TW448185B

TW448185B - Vaccine design and production

Info

Publication number: TW448185B
Application number: TW083110048A
Authority: TW
Inventors: Curtis Coats Scheifinger; David Lee Smiley
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-01
Publication date: 2001-08-01
Also published as: NO961808L; EP0726774A1; SG49830A1; RU2143920C1; HUT75556A; KR960705582A; PL314303A1; WO1995012410A1; CN1141000A; CZ128896A3; FI961869A0; UA42741C2; EP0726774A4; CN1087953C; BR9407988A; CA2175708A1; HU9601191D0; JPH09505039A; US5679349A; AU1050595A

Description

44818ο 經濟部中央橾準局员工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（1 ) 本發明提供決定姻菌附著性槠制之方法。槽式细菌附著性基礎的機制允許吾人辨認負責附著之细菌分子並使吾人能設計可用K預防或滅少细菌之附著性於细菌、豁學装置、.輔肋物及類物。據此，本發明靨於免疫學與微生物學的範暍、不同细菌反其他微生物之附著於特定细胞類型K及植入的裝置諸如輔肋物、植入型去纖維顗動器、心率調整器、人工關節與類似物給予-吾人.治__療此類感染時相當的臨床障礙。很多此類附著性微生物之對抗生素與抗徽菌藥的抗藥性混淆此種問題。本發明包括經由評估附著性與非附著性微生物間之細胞表®的差別以決定微生物附著性之特性。藉由使用上面引述之方法K決定金色《萄狀球菌（SjLa^h Υ 1 Q 〇〇 (> ΓR aureus)類型對牛乳管上皮细胞之附著性及藉此導致牛的轧房炎可說明本發明之可操作性與脔要性。本發明之乳房炎疫苗為本發明的一個較佳具體實施例，其乃根據本發明的方法製備兼可做為本發明疫苗之說明。已知有多種格蘭姆陽性菌會導致乳房炎。格蘭姆陽性菌諸如鍵徽球菌（Streptococci) |金色葡萄狀球菌 (Staphylococci)，與棒狀桿菌（Corynebacteria)靥 (SPP.)等為吾人通常所指乳房炎之致病物。微生物引發乳房炎的與該微生物對牛乳房乳管上皮细胞之附著能力相關 ° A . J . F「ost, Tnff；nt. ion and Immunity 12: 1 554- 1 556 ( 1 975 ) ° -4 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------裝------ΐτ-----^|一踩 _ -4 (請先-¾讀背面之注意事分填寫本頁) 448185 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 本發明之乳房炎疫苗即利用微生物對牛乳房乳管上皮细胞之附著能力與造成的疫病之相翮性。吾人製備與萃取细爾细胞壁以決定表琨對乳管上皮细胞具附晋性與不具附著性的细爾間特定的蛋白質之存在情形°然後，吾人使用存在於附'著性細菌而不存於非附著性细菌之蛋白質以生產·肽次Η段（S u b f r a g m en t)其即為本發明之轧房炎疫苗範例的基礎。本發明藉由製備细胞.壁或_细_胞膜萃取物比較附著性與非附著性微生物以決定與附著性相關之分子*決定與附著性有關的分子之生化特徴及使用資料Μ合理的設計可誘發免疫反應且反過來阻斷微生物附著能力之疫苗等提供做為設計疫苗的方法。本發明的一Μ較佳具體實豳例提供與细菌附著於乳管上皮細胞有關Μ及具下列衍生型式的式子之蛋白質的肽次片段。

Formula I (式 I) R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8-Gly-R10-Gly-R12-R13-Gly-R1-5-R1·5-A1 a-R-^· ^-Arg-AIa-B.^-*--Gln-GIy-R^^ 其中R1為氬或Ca-Cie羧酸、 R2 為 Ala，Gly，Ser 或丙酸； R3為Val* lie* Leu或 D-Val; R4 為 Lys 或 Arg ; R5為 Val， lie或 Leu; -5 - 本紙張尺度適用中國國家摞準（CMS ) A4規格（2丨0X297公釐） --------裝— - (請先Ψ讀背面之注意事V.4·填寫本頁)

、1T 4 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 4 π 8 5 A7 B7 五、發明説明（3

Ra為 A1a * Gly或 Ser ; R7為 lie， Leu或 Val; R3為 Asp， Asn或 Glu; R10為 Phe ， Tyr或 Τγρ ; R12為 Arg，A s n > Lys或 His; R13^Ile> Leu^Val； R 1 5Ά Ar g * hsn · Lys 或 His; R1® 為 Leu，Ala，lie 或._V a 1 _ R18為Phe， Asn > Lys或 His; R21為 lie， Ala， Val或 Leu; R2A^ OH * Ala 或 Ser° 本發明亦提供具下式之圼現多抗原性的肽： Formula II (式 II) Ο

pepddel —N

其中，呔合物。肽3與呔Λ傺獨立地選自具式I的化本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） 4 4 d Ί b 〇 A7 B7 五、發明説明（4 ) ^:發明亦提供一種含肽與多抗原性肽的處方’其適於誘發最強的免疫反應Μ對抗該肱與該圼現多抗原性的肽。有效地控制牛乳房炎是重要的。汲乳動物有乳房炎時必須Κ杭生素治療，而Κ抗生素治療汲乳動物常導致乳中抗生素濃’度無法符合現行管理法規。據此’發展有效之治療牛乳房炎的疫苗不僅具商業之重要性並可提供獸翳處理見房炎時減少抗生素治療之需要的可能’具式I之化合物

Focinulg 1_ (式 Ί)

Rl-R2_R3_R4_R5_R6_R7_R8_Gly_Ri〇„Gly_Ri.2_RI3，Gly_Ri5_RlS_

Ala~R1-8-A.rg-Ala-R2；L-Gln-Gly-R24 其中： R1為氫或Ci-Cu羧酸； R2 為 Ala，Gly，Ser 或丙酸；

RlVal，lie，Uu 或 D-Val;

LysSK Arg ； RIVal，lie 或 Uu;

Ala · Gly 或 Ser ; R7為 lie， Leu或 Val;

