RU2595717C2

RU2595717C2 - Производные трисахаридов и их применение в качестве адъювантов

Info

Publication number: RU2595717C2
Application number: RU2013100945/04A
Authority: RU
Inventors: БРЕ Йоханнес Гернардус Матиас Вильхельмус Мария ВАН; Эверардус Йоаннес Петер Мария СХЕНКЕЛАРС; Яуверт Анне ТУРКСТРА; Мария Алдегонда Якоба КРИК; Роберт Патрик Хоф; Вильхельмус Мартинус Мария СХАПЕР
Original assignee: Иммуново Б.В.
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2016-08-27
Also published as: PL2580226T3; NO2580226T3; KR101929973B1; EP3312188A1; ES2654156T3; US9327020B2; PT2580226T; CN103154013A; WO2011155822A1; LT2580226T; AU2011262606B2; JP2013528211A; RU2013100945A; HRP20171947T1; BR112012031440A2; DK2580226T3; RS56690B1; ZA201209395B; CY1119704T1; KR20130056273A

Abstract

Настоящее изобретение относится к производному трисахарида, пригодному для использования в качестве адъюванта, его получению и применению в медицине. Предложенное производное трисахарида содержит трисахаридное ядро из раффинозы, мелецитозы или мальтотриозы, полностью замещенное группами сложных эфиров жирных кислот и одной-двумя анионными группами, выбранными из сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты, причем группа сложного эфира жирной кислоты представляет собой сложный эфир прямой, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты с длиной цепи от 4 до 20 атомов углерода. Указанный трисахарид получают путем растворения раффинозы, мелецитозы или мальтотриозы и соответствующей этерификации всех ОН-групп трисахарида. Предложено новое трисахаридное производное, пригодное в производстве адъювантов и вакцин. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 пр., 2 табл., 7 ил.

Description

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к новым производным трисахаридов и к их применению в качестве адъювантов, эти производные трисахаридов содержат замещенное трисахаридное ядро, которое полностью замещено группами сложных эфиров жирных кислот и, необязательно, одной или более анионными группами, кроме того, изобретение относится к способу получения этих трисахаридных производных, к трисахаридам, получаемым при помощи этого способа, а также к применению адъюванта в вакцине.

Уровень техники

Антитела являются веществами, которые содержатся в крови и других жидкостях организма, а также в тканях, и которые связываются с антигеном, чтобы обезвредить его. Антитела представляют собой один из естественных механизмов защиты организма. Они обладают высокой специфичностью и уничтожают, связывают или обезвреживают антиген, который вызвал их образование.

При контакте с иммунной системой антиген активирует сложный ряд клеточных взаимодействий для устранения антигена и/или для восстановления предыдущего равновесия.

Двумя характерными особенностями антигенов являются их иммуногенность, которая представляет собой их способность вызывать иммунный ответ in vivo (в том числе образование специфических антител), и их антигенность, которая представляет собой их способность избирательно узнаваться антителами, причиной появления которых являются данные антигены.

Известно, как намеренно стимулировать иммунный ответ путем введения конкретного антигена с помощью вакцины. Процедура позволяет сохранять состояние иммунного ответа в организме, что делает возможным более быстрый и более эффективный ответ организма при последующем контакте с антигеном.

Однако некоторые антигены обладают лишь слабой иммуногенностью, и они вызывают иммунный ответ, недостаточный для создания эффективной защиты организма. Такую иммуногенность можно значительно повысить, если антиген вводить совместно с адъювантом.

Адъюванты являются веществами, которые усиливают иммунный ответ на антигены, однако сами они не обязательно иммуногенны. Адъюванты могут действовать путем удержания антигена локально вблизи места введения для создания эффекта депо, способствующего постепенному длительному высвобождению антигена для клеток иммунной системы. Адъюванты также могут привлекать клетки иммунной системы к депо антигена и стимулировать такие клетки для вызывания иммунных ответов.

Адъюванты использовали в течение многих лет для усиления иммунного ответа хозяина, например, к вакцинам. Внутренними адъювантами, как правило, являются компоненты убитых или ослабленных бактерий, используемых в качестве вакцин. Внешними адъювантами являются иммуномодуляторы, которые, как правило, нековалентно связаны с антигенами и разработаны для повышения иммунного ответа.

Гидроксид алюминия и фосфат алюминия (совместно называемые квасцами) обычно используют в качестве адъювантов в вакцинах, предназначенных для человека и животных. Эффективность квасцов для повышения выработки антител к дифтерийному и столбнячному анатоксинам хорошо известна, и совсем недавно квасцы были использованы в качестве адъюванта в вакцине против HBsAg.

Широкий диапазон внешних адъювантов может провоцировать иммунный ответ на антигены. К ним относятся сапонины в комплексе с антигенами мембранных белков (иммуностимулирующие комплексы), полимеры плюроники с минеральным маслом, убитые микобактерии в минеральном масле, полный адъювант Фрейнда, бактериальные продукты, такие как мурамилдипептид (MDP).

Адъюванты с определенным химическим составом, такие как монофосфориллипид A, фосфолипидные конъюгаты, изучены (см. Goodman-Snitkoff et al., J. Immunol. 147: 410-415 (1991), как и инкапсуляция белка протеолипосомой (см. Miller et al., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992)).

Синтетические полимеры также были оценены в качестве адъювантов. Они включают гомо- и сополимеры молочной и гликолевой кислот, которые были использованы для получения микросфер, инкапсулирующих антигены (см. Eldridge et al., Mol. Immunol. 28: 287-294 (1993)).

Другими изучаемыми синтетическими адъювантами являются неионные блок-сополимеры. Адъювантные эффекты также были исследованы для низкомолекулярных сополимеров в эмульсиях на масляной основе (см. Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.), John Wiley and Sons, NY. pp. 51-94 (1995)) и для высокомолекулярных сополимеров в водных препаратах (Todd et al., Vaccin 15: 564-570 (1997)).

