JP2690620B2 - ワクチンにおける，または関する改良 - Google Patents

ワクチンにおける，または関する改良

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ワクチンにおける、またはワクチンに関す
る改良に係わり、特に、例えば合成抗原を含むワクチン
における新規アジュバントに関する。
多くの成功したヒトおよび獣医学上のワクチンは、弱
毒化された生体病原体を用いている。しかしながら、病
原体感染の全範囲での最近の研究は、組換えDNA技術、
および改善された培養、収穫および精製技術を用いてバ
ルク単位で生産できる、潜在的に防御的で、種−特異的
な抗原を特定した。また、天然抗原の有効なエピトープ
を模倣する完全に合成した抗原の製造も実施可能であ
る。サブユニットワクチンは、病原体の特定抗原のみを
含むワクチンであり、即ち抗原性タンパク質または個々
のペプチドエピトープを含みうるワクチンである。好適
なペプチドは、コンピュータモデリング技術によって設
計することができる。このような合成抗原は、多くの潜
在的利点、例えば、純度、安定性、高レベルの防御、特
異性、および弱毒化病原体を含むワクチンに時々見られ
る病原的特性の欠如の保証などを有している。
不幸にも、化学合成あるいは組換え手段によって製造
された分子量の低い抗原は、内在的に低い抗原性を示
し、一般的に弱い免疫反応刺激剤である。例えばツベル
クリンの精製タンパク質誘導体（PPD）のようなキャリ
アタンパク質に結合した後であっても、その免疫原性
は、しばしば充分な反応を引出すには不充分である。
この問題はアジュバントを用いることによって克服で
きるが、このようなアジュバントは更に困難を起こす。
現在、ヒトに対する使用を許可されている唯一のアジュ
バントは、水酸化アルミニウムである。しかしながら、
水酸化アルミニウムは、Leishmania（リューシュマニ
ア）およびToxoplasma（トキソプラズマ）などの細胞内
病原体に対してワクチンが有効であるならば基本的特性
である細胞性免疫（CMI）を補助しないため、全ての抗
原の充分なアジュバントとは考えられない。フロイント
完全アジュバント（FCA）は、細胞性免疫を刺激する
が、肉芽腫の形成、癒着および他の毒性副作用を助長す
るために、ヒトまたは獣医学上の使用には適していな
い。また、FCAは数カ月の間続き得る局部的炎症反応を
起こす。細胞性免疫（CMI）を、好ましくはFCAに見られ
るのと匹敵するレベルで促進する新規な非毒性アジュバ
ントに対する緊急の需要が存在している。実際、このよ
うなアジュバントは、サブユニットワクチンの完全な潜
在能力が実現されるのであれば、重要であろう。
我々は、抗原を捕獲した非イオン性界面活性剤小胞
（NISV）が、内在的に弱免疫反応を起こすより短いペプ
チド抗原と共に用いたとしても、効果のある免疫アジュ
バントとして使用することを発見した。実際、我々は、
アジュバントとしてFCAを用いた場合と略同程度の大き
さの抗体力価と、より大きなＴ細胞刺激指数とを観察し
たが、明らかな毒性を観察しなかった。また、免疫反応
は、後により詳しく議論されるように、量的と同様に質
的にも変化させることができる。
最も良く知られている小胞は、リン脂質二重層を有す
るリポソームである。しかしながら、他の両親媒性分
子、例えば非イオン性界面活性剤（NIS）なども、小胞
を形成させることができる。実際、このようなNISVは、
抗腫瘍薬など、例えばメトトレキサートおよびドキソル
ビシン（doxorubicin）等のための薬剤キャリヤーとし
て提案されている。しかしながら、NISVは、抗原が単独
では最少反応しか引き出さない場合であっても、抗原に
対する免疫反応を著しく増強しうるという認識は、全く
知られていなかった。
したがって、１つの観点において本発明は、NISVに捕
獲された少なくとも１つの抗原、特に合成あるいは組換
え起源のペプチドを含んだワクチンを提供する。
本発明の他の観点は、上記NISVに捕獲された少なくと
も１つの抗原を投与することからなる、哺乳類または非
哺乳類における少なくとも１つの抗原に対する免疫反応
の増強方法である。
本発明の更なる観点は、少なくとも１つの抗原、例え
ば合成あるいは組換え起源のペプチド抗原を、NISV内に
捕獲することからなるワクチンの製造方法である。
NISVを形成するために用いられる非イオン性界面活性
剤は、適切な界面活性特性を有する薬理学的に許容され
る材料の何れであってもよい。このような材料のこの好
ましい例は、グリセロールエステルである。このような
グリセロールエステルは、１または２以上の高級脂肪族
アシル基を有していてもよく、この基は、例えば各アシ
ル部分に少なくとも10以上の炭素原子を含んでいる。グ
リセロールモノエステルが好ましく、特にC12〜C20のア
ルカノイル部分またはアルケノイル部分、例えばカプロ
イル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、オレ
イルまたはステアロイルなどを含むものが好ましい。特
に好ましい界面活性剤は、１−モノパルミトイルグリセ
ロールである。
エーテル結合界面活性剤もまた、本発明によるNISVの
構成部分である非イオン性界面活性剤として用いること
ができる。このような材料の好ましい例は、グリセロー
ル、あるいはグリコール、好ましくは４個までの炭素原
子を有する低級脂肪族グリコール、最も好ましくはエチ
レングリコールを基礎とするエーテル結合界面活性剤等
である。このようなグリコールを基礎とする界面活性剤
は、２個以上のグリコール単位、好ましくは５個までの
グリコール単位、最も好ましくは２個または３個のグリ
コール単位から構成されていてもよく、例えばジグリコ
ールセチルエーテルまたはポリオキシエチレン−３−ラ
ウリルエーテルである。グリコールまたはグリセロール
のモノエーテルが好ましく、特にC12〜C20のアルカニル
部分またはアルケニル部分、例えばカプリル、ラウリ
ル、ミリスチル、セチル、オレイルまたはステアリルな
どを含むものが好ましい。
本発明で用い得るエチレンオキシド縮合物としては、
WO88/06882に開示されるもの、例えばポリオキシエチレ
ン高級脂肪族エーテルおよびアミン界面活性剤が挙げら
れる。特に好ましいエーテル結合界面活性剤は、１−モ
ノセチルグリセロールエーテルおよびジグリコールセチ
ルエーテルである。しかしながら、本発明で用いるに
は、薬理学的に許容される材料、好ましくは哺乳類の器
官系内で容易に生物分解されるものを選択することが必
要である。この理由から、我々は、皮下、筋肉内、皮内
または腹膜組織内の注射により、あるいは口、鼻、気管
支、尿生殖器または直腸投与（特に経口投与が好まし
い）などの粘膜経路を介して投与されるべき小胞の調製
