente un método para el tratamiento o la prevención de una infección por Borrelia en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de acuerdo con el tercer aspecto.
40 El término "sujeto" se usa a lo largo de la memoria descriptiva para describir un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, a quien se proporciona un tratamiento o un método de acuerdo con la presente invención. Para el tratamiento de esas infecciones, afecciones o patologías que son específicas de un animal específico, tal como un paciente humano, el término paciente se refiere a ese animal específico. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano; sin embargo, el uso médico de la composición puede incluir también
45 animales tales como aves, incluyendo gallinas, pavos, patos o gansos, ganado tal como caballos, vacas u ovejas, o animales de compañía tales como perros o gatos.
La expresión "cantidad eficaz" se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva para describir una cantidad de la presente composición farmacéutica que puede usarse para inducir un resultado previsto al utilizarse en el método de
50 la presente invención. En varios aspectos de la presente invención, el término cantidad eficaz se usa junto con el tratamiento o prevención. En otros aspectos, el término cantidad eficaz simplemente se refiere a una cantidad de un agente que produce un resultado que se observa como beneficioso o útil, inclusive en métodos de acuerdo con la presente invención, donde se busca el tratamiento o prevención de una infección por Borrelia.
55 El término cantidad eficaz con respecto a los compuestos y composiciones descritos en el presente documento se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva para describir esa cantidad del compuesto de acuerdo con la presente invención que se administra a un paciente mamífero, especialmente un paciente humano, que padece una enfermedad asociada a Borrelia, para reducir o inhibir la infección por Borrelia.
El método para inmunizar a un sujeto comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica del tercer aspecto de la presente invención.
El método comprende inducir una respuesta inmunológica en un individuo mediante terapia génica o de otra forma,
5 mediante la administración de un polipéptido o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención in vivo a fin de estimular una respuesta inmunológica para producir anticuerpos o una respuesta mediada por células de linfocitos T, ya sean linfocitos T productores de citocinas o linfocitos T citotóxicos, para proteger a dicho individuo de la enfermedad, aunque esa enfermedad ya se haya establecido en el individuo.
10 Los productos de la presente invención, particularmente los polipéptidos y ácidos nucleicos, se proporcionan preferiblemente de forma aislada y pueden purificarse hasta la homogeneidad. El término "aislado", como se usa en el presente documento, significa separado "por la mano del hombre" de su estado natural; es decir, si ocurre de manera natural, se ha cambiado o retirado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de origen natural o un polipéptido presente de manera natural en un organismo vivo en su estado natural no
15 está "aislado", pero la misma molécula o polipéptido de ácido nucleico separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", según el término que se emplea en el presente documento. Como parte del aislamiento o después del mismo, dichas moléculas de ácido nucleico pueden unirse a otras moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ADN, para la mutagénesis, para formar genes de fusión y para propagación o expresión en un huésped, por ejemplo. Las moléculas aisladas de ácido nucleico, solas o unidas a otras moléculas
20 de ácido nucleico tales como vectores, pueden introducirse en células huésped, en cultivo o en organismos completos. Introducidas en células huésped en cultivo o en organismos completos, dichas moléculas de ADN aún se encontrarían aisladas, según se utiliza el término en el presente documento, dado que no estarían en su forma o entorno natural. De forma similar, las moléculas y polipéptidos de ácido nucleico pueden aparecer en una composición, tales como formulaciones de medio, soluciones para la introducción de polipéptidos o moléculas de
25 ácido nucleico, por ejemplo, en células, composiciones o soluciones para reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, que no son composiciones de origen natural, y quedan en las mismas moléculas o polipéptidos aislados de ácido nucleico dentro del significado de ese término empleado en el presente documento.
La invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos en particular descritos en el presente documento,
30 dado que pueden variar. Además, la terminología utilizada en el presente documento es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la", incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, las palabras "comprender", "contener" e "incluir" deben interpretarse de forma inclusiva y no de forma exclusiva.
35 A menos que se defina otra cosa, toda expresión técnica y científica, y cualquier acrónimo usado en el presente documento, tiene el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica en el campo de la invención. Aunque en la práctica de la presente invención se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, en el presente documento se describen los métodos y
40 materiales preferidos.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes Figuras, Tablas, Ejemplos y la Lista de secuencias, de los cuales pueden tomarse características, realizaciones y ventajas adicionales. Como tales, las modificaciones específicas analizadas no deben interpretarse como limitaciones del alcance de la invención. Será
45 evidente para el experto en la técnica que pueden realizarse diversas equivalencias, cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, y debe entenderse que dichas realizaciones equivalentes se incluyen en el presente documento.
En relación con la presente invención
50 La Fig. 1 muestra el alineamiento de aminoácidos de los serotipos 1-6 de OspA de Borrelia. La Fig. 2 muestra esquemáticamente la producción de heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA de acuerdo con la presente invención. La Fig. 3 representa esquemáticamente los componentes polipeptídicos de una posible composición
55 farmacéutica de la presente invención que comprenden tres heterodímeros mutantes de OspA diferentes, una "vacuna de combinación". La Fig. 4 muestra la estructura química de Pam3Cys, un ejemplo de una cisteína de ácido graso sustituido, tal como se encontraría en el extremo N de polipéptidos lipidados de la presente invención. La Fig. 5 muestra la unión de anticuerpos de ratones inmunizados con polipéptidos del heterodímero del
fragmento mutante de OspA a la superficie celular de Borrelia de los serotipos 1-6 de OspA. La Tabla 1 muestra la estabilidad térmica del plegamiento de fragmentos mutantes del serotipo 2 de OspA con los tipos de enlace disulfuro de D1 a D5 (para la nomenclatura, véase la Tabla A-4) en comparación con el fragmento de tipo salvaje del serotipo 2 de OspA sin enlaces disulfuro (D0).
5 La Tabla 2 muestra la protección de los ratones de la infección por B. afzelii (cepa IS1) mediante el método de exposición por garrapatas tras la inmunización con fragmentos mutantes del serotipo 2 de OspA con los tipos de enlace disulfuro D1 a D5 (para la nomenclatura véase la tabla A-4), incluyendo grupos de control de ratones inmunizados con PBS, OspA de longitud completa o el fragmento de tipo salvaje del serotipo 2 de OspA (S2D0-His).
10 La Tabla 3 muestra la protección de los ratones de la infección por B. afzelii (cepa IS1) mediante el método de exposición por garrapatas tras la inmunización con fragmentos mutantes lipidados del serotipo 2 de OspA con los tipos de enlace disulfuro D1, D3 y D4 (Lip-S2D1-His, Lip-S2D3-His y Lip-S2D4-His), incluyendo grupos de control de ratones inmunizados con PBS o proteína OspA de longitud completa. La Tabla 4 muestra la capacidad protectora de los heterodímeros mutantes de OspA de la invención en
15 modelos de exposición in vivo de Borrelia. Se inmunizó a los ratones con Lip-S1D1-S2D1-His, Lip-S4D1S3D1-His, Lip-S4D1-S3D1 o Lip-S5D1-S6D1-His y se expusieron al serotipo indicado de OspA de Borrelia mediante métodos de exposición por aguja o por garrapata, según se indicó. El grupo de control en cada experimento se inmunizó con un adyuvante de Al(OH)3 en solitario. La Tabla 5 muestra la capacidad protectora de la vacuna de combinación de la invención contra la
20 exposición in vivo de Borrelia de serotipo 1 de OspA (cepa N40 en el método de exposición por aguja) y Borrelia de serotipo 2 de OspA (cepa IS1 en el método de exposición por garrapatas). Se inmunizó a los ratones con los tres antígenos LipS1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1 juntos en una relación
1:1:1 (vacuna de combinación) o con los antígenos de control indicados y se expusieron a Borrelia mediante
métodos de exposición por aguja o garrapata, según se indicó El grupo de control en cada experimento se 25 inmunizó con un adyuvante de Al(OH)3 en solitario.
Las figuras y tablas a las que puede hacerse referencia en la memoria descriptiva se describen a continuación en mayor detalle.
30 Fig. 1 Alineamiento de secuencias de aminoácidos de los serotipos de OspA uno a seis. El alineamiento ilustra que la porción N-terminal asociada con la membrana de la proteína tiene una secuencia de aminoácidos más altamente conservada que la porción C-terminal más expuesta.
Fig. 2 Producción de un heterodímero de OspA mutante de la invención que comprende fragmentos mutantes C
35 terminal de OspA a partir de dos serotipos diferentes de OspA de Borrelia sp. (A) Representación esquemática de un ácido nucleico que codifica un heterodímero mutante lipidado de OspA. Los componentes, de 5' a 3', comprenden las secuencias codificantes para una secuencia señal de lipidación (señal Lip), un péptido que contiene una cisteína pequeña para la lipidación N-terminal (péptido de lipidación = LP), un fragmento mutante C-terminal de OspA con dos cisteínas no naturales, un péptido enlazador corto (LN1), seguido de un segundo fragmento mutante C-terminal
40 de OspA con dos cisteínas no nativas. (B) El polipéptido heterodímero de OspA mutante intermedio comprende el producto naciente directamente después de la traducción de la construcción de ácido nucleico. Desde el extremo N al extremo C, este polipéptido consiste en una secuencia señal de lipidación (señal Lip), un péptido que contiene cisteína para lipidación (LP), un fragmento mutante de OspA con un enlace disulfuro no nativo, un péptido enlazador corto (LN1), seguido de un segundo fragmento mutante de OspA con un enlace disulfuro no nativo. (C) El polipéptido
45 heterodímero mutante de OspA lipidado final después de la modificación postraduccional. El heterodímero, desde el extremo N al extremo C, consiste en un péptido corto que contiene cisteína con la cisteína N-terminal lipidada (indicada con "Lip"), un fragmento mutante de OspA estabilizado por un enlace disulfuro, un péptido enlazador (LN1), y un segundo fragmento mutante de OspA estabilizado por un enlace disulfuro. La secuencia señal de lipidación se escinde durante la modificación postraduccional del polipéptido, como se muestra.
50 Fig. 3 Un ejemplo de una composición farmacéutica preferida de acuerdo con la presente invención. Están presentes en la composición tres heterodímeros mutantes de OspA, comprendiendo cada uno fragmentos mutados de OspA de dos serotipos distintos de OspA de Borrelia, y juntos proporcionan antígenos de OspA de seis serotipos diferentes de OspA de Borrelia. Tal composición farmacéutica permite la inmunización simultánea contra seis
55 serotipos de Borrelia.