Желательными характеристиками идеальных адъювантов являются отсутствие токсичности и способность стимулировать длительный иммунный ответ. Одним из наиболее часто используемых адъювантов применительно к людям являются квасцы. Другие адъюванты, такие как сапонин, Quil A и адъювант типа «вода в масле», адъювант Фрейнда с убитыми бациллами туберкулеза (полный адъювант Фрейнда) или без бацилл (неполный адъювант Фрейнда), имели ограниченное применение для людей вследствие их токсических эффектов; и появились опасения, вызванные их нежелательными эффектами у животных.

Проще говоря, описано множество препаратов адъювантов, но большинство из них никогда не были приемлемыми для использования в обычных вакцинах, и лишь немногие из них были одобрены для использования в организме человека. Это происходит главным образом из-за их токсичности. Например, минеральные масла, используемые в качестве адъювантов в некоторых вакцинах для животных, с трудом разлагаются и присутствуют в месте инъекции, тем самым вызывая неприемлемые гранулемы; и, как правило, препараты адъювантов, такие как масляные эмульсии минеральных соединений, липосомы и биоразлагаемые полимерные микросферы, вызывают местные реакции в связи с образованием депо в месте инъекции.

Примеры адъювантов, в настоящее время одобренных для применения в человеческих вакцинах, включают квасцы, MF59 (эмульсия типа «масло в воде»), MPL (гликолипид), VLR, иммуностимулирующие реконструированные виросомы гриппа (IRIV) и холерный токсин (см. Reed et al. Trends in Immunology 30: 23-32 (2008).

Одной из групп адъювантов, известных в данной области, являются так называемые сульфолипополисахариды, то есть, полисахариды, содержащие как сложные эфиры жирных кислот, так и сложные эфиры серной кислоты (Hilgers et al., Immunology 60., pp. 141-146, 1986). Метод получения таких соединений описан в международных патентных заявках WO 96/20222 и WO 96/20008. Эти методы получения сульфолипополисахаридов приводят к образованию различных производных сульфолипополисахаридов, отличающихся по числу сложных эфиров жирных кислот, приходящихся на молекулу полисахарида, числу сложных эфиров серной кислоты, приходящихся на молекулу полисахарида, числу гидроксильных групп на молекулу полисахарида и по распределению сложных эфиров жирных кислот, сложных эфиров серной кислоты и гидроксильных групп по молекуле полисахарида. Это означает, что в процессе получения таких сульфолипополисахаридов получают смесь множества различных сульфолипополисахаридов. Следовательно, выход нужного сульфолипополисахарида относительно низок, либо адъювант, который нужно применять в виде смеси, которую трудно охарактеризовать, вызывает проблемы нормативного характера.

В европейском патенте EP 1233969 заявлена адъювантная композиция, в которой адъювант содержит сульфолиподисахариды. Также описан метод получения таких сульфолиподисахаридов. В одном из вариантов осуществления полученные сульфолиподисахариды полностью замещены группами сложных эфиров жирных кислот или сложных эфиров серной кислоты. Однако, как будет описано в дальнейшем, когда эти сульфолиподисахариды используют в качестве адъювантов в организме животных, имеют место нежелательные побочные эффекты, такие как повышение средней температуры тела (включая лихорадку) и местное раздражение (отек тканей).

Подробное описание изобретения

С учетом вышеизложенного целью настоящего изобретения является получение соединений, которые относительно легко и недорого получать, которые обладают хорошими адъювантными свойствами и вызывают минимум нежелательных побочных эффектов при клиническом применении. Следующей целью настоящего изобретения является получение соединений, которые можно использовать в адъювантной композиции, например в комбинации с вакциной, и которые обладают превосходными показателями безопасности и профилем побочных эффектов.

Первый и второй аспекты настоящего изобретения относятся к производным трисахаридов и к их применению в качестве адъювантов. Производные трисахаридов по настоящему изобретению содержат замещенное трисахаридное ядро, которое полностью замещено группами сложных эфиров жирных кислот и, необязательно, одной или более анионными группами.

Производные трисахаридов по настоящему изобретению отлично подходят для использования в качестве адъюванта для вакцин. Они обладают профилем побочных эффектов, который на удивление значительно превосходит профиль побочных эффектов других адъювантов, которые имеют в основе производные полисахаридов, таких как, например, адъюванты на основе дисахаридов. У животных, которых вакцинировали антигенной композицией и адъювантной композицией, содержащей производные трисахаридов по настоящему изобретению, наблюдается меньшее повышение средней температуры тела по сравнению, например, с производными дисахаридов, описанными в EP 1233969. Кроме того, местные реакции (отек тканей) вокруг области инъекции менее выражены при использовании адъюванта, содержащего производные трисахаридов по данному изобретению.

Используемый в настоящем описании термин «антиген» означает любой компонент или материал, который вызывает иммунологическую реакцию в организме человека или животного, например, вирус, бактерия, микоплазма, паразит или раковая клетка, субъединица микроорганизма, такая как белок, полисахарид, пептид, гликопротеин, конъюгат полисахарид-белок, конъюгат пептид-белок.

Антиген может, например, состоять из, или содержать один или более живых организмов, инактивированных организмов или так называемых субъединиц (последние, например, получены синтетическими методами, или методами рекомбинантной ДНК, или выделены из организмов). Термин «антиген», кроме того, означает любой компонент, который может вызывать иммунную реакцию в организме человека или животного.

Трисахаридное ядро производных по настоящему изобретению предпочтительно является производным от раффинозы, мелецитозы, мальтотриозы, нигеротриозы, мальтотриулозы или кестозы. Особенно предпочтительно, если трисахаридное ядро является производным от раффинозы, мелецитозы или мальтотриозы, наиболее предпочтительно раффинозы или мальтотриозы. Эти трисахариды имеют в своей нормальной, то есть незамещенной форме, одиннадцать OH-групп, которые доступны для реакции, такой как, например, этерификация с жирными кислотами. Однако возможно также, что одна или более, предпочтительно одна, из OH-групп прореагировала с анионной группой так, что, например, образовалась группа сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты, предпочтительно, если образовалась группа сложного эфира серной кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения производные трисахаридов по изобретению не содержат анионные группы, а только группы жирных кислот, предпочтительно идентичные группы жирных кислот.