には、上記グリセロールエステルを好ましいと考える。
効果的な小胞形成には、非イオン性界面活性剤を、二
重層を形成し得る高分子量の適当な親水性材料、特にス
テロイド、例えばコレステロールなどのステロイドと混
合する必要があるであろう。ステロイドの存在は、小胞
の物理的特徴が依存する二重層を形成するのを助ける。
NISVは、電荷生成両親媒性物（charge−producing am
phiphile）と混合し、NISVに負の電荷を有するようにし
てもよい。酸材料、例えば高級アルカン酸および高級ア
ルケン酸（例えばパルミチン酸、オレイン酸）；または
酸基を含む他の化合物、例えばジアルキルリン酸エステ
ル、好ましくはジセチルリン酸などのジ（高級アルキ
ル）リン酸エステル、またはホスファチジン酸またはホ
スファチジルセリン；または硫酸モノエステル、例えば
セチル硫酸などの高級アルキル硫酸を、この目的に用い
ることができる。
ステロイドは、例えば20〜120重量％、好ましくは60
〜100重量％の非イオン性界面活性剤を含んでいてもよ
い。負電荷を生成する両親媒性材料は、例えば１〜30重
量％の非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。
電荷生成両親媒性材料は、小胞の構造を安定させ、効
果的な分散液を提供する。
非イオン性界面活性剤および膜形成疎水性材料は、剪
断力の存在下での水和によってNISVに換えることができ
る。このような剪断力を加えるための装置は公知であ
り、好適な装置は例えばWO88/06882に言及されている。
音波処理および超音波処理もまた、NISVを形成するた
め、あるいはその粒子サイズを変更するための効果的な
手段である。
NISVの製造に効果的な方法は、Collins et al.,J.Pha
rm.Pharmoc ol．42,53（1990）により開示された方法で
ある。これは、NIS、ステロイド、および両親媒性物
（もし用いれば）の混合物を溶融し、次いで水性緩衝液
の存在下で激しく混合して水和することを含んでいる。
この懸濁液は、NISV形成混合物を溶融状態に維持するの
に充分に上昇させた温度で、微小多孔性ポリカーボネー
ト膜を通して数回押出してもよい。
有機溶媒、例えば炭化水素溶媒またはクロロホルムな
どの塩素化炭化水素溶媒などからの回転フィルム蒸発に
より、NISVを形成することも可能である。得られた薄膜
は、次いで抗体および任意の他の界面活性剤の存在下、
リン酸塩緩衝生理食塩水中で水和することができる（Ru
ssell and Alexander,J.Immunol．140,1274（1998）。
抗原が、NISV形成時に、このNISV中に捕獲される場合、
小胞外抗原は、公知の分離方法、例えばゲル濾過または
超遠心などの遠心等によって洗浄することで小胞懸濁液
から分離することができる。
抗原を既に形成したNISV内に捕獲し得る方法は、脱水
−再水和法（Kirby and Gregoriadis,Biotechnology
２,979（1984）であり（この方法では、水相に存在する
抗原がフラッシュ冷凍によって、既に形成された小胞中
に捕獲され、引き続き凍結乾燥される）、および凍結融
解技術（Pick,Arch.Biochem.Biophys.212,195（198
1））である。後者の技術では、小胞は抗原と混合さ
れ、繰り返し液体窒素中でフラッシュ冷凍され、かつ例
えば約60℃（即ち対応する界面活性剤の転移温度以上）
の温度に温められる。
小胞は、更に処理し、例えば洗浄および遠心などによ
って、非捕獲抗原を全て除去してもよい。我々の得た結
果が、NISは単独では効果的なアジュバントではなく、
即ち小胞形成が望ましい効果を得るために重要であるこ
とを明らかに示していることに注目すべきである。もし
望ましいアジュバント効果を達成するのであれば、抗原
はNISV中に捕獲されなければならない。
抗原は、例えば８〜50、好ましくは10〜20のアミノ酸
単位を有する合成または組換え起源のペプチドであるこ
とが好ましい。抗原は、例えば１つ以上の病原微生物の
Ｂ細胞、またはＢ細胞およびＴ細胞のエピトープを模倣
し、ワクチンがこの微生物に対する中和抗体を誘発する
ようにしてもよい（例えば、我々のWO88/10267およびWO
/13909におけるHIVに対する合成抗体の開示を参照せ
よ）。
あるいは、ペプチドは、他の生体活性物質、特にホル
モン活性を有する物質に対する免疫反応を誘発してもよ
い。後者の範疇における例としては、内因性黄体形成ホ
ルモン−放出ホルモン（LHRH）に対する免疫反応の誘発
であってもよい。このような処置は、農業家畜の男性ホ
ルモン抑制または免疫去勢、および男性ホルモン感受性
または発情ホルモン感受性悪性腫瘍の処置（我々のGB−
Ｂ−2196969参照）に用いることができる。ペプチド抗
原そのものは、NISVに捕獲された場合に、しばしばワク
チンとして用いるのに充分な免疫原性を示すであろう。
これは特に、ペプチドが良く認識されたエピトープを含
み、少なくとも約12、好ましくは少なくとも15のアミノ
酸残基を有している場合である。
ある場合には、ペプチドをキャリヤーに結合してその
免疫原性を促進することが好ましいであろう。適切なキ
ャリヤーは本技術分野で公知であり、例えばタンパク質
キャリヤー、例えばツベルクリンの精製タンパク質誘導
体（PPD）、破傷風トキソイド、コレラ毒およびそのＢ
サブユニット、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、
大豆トリプシンインヒビター、ムラミルジペプチドおよ
びその類似体、およびブラウンのリポプロテインなどで
ある。PPDをキャリアーとして用いる場合には、もしワ
クチンのレシピエントが、例えば初期BCGワクチン接種
によって、既にツベルクリン感受性であると、抗体の高
力価が達成される。
NISV内に捕獲される抗原（１つ以上）は、従来の製剤
法を用いて、例えば非経口的に許容される減菌水性賦形
剤中の懸濁によって、ワクチンに調剤することができ
る。
合成または組換えペプチドは、本発明で用いる好まし
い抗原であるが、タンパク質抗原がNISVに捕獲された場
合にも、強いアジュバント効果が観察される。例えば、
肯定的な結果が、抗原としてウシ血清アルブミン（BS
A）を用いて得られた。より重要なことに、NISVアジュ
バントを用いたToxoplasma gondii（トキソプラズマ・
ゴンディ）の破壊細胞の上澄みによる免疫によって、ト
キソプラズマ症に対する効果的な防御が確率された。
皮下接種は、しばしば注射による投与の最も効果的な
モードであり、特にしばしば腹膜組織内投与より有効で
あろう。筋肉内注射または皮内注射は有効である。これ
は、多分、注射部位に抗原貯留部を形成する結果となる