Fig. 4 Ilustración de la estructura química de Pam3Cys, un ejemplo de una sustitución de ácidos grasos de la cisteína N-terminal de la proteína OspA de tipo salvaje de longitud completa, así como heterodímeros y monómeros del fragmento mutante de OspA lipidado de la invención. Durante la modificación postraduccional de polipéptidos o
proteína OspA de longitud completa de la invención, la secuencia señal de lipidación N-terminal se elimina por escisión y los ácidos grasos, más comúnmente tres restos palmitoílo ("Pam3"), se unen enzimáticamente y covalentemente al residuo de cisteína N-terminal (el átomo de azufre, "S", se indica por medio de una flecha). Los residuos restantes de la cadena de polipéptidos, que están ubicados hacia el extremo C respecto al residuo 5 Pam3Cys se representan por "Xn" (modificado a partir de Bouchon, et al. (1997) Analytical Biochemistry 246: 52-61.)
Fig. 5 Unión de anticuerpos a partir de ratones inmunizados con respecto a la superficie celular de espiroquetas de Borrelia. Los ratones se inmunizaron tres veces con 1 µg de cada uno de los antígenos indicados: Proteínas OspA de longitud completa marcadas con His y lipidadas de los serotipos de OspA 1-6; Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 o 10 Lip-S5D1-S6D1 en solitario, o Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1 juntas en una relación 1:1:1 ("vacuna de combinación") en intervalos de dos semanas y se recogieron los sueros una semana después de la última dosis. Se ensayaron varias diluciones de sueros para determinar la unión a la superficie celular de Borrelia por medio de tinción celular y citometría de flujo. Los valores de intensidad fluorescente observados en la tinción con sueros recogidos de los ratones de control inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 en solitario se extrajeron para 15 estimar la unión no específica. (Las Borrelia usadas fueron: B. burgdorferi, OspA de serotipo 1, cepa N40; B. afzelii, OspA de serotipo 2, cepa "C"; B. garinii, OspA de serotipo 3, cepa "D"; B. bavariensis, OspA de serotipo 4, cepa Fin;
B. garinii, OspA de serotipo 5, cepa "E"; B. garinii, OspA de serotipo 6, cepa "B").
Tabla 1. Estabilidad térmica de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 no lipidados, marcados con His 20 de B. afzelii K78 con ubicación diferente de enlaces disulfuro. Los fragmentos mutantes de OspA serotipo 2 con
diferentes tipos de enlace de cisteína (véase la Tabla A-4) se solubilizaron en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0) y se ensayaron para determinar la estabilidad térmica en comparación con el fragmento de tipo salvaje de OspA de serotipo 2 (S2D0). La presencia de un enlace disulfuro dio como resultado un aumento de la temperatura de fusión en comparación con el fragmento de tipo salvaje de OspA de serotipo 2.
Fragmento mutante de OspA de serotipo 2
SEQ ID NO: Temperatura de fusión (°C)
S2D0-His*
1 47,6
S2D1-His
2 70,4
S2D2-His
3 54,6
S2D3-His
4 58,6
S2D4-His
5 58,4
S2D5-His
6 53,8
*véanse las Tablas A-4 y A-5 para la nomenclatura.
Tabla 2. Capacidad protectora de las dosis decrecientes de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 no lipidados marcados con His contra la infección por B. afzelii (serotipo 2) mediante el método de exposición por garrapata. Cinco fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 no lipidados y marcados con His se ensayaron para determinar la capacidad protectora en dos dosis diferentes (30 μg y 5 μg) y se compararon con el fragmento de
30 OspA de serotipo 2 de tipo salvaje. Los grupos de ratones inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo o con OspA
de serotipo 2 de longitud completa no lipidada sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. Todos los antígenos estaban marcados con His y no lipidados. Los datos presentados combinan los resultados de varios experimentos realizados en condiciones idénticas.
Inmunógeno
Exposición por garrapatas (OspA de serotipo 2: B. afzelii, cepa IS1) 3 x 30 µg (11 experimentos) 3 x 5 µg (4 experimentos)
Infectados/total
Infectados/total
Adyuvante de Al(OH)3 en solitario
Garrapata (OspA-ST2) 58/62 20/23
OspA K78-His de longitud completa (SEQ ID NO: 209)
Garrapata (OspA-ST2) 1/72 1/25
S2D0-His (SEQ ID NO: 1)
Garrapata (OspA-ST2) 15/20 8/16
S2D1-His (SEQ ID NO: 2)
Garrapata (OspA-ST2) 1/26 1/25
S2D2-His (SEQ ID NO: 3)
Garrapata (OspA-ST2) 0/26 4/26
S2D3-His (SEQ ID NO: 4)
Garrapata (OspA-ST2) 0/34 1/21
S2D4-His (SEQ ID NO: 5)
Garrapata (OspA-ST2) 2/30 4/27
S2D5-His (SEQ ID NO: 6)
Garrapata (OspA-ST2) 5/35 2/11
35 Tabla 3. Capacidad protectora de las dosis decrecientes de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 lipidados marcados con His contra la infección por B. afzelii mediante el método de exposición por garrapata. Se evaluaron tres fragmentos mutantes marcados con His lipidados de OspA de serotipo 2 con diferentes
tipos de enlace disulfuro para determinar la capacidad protectora con tres dosis diferentes (3,0 µg, 1,0 µg y 0,3 µg). Los grupos de ratones inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo o con OspA de serotipo 2 de longitud completa no lipidada sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. Los datos presentados combinan los resultados de varios experimentos realizados en condiciones idénticas.
Inmunógeno
Exposición por garrapatas (OspA de serotipo 2: B. afzelii, cepa IS1) 3 x 3,0 µg (5 experimentos) 3 x 1,0 µg (5 experimentos) 3 x 0,3 µg (4 experimentos)
Infectados/total
Infectados/total
Infectados/total
Adyuvante de Al(OH)3 solo (control para todas las dosis)
Garrapata (OspA-ST2) 58/59 - -
OspA K78-His de longitud completa (SEQ ID NO: 209)
Garrapata (OspA-ST2) 0/14 0/21 1/20
Lip-S2D1-His (SEQ ID NO: 141)
Garrapata (OspA-ST2) 0/17 5/31 1/29
Lip-S2D3-His (SEQ ID NO: 143)
Garrapata (OspA-ST2) 1/15 1/12 5/19
Lip-S2D4-His (SEQ ID NO: 144)
Garrapata (OspA-ST2) 0/8 0/25 0/34
Tabla 4. Capacidad protectora de heterodímeros mutantes de OspA de la invención contra exposición a Borrelia in vivo a través de métodos de exposición por aguja o garrapatas. Se inmunizaron grupos de ratones tres veces en intervalos de dos semanas con las dosis indicadas de heterodímero de OspA o adyuvante de Al(OH)3 solo. Los inmunógenos usados fueron Lip-S1D1-S2D1-His (expuesto a OspA-ST1 de Borrelia, Experimentos 1-3),
10 Lip-S1D1-S2D1-His, Lip-S4D1-S3D1-His y Lip-S5D1-S6D1-His, por separado (expuestos a OspA-ST2 de Borrelia, Experimentos 4-6), Lip-S4D1-S3D1 (expuesto a OspA-ST4 de Borrelia, Experimentos 7 y 8) y Lip-S5D1-S6D1-His (expuesto a OspA-ST5 de Borrelia, Experimentos 9 y 10; expuesto a OspA-ST6 de Borrelia, Experimentos 11 y 12). Se expuso a los ratones inmunizados durante dos semanas después de la última inmunización a través de los modelos de exposición por aguja o garrapatas, según se indicó.
Inmunógeno
Dosis Exposición por aguja (OspA-serotipo 1: B. burgdorferi s.s., cepa N40) Infectados/Total
Exp. 1
Exp. 2 Exp. 3
Lip-S1D1-S2D1-His (SEQ ID NO: 49)
3 x 5,0 µg Aguja (OspA-ST1) 0/10*** 0/9*** 4/10**
Adyuvante de Al(OH)3 en solitario
- Aguja (OspA-ST1) 10/10 8/10 10/10
Inmunógeno
Dosis Exposición por garrapatas (OspA-serotipo 2: B. afzelii, cepa IS1) Exp. 4 Exp. 5 Exp. 6
Lip-S1D1-S2D1-His (SEQ ID NO: 49)
3 x 2,0 µg Garrapata (OspA-ST2) 0/10*** 0/9*** 0/6***
Lip-S4D1-S3D1-His (SEQ ID NO: 81)
3 x 2,0 µg Garrapata (OspA-ST2) 0/9*** 2/7* 0/6***
Lip-S5D1-S6D1-His (SEQ ID NO: 65)
3 x 2,0 µg Garrapata (OspA-ST2) 0/7*** 0/9*** 0/6***
Adyuvante de Al(OH)3 en solitario
- Garrapata (OspA-ST2) 9/9 8/8 7/7
Inmunógeno
Dosis Exposición por aguja (OspA-serotipo 4: B. bavariensis, cepa Scf) Exp. 7 Exp. 8
Lip-S4D1-S3D1 (Seq ID No: 194)
3 x 5,0 µg Aguja (OspA-ST4) 2/10** 1/10*** -
Adyuvante de Al(OH)3 en solitario
- Aguja (OspA-ST4) 9/10 9/10 -
Inmunógeno
Dosis Exposición por aguja (OspA-serotipo 5: B. garinii) Exp. 9 Exp. 10
Lip-SSD1-S6D1-His (SEQ ID NO: 65)
3 x 5,0 µg Aguja (OspA-ST5) 1/10 2/10 -
Adyuvante de Al(OH)3 en solitario
- Aguja (ST5) 6/10 6/10 -
Inmunógeno
Dosis Exposición por aguja (OspA-serotipo 6: B. garinii) Exp. 11 Exp. 12
Lip-S5D1-S6D1-His (SEQ ID NO: 65)
3 x 5,0 µg Aguja (OspA-ST6) 2/10** 2/10*** -
Adyuvante de Al(OH)3 en solitario
- Aguja (OspA-ST6) 9/10 10/10 -
Valor de p; prueba exacta de Fisher, dos colas. *significativo (<0,05), **muy significativo (<0,01), ***extremadamente significativo (<0,001)
Tabla 5. Capacidad protectora de la vacuna de combinación de heterodímero de OspA mutante de la invención contra exposición a OspA de serotipo 1 y serotipo 2 de Borrelia. Se inmunizaron grupos de ratones tres veces con las dosis indicadas de inmunógeno o adyuvante de Al(OH)3 solo en intervalos de dos semanas. Los inmunógenos usados fueron una combinación 1:1:1 de los heterodímeros mutantes de OspA LipS1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1 (vacuna de combinación), Lip-S1D1-S2D1, Lip-OspA1-His y OspA ST1/ST2 quimérica. Los ratones inmunizados se expusieron dos semanas después de la última inmunización a través del método de exposición por garrapatas (ST2, Experimentos 13 y 14) o el método de exposición por aguja (ST1, Experimentos 15 y 16).