По другому предпочтительному варианту осуществления производные трисахаридов по изобретению содержат одну или две анионные группы с десятью или девятью группами жирных кислот, соответственно, на замещенное трисахаридное ядро. Предпочтительно, группы жирных кислот являются идентичными.

Используемый термин «анионная группа» означает отрицательно заряженный фрагмент (то есть отрицательно заряженный при нейтральном рН или pH окружающей среды, в которой производное применяется). Такая анионная группа может быть, например, сульфатом, сульфонатом или фосфатом. Предпочтительные анионные группы включают группы сложных эфиров серной кислоты или группы сложных эфиров фосфорной кислоты. Примерами таких групп являются -O-SO₂-ONa или -O-SO₂-ONH₄, -O-SO₂-OTEA (то есть сульфат триэтиламмония).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения группа сложного эфира жирной кислоты, которая ковалентно связана с замещенным трисахаридным ядром, представляет собой сложный эфир прямой, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты с длиной цепи от 4 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 18, более предпочтительно от 8 до 16 атомов углерода, наиболее предпочтительно 10-14 и особенно предпочтительно 12 атомов углерода.

Хотя рамки настоящего изобретения охватывают случай, когда замещенное трисахаридное ядро замещено сложным эфиром жирной кислоты более чем одного типа, предпочтительно, если используется только один тип, то есть, что все сложные эфиры жирных кислот идентичны.

Использование жирных кислот особенно предпочтительно, хотя по настоящему изобретению также предусмотрено, что другие карбоновые кислоты, предпочтительно, близкородственные жирным кислотам, могут давать положительные результаты.

Предпочтительно, сложный эфир жирной кислоты представляет собой сложный эфир насыщенных жирных кислот, мононенасыщенных жирных кислот или полиненасыщенных жирных кислот, таких как масляная кислота, капроновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, пальмитолеиновая кислота, стеариновая кислота, рицинолеиновая кислота, вакценовая кислота, арахиновая кислота, гадолиновая кислота, арахидоновая кислота, олеиновая кислота или линолевая кислота. Наиболее предпочтительной является лауриновая кислота.

В предпочтительном варианте осуществления замещенное трисахаридное ядро является производным от раффинозы, мелецитозы или мальтотриозы и является трисахаридным производным, полностью замещенным идентичными группами сложного эфира жирной кислоты на замещенный трисахарид, то есть трисахаридное ядро является замещенным одиннадцатью идентичными группами сложного эфира жирной кислоты. В другом предпочтительном варианте осуществления замещенное трисахаридное ядро является производным от раффинозы, мелецитозы или мальтотриозы и содержит одну или две анионные группы, такие как группа сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты, и десять или девять, соответственно, идентичных групп сложного эфира жирной кислоты на замещенный трисахарид. Наиболее предпочтительно, если сложный эфир жирной кислоты является сложным эфиром лауриновой кислоты.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу получения трисахаридного производного, включающему стадии:

i) получения трисахарида и растворения его в растворителе; и ii) этерификации всех OH-групп трисахарида с жирной кислотой, либо ее источником, необязательно, реакции по меньшей мере одной из OH-групп трисахарида с анионным реагентом.

В связи с тем, что все OH-группы реагируют с анионными группами и/или жирными кислотами, образуется мало примесей. Это означает, что можно получать без масштабных стадий очистки фармацевтически приемлемую чистую форму предусмотренного производного трисахарида. Если используют только один тип жирной кислоты, например лауриновую кислоту, еще меньшая очистка необходима для получения производного трисахарида в фармацевтически приемлемой чистой форме. Еще одно преимущество способа по настоящему изобретению заключается в том, что нужные производные трисахаридов легко получать в относительно больших количествах, что делает метод экономически привлекательным.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полученные производные трисахаридов не содержат анионные группы, а только группы жирных кислот, предпочтительно идентичные группы жирных кислот, то есть все OH-группы прореагировали с жирной кислотой или ее источником.

По другому предпочтительному варианту осуществления полученные производные трисахаридов содержат одну или две анионные группы с десятью или девятью группами жирных кислот, соответственно, на замещенное трисахаридное ядро. Предпочтительно, группы жирных кислот являются одинаковыми.

Трисахариды, используемые в вышеуказанном способе, предпочтительно представляют собой раффинозу, мелецитозу, мальтотриозу, нигеротриозу, мальтотриулозу или кестозу. Более предпочтительно, используют раффинозу, мелецитозу или мальтотриозу, наиболее предпочтительно - мальтотриозу или раффинозу.

Понятие «жирные кислоты» применительно к вышеуказанному способу означает любой источник жирных кислот, включая соли жирных кислот, галогениды жирных кислот, сложные эфиры жирных кислот и производные жирных кислот. Предпочтительно, жирные кислоты, используемые в заявленном способе, представляют собой прямые, разветвленные, насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты с длиной цепи от 4 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 18, более предпочтительно от 8 до 16 атомов углерода, наиболее предпочтительно от 10 до 14 атомов углерода и особенно предпочтительно 12 атомов углерода.

Предпочтительно, используемые жирные кислоты являются насыщенными жирными кислотами, мононенасыщенными жирными кислотами или полиненасыщенными жирными кислотами, такими как масляная кислота, капроновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, пальмитолеиновая кислота, стеариновая кислота, рицинолеиновая кислота, вакценовая кислота, арахиновая кислота, гадолиновая кислота, арахидоновая кислота, олеиновая кислота или линолевая кислота. Наиболее предпочтительной является лауриновая кислота.

