KR0173366B1

KR0173366B1 - B형 간염 바이러스의 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀

Info

Publication number: KR0173366B1
Application number: KR1019950065412A
Authority: KR
Inventors: 이기영; 장진수; 정현용; 최명준; 황유경; 조성유; 박용식; 정홍석; 문홍모
Original assignee: 허영섭; 재단법인목암생명공학연구소
Priority date: 1995-12-29
Filing date: 1995-12-29
Publication date: 1999-02-01
Also published as: KR970032889A

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 유래의 펩타이드 항원을 함유하는 pH에 민감한 리포좀(liposome)에 관한 것이다. 본 발명의 리포좀은 전기 바이러스에 특이적인 세포독성 T 임파구(cytotoxic Tlymphocyte)의 생성을 유도하는 세포성 면역(cellular immunity)을 야기시킬 수 있으므로, HBV 관련 질환의 예방과 치료에 이용될 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스의 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀

본 발명은 B형 간염 바이러스의 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀(liposome)에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 C형 간염 바이러스 유래의 펩타이드 항원을 리포좀 제제화하여, 전기 바이러스에 특이적인 세포독성 T 임파구(cytotoxic T lymphocyte, 'CTL')의 생성을 유도하는 세포성 면역(cellular immunity)을 야기시키는 리포좀에 관한 것이다.

바이러스성 질환은 끊임없이 인간을 괴롭혀 왔으나, 이에 대한 획기적인 치료법은 오늘날까지도 발견되지 않고 있다. 다만, 예방백신에 의한 보호만이 가능할 따름이나, 예방백신이 개발되어 있는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, 'HBV')의 경우에도 감염 환자는 계속 발생하고 있고, 일단 발생한 바이러스 질환에 관한 근원적 치료를 할 수 있는 약물은 개발되어 있지 않다.

세포성 면역(cellular immunity)이란 임파계에 속하는 몇 종류의 세포에 의해 이루어지는데, 이러한 세포는 박테리아나 바이러스에 의해 감염된 세포와 조직을 직접 파괴하는 기능을 가지고 있다. 따라서, 세포성 면역은 박테리아나 바이러스의 세포내 감염 또는 암세포 등에 효과적으로 그 기능을 발휘한다.

따라서, 본 발명에 있어서는 HBV에서 기인한 펩타이드 항원을 리포좀 제제화하여 펩타이드 항원에 대한 CTL 생성을 유도함으로써 HBV 질환의 예방 및 치료에 응용하고자 하였다.

일반적으로, 인지질(phospholipid)을 수중에 분산시키면 인지질의 친수성 머리부분(polar head group)은 물쪽으로 향하고, 소수성 꼬리부분(hydrophobic tail)은 꼬리끼리 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의하여 화합하여, 이중분자막(bilayer)의 구형의 폐쇄소포체를 형성하는데 이를 '리포좀(liposome)'이라 한다. 이러한 리포좀은 생체막의 모델로 이용되어 왔을 뿐만 아니라, 약물의 전달매체로도 널리 이용되어 왔다(참조: Lee, J.W and Kim H., Arch. Biochem. Biophys., 297:354(1992): Hahn, K.H. and Kim, H., J. Biochem., 110:635(1991): Yun, C.H. and Kim, H., J. Biochem., 105:406(1989); Kim, J. and Kim, H., Bichemistry, 25:7867(1986); Kim, J. and Kim, H., Korean Biochem. J., 18:403(1985)).

최근에는 리포좀을 면역학 분야에도 이용하여, 리포좀을 백신의 운반체(carrier)또는 면역보조제(adjuvant)로의 사용이 집중적으로 연구되어 지고 있다.(참조: Rooijen, N.V., Vaccine, 11:1170(1993)). 일반적으로, 리포좀을 정맥주사하면 혈액내에 다량으로 존재하는 대식세포(macrophage, MO)에 의해 쉽게 포획된다. MO는 항원의 면역적 프로세싱(processing)에 매우 중요할 뿐만 아니라, 리포좀 항원의 프로세싱에도 매우 중요한 역할을 한다.