Inmunógeno
Dosis Exposición por garrapatas (OspA-serotipo 2: B afzelii, cepa IS1) Infectados/Total
Exp. 13
Exp. 14
Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 186)
3 x 5,0 µg Garrapata (OspA-ST2) 0/6*** 0/7**
Vacuna de combinación:
Garrapata (OspA-ST2) 0/9*** 0/6**
Lip-S1D1-S2D1 (Seq ID No: 186)
3 x 5,0 µg
Lip-S4D1-S3D1 (Seq ID No: 194)
3 x 5,0 µg
Lip-S5D1-S6D1 (Seq ID No: 190)
3 x 5,0 µg
Adyuvante de Al(OH)3 en solitario
- Garrapata (OspA-ST2) 7/7 6/7
Inmunógeno
Dosis Exposición por aguja (OspA-serotipo 1: B. burgdorferi s.s., cepa ZS7) Exp. 15 Exp. 16
Lip-S1D1-S2D1 (Seq ID No: 186)
3 x 1,0 µg Aguja (OspA-ST1) 0/10*** 0/10***
Lip-OspA1-His (Seq ID No: 210)
3 x 1,0 µg Aguja (OspA-ST1) 0/10*** 0/10***
OspA ST1/ST2 quimérica (Seq ID No: 212)
3 x 1,0 µg Aguja (OspA-ST1) 0/10*** 0/10***
Vacuna de combinación:
Aguja (OspA-ST1) 0/10*** 0/10***
Lip-S1D1-S2D1 (Seq ID No: 186)
3 x 1,0 µg
Lip-S4D1-S3D1 (Seq ID No: 194)
3 x 1,0 µg
Lip-S5D1-S6D1 (Seq ID No: 190)
3 x 1,0 µg
Adyuvante de Al(OH)3 en solitario
- Aguja (OspA-ST1) 10/10 10/10
Valor de p; prueba exacta de Fisher, dos colas. *significativo (<0,05), **muy significativo (<0,01), ***extremadamente significativo (<0,001)
Ejemplos Ejemplo 1. Evaluación de la estabilidad térmica de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2
Procedimientos experimentales
15 Estabilidad térmica
Las temperaturas de fusión (Tm) de los monómeros de fragmento mutante no lipidado de OspA de serotipo 2 se determinaron mediante el ensayo de cambio térmico basado en fluorescencia descrito por Pantoliano, et al. (J. Biomol Screen 6:429-440 (2001)). La tinción con tinte fluorescente en gel de proteína SYPRO® Orange 5 (proporcionado como un concentrado de 5000x en DMSO por Sigma, Estados Unidos) se usó para controlar el despliegue de proteínas. En cada pocillo, se combinaron 7,5 µl de SYPRO® Orange (diluido a 1:1000 a partir de la solución madre) y 17,5 µl de una solución de proteína (1 µg o 2 µg) en tampón. Las muestras de proteína se calentaron desde 25 °C a 95 °C a una velocidad de 0,2 °C/10 s en el sistema de detección en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, Estados Unidos) y se controlaron los cambios fluorescentes. La intensidad de fluorescencia se midió con
10 longitudes de onda con excitación y emisión de 490 y 575 nm, respectivamente. Se determinó la Tm usando el programa Bio-Rad CFX Manager 2.0. Los valores de Tm de los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 marcados con His no lipidados se midieron en cuatro sistemas de tampón diferentes: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 9,0); Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0); PBS (pH 7,4); y HEPES 25 mM, NaCl 150 mM (pH 6,5), usando el fragmento de tipo salvaje no lipidado de OspA de serotipo 2 (S2D0) como control.
Resultados
En todos los casos, los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 con un enlace de cisteína introducido tuvieron una Tm mayor que el fragmento de tipo salvaje de OspA de serotipo 2 (S2D0) (véase la Tabla 1). La Tm se ensayó en
20 cuatro sistemas de tampón diferentes con resultados similares (los datos para proteínas disueltas en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0) se muestran en la Tabla 1), lo que indica que la estabilidad de las proteínas es similar en un amplio intervalo de pH. Este resultado respalda la hipótesis de que el enlace disulfuro introducido estabiliza el fragmento de OspA.
25 Ejemplo 2. Evaluación de la capacidad protectora de monómeros del fragmento mutante no lipidado marcado con His de OspA de serotipo 2 en el método de exposición por garrapatas (ST2, B. afzelii) Procedimientos experimentales
30 Clonación y expresión de proteínas recombinantes
El fragmento de tipo salvaje de OspA de serotipo 2, así como los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 con enlaces de cisteína de tipos 1-5 (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente), se sometieron a optimización por codones para la expresión de E. coli por GenScript, Estados Unidos. Los fragmentos mutantes no lipidados de OspA
35 de serotipo 2 se marcaron con His en el extremo C con fines de purificación. Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Novagen, Estados Unidos), un vector que contenía un casete de resistencia a kanamicina, así como un promotor T7. Los monómeros se expresaron en células BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen, Estados Unidos) a 37 °C mediante la adición de IPTG. Las células se recogieron después de 4 horas mediante centrifugación y el sedimento se almacenó a -70 °C durante hasta 12 meses antes de su procesamiento adicional.
40 Purificación de proteínas de monómeros de fragmentos no lipidados marcados con His de tipo salvaje y mutantes de OspA
Las células se alteraron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y la fracción soluble que contenía
45 los fragmentos marcados con His de OspA se aplicó a una columna de Ni-sepharose (Ni Sepharose™ 6 Fast Flow; GE Healthcare, Reino Unido) y los fragmentos marcados con His de OspA se eluyeron en un gradiente de imidazol (0-250 mM). Las fracciones agrupadas se purificaron adicionalmente sobre una columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) seguido de una columna de intercambio de tampón (Sephadex G-25, GE Healthcare). Se agruparon picos de fragmentos marcados con His de OspA basándose en la columna analítica de
50 exclusión por tamaño y cromatografía de fase inversa. Después de la filtración estéril, las proteínas purificadas se almacenaron a -20 °C hasta su formulación.
Inmunización de ratones
55 Se usaron ratones hembra C3H/HeN (H-2k) para todos los estudios (Harlan, Italia). Antes de cada exposición, se extrajo sangre de grupos de cinco ratones de 8 semanas de edad a través de la vena de la cola y se prepararon y se agruparon los sueros preinmunizados. Se ensayaron cinco proteínas de fragmento mutante no lipidado de OspA serotipo 2 (S2D1-5, SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente), en quince experimentos separados. Se administraron tres inmunizaciones subcutáneas (s.c.) de 100 µl, a intervalos de dos semanas. Las dosis usadas
fueron de 30 y 5 µg de la proteína respectiva, ensayadas en 11 y 4 experimentos respectivamente. Todas las formulaciones incluían hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final del 0,15 %. Una semana después de la tercera inmunización, se recogió sangre y se prepararon sueros hiperinmunizados. En cada experimento, se incluyó un grupo inyectado con PBS formulado con Al(OH)3 como control negativo, y un grupo de ratones se
5 inmunizó con S2D0, el fragmento de tipo salvaje C-terminal de OspA a partir de la cepa K78 de B. afzelii (SEQ ID NO: 1). Otro grupo inmunizado con una proteína OspA de tipo salvaje no lipidada de longitud completa de B. afzelii, cepa K78 (SEQ ID NO: 209), también formulada con Al(OH)3 al 0,15 %, se incluyó como control positivo en cada estudio animal. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr. 501/1989) y aprobada por "Magistratsabteilung 58".
10 Exposición por garrapatas de ratones inmunizados y recolección de sueros y tejidos (también mencionado en el presente documento como "método de exposición por garrapatas")
La exposición por garrapatas de ratones inmunizados se realizó dos semanas después de la última inmunización.
15 Para exponer a los ratones inmunizados a B. afzelii, se eliminó el pelo del lomo de cada ratón con crema Veet® (Reckitt Benckiser, Reino Unido) y se pegó un recipiente pequeño y ventilado a la piel con pegamento instantáneo (Pattex, Alemania). Posteriormente, se aplicaron dos ninfas por ratón de I. ricinus infectadas con B. afzelii, cepa IS1, y se les permitió acoplarse y alimentarse completamente. El estado de la alimentación se controló a diario para cada garrapata individual y se incluyeron en la lectura final solamente los ratones donde se recogió al menos una
20 garrapata completamente alimentada. No se hizo distinción entre los ratones donde se recogieron una o dos garrapatas completamente alimentadas.
Seis semanas después de la aplicación de garrapatas, se recogió la sangre mediante hemorragia orbital y los sueros finales se prepararon y usaron para análisis por VlsE ELISA para determinar el estado de infección. Después, los
25 ratones entonces se sacrificaron mediante dislocación cervical y se recogió una oreja de cada ratón, se extrajo el ADN y se sometió a análisis por PCR anidada para identificar Borrelia en el tejido.
Lectura de infección
30 Solamente se incluyeron en la lectura final del experimento los ratones en los que las garrapatas aplicadas se alimentaron completamente y pudieron recogerse. Los ratones se sacrificaron 6 semanas después de la aplicación de garrapatas y se recogieron los órganos, así como los sueros finales. La lectura de infección final se basó en dos análisis diferentes (PCR anidada dirigida al espaciador intergénico 16S-23S y VlsE (IR6) ELISA como se describen en detalle a continuación).