Ra 為 Asp，A s n hE G 1 u ；經濟部中央標準局員工消費合作社印製

(讀先閎讀背面之注意事户"·.填寫本頁) Γ_______I R10為 Phe， Tyr或 Trp; R12為 Arg，As n » Lys或 His; R13為 lie，Leu或 Val ; R15為 Arg， A s n » Lys或 His ; 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） A7 B7 五、發明説明（5 )

RleaLeu，Ala，lie 或 Val; R18為 Phe’Asn'Lys或 His; R21 為 lie，Ala，Val或 Leu; non，A 1 a 或 s e r ° 經濟部中央標準局員工消費合作社印製、裝^-1 (請先碉讀背面之注意事^'"填寫本頁) 訂乃藉決定乳房炎之病源髏藉以附著於乳牛乳管上皮细胞的機制為目標之廣泛研究衍生而得。吾人比較不同的金色葡Γ 萄狀球菌品系之對乳管上皮姐纈的附著能力，然後再分成會附著與不會附著兩姐.。吾.人#取由附著性與非附著性之金色葡萄狀球菌外细胞膜製劑，以比較存在於附著性品性而非存於非附著性品条之蛋白質。有三種蛋白質只存在附著性而不存於非附著性品系中◊這些蛋白質的分子量分別為36 0，47KD與65KD。吾人定其生化特徵並選定36KD的蛋白質為最有潛力的製備保護乳房炎的疫苗之候選人。最終選定相當於36KD蛋白質胺基端之22個胺基酸長的狀為製備轧房炎疫苗之最適免疫原。該22個胺基酸之Ν-端的天然序列是製疫苗較佳的選擇。因此在式I中，較佳的胺基酸取代物如下：R1為氬、R2為Ala、R3為Val、R4為Lys、Rs為 Val、RegAU、RTgIle、R8 為 Asp、1^為（3卜、R10 為 Phe、 R11 為 Gly、為 Arg、R13為 lie、R15為 Ars、RiagLeu、尺13為卩!^、R21為lie而R24為羥基，選耽其他可能的式I取代物時係根據具相似官能基的胺基酸之已知的生化及免疫性質，本發明亦包括具式I的化合物之具免疫性的次片段，具式II之呈現多抗原性的呔允許具式】的多免疫原性肽之呈琨並因此提供可更有效引起免疫反應之較大分子的免

