ES2800873T3 - Fragmentos mutantes de OspA y métodos y usos relacionados con estos - Google Patents

Fragmentos mutantes de OspA y métodos y usos relacionados con estos Download PDF

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Abstract

Un polipéptido que comprende el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 190; o cualquier variante funcional de dicha secuencia de aminoácidos - con una identidad de secuencia de al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, incluso con mayor preferencia al menos 90 %, con la máxima preferencia al menos 95 % con respecto a la secuencia de la SEQ ID NO: 190, y - con una diferencia en la capacidad protectora (Apc) entre la variante funcional y el control placebo (negativo) de al menos 50 %, específicamente al menos 60 %, preferentemente, al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, incluso con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 %, con la máxima preferencia al menos 95 %.

Description

DESCRIPCIÓN
Fragmentos imitantes de OspA y métodos y usos relacionados con estos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la prevención y el tratamiento de la infección por Borrelia. Particularmente, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento mutante de una proteína de superficie externa A (OspA), un ácido nucleico que codifica la misma, una composición farmacéutica (particularmente para usar como un medicamento en un método de tratamiento o prevención de una infección por Borrelia) que comprende el polipéptido y/o el ácido nucleico.
Antecedentes de la invención
La borreliosis de Lyme, o enfermedad de Lyme, es la enfermedad transmitida por garrapatas más reportada comúnmente en Europa y América del Norte. La enfermedad es causada por la espiroqueta de tipo gramnegativo transmitida por artrópodos, Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi s.l.), y es una infección que puede afectar múltiples órganos o tejidos, lo que resulta en trastornos cutáneos, cardíacos, musculoesqueléticos y neurológicos. En la mayoría de los países, la borreliosis de Lyme no es una enfermedad de declaración obligatoria y no se dispone de datos exactos con respecto a las tasas de incidentes anuales. En los Estados Unidos, el agente causal es B. burgdorferi sensu stricto (B. burgdorferi s.s.) y la borreliosis de Lyme se localiza en los estados del noreste, medio Atlántico y norte-centro superior. En 2010, se notificó un total de aproximadamente 30 000 casos de borreliosis de Lyme por el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de los EE.UU. En Europa, los principales agentes causantes de la borreliosis de Lyme son B. afzelii and B. garinii, así como también B. burgdorferi s.s. y B. bavariensis, que contribuyen en una menor medida en dependencia de la ubicación geográfica. La prevalencia de la borreliosis de Lyme varía considerablemente en diferentes países europeos, con una prevalencia general incrementada de oeste a este. En gran parte de Europa, el número de casos reportados de borreliosis de Lyme ha aumentado desde principios de la década de 1990 (por ejemplo, la República Checa, Estonia, Lituania; ver Borreliosis de Lyme en Europa, informe de la OMS de 2006), y la distribución geográfica de los casos también se ha expandido.
Borrelia pertenece a la familia Spirochaetaceae, que se subdivide en los géneros de importancia médica Treponema, Leptospira y Borrelia. B. burgdorferi s.l. es una bacteria gramnegativa en forma de espiral, vigorosamente móvil, de aproximadamente 10-20 pm de largo y 0,2-0,5 pm de ancho, que crece en condiciones microaerófilas. La pared celular de las espiroquetas consiste en una membrana citoplasmática rodeada por peptidoglicano y numerosos flagelos y después por una membrana externa débilmente asociada.
La borreliosis de Lyme generalmente ocurre en etapas caracterizadas por diferentes manifestaciones clínicas, con remisiones y exacerbaciones. La etapa 1, infección temprana, consiste en una infección localizada de la piel, seguida en días o semanas por la etapa 2, de infección diseminada, y de meses a años después por la etapa 3, de infección persistente. Sin embargo, la infección es variable; algunos pacientes solo tienen infecciones localizadas de la piel, mientras que otros muestran solo manifestaciones posteriores de la enfermedad, tal como la artritis. Los diferentes síndromes clínicos de la borreliosis de Lyme también son causados por la infección con diversas especies de B. burgdorferi s.l. Con mayor frecuencia B. burgdorferi s.s. causa manifestaciones articulares (artritis) y problemas cardíacos, B. afzelii causa principalmente síntomas dérmicos (eritema migratorio; EM y acrodermatitis crónica atrófica; ACA), mientras que B. garinii está implicada en la mayoría de los casos de neuroborreliosis.
Infección localizada: El síntoma más común de la etapa 1 de una infección es el eritema migratorio, que ocurre en el 70-80 % de las personas infectadas. A esta lesión cutánea a menudo le siguen síntomas parecidos a la gripe, tales como mialgia, artralgia, dolor de cabeza y fiebre. Estos síntomas inespecíficos ocurren en el 50 % de los pacientes con eritema migratorio.
Infección diseminada: Durante la etapa 2, las bacterias se mueven al torrente sanguíneo desde el sitio de la infección hasta los tejidos y órganos distales. Los síntomas neurológicos, cardiovasculares y artríticos que ocurren en esta etapa incluyen meningitis, neuropatía craneal y artritis inflamatoria intermitente.
Infección persistente: La etapa 3 de la infección es crónica y ocurre de meses a años después de la picadura de la garrapata. El síntoma más común en América del Norte es la artritis reumatoide, causada por una infección con B. burgdorferi s.s. La infección persistente del sistema nervioso central con B. garinii causa síntomas neurológicos más graves durante la etapa 3, y una infección persistente de la piel con B. afzelii produce acrodermatitis crónica atrófica.
En algunos grupos de riesgo, tales como agricultores, trabajadores forestales, excursionistas, corredores o vacacionistas, las tasas de seroprevalencia e incidencia de enfermedades han aumentado, como en niños menores de 15 años y adultos entre 39 y 59 años, sin preferencia de género. Este aumento en la incidencia de la borreliosis de Lyme se relaciona con cambios en los hábitats forestales; así como también con factores sociales. Los cambios ambientales, tales como la fragmentación de los bosques, llevaron a una brusca reducción de los depredadores de roedores tales como los zorros y las aves de rapiña, lo que a su vez condujo a un aumento en la población de ratones, con un aumento posterior en la población de garrapatas. Más recientemente, la reforestación irregular ha aumentado el número de venados y, por lo tanto, el número de garrapatas. La expansión suburbana y el uso cada vez mayor de áreas forestales para la recreación, tal como el campismo y el excursionismo a pie, ha llevado a los humanos a un mayor contacto con el mayor número de garrapatas como vectores de Borrelia. Todos estos factores juntos han contribuido a una distribución más amplia de Borrelia y a una mayor incidencia de borreliosis de Lyme.
Los agentes antimicrobianos son el método principal de tratamiento de la infección por Borrelia. El antibiótico usado depende de la etapa de la enfermedad, de los síntomas y de las alergias del paciente a la medicación. La duración del curso de antibióticos depende, además, de la etapa de la enfermedad y de la gravedad de los síntomas. La borreliosis de Lyme en etapas tempranas se trata, típicamente, con tetraciclinas orales, tales como la doxiciclina, y penicilinas semisintéticas, tales como la amoxicilina o la penicilina V. Los trastornos artríticos y neurológicos se tratan con altas dosis de penicilina G intravenosa o ceftriaxona. Hasta el 30 % de los pacientes con borreliosis de Lyme no muestran los síntomas tempranos característicos de infección con Borrelia, lo que hace que el diagnóstico y el tratamiento sean problemáticos. El curso de antibióticos puede ser largo (hasta varios meses) y a veces ineficaz y, por lo tanto, se debate en el campo de Borrelia, especialmente durante la enfermedad en una etapa tardía. Incluso en el caso de un tratamiento eficaz de Borrelia, los pacientes pueden sufrir fatiga debilitante, dolor, o síntomas neurológicos durante años, lo que se conoce como síndrome de la enfermedad de Lyme posterior al tratamiento. En general, el uso de antibióticos puede tener consecuencias indeseables, tales como el desarrollo de resistencia por parte de los microorganismos a los que va dirigido el tratamiento. Finalmente, la terapia con antibióticos puede curar eficazmente la borreliosis de Lyme, pero no proporciona protección contra infecciones posteriores.
Una vacuna monovalente basada en OspA de serotipo 1 (LYMErix™) se aprobó y se comercializa en los EE.UU. para la prevención de la enfermedad de Lyme causada por Borrelia burgdorferi s.s. Sin embargo, la heterogeneidad en las secuencias de OspA entre diferentes serotipos en Europa y en otros lugares impide la protección eficiente con una vacuna basada en OspA a partir de solo un único serotipo.
Las moléculas de OspA quiméricas que comprenden la porción proximal de un serotipo de OspA, junto con la porción distal de otro serotipo de OspA, al mismo tiempo que conservan las propiedades de reacción antigénicas de ambos polipéptidos parentales, pueden usarse en la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Lyme o la borreliosis (documento WO2011/143617, WO2011/143623). Además, se ha informado la introducción de residuos de cisteína para la inmovilización de fragmentos de OspA y el posterior análisis de la mecánica intramolecular de las subestructuras de proteínas (Hertradi y otros, 2003, J. Mol. Biol. 333: 993-1002).
Actualmente, en el mercado no existe un medicamento preventivo para la borreliosis de Lyme y, por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de desarrollar tal medicamento que pueda proporcionar una protección eficaz contra Borrelia que está presente en los EE.UU., Europa y otros lugares, especialmente para el desarrollo de un medicamento que pueda proporcionar protección eficaz contra varios serotipos de Borrelia simultáneamente.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento de la proteína A de la superficie externa mutante de Borrelia (OspA), un ácido nucleico que codifica el mismo, un vector que comprende tal molécula de ácido nucleico, y una célula huésped que comprende tal vector como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un proceso para producir tal polipéptido y un proceso para producir una célula que expresa tal polipéptido. Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende tal polipéptido, molécula de ácido nucleico o vector (particularmente para usar como una vacuna o en un método para tratar o prevenir una infección por Borrelia).
Los esfuerzos para desarrollar una vacuna de subunidad para la prevención de la borreliosis de Lyme se han enfocado en gran parte en el uso de la proteína A de la superficie externa borrelial (OspA) como un antígeno. La proteína OspA se expresa por la Borrelia solamente cuando esta se encuentra en el intestino de la garrapata vector. Por lo tanto, los anticuerpos OspA producidos por la vacunación no combaten las infecciones en el cuerpo, sino que entran en el intestino de la garrapata cuando esta se alimenta de sangre. Allí, los anticuerpos neutralizan las espiroquetas y bloquean la migración de las bacterias desde el intestino medio a las glándulas salivales de la garrapata, la ruta a través de la cual la Borrelia ingresa al huésped vertebrado. Por lo tanto, los anticuerpos específicos de OspA evitan la transmisión de Borrelia a partir de la garrapata, como vector, al huésped humano.
La forma lipidada de OspA de B. burgdorferi s.s., cepa ZS7, junto con hidróxido de aluminio se desarrolló comercialmente como una vacuna contra Borrelia (LYMErix™) por SmithKline Beecham, ahora GlaxoSmithKline (GSK) para el mercado estadounidense. Se necesitaron tres dosis de LYMErix™ durante un período de un año para una protección óptima. Después de las dos primeras dosis, la eficacia de la vacuna contra la borreliosis de Lyme fue del 49 %, y después de la tercera dosis del 76 %. Sin embargo, poco después de que LYMErix™ estuviera disponible comercialmente, se retiró del mercado en 2002. Las razones citadas fueron cuestiones de aplicación práctica de la vacuna, por ejemplo, la necesidad de inyecciones de refuerzo cada año o cada dos años, así como también el costo relativamente alto de este enfoque preventivo en comparación con el tratamiento con antibióticos para la infección temprana. Además, existía la preocupación de que LYMErix™ pudiera desencadenar reacciones autoinmunitarias en un subgrupo de la población debido a la homología de secuencia con una proteína humana, aunque esto nunca se confirmó. Además, esta vacuna no proporcionó protección cruzada contra otras especies de Borrelia clínicamente importantes.
Por consiguiente, en una modalidad, un objeto de la presente invención fue proporcionar una vacuna mejorada para la prevención de la borreliosis de Lyme. Preferentemente, la vacuna se produce fácilmente al mismo tiempo que es protectora, segura y más efectiva que las terapias existentes y/o proporciona protección contra más de una especie de Borrelia.
El problema subyacente a la presente invención se resuelve mediante un polipéptido que comprende un heterodímero que comprende dos fragmentos de una proteína A de la superficie externa (OspA) mutante, en donde cada fragmento mutante consiste en un dominio C-terminal de una proteína OspA de Borrelia y difiere del correspondiente fragmento de tipo silvestre al menos mediante la introducción de al menos un enlace disulfuro. Específicamente, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 190; o cualquier variante funcional de dicha secuencia de aminoácidos (i) con una identidad de secuencia de al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, incluso con mayor preferencia al menos 90 %, con la máxima preferencia al menos 95 % con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 190, y (ii) con una diferencia en la capacidad protectora (Apc) entre la variante funcional y el control placebo (negativo) de al menos 50 %, específicamente al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, incluso con mayor preferencia 90%, incluso con mayor preferencia 95 %, con la máxima preferencia al menos 95 %.
Sorprendentemente, se encontró que la introducción de al menos un enlace disulfuro en un fragmento mutante aumenta la capacidad protectora del polipéptido que comprende el fragmento de OspA mutante con respecto a un polipéptido que comprende el fragmento de OspA de tipo silvestre, como se demostró en un modelo de infección in vivo. Como se demuestra en los Ejemplos, la introducción de al menos un enlace disulfuro en el fragmento C-terminal de OspA de B. afzelii aumentó su capacidad protectora con respecto al fragmento OspA de tipo silvestre sin un enlace disulfuro. Las tablas 2 y 3 proporcionan datos que demuestran la capacidad protectora de los fragmentos mutantes con un enlace disulfuro introducido ("S2D1-5") en comparación con el fragmento de OspA de tipo silvestre ("S2D0"), ya que se infectaron menos animales después de la inmunización con fragmentos mutantes de OspAs en comparación con los fragmentos de OspA de tipo silvestre. Algunos de los fragmentos mutantes de OspA evaluados proporcionaron una protección comparable a la conferida por el antígeno de control positivo, la proteína OspA de longitud completa no lipidada.
Descripción detallada de la invención
Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un heterodímero que comprende dos fragmentos de una proteína A de la superficie externa (OspA) mutante, en donde cada fragmento mutante consiste en un dominio C-terminal de una OspA de Borrelia y difiere del fragmento correspondiente de tipo silvestre al menos mediante la introducción de al menos un enlace disulfuro. Específicamente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 190; o cualquier variante funcional de dicha secuencia de aminoácidos (i) con una identidad de secuencia de al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, incluso con mayor preferencia al menos 90 %, con la máxima preferencia al menos 95 % con respecto a la secuencia de la SEQ ID NO: 190 y (ii) con una diferencia en la capacidad protectora (Apc) entre la variante funcional y el control placebo (negativo) de al menos 50 %, específicamente al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, incluso con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 %, con la máxima preferencia al menos 95 %. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 190 se conoce como Lip-S5D1-S6D1 y comprende un heterodímero de una proteína de fusión de un fragmento de una OspA mutante de serotipo 5 y un fragmento de OspA mutante de serotipo 6, cada fragmento tiene un enlace disulfuro de tipo 1 (ver abajo). Pueden estar presentes uno o más fragmentos mutantes de OspAs adicionales en el polipéptido.
El término B. burgdorferi s.l. abarca al menos 13 especies de Borrelia (Tabla A-1). Estas especies se encuentran en diferentes regiones geográficas y viven en la naturaleza en ciclos enzoóticos que involucran garrapatas del complejo Ixodes ricinus (también llamado complejo Ixodes persulcatus) y una amplia gama de huéspedes animales. Cuatro especies de Borrelia son responsables de la mayoría de las infecciones en humanos: B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii. Otras tres especies, B. lusitaniae, B. bissettii y B. spielmanii, se han detectado ocasionalmente en humanos, pero su papel en la borreliosis de Lyme es incierto en la actualidad. Todavía se reportan nuevas especies de Borrelia.
Tabla A-1.
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Como se detalló anteriormente, la proteína A de la superficie externa de Borrelia (OspA) es una lipoproteína inmunogénica abundante de Borrelia de particular interés debido a su potencial como un candidato vacunal. La OspA de B. burgdorferi s.l. es una lipoproteína básica que tiene una masa molecular de aproximadamente 30 kDa y está codificada en un plásmido lineal. Un aspecto importante de la proteína OspA es su lipidación N-terminal; es decir, el residuo de cisteína N-terminal está sustituido con ácidos grasos con una longitud de cadena de entre C14 y C19 con o sin dobles enlaces, una característica que potencia la inmunogenicidad de la proteína OspA. Se ha demostrado que los péptidos sintéticos poco inmunogénicos inducen respuestas de anticuerpos más fuertes cuando están lipidados; por ejemplo, cuando se acoplan covalentemente a PamteCys (Bessler and Jung, Research Immunology (1992) 143:548-552), una sustitución de ácidos grasos que se encuentra en el extremo amino terminal de muchas lipoproteínas bacterianas que se sintetizan con una secuencia señal que especifica la unión de lípidos. Además, se demostró que la porción Pam3Cys potencia las respuestas inmunitarias a OspA en ratones, parcialmente a través de su interacción con TLR-2 (Yoder, y otros, (2003) Infection and Immunity 71:3894-3900). Por lo tanto, se esperaría que la lipidación de un fragmento C-terminal de OspA potencie la inmunogenicidad y la capacidad protectora del fragmento.
El análisis de los aislados de B. burgdorferi s.l. obtenidos en América del Norte y Europa ha revelado que OspA tiene una variabilidad antigénica y que pueden definirse varios grupos distintos en base a la serología. Se han informado AcM anti-OspA que se unen a determinantes antigénicos N-terminales específicos. La cristalografía de rayos X y el análisis de RMN se han usado para identificar dominios hipervariables inmunológicamente importantes en OspA y se ha mapeado el epítopo LA-2 en los aminoácidos C-terminales 203-257 (Ding y otros, Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000). Estudios anteriores demostraron que la producción de anticuerpos contra el epítopo LA-2 C-terminal se correlaciona con la inmunidad protectora después de la vacunación con OspA (Van Hoecke y otros, Vaccine (1996) 14(17-18):1620-6 y Steere y otros, N Engl J Med (1998) 339:209-215). Se demostró que los anticuerpos contra La -2 bloquean la transmisión de Borrelia de la garrapata al huésped (Golde y otros, Infect Immun (1997) 65(3):882-889). Estos estudios sugirieron que la porción C-terminal de la proteína OspA puede ser suficiente para inducir inmunidad protectora. Debe notarse que la secuencia de la porción C-terminal de OspA está menos altamente conservada entre los serotipos de Borrelia que la porción N-terminal (ver Figura 1).
En base a la información de los estudios descritos anteriormente, junto con otros, en la presente invención se usaron formas truncadas de OspA que comprenden la porción C-terminal (también denominada en la presente descripción "fragmento de OspA" o "monómero"). Estas formas truncadas de OspA demostraron ser menos protectoras que la proteína OspA de longitud completa. Sorprendentemente, sin embargo, se encontró en el curso de la presente invención que la introducción de un enlace disulfuro en la forma truncada (también denominada en la presente descripción "fragmento de OspA muíante" o "fragmento muíante") supera esta desventaja. Aunque no se limita a un mecanismo específico, se cree que la protección mejorada se debe a una mayor estabilidad del fragmento OspA, como se muestra en los ensayos que miden la estabilidad térmica.
Debido a su relevancia en el campo de la medicina, particularmente para los humanos, B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii son de particular interés. A este respecto, estas cuatro especies de Borrelia pueden clasificarse adicionalmente de acuerdo con sus serotipos de OspA, que se han determinado mediante análisis con anticuerpos monoclonales específicos para la proteína OspA respectiva. Los serotipos 1-7, que representan la mayoría de las infecciones humanas por Borrelia, junto con sus tasas de prevalencia, se muestran en la Tabla A-2 más abajo.
Tabla A-2. Designación de serotipo y prevalencia de B. burdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii. La Borrelia aislada del líquido cefalorraquídeo humano o de la piel o de las garrapatas como vectores se clasificó en serotipos mediante el sondeo de lisados de células enteras con anticuerpos monoclonales de ratón, cada uno específico para un epítopo particular de OspA (como se describió por Wilske y otros, J. of Clin Microbiol (1993) 31(2):340-350 y presentado por Baxter Bioscience en "Climate change effect on ticks and tick-borne diseases",
Brussels, 06 Feb 2009).
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La estructura de la proteína OspA de B. burgdorferi s.s. cepa B31 se determinó por Li y otros, (Proc Natl Acad Sci (1997) 94:3584-3589). Se compone de hojas p N-terminal (hojas p1 a 4) y centrales (hojas p5 a 14n [parte N-terminal]), hoja de barril 1 (hojas p 14c [parte C-terminal] a 16), hoja de barril 2 (hojas p 17 a 21) y una hélice a C-terminal. El término "dominio C-terminal de OspA" o "dominio C-terminal" o "fragmento de tipo silvestre" o "porción C-terminal" con respecto a OspA como se usa a lo largo de la presente descripción significará la secuencia de aminoácidos C-terminal de OspA, es decir, OspA que carece al menos de la hoja p N-terminal (que incluye las hojas p1 a 4). En OspA de B. burgdorferi s.s. cepa B31, la hoja N-terminal consiste en los aminoácidos 17 a 70 (después de la escisión postraduccional del péptido señal de lipidación de 16 aa de longitud).
De acuerdo con la presente invención, el fragmento OspA C-terminal puede incluir, además, una secuencia señal de lipidación en el extremo N terminal, por ejemplo, la secuencia señal de lipidación de los aminoácidos 1 a 16 de OspA (SEQ ID NO: 14) u OspB (SEQ ID NO: 15) de B. burgdorferi s.s. cepa B31, una secuencia de señal de lipidación de E. coli, denominada en la presente descripción "señal de lipidación lpp" (SEQ ID NO: 16), o cualquier otra secuencia señal, por ejemplo, como se define más abajo.
La lipidación de una proteína con una secuencia señal de lipidación N-terminal, tales como las presentes en un polipéptido de OspA naciente, se produce en el vector de expresión de E. coli por la acción gradual de las enzimas diacilgliceril transferasa, señal peptidasa II y transacilasa, respectivamente. La primera etapa es la transferencia de un diacilglicérido al grupo sulfidrilo de la cisteína de la prolipoproteína no modificada, seguido de la escisión del péptido señal por la peptidasa señal II y, finalmente, la acilación del grupo a-amino de la cisteína N-terminal de la apolipoproteína. El resultado es la colocación de un lípido y un grupo de glicerol sustituido con dos lípidos adicionales en el residuo de cisteína N-terminal del polipéptido. La secuencia señal de lipidación, que se escinde durante la lipidación, no está presente en la secuencia final del polipéptido.
De acuerdo con la presente invención, el fragmento de OspA mutante puede ser una proteína lipidada, además una lipoproteína, en donde las porciones lipídicas, junto con el grupo glicerol, también se denominan "Lip". De acuerdo con la invención, Lip comprende de uno a tres lípidos tales como alquilo C14-20 y/o alquenilo C14-20 unidos a un glicerol y la cisteína N-terminal del polipéptido de la invención, o preferentemente, en donde Lip es una porción de la fórmula (I) más abajo,
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Fórmula (I)
en la que uno de Ri , R2 o R3 es alquilo o alquenilo C14-C20, y cada uno de los otros, es independientemente alquilo C14-C20 o alquenilo C14-C20 y X es una secuencia de aminoácidos unida al residuo de cisteína que se muestra en la Fórmula (I). Con mayor preferencia, Lip más la cisteína N-terminal del polipéptido es N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoiloxi)propil cisteína (denominada en la presente descripción como "Pam3Cys") y se conecta a través del C carbonilo de la cisteína a dicha secuencia de aminoácidos de la invención. En la Fórmula (I) anterior R1 , R2 y R3 podrían ser porciones palmitoilo y X es una secuencia de aminoácidos unida al residuo de cisteína.
De acuerdo con la presente invención, y a menos que se defina lo contrario, el dominio C-terminal de una OspA de una cepa B31 distinta de B. burgdorferi s.s. se define por (i) carecer al menos de los aminoácidos 17 a 70 y/o (ii) por carecer al menos del dominio N-terminal homólogo a los aminoácidos 17 a 70 de OspA de B. burgdorferi s.s. B31. Además, el dominio C-terminal de OspA de acuerdo con la presente invención puede carecer, además, de porciones adicionales de la hoja central como lo definido por Li y colaboradores, (Li y otros, arriba), particularmente cadenas adicionales tales como las porciones de aminoácidos de los aminoácidos 17 a 82, 93, 105, 118 o 119, preferentemente, 17 a 129, con mayor preferencia 1 a 125, 1 a 129 o 1 a 130 de cualquier Borrelia, particularmente B. burgdorferi s.s. B31, o porciones homólogas de una proteína OspA de una Borrelia sp. distinta de B. burgdorferi s.s. B31.
En el contexto de la presente invención, el dominio C-terminal de OspA también se denomina "fragmento OspA" o "fragmento de OspA".
El "fragmento mutante" en el contexto del polipéptido de la presente invención y como se usa a lo largo de la presente descripción significará el fragmento C-terminal de OspA, como se definió anteriormente, que difiere del fragmento de tipo silvestre cuanto menos, por al menos dos cisteínas introducidas que pueden formar un enlace disulfuro. Sin estar vinculado a esa teoría, se supone que el enlace disulfuro estabiliza el fragmento en una conformación conducente a la inducción de la unión del anticuerpo. El plegamiento del fragmento C-terminal de OspA de tipo silvestre muestra una estabilidad reducida a la temperatura en comparación con la proteína de longitud completa (Koide y otros, Structure-based Design of a Second-generation Lyme Disease Vaccine Based on a C-terminal Fragment of Borrelia burgdorferi OspA, J. Mol. Biol. (2005) 350:290-299). Para la presente invención, la secuencia del dominio C-terminal de OspA de B. burgdorferi s.s. B31 se analizó in silico para determinar las posiciones de los enlaces disulfuro introducidos que pueden potenciar la estabilidad del plegamiento de este dominio C-terminal. Los resultados del análisis se han transferido a fragmentos de OspA homólogos de otras especies de Borrelia con el supuesto de que el plegamiento está conservado entre las especies.
Típicamente, el enlace disulfuro puede introducirse mediante la introducción de uno o más residuos de cisteína, en donde se forma un enlace disulfuro (puente S-S) entre los grupos tiol de dos residuos de cisteína. Solo se necesita introducir un residuo de cisteína si se forma un enlace disulfuro con un residuo de cisteína presente en el fragmento de tipo silvestre. La una, o preferentemente dos, cisteína(s) pueden introducirse mediante adición de aminoácidos o, preferentemente, sustitución.
El fragmento de OspA mutante puede comprender, además, mutaciones adicionales en relación con el tipo silvestre. Como se detalló anteriormente, la estructura y la superficie del dominio de OspA son conocidas en la técnica. Por consiguiente, el fragmento mutante puede comprender mutaciones adicionales, particularmente en sitios que no están en la superficie de la proteína y/o que no participan en la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, no afectan la capacidad antigénica. Estos pueden incluir una o más deleciones de aminoácidos, particularmente deleciones pequeñas (por ejemplo, hasta 10 aminoácidos), una o más adiciones de aminoácidos (particularmente en los extremos C- o N-terminal), una o más sustituciones de aminoácidos, particularmente una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Los ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, los que se enumeran más abajo:
Ala Ser Leu Ile; Val
Arg Lys Lys Arg; Gln; Asn
Asn Gln; His Met Leu; Ile
Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
Cys Ser Ser Thr
Gln Asn Thr Ser
Glu Asp Trp Tyr
His Asn; Gln Tyr Trp; Phe
Ile Leu, Val Val Ile; Leu
Las mutaciones preferidas incluyen cambios en porciones seleccionadas del fragmento, por ejemplo, en donde la secuencia con similitud de secuencia con el antígeno asociado a la función de leucocitos humanos (hLFA-1), que existe en B. burgdorferi s.s., se modifica, por ejemplo, se sustituye por una secuencia homóloga de una proteína OspA de otra Borrelia sp. La racionalidad de esta modificación es reducir el riesgo de inducir reacción cruzada inmunológica con proteínas humanas. Además, es posible la adición de una secuencia señal para la lipidación en el fragmento final o intermedio, o la adición de una proteína marcadora (por ejemplo, para identificación o purificación).