PCR anidada dirigida al espaciador intergénico 16S-23S
Se sometió una oreja de cada ratón a extracción y purificación de ADN usando el kit de sangre y tejido DNeasy (Qiagen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con la siguiente modificación. Cada oreja de 40 digirió durante una noche a 60 °C en proteinasa K recombinante, grado PCR (Roche, 14-22 mg/ml). El ADN se eluyó en 50 µl de agua estéril desionizada y se almacenó a -20 °C hasta su análisis adicional. Como control negativo, se incluyó una columna de purificación vacía en cada extracción y purificación de ADN, y el eluato se sometió a PCR anidada. Todos los extractos de ADN se cribaron para determinar la presencia de ADN de Borrelia por un procedimiento de PCR anidada, que comprendía 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 56 °C durante 30 s y 72 °C 45 durante 60 s usando los cebadores; Directo 5'-GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG-3' (SEQ ID NO: 26) e Inverso 5'-GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG-3' (SEQ ID NO: 27). Del volumen de reacción de 10 µl, se usó 1 µl como plantilla para la reacción de PCR anidada. La etapa de PCR anidada comprendía 25 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 60 s usando los cebadores; Directo anidado 5'-AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG-3' (SEQ ID NO: 28) e inverso anidado 5'-GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA-3' (SEQ ID NO: 29). Del volumen final de
50 reacción, se separaron 5 µl en un gel de agarosa al 1 % que contenía bromuro de etidio y se visualizaron las bandas en luz UV.
En cada análisis por PCR, el ADN purificado de un cultivo con crecimiento in vitro de cepa K78 de B. afzelii se usó como una plantilla de control positivo. Además, se usó PBS en lugar de ADN extraído como control negativo. Se
55 separaron cinco microlitros del producto final en un gel de agarosa al 1 % que contenía bromuro de etidio y se visualizaron las bandas en luz UV.
ELISA con la región invariable 6 (IR6) de la proteína de secuencia E variable de tipo proteína principal (VlsE)
Se usó un péptido 25-mer biotinilado (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) (SEQ ID NO: 30) derivado de la secuencia de la cepa IP90 de B. garinii para el análisis (Liang FT, et al. (1999) J Immunol. 163:5566-73). Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos precubiertas con estreptavidina (Nunc, Dinamarca) con 100 µl/pocillo (1 µg/ml) de péptido biotinilado en PBS complementado con Tween 20 al 0,1 % (PBS/0,1T). Las placas se incubaron 5 durante una noche a 4 °C. Después del recubrimiento con el péptido, las placas se lavaron una vez con PBS/0,1T. Las placas se bloquearon entonces durante una hora a temperatura ambiente (TA) con 100 µl/pocillo de PBS + BSA al 2 %, antes del lavado de nuevo con PBS/0,1T. Se evaluó la reactividad después de la exposición de los sueros al péptido con diluciones de 1:200, 1:400 y 1:800 en PBS + BSA al 1 %. Las placas se incubaron durante 90 min a TA antes de lavarlas tres veces con PBS/0,1T. Cada pocillo recibió entonces 50 µl de 1,3 µg/ml de IgG anti-ratón 10 policlonal de conejo conjugada con HRP (Dako, Dinamarca) en PBS + BSA al 1 %. Las placas se incubaron entonces durante 1 h a TA. Después de tres lavados con PBS/0,1T, se añadió ABTS (50 µl/pocillo) como sustrato (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) y se dejó que se desarrollara color durante 30 min. Se midió la absorbancia a 405 nm. Todos los sueros se ensayaron por duplicado; los controles negativos incluían PBS en lugar de sueros, así como placas no recubiertas con el péptido. Los sueros de ratones que se mostró que eran positivos por cultivo para
15 la infección por B. afzelii se usaron como controles positivos.
Resultados
Niveles de protección en el método de exposición por garrapatas
20 Se observaron niveles elevados de protección para los cinco fragmentos estabilizados de OspA de B. afzelii con ambas dosis ensayadas (30 µg y 5 µg, véase la Tabla 2). Las tasas elevadas de infección en el grupo de control con PBS indican que las garrapatas se infectaron con frecuencia alta. Adicionalmente, el control positivo, OspA de longitud completa no lipidada de la cepa K78 de B. afzelii, fue muy protectora. Estos grupos de control juntos indican
25 la fiabilidad elevada de la lectura experimental.
Los resultados de protección a partir de experimentos que ensayan las dosis de 30 µg (11 experimentos en total) y las dosis de 5 µg (4 experimentos en total) se resumen en la Tabla 2. Los dos métodos empleados para verificar la infección, concretamente, VlsE ELISA y PCR anidada, dieron resultados prácticamente idénticos (datos no
30 mostrados), lo que demuestra la robustez de estos métodos de lectura para evaluar la infección en el método de exposición por garrapatas.
Ejemplo 3. Evaluación de la capacidad protectora de monómeros del fragmento mutante lipidado marcado con His de OspA de serotipo 2 contra exposición a Borrelia in vivo a través del método por exposición por
35 garrapatas (ST2, B. afzelii) Procedimientos experimentales
Clonación y expresión de proteínas de fragmento mutante de OspA lipidado marcado con His
40 Los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 con enlaces de cisteína de tipos 1, 3 y 4 (SEQ ID NOs: 141, 143 y 144, respectivamente) se modificaron mediante la adición de una secuencia señal de lipidación derivada de OspA (SEQ ID NO: 14) y seguida directamente C-terminal por un péptido CKQN (SEQ ID NO: 211) para proporcionar una cisteína N-terminal para la lipidación. Todos los fragmentos mutantes de OspA se marcaron con histidina en el
45 extremo C con fines de purificación. Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Novagen), un vector que contenía un casete de resistencia a kanamicina, así como un promotor T7. Los monómeros lipidados se expresaron en células BL21 Star™(DE3) (Invitrogen) y después de la inducción por IPTG, la temperatura de crecimiento de las células disminuyó de 37 °C a 25 °C para promover el procesamiento postraduccional eficaz de las proteínas. Las células se recogieron después de 4 horas mediante centrifugación y el sedimento se almacenó a -70
50 °C durante hasta 12 meses antes de su procesamiento adicional.
Purificación de proteínas de monómeros de fragmentos lipidados marcados con His de tipo salvaje y mutantes de OspA
55 Las células se alteraron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y los polipéptidos de monómero de fragmento marcado con His lipidado de OspA se enriquecieron en la fase lipídica mediante separación de fases, usando Triton X-114 como detergente. Posteriormente, la fase detergente diluida (20 a 30 veces) se aplicó a una columna de Ni-sepharose (Ni Sepharose™ 6 Fast Flow; GE Healthcare) y los fragmentos de OspA lipidados marcados con His se eluyeron mediante elución de gradiente de imidazol (0-250 mM). Las fracciones agrupadas se
purificaron adicionalmente sobre una columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) seguido de una columna de intercambio de tampón (Sephadex G-25, GE Healthcare). Se agruparon picos de fragmentos marcados con His lipidados de OspA basándose en la columna analítica de exclusión por tamaño y cromatografía de fase inversa. Después de la filtración estéril, las proteínas purificadas se almacenaron a -20 °C hasta su formulación.
Inmunización de ratones
Se expresaron y se purificaron tres proteínas OspA mutantes lipidadas (Lip-S2D1-His, Lip-S2D3-His y Lip-S2D4-His) como se ha descrito anteriormente. Se realizaron estudios de protección in vivo como se describe en el Ejemplo 2,
10 usando adyuvante de Al(OH)3 solo y OspA no lipidada de longitud completa de serotipo 2 como control negativo y positivo, respectivamente. Todos los inmunógenos se formularon con Al(OH)3 al 0,15 %. Se inyectaron los ratones por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con formulaciones que contenían 3,0 µg, 1,0 µg o 0,3 µg de antígeno y se expusieron a garrapatas infectadas con B. afzelii (cepa IS1) dos semanas después de la inmunización. Los ratones se sacrificaron seis semanas después de la exposición por garrapatas y se evaluó la
15 infección.
Resultados
Niveles de protección en el método de exposición por garrapatas
20 Los tres fragmentos mutantes de OspA lipidados confirieron niveles muy elevados de protección a la exposición a B. afzelii, incluso con la dosis más pequeña evaluada (Tabla 3). Las tasas de infección en los ratones inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo fueron elevadas, lo que indica que las garrapatas estaban infectadas a una frecuencia elevada. El antígeno de control positivo, OspA de longitud completa no lipidada de la cepa K78 de B. afzelii también
25 fue muy protector. Juntos, estos grupos de control indican la fiabilidad elevada del método de infección y, por lo tanto, proporcionan una credibilidad elevada con respecto a los resultados observados después de la inmunización con los fragmentos mutantes lipidados de OspA.
Ejemplo 4. Evaluación de la protectora de heterodímeros mutantes de OspA de la invención contra 30 exposición a Borrelia in vivo a través de métodos de exposición por aguja o garrapatas.
Procedimientos experimentales
Clonación y expresión de heterodímeros de fragmento mutante de OspA lipidado marcado con His
35 Los monómeros de fragmentos mutantes de OspA de B. burgdorferi s.s. cepa B31, B. afzelii cepa K78, B. garinii cepa PBr, B. bavariensis cepa PBi, B. garinii cepa PHEi y B. garinii cepa DK29 se optimizaron por codones para la expresión de E. coli por GenScript, Estados Unidos. El epítopo de tipo hLFA-1 (aa 164-174, SEQ ID NO: 17) de la OspA de B. burgdorferi s.s. cepa B31 se reemplazó por una secuencia de tipo no hLFA NFTLEGKVAND de la cepa
40 K78 de B. afzelii (SEQ ID NO: 18). La secuencia señal de lipidación añadida a los heterodímeros de fragmento mutante de OspA se derivó a partir de lipoproteína (Lpp) de membrana extrema principal de E. coli, y fue seguida directamente C-terminal por un péptido CSS para proporcionar una cisteína N-terminal para la lipidación. Los heterodímeros de fragmento mutante de OspA se generaron mediante la fusión de diferentes monómeros de fragmento mutante de OspA como se ha descrito anteriormente a través de una secuencia de enlazador de 21
45 aminoácidos, que se originan a partir de dos regiones de bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s. ("LN1"; aa 65-74 y aa 42-53 con un intercambio de aminoácidos de D53S, SEQ ID NO: 184). Los heterodímeros se construyeron con una etiqueta de His con fines de purificación. Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Novagen), un vector que contenía un casete de resistencia a kanamicina, así como un promotor T7. Las lipoproteínas de los heterodímeros estabilizados se expresaron en células BL21
50 Star™(DE3) (Invitrogen) y después de la inducción por IPTG, la temperatura de crecimiento de las células disminuyó de 37 °C a 25 °C para promover el procesamiento postraduccional eficaz de las proteínas. Las células se recogieron después de 4 horas mediante centrifugación y el sedimento se almacenó a -70 °C durante hasta 12 meses antes de su procesamiento adicional.