本紙張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 ί b 〇 Α7 -----Β7_ 五、發明説明（6 ) 疫原的次單位。在式II之圼現多抗原性肽上之具式I的呔可為具式I的狀本身或是該狀之任何的姐合。 ¢-如此技转所熟知者’吾人使用固相蛋白質合成可很方便地合成具式I的肽。本發明之固相蛋白質合成方案使用 —般的k斷基與去保護方案。儘管固相肽合式在此已達進步的發展水平且已成例行公事'本發明者仍推薄三篇固租" 合成之論文Μ促進本發明之實行。吾人可參考G. Barany * 等人 * Internationa. 1 J q u r_n a 1 of Peptide and ^fotein Re s.e arch* 30*705-739 (1987) ： J.M. Stewart 與 J.D. Young，固相合成（Solid Phase Peptide Synthesis) 1 Pierce Chemical Company, Rockford, ΪΠίη〇ί3 (1984)與 P.D. Bailey，肽化學之簡介（An introduction to Peptide Chemistry), John Wiley & Sons, New York (1 992)關於傳统阻斷基與其使用之反懕條件，去阻斷試劑與方法，切斷試劑及其使用之推駕條件等等，Μ做為要是热悉的技術人員來設計較佳條件與合成方法之參考，本發明者使用A ρ Ρ 1 i e d B i 〇 s y s t e m s自動呔合成儀，其完全K製造者推駕之方法、溶劑、試劑及類似物補充。實例中詳述固相合成之特別的方法。為確保完全了解，吾人將專利說明書中某些用語及縮寫加Κ定義。"Boc”之用語意指第三-丁氧羰基。” tosyl"之用語為對-甲笨磺酸基* ”Chxl”之用語為環己基之縮寫。 "2C1-Z”之用語為2 -氛苄氧羰基之縮富。” “-Cle羧酸”之用語意指具1-16個碳之真鍵烴加上“胺基端”羧酸，式1之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公釐） --------「滅------1T------,-1¾ 1 - ) ; J-- (請先Μ讀背面之注意事i-l.填寫本頁) ' 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 A7 __B7 五、發明説明（7 ) 視需要的Ci-Cw羧酸只是一個胺基端基。據此，Cl_Cie绕酸仍有可能發生相當纷歧之飽和度與取代情形。合適之非環吠軍元羧酸的實洌包括：乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚睃、辛酸、壬睃、癸酸、十一酸、十二酸。如上所述，亦^使用不飽和非環狀單元羧酸與經取代之飽和與不飽和非環狀單元羧酸。熟悉的技術人員對任何其唯一的功能只在提供一终端的部份之可變的特性皆會很激賞。據此 *本發明涵蓋“-(:13浚.酸與_上_述討論之諸多赛化。式II之LYS為離胺酸之縮寫，式I之化合物的副單位 (RkR24)除了諸如R4位置之丙酸與R3位置之D-Val外通常為L胺基酸。據此，副軍位間之鍵结為肽鍵，吾人定義式I 與II之肽的終端（R1與R24) K考應：若加入另一胺基酸便可被消去以形成肽鍵之氩與羥基。因此•當R1為Η且該Η非另外的Η，其便為相當的胺基酸或R2之丙酸的Η 。依此，當 R24為0Η，該0Η非另外0Η時，其便為R23之相當的胺基酸之0Η，當R24為AU或Ser時，便存在完金的胺基睃，且若須要式II之化合物時，羧酸之羧基终端可供形成醯胺鍵， R2位置之丙酸可為正丙酸或異丙酸。藉遺傳工程技術Μ表現由L-胺基酸組成之具式I的肽較佳。藉遺傳工程技術使用胺基酸序列與已知退化性之遺傳密碼Μ建立可Μ最低成本大量表現肽之表琨載體是製備只含天然胺基酸之式I的肽之最有效率方法，因目前之進步的分子生物學研發成就，可市購定製的DNA序列與可用於细菌、酵母及哺乳類细胞之表現載體，故不需要繁潰的非 *10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（21〇\297公爱） ---------- • - AJ-. (請先瀾讀背面之注意事i4..、填寫本頁) 訂經濟部中央揉隼局員工消f合作社印裂 448,1 8 5 A7 ______B7 五、發明説明U ) 必要之诮傳工程的論述。欲使用遺傳工程以製餚本發明的狀之技術人員可參考J. Sambroolt，等人1 Molecular Cloning1 A Laboratory Manual -(第 2版，1989)與 F . Μ . A u s u b e 1，等人，C u r r e n t P r o t o c ο 1 s I η Μ ο 1 e c u 1 a r B i 0丨0 g y , ( 1 9 8 9 )。上述來源提供遺傳工程任何論述之絕佳技術補充。 / 適於誘發免疫反應的處方為此技藝所熟知。完全的 Freutid's佐劑（CFA)可.能是.已洳誘發最適免疫反應之最佳佐劑。然而，.完全的Freund's佐劑中之分枝桿菌及因重複施用CF A造成之發炎限制此佐劑對治療汲乳動物之用途。目前可得多種其他Μ天然及合成油類為基礎之佐劑且可很方便的符合本發明之目的。下述提供佐劑之簡短討論。佐劑可定義為當與抗原同時施用時可增強對該抗原之免疫反應的任何製劑。抗原為可激擾宿主免疫糸统並引起對該來犯的物質（抗原）免疫反應之物質。佐劑之作用機制迄未完全明瞭，但咸信其可引誘免疫反應性的淋巴球至抗原存在的位置，侷限抗原於發炎位置（定置（depot)效應）、延遲抗原同化，活化反應性细胞之代謝並剌激淋巴细胞作用。佐劑亦藉數種其他機制作用，諸如：經由结合自抗原並對之加以_修飾、僅藉改變其在Freund’s佐劑中水-油介面之構型或藉非專一性地刺激Τ與/或Β林巴球。很多佐劑若施用時不含特定抗原亦可產生"非專一性” 免疫反應性增加情形。有效的佐劑包括油類、礦物鹽、雙 -11 - 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4规格（2丨0X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項.^填寫本頁) ，裝訂 A7 448185 B7 五、發明説明u ) 股核酸、微生物產物及多種其他物質。最廣為人知以油為基礎之佐劑為如上所簡述之加強與未加強的F r e li n d ’ S佐劑。這些佐劑由水或鹽溶於油（或腿）之乳化物所姐成。典型地，將可溶抗原溶於鹽液並與等量油類乳化，諸如837〇1卩1^(42.5%石臘、31.4%單環萘與 26.1%多環萘）或Arlacel A (軍油酸甘兹糖醅（mannite raonolate))。加入殺死的分枝稈菌大大增加佐劑活性且命名該佐劑為“加強”佐劑，K與缺分枝桿菌之未加強佐劑區別。亦可使用包括脂蛋白萃取物Μ取代分枝菌者。吾人已確知，當使用加強佐劑時，分枝菌之醣脂質與肽聚W部份（Wax D)為增強佐劑效應之主要角色。當内皮及皮下注射時，使用單一乳化劑佐劑系统之疫苗最有效。雙乳化劑（水溶於油中再溶於水中）為更“自由潦動”之乳化劑且可維持其K較多途徑施用之可能。礦物鹽為增強免疫性及疫苗效率之另種方法。K諸如璘酸鈣、矽膠、亞倫（A 1U«)(硫酸鋁鉀或磷酸鋁）之礦物馥或含鋁資劑沈澱形式之抗原溶液注射后會於注射位置及流滲注射位置的淋巴節生成肉芽瘤。該免疫肉芽頫的功能類似PreuniTs佐劑所生者》吾人使用亞倫沈澱製成之抗原於人類K増強對抗原預防免疫之免疫反懕的程度，諸如白喉類毒素。不可溶的膠體載體為另一類之佐劑。除亞倫沈澱物外*

亦可獨立使用其他膠體載體或與微生物產物或萃取物及該抗原Μ構成佐劑。纆證實可用’血碳（blood charcoal)K 本紙張尺度逋用中國國家梂準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------ί丨_ - - 二請先閡绩背面之注$吼vir'寫本頁) -訂經濟部t央櫟準局身工消费合作社印製 448185 A7 B7 五、發明説明（10 ) (請先倒讀背面之注意事肀，九填寫本頁) 刺激對吸附之抗原產生抗體。具控制的聚合物畏度之藻酸钙或納亦有佐劑性質。聚丙烯醯胺膠亦經證筲可有效地剌激抗體產生Μ對抗少量附著的抗原。亦有人很成功地使用矽酸铝漿土（Bentonite)為佐劑。當與帶負電抗原，DNA或聚核苷酸生成沈殺物時，甲基化牛血清白蛋白與其他帶正電蛋白質亦可做相當有效的佐劑。. . 此處簡單提及微生物..萃取.物J故為佐劑之用途。諸如格蘭姆陰性爾之细胞内脂多釀的内毒素可強力地激發免疫反應。當有系铳地施用時内毒素可做為佐劑，坦若與抗原一起注射會更有效。很多内毒素能夠刺激抗體合成與B细胞增生K及賴巨噬细胞增強噬菌能力。較佳的内毒素包括源於大腸桿菌〇m:B4、麻瘋桿菌鼷、腸炎菌（S. entericiitis)與S. minnesota者。分枝桿菌及某些真菌的細胞檗亦可增進免疫反應性。這些物質似乎可吸引與活化巨噬细胞，因此增強抗原誘發的發炎位置之噬菌作用'此反過來導致經輔助细胞表現之抗原性增加，此又反過來增強具抗原反應性之B淋巴球之活化Μ及增強细胞-媒介（ Τ细胞）之功能。經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製聚核苷酸，尤其雙股聚核苷酸諸如聚肌苷-聚胞苷（聚 (1C))或，聚腺苷-聚尿苷（聚（AU))為強力的佐劑與免疫剌激劑。他們的作用似乎是經活化具抗原反應性的了细胞。聚核苷酸亦可供Μ活化巨噬细胞。吾人皆己將桿菌製劑 i 1 1 tiS--C.al.giet-t.S- guerin (BCG.) - 13 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公 448185 Α7 Β7 五、發明説明（11 ) ，棒狀桿爾 Corynebactprinm o u IB，李斯德菌 i, i s t p r i a iBonocvtogFuisalfS 百日咳稈菌，Bordets] Pertussis,^這些细菌的萃取物用做佐劑。列弗米索 (Levami sole)—種驅蟲藥亦充做佐劑使用，推測其可活化 T细胞i能力，增強補體含量並活化巨噬细胞。佐劑之選取或姐合對熟錬的免疫學家而言是很平常的技' 術。上列討論之佐劑包栝可用於實驗組合之佐劑以及可為戳路施用的佐劑。欣將本發.明_之乳房炎疫苗製成處方可使用任何上述之佐劑與任何佐劑和列於本文之本發明的肽之姐合| Η亦皆藺於本發明之範嚼。證實發規本發明之乳房炎疫苗可有效激起體液反應，包栝會陌斷否則细菌品系即會與培養中的乳管上皮妞胞结合之杭體。牛轧管上皮细胞/细菌附著力分析的免疫注射方法與細節列於實例之中。表I呈規本發明的乳房炎疫苗誘發體液反愿之明顯效力，其會抑制金色葡萄狀球菌對汲乳動物乳管上皮紐胞的附著力。 (請先濶讀背面之注意事«=.七填寫本页) ，'裝- *1Τ 經濟部_央揉準局貝工消費合作社印製 —14 - 本纸張尺度適用中國因家樑率（CNS ) Α4現格（210X297公釐〉 448 1