Как упомянуто выше, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна из OH-групп реагирует с анионным реагентом. Предпочтительно, используемый анионный реагент представляет собой сульфирующий или фосфатирующий реагент, такой как газообразный SO₃, HClSO₃, SO₃-пиридин, SO₃-2-метилпиридин, SO₃-2,6-диметилпиридин, SO₃-диметилформамид, SO₃-триметиламид, SO₃-триэтиламин, SO₃-диметиланилин, SO₃-N-этилморфолин, SO₃-диэтилаланин, SO₃-диоксан, а также их сочетания. Наиболее предпочтительным сульфирующим реагентом является SO₃-пиридин или SO₃-триэтиламин.

Наиболее предпочтительным сульфирующим реагентом является SO₃-пиридин. Еще более предпочтительно, если реакция по меньшей мере одной из OH-групп трисахарида с сульфирующим реагентом была проведена до этерификации трисахарида с жирной кислотой. Преимущество первоначального проведения реакции с сульфирующим реагентом заключается в том, что сульфирующий реагент реагирует сначала с так называемыми первичными OH-группами до вступления в реакцию с другими OH-группами, тем самым снижая число образующихся изомеров.

В предпочтительном варианте осуществления отношение эквивалентов трисахарида:анионного реагента:жирной кислоты составляет 1:0-3:8-11, предпочтительно 1:0-1:10-11. В этих заявленных диапазонах эффективно получают полное замещение OH-групп трисахарида сложными эфирами жирных кислот и, необязательно, анионной группой, такой как сложный эфир серной кислоты.

Предпочтительно, используемым растворителем для проведения реакции является смесь пиридина и диметилформамида.

На дополнительной стадии способа по изобретению производные трисахаридов подвергают дополнительной стадии смешивания их с фармацевтически приемлемым эксципиентом или разбавителем так, что получается адъювантная композиция.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к адъювантным композициям, содержащим производные трисахаридов по изобретению, либо их смесь. Когда такие производные трисахаридов формулируют в адъювантную композицию, их предпочтительно смешивают с фармацевтически приемлемыми эксципиентами или разбавителями. Предпочтительно, адъювантную композицию формулируют в виде эмульсии типа «масло в воде». Подходящими для использования маслами являются, среди прочих, животные жиры, растительные масла и минеральные масла, такие как рыбий жир, витамин Е, сквалан, сквален. Предпочтительно, используют сквалан, предпочтительно в сочетании с полисорбатом.

Хотя можно использовать производное трисахарида только одного вида, в пределах объема изобретения также находится использование в адъювантной композиции смеси различных производных трисахаридов по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления используют смесь производных трисахаридов по изобретению с анионной группой, такой как группа сложного эфира серной кислоты, и таких же производных трисахаридов без анионной группы, например, сульфолипораффинозу и липораффинозу. Наиболее предпочтительно, сложные эфиры жирных кислот в производных трисахаридов, используемых в такой смеси, являются одними и теми же, такими как, например, сложный эфир лауриновой кислоты.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к вакцине, содержащей адъювантную композицию или производные трисахаридов, упомянутые выше.

И адъювантную композицию, и антигенную композицию или вакцину предпочтительно вводят парентерально. Подходящие способы парентерального введения включают внутримышечное, подкожное, субдермальное и внутрикожное введение. Подходящие устройства для парентерального введения включают иглы (в том числе микроиглы), инжекторы и трансдермальные системы доставки.

Парентеральный препарат легко может приготовить специалист в данной области стандартными методами. Предпочтительно, парентеральный препарат готовят в виде эмульсии типа «масло в воде».

Получение парентеральных препаратов в стерильных условиях, например, путем фильтрации, можно легко осуществлять, используя стандартные фармацевтические методы, хорошо известные специалистам в данной области.

Вакцину или адъювантную композицию по изобретению можно вводить человеку и многим различным целевым животным, таким как, например, свиньи, крупный рогатый скот, домашняя птица, собаки, кошки, лошади и тому подобные.

Шестой аспект настоящего изобретения относится к набору, содержащему вышеуказанную адъювантную композицию и антигенную композицию.

Может оказаться желательным вводить комбинацию адъювантной композиции и антигенной композиции или вакцины раздельно. В таком случае адъювантную композицию и антигенную композицию можно удобно объединять в виде набора. Такой набор может, например, представлять собой систему из двух флаконов или двухкамерный шприц.

Далее изобретение будет дополнительно описано при помощи следующих не ограничивающих примеров.

ПРИМЕРЫ

Получение производных трисахаридов по изобретению

Пример 1. Общий синтез сульфолипотрисахаридов по изобретению

Трисахарид высушивали в вакуумной печи для удаления кристаллов воды. Затем трисахарид (5 г) растворяли в токе азота в 30 мл ДМФА (DMF) и 14 мл пиридина в 100-мл трехгорлой круглодонной колбе, оснащенной рефлюкс-конденсатором. 1,05 эквивалента пиридина-SO₃ добавляли при интенсивном перемешивании. Через 1 час колбу охлаждали в ледяной воде и при интенсивном перемешивании добавляли лауроил хлорид по каплям, чтобы предотвратить нагревание реакционной смеси. Через 15 минут ледяную баню медленно нагревали до 40°C. За ходом реакции следили с помощью ВЭЖХ. После завершения реакции смесь концентрировали в вакууме в роторном испарителе (нагретом до 60°C). Сырой продукт растворяли в 300 мл гептана и 150 мл солевого раствора. Органический слой отделяли в 500-мл делительной воронке, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. Раствор гептана концентрировали в вакууме. Полученное масло растворяли в 200 мл гептана и по каплям добавляли триэтиламин (2,37 мл). Полученный раствор фильтровали и концентрировали в вакууме. Масло вновь растворяли в 100 мл гептана, фильтровали и раствор концентрировали в вакууме.