En algunas modalidades, el fragmento de OspA mutante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con el fragmento de tipo silvestre. En otra modalidad, la secuencia difiere en como máximo 10 %, como máximo 9 %, como máximo 8 %, como máximo 7 %, como máximo 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, con la máxima preferencia como máximo 1 %, debido a una adición, deleción o sustitución de la secuencia.
La identidad, como se conoce en la técnica y como se usa en la presente descripción, es la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos, como se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, identidad significa, además, el grado de relación de secuencia entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre las cadenas de tales secuencias. La identidad puede calcularse fácilmente. Si bien existen varios métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos, el término es bien conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad están codificados en programas de computadora. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG (Devereux, J. y otros, 1984), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. y otros, 1990).
En contraste con el fragmento de OspA mutante, el "fragmento de tipo silvestre" en el contexto de la presente invención se refiere a un fragmento de una OspA de origen natural de Borrelia. El fragmento de tipo silvestre se obtiene mediante deleciones N-terminal, pero no comprende deleciones internas (excepto de secuencias señal como se detalla en la presente descripción) o mutaciones. En relación con el fragmento de OspA mutante, el fragmento de tipo silvestre consiste en una parte idéntica de la OspA (longitud idéntica y la misma cepa de OspA, etcétera) y difiere solo en las mutaciones detalladas anteriormente, particularmente en la introducción de al menos un enlace disulfuro o la sustitución de una secuencia con homología humana, por ejemplo, hLFA-1 (ver anteriormente).
De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el polipéptido de la presente invención no comprende o consiste en el polipéptido OspA de longitud completa que tiene al menos un enlace disulfuro introducido.
En una modalidad de la presente invención, el fragmento de OspA mutante puede diferir del fragmento de tipo silvestre respectivo solo por la introducción de al menos un enlace disulfuro, preferentemente exactamente uno.
Un polipéptido es un polímero lineal único de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, en algunos casos, además, por enlaces disulfuro. De acuerdo con la presente invención, el polipéptido puede comprender una o más modificaciones postraduccionales; es decir, un grupo funcional bioquímico adjunto, tal como un acetato, fosfato, lípidos o hidratos de carbono unidos, preferentemente un lípido o lípidos unido a la cisteína N-terminal junto con un glicerol, con mayor preferencia de 1 a 3 porciones alquilo o alquenilo C14-C20, incluso con mayor preferencia de 1 a 3 grupos palmitoilo, con la máxima preferencia tres grupos palmitoilo (Pam3).
De acuerdo con la presente invención, el polipéptido de la presente invención comprende los fragmentos mutantes de OspA como se define en las reivindicaciones. De acuerdo con la presente invención, este no comprende (i) la hoja N-terminal como se definió anteriormente y (ii) opcionalmente una o más cadenas adicionales de la hoja central como se definió anteriormente. Sin embargo, el polipéptido puede comprender una o más secuencias funcionales tales como una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal de lipidación o una modificación postraduccional, tal como la lipidación.
En una modalidad adicional de la presente invención, el polipéptido de la presente invención consiste en (i) dos o más fragmentos mutantes de OspA, opcionalmente unidos por enlazadores, por ejemplo, como se define más abajo y (ii) opcionalmente uno o más aminoácidos heterólogos con respecto a OspA, particularmente una secuencia señal y (iii) opcionalmente una modificación postraduccional, tal como la lipidación.
El polipéptido de la presente invención tiene capacidad protectora. Como se detalla anteriormente, la introducción de un enlace disulfuro en los fragmentos mutantes de OspA aumenta la capacidad protectora del polipéptido con respecto a un polipéptido que comprende el fragmento respectivo sin el enlace o enlaces disulfuro. En algunas modalidades, la capacidad protectora se incrementa en al menos 10 %, con mayor preferencia en al menos 20 %, con mayor preferencia en al menos 30 %, con mayor preferencia en al menos 40 %, con mayor preferencia en al menos 50 %, con mayor preferencia en al menos 60 %, con mayor preferencia en al menos 70 %, con mayor preferencia en al menos 80 %, incluso con mayor preferencia en al menos 90 % con respecto a un polipéptido que comprende el fragmento respectivo sin el enlace o enlaces disulfuro.
El término capacidad protectora describe la capacidad de proteger a un sujeto contra una infección por Borrelia. Con respecto al polipéptido de la invención, la capacidad protectora se refiere a la capacidad del polipéptido para inducir una respuesta inmunitaria que protege a un sujeto contra una infección por Borrelia. La capacidad protectora puede evaluarse mediante la administración del polipéptido a un sujeto de manera que induzca una reacción inmunitaria contra el polipéptido. A partir de entonces, el sujeto puede ser retado con Borrelia. La reacción del sujeto a la infección se controla. Particularmente, puede determinarse la presencia de Borrelia en el sujeto. Por ejemplo, el polipéptido es protector si no puede detectarse Borrelia en el sujeto. La presencia de Borrelia puede determinarse mediante la detección de ácidos nucleicos específicos de Borrelia (por ejemplo, mediante PCR) o anticuerpos específicos contra Borrelia (por ejemplo, mediante ELISA o transferencia Western) o mediante la detección de la propia Borrelia (por ejemplo, mediante el cultivo de órganos o tejidos en medio de crecimiento y posteriormente se verifica la presencia de Borrelia mediante microscopía). En particular, la capacidad protectora ("pc"), informada como un porcentaje, para una dosis particular se define de la siguiente manera:
pc (%) = [(número total de sujetos evaluados - número de sujetos infectados con Borrelia) / número total de sujetos evaluados] x 100
Las diferencias en la capacidad protectora (Apc) pueden determinarse, por ejemplo, mediante la comparación de la capacidad protectora (pc) de un fragmento de OspA mutante con un enlace o enlaces disulfuro (pc [con enlace]) con respecto a la capacidad protectora de un fragmento de OspA sin un enlace o enlaces disulfuro (pc [sin enlace]). De acuerdo con la presente invención, los polipéptidos para compararse difieren solamente en la introducción de al menos un enlace disulfuro. El cambio en la capacidad protectora (Apc) por la introducción del enlace(s) disulfuro se determina de la siguiente manera:
Apc = (pc [muestra] - pc [control])
por ejemplo, Apc = (pc [con enlace] - pc [sin enlace])
Si Apc es mayor que cero (> 0), suponiendo que todos los demás parámetros (por ejemplo, la dosis y el ensayo) son los mismos, entonces la capacidad protectora de la muestra (por ejemplo, el fragmento de OspA mutante con un enlace(s) disulfuro) es mejor que la capacidad protectora del control (por ejemplo, el fragmento de OspA sin un enlace(s) disulfuro). Por el contrario, si Apc es menor que cero (<0) y suponiendo que todos los demás parámetros (por ejemplo, la dosis y el ensayo) son los mismos, entonces la capacidad protectora de la muestra (por ejemplo, el fragmento de OspA mutante con un enlace(s) disulfuro) es menor que la capacidad protectora de la comparación (por ejemplo, el fragmento de OspA sin un enlace(s) disulfuro).
Preferentemente, el polipéptido de la presente invención se evalúa por su capacidad protectora mediante un ensayo de reto in vivo en donde los ratones inmunizados con el polipéptido de la invención o con un control de placebo se retan con Borrelia introducida en los sujetos inmunizados con una aguja hipodérmica (Método de Reto con Aguja) o mediante la introducción de una garrapata como vector (Método de Reto con Garrapata).
El Método de Reto con Aguja se realiza para la cepa de Borrelia conveniente (por ejemplo, B. burgdorferi, cepa N40) mediante la introducción subcutánea de Borrelia en una dosis entre 20 y 50 veces la Dosis Infecciosa (ID)50 a ratones inmunizados con dicho primer polipéptido del primer aspecto o con un control apropiado de placebo (negativo), tal como tampón o adyuvante solo y mediante la comparación de las tasas de infección en los ratones retados. La ID50 se define como la dosis en la que se infecta el 50 % de los ratones retados. La dosis de Borrelia se mide en número de bacterias. La dosis de reto puede variar ampliamente y depende de la cepa; por lo tanto, la virulencia de la cepa primero debe evaluarse mediante experimentos de reto para la determinación de la ID50. Cuatro semanas después de la prueba del reto con aguja, se recolectan sangre y tejidos para los métodos de lectura con el propósito de determinar el estado de la infección. Estos métodos de lectura pueden ser, por ejemplo, ELISA VlsE en suero o qPCR en tejidos recolectados para la identificación de Borrelia, como se describe en la presente descripción, u otros métodos. El Método de Reto con Garrapata se realiza mediante la aplicación de al menos una ninfa de garrapata (por ejemplo, I.
ricinus) infectada con Borrelia (por ejemplo, B. afzelii, cepa IS1), a un ratón que se inmunizó con dicho primer polipéptido del primer aspecto; y b) mediante la aplicación de al menos una ninfa de garrapata infectada a un segundo ratón que se inmunizó con dicho segundo polipéptido del primer aspecto; y c) mediante la comparación de las tasas de infección en los dos ratones, generalmente seis semanas después del reto. Preferentemente, el ensayo o evaluación se realiza con un grupo de ratones por polipéptido a evaluar. Una prueba adecuada se describe, y además, se ilustra en los Ejemplos. La evaluación del estado de infección puede hacerse mediante el uso de un ELISA VlsE en suero o qPCR en tejidos recolectados, o mediante el uso de otros métodos adecuados.
En una modalidad preferida de la presente invención, los productos de la invención tales como, por ejemplo, los polipéptidos de la invención que comprenden los fragmentos mutantes de OspA con un enlace o enlaces disulfuro administrados 3 veces a un sujeto a una dosis de 30 pg, preferentemente 10 pg, preferentemente 5,0 pg, preferentemente 1,0 pg, preferentemente 0,3 pg o menos tienen una capacidad protectora de 50 % o más, preferentemente 60 % o más, con mayor preferencia 70 % o más, con mayor preferencia 80 % o más, con mayor preferencia 90 % o más, incluso con mayor preferencia 95 % o más, con la máxima preferencia 99 % o más. En una modalidad, la capacidad protectora se evalúa en un método de reto in vivo, preferentemente un Método de Reto con Garrapata, con mayor preferencia un Método de Reto con Aguja, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos. Se ha observado sorprendentemente que la inmunización con un fragmento de OspA mutante de un serotipo puede proporcionar protección cruzada contra otro serotipo diferente (Ejemplo 4, Tabla 4). En base a este hallazgo, podría anticiparse que la dosis de polipéptido de la presente invención podría reducirse aún más.
En una modalidad preferida, la diferencia en la capacidad protectora (Apc) entre los polipéptidos de la invención que comprenden los fragmentos mutantes de OspA con un enlace o enlaces disulfuro y el control placebo (negativo) es al menos 50 %, específicamente al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, incluso con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 %, con la máxima preferencia al menos 95 %, cuando se administra 3 veces a un sujeto a una dosis de 30 pg, preferentemente 10 pg, preferentemente 5,0 pg, preferentemente 1,0 pg, preferentemente 0,3 pg o menos.
En una modalidad preferida de la presente invención, el dominio C-terminal se define como un fragmento que consiste en al menos los 150 aminoácidos C-terminales de la proteína OspA. En una modalidad, el dominio C-terminal tiene una longitud de entre 140 y 152 aminoácidos. En una modalidad adicional, el dominio C-terminal consiste en no más de los últimos 152 aminoácidos de la proteína OspA, preferentemente, los últimos 151 aminoácidos, con mayor preferencia los últimos 150 aminoácidos. En una modalidad alternativa, el dominio C-terminal consiste en no menos de los últimos 140 aminoácidos de la proteína OspA, preferentemente, los últimos 141 aminoácidos, preferentemente, los últimos 142 aminoácidos, con la máxima preferencia los últimos 143 aminoácidos. Los últimos aminoácidos de la proteína OspA se definen en la presente descripción como la secuencia de aminoácidos contigua más hacia el extremo C terminal de la proteína OspA.
En otra modalidad, el dominio C-terminal de una proteína OspA de Borrelia comprende, esencialmente comprende o consiste en (i) los aminoácidos desde la posición 126, 131 o 130 hasta la posición 273 de la OspA de B. afzelii, cepa K78 o (ii) el dominio homólogo a los aminoácidos de OspA de una cepa de Borrelia distinta de B. afzelii, cepa K78.
El polipéptido de la presente invención puede comprender o comprender esencialmente o consistir en (i) dos o más de estos fragmentos mutantes, opcionalmente unidos por enlazadores, por ejemplo, como se define a continuación y (ii) opcionalmente uno o más aminoácidos heterólogos con respecto a OspA, particularmente una secuencia o sitio señal para una modificación postraduccional tal como la lipidación y (iii) opcionalmente una modificación postraduccional, tal como la lipidación.
De acuerdo con la presente invención, el polipéptido de la presente invención puede comprender o comprender esencialmente o consistir en los elementos tal como se definen en la presente descripción, particularmente los dos o más fragmentos mutantes de OspA y opcionalmente uno o más elementos adicionales tales como el dominio homólogo, un péptido enlazador, una secuencia señal o un sitio para la lipidación. "Comprender esencialmente" en este contexto significa que el (los) elemento(s) pueden tener algunos cambios menores de aminoácidos con respecto a las secuencias anteriores, tales como adiciones, sustituciones o deleciones de aminoácidos, preferentemente relacionadas a lo sumo 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de los aminoácidos de los elementos como se define en la presente descripción.
De acuerdo con la presente invención, se introduce al menos un enlace disulfuro en un fragmento de OspA. Esto puede lograrse, preferentemente, mediante la introducción en el fragmento de al menos 1 o 2 cisteína(s), particularmente 2 cisteínas, para permitir la formación del al menos un enlace disulfuro. Solo se puede introducir una cisteína, si otra cisteína en el fragmento está disponible para un enlace disulfuro. Sin embargo, preferentemente, se introducen dos cisteínas. La(s) cisteína(s) se introducen por adición o sustitución de aminoácidos, preferentemente, por sustitución. En caso de adición, la cisteína se inserta en la secuencia de aminoácidos entre dos aminoácidos, mientras que en caso de sustitución, un aminoácido se sustituye con la cisteína.
La OspA puede ser de cualquier cepa de Borrelia, particularmente de las especificadas en la presente descripción, tales como B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japónica, B. tanukii, B. turdi o B. sínica, B. bavariensis, preferentemente de B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis o B. garinii. Preferentemente, la OspA es de B. afzelii, particularmente la cepa K78, OspA de serotipo 2 (SEQ ID NO: 19); B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, OspA de serotipo 1 (SEQ ID n O: 20); B. garinii, particularmente la cepa PBr, OspA de serotipo 3 (SEQ ID NO: 21); B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, OspA de serotipo 4 (SEQ iD NO: 22); B. garinii, particularmente la cepa PHei, OspA de serotipo 5 (SEQ ID NO: 23); B. garinii, particularmente la cepa DK29, OspA de serotipo 6 (SEQ ID NO: 24) o B. garinii, particularmente la cepa T25, OspA de serotipo 7 (SEQ ID NO: 25). Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas OspA (de longitud completa) se dan más abajo.
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El enlace disulfuro puede formarse entre cisteínas que se han introducido en cualquier posición del fragmento de OspA lo que permite o sustenta el plegamiento apropiado del fragmento. Las posiciones pueden seleccionarse, como se detalla anteriormente, en función de la estructura conocida de OspA. El polipéptido puede contener al menos un enlace disulfuro entre cualquiera de las posiciones 182 /- 3 y cualquiera de las posiciones 269 /- 3 (enlace disulfuro tipo 1); cualquiera de las posiciones 182 /- 3 y cualquiera de las posiciones 272 /- 3 (enlace disulfuro tipo 2); cualquiera de las posiciones 244 /- 3 y cualquiera de las posiciones 259 /- 3 (enlace disulfuro tipo 3); cualquiera de las posiciones 141 /- 3 y cualquiera de las posiciones 241 /- 3 (enlace disulfuro tipo 4); cualquiera de las posiciones 165 /- 3 y cualquiera de las posiciones 265 /- 3 (enlace disulfuro tipo 5); cualquiera de las posiciones 185 /- 3 y cualquiera de las posiciones 272 /- 3 (enlace disulfuro tipo 6); cualquiera de las posiciones 199 /- 3 y cualquiera de las posiciones 223 /- 3 (enlace disulfuro tipo 7); cualquiera de las posiciones 243 /- 3 y cualquiera de las posiciones 262 /- 3 (enlace disulfuro tipo 8); cualquiera de las posiciones 184 /- 3 y cualquiera de las posiciones 204 /- 3 (enlace disulfuro tipo 9); cualquiera de las posiciones 201 /- 3 y cualquiera de las posiciones 214 /- 3 (enlace disulfuro tipo 10); cualquiera de las posiciones 246 /- 3 y cualquiera de las posiciones 259 /- 3 (enlace disulfuro tipo 11); y/o cualquiera de las posiciones 167 /- 3 y cualquiera de las posiciones 178 /- 3 (enlace disulfuro tipo 12) de una B. afzelii, particularmente B. afzelii K78 serotipo 2 OspA, o los aminoácidos homólogos de una OspA de una Borrelia sp. distinta de B. afzelii, tales como B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1; B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3; B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4; B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5; B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6 o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7.
El polipéptido puede contener al menos un enlace disulfuro entre cualquiera de las posiciones 182 y 269 (enlace disulfuro tipo 1); posiciones 182 y 272 (enlace disulfuro tipo 2); posiciones 244 y 259 (enlace disulfuro tipo 3); posiciones 141 y 241 (enlace disulfuro tipo 4); posiciones 165 y 265 (enlace disulfuro tipo 5); posiciones 185 y 272 (enlace disulfuro tipo 6); posiciones 199 y 223 (enlace disulfuro tipo 7); posiciones 243 y 262 (enlace disulfuro tipo 8); posiciones 184 y 204 (enlace disulfuro tipo 9); posiciones 201 y 214 (enlace disulfuro tipo 10); posiciones 246 y 259 (enlace disulfuro tipo 11); y/o las posiciones 167 y 178 (enlace disulfuro tipo 12) de una B. afzelii, particularmente B. afzelii K78 OspA de serotipo 2, o los aminoácidos homólogos de una OspA de una Borrelia distinta de B. afzelii, tal como B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1; B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3; B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4; B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5; B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6 o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7.
Tabla A-4. Tipos de enlace disulfuro con nomenclatura y la posición de las sustituciones de cisteína en la proteína OspA de serotipo 2.
Figure imgf000016_0001
Incluso, los más preferidos son los enlaces disulfuro de tipos 1 a 5, específicamente los enlaces disulfuros de tipos 1 a 4.
Se observa que:
La posición 182 /- 3 es una abreviatura para la posición 179, 180, 181, 182, 183, 184 o 185, preferentemente 182. La posición 269 /- 3 es una abreviatura para la posición 266, 267, 268, 269, 270, 271 o 272, preferentemente 269. La posición 272 /- 3 es una abreviatura para la posición 269, 270, 271,272, 273, 274 o 275, preferentemente 272.
La posición 244 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 241, 242, 243, 244, 245, 246 o 247, preferentemente 244 La posición 259 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 256, 257, 258, 259, 260, 261 o 262, preferentemente 259 La posición 141 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 138, 139, 140, 141, 142, 143 o 144, preferentemente 141 La posición 241 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 238, 239, 240, 241, 242, 243 o 244, preferentemente 241 La posición 165 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 162, 163, 164, 165, 166, 167 o 168, preferentemente 165 La posición 265 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 262, 263, 264, 265, 266, 267 o 268, preferentemente 265 La posición 185 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 182, 183, 184, 185, 186, 187 o 188, preferentemente 185 La posición 199 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 196, 197, 198, 199, 200, 201 o 202, preferentemente 199 La posición 223 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 220, 221, 222, 223, 224, 225 o 226, preferentemente 223 La posición 243 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 240, 241, 242, 243, 244, 245 o 246, preferentemente 143 La posición 262 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 259, 260, 261, 262, 263, 264 o 265, preferentemente 262 La posición 184 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 181, 182, 183, 184, 185, 186 o 187, preferentemente 184 La posición 204 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 201, 202, 203, 204, 205, 206 o 207, preferentemente 204 La posición 201 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 198, 199, 200, 201, 202, 203 o 204, preferentemente 201 La posición 214 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 211, 212, 213, 214, 215, 216 o 217, preferentemente 214 La posición 246 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 243, 244, 245, 246, 247, 248 o 249, preferentemente 246 La posición 167 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 164, 165, 166, 167, 168, 169 o 170, preferentemente 167 La posición 178 /- 3 es una abreviatu ra para la posición 175, 176, 177, 178, 179, 180 o 181, preferentemente 178
Se describen fragmentos imitantes derivados de los aminoácidos de la posición 126, 130 o 131 hasta la posición 273 de la secuencia de tipo silvestre de OspA de serotipo 2 de B. afzelii cepa K78, (SEQ ID NO: 18) y difiere solo por la introducción de al menos un enlace disulfuro, particularmente en donde el al menos un enlace disulfuro está entre las posiciones 182 y 269 (enlace disulfuro tipo 1); posiciones 182 y 272 (enlace disulfuro tipo 2); posiciones 244 y 259 (enlace disulfuro tipo 3); posiciones 141 y 241 (enlace disulfuro tipo 4); posiciones 165 y 265 (enlace disulfuro tipo 5); posiciones 185 y 272 (enlace disulfuro tipo 6); posiciones 199 y 223 (enlace disulfuro tipo 7); posiciones 243 y 262 (enlace disulfuro tipo 8); posiciones 184 y 204 (enlace disulfuro tipo 9); posiciones 201 y 214 (enlace disulfuro tipo 10); posiciones 246 y 259 (enlace disulfuro tipo 11); y/o posiciones 167 y 178 (enlace disulfuro tipo 12), o los fragmentos y posiciones homólogas de una OspA de una Borrelia sp. distinta de B. afzelii, tal como B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1; B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3; B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4; B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5; B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6 o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7.
Los fragmentos mutantes pueden tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178 y una secuencia de aminoácidos que tiene 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con al menos una de las secuencias con las SEQ ID NOs: 2 a 13, en donde las cisteínas no se sustituyen. Detalles adicionales sobre mutaciones e identidad de secuencia se dieron anteriormente.
Como se detalló anteriormente, el polipéptido de la presente invención puede comprender secuencias señal. Se ha demostrado que la lipidación confiere propiedades adyuvantes en OspA. Por consiguiente, se prefieren las formas lipidadas del polipéptido de la invención o los polipéptidos que comprenden una señal de lipidación. En una modalidad preferida, el polipéptido de la presente invención comprende una señal de lipidación, preferentemente una señal de lipidación de una proteína de la superficie externa de Borrelia, OspA u OspB (SEQ ID NOs: 14 y 15, respectivamente) o con mayor preferencia una secuencia señal de lipidación lpp de E. coli (SEQ ID NO: 16). El fragmento de OspA de la invención que comprende una señal de lipidación es lipidado durante el procesamiento y el péptido señal de lipidación se escinde. Por lo tanto, el péptido señal ya no está presente en la proteína lipidada madura.
Las proteínas lipidadas de acuerdo con la presente invención están marcadas con "Lip" en el extremo N terminal para indicar la adición de 3 grupos de ácidos grasos y un glicerol al polipéptido (ver Figura 4). Las señales de lipidación adecuadas como las descritas anteriormente incluyen MKKYLLGIGLILALIA (SEQ ID n O: 14), MRLLIGFALALALIG (SEQ ID NO: 15) y MKATKLVLGAVILGSTLLAG (SEQ ID NO: 16). Debido a que las porciones lipídicas y un glicerol están unidos al residuo de cisteína N-terminal que está presente en la proteína OspA de tipo silvestre de longitud completa, los fragmentos C-terminales de OspA para la lipidación pueden comprender adicionalmente un péptido que comprende un residuo de cisteína seguido de aminoácidos adicionales, denominado en la presente descripción como "Péptido de Lipidación" o "LP" (ver las Figuras 1 y 2). Por ejemplo, las secuencias tales como CSS o CKQn (SEQ ID NO: 211) inmediatamente C-terminal con respecto a la secuencia señal de lipidación proporcionan un residuo de cisteína N-terminal para la lipidación tras la escisión del péptido de señal de lipidación. Los péptidos que contienen cisteína lipidada están presentes en el polipéptido lipidado final de la invención.
Se ha encontrado que la proteína OspA de B. burgdorferi s.s. comprende una secuencia con la capacidad de unirse a un receptor de células T que también tiene la capacidad de unirse al antígeno asociado a la función leucocitaria humana (hLFA-1) (además referido en la presente descripción como "secuencia similar a hLFA-1"). La similitud de esta región de OspA con hLFA-1 puede resultar en una respuesta inmunitaria con reactividad cruzada tras la administración de OspA de B. burgdorferi s.s. a un sujeto humano y puede inducir enfermedades autoinmunitarias, particularmente artritis autoinmunitaria, en individuos susceptibles. Por consiguiente, en una modalidad preferida, el polipéptido de la presente invención no comprende una secuencia con capacidad de unión al receptor de células T que tiene una capacidad de unión al antígeno asociado a la función leucocitaria humana (hLFA-1), y particularmente no comprenden la secuencia de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17). Para este fin, la secuencia similar a hLFA-1, particularmente la secuencia de aminoácidos GYVLEGTLTAE (SEQ ID NO: 17), puede sustituirse con una secuencia homóloga de una proteína OspA de otra Borrelia sp., particularmente con NFTLEGKVAND (SEQ ID NO: 18).
El polipéptido que comprende al menos un enlace disulfuro establece esencialmente la misma capacidad protectora con dicho polipéptido contra una infección por Borrelia en relación con al menos una de las proteínas OspA de tipo silvestre de longitud completa derivadas de al menos una cepa de Borrelia, particularmente B. afzelii K78, OspA de serotipo 2 (SEQ ID NO: 19); B. burgdorferi s.s., particularmente la cepa B31, serotipo 1 (SEQ ID NO: 20); B. garinii, particularmente la cepa PBr, serotipo 3 (SEQ ID NO: 21); B. bavariensis, particularmente la cepa PBi, serotipo 4 (SEQ ID NO: 22); B. garinii, particularmente la cepa PHei, serotipo 5 (SEQ ID NO: 23); B. garinii, particularmente la cepa DK29, serotipo 6 (SEQ ID NO: 24) o B. garinii, particularmente la cepa T25, serotipo 7 (SEQ ID NO: 25).
Para proporcionar protección cruzada contra diferentes especies de Borrelia o serotipos de OspA, es conveniente el desarrollo de una vacuna multivalente. Como se detalló anteriormente, el polipéptido del primer aspecto comprende al menos dos fragmentos mutantes de dos serotipos de Borrelia diferentes como se definió anteriormente. Además, se describen polipéptidos que comprenden al menos dos fragmentos mutantes de OspA que se seleccionan del grupo que consiste en
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 2
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 3
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 4
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 5
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 6
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 7
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 8
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 9
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 1 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 3
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 4
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 5
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 6
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 7
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 8
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 9
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 2 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 4
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 5
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 6
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 7
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 8
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 9
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 3 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro tipo 5
- fragmento con enlace disulfuro tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro tipo 6
- fragmento con enlace disulfuro tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro tipo 7
- fragmento con enlace disulfuro tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro tipo 8
- fragmento con enlace disulfuro tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro tipo 9
- fragmento con enlace disulfuro tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 4 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro tipo 6
- fragmento con enlace disulfuro tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro tipo 7
- fragmento con enlace disulfuro tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro tipo 8
- fragmento con enlace disulfuro tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro tipo 9
- fragmento con enlace disulfuro tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 5 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro tipo 7;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro tipo 8;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro tipo 9;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 6 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro tipo 8;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro tipo 9;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 7 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 8 y fragmento con enlace disulfuro tipo 9;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 8 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 8 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 8 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 9 y fragmento con enlace disulfuro tipo 10
- fragmento con enlace disulfuro tipo 9 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 9 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12
- fragmento con enlace disulfuro tipo 10 y fragmento con enlace disulfuro tipo 11;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 10 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12;
- fragmento con enlace disulfuro tipo 11 y fragmento con enlace disulfuro tipo 12;
- y
particularmente en donde
- el fragmento con enlace disulfuro tipo 1 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con el enlace disulfuro tipo 2 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con el enlace disulfuro tipo 3 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con enlace disulfuro tipo 4 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con el enlace disulfuro tipo 5 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con enlace disulfuro tipo 6 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con el enlace disulfuro tipo 7 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con el enlace disulfuro tipo 8 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con el enlace disulfuro tipo 9 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85%, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con enlace disulfuro tipo 10 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 11, en donde las cisteínas no se sustituyen;
- el fragmento con el enlace disulfuro tipo 11 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12, en donde las cisteínas no se sustituyen; y/o
- el fragmento con el enlace disulfuro tipo 12 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 %, con mayor preferencia 85 %, con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 13, en donde las cisteínas no se sustituyen.