ためである。しかしながら、注射部位は、FCAが引き起
こすことで名高い慢性炎症反応を示さなかった。注射に
よる投与は、全身的な免疫反応、すなわち体液性および
細胞性の両方の免疫を誘発する。１つの粘膜表面（例え
ば鼻）での免疫は、他の粘膜表面（例えば気管支）での
粘膜免疫反応を引き起こす結果となることが予期され
る。本発明に係るワクチンは、粘膜経路を介しても投与
することができる。
本発明の他の驚くべき、かつ価値ある特徴は、NISV内
に捕獲された抗原が、経口経路により投与された場合
に、しばしば有用なレベルの免疫反応を示すことであ
る。NISVは、抗原を胃腸管内での消化から少なくともあ
る程度保護することができ、かつ無電荷の腸壁を通過さ
せうるようであり、従って今までは非経口投与において
のみ得られていた結果を与えるであろう。
本発明は、従って、上記抗原をNISV内に捕獲すること
を含む経口活性ワクチンとしての抗原の調剤方法を提供
する。
例えば合成ペプチドの、経口投与によるアジュバント
効果を達成する能力は、本発明のワクチンの高度に有益
な特性であり、かつ従来技術において、以前は予期でき
なかった特性である。経口投与経路は、注射による先の
投与経路に対して幾つかの利点を有している。注射に伴
う感染の危険、例えば滅菌しない針を用いることから誘
発される感染の危険を避けることができる。全身的免疫
反応を誘発するのに加えて、経口投与は、粘膜反応をも
誘発することができる。このような粘膜反応は多くの病
原体、例えばHIV、Toxoplasumaなどに対する免疫防御に
おいて重要であると考えられている。患者に対する許容
度も、経口組成物に対しては高い。
特に経口投与されるべきワクチンとして用いられる小
胞の調剤において、エステル結合界面活性剤が好ましい
が、エーテル結合界面活性剤、特に１−モノセチルグリ
セロールエーテルおよびジクリコールセチルエーテルを
用いることができる。エーテル結合は、対応するエステ
ル結合よりも酸安定性が高く、哺乳類の胃の酸性環境に
おける分解に耐え得るより高い能力を有していると信じ
られている。
本発明の新規ワクチンによって作り出された免疫反応
の更なる解析により、驚くべきことに、高割合の抗体
は、IL−２およびIFN−γの放出に関連するIgG2a型の抗
体であることが示された。これらサイトカイン（cytoki
ne）は、CD4＋Ｔリンパ球のTh1サブセットによって分泌
される。高IgG2aレベルは、細胞性免疫（CMI）の発達に
関連すると信じられている。一方、水酸化アルミニウム
は優先的にTh2細胞を刺激し、結果としてIgG1抗体を産
生し、フロイント完全アジュバントは、一般的に高めら
れた細胞性免疫と関連するが、高くかつ延長されたIgG1
力価をも作り出す。Th2細胞は、IgG1ばかりでなく、IgE
合成の（IL−４分泌を介した）第一制御因子である。従
って、プラズマ中での高レベルIgG1の継続的産生は、Ig
Eの過剰産生を示すこともあるため、好ましくないであ
ろう。近年のインビトロでの研究によって、Th1およびT
h2細胞は、異なる抗原処理上の要求を持っていることが
認められた。Th1細胞はマクロファージによる抗原提供
を要求する一方、Th2細胞は、Ｂ−細胞提供により最適
に刺激される（Gajewski et al,Immunol.Rev.III,79,
（1989）およびGajewski et al,J.Innunol.146,1750,19
91参照）。マクロファージはリポソームを摂取する能力
があるようであり、従って小胞内への抗原のカプセル換
はTh1活性化およびIgG2a抗体の合成に、結果として伴う
高レベルCMIとともに、好都合であろう。
我々の結果は、本発明に係る新規ワクチンが、最初は
FCAによって誘発される力価より大きいが、時間ととも
に、結局FCAによって作り出される力価と匹敵するIgG2a
力価を誘発することができることを示した。本発明に係
るワクチンに対する初期反応は、FCAによって達成され
る刺激と比較した場合、Th2リンパ球と比較して優先的
なThリンパ球の刺激であるようである。また、我々の結
果は、本発明に係るワクチンを用いて達成したIgG1の誘
発された力価は、FCAを用いて作り出したものと同程度
であり、従って本発明のワクチンは体液性免疫を仲介す
るのにも有用であることを示した。
従って、本発明の他の観点は、少なくとも１つの抗原
をNISV中に捕獲することを含む、Th1 Tリンパ球経路を
介した抗体産生を刺激するための少なくとも１つの抗原
の調剤方法である。
本発明に係る調剤抗原は、Th2 Tリンパ球経路を介し
た抗体産生をも刺激する。抗原は、Th2 Tリンパ球経路
と比較して、特にFCAアジュバントを用いて生じた抗体
レベルと比較して、Th1 Tリンパ球経路を介する抗体産
生を優先的に刺激するように調剤できる。
更に、NISV増強抗原での免疫によって誘発された抗体
の力価は、実際、FCAを用いて得られたものよりも高く
なり得る一方で、FCAの強い毒性効果を完全に避けるこ
とができる。従って、本発明の他の観点は、少なくとも
１つの抗原をNISV中に捕獲することを含む、少なくとも
１つの抗原の免疫原性を、少なくともフロイント完全ア
ジュバントの使用によって得られるものと同程度まで増
強する方法である。
NISVは、細胞性および体液性免疫を要求する疾患に対
するワクチンに用いるのに理想的なアジュバントである
ようである。アジュバントとしてのNISVの、特にエーテ
ル結合界面活性剤を含むものの他の主な利点は、典型的
な環境条件下での安定性である。特に、これらは、卵レ
シチンに基づくリポソームと同様の分解自己酸化反応を
起こさない。
ワクチンに用いるアジュバントとしてのNISVの更なる
重要な利点は、従来のアジュバントとは異なり、NISVが
実質的に非毒性であることである。我々は、１−モノパ
ルミトイルグリセロールエステルを含む小胞内に捕獲さ
れたLHRH類似体LHRH−Gly−Cys（我々のEP−Ａ−029353
0に開示されるような）をラットに腹膜組織内注射する
と、毒性副作用、特にしばしばフロイント完全アジュバ
ントに、またはアルミニウムゲルにでさえ伴う副作用を
全く起こさなかったと言うことを発見した。試験動物
に、検出可能な病理は観察されなかった。
上記のEP−Ａ−0293530には、式pGlu−His−Trp−Ser
−Try−Ｘ−Leu−Arg−Pro−Gly−Ｙ−Ｚ（式中、ＸはG
lyまたはＤ−アミノ酸を示し、Ｙは１個または数個のア
ミノ酸残基を示し、これらの残基は同一でも異なっても
よく、ＺはCysまたはTryを示す）で表されるLHRH類似体
が記載されており、この類似体の溶液中のコンフォメー
ションは、天然LHRHの溶液中のコンフォメーションと実
質的に同様である。類似体LHRH−Gly−Cysは、Seq.I.D.