Пример 2. Синтез сульфолипомальтотриозы (S1L10-Ma) с использованием пиридина-SO₃

Указанный в названии продукт синтезировали, следуя общему методу, описанному в примере 1, со следующими подробностями: мальтотриозу (5,1 г, 10 ммоль) высушивали в вакуумной печи при <10 мбар в течение 19 часов при 40°C и 48 часов при 70°C, выход составил 4,9 г. Высушенную мальтотриозу растворяли в 30 мл ДМФА и 14 мл пиридина и сульфировали с использованием 1,6 г (1,05 экв) пиридина-SO₃, суспендировали в 2 мл ДМФА. Через 1 час сульфотрисахарид этерифицировали в ледяной бане с 11 эквивалентами (25,5 мл) лауроил хлорида. Смесь медленно нагревали до 40°С и проводили реакцию в течение 3 часов. Стадии реакции отслеживали при помощи ВЭЖХ-ИДС. Продукт выделяли после экстракции и обмена триэтиламина. Выход густого коричнево-желтого сиропа составил: 15,5+5,5 г (второй сбор из испарительной колбы после нагревания до 50°C). Хроматограмма ВЭЖХ-ИДС: смотри фиг.1A.

Пример 3. Альтернативный синтез сульфолипомальтотриозы (S1L10-Ma) с использованием пиридина-SO₃

Указанный в названии продукт синтезировали, следуя общему методу, описанному в примере 1, со следующими подробностями: мальтотриозу (5,0 г, 10 ммоль) высушивали в вакуумной печи при <10 мбар в течение 20 часов при 40°C и 90 часов при 70°C, выход составил 4,9 г. Высушенную мальтотриозу растворяли в 30 мл ДМФА и 1,6 г (1,05 экв) пиридина-SO₃ добавляли в виде суспензии в 14 мл пиридина. Через 1 час сульфотрисахарид этерифицировали в ледяной бане с 11 эквивалентами (25,5 мл) лауроил хлорида и медленно нагревали до 40°C. Образцы для анализа ВЭЖХ-ИДС отбирали через регулярные промежутки времени в процессе реакции. Реакцию с лауроил хлоридом оставляли протекать на ночь при комнатной температуре. Выделение продукта реакции проводили, как описано в примере 1. Выход густого коричнево-желтого сиропа составил: 24,7 г. Хроматограмма ВЭЖХ-ИДС: см. фиг.1B.

Пример 4. Синтез сульфолипораффинозы (S1L10-Ra) с использованием пиридина-SO₃

Указанный в названии продукт синтезировали, как описано в примере 1, со следующими подробностями: раффинозы пентагидрат (5,0 г, 10 ммоль) высушивали в вакуумной печи при <10 мбар в течение 24 часов при 30°C и 90 часов при 60°C, выход составил 4,3 г. Высушенную раффинозу растворяли в 30 мл ДМФА и 14 мл пиридина. Пиридин-SO₃ (1,6 г, 1,05 экв) добавляли в одну партию. Через 1 час сульфотрисахарид этерифицировали в ледяной бане с 12 эквивалентами (23,5 мл) лауроил хлорида и медленно нагревали до 40°C. Через 4 часа смесь концентрировали в вакууме, экстрагировали и обрабатывали ТЭА (TEA), как описано в примере 1. Выход густого желто-коричневого сиропа составил: 18,0 г. Хроматограмма ВЭЖХ-ИДС: см. фиг.2.

Пример 5. Синтез липомальтотриозы (L11-Ma)

Указанный в названии продукт синтезировали, следуя общему методу, описанному в примере 1, со следующими подробностями: мальтотриозы гидрат (0,50 г) высушивали в вакуумной печи. Высушенный трисахарид (0,49 г, 0,97 ммоль) растворяли в пиридине (1,4 мл) и ДМФА (3 мл), охлаждали в ледяной бане и проводили реакцию с лауроил хлоридом (3,36 мл, 15 экв) в течение 1 часа при 0°C, а затем в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционная смесь становилась гелем, при добавлении 3 мл гептана и обработки ультразвуком продукт растворялся. Добавление гептана повторяли дважды. Органическую фазу (75 мл) промывали водой, и образовалась трехслойная система. Только органический слой отделяли, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, получая густой желто-коричневый сироп: 1,39 г. Хроматограмма ВЭЖХ-ИДС: см. фигуру 3A.

Пример 6. Синтез липораффинозы (L11-Ra)

Раффинозы пентагидрат (0,50 г) высушивали в вакуумной печи. Высушенную раффинозу (0,41 г, 0,86 ммоль) в пиридине (1,4 мл) и ДМФА (3 мл) охлаждали в ледяной бане и проводили реакцию с лауроил хлоридом (2,97 мл, 15 экв) в течение 1 часа при 0°C, а затем в течение 18 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли гептаном (50 мл) и промывали водой (25 мл). Органическую фазу высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, получая густой желто-коричневый сироп: 2,33 г. Хроматограмма ВЭЖХ-ИДС: см. фиг.3B.

Эффект адъювантов, содержащих производные трисахаридов по изобретению, на титры анти-GnRH, уровни тестостерона в сыворотке и возникновение побочных эффектов

Эксперименты на животных проводили для оценки эффективности и возможных побочных эффектов, связанных с использованием трисахаридов по изобретению в качестве адъюванта. В данном исследовании на крысах тестировали адъюванты на основе трех (сульфо)липотрисахаридов: сульфолипомальтотриозы (одна группа сложного эфира серной кислоты и десять групп сложного эфира лауроиловой кислоты, S1L10-Ma), полученной в соответствии с примером 3; сульфолипораффинозы (одна группа сложного эфира серной кислоты и десять групп сложного эфира лауроиловой кислоты, S1L10-Ra), полученной в соответствии с примером 4; и липораффинозы (раффиноза, полностью замещенная группами сложного эфира лауроиловой кислоты, L11-Ra), полученной в соответствии с примером 6. Адъюванты, содержащие сульфолипомальтотриозу, также содержали липомальтотриозу (полное замещение группами сложного эфира лауроиловой кислоты, L11-Ma). Адъюванты, содержащие сульфолипораффинозу, также содержали липораффинозу (полное замещение группами сложного эфира лауроиловой кислоты, L11-Ra).