55 Purificación de heterodímeros de fragmento mutante de OspA lipidado marcado con His
Las células se alteraron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y los heterodímeros de fragmento mutante marcado con His lipidado de OspA se enriquecieron en la fase lipídica mediante separación de fases, usando Triton X-114 como detergente. Posteriormente, la fase detergente diluida (20 a 30 veces) se aplicó a una
columna de Ni-sepharose (Ni Sepharose™ 6 Fast Flow; GE Healthcare) y los heterodímeros de OspA lipidados marcados con His se eluyeron mediante elución de gradiente de imidazol (0-250 mM). Las fracciones agrupadas se purificaron adicionalmente sobre una columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) seguido de una columna de intercambio de tampón (Sephadex G-25, GE Healthcare). Se agruparon los picos de heterodímeros
5 mutantes marcados con His lipidados de OspA basándose en la columna analítica de exclusión por tamaño y cromatografía de fase inversa. Después de la filtración estéril, los heterodímeros purificados se almacenaron a -20 °C hasta su formulación.
Clonación y expresión de heterodímeros de fragmento mutante de OspA lipidado no marcado con His
10 Las construcciones hechas como se ha descrito anteriormente se usaron para la generación de construcciones sin una etiqueta de His, mediante la introducción de un codón de terminación mediante amplificación por PCR. Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Merck Millipore), un vector que contenía un casete de resistencia a kanamicina, así como un promotor T7. Las lipoproteínas de los heterodímeros estabilizados se
15 expresaron en células BL21 Star™(DE3) (Invitrogen) y después de la inducción por IPTG, la temperatura de crecimiento de las células disminuyó de 37 °C a 25 °C para promover el procesamiento postraduccional eficaz de las proteínas. Las células se recogieron después de 4 horas mediante centrifugación y el sedimento se almacenó a -70 °C durante hasta 12 meses antes de su procesamiento adicional.
20 Purificación de heterodímeros de fragmento mutante de OspA lipidado no marcado con His
Las células se alteraron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y los heterodímeros de fragmento mutante lipidado de OspA se enriquecieron en la fase lipídica mediante separación de fases, usando Triton X-114 como detergente. Posteriormente, la fase de detergente diluido se sometió a cromatografía de intercambio aniónico
25 ejecutada en modo sin unión. El flujo resultante se cargó en una columna de hidroxiapatita (Bio-Rad) y las proteínas lipidadas se eluyeron a partir de una columna mediante un gradiente de sal no lineal. El eluato se sometió a purificación adicional sobre una columna de DEAE-Sepharose (GE Healthcare) en modo sin unión, seguida de columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) para el intercambio de tampón. Se agruparon los picos de heterodímeros mutantes lipidados de OspA basándose en la columna analítica de exclusión por tamaño y SDS
30 PAGE. Después de la filtración estéril, los heterodímeros purificados se almacenaron a -20 °C hasta su formulación.
Inmunización de ratones
Se usaron ratones C3H/HeN hembra (Janvier, Francia) para todos los estudios. Antes de cada exposición, se extrajo
35 sangre de grupos de diez ratones de 8 semanas de edad a través de la vena facial y se prepararon y se agruparon los sueros preinmunizados. Se administraron tres inmunizaciones subcutáneas (s.c.) de 100 µl cada una, a intervalos de dos semanas. Cada dosis contenía la cantidad de inmunógeno indicada en la Tabla 4 (dosis), formulada con hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final del 0,15 %. Una semana después de la tercera inmunización, se recogió sangre de la vena facial y se prepararon sueros hiperinmunizados. En cada
40 experimento, un grupo inmunizado con Al(OH)3 solo se incluyó como control negativo. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr. 501/1989) y aprobada por "Magistratsabteilung 58".
Exposición por garrapatas de ratones inmunizados y recolección de sueros y tejidos (también mencionado en el 45 presente documento como "método de exposición por garrapatas")
Para exponer a los ratones inmunizados a B. afzelii, se eliminó el pelo del lomo de cada ratón con crema Veet® (Reckitt Benckiser) y se pegó un recipiente pequeño y ventilado a la piel con pegamento instantáneo (Pattex). Posteriormente, se aplicaron dos ninfas por ratón de I. ricinus infectadas con B. afzelii, cepa IS1, y se les permitió
50 acoplarse y alimentarse hasta que se dilataron por completo y se cayeron. El estado de la alimentación se controló a diario para cada garrapata individual y se incluyeron en la lectura final solamente los ratones de los que se recogió al menos una garrapata completamente alimentada.
Exposición por aguja de ratones inmunizados con Borrelia cultivada in vitro
55 Dos semanas después de la última inmunización, se expuso por vía s.c. a los ratones con Borrelia diluida en 100 µl de medio de crecimiento de Borrelia (BSK II). Las dosis de exposición dependieron de la cepa, donde la virulencia de las cepas individuales se evaluó mediante experimentos de exposición para la determinación de la ID50. Las dosis empleadas para los experimentos de exposición por aguja variaron de 20 a 50 veces la ID50.
Sacrificio de ratones y recolección de material
Cuatro semanas después de la exposición por aguja con la Borrelia spp. indicada, o seis semanas después de la
5 exposición por garrapatas con B. afzelii, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical. Se recogió la sangre mediante hemorragia orbital y los sueros finales se prepararon y usaron para VlsE ELISA para determinar el estado de infección. Además, se recogió una oreja de cada ratón, y se extrajo el ADN y se sometió a PCR cuantitativa (qPCR) para la identificación de Borrelia. La lectura de infección final se basó en dos análisis diferentes (VlsE ELISA y qPCR dirigida a recA).
ELISA con región invariable 6 (IR6) de VlsE
Se usó un péptido 25-mer biotinilado (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) derivado de la secuencia de la cepa IP90 de B. garinii para el análisis (Liang FT, Alvarez AL, Gu Y, Nowling JM, Ramamoorthy R, Philipp MT. An 15 immunodominant conserved region within the variable domain of VlsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi. J Immunol. 1999;163:5566-73). Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos precubiertas con estreptavidina (Nunc) con 100 µl/pocillo (1 µg/ml) de péptido en PBS complementado con Tween al 0,1 % (PBS/0,1T). Las placas se incubaron durante una noche a 4 °C. Después del recubrimiento con el péptido, las placas se lavaron una vez con PBS/0,1T. Las placas se bloquearon entonces durante una hora a temperatura ambiente 20 (TA) con 100 µl/pocillo de PBS + BSA al 2 %, antes del lavado de nuevo con PBS/0,1T. Se evaluó la reactividad después de la exposición de los sueros al péptido con diluciones de 1:200, 1:400 y 1:800 en PBS + BSA al 1 %. Las placas se incubaron durante 90 min a TA antes de lavarlas tres veces con PBS/0,1T. Cada pocillo recibió entonces 50 µl de 1,3 µg/ml de IgG anti-ratón policlonal de conejo conjugada con HRP (Dako) en PBS + BSA al 1 %. Las placas se incubaron entonces durante 1 h a TA. Después de tres lavados con PBS/0,1T, se añadió ABTS (50
25 µl/pocillo) como sustrato (Sigma-Aldrich) y se dejó que se desarrollara color durante 30 min. Se midió la absorbancia a 405 nm. Todos los sueros se ensayaron por duplicado. Los controles negativos incluían PBS en lugar de sueros, así como placas no recubiertas con el péptido. Los sueros de ratones que se mostró que eran positivos por cultivo para la infección por B. afzelii se usaron como controles positivos.
30 qPCR dirigida a recA
Se diseñaron cebadores de oligonucleótidos para el gen recA de manera que pudieran ser usados en qPCR para identificar todas las especies relevantes de Borrelia que causan borreliosis de Lyme (directo: CATGCTCTTGATCCTGTTTA, inverso: CCCATTTCTCCATCTATCTC). El fragmento de recA se clonó a partir de la 35 cepa N40 de B. burgdorferi s.s. en pET28b(+), para usarse como estándar para cada reacción. El ADN cromosómico extraído de las orejas de ratón se diluyó 1:8 en agua para reducir los efectos de matriz observados con el ADN no diluido. Se preparó una mezcla maestra que consistía en 10 µl de SSoAdvanced™ SYBR® Green Supermix, 0,3 µl de cada cebador (10 µm), y 7,4 µl de agua para cada experimento. Se mezclaron dieciocho µl de mezcla maestra con 2 µl del extracto de ADN diluido de cada vejiga u oreja en placas de microtitulación, y se amplificó el ADN 40 usando el sistema de detección por PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, Estados Unidos). Se desnaturalizó el ADN durante 3 minutos a 95 °C, seguido de 50 ciclos de 15 segundos a 95 °C y 30 segundos a 55 °C. Después de la amplificación, el ADN se preparó para el análisis de la curva de fusión mediante desnaturalización por 30 segundos a 95 °C seguido de 2 minutos a 55 °C. El análisis de la curva de fusión se realizó mediante una incubación de 5 segundos a 55 °C, con un aumento de 0,5 °C por ciclo, y 5 segundos a 95 °C. En cada placa, se incluyeron cuatro
45 controles no plantilla (NTC), así como una curva estándar por duplicado con las cantidades de copia de plantilla en el intervalo de 10 a 10.000.
Resultados
50 Se ensayaron los heterodímeros del fragmento mutante lipidado de OspA para determinar su capacidad protectora en doce experimentos separados. Se expuso a los ratones a B. burgdorferi s.s., cepa N40, OspA de serotipo 1 (ST1, exposición por aguja) o B. afzelii cepa IS1, OspA de serotipo 2 (ST2, exposición por garrapata) en tres experimentos cada vez o B. bavariensis, cepa Scf, OspA de serotipo 4 (ST4, exposición por aguja), B. garinii, cepa "A", OspA de serotipo 5 (ST5, exposición por aguja) o B. garinii, cepa "B", OspA de serotipo 6 (ST6, exposición por aguja) en dos
55 experimentos cada vez. En todos los experimentos, un grupo de ratones inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo sirvió como grupo de control negativo. Para la exposición por garrapatas, se aplicaron 1-2 garrapatas por ratón y únicamente los ratones de los cuales una garrapata se alimentó hasta la dilatación total se incluyeron en la lectura final. Sin embargo, no se realizó distinción entre los ratones de los cuales se recogieron una o dos garrapatas completamente alimentadas. Los datos de protección de los doce experimentos se resumen en la Tabla 4.