No.2として表される。
本発明により意図されるワクチンは、基本的に哺乳類
に適用でき、従ってヒトおよび獣医学上の薬剤の分野で
適用できる。また、NISVは、ある非哺乳類用ワクチンの
ための、例えば、魚類および家禽のワクチンのための効
果的なアジュバントを提供できると見なされる。
以下の実施例により、NISVのアジュバント特性を説明
する。
実施例１−LHRH−Gly−Cys−PPDによるラットの免疫感
作 NISVの形成 非イオン性界面活性剤、コレステロールおよびジセチ
ルホスフェート（Sigma,Poole,Dorset,UK）のモル比5:
4:1の混合物から、小胞を形成した。μモル数およびmg
での重量を下記に示す。
小胞は、Collins et alの技術（上記）によって形成
した。次いで、小胞を、Mettler Electronics水浴音波
処理装置（50Hz.Pasadena.CA）において20℃で５分間音
波処理した。黄体形成ホルモン−放出ホルモンの類似体
である抗原LHRH−Gly−Cysは、本出願人のEP−Ａ−0293
530に記載されている。予め形成された小胞中への抗原
の捕獲は、KirbyおよびGregoriadisにより記載された脱
水−再水和技術（Biotechnology,2,979（1984））によ
って行った。簡単に述べると、小胞溶液5ml（150μモ
ル）を、ポリプロピレン製遠心管（Elkay Products In
c.,Shrewsbury,MA）中で、PBS中の抗原（0.5mg/ml）1ml
と混合し、液体窒素中に渦巻き状に入れることにより、
薄い殻状にフラッシュ凍結した。次いで調製物を、蒸留
水0.5ml中で再水和する前に、凍結乾燥機内で0.1torrに
おいて一夜凍結乾燥した。サンプルを30分間放置し、蒸
留水で6mlにした。
ａ）BCG一次感作およびアジュバントを使用または不使
用のLHRH−Gly−Cys−PPDによる免疫感作 ８つのグループの雄性Copenhagen Fisher F1ラット
に、リン酸塩緩衝食塩水中のLHRH−Gly−Cys−PPD、NIS
V中に捕獲されたLHRH−Gly−Cys−PPD、FCA中のLHRH−G
ly−Cys−PPDのエマルジョンおよび水酸化アルミニウム
上に吸着されたLHRH−Gly−Cys−PPDを0.2ml腹腔注射し
た。各注射におけるLHRH−Gly−Cysの量は、食塩水、FC
A/FIAおよび水酸化アルミニウムを用いた場合は50μ
ｇ、NISVを用いた場合は５μｇであった。
４つのグループのラットに、LHRH−Gly−Cys−PPD複
合体を最初に注射する４週間前に、先ずBCGを注射し
た。２週間の間隔で合計４回の複合体の注射を行った。
抗−LHRH抗体の決定 間隔をおいて得られた血漿サンプルを、ELISA法によ
り抗−LHRH抗体についてアッセイした。組織培養等級の
96−ウェルマイクロタイタープレートを、LHRH−Gly−C
ys−BSA（PBS中、pH7.2）で、0.1μg/ウェルの量で被覆
し、37℃で１時間インキュベートした。ウェルをPBS/0.
1％Tween緩衝液で３回洗浄した後、３％Marvel/Tween20
0μｌを用いて37℃で１時間ブロックした。ウェルを上
記のように洗浄し、PBSで希釈したサンプル50μｌを一
対のウェルに加えた。サンプルを37℃で１時間インキュ
ベートし、ウェルを前記のように洗浄した。PBSで1:500
0に希釈したホースラディッシュ過酸化酵素ヤギ抗−ラ
ットIgG複合体（Sigma）50μｌのアリコートを、各ウェ
ルに加え、37℃で45分間インキュベートした後、前記の
ように洗浄した。過酸化水素４μｌ、およびジメチルス
ルホキシド中のテトラメチルベンチジン原液（6mg/ml）
250μｌを、0.1M酢酸塩−クエン酸塩緩衝液（pH5.5）25
mlに加えることにより、基質溶液を調製した。
各ウェルに基質100μｌを加えた後、室温で暗所にお
いて５分間インキュベートした。10％硫酸（v/v）の添
加により反応を停止し、450nmでの吸光度を測定した。E
LISA法の結果は、陽性コントロールのパーセントで表さ
れる。アッセイを通じて対照標準を用いて、相互および
内部比較（inter−and intracomparison）を行うことが
できるようにした。対照標準は、FCA中のLHRH−Gly−Cy
s−PPDで免疫した多数のラットからの血清プールであ
る。この陽性コントロールは、100％の任意値を有をす
る。
結果 各ELISAの結果を図１および２に示す。図１は、食塩
水（Ａ）、NISV（Ｂ）、Freundの完全および不完全アジ
ュバント（Ｃ）および水酸化アルミニウム（Ｄ）中のLH
PH−Gly−Cys−PPD複合体で免疫したCopenhagen−Fishe
r雄性ラットの抗体応答を描いている。LHRH−Gly−Cys
に対する抗体応答は、FCA/FIAまたは水酸化アルミニウ
ムを用いた場合に、より大きいように見えるが、これら
のアジュバントと共に投与したペプチド量は、NISVに導
入された量の10倍である。従って、NISVは、水酸化アル
ミニウムまたはFreundの完全アジュバントよりも少ない
量のペプチド複合体をアジュバント化する（adjuvantin
g）際に、更に有効な増強効果を有するようである。図
２は、LHRH−Gly−Cys−PPD複合体に対する抗体応答に
及ぼすBCG一次感作の効果を示している。一次感作を行
った場合にも、行わなかった場合にも、同程度の免疫応
答が見られた。ここでもまた、得られた抗体力価はFCA
および水酸化アルミニウムの場合に高い。しかしなが
ら、これらのアジュバントでは、NISVでの10倍量の免疫
原が投与された。
ｂ）NISVのアジュバント効果を更に正確に証明するため
に、同じ量の抗原に対する抗体応答を、FCA中のLHRH−G
ly−Cys−PPD、および前記のようにして調製したNISV内
部のLHRH−Gly−Cys−PPDを注射したBALB/Cマウスにお
いて測定した。
LHRH−Gly−Cys−PPDによる免疫感作 ３匹の雌性BALB/Cマウスに、FCA中のLHRH−Gly−Cys
−PPD（PBS中の複合体:FCAは1:1v/v）0.2mlを皮下注射
した。２週間後に、FIA中のLHRH−Gly−Cys−PPD（PBS
中の複合体:FIAは1:1v/v）0.2mlを皮下注射することに
より、マウスを追加免役した。
５匹の雌性BALB/Cマウスに、同様に、NISV内に捕獲さ
れたLHRH−Gly−Cys−PPD0.2mlを皮下注射し、２週間後
に、更に0.2mlで追加免役した。BCG一次感作は用いなか
った。各注射により、同じ100μｇのLHRH−Gly−Cys−P
PDを投与した。
抗−LHRH抗体の決定 ２度目の免疫感作から１週間後に、尾部採血を行い、
血清サンプルをプールし、本質的に上記のELISA法によ