Q 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12 ) 結会力疝制芮分比對照組牛隻 r· 前.：後追加後 y 1 0 8 34 2 11 20 28 3 ， -12- 17 39 平均 -* 3 15 34 .'寅驗組牛隻_ 1 10 35 58 2 21 52 63 3 0 41 58 4 5 54 57 5 10 38 5L 6 5 3S 58 7 2 4 6 55 a 12 40 57 9 12 36 59 10 3 32 52 11 0 55 54 12 、 0 30 53 13 12 45 57 14 31 36 . 55 15 17 46 51 平均 9 41 , 56 -15 — --------、袭------1T-----.]!}球 - \J. . ' - (請先閲讀背面之注意事人填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 448 ΐ8 δ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（13 ) “ PRE”之用語意指動物血清於正常的免疫注射前阻斷附著之能力。“POST，’反映免疫注射後的量。•‘ B00ST"值為 .如實例中所示之追加兔疫注射後親察到的值。用以生產表 T的資料之方法列於篑例6中。本發^的疫苗在獸豁處理乳牛的乳房炎時特別有用’因為本發明的疫苗可姐斷细菌之附著因此，故乳房炎時姻菌' 對乳管上皮细胞之附著特刖易受本發明疫苗之干擾導致正常汲乳過程時细菌即可脘落.。- 上述提供之討論與資料主要指向本發明之較佳具體實胞例，其乃使用本發明的方法以設計本發明之乳房炎疫苗。熟練的技術人員會了解本發明在不同方面上可外推到無數其他微生物附著亦是重要問題的範圍，因比，本發明亦涵葸這些其他的應用於本發明範峨中。下列實例說明本發明之特定具體宵施例且欲進一步闡述本發明但非意謂其即為本發明範蟋之任何限制。當例 1 AVOAIDGFGRIGRLAFRAIQG-OH 之合成使用含下列支鏈保護基：Arg (Tosyl)，Asp(Chxl)與 Lys(2-Cl-Z)之 Boc 胺基酸以 Applied Biosystens 430A 肽合成儀進行328毫克（〇.25mM) Boc GlyOCH2PAM樹脂之雙重偶合週期。在完成肽樹脂合成後經TFA去保護週期去除N-端Boc基*然後將樹脂轉移至一 HF反應槽以去除遇量溶劑並於真空乾燥樹脂可得1.03克。加入1毫升間一甲酚本紙張尺度逋用中固國家梯準（CMS ) A4規格（210X297公董） 7Γ 裝------IT----- (請先閲讀背面之注意事填寫本頁) 448 f A7 B7 五、發明説明（Μ ) 將該榷連接於一 HF裝置（PenninsuU Labs) 、冷卻至-73t：、真空油乾、其中可得約15毫升之濃縮的氟化氫（HF)。於冷浴中搜拌該反應物1小時，然後於真空中去除HP並將殘濟懸浮於200毫升乙醚中。將固體物質濾過60毫升之陶瓷披璃過濾漏斗，然後以乙_洗兩次。溶該呔，並K 1 5毫升 50* 乙酸溶液（aq HOAc)二次，15 毫升 10¾ aq HOAc 二次，，與15毫升水一次*洗收集之物質以將其與樹脂分雛，冷凍該總和的過滅溶液並冷-凍乾_燥_。再溶該冷凍乾燫的物質於15毫升50¾ aq HOAc，10毫升 10¾ aq HOAc及3毫升CH3CH 。自該溶液取出5微升，以〇.U TFA稀釋至500微升並將25微升注射人0·46χ15公分 Vydac C 18管柱，使用FPLC (Pharmacia)糸统做分析。所用流速為0.5毫升/分。層析於室溫中進行。使用214毫微米滹器與一設定0.2A規模裝置之FPLC’s偵測器 (Pharmacia)以偵測分離情形。阍析溶液A為0,1¾ TFA。