Адъюванты на основе сульфолипогрупп тестировали в различных дозах в диапазоне 0,008-8 мг на дозу. Адъюванты тестировали в сочетании с конъюгатом GnRH-KLH при использовании 0,7 мкг конъюгированного GnRH на дозу. Адъювантные свойства адъювантов сравнивали с адъювантом положительного контроля, сульфолипосахарозой (дисахарид с одной группой сложного эфира серной кислоты и семью группами сложного эфира лауроиловой кислоты, S1L7-Su) и с адъювантом отрицательного контроля, состоящим из эмульсии сквалан-в-воде без сахаридного соединения, и одна группа получала только PBS.

Эффективность определяли на основании титров антител и биологических эффектов продуцированных антител на уровни тестостерона. Для определения неблагоприятных побочных эффектов иммунизации с адъювантами проводили ежедневный клинический осмотр и определяли температуру тела и реакцию в месте инъекции.

Получение эмульсий адъювантов

▪ Сахариды: Сульфолипомальтотриоза (S1L10-Ma)

Сульфолипораффиноза (S1L10-Ra)

Липораффиноза (L11-Ra)

▪ Сквалан (A&E Connock)

▪ Полисорбат-80 (Fagron)

▪ Стерильный PBS-wit pH 7,4 (Mediabereiding ASG, Lelystad)

▪ Вода MilliQ

▪ Фильтрационная насадка на шприц Millex 0,22 мкм PES, 33 мм, 4,5 см² (Millipore)

▪ Микрофлюидизатор M-110S, оснащенный камерой взаимодействия типа: F20Y

▪ Microtrac Nanotrac анализатор системы NPA-253

Экспериментальные адъюванты получали следующим образом.

Таблица 1
Состав эмульсий для различных СЛС (SLS)
Группа	Сахарид	Количество СЛС (г)	Сквалан (г)	Твин-80 (г)	MilliQ (г)	PBS-wit (г)
1	Сульфолипомальтотриоза (SlL10-Ma-8)	1,0018	4,0010	1,0019	0,2507	18,7495
2	Сульфолипомальтотриоза (SlL10-Ma-2)	0,2497	4,0051	1,0017	1,0007	18,7515
3	Сульфолипомальтотриоза (S1L1O-Ma-O,8)	0,1007	4,0025	1,0030	1,1525	18,7524
4	Сульфолипомальтотриоза (SlL10-Ma-0,08)	0,0101	4,0040	1,0010	1,2439	18,7525
5	Сульфолипомальтотриоза (SlL10-Ma-0,008)	0,00225	9,0018	1,0006	1,2706	18,75
6	Сульфолипораффиноза (SlL10-Ra-8)	1,0029	4,0004	1,0009	0,2528	18,7495
7	Сульфолипораффиноза (SlL10-Ra-2)	0,2503	4,0007	1,0008	1,0015	18,7514
8	Сульфолипораффиноза (SlL10-Ra-0,8)	0,1004	4,0015	1,0020	1,1496	18,7526
9	Сульфолипораффиноза (SlL10-Ra-0,08)	0,0106	4,0003	1,0008	1,2386	18,7529
10	Сульфолипораффиноза (SlL10-Ra-0,008)	0,00154	6,1587	1,0045	1,2526	18,76
11	Нет	0,0000	3,9995	1,0011	1,2527	18,74
12	Липораффиноза (LI l-Ra-8)	1,0006	4,0067	1,0037	0,2502	18,76

Примечание: для группы 5 и 10 сахарид растворяли в сквалане. Из этих растворов 4,0056 г (5) и 4,0006 г (10) использовали для дальнейшего приготовления эмульсий. Содержание СЛС в конечной эмульсии составляло 1 мг/25 мл.

Компоненты масляной фазы (сахарид, сквалан, полисорбат-80 и воду MilliQ в количествах, указанных в таблице 1) отвешивали в 50-мл пробирку Falcon. Компоненты смешивали при помощи вихревой мешалки и нагревали в водяной бане при 50°C до растворения сахарида. Теплую масляную фазу добавляли к водной фазе (PBS) и две фазы смешивали при помощи вихревой мешалки и Ultra-Turrax при 24000 мин^-1 в течение примерно 30 секунд с интервалами. Затем получали эмульсию путем обработки с помощью микрофлюидизатора. Рабочее давление было установлено на 500 кПа (5 бар) и каждую смесь пропускали три раза при охлаждении камеры взаимодействия в ледяной бане. Каждую эмульсию подвергали ручной стерильной фильтрации. Размер частиц эмульсии измеряли с помощью измерителя размера частиц Nanotrac.

Готовили препараты вакцин 1-13 путем добавления равного объема адъюванта (содержащего сахаридные соединения, приведенные в таблице 2) к водной фазе (содержащей 0,7 мкг конъюгированного GnRH). Вакцина 14 состояла только из PBS. Были получены следующие вакцины:

Таблица 2
Дизайн эксперимента
Группа	Сахаридное соединение	Доза адъюванта
1	Сульфолипомальтотриоза (S1L10-Ma-8)	8 мг
2	Сульфолипомальтотриоза (S1L10-Ma-2)	2 мг
3	Сульфолипомальтотриоза (S1L10-Ma-0,8)	0,8 мг
4	Сульфолипомальтотриоза (S1L10-Ma-0,08)	0,08 мг
5	Сульфолипомальтотриоза (S1L10-Ma-0,008)	0,008 мг
6	Сульфолипораффиноза (S1L10-Ra-8)	8 мг
7	Сульфолипораффиноза (S1L10-Ra-2)	2 мг
8	Сульфолипораффиноза (S1L10-Ra-0,8)	0,8 мг
9	Сульфолипораффиноза (S1L10-Ra-0,08)	0,08 мг
10	Сульфолипораффиноза (S1L10-Ra-0,008)	0,008 мг
11	Без сахарида (Б/С) (NS)	0
12	Липораффиноза (L11-Ra)	8 мг
13	Сульфолипосахароза (S1L7-Su-8)	8 мг
14	Контроль PBS (без антигена, без адъюванта)	0