って、しかし終点力価を確立するために一連の希釈を用
いて、総抗体応答を測定した。
結果 結果を図３に示す。等しい免疫学的チャレンジにおい
て、NISVは有能なアジュバントであり、かつ、FCAで達
成されるよりも高いLHRH特異的抗体レベルを誘導できる
ことが、明確に判る。
図１および２の記号解： A:アジュバント無し（食塩水） B:NISV C:FCA ＆ FIA D:水酸化アルミニウム 矢印は、免疫感作の時を示す。
図1: LHRH−Gly−Cys−PPD 図2: BCG＋LHRH−Gly−Cys−PPD 図3: LHRH−Gly−Cys−PPD 実施例２ ウシ血清アルブミン（BSA）による免疫感作 実施例１に記載の成分から、実施例１に記載の方法に
より、あるいはクロロホルムからの回転フィルム蒸発に
より、小胞を形成した。PBSおよび抗原（5mg/ml）中
で、あるいはRussellおよびAlexanderによりリポソーム
について記載されたようにして（上記）、界面活性剤
（１％ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、Sigm
a）および抗原（5mg/ml）（PBS中）を用いて、得られた
フィルムを水和した。界面活性剤（使用した場合）およ
び捕獲されなかった抗原を除去するために、調製物を8
4,000gで40〜44分間遠心し、ペレットをPBS中に再懸濁
させた。洗浄を２回繰り返した。
８〜10週令のBALB/cマウスを１グループにつき４〜５
匹用いた。第１日目に、マウスのグループに、BSAを捕
獲したNISV（NISV/BSA）、あるいはFCA中のBSAエマルジ
ョン（FCA＋BSA:Sigma）を皮下注射または腹腔内注射し
た。各注射における最終BSA濃度は0.5mg/mlであり、各
マウスにBSA 100μｇの用量で投与した。マウスに二次
チャレンジの14日間前に、一次注射を与えた。図４中の
ヒストグラムにおいて、第14日、28日等は、第二チャレ
ンジ後の時を示している。
抗BSA抗体をELISA法で測定した。図４のセクション
（ａ）は、IgG1に関する抗体力価を示し、セクション
（ｂ）は、IgG2aに関する抗体力価を示す。斜線のヒス
トグラムはNISV/BSAに関し、黒いヒストグラムはBSA＋F
CAに関する。（ａ）および（ｂ）の各場合に、図の左側
のヒストグラムは腹腔内注射で得られた結果を表し、右
側のヒストグラムは皮下注射で得られた結果を示す。
腹腔内注射により、FCA＋BSAは70日まで持続した極め
て高いIgG1力価を生じ、NISV/BSAでは力価が時間と共に
減少したことが判る。皮下注射によると、NISV/BSA免疫
感作は、初めはFCAよりも高い力価を生じたが、70日ま
でにFCA＋BSAで得られた力価よりも充分低い力価に低下
した。
これとは対照的に、セクション（ｂ）のIgG2aに関す
るアッセイは、NISV/BSAが腹腔内または皮下の何れかの
経路によって、初めはFCA＋BSAが与えたよりも充分高い
力価を引き出したが、70日までにFCA＋BSAにより生じた
IgG2aレベルの時間に依存した増加のため、両方のアジ
ュバント調製物により生じた力価は類似していたことを
示している。
実施例３ 種々の界面活性剤から調製されたNISVのアジュバント活
性 FCAの皮下注射後に観察された肉芽腫が、NISVの注射
後に全く存在しなかったことは、注目に値する。
NISVを、ａ）１−モノパルミトイルグリセーロール
（MPG）（実施例１および２と同様）、またはｂ）ポリ
オキシエチレン−３−ラウリルエーテル（POE）から、
実施例１に記載したような5:4:1の界面活性剤：コレス
テロール：ジセチルホスフェートの比率で形成した。８
〜10週令の雌性BALB/cマウス（各グループ５匹）に、実
施例１に記載したのと同様にして、１日目に、NISV内に
捕獲されたBSAまたはPBS中のBSA溶液として注射した。
二次チャレンジ後14、35および70日目に、全Ig、IgG1お
よびIgG2aレベルをELISA法でアッセイした。この分析の
ために、血漿を、全抗体力価分析には1/8000に、IgG1に
は1/15000に、IgG2aには1/1000に希釈し、個々のマウス
の血漿中に存在する抗体力価を、ELISA法で検出された
吸光度として表した。得られた結果を図５に示す。図5a
には二次接種後の種々の時点で検出された全免疫グロブ
リンを示し、図5bおよび5cは、それぞれIgG1および1gG2
aのレベルを示す。
各界面活性剤から調製したNISVは、アジュバント無し
のBSAと比較して、捕獲されたBSAに対する抗体力価を有
意に増加させたことが判る。分析した全ての抗体サブク
ラスに関し、MPGを基礎とするBSA捕獲小胞は、二次注射
後14日に、POEを基礎とするBSA捕獲小胞よりも高い抗体
力価を生じた。二次注射後35日まで、IgおよびIgG1の力
価は、POEよりもMPGを基礎とする小胞で高かったが、Ig
G2aレベルは同様であった。70日まで、小胞調製物間の
全抗体力価、あるいは分析した免疫グロブリンサブクラ
ス間に、有意差はなかった。
このように、NISVのアジュバント活性は、広く適用可
能であり、そして界面活性剤に依存しないことが判る。
実施例４ 類似遺伝子型系統のマウスにおけるNISVのアジュバント
活性 ある従来技術のアジュバントは、遺伝的に決定された
固体間での免疫応答における違いに関して制限された用
途しか持たないことが知られている。NISVのアジュバン
ト活性が、遺伝的には限定されないことを示すために、
BSA単体（すなわちPBS中）で、NISV中に捕獲したBSA、
あるいはフロイント完全アジュバントを用いたエマルジ
ョン中のBSAに対する抗体応答を、BALBマウスの三系
統、BALB/c、BALB/BおよびBALB/kにおいて測定した。NI
SVを、実施例１および２に従って調製し、これらグルー
プのマウスに皮下注射した。抗体レベルをELISAによっ
て測定し、結果を図6A、ＢおよびＣに示した。図6Aにお
いて、BSA特異的全抗体力価は、二次接種後14日（図
ａ）、35日（図ｂ）および70日（図ｃ）に収集された血
液から調製した血漿において検出された値が示されてお
り、これらの結果は、450nmで検出された平均吸光度
（＋／−S.E）として表されている。同様のデータを、I
gG1（図6B）およびIgG2a（図6C）に関して示した。ELIS
Aのために、血漿サンプルを1/1500に希釈し、複合体を1
/1000に希釈して用い（6A）、プラズマおよび複合体各
々に関して対応する数値は、1/30000および1/8000（6
B）、および1/1000および1/800（6C）であった。
全てのマウス系統において、NISV/BSAは、全抗体およ
び特定アイソタイプIgG1およびIgG2aの両方に関して、