또한, 최근 pH에 민감한 리포좀(pH-sensitive liposome)을 이용하여 바이러스에 선택적인 CTL 생성을 유도하는 방법(참조 : Readdy, R. et al., J. Immunol. Methods, 141:157(1991); Zhou, F. et al., J. Immunol. Methods, 145:143(1991); Nair, S. et al., J. Exp. Med., 175:609(1992); Harding, C.V. et al., J. Immunol., 147:2860(1991); Zhou, F. and Huang, L., Vaccine, 11:1139(1993))이 개발되어, 치료용 백신의 운반체 또는 면역보조제로 널리 이용되고 있다. 이와 관련하여, 본 발명자들도 항암약물의 선택적인 전달이 가능한 pH에 민감한 리포좀의 제조방법(참조 : Choi, M.J. et J. Biochem., 112:694(1992))과 그 조성에 대해서 특허를 출원한 바 있다.(참조 : 대한민국 특허출원 제 93-18389호 및 제93-18390호).

본 발명의 발명자들은 상기와 같이 특허출원되어 공지된 pH에 민감한 리포좀의 인지질 조성으로 리포좀을 제조하여, HBV 항원 단백질 중에서 CTL에 의해 인지되는 펩타이드 항원을 포획함으로써, HBV에 특이적인 세포성 면역을 유도할 수 있는 펩타이드 함유 리포좀을 제조하여, 그를 HBV 질환의 예방과 치료에 이용하려는 목적으로 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 HBV에서 유래한 펩타이드 항원을 포함하여, 세포성 면역을 유도하는 리포좀을 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

HBV 유래의 펩타이드 항원을 함유한 pH에 민감한 리포좀을 제조하기 위하여, 포스파티딜에탄올아민-β-올레일-γ-팔미토일(phosphatidylethanolamine-β-oleoyl-γ-palmitoyl: POPE)과 콜레스테롤 헤미석시네이트(cholesterol hemisuccinate : CHOH)를 몰 비율로 6:4 내지 8:2, 가장 바람직하게는 7:3, 또는 POPE/PE(phosphatidylethanolamine)/CHOH를 몰 비율로 3:3:4 내지 4:4:2, 가장 바람직하게는 3.5:3.5:3으로 혼합하여 형성된 인지질이 얇은 막을 형성하도록 한 다음, 포획시킬 HBV 유래의 펩타이드 항원 즉 HBV 항원 단백질 중에서 CTL에 의해 인지되는 펩타이드 항원을 용해시킨 완충용액을 첨가하였다. 이때, HBV 유래의 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀은 펩타이드 항원 1종 이상과 인지질을 몰 비율로 1:5내지 1:25, 가장 바람직하게는 1:20이 되도록 혼합하여 제조된 것이다. 또한, 본 발명에 의해 제조된 pH에 민감한 리포좀은 인지질로서 1몰%의 단일인산화 지질 A(monophosphoryl lipid A)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 HBV 유래의 펩타이드 항원은 본 발명의 취지에 따라, 후술하는 실시예 1의 표 1에 기재된 9개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 뿐만 아니라, 전기 펩타이드 전, 후에 1개 내지 5개의 아미노산을 추가로 포함하는 모든 펩타이드 및 그의 기능적 등가물을 포함한다. 본 발명에서, '기능적 등가물'이라 함은 전기 펩타이드의 아미노산 서열 중 1개 또는 2개가 치환된 모든 펩타이드를 의미한다. 예를 들면, 치환은 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및, Phe, Tyr과 같은 조합을 포함한다.