Por favor, note que más detalles sobre mutaciones e identidad de secuencia se dieron anteriormente.
Tabla A-5. Nomenclatura y SEQ ID NO. de heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA, no lipidada y lipidada, descritos en la presente invención.
Figure imgf000020_0001
El polipéptido de acuerdo con el primer aspecto puede comprender al menos dos o tres fragmentos mutantes que están conectados a través de uno o más enlazadores. Un enlazador es una secuencia de aminoácidos bastante corta empleada para conectar dos fragmentos. Debe diseñarse para evitar cualquier impacto negativo en los fragmentos, su interacción en los sujetos a tratar o vacunar o sobre su capacidad protectora. Se prefieren enlazadores cortos de como máximo 21 aminoácidos, particularmente como máximo 15 aminoácidos, específicamente como máximo 12 u 8 aminoácidos. Con mayor preferencia, el uno o más enlazadores están compuestos por aminoácidos pequeños para reducir o minimizar las interacciones con los fragmentos, tales como glicina, serina y alanina. Los ejemplos o enlazadores preferidos incluyen enlazadores que comprenden o consisten en poliG, tales como (G)8 (SEQ ID NO: 36) (G)12 (SEQ ID NO: 37), GAGA (SEQ ID NO: 38), (GAGA)2 (SEQ ID NO: 39), (GAGA)3 (SEQ ID NO: 40), (GGGS)2 (s Eq ID NO: 41), o (Gg GS)3 (Se Q ID NO: 42). Un enlazador más preferido es el enlazador peptídico "LN1", una fusión de dos regiones de bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA de B. burgdorferi s.s., cepa B31 (aa 65-74 y aa 42-53, con un intercambio de aminoácido en la posición 53 de D53S) que tiene la siguiente secuencia: GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (SEQ ID NO: 184).
En otra modalidad preferida, el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto comprende un polipéptido con un tamaño total de como máximo 500 aminoácidos, que comprende dos o tres fragmentos mutantes diferentes como se define en el primer aspecto; o un polipéptido que consiste esencialmente en dos o tres fragmentos mutantes diferentes, uno o dos enlazadores y, opcionalmente, una cisteína N-terminal; y/o un polipéptido que consiste esencialmente en dos o tres fragmentos mutantes diferentes, una extensión N-terminal del fragmento que consiste como máximo en 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 u 11 aminoácidos, preferentemente, como máximo 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos, aún con mayor preferencia como máximo 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos, en donde la extensión N-terminal se ubica directamente N-terminalmente del fragmento en la OspA de Borrelia respectiva y, opcionalmente, una cisteína N-terminal. La cisteína N-terminal puede estar seguida opcionalmente por un enlazador peptídico corto de 1-10 aminoácidos de longitud, y preferentemente toma la forma de un péptido CSS N-terminal o péptido CKQN (SEQ ID NO: 211).
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto.
La invención proporciona, además, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Para los fines de la invención, el término "ácido(s) nucleico(s)" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado que incluye regiones/formas monocatenarias y bicatenarias.
El término "ácido nucleico que codifica un polipéptido" como se usa en la presente descripción abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un péptido o polipéptido de la invención. El término abarca, además, polinucleótidos que incluyen una única región continua o regiones discontinuas que codifican el péptido o polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por un fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada o debido a la edición de ARN o reorganización del ADN genómico) junto con regiones adicionales, que además pueden contener secuencias codificantes y/o no codificantes.
Los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en la presente descripción. Algunos de estos polinucleótidos tienen una similitud mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo (es decir, de origen natural). No obstante, la presente invención contempla específicamente polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones humanos y/o primates y/o E. coli.
Las secuencias que codifican un polipéptido deseado pueden sintetizarse, en su totalidad o en parte, mediante el uso de métodos químicos bien conocidos en la técnica (ver Caruthers, M. H. y otros, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 215­ 223 (1980), Horn y otros, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225-232 (1980)). Alternativamente, la propia proteína puede producirse mediante el uso de métodos químicos para sintetizar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, o una porción de este. Por ejemplo, la síntesis de péptidos puede realizarse mediante el uso de diversas técnicas de fase sólida (Roberge y otros, Science 269:202-204 (1995)) y puede lograrse una síntesis automatizada, por ejemplo, mediante el uso del sintetizador de péptidos ASI 431 A (Perkin Elmer, Palo Alto, California).
Además, las secuencias de polinucleótidos de la presente invención pueden manipularse mediante el uso de métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican polipéptidos por una diversidad de razones, que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico. Por ejemplo, la combinación aleatoria de ADN mediante fragmentación aleatoria y la reagrupación por PCR de fragmentos de genes y oligonucleótidos sintéticos pueden usarse para diseñar las secuencias de nucleótidos. Además, la mutagénesis dirigida a un sitio puede usarse para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes de empalme, o introducir mutaciones, y así sucesivamente.
En un aspecto adicional de la invención, la presente invención se refiere a un vector que comprende un ácido nucleico de la invención unido a un promotor inducible de manera que cuando se induce el promotor se expresa un polipéptido codificado por el ácido nucleico. En una modalidad preferida, el vector es pET28b(+).
Otro aspecto de la invención comprende dicho vector en donde el promotor inducible se activa mediante la adición de una cantidad suficiente de IPTG (isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido), preferentemente, al medio de crecimiento.
Opcionalmente, esto es a una concentración de entre 0,1 y 10 mM, 0,1 y 5 mM, 0,1 y 2,5 mM, 0,2 y 10 mM, 0,2 y 5 mM, 0,2 y 2,5 mM, 0,4 y 10 mM, 1 y 10 mM, 1 y 5 mM, 2,5 y 10 mM, 2,5 y 5 mM, 5 y 10 mM. Alternativamente, el promotor puede ser inducido por un cambio de temperatura o pH.
La molécula de ácido nucleico como se usa en la presente descripción generalmente se refiere a cualquier molécula de ácido ribonucleico o molécula de ácido desoxirribonucleico, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por lo tanto, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico como se usa en la presente descripción se refiere al menos a ADN monocatenario y bicatenario, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Como se usa en la presente descripción, el término molécula de ácido nucleico incluye moléculas de ADN o ARN como se describió anteriormente que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, las moléculas de ADN o ARN con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otras razones son "moléculas de ácido nucleico" como el término que se destina en la presente descripción. Además, las especies de ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiladas, por nombrar solo dos ejemplos, son también moléculas de ácido nucleico como se define en la presente descripción. Se apreciará que se han realizado una gran diversidad de modificaciones en las moléculas de ADN y ARN que sirven para muchos propósitos útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término molécula de ácido nucleico como se usa en la presente descripción abarca tales formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de moléculas de ácido nucleico, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, que incluye células simples y complejas, entre otras. El término molécula de ácido nucleico abarca, además, moléculas cortas de ácido nucleico a menudo denominadas oligonucleótidos. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente en la presente descripción.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse químicamente. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden aislarse de Borrelia y modificarse mediante los métodos conocidos por un experto en la técnica. Lo mismo se aplica a los polipéptidos de acuerdo con la presente invención.
Además, el ácido nucleico de la presente invención puede unirse funcionalmente, mediante el uso de técnicas estándar tales como la clonación, a cualquier secuencia deseada, ya sea una secuencia reguladora de Borrelia o una secuencia reguladora heteróloga, secuencia líder heteróloga, secuencia marcadora heteróloga o una secuencia de codificación heteróloga para crear un gen de fusión.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tales como ARNm o ARNc, o en forma de ADN, que incluye, por ejemplo, ADNc y ADN genómico que se obtiene por clonación o se produce por técnicas de síntesis química o por una combinación de estos. El ADN puede ser de triple cadena, de doble cadena o de cadena sencilla. El ADN monocatenario puede ser la cadena codificante, también conocida como la cadena sentido, o puede ser la cadena no codificante, también conocida como la cadena antisentido. El ácido nucleico de la presente invención puede estar comprendido en un vector o en una célula. El vector puede comprender el ácido nucleico mencionado anteriormente de tal manera que el vector sea replicable y pueda expresar la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos en una célula huésped.
Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células huésped pueden modificarse genéticamente para incorporar sistemas de expresión o porciones de estos, o el ácido nucleico de la invención. La introducción de un ácido nucleico en la célula huésped puede realizarse mediante los métodos descritos en muchos manuales de laboratorio estándar tales como Davis, y otros, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook, y otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2da Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tales como transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, conjugación, transducción, carga de raspado, introducción balística e infección.
Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas gram negativas, tales como células de E. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Cyanobacteria, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Yersinia. En una modalidad, la célula huésped es una célula de Escherichia coli. En una modalidad preferida, la célula huésped es una célula E. coli BL21 (DE3) o una célula E. coli BL21 Star™ (DE3).
Alternativamente, además pueden usarse células bacterianas gram positivas. Puede usarse una gran diversidad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. En una modalidad, el vector se deriva de plásmidos bacterianos. Generalmente, cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o expresar un polipéptido en un huésped puede usarse para la expresión a este respecto. La secuencia de a Dn apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las establecidas en Sambrook y otros, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (arriba).
En una modalidad de la presente invención, las células crecen bajo presión selectiva, tal como en presencia de antibióticos, preferentemente kanamicina. En otra modalidad, las células se cultivan en ausencia de antibióticos.
Puede usarse una gran diversidad de vectores de expresión para expresar los polipéptidos de acuerdo con la presente invención. Generalmente, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar ácidos nucleicos para expresar un polipéptido en un huésped puede usarse para la expresión a este respecto. De acuerdo con este aspecto de la invención, el vector puede ser, por ejemplo, un vector plasmídico, un vector de fago monocatenario o bicatenario o un vector viral de ARN o ADN monocatenario o bicatenario. Los plásmidos iniciales descritos en la presente descripción están disponibles comercialmente, disponibles públicamente, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles mediante la aplicación rutinaria de procedimientos publicados y bien conocidos. En determinados aspectos, entre los vectores preferidos están aquellos para la expresión de moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos de acuerdo con la presente invención. Las construcciones de ácido nucleico en las células huésped pueden usarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden producirse sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales.
Además, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende este vector. Los ejemplos representativos de células huésped apropiadas incluyen bacterias, tales como estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; hongos, tales como levadura y Aspergillus; células de insectos tales como células Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de mamífero tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 o células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Los sistemas de traducción libre de células pueden emplearse, además, para producir tales proteínas mediante el uso de ARN derivado de la construcción de ADN de la presente invención.
Para expresar la secuencia de aminoácidos deseada prácticamente mediante la introducción del vector de acuerdo con la presente invención en una célula huésped, el vector puede contener, además de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, otras secuencias para controlar la expresión (por ejemplo, secuencias promotoras, secuencias terminadoras y secuencias potenciadoras) y marcadores genéticos para la selección de los microorganismos, células de insectos, células animales de cultivo, o similares (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina y genes de resistencia a kanamicina). Además, el vector puede contener la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en una forma repetida (por ejemplo, en tándem). El vector puede construirse en base a procedimientos y métodos que se usan convencionalmente en el campo de la ingeniería genética.
Las células huésped pueden cultivarse en un medio apropiado, y la proteína de acuerdo con la presente invención puede obtenerse del producto de cultivo. La proteína de acuerdo con la presente invención puede recuperarse del medio de cultivo y purificarse de la manera convencional.
El problema subyacente a la presente invención se resuelve, además, mediante un método para producir un polipéptido como se definió anteriormente, caracterizado por las siguientes etapas:
a) introducir un vector que codifica el polipéptido en una célula huésped,
b) hacer crecer la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido,
c) Homogeneizar dicha célula huésped, y
d) someter el homogeneizado de la célula huésped a etapas de purificación.
Alternativamente, el polipéptido como se definió anteriormente puede producirse mediante un método caracterizado por las siguientes etapas:
a) introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector,
b) introducir dicho vector en una célula huésped,
c) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión del polipéptido,
d) homogeneizar dicha célula huésped,
e) enriquecer el polipéptido en la fase lipídica por separación de fases, y
f) purificar posteriormente sobre una columna de filtración en gel.
Además, se describe un método para producir un polipéptido como se definió anteriormente, caracterizado por las siguientes etapas:
a) introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector,
b) introducir dicho vector en una célula huésped,
c) cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión del polipéptido,
d) homogeneizar dicha célula huésped,
e) enriquecer el polipéptido en la fase lipídica por separación de fases,
f) purificar sobre una columna de filtración en gel, y
g) opcionalmente, procesar adicionalmente sobre una columna de intercambio de tampón.
Un anticuerpo, o al menos una parte eficaz de este, que se une específicamente a al menos una parte selectiva de un polipéptido, como se define anteriormente, se describe en la presente descripción.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal.
La parte eficaz puede comprender un fragmento Fab, un fragmento F(ab), un fragmento F(ab)N, un fragmento F(ab)2 o un fragmento Fv.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado.
Los anticuerpos pueden unirse específicamente a la porción del fragmento OspA mutante de los polipéptidos de la invención, pero no a los polipéptidos del fragmento OspA de tipo silvestre correspondientes. El anticuerpo puede unirse específicamente al enlace disulfuro del fragmento OspA mutante.
El término "especificidad" se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que puede unirse una molécula de unión a antígeno particular o una proteína de unión a antígeno (tal como un Nanocuerpo o un polipéptido de la invención). La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse en base a la afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (Kd), es una medida de la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: en cuanto menor sea el valor de Kd, mayor será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión a antígeno (alternativamente, la afinidad puede expresarse, además, como la constante de afinidad (Ka ), que es 1/Kd).
Como quedará claro para el experto (por ejemplo, sobre la base de la descripción adicional en la presente descripción), la afinidad puede determinarse de una manera conocida per se, en dependencia del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión a antígeno (tal como un anticuerpo de la invención o una parte eficaz de este) y el antígeno pertinente. La avidez se relaciona tanto con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión al antígeno en la molécula de unión al antígeno y el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión al antígeno. Típicamente, las proteínas de unión a antígeno (tales como un anticuerpo de la invención o una parte eficaz de este) se unirán a su antígeno con una constante de disociación (Kd) de 10-5 a 10-12 moles/litro o menor, y preferentemente 10-7 a 10-12 moles/litro o menor y con mayor preferencia 10-8 a 10-12 moles/litro (es decir, con una constante de asociación (Ka) de 105 a 1012 litro/mol o más, y preferentemente 107 a 1012 litro/mol o más y con mayor preferencia 108 a 1012 litro/mol). Cualquier valor de Kd mayor que 104 mol/litro (o cualquier valor de Ka menor que 104 M-1) litros/mol generalmente se considera que indica una unión no específica. Preferentemente, una secuencia de inmunoglobulina monovalente de la invención se unirá al antígeno deseado con una afinidad menor que 500 nM, preferentemente menor que 200 nM, con mayor preferencia menor que 10 nM, tal como menor que 500 pM. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida per se, que incluye, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición en sándwich, y diferentes variantes de estos conocidas per se en la técnica, así como también las otras técnicas mencionadas en la presente descripción.
La constante de disociación puede ser la constante de disociación real o aparente, como quedará claro para el experto. Los métodos para determinar la constante de disociación serán claros para el experto y, por ejemplo, incluyen las técnicas mencionadas en la presente descripción. A este respecto, quedará claro, además, que no puede ser posible medir constantes de disociación de más de 10-4 moles/litro o 10-3 moles/litro (por ejemplo, de 10-2 moles/litro). Opcionalmente, como también quedará claro para el experto, la constante de disociación (real o aparente) puede calcularse sobre la base de la constante de asociación (real o aparente) (Ka), mediante la relación [Kd = 1/Ka].
La afinidad denota la fuerza o estabilidad de una interacción molecular. La afinidad se da comúnmente como la Kd, o constante de disociación, que tiene unidades de mol/litro (o M). La afinidad puede expresarse, además, como una constante de asociación, Ka, que equivale a 1/Kd y tiene unidades de (mol/litro) (o M-1). En la presente descripción, la estabilidad de la interacción entre dos moléculas (tales como una secuencia de aminoácidos, Nanocuerpo o polipéptido de la invención y su diana prevista) se expresará principalmente en términos del valor de Kd de su interacción; para el experto en la técnica es claro que, en vista de la relación Ka = 1/Kd, especificar la fuerza de la interacción molecular por su valor de Kd puede usarse, además, para calcular el valor de Ka correspondiente. El valor de Kd caracteriza la fuerza de una interacción molecular también en un sentido termodinámico, ya que se relaciona con la energía libre (DG) de unión por la bien conocida relación DG = RT.ln(KD) (equivalentemente DG = -RT.ln(KA)), donde R es igual a la constante del gas, T es igual a la temperatura absoluta e ln es el logaritmo natural.
La Kd para las interacciones biológicas que se consideran significativas (por ejemplo, específicas) están típicamente en el intervalo de 10-10 M (0,1 nM) a 10-5 M (10000 nM). Cuanto más fuerte es una interacción, menor es su Kd.
La Kd del anticuerpo puede estar entre 10-12 M y 10-5 M, preferentemente menos de 10-6, preferentemente menos de 10-7, preferentemente menos de 10-8 M, preferentemente menos de 10-9 M, con mayor preferencia menos de 10-10 M, incluso con mayor preferencia menos de 10-11 M, con la máxima preferencia menos de 10-12M.
La Kd puede expresarse, además, como la relación de la constante de tasa de disociación de un complejo, denotada como koff, a la tasa de su asociación, denotada kon (de manera que Kd = koff/kon y Ka = kon/koff). La tasa de disociación koff tiene unidades s-1 (donde s es la notación de la unidad del SI para el segundo). La tasa de asociación kon tiene unidades M-1 s-1. La tasa de asociación puede variar entre 102 M-1 s-1 a aproximadamente 107 M-1s-1, acercándose a la constante de la tasa de asociación limitada por difusión para las interacciones bimoleculares. La tasa de disociación se relaciona con la vida media de una interacción molecular dada por la relación t1/2 = ln(2)/koff. La tasa de disociación puede variar entre 10-6 s-1 (complejo casi irreversible con t1/2 de múltiples días) a 1 s-1 (t1/2 = 0,69 s).
La afinidad de una interacción molecular entre dos moléculas puede medirse a través de diferentes técnicas conocidas per se, tales como la bien conocida técnica de biosensores de resonancia de plasmón superficial (SPR) (ver, por ejemplo, Ober y otros, Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001) donde una molécula se inmoviliza en el chip biosensor y la otra molécula se pasa sobre la molécula inmovilizada en condiciones de flujo que producen mediciones de kon, koff y, por lo tanto, valores de Kd (o Ka). Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante el uso de los bien conocidos instrumentos BIACORE.
Además, será claro para el experto que la medida de Kd puede corresponder a la Kd aparente si el proceso de medición de alguna manera influye en la afinidad de unión intrínseca de las moléculas implicadas, por ejemplo, por los artefactos relacionados con el recubrimiento sobre el biosensor de una molécula. Además, una Kd aparente puede medirse si una molécula contiene más de un sitio de reconocimiento para la otra molécula. En tal situación, la afinidad medida puede verse afectada por la avidez de la interacción por las dos moléculas.
Otro enfoque que puede usarse para evaluar la afinidad es el procedimiento ELISA (Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas) de 2 etapas de Friguet y otros, (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985). Este método establece una medición del equilibrio de unión de la fase de solución y evita posibles artefactos relacionados con la adsorción de una de las moléculas en un soporte tal como el plástico.
Sin embargo, la medición precisa de Kd puede ser bastante laboriosa; por lo tanto, los valores de Kd aparentes se determinan a menudo con el fin de evaluar la fuerza de unión de dos moléculas. Debe señalarse que, mientras todas las mediciones se realizan de una manera coherente (por ejemplo, con el mantenimiento de las condiciones de ensayo sin cambios), las mediciones aparentes de Kd pueden usarse como una aproximación de la verdadera Kd y por lo tanto en la presente descripción Kd y Kd aparente deben tratarse con igual importancia o relevancia.
Finalmente, debe notarse que en muchas situaciones el científico experimentado puede juzgar que es conveniente determinar la afinidad de unión en relación con alguna molécula de referencia. Por ejemplo, para evaluar la fuerza de unión entre las moléculas A y B, puede usarse, por ejemplo, una molécula de referencia C que se conoce que se une a B y que está marcada adecuadamente con un grupo fluoróforo o cromóforo u otra porción química, tal como la biotina, para facilitar la detección en un ELISA o citometría de flujo u otro formato (el fluoróforo para la detección de fluorescencia, el cromóforo para la detección de absorción de luz, la biotina para la detección de ELISA mediada por estreptavidina). Típicamente, la molécula de referencia C se mantiene a una concentración fija y la concentración de A varía para una concentración o cantidad dada de B. Como resultado, se obtiene un valor de Concentración inhibitoria (IC)50 correspondiente a la concentración de A, a la cual la señal medida para C en ausencia de A se reduce a la mitad. Siempre que se conozca KDref, la Kd de la molécula de referencia, así como también la concentración total cref de la molécula de referencia, la Kd aparente para la interacción A-B puede obtenerse de la siguiente fórmula: Kd = IC50/(1 cref/KDref). Tenga en cuenta que si cref << KDref, KD “ IC50. Siempre que la medición de la IC50 se realice de manera consistente (por ejemplo, manteniendo cref fijo) para los ligandos que se comparan, la IC50 puede evaluar la fuerza o la estabilidad de una interacción molecular y esta medición se considera equivalente a la Kd o a la Kd aparente a lo largo de este texto.
Además, se describe una línea celular de hibridoma, que produce un anticuerpo como se definió anteriormente.
El anticuerpo como se definió anteriormente puede producirse mediante un método caracterizado por las siguientes etapas:
a) iniciar una respuesta inmunitaria en un animal no humano mediante la administración de un polipéptido como se definió anteriormente a dicho animal,
b) eliminar un anticuerpo que contiene fluido corporal de dicho animal, y
c) producir el anticuerpo sometiendo dicho anticuerpo que contiene fluido corporal a etapas de purificación adicionales.
O mediante el seguimiento de las siguientes etapas:
a) iniciar una respuesta inmunitaria en un animal no humano mediante la administración de un polipéptido como se definió anteriormente a dicho animal,
b) eliminar el bazo o las células del bazo de dicho animal,
c) producir células de hibridoma de dicho bazo o células de bazo,
d) seleccionar y clonar células de hibridoma específicas para dicho polipéptido,
e) producir el anticuerpo mediante el cultivo de dichas células de hibridoma clonadas, y
f) opcionalmente, realizar más etapas de purificación.
Además, se describe una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se especificó anteriormente.
La descripción describe un anticuerpo como se definió anteriormente o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se definió anteriormente para el tratamiento o prevención de una infección con especies de Borrelia, con mayor preferencia especies de Borrelia patógenas como se describe en la presente descripción, con mayor preferencia que comprende B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii.
El problema subyacente a la presente invención se resuelve en otro aspecto mediante el uso de un anticuerpo como se definió anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir infecciones con especies de Borrelia, con mayor preferencia especies de Borrelia patógenas como se describió en la presente descripción, con mayor preferencia que comprende B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto y/o el ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto. La composición farmacéutica puede contener opcionalmente cualquier vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente, como sustancias tampón, estabilizadores u otros ingredientes activos, específicamente ingredientes conocidos en relación con composiciones farmacéuticas y/o producción de vacunas. Preferentemente, la composición farmacéutica se usa como un medicamento, particularmente como una vacuna o para prevenir o tratar una infección causada por especies de Borrelia, con mayor preferencia especies de Borrelia patógenas como se describió en la presente descripción, con mayor preferencia que comprende B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. bavariensis y B. garinii, y/u otros patógenos contra los cuales los antígenos se incluyeron en la vacuna.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende, además, un adyuvante. La elección de un adyuvante adecuado para mezclar con toxinas bacterianas o conjugados preparados mediante el uso de los procesos de la invención está dentro del conocimiento de la persona experta en la técnica. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, pero también pueden ser otras sales metálicas tales como las de calcio, magnesio, hierro o zinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, sacáridos derivados catiónica o aniónicamente o polifosfacenos. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica está adyuvada con hidróxido de aluminio.
En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende, además, una sustancia inmunoestimuladora, preferentemente, seleccionada del grupo que consiste en polímeros policatiónicos, específicamente péptidos policatiónicos, oligodesoxinucleótidos inmunoestimuladores (o Dn ), específicamente oligo(dIdC)13 (SEQ ID NO: 32), péptidos que contienen al menos dos motivos Lys-LeuLys, específicamente el péptido KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 33), compuestos neuroactivos, específicamente la hormona de crecimiento humano, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, adyuvantes completos o incompletos de Freund, o combinaciones de estos. Preferentemente, la sustancia inmunoestimuladora es una combinación de cualquiera de un polímero policatiónico y desoxinucleótidos inmunoestimuladores o de un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys y desoxinucleótidos inmunoestimuladores, preferentemente, una combinación de KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 33) y oligo(dIdC)13 (SEQ ID NO: 32). Con mayor preferencia, dicho péptido policatiónico es poliarginina.
En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende fosfato de sodio, cloruro de sodio, L-metionina, sacarosa y Tween-20 a un pH de 6,7 /- 0,2. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende, además, hidróxido de aluminio, preferentemente, a una concentración de 0,15 %.
En una modalidad, la formulación comprende fosfato de sodio entre 5 mM y 50 mM, cloruro de sodio entre 100 y 200 mM, L-Metionina entre 5 mM y 25 mM, sacarosa entre 2,5 % y 10 %, Tween 20 entre 0,01 % y 0,1 % e hidróxido de aluminio entre 0,1 % y 0,2 % (p/v). Con mayor preferencia, la formulación comprende fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, L-metionina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween 20 al 0,05 % e hidróxido de aluminio al 0,15 % (p/v) a pH 6,7 ± 0,2. Incluso con mayor preferencia, la formulación comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres heterodímeros de OspA mutantes (uno de los cuales es el polipéptido de acuerdo con la invención).
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende 3 heterodímeros (uno de los cuales es el polipéptido de la invención), preferentemente Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 186), Lip-S4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 194) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 190). Preferentemente, los tres heterodímeros se mezclan en una relación molar de 1:2:1, 1:3:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:2:2, 1:2:3, 1:3:2, 1:3:3, 2:1:1,2:1:2, 2:1:3, 2:2:3, 2:2:1,2:3:1,2:3:2, 2:3:3, 3:1:1, 3:1:2, 3:1:3, 3:2:1,3:2:2, 3:2:3, 3:3:1, 3:3:2, con la máxima preferencia 1:1:1.
En una modalidad adicional, la composición farmacéutica comprende dos heterodímeros (uno de los cuales es el polipéptido de la invención), preferentemente, Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 186) y Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 190), Lip-S1D1-S2D1 (SEQ ID NO: 186) y Lip-S4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 194) o Lip-S4D1-S3D1 (SEQ ID NO: 194) y LipS5D1-S6D1 (Se Q ID NO: 190) en una relación molar de 1:2, 1:3, 2:1, 3:1, 2:3, 3:2, preferentemente 1:1.
En una modalidad, la composición farmacéutica o vacuna de la invención comprende, además, al menos un antígeno adicional (denominado en la presente descripción genéricamente como "vacuna combinada"). En una modalidad preferida, el al menos un antígeno adicional se deriva de una especie de Borrelia que causa la borreliosis de Lyme. En diversos aspectos, el al menos un antígeno adicional se deriva de otro patógeno, preferentemente, un patógeno transmitido por garrapatas. En otro aspecto, el patógeno causa fiebre manchada de las Montañas Rocosas, ehrlichiosis granulocítica Humana (HGE), fiebre de Sennetsu, Ehrlichiosis Monocítica Humana (HME), Anaplasmosis, fiebre de Boutonneuse, Rickettsiosis por Rickettsia parkeri, Enfermedad de Erupción Asociada a Garrapatas del Sur (STARI), Fiebre manchada Helvetica, Rickettsiosis 364D, Fiebre manchada africana, Fiebre recurrente, Tularemia, Fiebre por garrapatas de Colorado, Encefalitis transmitida por garrapatas (TBE, también conocida como FSME), Fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, Fiebre Q, Fiebre hemorrágica de Omsk, Enfermedad del bosque de Kyasanur, Encefalitis de Powassan, Enfermedad del virus Heartland o babesiosis. En otro aspecto, la enfermedad es la Encefalitis Japonesa.