El heterodímero de OspA marcado con His lipidado (Lip-S1D1-S2D1-His) mostró una protección elevada estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher de dos colas) en la totalidad de los seis experimentos tanto contra la exposición al serotipo 1 de OspA como al serotipo 2 de OspA, en comparación con el grupo de control negativo. Sorprendentemente, la inmunización con Lip-S4D1-S3D1-His y Lip-S5D1-S6D1-His también confirió una 5 capacidad protectora elevada contra la exposición al serotipo 2 de OspA (Experimentos 4-6), lo que indica que puede haber un efecto de protección cruzada de inmunización con otros serotipos de los fragmentos mutantes de OspA. Además, la inmunización con Lip-S4D1-S3D1 confirió una protección estadísticamente significativa contra exposición por aguja con el serotipo 4 de OspA de Borrelia (Experimentos 7 y 8). Finalmente, la inmunización con Lip-S5D1-S6D1-His confirió protección contra exposición por aguja tanto con el serotipo 5 de OspA (Experimentos 9
10 y 10) y el serotipo 6 de OspA (Experimentos 11 y 12). El estado infeccioso de cada ratón se determinó usando VlsE ELISA en combinación con qPCR de recA. Se consideró que un ratón estaba infectado cuando al menos uno de los métodos daba un resultado positivo.
En conclusión, la inmunización con polipéptidos del heterodímero del fragmento mutante de OspA de la invención
15 confiere protección contra los serotipos de Borrelia ensayados y también puede proporcionar protección cruzada en algunos casos.
El heterodímero de OspA marcado con His lipidado (Lip-S1D1-S2D1-His) mostró una protección elevada estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher de dos colas) en la totalidad de los seis experimentos tanto 20 contra la exposición al serotipo 1 de OspA como al serotipo 2 de OspA, en comparación con el grupo de control negativo. Sorprendentemente, la inmunización con Lip-S4D1-S3D1-His y Lip-S5D1-S6D1-His también confirió una capacidad protectora elevada contra la exposición al serotipo 2 de OspA (Experimentos 4-6), lo que indica que puede haber un efecto de protección cruzada de inmunización con otros serotipos de los fragmentos mutantes de OspA. Además, la inmunización con Lip-S4D1-S3D1 confirió una protección estadísticamente significativa contra
25 exposición por aguja con el serotipo 4 de OspA de Borrelia (Experimentos 7 y 8). Finalmente, la inmunización con LipS5D1-S6D1-His confirió protección contra exposición por aguja tanto con el serotipo 5 de OspA (Experimentos 9 y 10) y el serotipo 6 de OspA (Experimentos 11 y 12). El estado infeccioso de cada ratón se determinó usando VlsE ELISA en combinación con qPCR de recA. Se consideró que un ratón estaba infectado cuando al menos uno de los métodos daba un resultado positivo.
30 En conclusión, la inmunización con polipéptidos del heterodímero del fragmento mutante de OspA de la invención confiere protección contra los serotipos de Borrelia ensayados y también puede proporcionar protección cruzada en algunos casos.
35 Ejemplo 5. Evaluación de la capacidad protectora de una vacuna de combinación 1:1:1 de los heterodímeros mutantes de OspA de la invención contra la exposición in vivo de OspA de serotipo 1 y serotipo 2 de Borrelia a través de los métodos de exposición por aguja o por garrapatas Procedimientos experimentales
Inmunización de ratones
Se usaron ratones C3H/HeN hembra (Janvier, Francia) para todos los estudios. Antes de cada exposición, se extrajo sangre de grupos de diez ratones de 8 semanas de edad a través de la vena facial y se prepararon y se agruparon 45 los sueros preinmunizados. Se administraron tres inmunizaciones s.c. de 100 µl cada una, a intervalos de dos semanas. Los grupos de ratones se inmunizaron con la vacuna de combinación que consistía en 1 µg de cada uno de Lip-S1D1-S2D1, LipS4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1. Otros tres antígenos a base de OspA se incluyeron en los experimentos de exposición: Lip-OspA1-His (serotipo 1 de longitud completa, OspA, lipidado y marcado con his), OspA ST1/ST2* quimérica lipidada y Lip-S1D1-S2D1 solo. El control negativo (placebo) fue adyuvante de Al(OH)3
50 solo. Todos los antígenos se formularon en PBS con hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final del 0,15 %.
*(OspA ST1/ST2 quimérica (SEQ ID NO: 212) es una quimera de OspA que consiste en los primeros 10 aminoácidos de la porción N-terminal de OspB (cepa B31), los aminoácidos 11-200 de serotipo 1 de OspA,
55 fusionados con los últimos 201-255 aminoácidos de la porción C-terminal de serotipo 2 de OspA y en donde la secuencia de tipo hLFA-1 del serotipo 1 de OspA (146-170) se reemplaza con la secuencia homóloga de un serotipo 2 de OspA. La secuencia de OspA de serotipo 2 va seguida de dos aminoácidos que se añaden debido al sitio de clonación (XhoI) más adelante del codón de terminación en el vector).
Una semana después de la tercera inmunización, se recogió sangre de la vena facial y se prepararon sueros hiperinmunizados. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr. 501/1989) y aprobada por "Magistratsabteilung 58".
5 Exposición por aguja de ratones inmunizados con Borrelia cultivada in vitro
Dos semanas después de la última inmunización, se expuso por vía s.c. a los ratones con espiroquetas de Borrelia diluida en 100 µl de medio de crecimiento (BSKII). Las dosis de exposición dependieron de la cepa, donde la virulencia de las cepas individuales se evaluó mediante experimentos de exposición para la determinación de la ID50.
10 Las dosis empleadas para los experimentos de exposición por aguja variaron de 20 a 50 veces la ID50. Cuatro semanas después de la exposición por aguja, los ratones se sacrificaron, y se recogió sangre y tejidos para que los métodos de lectura determinaran el estado infeccioso.
Exposición por garrapatas de ratones inmunizados y recolección de sueros y tejidos (también mencionado en el 15 presente documento como "método de exposición por garrapatas")
Para exponer a los ratones inmunizados a B. afzelii, se eliminó el pelo del lomo de cada ratón con crema Veet® (Reckitt Benckiser, Reino Unido) y se pegó un recipiente pequeño y ventilado a la piel con pegamento instantáneo (Pattex, Alemania). Posteriormente, se aplicaron dos ninfas por ratón de I. ricinus infectadas con B. afzelii, cepa IS1,
20 y se les permitió acoplarse y alimentarse hasta que se dilataron por completo y se cayeron. El estado de la alimentación se controló para cada garrapata individual y se incluyeron en la lectura final solamente los ratones donde se recogió al menos una garrapata completamente alimentada.
Resultados
25 Los heterodímeros de fragmento mutante de OspA lipidado que no estaban marcados con His se combinaron a una relación 1:1:1 y se ensayaron para determinar la capacidad protectora contra exposición a Borrelia. Los ratones inmunizados se expusieron a B. afzelii (ST2, cepa IS1, exposición por garrapatas) o con B. burgdorferi s.s. (ST1, cepa ZS7, exposición por aguja) en dos experimentos cada vez. Otros antígenos a base de OspA incluían Lip-S1D1
30 S2D2 en los cuatro experimentos y Lip-OspAl-His y OspA ST1/ST2 quimérica lipidada en los Experimentos 15 y 16. Un grupo de ratones inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo sirvió como grupo de control negativo en cada experimento. Para la exposición por garrapatas, se aplicaron 1-2 garrapatas por ratón y únicamente los ratones de los cuales una garrapata se alimentó hasta la dilatación total se incluyeron en la lectura final. Sin embargo, no se hizo distinción entre los ratones de los cuales se recogieron una o dos garrapatas completamente alimentadas. Los
35 datos de protección de los cuatro experimentos se resumen en la Tabla 5.
La vacuna de combinación que contenía tres heterodímeros de fragmento mutante de OspA lipidado a una relación
1:1:1 confirió protección estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher de dos colas) en los cuatro experimentos de exposición en comparación con el grupo de control negativo. El estado infeccioso de cada ratón se
40 determinó usando VlsE ELISA en combinación con qPCR de recA. Se consideró que un ratón estaba infectado cuando al menos uno de los métodos daba un resultado positivo.
Ejemplo 6 Unión de anticuerpos de sueros de ratones inmunizados con heterodímeros de fragmento mutante de OspA a la superficie celular de Borrelia
Procedimientos experimentales
Inmunización de ratones
50 Se usaron ratones C3H/HeN hembra para todos los estudios. Antes de cada exposición, se extrajo sangre de grupos de veinte ratones de 8 semanas de edad a través de la vena facial y se prepararon y se agruparon los sueros preinmunizados. Se administraron tres inmunizaciones s.c. de 100 µl cada una, a intervalos de dos semanas. Cada dosis contenía 1 µg de cada una de las proteínas respectivas: Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1 (vacuna de combinación), o 1 µg de proteína OspA lipidada de longitud completa (ST1-ST6 como se indica) o 1 µg
55 de heterodímero de OspA solo (Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 o Lip-S5D1-S6D1, como se indica) en adyuvante con hidróxido de aluminio a una concentración final del 0,15 %. El control negativo (placebo) fue adyuvante de Al(OH)3 solo. Una semana después de la tercera inmunización, se recogió sangre de la vena facial y se prepararon sueros hiperinmunizados. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr. 501/1989) y aprobada por "Magistratsabteilung 58".
Citometría de flujo para evaluar la unión a Borrelia
Se mezclaron espiroquetas (1 x 106) con un volumen igual de paraformaldehído al 4 % y se incubaron durante 2
5 horas a temperatura ambiente en una placa de 96 pocillos (Nunclon 96U, Nunc). La placa se centrifugó durante 5 minutos a 2.000 g y se eliminó el sobrenadante. Las células se lavaron con 150 µl de HBSS con BSA al 2 % (HBSS-B), se centrifugaron como anteriormente y se desechó el sobrenadante. Los sueros de ratón se inactivaron con calor incubándolos a 56 °C durante 35 minutos. Los sueros inactivados con calor se diluyeron en HBSS-B y se filtraron de manera estéril mediante centrifugación a 4.000 g durante 3 minutos usando filtros de tubo de centrífuga Costar spin
10 X (0,22 µm, Corning, Estados Unidos). Las espiroquetas se disolvieron en 100 µl de suero y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se centrifugó durante 15 minutos a 2.000 g y se eliminó el sobrenadante. Las células se lavaron una vez con 150 µl de HBSS-B y entonces se disolvieron en 100 µl de HBSS-B. Se añadió un microlitro de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de cabra conjugado con PE, Beckman Coulter, Estados Unidos) a las células y se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos en la oscuridad. Las espiroquetas se lavaron
15 una vez con 150 µl de HBSS-B y después de disolvieron en 200 µl de HBSS que contenía 2,5 µm de tinte de ADN SYTO-17 y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las espiroquetas teñidas se sedimentaron mediante centrifugación durante 5 minutos a 2.000 g y posteriormente se disolvieron en 200 µl de HBSS. Las espiroquetas marcadas se midieron en un citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter), y se controlaron para verificar eventos positivos a SYTO-17. Los valores obtenidos con sueros del grupo inmunizado con placebo se
20 restaron de los valores observados con sueros de los grupos inmunizados con heterodímero para controlar la unión no específica.