If 析溶液 B 為 0 . 1S! T F A C H 3 C N 及 5 0 B * 5 % B，13! B， 40%B， 0SJB之梯度且是使用5ΧΒ。經濟部中央潘率局員工消費合作社印製將刺餘溶液加入一 2.2χ 25公分Vydac CIS管柱Κ便經 FPLC做預纯化。使用梯度為25% B ，50分鐘，然後為 25-65¾ B超過450分鏡長。收集5分鐘（25毫升）那一部份。UV吸收值Μ2·0Α規模裝置之FPLC使用214毫微米偵測。各取由60-74之不用部份40微升為樣本以0.1¾ TFA做1:10 稀釋並各取20微升做HPLC分析。總合64-68的部份、冷凍並冷凍乾燥以產生112毫克。取一些產物為樣本做胺基酸 -17 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 448185 經濟部令央標率局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（l.5 ) 與質譜儀分析。由胺基酸莫耳數比可確定已獲得所須的產物。由快速原子撞擊質譜儀的資料顯示*除所要產物（ 2315.75) 外另有兩種高分子量成份（2375.0與2357.4) ° HPLC'分析顯示產物纯度高於90%。 g W 2 AVOAIDGFGRIGUARAIJ3G-OH 之大規模合成含成切斷與纯化實際上根據實例1教授之方法進行。吾人使用 0.65 克（0.5mM) Boc Gly〇CH2PAM 樹脂 Μ 合成 AVKVAIDGFGRIGRLAFRAIQG-OH > 可得 2.1 克之完全的肽樹脂理論上（可得98¾重最）*切斷反應乃使用1.5毫升間 -甲酚及20毫升HF，娌冷凍乾燥收集固體之水洗液後可得 1 . 06克相.產物。產物經HPLC分析之純度約75%胺基睃 > 分析亦顯示所有預測之殘基。胺基酸比例仍在吾人預測的粗肽製備物範爾内，但比例差異性比吾人須要者略高。質譜無法偵測質最達2315.75之產物。吾入將缺少分子量 2315.75之產物的结果歸因於位置7與8之Asp-Gly的存在與HF的切斷反應。 g制 3 AVKVAIEGFGAIGRUFRAIQG-OH之合成合成切斷與純化實際上根據實例1教授之方法進行。此合成反應位置7與8與實例2反應產物之對應位置不同。 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） ---------------,玎----—li-Ji ,(請先濶讀背面之注意事序V填寫本頁) Α7 Β7 五、發明説明（16 ) 此肽位置7與8乃特選而可與切斷方法相容者。吾人使用650毫克（〇.5mM)之Boc GlyOCH2PAM樹脂進行必要合成並使用Chxl做為GIu7支鐽保護基。如簧例1所示在ABI 4 3 0A狀合成儀上進行雙重偶合。乾燥後可得2.08克（97¾) 肽樹脂、HP切斷反應簧質上根據赏例2進行。進行收集的固體水洗液之HPLC分析並藉預備色析法鈍化剌餘之100署升水甲液。缌合97- 107部份，冷._凍並_冷_凍乾燥可得400毫克產物。 H PLC分析顯示純度為9555+。胺基酸亦符合理論值且質諶資料確認所要的分子量（2329.78)的產物之存在。呈琨多抗原性的乳房炎呔之合成： UVKV/UDGFGRIGRLAFRAIQGU MAPS 4-支鐽經濟部中央樣準屬員工消費合作社印装如實例1所示 > 使用1公克（〇.5mM)之MAP 4-支锤第三 - Boc樹腊（Applied Bi〇systeras)M Boc胺基酸進行雙重偶合之固相合成。乾燦後可得2.7克肽樹脂，切斷反應時則使用2毫升間-甲酚與25毫升液體HF。去除HF且經乙醚沈殺後，過濾固體，Μ乙醚洗並Μ50ϋί HOAc溶液、10¾ HOAc 溶液及水清洗由收集的固體萃取出之肽。冷凍總和的過滹溶液並冷_凍乾燥可得830毫克產物。高效液相曆析（HPLC) 分析顯示只有一個寬峰，而胺基酸分析顗示之比例介於理論值68-127¾之間。經發現蛋白質含量為36¾ 。產物不經進一步純化/定特徵便可供免疫注射。 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2Ι0Χ297公釐） 448 i 8 5 A7 B7 五、發明説明（I7 ) 方處之苗疫在油5¾ 在ο 水含 t之物菌化無乳於 .重溶雙肽製較 -"=451 乃之苗量疫的炎要房需乳將之人佳吾較。明，者發1 本中水經濟部中央標準局—工消費合作杜印製