高い抗体力価を生み出すことが判る。BSAおよびFCAと比
較した比力価は、二次チャレンジ後の時間、および異な
る系統によって変化するが、NISVは試験された３系統全
てにおいてアジュバント効果を達成し、BSA/FCAによっ
て産生されたものより大きいか、あるいは少なくとも匹
敵する程度の抗体応答を誘発することができた。
実施例５ 先天性トキソプラズマ症に対するワクチンの製造 トキソプラズマ症は、原生動物（protozoan）Toxopla
sma gondii（トキソプラズマ・ゴンディ）によって引き
起こされる鳥類および哺乳類の疾患である。非防御な動
物において、この疾患は母体から胎児に垂直に移行し、
この移行は結果的に胎児を死亡させ得る。しかしなが
ら、防御免疫は、前の感染によって、またはある程度ま
でワクチンによって発生し得る。これはCD8+T細胞およ
びTh1 CD4+サブセット間の共同作用からの結果であると
信じられている。特にＴ細胞のこれらサブセットの活性
化に関するNISV捕獲抗原のワクチン特性を、研究室モデ
ルとしてのBALB/cおよびBALB/Kマウス系統において調査
した。
マウス 同血統のBALB/cおよびBALB/Kマウス、および他血統の
Strathclyde A系統マウスを、従来条件に維持した。マ
ウスを、８〜10週令の時に用い、各実験グループを、５
〜10固体で構成した。
12週間前にT.gondiiのRRA（Beverly）株を感染させた
系統Ａマウスの脳を、組織嚢胞（tissue cysts）源とし
て用い、これは文献記載（Roberts and Alexander 199
2,Parasitol.104,19−23）のように収集し、計数した。
全ての実験的感染は経口経路であり、先天性感染モデル
は、文献記載（Roberts and Alexander 1992）のもので
あった。簡単に言えば、BALB/cマウスを、20個の組織嚢
胞を用いて妊娠11〜12日に感染させた。次いで、生存す
る子を感染養母に移した後、先天性感染の罹患率を、EL
IZAによって、生後８〜９週目に測定した。感染の激し
さを、適正である場合は、死亡率レベルあるいは脳中の
全嚢胞数によってモニターした。
抗原調製物 凍結−溶解殺傷タキゾイト（tachyzoites）（kp）、
タキゾイト排出／分泌抗原（ESAg）、膜抗原および可溶
性抗原（STAg）を、全てワクチン研究に用いた。RH株の
T.gondiiタキゾイトは、感染コットンマウスの腹腔滲出
物から得、生理食塩水で３回洗浄した。ESAgは、40mlの
PBS中で５×1010のタキゾイトを一昼夜インキュベート
することにより得た。全てのタンパク質濃度は、Bradfo
rdアッセイ（Bradford 1976 Analyt.Biochem.72,248−2
54）によって決定した。タキゾイト可溶性および膜抗原
フラクションは、低張緩衝液（40mlの10mMトリス−塩
酸、2mM EDTA、pH7.8）中で、Braunホモジナイザーを用
いて５×1010の寄生虫を破壊した後に、４℃で30分間、
1000gにて遠心することにより得た。上澄みはSTAgを含
み、ペレットは膜フラクションを含んでいた。膜抗原
を、１％オクチルグリコシドを用い、100,000gにて遠心
することによって更に精製した。上澄みを収集し、４℃
のPBSに対して一昼夜透析して、界面活性剤を除去し
た。
ワクチン調製物 ワクチン調製物を受ける全ての動物に、感染前２週間
および４週間、50μｇのタキゾイト抗原を皮下に接種し
た。ワクチン用の抗原は、フリー形態で、フロイント完
全アジュバント中でエマルジョン化して、あるいは非イ
オン性界面活性剤小胞内に捕獲して用いた。
小胞形成 １−モノパルミトイルグリセロールNISVへのSTAgの捕
獲を、実施例１に記載の方法で行った。
結果 得られた結果を、図7A〜Ｄに示した。
図7Aは、感染させる２週間前または４週間前に、NISV
に捕獲されたSTAg、STAg単体、あるいはNISVと混合した
STAgを皮下接種した後、20嚢胞で経口感染させたBALB/K
マウスの脳内における、感染後４週間の平均嚢胞数（＋
／−S.E.）を示す。図から判るように、NISV内捕獲STAg
は、他のグループと比較して、有意に減少した嚢胞数を
生み出した。
図7Bは、平均血清抗体レベルを示し、図7Cは20嚢胞で
の経口感染後８週間のBALB/c母マウスにおける脳中平均
嚢胞数を示す。マウスは、妊娠11〜12日に感染させた。
ワクチン接種グループには、感染前２および４週に、NI
SV内捕獲STAg（50μｇ）を皮下に接種した。図から判る
ように、NISV内捕獲抗原によるワクチン接種は、コント
ロールと比較して、脳内嚢胞数および抗体レベルの両方
を有意に減少させた。
図7Dは、ワクチン接種マウスおよびワクチン非接種マ
ウスに生まれた子の運命を示している。図から判るよう
に、ワクチン接種マウスに生まれた子孫の50％以上が感
染したという事実にも係わらず、半数以上の子が生後直
ぐ、または24時間以内に死亡したワクチン非接種サンプ
ルと比較して、ワクチン接種マウスに生まれた子には胎
児死亡は起こらなかった。
従って、NISV内への可溶性抗原の捕獲は、成体マウス
に対してこの抗原の防御を増幅し、胎児死亡を完全に無
くするアジュバント効果を促進することが示された。
実施例６ NISVが合成Ｔ細胞エピトープ用のアジュバントとして作
用する能力 ペプチドの製造 嚢虫Ｆタンパク質の258〜277残基である“Giles"ペプ
チドを、従来のFMOC化学で合成した。このペプチドは、
配列：（Seq.I.D.No:1）GILESPGIKARITHVDTESYを有し、
Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの両方を有し
ている。
NISVは、Collinsの方法（上記）に従って、１−モノ
パルミトイルグリセロールエステルから製造し、抗原
は、Pickの凍結−解凍技術（上記）を用いて捕獲した。
免疫感染 ８〜10週令の雌性BALB/cマウスのグループ（各グルー
プにマウス４個体）を、PBS中の、NISV内に捕獲した、
またはFCA中にエマルジョン化したPBS中のペプチド25μ
ｇで、皮下にて免疫した。１週間後、これらの脾臓を除
去し、ペプチド特異的Ｔ細胞増殖反応を、チミジン組み
込みアッセイ（Corradin et al,J.Immunol.119,1048−1
053（1977））によって測定した。
結果 結果を図８および９に示した。アッセイで試験された
全ての濃度において、NISV捕獲抗原で免疫されたマウス
からの脾臓細胞は、PBSまたはFCA中のペプチドを受けた
マウスから誘導された細胞と比較して、インビトロにお
いてより多く増殖した（図８）。
50μg/mlのGILESで刺激された培養物からの上澄み