Resultados
25 La unión de anticuerpos a partir de suero de ratón hiper inmunizados se observó en el caso de diferentes Borrelias que expresaban los seis serotipos de OspA, lo que indica que los anticuerpos generados en respuesta a todos los antígenos son funcionalmente activos y pueden unirse a OspA natural in situ. La intensidad de fluorescencia fue lineal durante un intervalo prolongado de diluciones de suero. Para la mayoría de los serotipos de OspA, se observó que la intensidad de fluorescencia con sueros generados por heterodímeros era similar a la intensidad de
30 fluorescencia observada con sueros generados con OspA lipidada de longitud completa.
Ejemplo 7 Estudios de formulación
Se realizaron estudios relacionados con la formulación de la vacuna de combinación de la invención para optimizar
35 la estabilidad. Se ensayaron diferentes tipos de tampones y estabilizadores a diversas concentraciones, en combinación con hidróxido de aluminio y antígeno. Se determinó una formulación óptica de 40 µg/ml de cada uno de tres heterodímeros (120 µg de proteína total), fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, L-metionina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween 20 al 0,05 % (polisorbato 20) e hidróxido de aluminio al 0,15 % (p/v) a pH 6,7 ± 0,2.#
40 SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 S2D0-His: aminoácidos de las posiciones 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2,
SEQ ID NO: 2 S2D1-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1 (aa
SEQ ID NO: 3 S2D2-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 2 (aa
SEQ ID NO: 4 S2D3-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 3 (aa 244 y 259), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH)
SEQ ID NO: 5 S2D4-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4 (aa
SEQ ID NO: 6 S2D5-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 5 (aa
SEQ ID NO: 7 S2D6-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 6 (aa 185 y
SEQ ID NO: 8 S2D7-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 7 (aa
SEQ ID NO: 9 S2D8-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 8 (aa
SEQ ID NO: 10 S2D9-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 9 (aa
SEQ ID NO: 11 S2D10-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 10 (aa
SEQ ID NO: 12 S2D11-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 11 (aa
SEQ ID NO: 13 S2D12-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 12 (aa
SEQ ID NO: 14 Señal de lipidación de OspA de Borrelia MKKYLLGIGLILALIA SEQ ID NO: 15
5 Señal de lipidación de OspB de Borrelia MRLLIGFALALALIG SEQ ID NO: 16 Señal de lipidación lpp de E. coli MKATKLVLGAVILGSTLLAG
10 SEQ ID NO: 17 secuencia de tipo hLFA-1 de B. burgdorferi s.s. cepa B31 GYVLEGTLTAE SEQ ID NO: 18 Secuencia de tipo no hLFA-1 de B. afzelii cepa K78
15 NFTLEGKVAND SEQ ID NO: 19
B. afzelii (cepa K78; OspA de serotipo 2)
SEQ ID NO: 20
SEQ ID NO: 21
SEQ ID NO: 22
SEQ ID NO: 23
SEQ ID NO: 24
SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 26 Cebador directo GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG SEQ ID NO: 27
Cebador inverso GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG SEQ ID NO: 28 Cebador directo anidado
5 AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG SEQ ID NO: 29 Cebador anidado inverso GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA SEQ ID NO: 30
10 péptido 25 mer MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK SEQ ID NO: 31 Catelina de ratón RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE
15 SEQ ID NO: 32 5'-(dldC)13-3' dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC SEQ ID NO: 33 péptido KLK
20 KLKLLLLLKLK SEQ ID NO: 34
B. afzelii (cepa K78, serotipo 2), OspA aa 126-273
SEQ ID NO: 35
SEQ ID NO: 36 enlazador peptídico GGGGGGGG
30 SEQ ID NO: 37 enlazador peptídico GGGGGGGGGGGG SEQ ID NO: 38 enlazador peptídico
35 GAGA SEQ ID NO: 39 enlazador peptídico GAGAGAGA SEQ ID NO: 40
40 enlazador peptídico GAGAGAGAGAGA SEQ ID NO: 41 enlazador peptídico GGGSGGGS
45 SEQ ID NO: 42 enlazador peptídico GGGSGGGSGGGS SEQ ID NO: 43 S1D4-S2D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA serotipos 1 y 2 ambos con enlace disulfuro
50 de tipo 4, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 44 Lip-S1D4-S2D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de OspA de serotipos 1 y 2 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND
SEQ ID NO: 45 Lip-S1D4-S2D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 1 y 2 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 46 Lip-S1D4-S2D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 1 y 2 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 47 S1D1-S2D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por
la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND
SEQ ID NO: 48 Lip-S1D1-S2D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND
SEQ ID NO: 49 Lip-S1D1-S2D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 50 Lip-S1D1-S2D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 51 S3D4-S4D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 52 Lip-S3D4-S4D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 53
10 Lip-S3D4-S4D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH)
SEQ ID NO: 54
15 Lip-S3D4-S4D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N
SEQ ID NO: 55 S3D1-S4D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 3 y 4 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 56 Lip-S3D1-S4D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 3 y 4 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS Nterminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 57 Lip-S3D1-S4D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 3 y 4 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N
SEQ ID NO: 58 Lip-S3D1-S4D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 3 y 4 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para
SEQ ID NO: 59 S5D4-S6D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 5 y 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 60 Lip-S5D4-S6D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 5 y 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS Nterminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 61 Lip-S5D4-S6D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero OspA de serotipos 5 y 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia enlazadora
SEQ ID NO: 62 Lip-S5D4-S6D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero OspA de serotipos 5 y 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición
SEQ ID NO: 63 S5D1-S6D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 64 Lip-S5D1-S6D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS Nterminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 65 Lip-S5D1-S6D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia enlazadora
SEQ ID NO: 66 Lip-S5D1-S6D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la
SEQ ID NO: 67 S2D4-S1D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA serotipos 2 y 1 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 68 Lip-S2D4-S1D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N
5 terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND
SEQ ID NO: 69 Lip-S2D4-S1D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace 10 disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 70 Lip-S2D4-S1D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la
SEQ ID NO: 71 S2D1-S1D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace
disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND
SEQ ID NO: 72 Lip-S2D1-S1D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS Nterminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con
SEQ ID NO: 73 Lip-S2D1-S1D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N
SEQ ID NO: 74 Lip-S2D1-S1D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la
SEQ ID NO: 75
S4D4-S3D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 76 Lip-S4D4-S3D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N
SEQ ID NO: 77 Lip-S4D4-S3D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N
SEQ ID NO: 78 Lip-S4D4-S3D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para
SEQ ID NO: 79 S4D1-S3D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1 SEQ ID NO: 80 Lip-S4D1-S3D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N
SEQ ID NO: 81 Lip-S4D1-S3D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N
SEQ ID NO: 82 Lip-S4D1-S3D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para
SEQ ID NO: 83 S6D4-S5D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1 SEQ ID NO: 84 Lip-S6D4-S5D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N
SEQ ID NO: 85 Lip-S6D4-S5D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N
SEQ ID NO: 86 Lip-S6D4-S5D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para
SEQ ID NO: 87 S6D1-S5D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1 SEQ ID NO: 88 Lip-S6D1-S5D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N
SEQ ID NO: 89 10 Lip-S6D1-S5D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace
SEQ ID NO: 90 Lip-S6D1-S5D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de 15 serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para
SEQ ID NO: 91 S1D4-S2D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, SEQ ID NO: 92 Lip-S1D4-S2D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa
SEQ ID NO: 93 Lip-S1D4-S2D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no
SEQ ID NO: 94 Lip-S1D4-S2D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His
SEQ ID NO: 95 S1D1-S2D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND
SEQ ID NO: 96 Lip-S1D1-S2D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa
SEQ ID NO: 97 Lip-S1D1-S2D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no
SEQ ID NO: 98 Lip-S1D1-S2D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His CSEQ ID NO: 99 S3D4-S4D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4 y
SEQ ID NO: 100 Lip-S3D4-S4D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1,
SEQ ID NO: 101 Lip-S3D4-S4D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos,
SEQ ID NO: 102 Lip-S3D4-S4D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His
SEQ ID NO: 103 S3D1-S4D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1 y
OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 104 Lip-S3D1-S4D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1,
SEQ ID NO: 105 Lip-S3D1-S4D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos,
SEQ ID NO: 106 Lip-S3D1-S4D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His
SEQ ID NO: 107 S5D4-S6D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1 SEQ ID NO: 108 Lip-S5D4-S6D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1,
SEQ ID NO: 109 Lip-S5D4-S6D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos,
SEQ ID NO: 110 Lip-S5D4-S6D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His
SEQ ID NO: 111 S5D1-S6D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1 SEQ ID NO: 112 Lip-S5D1-S6D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4,
SEQ ID NO: 113 Lip-S5D1-S6D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos,
SEQ ID NO: 114 Lip-S5D1-S6D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His
SEQ ID NO: 115 S2D4-S1D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND SEQ ID NO: 116 Lip-S2D4-S1D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa
SEQ ID NO: 117 Lip-S2D4-S1D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no
SEQ ID NO: 118 Lip-S2D4-S1D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C
SEQ ID NO: 119 S2D1-S1D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND
SEQ ID NO: 120 Lip-S2D1-S1D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa
SEQ ID NO: 121 Lip-S2D1-S1D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no
SEQ ID NO: 122 Lip-S2D1-S1D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His CSEQ ID NO: 123 S4D4-S3D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4 y
5 SEQ ID NO: 124 Lip-S4D4-S3D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1,
10 SEQ ID NO: 125 Lip-S4D4-S3D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, etiqueta His C
SEQ ID NO: 126 Lip-S4D4-S3D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His
SEQ ID NO: 127 S4D1-S3D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1
SEQ ID NO: 128 Lip-S4D1-S3D4_nt: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para
SEQ ID NO: 129 Lip-S4D1-S3D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos,
SEQ ID NO: 130 Lip-S4D1-S3D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His
SEQ ID NO: 131 S6D4-S5D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1, secuencia enlazadora LN1 SEQ ID NO: 132 Lip-S6D4-S5D1_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1,