CaCI2的磷酸緩衝鹽液（PBS)並蚁附微附件之Omni Cory: 攪拌荦在等啬諝積之CFA (D〇ifco)中進行乳化。使用冰浴 Μ防對呔之熱破壊。另.種方.式為使用兩支玻璃注射筒及一魯爾（LUer)瑣閥（lock valve)在兩支注射筒間重覆轉送之轧化步驟。不管任何乳化方式，皆須檢測乳化物在水性介質中抗分散之能力，檢測乳化物時，乃將一滴乳化物滴在在水面視其分散性。若該滴乳化物能在水面穩定的經過数分鏑便具足夠乳化性。然後使用附有微附件之攪伴器Μ等量體積之2¾吐溫TM80 (西格瑪）乳化已乳化於油（C F A)中之肽的PB S溶液（起始.水相曆）。使用附有魯爾瑣閥之注射器亦可達良好的轧化效果。宵制 R 疫苗注射方法對牛的t研究 saw» 開始免疫注射前先自每隻動物採少量血液樣本。供研究之每隻動物的前採血值皆列於表1之PRE項。所有的免疫注射皆含1毫升注射物且皆是皮下進行。每次實驗姐接種 -20 - 本纸張尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐） --------.}裝------1Τ-----i I '} • _ ,、、γ . - (請先饲讀背面之注意事填寫本頁) 4 4.8 五、 3 11 〇〇 4 8號專利申請案中文說明書修正頁（89年4月）A7 B7 發明説明（/ /) 年月a修正丨組4.U補充| 疫苗時對照姐皆接種1毫升PBS 。如寅例5所詳述者，起始注射包含50微克之於經修飾的加強Freund ’s佐劑中乳化的較佳的肽*其中較佳之肽為AVKVAIDGFGRIGRLAFRAIQG-〇H，AVKVAIEGFGAIGRUFRAIQG-OH或 Ul/OA_IDGFGRIGRL/\ PRAIdGU MAPS 4-支鏈。起始注射7天後，每隻實驗動物係經皮下注射而獲得一75微克於經修飾不完全Frend氏的肽（1毫升總體積）之第二次注射。實驗動物接種溶於修飾的未加強FreuncTs佐劑之較佳.的肽100微克。起始注射· 7週後進行追加注射，所有實驗動物皆接受100微克之修飾的未加強Freund's佐劑。取血液樣本並評估可阻止细菌附著於乳管上皮细胞之抗體存在情形。對山羊的研究因對牛的研究有關之費用太過，遂有對羊做預備研究K 考證血清轉換（對抗本發明的較佳肽免疫原之抗體生產）情形。免疫注射方法，採血進度與由其所得结果皆列於下 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製週數 1 疫苗注射 X 收集的血 X 液樣本细胞分析中 8. δ 抑制效力的百分比 3 X X 31 4 X X 37 10 46 55 56 52 當例 7 牛乳管上皮细胞之製備本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 21 44Β 1 b 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（!9 ) A .組識回收選取正常汲乳活動之動物（亦即無疾病或受傷者）"使用雷擊行安樂死且去除整個乳房。於室溫下以0.85¾鹽液徹底的洗轧房。循靭帶正中均切乳房成兩半。收取健康姐嫌。欲確認健康姐織需對此羯姐織有些熟悉。因欲進行此方法的技術人員通常對此不热悉本發明者遂建議只要外表有顆符狀者即可收取。將收取的姐織樣本切成較小碎片直至可通過20號的針頭，._將齓戤_碎片置於含補充以健大徼素與殺嫌菌劑（-fungizone) (50ρρπι)之漢克氏平衡鹽液（HBSS) 、（GIBC0)的容器中。HBSS有兩種，其中一種含Hs與Ca。此後定名無Ms與Ca之HBSS為HBSS-。熟練的技術人員可確認Μ包含強力的杭生素與抗真菌劑之生理上可接受的溶液洗外科切除的樣本可得將初级培養時的污染機會減至最低之需要。亦可用其他溶液、抗生素與抗真菌劑，這只是選擇的問題。 Β .組織製備將步驟Α所製備之姐嫌約100克置入約400毫升之新鲜冰冷HBSS。在其後步驟中儘最保存該組織於冰中且進行這呰步驟時愈快愈好。將小的驵識切片之樣本移至無菌培養皿中並切成濃粥狀。收集切碎的樣本並K冷的HBSS洗直至上澄液不.再呈乳白色為主。 C .消化步驟製備酶的混合液Μ消化细胞間質藉此以釋出個別细胞。製備_溶液時乃將下列成份溶於包含健大徽素與殺徽菌劑 -22 - 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) Α4規格（210Χ29?公釐） (請先閱讀背面之注意事胥Φ.填寫本頁) 訂 -i 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 ___B7 五、發明説明（2〇 ) 之400毫升的HBSS-中：膠原蛋白酶1.38克、阿法-胰凝轧蛋白酶]克，彈性蛋白酶-20毫克，玻尿酸酶1克•大豆胰蛋白酶抑制50毫克，與牛血清白蛋白10克。前述試劑可由很多生物試劑供應商購得。S Uma化學公司與 Worthington生化公司為較佳供應者。將述製備之酶混合液過滹滅菌並用Μ消化約1 0 0克的 m織。消化作用於3 7 t約進行4 5分鐘。真正時間依溫度、攪拌、砠織碎片大小、_酶活.性等等而定。本發明者推駕定期移出等最的淌化混合物並観察含有超過〗〇〇個细胞之凝塊存在情形*此步驟使用顥微鏡與血球計數器梗已足夠。自37 °C水浴或恆溫箱中移出消化槽（水浴較佳，因其比恆溫箱的熱平衡快）並將液體倒出滅過20網目的篩網，至一無爾燒杯中。若再有任何含多於200個细胞的凝塊便以橡皮刮器袢之（末端附橡皮之注射活塞（syringe plunge「）亦可用）。將濟化後置於水浴並密切偵測Μ產生每個凝塊 50-100細胞的腺泡之製備物。須避免過度消化以確保製備物之活力與可用性。自水浴中移出燒瓶並將液Ρ倒過一無菌之CELLECT0RTM 篩f 20網目）必要時使用刮器以拌開任一不通過網目的殘渣凝塊。.將仍留在網目之组戤丟棄並將细胞製備物置入離心管。離心令细胞成瑰，Μ Η B S S洗兩次，並將细胞Μ約6 χ10β细胞/毫升濃度再懸浮於含20¾胎牛血清與10¾二甲硯之含Ea「l's鹽的培養液199 (GIBC0)中。本紙浪尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------1裝-- 請先1讀背面之注意事t填寫本頁) 訂 --;線 4 48 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝 Α7 Β7 五、發明説明（2!) !).姐織貯存將由步驟C所得之细胞製備钧分成1毫升等分並置入 2.0毫升塑膠耐冷凍瓶（Sarstedt西德）。先將瓶子預冷凍於-70C 冷凍庫24小時，然後移轉至液態氮K做最後貯藏。〆審例 8 结合力抑制分析 A.乳管上皮细胞集合3個冷凍瓶之乳管上皮细胞並每次約25 t之PHS * pH 7.2 40棄升洗三次。 B .细菌生長將先前已經確定會附著乳管上皮细胞之一接種環的金色葡萄狀球菌品系轉移至5毫升之無菌的胰蛋白酶濟化的大豆培莠基並K 3 9 t：保溫2 0小時。離心收集细胞並Μ等量 PBS洗一次。清洗後，將细胞ΜΙ 〇θ细胞/毫升懸浮於 PBS 中。 C .细爾附著力分析. 將洗過的乳管上皮细胞（1〇4细胞/奄升懸浮液’ 0.5 毫升）與在步驟Β中所製的细菌细胞懸浮液0.5毫升混於無菌的12.x 75毫米的玻璃管並在振盪水浴中約39¾ *保溫 30分鐘。保溫後KPBS洗细胞混合物4次以去除任何非吸附性的细菌。製成抹片，風乾並Μ格蘭姆龍膽紫染劑染15 分鐘。藉由計算在多Η抹片上附著於25個轧管细胞的金色 -24 一本紙張尺度適用t國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐）請先¾讀背面之注意事f填寫本頁) ，.等 4 4 8 η 第S3 1 1 00 48號專利申請案中文說明書修正頁（8 9年4月）Α7 Β7