Животные и иммунизация

Самцов крыс линии Wistar, возраст 10 недель, размещали по 3 крысы в клетке. Крысы имели неограниченный доступ к корму и воде. Крыс иммунизировали в день 0, 14 и 28 в соответствии с дизайном эксперимента (таблица 2) 400 мкл вакцины, содержащей 200 мкл водной фазы и 200 мкл адъюванта. Две внутримышечные инъекции (по 100 мкл каждая) делали в левую и правую внутреннюю сторону бедра и 2×100 мкл вводили подкожной инъекцией в область шеи. Каждая группа состояла из 5 крыс.

Образцы крови для сыворотки собирали от всех животных до иммунизации и в день 41 и 56.

Эффективность вакцин

Анализы

Специфические для GnRH антитела измеряли методом ELISA. Планшеты (96-луночные) предварительно покрывали раствором 0,2% глютардиальдегида в фосфатном буфере (pH 5) в течение 3 часов при комнатной температуре, промывали 0,1М фосфатным буфером (pH 8), покрывали по 100 мкл на лунку раствором, содержащим 10 мкг GnRH (Pepscan Presto, Lelystad, Нидерланды) на мл фосфатного буфера (pH 8) и инкубировали в течение 3 часов при 37°C. Покрытые планшеты промывали 0,05% Твин-80. Образцы сыворотки разбавляли (1/10) в PEM (1% Твин-80 с 4% лошадиной сыворотки). Сыворотку в этом разведении дополнительно разводили в 96-луночном планшете (100 мкл на лунку, 8 шагов) и инкубировали 1 час при 37°C. После промывания 0,05% Твин-80 в лунки добавляли по 100 мкл антисыворотки козы против иммуноглобулинов крысы, конъюгированной с пероксидазой, в PEM. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°C и промывали 12 раз 0,05% Твин-80. Затем в лунки планшетов добавляли по 150 мкл раствора субстрата, содержащего 2,2-азино-бис-(3-бензтиазолин-6-сульфоновую кислоту) (ABTS) плюс H₂O₂. Планшеты инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность при 405 нм. Титр антител выражали как логарифм по основанию 10 фактора разведения, который давал оптическую плотность, превышающую фон в 4 раза (примерно 100).

Уровни тестостерона в сыворотке измеряли, используя коммерчески доступный набор для ИФА на тестостерон (Beckman Coulter, Woerden, Нидерланды) в соответствии с инструкциями производителя.

Титры антител к GnRH

Титры антител к GnRH в группах, получавших сульфолипомальтотриозу (S1L10-Ma) и сульфолипораффинозу (S1L10-Ra) приведены на фиг.4A и 4B. Оба сульфолипотрисахарида индуцировали появление дозозависимых титров антител против GnRH. Титры антител были значительно выше у крыс, получавших 0,08-8 мг сульфолипотрисахаридов, чем у крыс, получавших адъювант без сахарида (Б/С, группа 11), что свидетельствовало о значительном вкладе сульфолипотрисахаридов в иммунный ответ.

На фиг.4C отчетливо видно, что титры антител к GnRH у крыс, получавших 8 мг сахаридных соединений по изобретению, то есть S1L10-Ma-8, S1L10-Ra-8 и L11-Ra-8, были значительно выше, чем у крыс, получавших только эмульсию сквалана (Б/С), что подчеркивает сильные адъювантные свойства как S1L10-, так и L11-трисахаридов.

Тестостерон в сыворотке

Иммунизация конъюгатом GnRH-KLH, эмульгированным с адъювантом, содержащим сульфолипотрисахариды по изобретению, то есть S1L10-Ma и S1L10-Ra, приводила к резкому снижению уровня тестостерона, начиная с дозы сульфолипотрисахарида 0,08 мг и выше (фиг.5 A-B), тогда как эффекты самой низкой дозы сульфолипотрисахарида (0,008 мг) на сывороточный тестостерон были сходны с эффектом эмульсии типа «масло в воде» без сахаридного соединения. Иммунизация липидированным трисахаридом (L11-Ra-8) также вызывала снижение уровня тестостерона (фиг.5C).

Побочные эффекты

Повышение средней температуры тела

По меньшей мере один раз в день проводили клинический осмотр всех животных. Среднюю температуру тела (MBT) определяли для всех животных до и после каждой иммунизации, измеряя ректальную температуру. Средние температуры тела в группе (MBT) приведены относительно уровней до иммунизации на фигуре 6.

Через 3 часа после каждой вакцинации незначительное увеличение MBT наблюдали только у крыс, получавших сульфолипотрисахариды в дозе 8 и 2 мг, тогда как никакого влияния на MBT не было отмечено при использовании доз 0,8, 0,08 и 0,008 мг. Однако на следующий день через 21 час после вакцинации MBT вновь понижалась до почти нормального уровня (фиг.6A и 6B). Напротив, при иммунизации дисахаридным соединением (S1L7-Su-8), которое вызвало несколько большее увеличение MBT, чем трисахаридные соединения через 3 часа после вакцинации, не наблюдали снижение MBT через день после иммунизации, MBT все еще была повышена через 21 час после вакцинации (фиг.6C). Липидированный трисахарид (L11-Ra-8) не вызывал никакого повышения MBT. Таким образом, из фиг.6 очевидно, что вакцины, содержащие соединения по изобретению (S1L10-трисахариды) в качестве адъювантов, на удивление, вызывали значительно более короткие температурные эффекты по сравнению с производными дисахаридов, известных ранее, притом что липидированный трисахарид (L11-трисахарид), подобно эмульсии типа «масло в воде» без сахаридного соединения (Б/С), совсем не вызывал температурные эффекты.