전기의 펩타이드 함유 리포좀은 HBV 항원 단백질 중에서 사람에게서 CTL 생성을 유도할 수 있는 펩타이드 항원을 포획하고 있으며, 또한 펩타이드의 운반체인 pH에 민감한 리포좀은 그에 포착된 펩타이드의 기원이 되는 바이러스에 특이적인 CTL 생성을 유도하는 것으로 알려져 있으므로(참조). 대한민국 특허출원 제94-22792호), 사람에게서 세포성 면역을 유도할 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[펩타이드 항원을 함유한 pH에 민감한 리포좀의 제조]

POPE/CHOH(7:3 몰 비율)로 된 인지질 또는 POPE/PE/CHOH(3.5:3.5:3몰 비율)로 된 인지질을 유리병(glass vial)에 넣어 유기용매에 용해시킨후, 질소가스를 불어 넣어 유리병 내에 얇은 막을 형성시켰다. 그런 다음, 포획시킬 펩타이드를 용해시킨 완충용액(pH8.0)을 첨가하여 충분히 수화시키고, 강하게 교반하여 중첩된 다층막 리포좀(multilamellar vesicle, 'MLV')을 제조하고, 이를 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 소형 단층막 리포좀(small unilamellar vesicle, 'SUV')를 제조하였다. 이렇게하여 제조된 SUV를 상온에서 2 내지 12시간 방치한 다음, 액체질소로 급격히 냉동시키고 다시 상온에서 천천히 해동시키는 과정을 3내지 4회 반복하여 펩타이들르 함유한 리포좀을 제조하였다. 이렇게 제조된 펩타이드를 함유한 리포좀은 펩타이드와 인지질을 몰비율로 1:20으로 되도록 혼합하여 제조된 것이며, 사용한 펩타이드는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다(참조: 대한민국 특허출원 제94-11906). 이때, 리포좀내에 들어가지 않은 펩타이드 세파덱스 G-50컬럼(1×20cm)을 통과시켜 제거하고, 리포좀 용액만을 수득하였다. 이렇게 수득한 펩타이드 함유 리포좀은 에탄올에 의한 파괴정도가 적어 물리적 안정성이 우수하고, 리포좀 내용물의 누출정도가 종래의 pH에 민감한 리포좀보다 매우 적음을 확인하였다(참조 : 대한민국 특허출원 제 93-18390호).

결국, 상기에서 제조한 펩타이드 함유 리포좀에 포획된 펩타이드가 HBV 항원 단백질 중에서 CTL 생성을 유도하는 펩타이드 항원이고, 펩타이드의 운반체인 pH에 민감한 리포좀이 그 안에 포착된 펩타이드의 기원이 되는 특정 바이러스에 특이적인 CTL을 유도한다는 보고(참조 : 대한민국 특허출원 제 94-22792호)로 부터, 본 발명의 펩타이드 함유 리포좀은 사람에게서 CTL 생성을 유도하는 세포성 면역을 야기하리라는 당연한 결과가 도출된다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 HBV 유래의 펩타이드 항원을 함유하며, HBV에 대해 세포성 면역을 유도할 수 있는 pH에 민감한 리포좀을 제공한다. 따라서, 이러한 리포좀은 HBV 관련 질환의 예방과 치료에 이용될 수 있다.

Claims

(i) 포스파티딜에탄올아민-β-올레일-γ-팔미토일(phosphatidyl-ethanolamine-β-oleoyl-γ-palmitoyl)과 콜레스테롤 헤미석시네이트(cholesterol hemisu ccinate)를 6:4 내지 8:2의 몰비율로 혼합한 인지질; 및,

(ii) 전기 인지질에 대하여, 중화항체 및 세포독성 T 임파구의 생성을 유도하는 폴리펩타이드 항원의 함유량이 5:1 내지 25:1의 몰비율이 되도록, 하기와 같은 아미노산 서열을 포함하는 HBV 유래의 펩타이드 항원을 1종 이상 함유하는 pH에 민감한 리포좀

상기에서, 아미노산 서열은 IUPAC-IUB의 명명법에 따라 기재하였다.
제1항에 있어서, 인지질은 1몰%의 단일인산화 지질 A(monophosphoryl lipid A)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 pH에 민감한 리포좀.