En una modalidad adicional, el al menos un antígeno adicional se deriva de un patógeno transmitido por vectores, preferentemente, transmitido por garrapatas, seleccionado del grupo que comprende Borrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conori, Rickettsia helvetica, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Coxiella burnetii and Borrelia lonestari, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (virus TBEV aka FSME), virus de la fiebre por garrapatas del Colorado (CTFV), virus de la Fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (CCHFV), virus de la fiebre hemorrágica de Omsk (OHFV), virus de la Encefalitis Japonesa (JEV) y Babesia spp.
En otro aspecto, una vacuna combinada de la invención comprende cualquier composición de vacuna discutida en la presente descripción en combinación con al menos una segunda composición de vacuna. En algunos aspectos, la segunda composición de vacuna protege contra una enfermedad transmitida por vectores, preferentemente, una enfermedad transmitida por garrapatas. En diversos aspectos, la segunda composición de la vacuna tiene un calendario de vacunación estacional compatible con la inmunización contra la infección por Borrelia o la borreliosis de Lyme. En otros aspectos, las vacunas combinadas son útiles en la prevención de múltiples enfermedades para usar en ubicaciones geográficas donde estas enfermedades son prevalentes.
En un aspecto, la segunda composición de vacuna es una vacuna seleccionada del grupo que consiste en una vacuna contra la encefalitis transmitida por garrapatas, una vacuna contra la encefalitis japonesa y una vacuna contra la Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas. En un aspecto preferido, la composición de la vacuna es FSME-IMMUN® (Baxter), Encepur® (Novartis Vaccines), EnceVir® (Microgen NPO) o TBE Moscow Vaccine® (Instituyo Chumakov de Poliomielitis y Encefalitis Virales de la Academia Rusa de Ciencias Médicas). En otro aspecto preferido, la composición de la vacuna es IXIARO®/JESPECT® (Valneva SE), JEEV® (Biological E, Ltd.) o IMOJEV® (Sanofi Pasteur).
Se proporciona además una vacuna que comprende la composición farmacéutica, esta vacuna puede comprender, además, un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, el excipiente es L-metionina.
La invención incluye, además, composiciones inmunogénicas. En algunos aspectos, una composición inmunogénica de la invención comprende cualquiera de las composiciones discutidas en la presente descripción y un vehículo aceptable farmacéuticamente. En diversos aspectos, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que se une específicamente a una proteína de la proteína A de la superficie externa (OspA). En determinados aspectos, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que se une específicamente a Borrelia. En aspectos particulares, la composición inmunogénica tiene la propiedad de inducir la producción de un anticuerpo que neutraliza a Borrelia. En algunos aspectos, el anticuerpo es producido por un animal. En aspectos adicionales, el animal es un mamífero. Incluso en aspectos adicionales, el mamífero es humano.
Las preparaciones de vacuna que contienen composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para proteger a un mamífero susceptible a la infección por Borrelia o tratar a un mamífero con una infección por Borrelia, mediante la administración de dicha vacuna por vía sistémica o a través de las mucosas. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración a la mucosa de los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. Aunque la vacuna de la invención puede administrarse como una dosis única, los componentes de esta pueden administrarse, además, conjuntamente al mismo tiempo o en momentos diferentes.
Se proporciona un kit de vacuna, que comprende un vial que contiene una composición farmacéutica de la invención, opcionalmente en forma liofilizada, y que comprende, además, un vial que contiene un adyuvante como se describe en la presente descripción. Se prevé que en este aspecto de la invención, el adyuvante se usará para reconstituir la composición inmunogénica liofilizada. En otro aspecto, la composición farmacéutica de la invención puede mezclarse previamente en un vial, preferentemente, en una jeringa.
La descripción proporciona un método para prevenir o tratar la infección por Borrelia que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición farmacéutica o vacuna o kit de la invención. Se proporciona un método para prevenir o tratar episodios primarios y/o recurrentes de infección por Borrelia que comprende administrar al huésped una dosis inmunoprotectora de la composición farmacéutica o vacuna o kit de la invención. Un aspecto adicional de la invención es una composición farmacéutica de la invención para usar en el tratamiento o prevención de la enfermedad Borrelial. En una modalidad, se proporciona una composición farmacéutica para usar en el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia.
Además, se describe el uso de la composición farmacéutica o vacuna o kit de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia. En una modalidad, se proporciona una composición farmacéutica de la invención para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la infección por Borrelia.
La descripción proporciona métodos para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto. En diversos aspectos, tales métodos comprenden la etapa de administrar al sujeto cualquiera de las composiciones inmunogénicas o composiciones de vacuna discutidas en la presente descripción, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunológica. En determinados aspectos, la respuesta inmunológica comprende la producción de un anticuerpo anti-OspA.
La descripción proporciona métodos para prevenir o tratar una infección por Borrelia o la borreliosis de Lyme en un sujeto. En diversos aspectos, tales métodos comprenden la etapa de administrar cualquiera de las composiciones de vacuna discutidas en la presente descripción o cualquiera de las vacunas combinadas discutidas en la presente descripción al sujeto en una cantidad eficaz para prevenir o tratar la infección por Borrelia o la borreliosis de Lyme.
La descripción proporciona el uso de polipéptidos, ácidos nucleicos, anticuerpos, composiciones farmacéuticas o vacunas de la invención para la preparación de medicamentos. Además, otros aspectos relacionados se proporcionan en la presente invención.
Los términos "que comprende", "comprenden" y "comprende" en la presente descripción están destinados por los inventores a ser sustituibles opcionalmente con los términos "que consiste en", "consisten en" y "consisten de", respectivamente, en cada caso. El término "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende", y se entenderá que variaciones tales como "que comprende" y "comprender" implican la inclusión de un compuesto o composición establecida (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido, anticuerpo) o etapa, o grupo de compuestos o etapas, pero no con exclusión de otros compuestos, composición, etapas, o grupos de estos. La abreviatura "e.g.", se deriva del latín ejempli gratia, y se usa aquí para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto, la abreviatura "e.g." es sinónimo del término "por ejemplo".
Las modalidades de la presente invención relacionadas con las "composiciones de vacuna" de la invención son aplicables, además, a las modalidades relacionadas con las "composiciones farmacéuticas" de la invención, y viceversa.
A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Pueden encontrarse definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y otros, (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8).
Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. Debe entenderse, además, que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para su descripción. Adicionalmente, las limitaciones numéricas dadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antígeno, pueden ser aproximadas.
Un vehículo o excipiente preferible para los polipéptidos de acuerdo con la presente invención en sus diversas modalidades, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es un compuesto inmunoestimulador tal como un adyuvante para estimular aún más la respuesta inmunitaria con respecto al polipéptido de acuerdo con la presente invención o una molécula de ácido nucleico que codifica este.
Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a:
A. Composiciones que contienen minerales.
Las composiciones adecuadas que contienen minerales para usar como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etcétera, o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos tomando cualquier forma adecuada (porejemplo, gel, cristalino, amorfo, etcétera), y prefiriéndose la adsorción. Las composiciones que contienen minerales pueden formularse, además, como una partícula de sal metálica.
Un adyuvante útil de fosfato de aluminio es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar PO4/Al entre 0,84 y 0,92. Otro adyuvante útil a base de aluminio es AS04, una combinación de hidróxido de aluminio monofosforil lípido A (MPL).
B. Emulsiones de Aceite
Las composiciones adecuadas de emulsión de aceite para usar como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno en agua, tales como MF59 (escualeno 5 %, Tween 800,5 % y Span 850,5 %, formulado en partículas submicrométricas mediante el uso de un micro-fluidizador), AS03 (escualeno, DL-a-tocoferol y Tween 80) y AF03 (escualeno, Montane® 80 y Eumulgon® B1 PH). Además, pueden usarse el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA).
Las emulsiones útiles de aceite en agua incluyen, típicamente, al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el (los) aceite(s) y el (los) tensioactivo(s) biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Las gotas de aceite en la emulsión generalmente tienen menos de 1 pm de diámetro, y estos tamaños pequeños se logran con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren las gotas con un tamaño inferior a 220 nm, ya que pueden someterse a esterilización por filtración.
La emulsión puede comprender aceites tales como los de un animal (tal como pescado) o una fuente vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de maní, el aceite de soja, el aceite de coco, y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nueces. Puede usarse el aceite de jojoba, por ejemplo, que se obtiene del grano de jojoba. Los aceites de semilla incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero, además, pueden usarse el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Los ésteres de ácido graso de 6-10 carbonos del glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se encuentran naturalmente en los aceites de semillas, pueden prepararse mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales de partida apropiados de los aceites de nueces y de semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamíferos son metabolizables y, por lo tanto, pueden usarse en la práctica de esta invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de origen animal son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón, y el aceite de ballena tal como el espermaceti ejemplifican numerosos de los aceites de pescado que pueden usarse en la presente descripción. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado, insaturado, conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferido en la presente descripción. El escualano, el análogo saturado del escualeno, es, además, un aceite preferido. Los aceites de pescado, que incluyen escualeno y escualano, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (ver más abajo). Pueden usarse mezclas de aceites.
Los tensioactivos pueden clasificarse por su 'HLB' (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferentemente, al menos 15, y con mayor preferencia al menos 16. La invención puede usarse con tensioactivos que incluyen, pero no se limitan a: los tensioactivos de ésteres de sorbitán de polioxietileno (comúnmente denominados como los Tweens), específicamente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO), vendidos bajo el nombre comercial DOWF AX™, tales como copolímeros de bloque e O/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) repetidos, con octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol) de particular interés; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tales como las series Tergitol™ NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocidos como tensioactivos Brij), tales como monolauril éter de trietilenglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los SPAN), tales como el trioleato de sorbitán (Span 85) y el monolaurato de sorbitán. Se prefieren los tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos preferidos para incluir en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietilensorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.
Pueden usarse mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas Tween 80/Span 85. Además, es adecuada una combinación de un éster de sorbitán de polioxietileno tal como monooleato de sorbitán de polioxietileno (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 plus un éster de polioxietilensorbitán y/o un octoxinol.
Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de sorbitán de polioxietileno (tales como Tween 80) 0,01 a 1 %, en particular aproximadamente 0,1 %; octil o nonilfenoxi polioxietanoles (tales como Triton X-100, u otros detergentes en las series Tritón) 0,001 a 0,1 %, en particular 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como Laureth 9) 0,1 a 20 %, preferentemente, 0,1 a 10 % y en particular 0,1 a 1 % o aproximadamente, 0,5 %.
Preferentemente, sustancialmente todas (por ejemplo, al menos 90 % en número) de las gotas de aceite tienen un diámetro de menos de 1 pm, por ejemplo <750 nm, <500 nm, <400 nm, <300 nm, <250 nm, <220 nm, <200 nm o menor. Una emulsión submicrométrica útil específica consiste en escualeno, Tween 80, y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente 0,5 % de Span 85. En términos de peso, estas relaciones se convierten en 4,3 % de escualeno, 0,5 % de polisorbato 80 y 0,48 % de Span 85. La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones citrato, por ejemplo, tampón citrato sódico 10 mM.
C. Formulaciones de saponina
Las formulaciones de saponina pueden usarse, además, como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glucósidos de esteroles y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso en las flores de una amplia gama de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvante. Además, la saponina puede obtenerse comercialmente de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (brideal veil), y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como también formulaciones lípidas, tales como ISCOM. QS21 se comercializa como Stimulon™.
Las composiciones de saponina se han purificado mediante el uso de HPLC y RP-HPLC. Mediante el uso de estas técnicas se han identificado fracciones purificadas específicas, que incluye QS7, QS 17, QS 18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Las formulaciones de saponina pueden comprender, además, un esterol, tal como el colesterol.
Pueden usarse combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM). Los ISCOM típicamente además incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida puede usarse en ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QS7, QS 17, QS 18, Qs 21, QH-A, QH-B y QH-C. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional.
D. Virosomas y partículas similares a virus.
Los virosomas y las partículas similares a virus (VLP) pueden usarse, además, como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Generalmente no son patógenos, no se replican y generalmente no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden producirse de forma recombinante o aislarse de virus completos. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la influenza (tales como HA o NA), el virus de la hepatitis B (tales como las proteínas centrales o de la cápside), el virus de la hepatitis E, el virus del sarampión, el virus Sindbis, el Rotavirus, el virus de la enfermedad boca mano pie, Retrovirus, virus Norwalk, virus del Papiloma Humano, VIH, fagos de ARN, fago Qp (tal como las proteínas de recubrimiento), fago GA, fago fr, fago AP205, y Ty (tales como la proteína Pi del retrotransposón Ty).
E. Derivados bacterianos o microbianos.
Los adyuvantes adecuados para usar en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados de lípidos A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas de ribosilación de ADP y derivados desintoxicantes de estos.
Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-deacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de 3 monofosforil lípido A de-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas como para esterilizarse mediante filtración a través de una membrana de 0,22 pm. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen los miméticos de monofosforil lípido A, tales como derivados de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por ejemplo, RC-529 y el dímero de fosfolípido sintético, E6020.
Los derivados del lípido A incluyen derivados del lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para usar como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citosina no metilada unida por un enlace fosfato a una guanosina). Además, se ha demostrado que los ARN bicatenarios y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli (dG) son inmunoestimuladores.
Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. La secuencia de CpG puede dirigirse al TLR9, tal como el motivo g TCg TT o TTCGTT. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria de tipo Th1, tal como un CpG-A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como un CpG-B ODN.
Preferentemente, el CpG es un CpG-A ODN.
Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de manera que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, pueden unirse dos secuencias de oligonucleótidos CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimuladores se conoce como IC31®. Por lo tanto, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos uno (y preferentemente múltiples) motivos CpI (es decir, una citosina unida a una inosina para formar un dinucleótido), y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferentemente múltiples) secuencias del tripéptido Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia de 26-mer 5'-(dIdC)13-3' (s Eq ID NO: 32). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de 11 mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 33).
Los compuestos policatiónicos derivados de fuentes naturales incluyen HIV-REV o HIV-TAT (péptidos catiónicos derivados, péptidos de antenapedia, quitosano u otros derivados de quitina) u otros péptidos derivados de estos péptidos o proteínas mediante producción bioquímica o recombinante. Otros compuestos policatiónicos preferidos son catelina o sustancias relacionadas o derivadas de catelina. Por ejemplo, la catelina de ratón es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos NH2-RLAGLL-RKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE-COOH (SEQ ID NO: 31). Las sustancias derivadas de catelina o relacionadas contienen la totalidad o partes de la secuencia de catelina con al menos 15-20 residuos de aminoácidos. Las derivaciones pueden incluir la sustitución o modificación de los aminoácidos naturales por aminoácidos que no se encuentran entre los 20 aminoácidos estándar. Además, pueden introducirse residuos catiónicos adicionales en tales moléculas de catelina. Se prefiere que estas moléculas de catelina se combinen con el antígeno. Sorprendentemente, estas moléculas de catelina han resultado ser también eficaces como adyuvantes para un antígeno sin la adición de adyuvantes adicionales. Por lo tanto, es posible usar tales moléculas de catelina como adyuvantes eficaces en formulaciones de vacunas con o sin sustancias inmunoactivadoras adicionales.
Las toxinas bacterianas de ribosilación de ADP y los derivados desintoxicantes de estas pueden usarse como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina lábil al calor "LT" de E. coli), Vibrio cholerae (toxina del cólera "CT") o Bordetella pertussis (toxina de Pertussis). Se conoce el uso de toxinas de ribosilación de ADP desintoxicantes como adyuvantes de la mucosa y como adyuvantes parenterales. La toxina o toxoide está preferentemente en forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación desintoxicante; preferentemente la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT desintoxicante tal como LT-K63, LT-R72, LT-G192 o dmLT. Un mutante CT útil es CT-E29H.
F. Inmunomoduladores humanos
Los inmunomoduladores humanos adecuados para usar como adyuvantes en la invención incluyen citocinas tales como las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etcétera), los interferones (por ejemplo, interferón --/), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferido es IL-12.
G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos.
Los bioadhesivos y mucoadhesivos pueden usarse, además, como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas o mucoadhesivos de ácido hialurónico esterificados tales como derivados reticulados de ácido poliacrílico, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosano y sus derivados pueden usarse, además, como adyuvantes en la invención.
H. Micropartículas
Las micropartículas pueden usarse, además, como adyuvantes en la invención. Micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 pm de diámetro, con mayor preferencia de ~200 nm a ~30 pm de diámetro, y con la máxima preferencia de ~500 nm a ~10 pm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, un poli(lactida-co-glicólido), etcétera), en donde se prefiere el poli(lactida-co-glicólido), opcionalmente tratado para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).
I. Liposomas
Se conocen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para usar como adyuvantes.
J. Formulaciones de éter de polioxietileno y de éster de polioxietileno
Los adyuvantes adecuados para usar en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ásteres de polioxietileno. Tales formulaciones incluyen, además, tensioactivos de áster de polioxietileno sorbitán en combinación con un octoxinol, así como también polioxietilen alquil éteres o tensioactivos de áster en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietileno-9-lauril éter (laureth 9), polioxietileno-9-esteoril éter, polioxietileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35-lauril éter, y polioxietileno-23-lauril éter.
K. Péptidos de Muramil
Los ejemplos de péptidos de muramil adecuados para usar como adyuvantes en la invención incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-5n-glicero-3 -hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).
L. Compuestos de imidazoquinolona.
Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para usar como adyuvantes en la invención incluyen Imiquimod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M").
La invención puede comprender, además, combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente.
Preferentemente, el compuesto inmunoestimulador en la preparación farmacéutica de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo de sustancias policatiónicas, específicamente péptidos policatiónicos, moléculas de ácidos nucleicos inmunoestimuladoras, preferentemente desoxinucleótidos inmunoestimuladores, emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, MF59, sales de aluminio, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, compuestos neuroactivos, específicamente hormona de crecimiento humano, o combinaciones de estos.
Se prefiere particularmente el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio, y los antígenos generalmente se adsorben en estas sales.
Además, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención es una composición farmacéutica que comprende al menos cualquiera de los siguientes compuestos o combinaciones de estos: las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención en sus diversas modalidades, el vector de acuerdo con la presente invención, las células de acuerdo con la presente invención y el anticuerpo de acuerdo con la presente invención. En relación con esto, cualquiera de estos compuestos puede emplearse en combinación con un vehículo o portador estéril o no estéril para usar con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un sujeto. Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de estos. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende un estabilizador. El término "estabilizador" se refiere a una sustancia o excipiente de vacuna que protege la composición inmunogénica de la vacuna de condiciones adversas, tales como las que ocurren durante el calentamiento o la congelación, y/o prolonga la estabilidad o la vida útil de la composición inmunogénica en una condición o estado estable e inmunogénico. Los ejemplos de estabilizadores incluyen, pero no se limitan a, azúcares, tales como sacarosa, lactosa y manosa; alcoholes de azúcar, tales como manitol; aminoácidos, tales como glicina o ácido glutámico; y proteínas, tales como la albúmina sérica humana o la gelatina.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de cualquier manera eficaz y conveniente que incluye, por ejemplo, la administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal o intradérmica, entre otras. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas se administran por vía subcutánea o intramuscular, con la máxima preferencia intramuscularmente.
En terapia o como profiláctico, el agente activo de la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo, como una dispersión acuosa estéril, preferentemente isotónica.
Alternativamente, la composición, preferentemente la composición farmacéutica, puede formularse para aplicación tópica, por ejemplo, en forma de ungüentos, cremas, lociones, ungüentos para los ojos, gotas para los ojos, gotas para los oídos, enjuagues bucales, apósitos y suturas impregnados y aerosoles, y puede contener los aditivos convencionales apropiados, que incluyen, por ejemplo, conservantes, solventes para ayudar a la penetración de drogas y emolientes en ungüentos y cremas. Tales formulaciones tópicas pueden contener, además, vehículos convencionales compatibles, por ejemplo, bases de crema o pomada, y etanol o alcohol oleílico para lociones. Tales vehículos pueden constituir de aproximadamente 1 % a aproximadamente 98 % en peso de la formulación; más usualmente constituirán hasta aproximadamente el 80 % en peso de la formulación.
Además de la terapia descrita anteriormente, las composiciones de esta invención pueden usarse generalmente como un agente de tratamiento de heridas para evitar la adhesión de bacterias a proteínas de la matriz expuestas en el tejido de la herida y para uso profiláctico en el tratamiento dental como una alternativa o junto con, profilaxis antibiótica.
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica es una composición de vacuna. Preferentemente, tal composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para mejorar la respuesta inmunitaria. Una dosis unitaria adecuada para la vacunación con un antígeno proteico es para adultos entre 0,02 pg y 3 pg de antígeno por kg de peso corporal y para niños entre 0,2 pg y 10 pg de antígeno por kg de peso corporal, y tales dosis se administran preferentemente, de 1 a 3 veces a intervalos de 2 a 24 semanas.
En el intervalo de dosis indicado, no se esperan efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención, lo que imposibilitaría su administración a individuos adecuados.
La descripción describe kits que comprenden una o más formulaciones farmacéuticas para la administración a un sujeto envasadas de una manera que facilita su uso para la administración a los sujetos. En una modalidad preferida, los kits comprenden la formulación en un volumen final de 2 mL, con mayor preferencia en un volumen final de 1 mL.
Los kits pueden usarse para producir una unidad de administración de dosis única. Los kits, en diversos aspectos, contienen cada uno un primer recipiente que tiene una proteína desecada y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. Además, se incluyen dentro del alcance de esta invención los kits que contienen jeringas prellenadas de una o múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas líquidas y jeringas con contenido liofilizado).
En otra modalidad, dicho kit incluye la formulación farmacéutica descrita en la presente descripción (por ejemplo, una composición que comprende una proteína o péptido terapéutico), empaquetada en un recipiente tal como una botella o recipiente sellado, con una etiqueta pegada al recipiente o incluida en el paquete que describe el uso del compuesto o composición en la práctica del método. En una modalidad, la formulación farmacéutica se envasa en el recipiente de manera que la cantidad de espacio de cabeza en el recipiente (por ejemplo, la cantidad de aire entre la formulación líquida y la parte superior del recipiente) es muy pequeña. Preferentemente, la cantidad de espacio de cabeza es insignificante (es decir, casi ninguno).
En un aspecto, el kit contiene un primer recipiente que tiene una composición terapéutica de proteína o péptido y un segundo recipiente que tiene una solución de reconstitución aceptable fisiológicamente para la composición. En un aspecto, la formulación farmacéutica se envasa en una forma de dosificación unitaria. El kit incluye, opcionalmente, además un dispositivo adecuado para administrar la formulación farmacéutica de acuerdo con una ruta específica de administración. En algunos aspectos, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de las formulaciones farmacéuticas.
La composición farmacéutica puede contener una gama de antígenos diferentes. Los ejemplos de antígenos son organismos completamente muertos o atenuados, subfracciones de estos organismos, proteínas, o, en su forma más simple, péptidos. El sistema inmunitario, además, puede reconocer los antígenos en forma de proteínas o péptidos glicosilados y además pueden ser o contener polisacáridos o lípidos. Pueden usarse péptidos cortos, ya que las células T citotóxicas (CTL) reconocen antígenos en forma de péptidos cortos, generalmente de 8-11 aminoácidos de longitud, junto con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las células B pueden reconocer epítopos lineales tan cortos como de 4 a 5 aminoácidos, así como también estructuras tridimensionales (epítopos conformacionales).
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica del tercer aspecto comprende adicionalmente un antígeno reactivo en suero hiperinmune contra una proteína de Borrelia o un fragmento activo o variante de esta, tal como, por ejemplo, los antígenos, fragmentos y variantes como se describe en el documento WO 2008/031133. De acuerdo con la invención, la composición farmacéutica de acuerdo con el tercer aspecto puede usarse como un medicamento, particularmente como una vacuna, particularmente en relación con una enfermedad o afección de enfermedad que es causada por, vinculada o asociada con Borrelia.
La composición farmacéutica de la presente invención puede usarse como un medicamento, particularmente como una vacuna, particularmente en relación con una enfermedad o afección de enfermedad causada por, vinculada o asociada con Borrelia, con mayor preferencia cualquier especie patógena de Borrelia y con mayor preferencia en un método de uso para tratar o prevenir una infección por Borrelia, particularmente una infección por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japonica, B. tanukii, B. turdi or B. sinica infection, preferentemente una in fección por B. burgdorferi s.s., B. afzelii o B. garinii.
En relación con esto, debe observarse que las diversas especies de Borrelia, que incluye B. burgdorferi s.l., comprenden varias especies y cepas, que incluye las descritas en la presente descripción. Una enfermedad relacionada, causada o asociada con la infección bacteriana que debe prevenirse y/o tratarse de acuerdo con la presente invención incluye la borreliosis de Lyme (enfermedad de Lyme). Aspectos adicionales, síntomas, etapas y subgrupos de borreliosis de Lyme, así como también grupos específicos de pacientes que padecen de tal enfermedad, como además se describe en la presente descripción, se incluyen en la parte introductoria. Más específicamente, la borreliosis de Lyme generalmente ocurre en etapas, con remisión y exacerbaciones con diferentes manifestaciones clínicas en cada etapa. La etapa 1 de infección temprana consiste en una infección localizada de la piel, seguida en días o semanas por la etapa 2, de infección diseminada, y meses a años después por la etapa 3, de infección persistente. Sin embargo, la infección es variable; algunos pacientes solo tienen infecciones localizadas de la piel, mientras que otros muestran solo manifestaciones posteriores de la enfermedad, tal como la artritis.
Además, se describe un método para tratar o prevenir una infección por Borrelia en un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de una composición farmacéutica de acuerdo con el tercer aspecto.
El término "sujeto" se usa a lo largo de la descripción para describir un animal, preferentemente un mamífero, con mayor preferencia un ser humano, a quien se proporciona un tratamiento o un método de acuerdo con la presente invención. Para el tratamiento de esas infecciones, afecciones o estados de enfermedad que son específicos para un animal específico, tal como un paciente humano, el término paciente se refiere a ese animal específico. Preferentemente, el sujeto es un humano; sin embargo, el uso médico de la composición puede incluir, además, animales tales como aves de corral, que incluye pollo, pavo, pato o ganso, ganado tal como caballos, vacas u ovejas, o animales de compañía tales como perros o gatos.
El término "cantidad con eficacia" se usa en toda la descripción para describir una cantidad de la presente composición farmacéutica que puede usarse para inducir un resultado deseado cuando se usa en el método de la presente invención. En numerosos aspectos de la presente invención, el término cantidad con eficacia se usa junto con el tratamiento o prevención. En otros aspectos, el término cantidad con eficacia simplemente se refiere a una cantidad de un agente que produce un resultado que se considera beneficioso o útil, que se incluye en los métodos de acuerdo con la presente invención donde se busca el tratamiento o la prevención de una infección por Borrelia.
El término cantidad con eficacia, con respecto a los compuestos y composiciones descritos actualmente se usa en toda la descripción para describir esa cantidad del compuesto de acuerdo con la presente invención que se administra a un paciente mamífero, específicamente a un paciente humano, que padece una enfermedad asociada a Borrelia, para reducir o inhibir una infección por Borrelia.
El método de inmunización de un sujeto comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de una composición farmacéutica del tercer aspecto de la presente invención.
El método comprende inducir una respuesta inmunológica en un individuo mediante terapia génica o de otro modo, mediante la administración de un polipéptido o ácido nucleico de acuerdo con la presente invención in vivo para estimular una respuesta inmunológica para producir anticuerpos o una respuesta celular mediada por células T, ya sea de células T productoras de citocinas o de células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo de la enfermedad, aún si esa enfermedad ya está establecida, o no, dentro del individuo.
Los productos de la presente invención, particularmente los polipéptidos y los ácidos nucleicos, se proporcionan preferentemente en forma aislada, y pueden purificarse para lograr la homogeneidad. El término "aislado" como se usa en la presente descripción significa separado "por la mano del hombre" de su estado natural; es decir, si ocurre en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de origen natural o un polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo en su estado natural no está "aislada", pero la misma molécula de ácido nucleico o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislada", como el término se emplea en la presente descripción. Como parte de o después del aislamiento, tales moléculas de ácido nucleico pueden unirse a otras moléculas de ácido nucleico, tales como moléculas de ADN, para mutagénesis, para formar fusión de genes, y para propagación o expresión en un huésped, por ejemplo. Las moléculas de ácido nucleico aisladas, solas o unidas a otras moléculas de ácido nucleico, tales como los vectores, pueden introducirse en las células huésped, en cultivo o en organismos completos. Introducidas en las células huésped en cultivo o en organismos completos, tales moléculas de ADN aún pudieran aislarse, como se usa el término en la presente descripción, porque no estarían en su forma o entorno natural. De manera similar, las moléculas de ácido nucleico y los polipéptidos pueden aparecer en una composición, tal como formulaciones de medios, soluciones para la introducción de moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, por ejemplo, en células, composiciones o soluciones para reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, que no son composiciones de origen natural y, en ellas, permanecen moléculas de ácido nucleico o polipéptidos aislados dentro del significado de ese término tal como se emplea en la presente descripción.
La invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente descripción porque pueden variar. Además, la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir modalidades particulares solamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, las palabras "comprende", "contiene" y "abarca" deben interpretarse de manera inclusiva en lugar de exclusivamente.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos y cualquier acrónimo usado en la presente descripción tienen los mismos significados que comúnmente entiende un experto en la técnica en el campo de la invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen en la presente descripción.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes Figuras, Tablas, Ejemplos y el listado de Secuencias, de las cuales pueden tomarse características, modalidades y ventajas adicionales. Como tal, las modificaciones específicas discutidas no deben interpretarse como limitaciones en el alcance de la invención. Será evidente para el experto en la técnica que pueden hacerse varios equivalentes, cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención, y por lo tanto debe entenderse que tales modalidades equivalentes deben incluirse en la presente descripción.
En relación con la presente invención
La Figura 1 muestra el alineamiento de aminoácidos de OspA de los serotipos 1-6 de Borrelia.
La Figura 2 muestra esquemáticamente la producción de heterodímeros de fragmentos mutantes de OspAs de acuerdo con la presente invención.
La Figura 3 representa esquemáticamente los componentes polipeptídicos de una posible composición farmacéutica de la presente invención que comprende tres heterodímeros diferentes de OspA mutante, una "vacuna combinada".
La Figura 4 muestra la estructura química de Pam3 Cys, un ejemplo de una cisteína sustituida con ácido graso, tal como se encontraría en el extremo N-terminal de polipéptidos lipidados de la presente invención.
La Figura 5 muestra la unión de anticuerpos de ratones inmunizados con polipéptidos heterodímeros del fragmento de OspA mutante a la superficie celular de Borrelia de serotipos de OspA 1-6.
La Tabla 1 muestra la estabilidad térmica del plegamiento de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo D1 a D5 (para la nomenclatura, ver Tabla A-4) en comparación con el fragmento de OspA de tipo silvestre de serotipo 2 sin enlaces disulfuro (D0).
La Tabla 2 muestra la protección de ratones contra la infección por B. afzelii (cepa IS1) mediante el Método de Reto con Garrapata después de la inmunización con fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro de tipo D1 a D5 (para la nomenclatura, ver Tabla A-4), que incluye los grupos de control de ratones inmunizados con PBS, OspA de longitud completa o el fragmento de OspA de tipo silvestre de serotipo 2 (S2D0-His).
La Tabla 3 muestra la protección de ratones contra la infección por B. afzelii (cepa IS1) mediante el Método de Reto con Garrapata después de la inmunización con fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 lipidada con enlace disulfuro de tipo D1, D3 y D4 (Lip-S2D1-His, Lip-S2D3-His y Lip-S2D4-His), que incluye los grupos de control de ratones inmunizados con PBS o proteína OspA de longitud completa.
La Tabla 4 muestra la capacidad protectora de los heterodímeros de OspA mutante de la invención en modelos de reto in vivo con Borrelia. Los ratones se inmunizaron con Lip-S1D1-S2D1-His, Lip-S4D1-S3D1-His, Lip-S4D1-S3D1 o Lip-S5D1-S6D1-His y se retaron con Borrelia del serotipo indicado de OspA mediante el Método de Reto con Aguja o con Garrapata, como se indica. El grupo de control en cada experimento se inmunizó con adyuvante Al(OH)3 solo.
La Tabla 5 muestra la capacidad protectora de la vacuna combinada de la invención contra el reto in vivo con Borrelia del serotipo 1 de OspA (cepa N40 en el Método de Reto con Aguja) y Borrelia del serotipo 2 de OspA (cepa IS1 en Método de Reto con Garrapata). Los ratones se inmunizaron con los tres antígenos LipS1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1 juntos en una proporción 1:1:1 (vacuna combinada) o con los antígenos de control indicados y se retaron con Borrelia a través del Método de Reto con Aguja o con Garrapata, como se indica. El grupo de control en cada experimento se inmunizó con adyuvante Al(OH)3 solo.
Las figuras y tablas a las que puede hacerse referencia en la descripción se describen más abajo con más detalle.
Figura 1 Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de OspA de serotipos uno a seis. La alineación ilustra que la porción N-terminal de la proteína asociada a la membrana tiene una secuencia de aminoácidos más altamente conservada que la porción C-terminal, más expuesta.
Figura 2 Producción de un heterodímero de OspA mutante de la invención que comprende los fragmentos C-terminal de OspA mutante a partir de dos serotipos diferentes de OspA de Borrelia sp. (A) Representación esquemática de un ácido nucleico que codifica un heterodímero OspA mutante lipidada. Los componentes, de 5' a 3', comprenden las secuencias de codificación para una secuencia señal de lipidación (señal Lip), un pequeño péptido que contiene cisteína para la lipidación N-terminal (péptido de lipidación = LP), un fragmento C-terminal de OspA mutante con dos cisteínas no nativas, un péptido enlazador corto (LN1), seguido de un segundo fragmento C-terminal de OspA mutante con dos cisteínas no nativas. (B) El polipéptido heterodímero de OspA mutante intermedio comprende el producto naciente directamente después de la traducción de la construcción de ácido nucleico. Desde el extremo N terminal al C terminal, este polipéptido consiste en una secuencia señal de lipidación (señal Lip), un péptido que contiene cisteína para la lipidación (LP), un fragmento de OspA mutante con un enlace disulfuro no nativo, un péptido enlazador corto (LN1), seguido de un segundo fragmento de OspA mutante con un enlace disulfuro no nativo. (C) El polipéptido heterodímero de OspA mutante lipidada final después de la modificación postraduccional. El heterodímero, desde el extremo N terminal al C terminal, consiste en un péptido corto que contiene cisteína con la cisteína N-terminal lipidada (indicada por "Lip"), un fragmento de OspA mutante estabilizado por un enlace disulfuro, un péptido enlazador (LN1), y un segundo fragmento de OspA mutante estabilizado por un enlace disulfuro. La secuencia señal de lipidación se escinde durante la modificación postraduccional del polipéptido como se muestra.
Figura 3 Un ejemplo de una composición farmacéutica preferida de acuerdo con la presente invención. Tres heterodímeros de OspA mutantes, cada uno de los cuales comprende fragmentos de OspA mutados de dos serotipos de OspA de Borrelia diferentes, están presentes en la composición, y juntos proporcionan antígenos de OspA de seis serotipos diferentes de OspA de Borrelia. Tal composición farmacéutica permite la inmunización simultánea contra seis serotipos de Borrelia.
Figura 4 Ilustración de la estructura química de Pam3 Cys, un ejemplo de una sustitución de ácidos grasos de la cisteína N-terminal de la proteína OspA de tipo silvestre de longitud completa, así como también monómeros y heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA lipidada de la invención. Durante la modificación postraduccional de una proteína o polipéptidos de OspA de longitud completa de la invención, la secuencia señal de lipidación N-terminal se escinde y los ácidos grasos, más comúnmente tres restos palmitoilo ("Pam3"), se unen enzimáticamente de manera covalente al residuo de cisteína N-terminal (el átomo de azufre, "S", se indica con una flecha). Los residuos restantes de la cadena polipeptídica, que están ubicados C-terminalmente del residuo PaiTteCys, se representan por "Xn". (Modified from Bouchon, y otros, (1997) Analytical Biochemistry 246: 52-61.)
Figura 5 Unión de anticuerpos de ratones inmunizados a la superficie celular de las espiroquetas de Borrelia. Los ratones se inmunizaron tres veces con 1 mg de cada uno de los antígenos indicados: proteínas OspA lipidadas y etiquetadas con His de longitud completa de los serotipos de OspA 1-6; Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 o Lip-S5D1-S6D1 solo, o Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1 juntos en una relación 1:1:1 ("vacuna combinada ") a intervalos de dos semanas y se recolectaron los sueros una semana después de la última dosis. Se analizaron varias diluciones de los sueros para determinar la unión a la superficie celular de Borrelia mediante tinción celular y citometría de flujo. Los valores de intensidad fluorescente observados cuando se tiñeron con sueros recolectados de ratones de control inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo se restaron para tener en cuenta la unión no específica. (Las Borrelia usadas fueron: B. burgdorferi, OspA de serotipo 1, cepa N40; B. afzelii, OspA de serotipo 2, cepa "C"; B. garinii, OspA de serotipo 3, cepa "D"; B. bavariensis, OspA de serotipo 4, cepa Fin; B. garinii, OspA de serotipo 5, cepa "E"; B. garinii, OspA de serotipo 6, cepa "B".)
Tabla 1. Estabilidad térmica de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 de B. afzelii K78, etiquetada con His, no lipidada, con diferente ubicación de los enlaces disulfuro. Los fragmentos mutantes de OspA del serotipo 2 con diferentes tipos de enlaces de cisteína (ver Tabla A-4) se solubilizaron en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0) y se evaluó la estabilidad térmica en comparación con el fragmento de OspA de serotipo 2 de tipo silvestre (S2D0). La presencia de un enlace disulfuro resultó en un aumento de la temperatura de fusión en comparación con el fragmento de OspA de serotipo 2 de tipo silvestre.
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Tabla 2. Capacidad protectora de dosis decrecientes de fragmentos imitantes de OspA de serotipo 2 marcada con His no lipidada contra la infección por B. afzelii (serotipo 2) por el Método de Reto con Garrapata. Se evaluaron cinco fragmentos de OspA de serotipo 2 mutante etiquetadas con His, no lipidadas, para determinar su capacidad protectora a dos dosis diferentes (30 pg y 5 pg) y se compararon con el fragmento de OspA de serotipo 2 de tipo silvestre. Los grupos de ratones inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo o con OspA de serotipo 2 de longitud completa no lipidada sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. Todos los antígenos se etiquetaron con His y no estaban lipidados. Los datos presentados combinan los resultados de diversos experimentos realizados en condiciones idénticas.
Figure imgf000037_0002
Tabla 3. Capacidad protectora de dosis decrecientes de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 etiquetada con His, lipidada contra la infección por B. afzelii mediante el Método de Reto con Garrapata. Se evaluaron tres fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 marcada con His, lipidada, con diferentes tipos de enlaces disulfuro para determinar la capacidad protectora en tres dosis diferentes (3,0 pg, 1,0 pg y 0,3 pg). Los grupos de ratones inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo o con OspA de serotipo 2 de longitud completa no lipidada sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. Los datos presentados combinan los resultados de diversos experimentos realizados en condiciones idénticas.
Figure imgf000037_0001
Tabla 4. Capacidad protectora de los heterodímeros de OspA imitante de la invención contra el reto de Borrelia in vivo a través de los Métodos de Reto con Aguja o Garrapata. Se inmunizaron grupos de ratones tres veces a intervalos de dos semanas con las dosis indicadas de heterodímero de OspA o el adyuvante Al(OH)3 solo. Los inmunógenos usados fueron Lip-S1D1-S2D1-His (retado con Borrelia OspA-ST1, Experimentos 1-3), Lip-S1 D1-S2D1-His, Lip-S4D1-S3D1-His y Lip-S5D1-S6D1-His, por separado (retado con Borrelia OspA-ST2, Experimentos 4­ 6), Lip-S4D1-S3D1 (retado con Borrelia OspA-ST4, Experimentos 7 y 8) y Lip-S5D1-S6D1-His (retado con Borrelia OspA-ST5, Experimentos 9 y 10; retado con Borrelia OspA-ST6, Experimentos 11 y 12). Los ratones inmunizados se retaron dos semanas después de la última inmunización a través de los Modelos de Reto con Aguja o con Garrapata, como se indica.
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Tabla 5. Capacidad protectora de la vacuna combinada de heterodímero de OspA mutante de la invención contra el reto con Borrelia con OspA de serotipo 1 y de serotipo 2. Se inmunizaron grupos de ratones tres veces con las dosis indicadas de inmunógeno o adyuvante de Al(OH)3 solo a intervalos de dos semanas. Los inmunógenos usados fueron una combinación 1:1:1 de los heterodímeros de OspA mutantes LipS1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1 (vacuna combinada), Lip-S1D1-S2D1, Lip-OspA1-His y OspA Quimérica ST1/ST2. Los ratones inmunizados se retaron dos semanas después de la última inmunización mediante el Método Reto con Garrapata (ST2, Experimentos 13 y 14) o el Método de Reto con Aguja (ST1, Experimentos 15 y 16).
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Ejemplos
Ejemplo 1. Evaluación de la estabilidad térmica de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 Procedimientos experimentales
Estabilidad térmica
Las temperaturas de fusión (Tm) de los monómeros de fragmento de OspA mutante serotipo 2 no lipidada se determinaron mediante el ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia descrito por Pantoliano, y otros, (J. Biomol Screen 6:429-440 (2001)). La tinción del gel de proteínas con el colorante fluorescente SYPRO® Orange (suministrado como un concentrado 5000x en DMSO por Sigma, EE.UU.) se usó para controlar el estado de plegamiento de las proteínas. En cada pocilio, se combinaron 7,5 pL de SYPRO® Orange (diluido 1:1000 de la solución madre) y 17,5 pL de una solución de proteína (1 pg o 2 pg) en tampón. Las muestras de proteínas se calentaron de 25 °C a 95 °C a una velocidad de 0,2 °C/10 segundos en el Sistema de Detección en Tiempo Real CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.) y se monitorearon los cambios fluorescentes. La intensidad de fluorescencia se midió con longitudes de onda de excitación y emisión de 490 y 575 nm, respectivamente. La Tm se determinó mediante el uso del programa Bio-Rad CFX Manager 2.0. Los valores de Tm de los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 etiquetada con His, no lipidada, se midieron en cuatro sistemas de tampones diferentes: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 9,0); Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0); PBS (pH 7,4); y HEPES 25 mM, NaCl 150 mM (pH 6,5), mediante el uso del fragmento de OspA de tipo silvestre de serotipo 2 no lipidada (S2D0) como control.
Resultados
En todos los casos, los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 con un enlace de cisteína introducido tuvieron mayor Tm que el fragmento de OspA de tipo silvestre de serotipo 2 (S2D0) (ver la Tabla 1). La Tm se evaluó en cuatro sistemas de tampones diferentes con resultados similares (los datos para las proteínas disueltas en Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0) se muestran en la Tabla 1), lo que indica que la estabilidad de las proteínas es similar en un amplio intervalo de pH. Este resultado da crédito a la hipótesis de que el enlace disulfuro introducido estabiliza el fragmento de OspA.
Ejemplo 2 Evaluación de la capacidad protectora de los monómeros de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 etiquetada con His, no lipidada, en el Método de Reto con Garrapata (ST2, B. afzelii)
Procedimientos experimentales
Clonación y expresión de proteínas recombinantes.
El fragmento de OspA de tipo silvestre de serotipo 2, así como también los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 con enlaces de cisteína de tipos 1-5 (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente), se optimizaron por codones para la expresión en E coli por GenScript, EE.UU. Los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 no lipidada se etiquetaron con His en el extremo C-terminal para fines de purificación. Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Novagen, EE.UU.), un vector que contiene un casete de resistencia a Kanamicina, así como también un promotor T7. Los monómeros se expresaron en células BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen, EE.UU.) a 37 °C mediante la adición de IPTG. Las células se recolectaron después de 4 horas por centrifugación y el pellet se almacenó a -70 °C durante hasta 12 meses antes del procesamiento adicional.
Purificación de monómeros de proteínas de fragmentos de OspA de tipo silvestre y mutante etiquetadas con His, no lipidadas
Las células se destruyeron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y la fracción soluble que contenía los fragmentos de OspA etiquetada con His se aplicó a una columna de Ni-sefarosa (Ni Sepharose™ 6 Fast Flow; GE Healthcare, Reino Unido) y los fragmentos de OspA etiquetada con His se eluyeron en un gradiente de imidazol (0-250 mM). Las fracciones agrupadas se purificaron adicionalmente sobre una columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) seguido de una columna de intercambio de tampón (Sephadex G-25, GE Healthcare). Los picos de fragmentos de OspA etiquetada con His se agruparon sobre la base de la columna de exclusión de tamaño analítico y de la cromatografía de fase inversa. Después de la filtración estéril, las proteínas purificadas se almacenaron a -20 °C hasta la formulación.
Inmunización de ratones
Se usaron ratones hembra C3H/HeN (H-2k) para todos los estudios (Harlan, Italia). Antes de cada reto, se sangraron grupos de cinco ratones de 8 semanas de edad a través de la vena de la cola y se prepararon y agruparon los sueros preinmune. Se evaluaron cinco proteínas del fragmento de OspA mutante de serotipo 2 no lipidada (S2D1-5, SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente), en quince experimentos separados. Se administraron tres inmunizaciones subcutáneas (s.c.) de 100 pL a intervalos de dos semanas. Las dosis usadas fueron 30 y 5 pg de la proteína respectiva, evaluadas en los experimentos 11 y 4, respectivamente. Todas las formulaciones incluían hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final de 0,15 %. Una semana después de la tercera inmunización, se recolectó sangre y se prepararon sueros hiperinmunes. En cada experimento, se incluyó un grupo inyectado con PBS formulado con Al(OH)3 como control negativo y se inmunizó un grupo de ratones con S2D0, el fragmento de OspA C-terminal de tipo silvestre de la cepa K78 de B. afzelii (SEQ ID NO: 1). Otro grupo inmunizado con una proteína OspA de tipo silvestre de longitud completa no lipidada de B. afzelii, cepa K78 (SEQ ID NO: 209), también formulada con 0,15 % de Al(OH)3, se incluyó como control positivo en cada estudio con animales. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr. 501/1989) y se aprobaron por "Magistratsabteilung 58".
Reto con garrapata de ratones inmunizados y recolección de sueros y tejidos (denominado en la presente descripción, además, como "Método de Reto con garrapata")
El reto con garrapata de los ratones inmunizados se realizó dos semanas después de la última inmunización. Para retar a los ratones inmunizados con B. afzelii, se eliminó el vello de la parte posterior de cada ratón con Crema Veet® (Reckitt Benckiser, Reino Unido) y se pegó un pequeño recipiente ventilado a la piel con súper pegamento (Pattex, Alemania) Posteriormente, se aplicaron una o dos ninfas de I. ricinus infectadas con B. afzelii, cepa IS1, por ratón, se les permitió unirse y alimentarse hasta el agotamiento. El estado de alimentación se controló diariamente para cada garrapata individual y solo se incluyeron en la lectura final los ratones en los que se recolectó al menos una garrapata completamente alimentada. No se hizo distinción entre ratones donde se recolectaron una o dos garrapatas completamente alimentadas.
Seis semanas después de la aplicación de la garrapata, se recolectó sangre por sangrado orbital y se prepararon sueros finales y se usaron para el análisis ELISA VlsE con el propósito de determinar el estado de la infección. Después los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se recolectó una oreja de cada ratón, se extrajo el ADN y se sometió a un análisis de PCR anidado para identificar Borrelia en el tejido.
Lectura de infección
Solo los ratones donde las garrapatas aplicadas se alimentaron hasta el final y pudieron recolectarse se incluyeron en la lectura final del experimento. Los ratones se sacrificaron 6 semanas después de la aplicación de la garrapata y se recolectaron los órganos; así como también los sueros finales. La lectura final de la infección se basó en dos análisis diferentes (PCR anidado dirigido al espaciador intergénico 16S-23S y ELISA VlsE (IR6) como se describe en detalle más abajo).
PCR anidado dirigido al espaciador intergénico 16S-23S
Una oreja de cada ratón se sometió a extracción y purificación de ADN mediante el uso del kit DNeasy Sangre y Tejido (Qiagen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con la siguiente modificación. Cada oreja se digirió durante la noche a 60 °C en Proteinasa K recombinante, grado PCR (Roche, 14-22 mg/mL). El ADN se eluyó en 50 pl de agua estéril desionizada y se almacenó a -20 °C hasta su posterior análisis. Como un control negativo, se incluyó una columna de purificación vacía en cada extracción y purificación de ADN y el eluato se sometió a PCR anidado. Todos los extractos de ADN se seleccionaron para detectar la presencia de ADN de Borrelia mediante un procedimiento de PCR anidado, que comprende 40 ciclos de 94 °C durante 30 s, 56 °C durante 30 s y 72 °C durante 60 s mediante el uso de los cebadores; Directo 5'- GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG-3' (SEQ ID NO: 26) e Inverso 5'-GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG-3' (SEQ ID NO: 27). Del volumen de reacción de 10 pL, se usó 1 pL como molde para la reacción de PCR anidado. La etapa de PCR anidado comprendió 25 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 60 s mediante el uso de los cebadores; Directo anidado 5'- AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG-3' (SEQ ID NO: 28) e Inverso anidado 5'-GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA-3' (SEQ ID NO: 29). Del volumen de reacción final, se separaron 5 pL en un gel de agarosa al 1 % que contenía bromuro de etidio y se visualizaron las bandas a la luz ultravioleta.
En cada análisis de PCR, se usó ADN purificado de un cultivo in vitro de B. afzelii cepa K78 como molde de control positivo. Además, se usó PBS en lugar de ADN extraído como control negativo. Se separaron cinco microlitros del producto final en un gel de agarosa al 1 % que contenía bromuro de etidio y se visualizaron las bandas a la luz ultravioleta.
ELISA con la Región Invariable 6 (IR6) de la secuencia de la proteína E similar a la proteína principal variable (VlsE)
Se usó para el análisis un péptido biotinilado de 25 mer (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) (SEQ ID NO: 30) derivado de la secuencia de B. garinii de la cepa IP90 (Liang FT, y otros, (1999) J Immunol. 163:5566-73). Las placas ELISA de 96 pocillos recubiertas previamente con estreptavidina (Nunc, Dinamarca) se recubrieron con péptido biotinilado 100 pL/pocillo (1 pg/mL) en PBS suplementado con Tween 20 al 0,1 % (PBS/0,1 T). Las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Después de recubrir con el péptido, las placas se lavaron una vez con PBS/0,1 T. Después se bloquearon las placas durante una hora a temperatura ambiente (RT) con 100 pl/pocillo de PBS BSA al 2 %, antes de volver a lavarlas con PBS/0,1 T. La reactividad de los sueros posterior al reto con respecto al péptido se evaluó a diluciones 1:200, 1:400 y 1:800 en PBS BSA al 1 %. Las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente antes de lavarse tres veces con PBS/0,1 T. Después, cada pocillo recibió 50 pL de IgG policlonal anti-ratón generada en de conejo 1,3 pg/mL conjugada con HRP (Dako, Dinamarca) en PBS BSA al 1 %. Las placas se incubaron después durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS/0,1 T, se añadió ABTS (50 pL/pocillo) como sustrato (Sigma-Aldrich, EE.UU.) y se dejó que se desarrollara el color durante 30 minutos. La absorbancia se midió a 405 nm. Todos los sueros se evaluaron por duplicado; los controles negativos incluyeron PBS en lugar de sueros, así como también las placas no recubiertas con el péptido. Como controles positivos se usaron sueros de ratones que mostraron ser positivos en cultivo para infección por B. afzelii.
Resultados
Niveles de protección en el método de reto con garrapata
Se observaron altos niveles de protección para los cinco fragmentos de OspA de B. afzelii estabilizados en las dos dosis evaluadas (30 pg y 5 pg, ver Tabla 2). Las altas tasas de infección en el grupo de control de PBS indican que las garrapatas se infectaron con alta frecuencia. Además, el control positivo, OspA de longitud completa no lipidada de la cepa K78 de B. afzelii, fue muy protector. Juntos, estos grupos de control indican la alta fiabilidad de la lectura experimental.
Los resultados de protección de los experimentos que evalúan las dosis de 30 pg (11 experimentos en total) y dosis de 5 pg (4 experimentos en total) se resumen en la Tabla 2. Los dos métodos empleados para verificar la infección, particularmente, ELISA VlsE y PCR anidado, dieron resultados prácticamente idénticos (datos no mostrados), lo que demuestra la solidez de estos métodos de lectura para evaluar la infección en el Método de Reto con Garrapata.
Ejemplo 3 Evaluación de la capacidad protectora de los monómeros de fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 etiquetada con His, lipidada, frente al reto in vivo con Borrelia mediante el Método de Reto con Garrapata (ST2, B. afzelii)
Procedimientos experimentales
Clonación y expresión de fragmentos de proteínas de OspA mutante etiquetada con His, lipidada
Los fragmentos mutantes de OspA de serotipo 2 con los enlaces de cisteína tipos 1, 3 y 4 (SEQ ID NO: 141, 143 y 144, respectivamente) se modificaron mediante la adición de una secuencia señal de lipidación derivada de OspA (SEQ ID NO: 14) y se direccionaron directamente al extremo C-terminal por un péptido c Kq N (SEQ ID NO: 211) para proporcionar una cisteína N-terminal para la lipidación. Todos los fragmentos mutantes de OspA se etiquetaron con histidina C-terminal para fines de purificación. Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Novagen), un vector que contiene un casete de resistencia a Kanamicina, así como también un promotor T7. Los monómeros lipidados se expresaron en células BL21 Star™(DE3) (Invitrogen) y después de la inducción por IPTG, la temperatura de crecimiento de las células se redujo de 37 °C a 25 °C para promover el procesamiento postraduccional eficiente de las proteínas. Las células se recolectaron después de 4 horas por centrifugación y el pellet se almacenó a -70 °C durante hasta 12 meses antes del procesamiento posterior.
Purificación de proteínas monoméricas de fragmentos mutantes de OspA y de tipo silvestre etiquetadas con His, lipidadas
Las células se destruyeron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y los polipéptidos monómeros de fragmentos de OspA etiquetada con His, lipidada, se enriquecieron en la fase lipídica por separación de fases, mediante el uso de Triton X-114 como detergente. Posteriormente, la fase de detergente diluido (20 a 30 veces) se aplicó a una columna de Ni-sefarosa (Ni Sepharose™ 6 Fast Flow; GE Healthcare) y los fragmentos de OspA etiquetada con His, lipidada, se eluyeron mediante elución con gradiente de imidazol (0-250 mM). Las fracciones agrupadas se purificaron adicionalmente sobre una columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) seguido de una columna de intercambio de tampón (Sephadex G-25, GE Healthcare). Los picos de fragmentos de OspA etiquetada con His, lipidada, se agruparon sobre la base de la columna de exclusión de tamaño analítico y la cromatografía de fase inversa. Después de la filtración estéril, las proteínas purificadas se almacenaron a -20 °C hasta la formulación.
Inmunización de ratones
Se expresaron y purificaron tres proteínas OspA mutantes lipidadas (Lip-S2D1-His, Lip-S2D3-His y Lip-S2D4-His) como se describió anteriormente. Los estudios de protección in vivo se realizaron como se describió en el Ejemplo 2 mediante el uso del adyuvante solo Al(OH)3 y OspA de serotipo 2 de longitud completa no lipidada como controles negativos y positivos, respectivamente. Todos los inmunógenos se formularon con 0,15 % de Al(OH)3. Los ratones se inyectaron por vía subcutánea tres veces a intervalos de dos semanas con formulaciones que contenían 3,0 pg, 1,0 mg o 0,3 pg de antígeno y se retaron con garrapatas infectadas con B. afzelii (cepa IS1) dos semanas después de la última inmunización. Los ratones se sacrificaron seis semanas después del reto con garrapatas y se evaluó la infección.
Resultados
Niveles de protección en el método de reto con garrapata
Los tres fragmentos mutantes de OspA lipidada confirieron niveles muy altos de protección contra el reto de B. afzelii incluso a la dosis más baja evaluada (Tabla 3). Las tasas de infección en los ratones inmunizados solo con adyuvante Al(OH)3 fueron altas, lo que indica que las garrapatas se infectaron con una frecuencia alta. El antígeno de control positivo, OspA de longitud completa no lipidada de la cepa K78 de B. afzelii, también fue muy protector. Juntos, estos grupos de control indican la alta fiabilidad del método de infección y, por lo tanto, dan una alta credibilidad a los resultados observados después de la inmunización con los fragmentos mutantes de OspA lipidada.