Реакции в месте инъекции

Перед вакцинацией места инъекции оценивали на наличие аномалий или существующих местных реакций. Если такие аномалии или местные реакции отсутствовали, животному делали инъекцию в этот участок. После каждой иммунизации места инъекций проверяли на наличие отека тканей. Определяли размеры участков подкожной инъекции (диаметр в мм). Поскольку реакции в месте внутримышечной инъекции на задних лапах трудно определять, определяли только наличие мест внутримышечных инъекций (отек тканей) и выражали в произвольных значениях (имеется = 10 мм, отсутствует = 0 мм). Баллы для реакций в местах инъекций суммировали для каждой крысы для четырех мест инъекций при каждой проверке, рассчитывали среднее значение на группу. Эти результаты приведены на фиг.7.

После иммунизации наблюдали незначительные дозозависимые реакции в местах инъекций у крыс, получавших сульфолипотрисахариды, главным образом, у крыс, получавших 8 и/или 2 мг (фиг.7A и 7B). Размер реагирующих зон в местах инъекций постепенно уменьшался ко дню 3 после иммунизации, и их было практически невозможно обнаружить ко дню 5 после последующей иммунизации. Реакции в местах инъекций, вызванные иммунизацией сульфолиподисахаридом (S1L7-Su-8), демонстрировали совершенно другую картину: реагирующие зоны в местах инъекций увеличивались в размерах вплоть до дня 4 и были более чем в 4 раза больше, чем в случае сульфолипотрисахаридов (см. фиг.7C), более того, при итоговой проверке через 5 дней после иммунизации имели место все еще значительные реакции в местах инъекций.

Липидированный трисахарид (L11-Ra-8) не вызывал никаких побочных эффектов в месте инъекции. Очевидно, что препараты вакцин, содержащие сульфолиподисахарид, вызывали большую реакцию в месте инъекции, чем вакцины, содержащие сульфолипотрисахариды по изобретению.

ФИГУРЫ

Фиг.1A-B: Хроматограмма ВЭЖХ-ИДС сульфолипомальтотриозы, синтезированной с использованием пиридина-SO₃.

Фиг.2: Хроматограмма ВЭЖХ-ИДС сульфолипораффинозы, синтезированной с использованием пиридина-SO₃.

Фиг.3A-B: Хроматограмма ВЭЖХ-ИДС липомальтотриозы и липораффинозы.

Фиг.4A-C: Титр антител к GnRH (средний) у крыс, иммунизированных различными препаратами вакцины.

Фиг.5A-C: Уровни тестостерона в сыворотке крыс, иммунизированных различными препаратами вакцины.

Фиг.6: Средняя температура тела крыс, иммунизированных различными препаратами вакцины.

Фиг.7: реакция в месте инъекции у крыс, иммунизированных различными препаратами вакцины.

Claims

1. Производное трисахарида, содержащее замещенное трисахаридное ядро, в котором трисахаридное ядро полностью замещено группами сложных эфиров жирных кислот и одной или более анионными группами, в котором замещенное трисахаридное ядро является производным от раффинозы, мелецитозы или мальтотриозы, и при этом трисахаридное ядро содержит одну группу сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты и десять идентичных групп сложного эфира жирной кислоты на замещенный трисахарид, или две группы сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты и девять идентичных групп сложного эфира жирной кислоты на замещенный трисахарид, причем группа сложного эфира жирной кислоты представляет собой сложный эфир прямой, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты с длиной цепи от 4 до 20 атомов углерода.

2. Производное трисахарида по п. 1, в котором сложный эфир жирной кислоты представляет собой сложный эфир лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты или арахиновой кислоты.

3. Производное трисахарида по п. 1, в котором группы сложного эфира жирной кислоты представляют собой сложные эфиры лауриновой кислоты.

4. Способ получения производного трисахарида, включающий стадии:
i) получения трисахарида и растворения его в растворителе, причем трисахарид представляет собой раффинозу, мелецитозу или мальтотриозу; и
ii) этерификации всех ОН-групп трисахарида, причем по меньшей мере одна из ОН-групп трисахарида реагирует с анионным реагентом, причем трисахарид этерифицирован в среднем одной группой сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты и десятью идентичными группами сложного эфира жирной кислоты на трисахарид, либо двумя группами сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты и девятью идентичными группами сложного эфира жирной кислоты на трисахарид, причем жирная кислота является прямой, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислотой с длиной цепи от 4 до 20 атомов углерода.

5. Адъювантная композиция, содержащая:
a. производное трисахарида, содержащее замещенное трисахаридное ядро, в котором замещенное трисахаридное ядро является производным от раффинозы, мелецитозы или мальтотриозы, и при этом трисахаридное ядро содержит одну группу сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты и десять идентичных групп сложного эфира жирной кислоты на замещенный трисахарид, или две группы сложного эфира серной кислоты или сложного эфира фосфорной кислоты и девять идентичных групп сложного эфира жирной кислоты на замещенный трисахарид;
b. фармацевтически приемлемый эксципиент и/или разбавитель.

6. Адъювантная композиция по п. 5, в которой жирная кислота является прямой, разветвленной, насыщенной или ненасыщенной жирной кислотой с длиной цепи от 4 до 20 атомов углерода.

7. Адъювантная композиция по п. 5, в которой сложный эфир жирной кислоты представляет собой сложный эфир лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты или арахиновой кислоты.

8. Адъювантная композиция по п. 5, в которой группы сложного эфира жирной кислоты представляют собой сложные эфиры лауриновой кислоты.

9. Состав вакцины, содержащий адъювантную композицию по любому из пп. 5-8.

10. Набор, включающий:
- антигенную композицию;
- и адъювантную композицию по пп. 5-8.

11. Способ по п. 4, в котором этерификацию сульфатирующим или фосфатирующим реагентом осуществляют до этерификации жирной кислотой или ее источником.