を、刺激後48時間で除去し、ELISAによってIFNγの存在
に関してアッセイした。図９から判るように、アジュバ
ントと共に、GILESでワクチン接種されたマウスからの
脾臓細胞は、PBS中のGILESでワクチン接種したマウスと
比較して、有意に多いIFN−γを産生し、NISV−捕獲抗
原は、FCA中の抗原より多いIFN−γを産生した。従っ
て、NISVは、ホルモンに対してと同様に、より大きなウ
イルスタンパク質に対応するペプチドに対しても、アジ
ュバントとして作用し得る。更に、NISVは、抗原特異的
Ｔ細胞増殖に関して、FCAよりも著しくマウスを免疫感
作する。培養上澄みのINF−γの存在は、CD4＋Th1細胞
および／またはCD8＋Ｔ細胞の活性化を意味する。
実施例７ 経口投与実験 マウスにおけるNISV捕獲BSAの経口投与 ジグリコールセチルエーテル（DGCE）または１−モノ
パルミトイルグリセロールエステル（MPG）から、実施
例１に記載されるように、非イオン性界面活性剤、コレ
ステロールおよびジセチルホスフェートのモル比5:4:1
にて小胞を形成する。小胞は、RussellおよびAlexander
によるクロロホルムからの回転フィルム蒸発法（上記）
によって製造する。薄膜に形成された150μmolの界面活
性剤を、100mgのBSAを含む5mlの炭酸塩緩衝液中で水和
する。混合物を、60℃にて２時間振動した後、やはり60
℃にて、水浴超音波処理器中で５分間超音波処理する。
８〜10週令雌性BALB/cマウスを、各処理グループ５個
体で用いる。各グループは、以下のものを受ける： ａ）炭酸塩緩衝液中のBSA ｂ）DGCE NISV中のBSA ｃ）MPG NISV中のBSA １日目、マウスに、ガバージュ管で投与して、0.1ml
（マウス１匹毎に240μｇのBSA）の一次経口投与量を受
けさせる。12日目に、二次経口投与量（マウス１匹毎に
500μｇのBSA）を投与する。血液サンプルを20日および
24日で収集し、IgG力価を分析する。
配列リスト 配列の数２ （１）Seq.I.D.No:1の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ） 長さ:20アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｃ） トポロジー：線型 （ii）分子のタイプ：ペプチド （ｖ）フラグメントのタイプ：内部フラグメント （xi）配列の記載:Seq.I.D.No:1 （１）Seq.I.D.No:2の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ） 長さ:12アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｃ） トポロジー：線型 （ii）分子のタイプ：ペプチド （xi）配列の記載:Seq.I.D.No:2
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブレウェア，ジェームズ マクドナルド 英国 スコットランド ケーエー10 ７ ビージェイ エアシャー トルーン ウ エスト クレセント 22 (56)参考文献 特開 昭63−23737（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−501078（ＪＰ，Ａ) 欧州公開293530（ＥＰ，Ａ１)

Claims (45)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】非イオン性界面活性剤小胞内に捕獲された
    少なくとも１つの抗原を含み、この抗原が単独で弱い免
    疫応答を引き起こす、ワクチン。
  2. 【請求項２】前記抗原がペプチドである、請求項１に記
    載のワクチン。
  3. 【請求項３】前記ペプチドが合成起源あるいは組換え起
    源である、請求項２に記載のワクチン。
  4. 【請求項４】前記ペプチドが８〜50のアミノ酸ユニット
    を含む、請求項３に記載のワクチン。
  5. 【請求項５】前記ペプチドが10〜20のアミノ酸ユニット
    を含む、請求項４に記載のワクチン。
  6. 【請求項６】前記ペプチドがキャリアーに結合されてい
    る、請求項３〜５の何れか１項に記載のワクチン。
  7. 【請求項７】前記抗原が、原生動物（protozoan）トキ
    ソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasmagondii）、および黄
    体形成ホルモン放出ホルモンおよび式pGlu−His−Trp−
    Ser−Tyr−Ｘ−Leu−Arg−Pro−Gly−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘ
    はGlyまたはＤ−アミノ酸を表し、Ｙは１つ以上のアミ
    ノ酸残基を表し、これらの残基は同一であっても異なっ
    ていてもよく、ＺはCysまたはTryを表す）のその類似体
    の抗原から選択され、上記類似体の溶液中のコンフォメ
    ーションが天然LHRHの溶液中のコンフォメーションと実
    質的に同じである、請求項１に記載のワクチン。
  8. 【請求項８】前記非イオン性界面活性剤がグリセロール
    エステルを含む、前記請求項の何れか１項に記載のワク
    チン。
  9. 【請求項９】前記グリセロールエステルが、C12〜C20の
    アルカノイル部分またはアルケノイル部分を含むグリセ
    ロールモノエステルである、請求項８に記載のワクチ
    ン。
  10. 【請求項１０】前記グリセロールエステルが１−モノパ
    ルミトイルグリセロールである、請求項９に記載のワク
    チン。
  11. 【請求項１１】前記小胞がグリセロールまたは低級脂肪
    族グリコールに基づくエーテルを含む、請求項１〜７の
    何れか１項に記載のワクチン。
  12. 【請求項１２】前記エーテルが、グリセロールモノエー
    テルまたはC12〜C20のアルカニル部分またはアルケニル
    部分を含む低級脂肪族グリコールに基づくモノエーテル
    である、請求項11に記載のワクチン。
  13. 【請求項１３】前記モノエーテルが５以下のグリコール
    ユニットを含む、請求項12に記載のワクチン。
  14. 【請求項１４】前記グリセロールエーテルが１−モノセ
    チルグリセロールエーテルであるか、前記低級脂肪族グ
    リコールエーテルがジグリコールセチルエーテルであ
    る、請求項12に記載のワクチン。
  15. 【請求項１５】前記小胞が電荷生成両親媒性分子を含