Ejemplo 4. Evaluación de la capacidad protectora de los heterodímeros de OspA mutante de la invención frente al reto con Borrelia in vivo mediante los Métodos de Reto con Aguja o Garrapata
Procedimientos experimentales
Clonación y expresión de heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA etiquetada con His, lipidada
Los monómeros de fragmento de OspA mutante de B. burgdorferi s.s. cepa B31, B. afzelii cepa K78, B. garinii cepa PBr, B. bavariensis cepa PBi, B. garinii cepa PHEi y B. garinii cepa DK29 se optimizaron por codones para la expresión en E. coli mediante GenScript, EE.UU. El epítopo similar a hLFA-1 (aa 164-174, SEQ ID NO: 17) de la OspA de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s. se sustituyó por una secuencia NFTLEGKVAND no similar a hLFA-1 de B. afzelii cepa K78 (SEQ ID NO: 18). La secuencia señal de lipidación añadida a los heterodímeros del fragmento de OspA mutante se obtuvo de la lipoproteína de la membrana externa principal de E. coli, Lpp, y se direccionó directamente al extremo C-terminal mediante un péptido CSS para proporcionar una cisteína N-terminal para la lipidación. Los heterodímeros del fragmento de OspA mutante se generaron mediante la fusión de diferentes monómeros del fragmento de OspA mutante como se describió anteriormente a través de una secuencia enlazadora de 21 aminoácidos, que se origina en dos regiones de bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA de la cepa B31 de B. burgdorferi s.s. ("LN1"; aa 65-74 y aa 42-53 con un intercambio de aminoácidos de D53S, SEQ ID NO: 184). Los heterodímeros se construyeron con una etiqueta His con el propósito de purificación. Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Novagen), un vector que contiene un casete de resistencia a Kanamicina, así como también un promotor T7. Las lipoproteínas de los heterodímeros estabilizados se expresaron en células BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen) y después de la inducción por IPTG, la temperatura de crecimiento de las células se redujo de 37 °C a 25 °C para promover un procesamiento postraduccional eficiente de las proteínas. Las células se recolectaron después de 4 horas por centrifugación y el pellet se almacenó a -70 °C durante hasta 12 meses antes del procesamiento posterior.
Purificación de heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA etiquetada con His, lipidada
Las células se destruyeron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y los heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA etiquetada con His, lipidada, se enriquecieron en la fase lipídica por separación de fases, mediante el uso de Triton X-114 como detergente. Posteriormente, la fase de detergente diluido (20 a 30 veces) se aplicó a una columna de Ni-sefarosa (Ni Sepharose™ 6 Fast Flow; GE Healthcare) y los heterodímeros de OspA etiquetada con His, lipidada, se eluyeron mediante elución de gradiente de imidazol (0-250 mM). Las fracciones agrupadas se purificaron adicionalmente sobre una columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) seguido de una columna de intercambio de tampón (Sephadex G-25, GE Healthcare). Los picos del heterodímero de OspA mutante etiquetada con His, lipidada, se agruparon sobre la base de la columna de exclusión de tamaño analítico y la cromatografía de fase inversa. Después de la filtración estéril, los heterodímeros purificados se almacenaron a -20 °C hasta la formulación.
Clonación y expresión de heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA no etiquetada con His, lipidada
Las construcciones hechas como se describió anteriormente se usaron para la generación de construcciones sin una etiqueta His por la introducción de un codón de parada mediante amplificación por PCR. Los fragmentos génicos se clonaron en el vector pET28b(+) (Merck Millipore), un vector que contiene un casete de resistencia a la kanamicina, así como también un promotor T7. Las lipoproteínas de los heterodímeros estabilizados se expresaron en células BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen) y después de la inducción por IPTG, la temperatura de crecimiento de las células se redujo de 37 °C a 25 °C para promover un procesamiento postraduccional eficiente de las proteínas. Las células se recolectaron después de 4 horas por centrifugación y el pellet se almacenó a -70 °C durante hasta 12 meses antes del procesamiento posterior.
Purificación de heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA no etiquetada con His, lipidada
Las células se destruyeron mecánicamente mediante homogeneización a alta presión y los heterodímeros del fragmento de OspA mutante lipidada se enriquecieron en la fase lipídica por separación de fases, mediante el uso de Triton X-114 como detergente. Posteriormente, la fase de detergente diluido se sometió a cromatografía de intercambio aniónico operada en modo no vinculante. El flujo resultante se cargó en una columna de hidroxiapatita (Bio-Rad) y las proteínas lipidadas se eluyeron de la columna mediante un gradiente lineal de sal. El eluato se sometió a purificación adicional sobre una columna DEAE-Sefarosa (GE Healthcare) en modo no vinculante seguido de una columna de filtración en gel (Superdex 200, GE Healthcare) para el intercambio de tampón. Los picos del heterodímero de OspA mutante lipidada se agruparon sobre la base de la columna de exclusión de tamaño analítico y SDS-PAGE. Después de la filtración estéril, los heterodímeros purificados se almacenaron a -20 °C hasta la formulación.
Inmunización de ratones
Se usaron ratones hembra C3H/HeN (Janvier, Francia) para todos los estudios. Antes de cada reto, se sangraron grupos de diez ratones de 8 semanas de edad a través de la vena facial y se prepararon y agruparon sueros preinmune. Se administraron tres inmunizaciones subcutáneas (s.c.) de 100 pl cada una a intervalos de dos semanas. Cada dosis contenía la cantidad de inmunógeno indicada en la Tabla 4 (dosis), formulada con hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final de 0,15 %. Una semana después de la tercera inmunización, se recolectó sangre de la vena facial y se prepararon sueros hiperinmunes. En cada experimento, se incluyó un grupo inmunizado con Al(OH)3 solo como un control negativo. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr. 501/1989) y se aprobaron por "Magistratsabteilung 58".
Reto con garrapata de ratones inmunizados y recolección de sueros y tejidos (denominado en la presente descripción, además, como "Método de Reto con garrapata")
Para retar a los ratones inmunizados con B. afzelii, se retiró el pelo de la parte posterior de cada ratón con Crema Veet® (Reckitt Benckiser) y se pegó un pequeño recipiente ventilado a la piel con superpegamento (Pattex). Posteriormente, se aplicaron una o dos ninfas de I. ricinus infectadas con B. afzelii, cepa IS1, por ratón, se les permitió unirse y alimentarse hasta que se hincharon completamente y se cayeron. El estado de alimentación se controló diariamente para cada garrapata individual y solo los ratones de los que se recogió al menos una garrapata completamente alimentada se incluyeron en la lectura final.
Reto con Aguja de ratones inmunizados con Borrelia cultivada in vitro
Dos semanas después de la última inmunización, los ratones se retaron s.c. con Borrelia diluido en 100 pL de medio de crecimiento Borrelia (BSK II). Las dosis de reto dependieron de la cepa, la virulencia de las cepas individuales se evaluó mediante experimentos de reto para la determinación de ID50. Las dosis empleadas para los experimentos de reto con aguja oscilaron entre 20 y 50 veces la ID50.
Sacrificio de ratones y recolección de material.
Cuatro semanas después del reto con aguja con la Borrelia spp. indicada o seis semanas después del reto con garrapata con B. afzelii, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical. La sangre se recolectó mediante sangrado orbital y se prepararon sueros finales y se usaron para ELISA VlsE para determinar el estado de infección. Además, se recolectó una oreja de cada ratón y se extrajo el ADN y se sometió a PCR cuantitativo (qPCR) para la identificación de Borrelia. La lectura final de la infección se basó en dos análisis diferentes (ELISA VlsE y qPCR dirigido a recA).
ELISA con la región 6 invariable (IR6) de VlsE
Para el análisis se usó un péptido biotinilado de 25 mer (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK) derivado de la secuencia de la cepa IP90 de B. garinii (Liang FT, Alvarez AL, Gu Y, Nowling JM, Ramamoorthy R, Philipp MT. An immunodominant conserved region within the variable domain of VlsE, the variable surface antigen of Borrelia burgdorferi. J Immunol. 1999; 163: 5566-73). Las placas de ELISA de 96 pocillos recubiertas previamente con estreptavidina (Nunc) se recubrieron con péptido de 100 pL/pocillo (1 pg/mL) en PBS suplementado con Tween al 0,1 % (PBS/0,1 T). Las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. Después de recubrir con el péptido, las placas se lavaron una vez con PBS/0,1 T. Después se bloquearon las placas durante una hora a temperatura ambiente (RT) con 100 pl/pocillo de PBS BSA al 2 %, antes de volver a lavarlas con PBS/0,1 T. La reactividad de los sueros posterior al reto con respecto al péptido se evaluó a diluciones 1:200, 1:400 y 1:800 en PBS BSA al 1 %. Las placas se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente antes de lavarse tres veces con PBS/0,1 T. Cada pocillo recibió 50 pL de IgG policlonal anti-ratón generada en conejo de 1,3 pg/mL conjugada con HRP (Dako) en PBS BSA al 1 %. Las placas se incubaron después durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS/0,1 T, se añadió ABTS (50 mL/pocillo) como sustrato (Sigma-Aldrich) y se dejó que se desarrollara el color durante 30 minutos. La absorbancia se midió a 405 nm. Todos los sueros se evaluaron por duplicado. Los controles negativos incluyeron PBS en lugar de sueros, así como también placas no recubiertas con el péptido. Como controles positivos se usaron sueros de ratones que mostraron ser positivos en cultivo para infección por B. afzelii.
qPCR dirigido a recA
Los cebadores de oligonucleótidos se diseñaron para el gen recA de manera que pudieran usarse en qPCR para la identificación de todas las especies de Borrelia relevantes que causan borreliosis de Lyme (directo: CATGCTCTTGATCCTGTTTA, inverso: CCCATTTCTCCATCTATCTC). El fragmento recA se clonó de B. burgdorferi s.s. de la cepa N40 en pET28b(+), para usarse como estándar en cada reacción. El ADN cromosómico extraído de las orejas de los ratones se diluyó 1:8 en agua para reducir los efectos de la matriz observados con el ADN sin diluir. Para cada experimento se preparó una mezcla maestra que consiste en SSoAdvanced™ SYBR® Green Supermix10 pL, 0,3 pL de cada cebador (10 pM), y 7,4 pL agua Dieciocho pL de la mezcla maestra se mezclaron con 2 pL del ADN diluido extraído de la vejiga o del oído, en placas de microtitulación y el ADN se amplificó mediante el uso de un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, EE.UU.). El ADN se desnaturalizó durante 3 minutos a 95 °C, seguido de 50 ciclos de 15 segundos a 95 °C y 30 segundos a 55 °C. Después de la amplificación, el ADN se preparó para el análisis de la curva de fusión mediante desnaturalización durante 30 segundos a 95 °C seguido de 2 minutos a 55 °C. El análisis de la curva de fusión se realizó mediante incubación de 5 segundos a 55 °C, con un aumento de 0,5 °C por ciclo, y 5 segundos a 95 °C. En cada placa, se incluyeron cuatro controles sin molde (NTC), así como también una curva estándar por duplicado con números de copia de molde que van de 10 a 10000.
Resultados
Los heterodímeros del fragmento de OspA mutante lipidada se evaluaron para determinar su capacidad protectora en doce experimentos separados. Los ratones se retaron con B. burgdorferi s.s., cepa N40, OspA de serotipo 1 (ST1, reto con aguja) o B. afzelii cepa IS1, OspA de serotipo 2 (ST2, reto con garrapatas) en tres experimentos cada uno o B. bavariensis, cepa Scf, OspA de serotipo 4 (ST4, reto con aguja), B. garinii, cepa "A", OspA de serotipo 5 (ST5, reto con aguja) o B. garinii, cepa "B", OspA de serotipo 6 (ST6, reto con aguja) en dos experimentos cada uno. En todos los experimentos, un grupo de ratones inmunizados con adyuvante de Al(OH)3 solo sirvió como grupo de control negativo. Para el reto con garrapatas, se aplicaron 1-2 garrapatas por ratón y solo los ratones a partir de los cuales al menos se alimentó una garrapata hasta que se hinchó completamente, se incluyeron en la lectura final. Sin embargo, no se hizo distinción entre ratones de los que se recolectaron una o dos garrapatas completamente alimentadas. Los datos de protección de los doce experimentos se resumen en la Tabla 4.
El heterodímero de OspA etiquetada con His, lipidada (Lip-S1D1-S2D1-His) mostró una alta protección estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher, dos colas) en los seis experimentos contra ambos, en los retos con OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2, en comparación con el grupo control negativo. Sorprendentemente, la inmunización con Lip-S4D1-S3D1-His y Lip-S5D1-S6D1-His también confirió una alta capacidad protectora contra el reto de OspA de serotipo 2 (Experimentos 4-6), lo que indica que puede haber un efecto de protección cruzada de la inmunización con otros serotipos de los fragmentos mutantes de OspA. Además, la inmunización con Lip-S4D1-S3D1 confirió una protección estadísticamente significativa contra el reto con aguja con Borrelia con OspA de serotipo 4 (Experimentos 7 y 8). Finalmente, la inmunización con LipS5D1-S6D1-His confirió protección contra el reto con aguja con ambas, OspA de serotipo 5 (Experimentos 9 y 10) y OspA de serotipo 6 (Experimentos 11 y 12). El estado infeccioso de cada ratón se determinó mediante el uso de ELISA VlsE en combinación con qPCR de recA. Se consideró que un ratón estaba infectado cuando al menos un método dio un resultado positivo.
En conclusión, la inmunización con polipéptidos heterodímeros del fragmento de OspA mutante de la invención confiere protección contra todos los serotipos de Borrelia evaluados y además, puede proporcionar protección cruzada en algunos casos.
El heterodímero de OspA etiquetada con His, lipidada (Lip-S1D1-S2D1-His) mostró una alta protección estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher, dos colas) en los seis experimentos contra ambos, en los retos con OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2, en comparación con el grupo control negativo. Sorprendentemente, la inmunización con Lip-S4D1-S3D1-His y Lip-S5D1-S6D1-His también confirió una alta capacidad protectora contra el reto de OspA de serotipo 2 (Experimentos 4-6), lo que indica que puede haber un efecto de protección cruzada de la inmunización con otros serotipos de los fragmentos mutantes de OspA. Además, la inmunización con Lip-S4D1-S3D1 confirió una protección estadísticamente significativa contra el reto con aguja con Borrelia con OspA de serotipo 4 (Experimentos 7 y 8). Finalmente, la inmunización con LipS5D1-S6D1-His confirió protección contra el reto con aguja con ambas, OspA de serotipo 5 (Experimentos 9 y 10) y OspA de serotipo 6 (Experimentos 11 y 12). El estado infeccioso de cada ratón se determinó mediante el uso de ELISA VlsE en combinación con qPCR de recA. Se consideró que un ratón estaba infectado cuando al menos un método dio un resultado positivo.
En conclusión, la inmunización con polipéptidos heterodímeros del fragmento de OspA mutante de la invención confiere protección contra todos los serotipos de Borrelia evaluados y además, puede proporcionar protección cruzada en algunos casos.
Ejemplo 5. Evaluación de la capacidad protectora de una vacuna combinada 1:1:1 de los heterodímeros de OspA mutante de la invención contra el reto con Borrelia in vivo con OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 a través de los Métodos de Reto con Aguja o Reto con Garrapata
Procedimientos experimentales
Inmunización de ratones
Se usaron ratones hembra C3H/HeN (Janvier, Francia) para todos los estudios. Antes de cada reto, se sangraron grupos de diez ratones de 8 semanas de edad a través de la vena facial y se prepararon y agruparon sueros preinmune. Se administraron tres inmunizaciones s.c. de 100 pL cada una a intervalos de dos semanas. Se inmunizaron grupos de ratones con la vacuna combinada que consiste en 1 mg de Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-S5D1-S6D1. Se incluyeron otros tres antígenos basados en OspA en los experimentos de reto: Lip-OspA1-His (OspA de serotipo 1 de longitud completa, lipidada y etiquetada con his), OspA quimérica lipidada ST1/ST2* y Lip-S1D1-S2D1 solo. El control negativo (placebo) fue solo el adyuvante de Al(OH)3. Todos los antígenos se formularon en PBS con hidróxido de aluminio (Al(OH)3) a una concentración final de 0,15 %.
*(OspA quimérica ST1/ST2 (SEQ ID NO: 212) es una quimera de OspA que consiste en los primeros 10 aminoácidos de la porción N-terminal de OspB (cepa B31), los aminoácidos 11-200 de OspA de serotipo 1, fusionados con los últimos 201-255 aminoácidos de la porción C-terminal de OspA de serotipo 2 y en donde la secuencia similar a hLFA1 de OspA de serotipo 1 (146-170) se sustituye con la secuencia homologa de una OspA de serotipo 2. La secuencia de OspA de serotipo 2 es seguida por dos aminoácidos que se añaden debido al sitio de clonación (XhoI) delante del codón de parada en el vector).
Una semana después de la tercera inmunización, se recolectó sangre de la vena facial y se prepararon sueros hiperinmunes. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr.
501/1989) y se aprobaron por "Magistratsabteilung 58".
Reto con aguja de ratones inmunizados con Borrelia cultivada in vitro
Dos semanas después de la última inmunización, los ratones se retaron por vía s.c. con espiroquetas de Borrelia diluidas en 100 pL de medio de crecimiento (BSKII). Las dosis de reto dependen de la cepa, la virulencia de las cepas individuales se evaluó mediante experimentos de reto para la determinación de ID50. Las dosis empleadas para los experimentos de reto con aguja oscilaron entre 20 y 50 veces la ID50. Cuatro semanas después del reto con aguja, se sacrificaron los ratones y se recolectaron sangre y tejidos para métodos de lectura con el propósito de determinar el estado de la infección.
Reto con garrapata de ratones inmunizados y recolección de sueros y tejidos (denominado en la presente descripción, además, como "Método de Reto con garrapata")
Para retar a los ratones inmunizados con B. afzelii, se retiró el pelo de la parte posterior de cada ratón con Crema Veet® (Reckitt Benckiser, Reino Unido) y se pegó un pequeño recipiente ventilado a la piel con súper pegamento (Pattex, Alemania). Posteriormente, se aplicaron una o dos ninfas de I. ricinus infectadas con B. afzelii, cepa IS1, por ratón, se les permitió que se unieran y se alimentaran hasta que estuvieran completamente hinchadas y se cayeran. El estado de alimentación se controló para cada garrapata individual y solo se incluyeron ratones en los que se recolectó al menos una garrapata completamente alimentada en la lectura final.
Resultados
Los heterodímeros del fragmento de OspA mutante lipidada que no estaban etiquetados con His se combinaron en una proporción 1:1:1 y se evaluó la capacidad protectora contra el reto con Borrelia. Los ratones inmunizados se retaron con B. afzelii (ST2, cepa IS1, reto con garrapata) o con B. burgdorferi s.s. (ST1, cepa ZS7, reto con aguja) en dos experimentos cada uno. Otros antígenos basados en OspA incluyeron Lip-S1D1-S2D2 en los cuatro experimentos y Lip-OspA1-His y OspA quimérica lipidada ST1/ST2 en los Experimentos 15 y 16. Un grupo de ratones inmunizados solo con adyuvante de Al(OH)3 sirvió como grupo de control negativo en cada experimento. Para el reto con garrapatas, se aplicaron 1-2 garrapatas por ratón y solo los ratones a partir de los cuales al menos se alimentó una garrapata hasta que se hinchó completamente, se incluyeron en la lectura final. Sin embargo, no se hizo distinción entre ratones de los cuales se recolectaron una o dos garrapatas completamente alimentadas. Los datos de protección de los cuatro experimentos se resumen en la Tabla 5.
La vacuna combinada que contenía tres heterodímeros de fragmentos mutantes de OspA lipidada en una proporción 1:1:1 confirió una protección estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher, dos colas) en los cuatro experimentos de reto en comparación con el grupo de control negativo. El estado infeccioso de cada ratón se determinó mediante el uso de ELISA VlsE en combinación con qPCR de recA. Se consideró que un ratón estaba infectado cuando al menos un método dio un resultado positivo.
Ejemplo 6 Unión de anticuerpos de los sueros de ratones inmunizados con heterodímeros del fragmento de OspA mutante a la superficie celular de Borrelia
Procedimientos experimentales
Inmunización de ratones
Se usaron ratones hembra C3H/HeN para todos los estudios. Antes de cada reto, se sangraron grupos de veinte ratones de 8 semanas de edad a través de la vena facial y se prepararon y agruparon sueros preinmune. Se administraron tres inmunizaciones por vía s.c.de 100 pl cada una a intervalos de dos semanas. Cada dosis contenía 1 mg de cada una de las proteínas respectivas: Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 y Lip-SSD1-S6D1 (vacuna combinada), o 1 pg de proteína de OspA lipidada de longitud completa (ST1-ST6 como se indica) o 1 pg de heterodímero OspA solo (Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 o Lip-SSD1-S6D1, como se indica) adyuvante con hidróxido de aluminio a una concentración final de 0,15 %. El control negativo (placebo) fue solo adyuvante de Al(OH)3. Una semana después de la tercera inmunización, se recolectó sangre de la vena facial y se prepararon sueros hiperinmunes. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la ley austriaca (BGB1 Nr.
501/1989) y se aprobaron por "Magistratsabteilung 58".
Citometría de flujo para evaluar la unión a Borrelia
La s espiroquetas ( 1 x 106) se m ezclaron con un volum en igual de paraform aldehído al 4 % y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en una placa de 96 pocillos (Nunclon 96U, Nunc). La placa se centrifugó durante 5 minutos a 2 000 g y se desechó el sobrenadante. La s célu las se lavaron con 150 pl de H B S S con B S A al 2 % (H B S S -B), se centrifugaron como se indicó anteriormente y se desechó el sobrenadante. Los sueros de ratón se inactivaron por calor incubándolos a 56 ° C durante 35 minutos. Los sueros inactivados por calor se diluyeron en H B S S -B y se esterilizaron por filtración centrifugación a 4000 g durante 3 minutos mediante el uso de tubo de centrífuga con filtros C o star sp in -X (0,22 pm, Corning, EE .U U .). La s espiroquetas se disolvieron en 100 pL de suero y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se centrifugó durante 15 minutos a 2 000 g y se desechó el sobrenadante. La s célu las se lavaron una vez con 150 pL de H B S S -B y después se disolvieron en 100 pL de H B S S -B . S e añadió un microlitro de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón generado en cabra conjugado con P E , Beckm an Coulter, E E .U U .) a las célu las y se incubó a temperatura am biente durante 45 minutos en la oscuridad. Las espiroquetas se lavaron una vez con 150 pl de H B S S -B y d esp ués se disolvieron en 200 pL de H B S S que contenía colorante de A D N S Y T O -17 2 ,5 pM y se incubaron durante 10 minutos a temperatura am biente en la oscuridad. Las espiroquetas teñidas se sedim entaron mediante centrifugación durante 5 minutos a 2 000 g y posteriormente se disolvieron en 200 pl de H B S S . La s espiroquetas m arcadas se midieron con un citómetro de flujo F C 500 (Beckm an Coulter), en el portal para eventos positivos S Y T O -17. Los valores obtenidos con sueros del grupo inm unizado con placebo se restaron de los valores observados con sueros de los grupos inm unizados con heterodímero para controlar la unión no específica.
Resultados
La unión de anticuerpos de los sueros de ratón hiperinmune se observó en el caso de diferentes Borreliae que expresan los se is serotipos de O spA , lo que indica que los anticuerpos generados en respuesta a todos los antígenos son activos funcionalm ente y pueden unirse a O sp A nativa in situ. La intensidad de fluorescencia fue lineal en un amplio intervalo de diluciones de suero. P ara la m ayoría de los serotipos de OspA, la intensidad de fluorescencia observada con los sueros generados con heterodím eros fue com parable a la intensidad de fluorescencia observada con sueros generados con O sp A de longitud completa lipidada.
Ejem plo 7 Estudios de formulación
S e realizaron estudios con respecto a la formulación de la vacun a com binada de la invención para optimizar la estabilidad. S e evaluaron diferentes tipos de tam pones y estabilizadores a d iversas concentraciones en com binación con hidróxido de aluminio y antígeno. S e determinó una formulación óptima de 40 mg/m L de cada uno de los tres heterodím eros (120 pg de proteína total), fosfato de sodio 10 pM, cloruro de sodio 150 pM, L-m etionina 10 pM, sa caro sa al 5 % , Tw een 20 al 0,05 % (polisorbato 20) e hidróxido de alum inio al 0 ,15 % (p/v) a pH 6,7 0,2.