於著附定決 M 巨數的菌球狀萄葡數菌细的胞细皮上個本發明的疫苗之效率*有部份*係藉免疫的動物之血漬之效價及稀釋系列對抑制附著力之相關性而測定，得自這些研究的資料摘録於11頁的表I中。 __________-'}.罠______丁 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 25 第83110048號專利申請案中文補充説明書(八十五年七月）表結合抑制百分比控制組牛隻. 847 819 815MEAN 實驗組牛隻 86i 877 871 859 876 874 前後1 後2 7.2 20.4 45 16.9 37 30.3 0 35 27.3 8 土 8,4 3〇.S±9.1 34.2 土 9.5

884 814 846 826 808 848 862 828 MEAN 11.4 20.7 12 12.3 27.4 17.2 15.1 7.212.6 13.1 8.3 14.8 17.7 0 0 0 11.9 土 7,5 4 3· 土 ·3·8·5·8·3·4·4·639 365'72 ^^^^^^^4·4·4·5'3··^1·!^2·0'2· 54555&5&555555555 ·33·6··33 59··51·71 ο^ιοίΝ5·2·0·0·5·0·9·1·1· 5445 5 555^544 5 47.7 47.5 46.3 49 土 3.4 0213F.D〇C/sh ___________墓八三--〇〇四八號專利申請案修文補充説明書（八十六年一月）

I .免疫計劃[弗德氏（Freund's)] 週數免疫作用血樣前免疫 0 50微克+完全弗德氏 1 75微克+不完全弗德氏 2 100微克+不完全弗德氏 3 100微克+不完全弗德氏 4 — 5 - 6 100微克+不完全弗德氏 7 - 8 — 前追加後追加 υ；\τΥΡΞ\Μ?Υ\Μ~·ί-220 ,DOC\2 -1 - α 4318 5 II.數據實驗ΑΗ4609213 (弗德佐劑）表1血清滴定係以1/5、1/10、1/100及1/1000於塗覆250毫微克 /孔之肽的ELISA盤進行。

牛隻编號血清稀釋度 O.D.4Q5/49Q 前血樣#406 1/5 1/10 1/100 1/1000 0.064 (.009) 0.051 (.001) 0.048 (.004) _ 0.048 (.003) #406 (3/16/93) 1/5 0.158 (.005)* 1/10 0.094 (.003) 1/100 0.047 (.001) 1/1000-. 0.045 (.001) 前血樣#114 1/5 —— 0.065 (.002) 1/10 0.058 (.002) 1/100 0.046 1/1000 0.043 (.001) #114(3/16/93) 1/5 0.073 (.010) 1/10 0.055 1/100 0.045 - 1/1000 0.045 (.002) 前血樣#154 1/5 0.06 (.007) 1/10 0.054 (.002) 1/100 0.044 (.001) 1/1000 0.044 (.001) #154 (3/16/93) 1/5 0.262 (.005)* 1/10 0.154 (.004) 1/100 0.049 (.001) 1/1000 0.041 (.001) 前血樣#118 1/5 0.058 (.003) 1/10 0.047 (.001) 1/100 0.041 (.001) 1/1000 0.041 (.001) 血清抗體緩衝液+僅共輊結合驗性鱗:酸醋酶 ϋ:\ΤΥΡΞ\Μ~Υ\ΗΓΥ-22ΰ 2 牛隻編號血清稀釋麼 O.D. 405/490 并丄4笨# 1 Q — 刖血银 1/5 0.052 (.001) 1/10 0.05 (.001) 1/100 0.047 (.003) 1/1000 0.043 (.001) #19 (3/16/93) 1/5 0.369 (.007)* 1/10 0.189 (.001)* 1/100 0.055 (.002) 1/1000 0.044 (.001) 前血樣#118 1/5 0.048 (.002) 1/10 0.046 (.001) 1/100' 0.047 (.002) 1/1000 0.044 (.001) #118 (3/16/03) 1/5 _ 0.063 (.001) 1/1〇_ . 0.054 (.002) 1/100 0.05 (.001) 1/1000 0.044 (.001) 血清抗體緩衝液+彳 0.040 (.001) 結合驗性鱗酸酿酶結果 J48185 這些牛隻係以施打追加疫苗後所採血樣，利用ELISA方式測定抗體的製造。編號19、406及1S4之牛隻（未預先測定）在1/5的稀釋度顯示正面結果。這些結果證實5隻經溶於弗德佐劑之金黃色葡萄球菌肽免疫之動物有3隻在低量即顯現抗體反應。 υ：\ΤΥ?ε\Μ?*·ί\Μ?Υ-220 .DOC\2 3 III. LY302224 192小時後挑戰數據授乳中牛隻牛隻號數# 連接抑制％臨床1 細菌1 QTS NEG QTS NEG 106 34 3 2 114 57 3 3 118 59 4 4 406 51 4 3 19 51 4 4 154 54 3 3 平均 54.4 3.6 3.4 18/20 17/20 ^4g·； I 8 5 U;\TYPE\M-Y\M?Y-220.^CC\2 4 1 控制组在每隻動物照顧與利用程序之第144小時施予頭芽胞菌素 J- ，.年正 4. li 補充 m 第八三一一〇〇四八號專利.申請案 86年1月中文補充說明書倐正年4 瓜. LY302224 192小時後挑戰數據授乳中牛隻牛隻號數# 連接抑制％臨床* 細菌* QTS NEG QTS NEG 106 34 3 2 114 57 3 3 118 59 4 4 406 51 4 3 19 51 4 4 154 54 3 3 平均 54.4 3.6 3.4 18/20 17/20 控制组在每隻動物照顧與利用程序之第144 小時施予頭芽胞素。 QTS :將乳房分成4等份，每一等份均進行實驗。 NEG :負結果之數目。 U：\TYPEV.MFY\Mfy-220\2