    む、前記請求項の何れか１項に記載のワクチン。
  16. 【請求項１６】前記電荷生成両親媒性分子がカルボン酸
    エステル、リン酸エステルおよび硫酸エステルから選択
    される酸基を含む、請求項15に記載のワクチン。
  17. 【請求項１７】皮下投与、筋肉内投与または皮内投与に
    適した形態にある、前記請求項の何れか１項に記載のワ
    クチン。
  18. 【請求項１８】粘膜投与に適した形態にある、請求項１
    〜16の何れか１項に記載のワクチン。
  19. 【請求項１９】経口投与に適した形態にある、請求項１
    〜16の何れか１項に記載のワクチン。
  20. 【請求項２０】非イオン性界面活性剤小胞内に捕獲され
    た少なくとも１つの抗原を含む、経口投与に適した形態
    にあるワクチン。
  21. 【請求項２１】非イオン性界面活性剤小胞内に捕獲され
    た少なくとも１つの抗原を含む、粘膜投与に適した形態
    にあるワクチン。
  22. 【請求項２２】少なくとも１つの抗原を非イオン性界面
    活性剤小胞内に捕獲することを含み、この抗原が単独で
    弱い免疫応答を引き起こすワクチンの製造方法。
  23. 【請求項２３】少なくとも１つの抗原を非イオン性界面
    活性剤小胞内に捕獲することを含む、上記抗原を経口活
    性ワクチンとして調剤する方法。
  24. 【請求項２４】前記ワクチンが請求項１〜19の何れか１
    項で定義されたものである、請求項22または23に記載の
    方法。
  25. 【請求項２５】少なくとも１つの抗原を非イオン性界面
    活性剤小胞中に捕獲することを含む、Th1 Tリンパ球経
    路を介した抗体産生を刺激するための少なくとも１つの
    抗原の調剤方法。
  26. 【請求項２６】少なくとも１つの抗原を非イオン性界面
    活性剤小胞中に捕獲することを含む、少なくとも１つの
    抗原の免疫原性を、少なくともフロイント完全アジュバ
    ントの使用によって得られるものと同程度まで増強する
    方法。
  27. 【請求項２７】前記抗原が請求項１〜７の何れか１項で
    定義されたものであり、前記非イオン界面活性剤小胞の
    前記非イオン界面活性剤が請求項８〜16の何れか１項で
    定義されたものである、請求項25または26に記載の方
    法。
  28. 【請求項２８】前記抗原が既に形成された小胞に捕獲さ
    れる、請求項22〜27の何れか１項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】細胞性および／または体液性免疫を刺激
    するための、単独で弱い免疫応答を引き起こす少なくと
    も１つの抗原を内部に捕獲して有する非イオン性界面活
    性剤小胞。
  30. 【請求項３０】経口投与可能な免疫アジュバントとして
    の、請求項29に記載の非イオン性界面活性剤小胞。
  31. 【請求項３１】前記抗原が請求項２〜７の何れか１項で
    定義されたものである、請求項29または30に記載の非イ
    オン性界面活性剤小胞。
  32. 【請求項３２】前記小胞がエステル結合界面活性剤分子
    を含む、請求項30または31に記載の非イオン性界面活性
    剤小胞。
  33. 【請求項３３】非イオン性界面活性剤小胞内に捕獲され
    た少なくとも１つの抗原を使用して、哺乳類または非哺
    乳類において少なくとも１つの抗原に対する免疫反応を
    増強するのに用いる製品を製造する方法。
  34. 【請求項３４】非イオン性界面活性剤小胞内に捕獲され
    た少なくとも１つの抗原を使用して、哺乳類または非哺
    乳類において少なくとも１つの抗原に反応する細胞性お
    よび／または体液性免疫を刺激するのに用いる製品を製
    造する方法。
  35. 【請求項３５】非イオン性界面活性剤小胞内に捕獲され
    た少なくとも１つの抗原を使用して、哺乳類または非哺
    乳類において少なくとも１つの抗原に反応するTh1 Tリ
    ンパ球経路を介する抗体産生を刺激するのに用いる製品
    を製造する方法。
  36. 【請求項３６】上記動物が哺乳類である、請求項33〜35
    の何れか１項に記載の製造方法。
  37. 【請求項３７】前記抗原が請求項１〜７の何れか１項で
    定義されたものであり、前記非イオン性界面活性剤小胞
    の前記非イオン性界面活性剤が請求項８〜16の何れか１
    項で定義されたものである、請求項33〜36の何れか１項
    に記載の製造方法。
  38. 【請求項３８】ヒト以外の哺乳類または非哺乳類に、非
    イオン性界面活性剤小胞内に捕獲された単独で弱い免疫
    応答を引き起こす少なくとも１つの抗原を投与すること
    を含む、上記動物における少なくとも１つの抗原に対す
    る免疫反応を増強する方法。
  39. 【請求項３９】ヒト以外の哺乳類または非哺乳類に、非
    イオン性界面活性剤小胞内に捕獲された少なくとも１つ
    の抗原を経口投与することを含む、上記動物における少
    なくとも１つの抗原に反応する免疫反応を増強する方
    法。
  40. 【請求項４０】ヒト以外の哺乳類または非哺乳類に、非
    イオン性界面活性剤小胞内に捕獲された少なくとも１つ
    の抗原を投与することを含む、上記動物における少なく
    とも１つの抗原に反応する細胞性および／または体液性
    免疫を刺激する方法。
  41. 【請求項４１】ヒト以外の哺乳類または非哺乳類に、非
    イオン性界面活性剤小胞内に捕獲された少なくとも１つ
    の抗原を投与することを含む、上記動物における少なく
    とも１つの抗原に反応したTh1 Tリンパ球経路を介する
    抗体産生を刺激する方法。
  42. 【請求項４２】前記動物が非哺乳類である、請求項38〜
    41の何れか１項に記載の方法。
  43. 【請求項４３】前記捕獲された抗原が経口投与される、
    請求項38、40および41の何れか１項に記載の方法。
  44. 【請求項４４】前記抗原が請求項１〜７の何れか１項で
    定義されたものであり、前記非イオン界面活性剤小胞の
    前記非イオン界面活性剤が請求項８〜16の何れか１項で
    定義されたものである、請求項38〜43の何れか１項に記
    載の方法。
  45. 【請求項４５】非イオン性界面活性剤小胞に捕獲された
    少なくとも１つの抗原を含み、粉末、タブレット、シロ
    ップ、カプセルまたは顆粒の形態にある経口投与可能な
    ワクチン。
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