SEQ ID NO: 133 Lip-S6D4-S5D1_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos,
SEQ ID NO: 134 Lip-S6D4-S5D1_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His
SEQ ID NO: 135 S6D1-S5D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4, secuencia enlazadora LN1 SEQ ID NO: 136 Lip-S6D1-S5D4_nt: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4,
SEQ ID NO: 137 Lip-S6D1-S5D4_His_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos,
SEQ ID NO: 138 Lip-S6D1-S5D4_His_nt: Secuencia codificante para proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4, señal de lipidación lpp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, etiqueta His
SEQ ID NO: 140 Lip-S2D0-His: aminoácidos de las posiciones 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2, secuencia de tipo salvaje, CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH)
SEQ ID NO: 141 Lip-S2D1-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1
SEQ ID NO: 142 Lip-S2D2-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 2
SEQ ID NO: 143 Lip-S2D3-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 3
SEQ ID NO: 144 Lip-S2D4-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4
SEQ ID NO: 145 Lip-S2D5-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 5
SEQ ID NO: 146 Lip-S2D6-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 6
SEQ ID NO: 147 Lip-S2D7-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 7
SEQ ID NO: 148 Lip-S2D8-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 8
SEQ ID NO: 149 Lip-S2D9-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 9
SEQ ID NO: 150 Lip-S2D10-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 10 (aa 201 y 214), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) SEQ ID NO: 151 Lip-S2D11-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 11
SEQ ID NO: 152 Lip-S2D12-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 12
SEQ ID NO: 153 Lip-S2D0: aminoácidos de las posiciones 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2,
SEQ ID NO: 154 Lip-S2D1: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1 (aa
SEQ ID NO: 155 Lip-S2D2: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 2 (aa
SEQ ID NO: 156 Lip-S2D3: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 3 (aa
SEQ ID NO: 157 Lip-S2D4: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4 (aa
SEQ ID NO: 158 Lip-S2D5: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 5 (aa
SEQ ID NO: 159 Lip-S2D6: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 6 (aa
SEQ ID NO: 160 Lip-S2D7: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 7 (aa 199 y 223), CKQN N-terminal para la adición de lípidos SEQ ID NO: 161 Lip-S2D8: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 8 (aa
SEQ ID NO: 162 Lip-S2D9: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 9 (aa
SEQ ID NO: 163 Lip-S2D10: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 10 (aa
SEQ ID NO: 164 Lip-S2D11: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 11 (aa
SEQ ID NO: 165 Lip-S2D12: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 12 (aa
SEQ ID NO: 166 S2D0: aminoácidos de las posiciones 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2, secuencia
SEQ ID NO: 167 S2D1: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1 (aa 182 y 269
SEQ ID NO: 168 S2D2: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 2 (aa 182 y
SEQ ID NO: 169 S2D3: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 3 (aa 244 y
SEQ ID NO: 170 S2D4: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4 (aa 141 y SEQ ID NO: 171 S2D5: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 5 (aa 165 y
SEQ ID NO: 172 S2D6: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 6 (aa 185 y
SEQ ID NO: 173 S2D7: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 7 (aa 199 y 223
SEQ ID NO: 174 S2D8: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 8 (aa 243 y 262
SEQ ID NO: 175 S2D9: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 9 (aa 184 y 204
SEQ ID NO: 176 S2D10: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 10 (aa 201 y 214
SEQ ID NO: 177 S2D11: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 11 (aa 246
SEQ ID NO: 178 S2D12: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 12 (aa 167
SEQ ID NO: 179
B. burgdorferi s.s. (cepa B31, serotipo 1), OspA_aa 126-273 con reemplazo de la secuencia de tipo hLFA
SEQ ID NO: 180
B. garinii (cepa PBr, serotipo 3), OspA_aa 126-274
SEQ ID NO: 181
SEQ ID NO: 182
SEQ ID NO: 183
SEQ ID NO: 184 Enlazador peptídico LN1 construido a partir de dos regiones bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA de B. burgdorferi s.s. cepa B31 (aa 65-74 y aa 42-53, intercambio de aminoácidos en la posición 53: D53S) GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS SEQ ID NO: 185 Lip-S1D4-S2D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 1 y 2 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de
SEQ ID NO: 186 Lip-S1D1-S2D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación Nterminal
SEQ ID NO: 187 Lip-S3D4-S4D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4 CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N-terminal
SEQ ID NO: 188 Lip-S3D1-S4D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 3 y 4 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación Nterminal SEQ ID NO: 189 Lip-S5D4-S6D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 5 y 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación Nterminal
SEQ ID NO: 190 Lip-S5D1-S6D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación Nterminal
SEQ ID NO: 191 Lip-S2D4-S1D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N
15 terminal
SEQ ID NO: 192 Lip-S2D1-S1D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 2 y 1 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación Nterminal
SEQ ID NO: 193 Lip-S4D4-S3D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación Nterminal
SEQ ID NO: 194 Lip-S4D1-S3D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 4 y 3 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación Nterminal
SEQ ID NO: 195 Lip-S6D4-S5D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación Nterminal SEQ ID NO: 196 Lip-S6D1-S5D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipos 6 y 5 ambos con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación Nterminal
SEQ ID NO: 197 Lip-S1D4-S2D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 198 Lip-S1D1-S2D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 199 Lip-S3D4-S4D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia
SEQ ID NO: 200 Lip-S3D1-S4D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia
SEQ ID NO: 201 Lip-S5D4-S6D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N-terminal SEQ ID NO: 202 Lip-S5D1-S6D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia
SEQ ID NO: 203 Lip-S2D4-S1D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 204 Lip-S2D1-S1D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 con reemplazo por la secuencia de tipo no hLFA-1
SEQ ID NO: 205 Lip-S4D4-S3D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia
SEQ ID NO: 206 Lip-S4D1-S3D4_aa: Secuencia codificante para proteínas de fusión de heterodímeros intermedios y finales de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro de tipo 4,
SEQ ID NO: 207 Lip-S6D4-S5D1_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia enlazadora LN1, lipidación N-terminal, SEQ ID NO: 208 Lip-S6D1-S5D4_aa: Proteína de fusión de heterodímero de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro de tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro de tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia
SEQ ID NO: 209
B. afzelii (cepa K78; OspA de serotipo 2) aa 17-273, secuencia señal de lipidación eliminada (aa 1-16:
SEQ ID NO: 210
B. burgdorferi (OspA de serotipo 1, cepa ZS7) aa 17-273, secuencia señal de lipidación eliminada (aa 1-16:
SEQ ID NO: 211 Péptido que contiene cisteína de OspA CKQN SEQ ID NO: 212
SEQ ID NO: 213
25 SEQ ID NO: 214 Cebador oligonucleotídico directo para el gen RecA de Borrelia CATGCTCTTGATCCTGTTTA SEQ ID NO: 215 Etiqueta de histidina
30 GLEHHHHHH SEQ ID NO: 216 Cebador oligonucleotídico inverso para el gen RecA de Borrelia CCCATTTCTCCATCTATCTC

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido que comprende el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 186;
    o cualquier variante funcional de dicha secuencia de aminoácidos
    -
    con una identidad de secuencia de al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 %, mucho más preferiblemente al menos el 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 186, y
    -
    con una diferencia en la capacidad protectora (∆pc) entre la variante funcional y el placebo (negativo) de control de al menos el 50 %, especialmente al menos el 60 %, preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, incluso más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente 95 %, mucho más preferiblemente al menos el 95 %.
  2. 2.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que consiste en Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 186).
  3. 3.
    Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
  4. 4.
    Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3.
  5. 5.
    Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 3 o el vector como se define en la reivindicación 4, en el que dicha célula huésped es preferiblemente E. coli.
  6. 6.
    Un proceso para producir una célula que expresa el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende transformar o transfectar una célula huésped adecuada con el vector de acuerdo con la reivindicación 4.
  7. 7.
    Un método para producir el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por las siguientes etapas:
    a) introducir un vector que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en una célula huésped, b) cultivar la célula huésped en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido, c) homogeneizar dicha célula huésped, y d) someter el homogenado de la célula huésped a etapas de purificación.
  8. 8.
    Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 y/o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  9. 9.
    La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el excipiente farmacéuticamente aceptable comprende L-metionina.
  10. 10.
    La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que comprende además al menos un antígeno adicional derivado de una especie de Borrelia que causa la borreliosis de Lyme.
  11. 11.
    La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 que comprende además al menos un antígeno adicional, en la que el antígeno adicional es de un patógeno transmitido por garrapatas, en donde el patógeno transmitido por garrapatas se selecciona del grupo que comprende Borrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conorii, Rickettsia helvetica, Rickettsia parkeri, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Coxiella burnetii y Borrelia lonestari, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), virus de la fiebre de Colorado transmitida por garrapatas (CTFV), virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (CCHFV), virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur (KFDV), virus Powassan, virus Heartland, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk (OHFV) y Babesia spp.
  12. 12.
    La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizada por que comprende además una sustancia inmunoestimulante, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en polímeros policatiónicos, especialmente péptidos policatiónicos, oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes (ODN), especialmente oligo(dIdC)13 (SEQ ID NO: 32), péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys,
    especialmente el péptido KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 33), compuestos neuroactivos, especialmente la hormona de crecimiento humana, hidróxido de aluminio, o fosfato de aluminio, adyuvante completo o incompleto de Freund, o combinaciones de los mismos.
    5 13. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en la que dicha composición farmacéutica es una vacuna.
  13. 14. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de acuerdo con
    cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para su uso como un medicamento, particularmente como una vacuna. 10
  14. 15. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para su uso en un método para el tratamiento o prevención de una infección por Borrelia, particularmente una infección por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica,
    15 preferiblemente una infección por B. burgdorferi s.s., B. afzelii o B. garinii.
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