Claims

44 氟钱备㈣號專利_蔡中文申請專利範圍蔭正本（90年元a ) ABCD

A V K V A I E G F G A I Q R L A F R A I Q G - Ο Η -2 . 一種具下式之多抗原圼現性呔：〇〇

妝 4~：--N (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) a~stE..ss..anpteisl^ .1 經濟部中央標準局5Κ Μ消費合作社印裝其中肽 1，呔 2，肽 3 及呔 4 為 A V 〇 A I D G F G R I G R L A F R A I Q G。 3 . 一種用於製廣預防轧房炎疫苗之®蔡组合物，其含有佐劑與根據申請專利範圍第1項之乳房炎疫苗眯。 4 . 一種用於製餚預防乳房炎疫苗之醫蔡组合樹|其含有佐劑與根據申請專利範圍第2項之多抗原圼現性肽。本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2iOX297公釐） 4 4.8 五、 3 11 〇〇 4 8號專利申請案中文說明書修正頁（89年4月）A7 B7 發明説明（/ /) 年月a修正丨組4.U補充| 疫苗時對照姐皆接種1毫升PBS 。如寅例5所詳述者，起始注射包含50微克之於經修飾的加強Freund ’s佐劑中乳化的較佳的肽*其中較佳之肽為AVKVAIDGFGRIGRLAFRAIQG-〇H，AVKVAIEGFGAIGRUFRAIQG-OH或 Ul/OA_IDGFGRIGRL/\ PRAIdGU MAPS 4-支鏈。起始注射7天後，每隻實驗動物係經皮下注射而獲得一75微克於經修飾不完全Frend氏的肽（1毫升總體積）之第二次注射。實驗動物接種溶於修飾的未加強FreuncTs佐劑之較佳.的肽100微克。起始注射· 7週後進行追加注射，所有實驗動物皆接受100微克之修飾的未加強Freund's佐劑。取血液樣本並評估可阻止细菌附著於乳管上皮细胞之抗體存在情形。對山羊的研究因對牛的研究有關之費用太過，遂有對羊做預備研究K 考證血清轉換（對抗本發明的較佳肽免疫原之抗體生產）情形。免疫注射方法，採血進度與由其所得结果皆列於下 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製週數 1 疫苗注射 X 收集的血 X 液樣本细胞分析中 8. δ 抑制效力的百分比 3 X X 31 4 X X 37 10 46 55 56 52 當例 7 牛乳管上皮细胞之製備本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） 21 4 4 8 η 第S3 1 1 00 48號專利申請案中文說明書修正頁（8 9年4月）Α7 Β7

於著附定決 M 巨數的菌球狀萄葡數菌细的胞细皮上個本發明的疫苗之效率*有部份*係藉免疫的動物之血漬之效價及稀釋系列對抑制附著力之相關性而測定，得自這些研究的資料摘録於11頁的表I中。 __________-'}.罠______丁 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 25 44 氟钱备㈣號專利_蔡中文申請專利範圍蔭正本（90年元a ) ABCD

A V K V A I E G F G A I Q R L A F R A I Q G - Ο Η -2 . 一種具下式之多抗原圼現性呔：〇〇

妝 4~：--N (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) a~stE..ss..anpteisl^ .1 經濟部中央標準局5Κ Μ消費合作社印裝其中肽 1，呔 2，肽 3 及呔 4 為 A V 〇 A I D G F G R I G R L A F R A I Q G。 3 . 一種用於製廣預防轧房炎疫苗之®蔡组合物，其含有佐劑與根據申請專利範圍第1項之乳房炎疫苗眯。 4 . 一種用於製餚預防乳房炎疫苗之醫蔡组合樹|其含有佐劑與根據申請專利範圍第2項之多抗原圼現性肽。本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2iOX297公釐）第83110048號專利申請案中文補充説明書(八十五年七月）表結合抑制百分比控制組牛隻. 847 819 815MEAN 實驗組牛隻 86i 877 871 859 876 874 前後1 後2 7.2 20.4 45 16.9 37 30.3 0 35 27.3 8 土 8,4 3〇.S±9.1 34.2 土 9.5

884 814 846 826 808 848 862 828 MEAN 11.4 20.7 12 12.3 27.4 17.2 15.1 7.212.6 13.1 8.3 14.8 17.7 0 0 0 11.9 土 7,5 4 3· 土 ·3·8·5·8·3·4·4·639 365'72 ^^^^^^^4·4·4·5'3··^1·!^2·0'2· 54555&5&555555555 ·33·6··33 59··51·71 ο^ιοίΝ5·2·0·0·5·0·9·1·1· 5445 5 555^544 5 47.7 47.5 46.3 49 土 3.4 0213F.D〇C/sh ___________墓八三--〇〇四八號專利申請案修文補充説明書（八十六年一月）

I .免疫計劃[弗德氏（Freund's)] 週數免疫作用血樣前免疫 0 50微克+完全弗德氏 1 75微克+不完全弗德氏 2 100微克+不完全弗德氏 3 100微克+不完全弗德氏 4 — 5 - 6 100微克+不完全弗德氏 7 - 8 — 前追加後追加 υ；\τΥΡΞ\Μ?Υ\Μ~·ί-220 ,DOC\2 -1 - J- ，.年正 4. li 補充 m 第八三一一〇〇四八號專利.申請案 86年1月中文補充說明書倐正年4 瓜. LY302224 192小時後挑戰數據授乳中牛隻牛隻號數# 連接抑制％臨床* 細菌* QTS NEG QTS NEG 106 34 3 2 114 57 3 3 118 59 4 4 406 51 4 3 19 51 4 4 154 54 3 3 平均 54.4 3.6 3.4 18/20 17/20 控制组在每隻動物照顧與利用程序之第144 小時施予頭芽胞素。 QTS :將乳房分成4等份，每一等份均進行實驗。 NEG :負結果之數目。 U：\TYPEV.MFY\Mfy-220\2