S e cu e n cia s
S E Q ID NO: 1
S 2 D 0 -H is : am inoácidos de las posiciones 131 -273 de Borrelia afzelii cepa K78, O sp A de serotipo 2, secuen cia de tipo silvestre, etiqueta His C-term inal (G L E H H H H H H )
E L S A K T M T R E N G T K L E Y T E M K S D G T G K A K E V L K N F T L E G K V A N D K V T L E V K E G T V T L S K E IA K S G E V T V A L N D T N T T Q A T K K T G A W D S K T S T L T IS V N S K K T T Q L V F T K Q D T IT V Q K Y D S A G T N L E G T A V E IK T L D E L K N A L K G L E H H H H H H S E Q ID NO: 2
S 2 D 1 -H is : aa 131 -273 de Borrelia afzelii cepa K78, O sp A de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1 (aa 182 y 269), etiqueta His C-term inal (G L E H H H H H H )
E L S A K T M T R E N G T K L E Y T E M K S D G T G K A K E V L K N F T L E G K V A N D K V T L E V K C G T V T L S K E IA K S G E V T V A L N D T N T T Q A T K K T G A W D S K T S T L T IS V N S K K T T Q L V F T K Q D T IT V Q K Y D S A G T N L E G T A V E IK T L D E L C N A L K G L E H H H H H H S E Q ID NO: 3
S 2 D 2 -H is : aa 131 -273 de Borrelia afzelii cepa K78, O sp A de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 2 (aa 182 y 272), etiqueta His C-term inal (G L E H H H H H H )
E L S A K T M T R E N G T K L E Y T E M K S D G T G K A K E V L K N F T L E G K V A N D K V T L E V K CG T V T L S K E IA K S G E V T V A L N D T N T T Q A T K K T G A W D S K T S T L T IS V N S K K T T Q L V F T K Q D T IT V Q K Y D S A G T N L E G T A V E IK T L D E L K N A CK G L E H H H H H H S E Q ID NO: 4
S 2 D 3 -H is : aa 131 -273 de Borrelia afzelii cepa K78, O sp A de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 3 (aa 244 y 259), etiqueta His C-term inal (G L E H H H H H H )
E L S A K T M T R E N G T K L E Y T E M K S D G T G K A K E V L K N F T L E G K V A N D K V T L E V K E G T V T L S K E IA K S G E V T V A L N D T N T T Q A T K K T G A W D S K T S T L T IS V N S K K T T Q L V F T K Q D T ICV Q K Y D S A G T N L E G T CV E IK T L D E L K N A L K G L E H H H H H H S E Q ID NO: 5
S 2 D 4 -H is : aa 131 -273 de Borrelia afzelii cepa K78, O sp A de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 (aa 141 y 241), etiqueta His C-term inal (G L E H H H H H H )
ELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 6
S2D5-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 5 (aa 165 y 265), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNCTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTCDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 7
S2D6-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 6 (aa 185 y 272), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTCTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNACKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 8
S2D7-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 7 (aa 199 y 223), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTCALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTCTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 9
S2D8-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 8 (aa 243 y 262), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTCTVQKYDSAGTNLEGTAVECKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 10
S2D9-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 9 (aa 184 y 204), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGCVTLSKEIAKSGEVTVALNDCNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 11
S2D10-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 10 (aa 201 y 214), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH)
ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVACNDTNTTQ ATKKTCAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 12
S2D11-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 11 (aa 246 y 259), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVCKYDSAGTNLEGTCVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 13
S2D12-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 12 (aa 167 y 178), etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTCEGKVANDKVTCEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTT QATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 14
Señal de lipidación de OspA de Borrelia
MKKYLLGIGLILALIA
SEQ ID NO: 15
Señal de lipidación de OspB de Borrelia
MRLLIGFALALALIG
SEQ ID NO: 16
Señal de lipidación Ipp de E. coli
MKATKLVLGAVILGSTLLAG
SEQ ID NO: 17
Secuencia similar a hLFA-1 de B. burgdorferi s.s. cepa B31
GYVLEGTLTAE
SEQ ID NO: 18
Secuencia no similar a hLFA-1 de B. afzelii cepa K78
NFTLEGKVAND
SEQ ID NO: 19
B. afzelii (cepa K78; OspA de serotipo 2)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSASVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLKATVDKIELKGTSDKDNGSGVLEGT KDDKSKAKLTIADDLSKTTFELFKEDGKTLVSRKVSSKDKTSTDEMFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGK AKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLV FTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 20
B. burgdorferi s.s. (cepa B31, OspA de serotipo 1)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDGKYDLIATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGV KADKSKVKLTISDDLGQTTLEVFKEDGKTLVSKKVTSKDKSSTEEKFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKA KEVLKGYVLEGTLTAEKTTLWKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFT KENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO: 21
B. garinii (cepa PBr, OspA de serotipo 3)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKSNGSGVLEG EKADKSKAKLTISQDLNQTTFEIFKEDGKTLVSRKVNSKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGK AKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQL VFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
SEQ ID NO: 22
B. bavariensis (cepa PBi, OspA de serotipo 4)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVDKLELKGTSDKSNGSGTLEG EKSDKSKAKLTISEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVNSKDKSSIEEKFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAK EVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTWLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKE DTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 23
B. garinii (cepa PHei, OspA de serotipo 5)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMKVLVSKEKDKDGKYSLMATVEKLELKGTSDKNNGSGTLEG EKTDKSKVKLTIAEDLSKTTFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAK EVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFT KEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 24
B. garinii (cepa DK29, OspA de serotipo 6)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGGMTVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGTLEG EKTDKSKVKSTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGK AKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLV FTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 25
B. garinii (cepa T25, OspA de serotipo 7)
MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEG VKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGK AKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLV FTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK
SEQ ID NO: 26
Cebador directo
GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG
SEQ ID NO: 27
Cebador inverso
GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG
SEQ ID NO: 28
Cebador directo anidado
AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG
SEQ ID NO: 29
Cebador inverso anidado
GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA
SEQ ID NO: 30
Péptido 25-mer
MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK
SEQ ID NO: 31
Catelina de ratón
RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE
SEQ ID NO: 32
5'-(dldC)13-3'
dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC dldC
SEQ ID NO: 33
Péptido KLK
KLKLLLLLKLK
SEQ ID NO: 34
B. afzelii (cepa K78, serotipo 2), OspA aa 126-273 FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALND TNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEI KTLDELKNALK
SEQ ID NO: 35
B. afzelii (cepa K78, serotipo 2), OspA aa 131-273 ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALK
SEQ ID NO: 36
péptido enlazador
GGGGGGGG
SEQ ID NO: 37
péptido enlazador
GGGGGGGGGGGG
SEQ ID NO: 38
péptido enlazador
GAGA
SEQ ID NO: 39
péptido enlazador
GAGAGAGA
SEQ ID NO: 40
péptido enlazador
GAGAGAGAGAGA
SEQ ID NO: 41
péptido enlazador
GGGSGGGS
SEQ ID NO: 42
péptido enlazador
GGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO: 43
S1 D4-S2D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 1 y 2, ambas con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA del serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND FNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDT DSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIA KSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNS KKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 44
Lip-S1 D4-S2D4_nt: Secuencia de codificación para proteínas de fusión de OspA de los serotipos 1 y 2, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar hLFA-1 NFTLEGKVAND ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAGTCTCGGAAAAAATCATTACCCGTGCTTGCGGCACCCGTCTGGAATACACCGGCATTAAAT CGGATGGCAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAGACC ACCCTGGTGGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAGTCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACT GAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAAAAGACGGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATT ACGGTTAATTCCAAAAAGACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGC AACGGTACCAAACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCAAAAATGCTCTGAAAGGTAC TAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGA ACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACC GGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGT GAAAGAAGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGA ATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAACAGC AAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAATGTACGATCACCGTGCAGAAATACGATAGTGCGGGTACCAA CCTGGAAGGCACCGCTGTT GAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAA
SEQ ID NO: 45
Lip-S1D4-S2D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 1 y 2, ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia del enlazador LN1, aa 164­ 174 de OspA del serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTL SKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 46
Lip-S1D4-S2D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 1 y 2, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA del serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAGTCTCGGAAAAAATCATTACCCGTGCTTGCGGCACCCGTCTGGAATACACCGGCATTAAAT CGGATGGCAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAGACC ACCCTGGTGGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAGTCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACT GAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAAAAGACGGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATT ACGGTTAATTCCAAAAAGACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGC AACGGTACCAAACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCAAAAATGCTCTGAAAGGTAC TAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGA ACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACC GGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGT GAAAGAAGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGA ATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAACAGC AAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAATGTACGATCACCGTGCAGAAATACGATAGTGCGGGTACCAA CCTGGAAGGCACCGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAAGGCCTC GAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 47
S1D1-S2D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar hLFA-1 NFTLEGKVAND FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDT DSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEI AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNS KKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 48
Lip-S1D1-S2D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar hLFA-1 NFTLEGKVAND ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCT GGGTT CTACTCTGCTGGCAGGTT GCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAA TCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTT CTGAAAAACTTT ACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGAT AAAAC CACCCTGGTGGTGAAATGCGGCACCGTT ACGCTGAGCAAAAACATT AGTAAATCCGGT GAAGTCTCT GTGGAAC TGAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATT ACGGTTAATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGC AATGGTACCAAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCTGTAATGCTCTGAAAGGTACT AGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGA ACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACC GGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGT GAAATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGA ATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAATAGC AAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGTGCGGGTACCAA CCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAA
SEQ ID NO: 49
Lip-S1D1-S2D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia del enlazador LN1, aa 164­ 174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVT LSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLD ELCNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 50
Lip-S1D1-S2D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAA TCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAAC CACCCTGGTGGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAAC TGAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATT ACGGTTAATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGC AATGGTACCAAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCTGTAATGCTCTGAAAGGTACT AGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGA ACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACC GGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGT GAAATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGA ATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAATAGC AAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGTGCGGGTACCAA CCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAAGGCCTCG AGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 51
S3D4-S4D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1 FNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALND TETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPA
EIKDLAELKAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGT LAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVN SKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 52
Lip-S3D4-S4D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4, s e ñ a l d e l ip id a c ió n l p p d e E. c o l i , secuencia DEL ENLAZADOR LN1
ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCT GGGTT CTACTCTGCTGGCAGGTT GCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCAAACTGTCAGAAAAAGTGGTCACCCGCGCTTGTGGCACCCGCCTGGAATACACCGAAATCAAAA ACGACGGCTCGGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTT GCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGA AACCAAACTGACCGTGACGGAAGGCACCGTT ACGCTGT CTAAAAACATT AGCAAGTCT GGTGAAATCACGGTCG CACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCT GAC CATTT CAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAATGCACGAT CACCGTGCAGAACTATAA TCGTGCCGGTAAT GCTCTGGAAGGCTCCCCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCGGAACTGAAGGCGGCACT GAAA GGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATT CAACGCTAAA GGTGAACTGTCGGAAAAAACCATCCTGCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAGTCGGACG GCACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCT GAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACG ATAGCAATTCTACGCAGGCGACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGTC AACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAATGCACGATCACCGTTCAAAAATATGATTCCGCAGGT ACCAACCTGGAAGGCAACGCTGTGGAAATCAAAACCCTGGACGAACT GAAAAATGCT CTGAAG
SEQ ID NO: 53
Lip-S3D4-S4D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEIT VALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVV LSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTL TISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 54
Lip-S3D4-S4D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 y
OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCAAACTGTCAGAAAAAGTGGTCACCCGCGCTTGTGGCACCCGCCTGGAATACACCGAAATCAAAA ACGACGGCTCGGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGA AACCAAACTGACCGTGACGGAAGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCG CACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGAC CATTTCAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTGCAGAACTATAA TCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCCCCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCGGAACTGAAGGCGGCACTGAAA GGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGCTAAA GGTGAACTGTCGGAAAAAACCATCCTGCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAGTCGGACG GCACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCT GAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACG ATAGCAATTCTACGCAGGCGACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGTC AACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAATGCACGATCACCGTTCAAAAATATGATTCCGCAGGT ACCAACCTGGAAGGCAACGCTGTGGAAATCAAAACCCTGGACGAACT GAAAAATGCT CTGAAGGG TCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 55
S3D1-S4D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 3 y 4, ambas con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1 FNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALND TETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALKGTSDKNNG SGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHI PNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVN SKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 56
Lip-S3D1-S4D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de los serotipos 3 y 4, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación de Ipp E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCAAACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAA AACGATGGTAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTG AAACCAAACTGACCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTC GCACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGA CCATTTCAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATA ATCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAA AGGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGCTAA AGGTGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATG GTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCT GAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTT CTGAGCAAACAT ATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTT GAACTGAACG ATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAAT ACCTCCACGCTGACCATTTCAGTC AACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTT CACGAAGGAAGATACGATCACCGTT CAAAAATAT GACTCCGCGGGC ACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAATGCTCTGAAG
SEQ ID NO: 57
Lip-S3D1-S4D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 3 y 4, ambas con enlace disulfuro
tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEIT VALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVV LSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTL TISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 58
Lip-S3D1-S4D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 3 y 4, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCAAACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAA AACGATGGTAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTG AAACCAAACTGACCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTC GCACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGA CCATTTCAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATA ATCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAA AGGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGCTAA AGGTGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATG GTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCT GAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACG ATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGTC AACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGC ACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAATGCTCTGAAGGGTC
TCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 59
S5D4-S6D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipos 5 y 6 ambas con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1 FNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTD SSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSGS KEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILK SGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQ KTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 60
Lip-S5D4-S6D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipos 5 y 6, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAATCAGTGAAAAAACCATTGTGCGTGCGTGTGGCACCCGTCTGGAATATACCGACATCAAGA GCGATAAAACGGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAA ACCACGCTGAAGGTGACCGAAGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGC CCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACGATCACCGTGCAAAACTATGATAGCG CAGGTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAGGTACT AGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGCAAAGGTGA AACGAGTGAAAAAACGATTGTTCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGATATCAAGTCGGATGGTTCGG GCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAG GTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACAG CGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAACT CCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGATAGTGCGGGCACC AACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO: 61
Lip-S5D4-S6D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipos 5 y 6 ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVA LDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDKNN GSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLS KNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 62
Lip-S5D4-S6D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión de OspA de serotipos 5 y 6, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAATCAGTGAAAAAACCATTGTGCGTGCGTGTGGCACCCGTCTGGAATATACCGACATCAAGA GCGATAAAACGGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAA ACCACGCTGAAGGTGACCGAAGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGC CCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACGATCACCGTGCAAAACTATGATAGCG CAGGTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAGGTACT AGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGCAAAGGTGA AACGAGTGAAAAAACGATTGTTCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGATATCAAGTCGGATGGTTCGG GCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAAG GTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGTCAA
AAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACC GGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCAC CAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGATAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTA CCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAGG TCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 63
S5D1-S6D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6, ambas con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1 FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTD SSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGS KEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILK SGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQ KTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
SEQ ID NO: 64
Lip-S5D1-S6D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de los serotipos 6, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAAT CAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAA ACCACGCTGAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGC CCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTT CACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTAT GACAGC GCAGGTACCAATCT GGAAGGCAAAGCTGTGGAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGTGT AATGCTCTGAAAGGTAC TAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATT CAACGGCAAAGGTG AAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAATCGGACGGCAG CGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTG AAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGA CAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAAT GGGATAGCAAGACCTCTACGCTGACCATT AGTGTCA ACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGACAGTGCGGGC ACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTT GAAATT ACCACGCT GAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO: 65
Lip-S5D1-S6D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6, ambas con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITV ALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVL SKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 66
Lip-S5D1-S6D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6 de, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCT GGGTT CTACTCTGCTGGCAGGTT GCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAAT CAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAA ACCACGCTGAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGC CCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGC GCAGGTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAGGTAC TAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGCAAAGGTG AAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAATCGGACGGCAG CGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTG AAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGA CAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCA ACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGACAGTGCGGGC ACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAG GTCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 67
S2D4-S1D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 2 y 1, ambas con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 del serotipo 1 de OspA sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND FNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALND TNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGTSDKNNGS GSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNIS KSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSK KTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO: 68
Lip-S2D4-S1D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de los serotipos 2 y 1, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164 -174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAA GCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTC ACCCTGGAAGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCT GAACGATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTA GTGTTAACAGCAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAATGTACGATCACCGTGCAGAAATACGATAGT GCGGGTACCAACCTGGAAGGCACCGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAAGGCA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGC GAAGTCTCGGAAAAAATCATTACCCGTGCTTGCGGCACCCGTCTGGAATACACCGGCATTAAATCGGATGGCAG CGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAGACCACCCTGGTGG TGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAGTCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATACC GACAGCTCTGCGGCCACCAAAAAGACGGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTACGGTTAATTC CAAAAAGACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAACGGTACCA AACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCAAAAATGCACTGAAA
SEQ ID NO: 69
Lip-S2D4-S1D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 2 y 1, ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, secuencia del enlazador LN1, aa 164­ 174 del serotipo 1 de OspA sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVT LSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLD EIKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 56
Lip-S2D4-S1D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 2 y 1, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 del serotipo 1 de OspA sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCT GGGTT CTACTCTGCTGGCAGGTT GCTCAAGCTTCAA CGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACT
GGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCA AAGTCGCCAATGACAAAGT CACCCTGGAAGTGAAAGAAGGCACCGTT ACGCTGTCAAAAGAAATT GCAAAATCG GGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCA AAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAACAGCAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAATGTACGATCA CCGTGCAGAAATACGATAGTGCGGGTACCAACCTGGAAGGCACCGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTG AAAAACGCCCTGAAAGGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTA CTCATTCAACGAAAAAGGCGAAGTCTCGGAAAAAATCATTACCCGTGCTTGCGGCACCCGTCTGGAATACACCG GCATTAAATCGGATGGCAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAAT GATAAGACCACCCTGGTGGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAGTCCGGTGAAGTCTC TGTGGAACTGAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAAAAGACGGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACG CTGACCATTACGGTTAATTCCAAAAAGACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACCATCACGGTGCAGCAA TATGACAGCAACGGTACCAAACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCAAAAATGCACT GAAAGGTCTC GAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 71
S2D1-S1D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 2 y 1, ambas con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 del serotipo 1 de OspA sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALND TNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGS GSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNIS KSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSK KTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALK
SEQ ID NO: 72
Lip-S2D1-S1D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de los serotipos 2 y 1, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164 -174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATAT ACGGAAATGAAAA GCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTC ACCCTGGAAGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCT GAACGATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTA GTGTTAATAGCAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGT GCGGGTACCAACCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAAGGCA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGC GAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAATCGGACGGCA GCGGCAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAACCACCCTGGTG GTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATAC CGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTACGGTTAATA GCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAATGGTACC AAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACT GGATGAAATCTGTAATGCACTGAAA
SEQ ID NO: 57
Lip-S2D1-S1D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 2 y 1 de, ambas con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 del serotipo 1 de OspA sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVT LSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 74
Lip-S2D1-S1 D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 2 y 1, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 del serotipo 1 de OspA sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATAT ACGGAAATGAAAA GCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTC ACCCTGGAAGT GAAATGCGGCACCGTT ACGCTGTCAAAAGAAATT GCAAAATCGGGT GAAGTGACCGTT GCTCT GAACGATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTA GTGTTAAT AGCAAGAAAACCACGCAGCT GGTCTT CACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGT GCGGGTACCAACCTGGAAGGCACGGCTGTT GAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGT AACGCCCTGAAAGGCA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGC GAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAATCGGACGGCA GCGGCAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAACCACCCTGGTG GTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATAC CGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTACGGTTAATA GCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAATGGTACC AAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCTGTAATGCACTGAAAGGTCTCG AGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 75
S4D4-S3D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 4 y 3, ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 FNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSN STQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGTSDKNNGSGS KEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNIS KSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNS QKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
SEQ ID NO: 76
Lip-S4D4-S3D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de los serotipos 4 y 3, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGCTAAAGGTGAACTGTCGGAAAAAACCATCCTGCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAGT CGGACGGCACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAAC CACGCTGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAAC TGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCGACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATT TCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAATGCACGATCACCGTTCAAAAATATGATTCC GCAGGTACCAACCTGGAAGGCAACGCTGTGGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAGGGTA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCA AACTGTCAGAAAAAGTGGTCACCCGCGCTTGTGGCACCCGCCTGGAATACACCGAAATCAAAAACGACGGCTCG GGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGA CCGTGACGGAAGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGAT ACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAA CTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTA ATGCTCTGGAAGGCTCCCCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCGGAACTGAAGGCGGCACTGAAA
SEQ ID NO: 77
Lip-S4D4-S3D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 4 y 3 ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH)
LipCSSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVE LNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT ISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 78
Lip-S4D4-S3D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 4 y 3, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGCTAAAGGTGAACTGTCGGAAAAAACCATCCTGCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAGT CGGACGGCACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAAC CACGCTGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAAC TGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCGACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATT TCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAATGCACGATCACCGTTCAAAAATATGATTCC GCAGGTACCAACCTGGAAGGCAACGCTGTGGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAGGGTA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCA AACTGTCAGAAAAAGTGGTCACCCGCGCTTGTGGCACCCGCCTGGAATACACCGAAATCAAAAACGACGGCTCG GGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTT GCCCT GGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGA CCGTGACGGAAGGCACCGTT ACGCTGTCT AAAAACATT AGCAAGTCTGGT GAAATCACGGTCGCACTGAATGAT ACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAA CTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTT CACCAAAGAAT GCACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTA ATGCTCTGGAAGGCTCCCCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCGGAACT GAAGGCGGCACTGAAAGGT CTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 79
S4D1-S3D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 4 y 3, ambas con enlace disulfuro tipo
1, secuencia del enlazador LN1 FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTWLSKHIPNSGEITVELNDSNS TQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSK EKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISK SGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNS QKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO: 80
Lip-S4D1-S3D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de los serotipos 4 y 3, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA TGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAAT CCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAAC CACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAAC TGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATT TCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCC GCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCA AACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAAAACGATGGTAGC GGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGA CCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGAT ACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAA CTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTA ATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAAA
SEQ ID NO: 81
Lip-S4D1-S3D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 4 y 3, ambas con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVE LNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT ISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 82
Lip-S4D1-S3D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 4 y 3, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA TGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAAT CCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAAC CACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAAC TGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATT TCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCC GCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCA AACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAAAACGATGGTAGC GGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGA CCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGAT ACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAA CTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTA ATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAAAGGTCT CGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 83
S6D4-S5D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6 y 5, ambas con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1 FNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDS DTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISK SGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRT KTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 84
Lip-S6D4-S5D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de los serotipos 6 y 5, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCT GGGTT CTACTCTGCTGGCAGGTT GCTCAAGCTTCAA CGGCAAAGGTGAAACGAGTGAAAAAACGATTGTTCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGATATCAAGT CGGATGGTTCGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAA AACCACGCTGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTT CTGT CAAAAAACATT CTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAG CTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGAC CATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAATGCACGAT CACCGTT CAACGCTATGA TAGTGCGGGCACCAACCT GGAAGGCAAAGCCGTT GAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAG GTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAG GCGAAATCAGTGAAAAAACCATTGTGCGTGCGTGTGGCACCCGTCTGGAATATACCGACATCAAGAGCGATAAA ACGGGTAAAGCGAAGGAAGTT CTGAAAGATTTT ACGCTGGAAGGTACCCT GGCAGCAGACGGTAAAACCACGCT GAAGGTGACCGAAGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATG ACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAAT CGTACGAAA
ACCAAGCAGCT GGTCTT CACGAAAGAATGCACGATCACCGTGCAAAACTAT GATAGCGCAGGTACCAATCT GGA AGGCAAAGCT GTGGAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO: 60
Lip-S6D4-S5D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6 y 5, ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWLSKNILKSGEITA ALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDK NNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTI SKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 86
Lip-S6D4-S5D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6 y 5, ambas con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCT GGGTT CTACTCTGCTGGCAGGTT GCTCAAGCTTCAA CGGCAAAGGTGAAACGAGT GAAAAAACGATT GTTCGCGCCTGTGGCACCCGCCT GGAATACACGGATAT CAAGT CGGATGGTT CGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAA AACCACGCTGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTT CTGT CAAAAAACATT CTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAG CTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGAC CATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGA TAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAG GTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAG GCGAAATCAGTGAAAAAACCATTGTGCGTGCGTGTGGCACCCGTCTGGAATATACCGACATCAAGAGCGATAAA ACGGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCT GAAGGTGACCGAAGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATG ACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAAT CGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACGATCACCGTGCAAAACTATGATAGCGCAGGTAC CAATCTGGAAGGCAAAGCT GTGGAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAGG TCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 87
S6D1-S5D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6 y 5, ambas con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1 FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALDDS DTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISK SGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRT KTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK SEQ ID NO: 88
Lip-S6D1-S5D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de los serotipos 6 y 5, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGGCAAAGGTGAAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAA TCGGACGGCAGCGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTA AAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCA GCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGAC CATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGA CAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAG GTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAG GCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAATCAGACAAG ACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCT GAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATG ACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAAT CGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGCGCAGGTAC CAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO: 89
Lip-S6D1-S5D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6 y 5, ambas con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITA ALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDK NNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTL TISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 90
Lip-S6D1-S5D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6 y 5, ambas con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGGCAAAGGTGAAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAA TCGGACGGCAGCGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTA AAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCA GCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGAC CATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGA CAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTT GAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCT GAAAG GTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAG GCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAATCAGACAAG ACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCT GAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATG ACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATT CAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAAT CGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTT CACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTAT GACAGCGCAGGTAC CAATCTGGAAGGCAAAGCT GTGGAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCT GAAAGGT CTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 91
S1D4-S2D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND FNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDT DSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEI AKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNS KKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 61
Lip-S1D4-S2D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAGTCTCGGAAAAAATCATTACCCGTGCTTGCGGCACCCGTCTGGAATACACCGGCATTAAAT CGGATGGCAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTT CTGAAAAACTTT ACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAGACC ACCCTGGTGGTGAAAGAAGGCACCGTT ACGCTGAGCAAAAACATT AGTAAGTCCGGT GAAGTCTCT GTGGAACT GAATGATACCGACAGCTCT GCGGCCACCAAAAAGACGGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCT GACCATT ACGGTT AATT CCAAAAAGACCAAAGATCTGGTCTT CACGAAAGAATGCACCAT CACGGTGCAGCAATATGACAGC AACG
GTACCAAACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCAAAAATGCTCTGAAAGGTACTAGT GACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGAACT GTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACCGGT AAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGTGAA ATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGAATA CCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAATAGCAAG AAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGTGCGGGTACCAACCT GGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAA
SEQ ID NO: 93
Lip-S1D4-S2D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVT LSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLD ELCNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 94
Lip-S1D4-S2D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAGTCTCGGAAAAAATCATTACCCGTGCTTGCGGCACCCGTCTGGAATACACCGGCATTAAAT CGGATGGCAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAGACC ACCCTGGTGGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAGTCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACT GAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAAAAGACGGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATT ACGGTTAATTCCAAAAAGACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGC AACGGTACCAAACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCAAAAATGCTCTGAAAGGTAC TAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGA ACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACC GGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGT GAAATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGA ATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAATAGC AAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGTGCGGGTACCAA CCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAAGGCCTC GAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 95
S1D1-S2D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDT DSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIA KSGEVTVALNDTNTT QATKKT GAWDSKTSTLTISVNS KKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 96
Lip-S1D1-S2D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1 y serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND
ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAA TCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAAC CACCCTGGTGGTGAAATGCGGCACCGTT ACGCTGAGCAAAAACATT AGTAAATCCGGT GAAGTCTCT GTGGAAC TGAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCT GACCATT ACGGTT AATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGC AATGGTACCAAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCT GTAAT GCTCTGAAAGGTACT AGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATT CAACGAAAAAGGCGA ACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACC GGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGT GAAAGAAGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGA ATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAACAGC AAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAATGTACGATCACCGTGCAGAAATACGATAGTGCGGGTACCAA CCTGGAAGGCACCGCTGTT GAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAA
SEQ ID NO: 97
Lip-S1D1-S2D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTL SKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 63
Lip-S1D1-S2D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hl_FA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAA TCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAAC CACCCTGGTGGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAAC TGAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATT ACGGTTAATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGC AATGGTACCAAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACTGGATGAAATCTGTAATGCTCTGAAAGGTACT AGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATT CAACGAAAAAGGCGA ACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAAGCGATGGCACC GGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTCACCCTGGAAGT GAAAGAAGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCTGAACGATACGA ATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAACAGC AAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAATGTACGATCACCGTGCAGAAATACGATAGTGCGGGTACCAA CCTGGAAGGCACCGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAAGGCCTCG AGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 99
S3D4-S4D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1 FNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALND TETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKGTSDKNNG SGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHI PNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVN SKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 100
Lip-S3D4-S4D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCAAACTGTCAGAAAAAGTGGTCACCCGCGCTTGTGGCACCCGCCTGGAATACACCGAAATCAAAA ACGACGGCTCGGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGA AACCAAACTGACCGTGACGGAAGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCG CACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGAC CATTTCAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTGCAGAACTATAA TCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCCCCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCGGAACTGAAGGCGGCACTGAAA GGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGCTAAA GGTGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGG TACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTT GCTCT GGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTG AAGGTGACGT GCGGCACCGTGGTT CTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAAT CACCGTT GAACTGAACGA TAGCAATT CTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAAT GGGACAGTAAT ACCTCCACGCTGACCATTTCAGTCA ACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTT CACGAAGGAAGATACGATCACCGTT CAAAAATAT GACTCCGCGGGCA CCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAATGCTCTGAAG
SEQ ID NO: 101
Lip-S3D4-S4D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEIT VALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVV LSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLD ELCNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 102
Lip-S3D4-S4D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, Etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCAAACTGTCAGAAAAAGTGGTCACCCGCGCTTGTGGCACCCGCCTGGAATACACCGAAATCAAAA ACGACGGCTCGGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGA AACCAAACTGACCGTGACGGAAGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCG CACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGAC CATTTCAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTGCAGAACTATAA TCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCCCCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCGGAACTGAAGGCGGCACTGAAA GGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGCTAAA GGTGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAATCCGATGG TACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGCTG AAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAACGA TAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGTCA ACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCCGCGGGCA CCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAATGCTCTGAAGGG TCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 103
S3D1-S4D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1 FNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALND TETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPA
EIKDLAELCAALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGT LAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDS AGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 104
Lip-S3D1-S4D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCAAACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAA AACGATGGTAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTG AAACCAAACTGACCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTC GCACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGA CCATTTCAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATA ATCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAA AGGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGCTAA AGGTGAACTGTCGGAAAAAACCATCCTGCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAGTCGGAC GGCACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGC TGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAAC GATAGCAATTCTACGCAGGCGACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGT CAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAATGCACGATCACCGTTCAAAAATATGATTCCGCAGG TACCAACCTGGAAGGCAACGCTGTGGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAATGCTCTGAAG
S E Q ID NO: 105
Lip-S3D1-S4D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEIT VALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVV LSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTL TISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 106
Lip-S3D1-S4D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, Etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCAAACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAA AACGATGGTAGCGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTG AAACCAAACTGACCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTC GCACTGAATGATACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGA CCATTTCAAAGAACTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATA ATCGTGCCGGTAATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAA AGGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGCTAA AGGTGAACTGTCGGAAAAAACCATCCTGCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAGTCGGAC GGCACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAACCACGC TGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAACTGAAC GATAGCAATTCTACGCAGGCGACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATTTCAGT CAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAATGCACGATCACCGTTCAAAAATATGATTCCGCAGG TACCAACCTGGAAGGCAACGCTGTGGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAATGCTCTGAAGGG TCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 107
S5D4-S6D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1 FNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTD SSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSGS KEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILK SGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQ KTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
SEQ ID NO: 108
Lip-S5D4-S6D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAATCAGTGAAAAAACCATTGTGCGTGCGTGTGGCACCCGTCTGGAATATACCGACATCAAGA GCGATAAAACGGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAA ACCACGCTGAAGGTGACCGAAGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGC CCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACGATCACCGTGCAAAACTATGATAGCG CAGGTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAGGTACT AGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGCAAAGGTGA AACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAATCGGACGGCAGC GGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAA GGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACA GCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAAC TCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGACAGTGCGGGCAC CAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO: 109
Lip-S5D4-S6D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVA LDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDKNN GSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLS KNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 110
Lip-S5D4-S6D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, Etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCT GGGTT CTACTCTGCTGGCAGGTT GCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAATCAGTGAAAAAACCATTGTGCGTGCGTGTGGCACCCGTCTGGAATATACCGACATCAAGA GCGATAAAACGGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAA ACCACGCTGAAGGTGACCGAAGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGC CCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACGATCACCGTGCAAAACTATGATAGCG CAGGTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAGGTACT AGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGCAAAGGTGA AACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAATCGGACGGCAGC GGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAA GGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACA GCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAAC TCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGACAGTGCGGGCAC CAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAGGTCTCGAGCACC ACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 111
S5D1-S6D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1 FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTD SSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSGS KEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILK SGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQ KTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 112
Lip-S5D1-S6D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAAT CAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAA ACCACGCTGAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGC CCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGC GCAGGTACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAGGTAC TAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGGCAAAGGTG AAACGAGTGAAAAAACGATTGTTCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGATATCAAGTCGGATGGTTCG GGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAA GGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACA GCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAAC TCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGATAGTGCGGGCAC CAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO: 113
Lip-S5D1-S6D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITV ALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVL SKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKE LKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 66
Lip-S5D1-S6D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, Etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAGGGCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAAT CAGACAAGACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAA ACCACGCTGAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGC CCTGGATGACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATT CAGGCACCTCGACGCTGACCATTT CTAAAAATCGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTT CACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTAT GACAGC GCAGGTACCAATCT GGAAGGCAAAGCTGTGGAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGTGT AATGCTCTGAAAGGTAC TAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATT CAACGGCAAAGGTG AAACGAGTGAAAAAACGATTGTTCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGATATCAAGTCGGATGGTTCG GGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCTGAA GGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGTCAA
AAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAGCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACC GGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGACCATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCAC CAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGATAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTA CCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAGG TCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 115
S2D4-S1D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND FNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALND TNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGTSDKNNGS GSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNIS KSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSK KTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALK
SEQ ID NO: 116
Lip-S2D4-S1D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAA GCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTC ACCCTGGAAGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCT GAACGATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTA GTGTTAACAGCAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAATGTACGATCACCGTGCAGAAATACGATAGT GCGGGTACCAACCTGGAAGGCACCGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAAGGCA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGC GAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCGCGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAATCGGACGGCA GCGGCAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAACCACCCTGGTG GTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATAC CGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAACCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTACGGTTAATA GCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAATGGTACC AAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAATCACGAAACT GGATGAAATCTGTAATGCACTGAAA
SEQ ID NO: 117
Lip-S2D4-S1D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVT LSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLD EICNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 118
Lip-S2D4-S1D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAATGCGGCACCAAACTGGAATATACGGAAATGAAAA GCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTC ACCCTGGAAGTGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCT GAACGATACGAATACCACGCAAGCG
ACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTAGTGTTAACAGCAAGAAAACCACGCA GCTGGTCTT CACCAAACAATGTACGATCACCGTGCAGAAATACGATAGTGCGGGTACCAACCTGGAAGGCACCG CTGTT GAAATCAAAACCCT GGACGAACT GAAAAACGCCCTGAAAGGCACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGT AGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGCGAAGTCAGCGAAAAAATCATTACCCG CGCAGACGGCACCCGCCTGGAATACACCGGCATCAAATCGGACGGCAGCGGCAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAA AACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAAACCACCCTGGTGGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGAG CAAAAACATTAGTAAATCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATACCGACAGCTCTGCGGCCACCAAGAAAA CCGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTACGGTTAATAGCAAGAAAACCAAAGATCTGGTCTTC ACGAAAGAAAACACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAATGGTACCAAACTGGAAGGCTCCGCTGTGGAAAT CACGAAACTGGATGAAATCTGTAATGCACTGAAAGGTCTCG AGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 119
S2D1-S1D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALND TNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGS GSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNIS KSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSK KTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO: 68
Lip-S2D1-S1D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATAT ACGGAAATGAAAA GCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTC ACCCTGGAAGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCT GAACGATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTA GTGTTAATAGCAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGT GCGGGTACCAACCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAAGGCA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGC GAAGTCTCGGAAAAAATCATTACCCGTGCTTGCGGCACCCGTCTGGAATACACCGGCATTAAATCGGATGGCAG CGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAGACCACCCTGGTGG TGAAAGAAGGCACCGTTACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAGTCCGGTGAAGTCTCTGTGGAACTGAATGATACC GACAGCTCTGCGGCCACCAAAAAGACGGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTACGGTTAATTC CAAAAAGACCAAAGATCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAACGGTACCA AACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGAT GAAATCAAAAATGCACTGAAA
SEQ ID NO: 121
Lip-S2D1-S1D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVT LSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLD EIKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 122
Lip-S2D1-S1D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N- terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGAAAAAGGCGAACTGTCGGCGAAAACGATGACGCGTGAAAACGGCACCAAACTGGAATAT ACGGAAATGAAAA GCGATGGCACCGGTAAAGCGAAAGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCCAATGACAAAGTC ACCCTGGAAGTGAAATGCGGCACCGTTACGCTGTCAAAAGAAATTGCAAAATCGGGTGAAGTGACCGTTGCTCT GAACGATACGAATACCACGCAAGCGACCAAGAAAACCGGCGCCTGGGACAGCAAAACCTCTACGCTGACCATTA GTGTTAATAGCAAGAAAACCACGCAGCTGGTCTTCACCAAACAAGATACGATCACCGTGCAGAAATACGACAGT GCGGGTACCAACCTGGAAGGCACGGCTGTTGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGTGTAACGCCCTGAAAGGCA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAGGC GAAGTCTCGGAAAAAATCATTACCCGTGCTTGCGGCACCCGTCTGGAATACACCGGCATTAAATCGGATGGCAG CGGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAAACTTTACCCTGGAAGGCAAAGTCGCAAATGATAAGACCACCCTGGTGG TGAAAGAAGGCACCGTT ACGCTGAGCAAAAACATTAGTAAGTCCGGTGAAGTCTCT GTGGAACTGAATGATACC GACAGCTCTGCGGCCACCAAAAAGACGGCAGCTTGGAACTCAGGCACCTCGACGCT GACCATT ACGGTT AATT C CAAAAAGACCAAAGATCT GGTCTT CACGAAAGAATGCACCATCACGGTGCAGCAATATGACAGCAACGGTACCA AACTGGAAGGCTCTGCGGTGGAAATCACGAAACTGGAT GAAATCAAAAATGCACTGAAAGGTCTC GAGCAC CACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 123
S4D4-S3D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1 FNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSN STQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGTSDKNNGSGS KEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNIS KSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNS QKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO: 124
Lip-S4D4-S3D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGCTAAAGGTGAACTGTCGGAAAAAACCATCCTGCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAGT CGGACGGCACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAAC CACGCTGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAAC TGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCGACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATT TCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAATGCACGATCACCGTTCAAAAATATGATTCC GCAGGTACCAACCTGGAAGGCAACGCTGTGGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAGGGTA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCA AACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAAAACGATGGTAGC GGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGA CCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGAT ACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAA CTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTA ATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAAA
SEQ ID NO: 125
Lip-S4D4-S3D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVE LNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSG
KAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQ LVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 69
Lip-S4D4-S3D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGCTAAAGGTGAACTGTCGGAAAAAACCATCCTGCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAGT CGGACGGCACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAAC CACGCTGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAAC TGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCGACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATT TCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAATGCACGATCACCGTTCAAAAATATGATTCC GCAGGTACCAACCTGGAAGGCAACGCTGTGGAAATCAAAACCCTGGACGAACTGAAAAACGCCCTGAAGGGTA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCA AACTGTCGGAAAAAGTGGTCACCCGCGCAAATGGCACCCGCCTGGAATACACGGAAATCAAAAACGATGGTAGC GGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGA CCGTGACGTGCGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGAT ACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAA CTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAAAACACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTA ATGCTCTGGAAGGCTCACCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCTGAACTGTGTGCGGCACTGAAAGGT CTCGAGCACCACCACCACCACCAC
S E Q ID NO: 127
S4D1-S3D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1 FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTWLSKHIPNSGEITVELNDSNS TQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSK EKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISK SGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNS QKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
SEQ ID NO: 128
Lip-S4D1-S3D4_nt: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA TGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAAT CCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAAC CACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAAC TGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATT TCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCC GCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCA AACTGTCAGAAAAAGTGGTCACCCGCGCTTGTGGCACCCGCCTGGAATACACCGAAATCAAAAACGACGGCTCG GGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGA CCGTGACGGAAGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGAT ACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAA CTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTA ATGCTCTGGAAGGCTCCCCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCGGAACTGAAGGCGGCACTGAAA
SEQ ID NO: 129
Lip-S4D1-S3D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVE LNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT ISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 130
Lip-S4D1-S3D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA TGCTAAGGGCGAACTGAGCGAAAAAACGATCCTGCGTGCGAATGGCACCCGTCTGGAATACACCGAAATCAAAT CCGATGGTACGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTGCTCTGGAAGGTACCCTGGCGGCCGACAAAAC CACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGAGCAAACATATTCCGAACTCTGGTGAAATCACCGTTGAAC TGAACGATAGCAATTCTACGCAGGCAACCAAAAAGACGGGCAAATGGGACAGTAATACCTCCACGCTGACCATT TCAGTCAACTCGAAAAAGACCAAAAATATTGTGTTCACGAAGGAAGATACGATCACCGTTCAAAAATATGACTCC GCGGGCACCAACCTGGAAGGCAATGCCGTCGAAATCAAAACCCTGGATGAACTGTGTAACGCCCTGAAGGGTA CTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTTAACGATAAGGGCA AACTGTCAGAAAAAGTGGTCACCCGCGCTTGTGGCACCCGCCTGGAATACACCGAAATCAAAAACGACGGCTCG GGCAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGGCTTTGCCCTGGAAGGTACCCTGACGGATGGCGGTGAAACCAAACTGA CCGTGACGGAAGGCACCGTTACGCTGTCTAAAAACATTAGCAAGTCTGGTGAAATCACGGTCGCACTGAATGAT ACCGAAACCACGCCGGCTGACAAAAAGACCGGCGAATGGAAAAGTGACACCTCCACGCTGACCATTTCAAAGAA CTCGCAGAAACCGAAGCAACTGGTCTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTGCAGAACTATAATCGTGCCGGTA ATGCTCTGGAAGGCTCCCCGGCTGAAATCAAGGACCTGGCGGAACTGAAGGCGGCACTGAAAGGT CTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 131
S6D4-S5D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1, secuencia del enlazador LN1 FNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDS DTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISK SGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRT KTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
S E Q ID NO: 132
Lip-S6D4-S5D1_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGGCAAAGGTGAAACGAGTGAAAAAACGATTGTTCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGATATCAAGT CGGATGGTTCGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAA AACCACGCTGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAG CTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGAC CATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGA TAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAG GTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAG GCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAATCAGACAAG ACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCT GAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATG ACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAAT CGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGCGCAGGTAC CAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO: 133
Lip-S6D4-S5D1_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWLSKNILKSGEITA ALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDK NNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTI SKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 134
Lip-S6D4-S5D1_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGGCAAAGGTGAAACGAGTGAAAAAACGATTGTTCGCGCCTGTGGCACCCGCCTGGAATACACGGATATCAAGT CGGATGGTTCGGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAA AACCACGCTGAAGGTGACGGAAGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCAG CTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGACAGCAAGACCTCTACGCTGAC CATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAATGCACGATCACCGTTCAACGCTATGA TAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAG GTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAG GCGAAATCTCAGAAAAAACCATCGTCCGCGCTAACGGCACCCGCCTGGAATACACCGACATCAAATCAGACAAG ACCGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCT GAAGGTGACCTGCGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATG ACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGATTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAAT CGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAAGATACGATCACCGTGCAAAACTATGACAGCGCAGGTAC CAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAGGTC TCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 135
S6D1-S5D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4, secuencia del enlazador LN1 FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALDDS DTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKNNGSG SKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISK SGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRT KTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 136
Lip-S6D1-S5D4_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1 ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCT GGGTT CTACTCTGCTGGCAGGTT GCTCAAGCTTCAA CGGCAAAGGTGAAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAA TCGGACGGCAGCGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTA AAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCA GCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGAC CATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGA CAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTT GAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAG GTACTAGTGACAAAAACAAT GGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAG GCGAAATCAGTGAAAAAACCATTGTGCGTGCGTGTGGCACCCGTCTGGAATATACCGACATCAAGAGCGATAAA ACGGGTAAAGCGAAGGAAGTT CTGAAAGATTTT ACGCTGGAAGGTACCCT GGCAGCAGACGGTAAAACCACGCT GAAGGTGACCGAAGGTACCGTT ACGCTGTCCAAAAACATT AGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGAT G ACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAAT CGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACGATCACCGTGCAAAACTATGATAGCGCAGGT
ACCAATCTGGAAGGCAAAGCTGTGGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAA
SEQ ID NO: 137
Lip-S6D1-S5D4_His_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCSSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITA ALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDK NNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKEL KNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 138
Lip-S6D1-S5D4_His_nt: Secuencia de codificación para el heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4, señal de lipidación Ipp de E. coli, c Ss N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) ATGAAAGCTACTAAACTGGTACTGGGCGCGGTAATCCTGGGTTCTACTCTGCTGGCAGGTTGCTCAAGCTTCAA CGGCAAAGGTGAAACGAGCGAAAAGACCATCGTGCGTGCGAACGGTACCCGCCTGGAATATACGGACATTAAA TCGGACGGCAGCGGCAAAGCAAAGGAAGTCCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTA AAACCACGCTGAAGGTGACGTGCGGCACCGTGGTTCTGTCAAAAAACATTCTGAAGTCGGGTGAAATCACCGCA GCTCTGGATGACAGCGATACCACGCGTGCTACGAAAAAGACCGGTAAATGGGATAGCAAGACCTCTACGCTGAC CATTAGTGTCAACTCCCAGAAAACGAAGAATCTGGTGTTCACCAAAGAAGATACGATCACCGTTCAACGCTATGA CAGTGCGGGCACCAACCTGGAAGGCAAAGCCGTTGAAATTACCACGCTGAAAGAACTGTGTAATGCTCTGAAAG GTACTAGTGACAAAAACAATGGCTCTGGTAGCAAAGAGAAAAACAAAGATGGCAAGTACTCATTCAACGAAAAAG GCGAAATCAGTGAAAAAACCATTGTGCGTGCGTGTGGCACCCGTCTGGAATATACCGACATCAAGAGCGATAAA ACGGGTAAAGCGAAGGAAGTTCTGAAAGATTTTACGCTGGAAGGTACCCTGGCAGCAGACGGTAAAACCACGCT GAAGGTGACCGAAGGTACCGTTACGCTGTCCAAAAACATTAGTAAGTCCGGCGAAATCACGGTCGCCCTGGATG ACACCGATAGCTCTGGCAACAAAAAGAGCGGTACCTGGGACTCAGGCACCTCGACGCTGACCATTTCTAAAAAT CGTACGAAAACCAAGCAGCTGGTCTTCACGAAAGAATGCACGATCACCGTGCAAAACTATGATAGCGCAGGTAC CAATCTGGAAGGCAAAGCT GTGGAAATT ACCACGCTGAAAGAACTGAAGAATGCTCTGAAAG GTCTCGAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO: 72
Lip-S2D0-His: aminoácidos de las posiciones 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2, secuencia de tipo silvestre, CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHH H
SEQ ID NO: 141
Lip-S2D1-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1 (aa 182 y 269), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALKGLEHHHHH H
SEQ ID NO: 142
Lip-S2D2-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 2 (aa 182 y 272), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNACKGLEHHHHH H
SEQ ID NO: 143
Lip-S2D3-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 3 (aa 244 y 259), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTICVQKYDSAGTNLEGTCVEIKTLDELKNALKGLEHHHHH H
SEQ ID NO: 144
Lip-S2D4-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 (aa 141 y 241), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNALKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 145
Lip-S2D5-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 5 (aa 165 y 265), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNCTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTCDELKNALKGLEHHHHH H
SEQ ID NO: 146
Lip-S2D6-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 6 (aa 185 y 272), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTCTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNACKGLEHHHHHH
SEQ ID NO: 73
Lip-S2D7-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 7 (aa 199 y 223), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTCALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTCTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHH H
SEQ ID NO: 148
Lip-S2D8-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 8 (aa 243 y 262), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTCTVQKYDSAGTNLEGTAVECKTLDELKNALKGLEHHHH HH
SEQ ID NO: 149
Lip-S2D9-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 9 (aa 184 y 204), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGCVTLSKEIAKSGEVTVALN DCNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHHH H
SEQ ID NO: 150
Lip-S2D10-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 10 (aa 201 y 214), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVAC NDTNTTQATKKTCAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHH HH
SEQ ID NO: 151
Lip-S2D11-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 11 (aa 246 y 259), CKQN N-terminal para la adición de lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVCKYDSAGTNLEGTCVEIKTLDELKNALKGLEHHHHH H
SEQ ID NO: 152
Lip-S2D12-His: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 12 (aa 167 y 178), CKQN N-terminal para la adición de los lípidos, etiqueta His C-terminal (GLEHHHHHH) LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTCEGKVANDKVTCEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVAL NDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGLEHHHH HH
S E Q ID NO: 153
Lip-S2D0: aminoácidos de las posiciones 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2, secuencia de tipo silvestre, CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 154
Lip-S2D1: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 74 (aa 182 y 269), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 155
Lip-S2D2: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 2 (aa 182 y 272), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNACK
SEQ ID NO: 156
Lip-S2D3: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 3 (aa 244 y 259), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTICVQKYDSAGTNLEGTCVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 157
Lip-S2D4: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 (aa 141 y 241), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 158
Lip-S2D5: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 5 (aa 165 y 265), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNCTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTCDELKNALK
SEQ ID NO: 159
Lip-S2D6: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 6 (aa 185 y 272), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTCTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNACK
SEQ ID NO: 160
Lip-S2D7: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 7 (aa 199 y 223), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTCALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTCTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 161
Lip-S2D8: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 74 con enlace disulfuro tipo 8 (aa 243 y 262), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTCTVQKYDSAGTNLEGTAVECKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 162
Lip-S2D9: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 9 (aa 184 y 204), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGCVTLSKEIAKSGEVTVALN DCNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 163
Lip-S2D10: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 10 (aa 201 y 214), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVAC NDTNTTQATKKTCAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTA VEIKTLDELKNALK
S E Q ID NO: 164
Lip-S2D11: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 11 (aa 246 y 259), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALN DTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVCKYDSAGTNLEGTCVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 165
Lip-S2D12: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 12 (aa 167 y 178), CKQN N-terminal para la adición de lípidos LipCKQNELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTCEGKVANDKVTCEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVAL NDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 166
S2D0: aminoácidos de las posiciones 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2, secuencia de tipo silvestre ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALK
SEQ ID NO: 167
S2D1: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1 (aa 182 y 269) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 168
S2D2: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 75 (aa 182 y 272) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNACK
SEQ ID NO: 169
S2D3: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 3 (aa 244 y 259) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTICVQKYDSAGTNLEGTCVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 170
S2D4: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 (aa 141 y 241) ELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALK
SEQ ID NO: 171
S2D5: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 5 (aa 165 y 265) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNCTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTCDELKNALK
SEQ ID NO: 172
S2D6: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 6 (aa 185 y 272) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTCTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNACK
SEQ ID NO: 173
S2D7: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 7 (aa 199 y 223) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTCALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTCTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALK
SEQ ID NO: 174
S2D8: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 8 (aa 243 y 262) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTCTVQKYDSAGTNLEGTAVECKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 175
S2D9: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 75 (aa 184 y 204) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGCVTLSKEIAKSGEVTVALNDCNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 176
S2D10: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 10 (aa 201 y 214) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVACNDTNTTQ ATKKTCAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDE LKNALK
SEQ ID NO: 177
S2D11: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 11 (aa 246 y 259) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQ ATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVCKYDSAGTNLEGTCVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 178
S2D12: aa 131-273 de Borrelia afzelii cepa K78, OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 12 (aa 167 y 178) ELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTCEGKVANDKVTCEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTT QATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLD ELKNALK
SEQ ID NO: 179
B. burgdorferi s.s. (cepa B31, serotipo 1), OspA_aa 126-273 con secuencia similar a hLFA sustituida del serotipo 1 de OspA FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDT DSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEIT KLDEIKNALK
SEQ ID NO: 180
B. garinii (cepa PBr, serotipo 3), OspA_aa 126-274 FNDKGKLSEKWTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDT ETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPA EIKDLAELKAALK
SEQ ID NO: 181
B.bavariensis (cepa PBi, serotipo 4), OspA_aa 126-273 FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSN STQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 182
B. garinii (cepa PHei, serotipo 5), OspA_aa 126-273 FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTD SSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITT LKELKNALK
SEQ ID NO: 183
B. garinii (cepa DK29, serotipo 6), OspA_aa 126-274 FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLSKNILKSGEITAALDDS DTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 184
El péptido enlazador LN1 construido a partir de dos regiones de bucle separadas de la mitad N-terminal de OspA de B. burgdorferi s.s. cepa B31 (aa 65-74 y aa 42-53, intercambio de aminoácidos en la posición 53: D53S) GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS
SEQ ID NO: 185
Lip-S 1 D4-S2D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 1 y 2 de, ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND LipCSSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGT
GKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQ LVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 186
Lip-S1D1-S2D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, N-terminal CSS para la adición de lípidos, secuencia del enlazador l N1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVT LSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 187
Lip-S3D4-S4D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEIT VALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVV LSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLD ELKNALK
SEQ ID NO: 188
Lip-S3D1-S4D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 3 y 4 de, ambas con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEIT VALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVV LSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLD ELCNALK
SEQ ID NO: 189
Lip-S5D4-S6D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 5 y 6 ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, N-terminal lipidación LipCSSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVA LDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDKNN GSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVLS KNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 190
Lip-S5D1-S6D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6, ambas con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITV ALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVL SKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
SEQ ID NO: 191
Lip-S2D4-S1D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 2 y 1 de, ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 de serotipo 1 de OspA sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVT LSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO: 192
Lip-S2D1-S1D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 2 y 1 de, ambas con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, aa 164-174 del serotipo 1 de OspA sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVT LSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLD EICNALK
SEQ ID NO: 193
Lip-S4D4-S3D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 4 y 3 de, ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal LipCSSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVE LNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT ISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALK
SEQ ID NO: 194
Lip-S4D1-S3D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 4 y 3 de, ambas con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVE LNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT ISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO: 195
Lip-S6D4-S5D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de los serotipos 6 y 5 de, ambas con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal LipCSSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWLSKNILKSGEITA ALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDK NNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTI SKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 196
Lip-S6D1-S5D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipos 6 y 5 tanto con enlace disulfuro tipo de 1, CSS N-terminal para la adición de los lípidos, secuencia del enlazador LN1, N-terminal lipidación LipCSSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITA ALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDK NNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTL TISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
SEQ ID NO: 197
Lip-S1D4-S2D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador Ln 1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKEGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVT LSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 198
Lip-S1D1-S2D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador Ln 1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLWKCGTVTLSKNISKSGEVSVE LNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTL SKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTL TISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALK
SEQ ID NO: 199
Lip-S3D4-S4D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador l N1, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVTLSKNISKSGEIT VALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELKAALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVV LSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTL TISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALK
SEQ ID NO: 200
Lip-S3D1-S4D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador l N1, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEIT VALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTVV LSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLD ELKNALK
SEQ ID NO: 201
Lip-S5D4-S6D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador l N1, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGEISEKTIVRACGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVTLSKNISKSGEITVA LDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKECTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDKNN GSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLS KNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK
SEQ ID NO: 202
Lip-S5D1-S6D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador l N1, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITV ALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTVVL SKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTIS VNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALK
SEQ ID NO: 203
Lip-S2D4-S1D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador Ln 1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGELSAKTMTRECGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKEGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQCTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELKNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGS
GKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKD LVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALK
SEQ ID NO: 204
Lip-S2D1-S1D4_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 2 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 1 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador Ln 1, aa 164-174 de OspA de serotipo 1 sustituido por la secuencia no similar a hLFA-1 NFTLEGKVAND, lipidación N-terminal LipCSSFNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVT VALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALKGTSD KNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKIITRACGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKEGTVT LSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTL TITVNSKKTKDLVFTKECTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEIKNALK
SEQ ID NO: 205
Lip-S4D4-S3D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador l N1, lipidación N-terminal LipCSSFNAKGELSEKTILRACGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTEGTWLSKHIPNSGEITVEL NDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKECTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELKNALKGTSDKNN GSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTL SKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLT ISKNSQKPKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK
SEQ ID NO: 206
Lip-S4D1-S3D4_aa: Secuencia de codificación para el heterodímero de las proteínas de fusión, intermedias y finales, de OspA de serotipo 4 con enlace disulfuro tipo 1 y OspA de serotipo 3 con enlace disulfuro tipo 4, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador LN1, lipidación N-terminal LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVE LNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKN NGSGSKEKNKDGKYSFNDKGKLSEKVVTRACGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTEGTVT LSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQLVFTKECTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLA ELKAALK
SEQ ID NO: 207
Lip-S6D4-S5D1_aa: Heterodímero de la proteína de fusión de OspA de serotipo 6 con enlace disulfuro tipo 4 y OspA de serotipo 5 con enlace disulfuro tipo 1, CSS N-terminal para la adición de lípidos, secuencia del enlazador l N1, lipidación N-terminal LipCSSFNGKGETSEKTIVRACGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTEGTWLSKNILKSGEITA ALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKECTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELKNALKGTSDK NNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTL SKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTI

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 190;
o cualquier variante funcional de dicha secuencia de aminoácidos
- con una identidad de secuencia de al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, incluso con mayor preferencia al menos 90 %, con la máxima preferencia al menos 95 % con respecto a la secuencia de la SEQ ID NO: 190, y
- con una diferencia en la capacidad protectora (Apc) entre la variante funcional y el control placebo (negativo) de al menos 50 %, específicamente al menos 60 %, preferentemente, al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, incluso con mayor preferencia 90 %, incluso con mayor preferencia 95 %, con la máxima preferencia al menos 95 %.
2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 que consiste en Lip-S5D1-S6D1 (SEQ ID NO: 190).
3. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2.
4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3.
5. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 3 o el vector como se define en la reivindicación 4, en donde dicha célula huésped es preferentemente E. coli.
6. Un proceso para producir una célula que expresa el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, que comprende transformar o transfectar una célula huésped adecuada con el vector de conformidad con la reivindicación 4.
7. Un método para producir el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por las siguientes etapas:
a) introducir un vector que codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2 en una célula huésped,
b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido,
c) homogeneizar dicha célula huésped, y
d) someter el homogeneizado de la célula huésped a etapas de purificación.
8. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2 y/o un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3 y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, en donde el excipiente farmacéuticamente aceptable comprende L-metionina.
10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8 o 9, que comprende, además, al menos un antígeno adicional derivado de una especie de Borrelia que causa la borreliosis de Lyme.
11. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 que comprende, además, al menos un antígeno adicional, en donde el antígeno adicional es de un patógeno transmitido por garrapatas, en donde el patógeno transmitido por garrapatas se selecciona del grupo que comprende Borrelia hermsii, Borrelia parkeri, Borrelia duttoni, Borrelia miyamotoi, Borrelia turicatae, Rickettsia rickettsii, Rickettsia australis, Rickettsia conorii, Rickettsia helvetica, Rickettsia parkeri, Francisella tularensis, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sennetsu, Ehrlichia chaffeensis, Coxiella burnetii y Borrelia lonestari, virus de encefalitis transmitido por garrapatas (TBEV), virus de la fiebre de Colorado transmitido por garrapatas (CTFV), virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (CCHFV), virus de la enfermedad forestal de Kyasanur (KFDV), virus de Powassan, virus de Heartland, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk (OHFV) y Babesia spp.
12. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizada porque comprende, además, una sustancia inmunoestimuladora, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en polímeros policatiónicos, específicamente péptidos policatiónicos, oligodesoxinucleótidos inmunoestimuladores (ODN), específicamente oligo(dIdC)13 (SEQ ID NO: 32), péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys, específicamente el péptido KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 33), compuestos neuroactivos, específicamente la hormona de crecimiento humano, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, adyuvantes completo o incompleto de Freund, o combinaciones de estos.
13. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde dicha composición farmacéutica es una vacuna.
14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para usar como un medicamento, particularmente como una vacuna.
15. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 o 2 o la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para usar en un método de tratamiento o prevención de una infección por Borrelia, particularmente una infección por B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. andersoni, B. bavariensis, B. bissettii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. spielmanii, B. japónica, B. tanukii, B. turdi o B. sinica, preferentemente, una infección por B. burgdorferi s.s., B. afzelii o B. garinii.
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