PT988862E

PT988862E - Formulação compreendendo um antigénio, um adjuvante indutor de th-1 e um aminoácido pouco solúvel em água, para utilização em imunização

Info

Publication number: PT988862E
Application number: PT99307406T
Authority: PT
Inventors: Alan Wheeler; Anthony Berry
Original assignee: Allergy Therapeutics Ltd
Priority date: 1998-09-21
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2007-01-31
Also published as: US20030007977A1; ATE346610T1; JP4743928B2; KR100642877B1; CA2282779C; GB2341801A; DK0988862T3; EP0988862A3; AU4877799A; DE69934179T2; ES2277413T3; US6440426B1; AU766251B2; US7815920B2; KR20000023273A; JP2000103745A; DE69934179D1; JP2010265330A; EP0988862B1; GB9922121D0

Description

DESCRIÇÃO

"FORMULAÇÃO COMPREENDENDO UM ANTIGÉNIO, UM ADJUVANTE INDUTOR DE TH-1 E UM AMINOÁCIDO POUCO SOLÚVEL EM ÁGUA, PARA UTILIZAÇÃO EM IMUNIZAÇÃO"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a uma nova formulação, de um modo particular, mas não exclusivo, para utilização em imunização.

Antecedentes da invenção 0 sistema imunitário evoluiu de um modo especifico para detectar e eliminar material estranho ou novo de um hospedeiro. Este material pode ser de origem virai, bacteriana ou parasitica e pode residir fora ou dentro das células do hospedeiro, ou pode ser de origem neoplásica. A resposta imunitária ao antigénio é geralmente, ou mediada por células (morte mediada por células-T), ou humoral (produção de anticorpos através do reconhecimento do antigénio total). 0 padrão de produção de citocinas por células TH envolvidas numa resposta imunitária pode influenciar qual destes tipos de resposta predomina: a imunidade mediada por células (TH1) caracteriza-se por uma produção elevada de IL-2 e IFNy, mas uma produção baixa de IL-4, enquanto que na imunidade humoral (TH2) 1 o padrão é IL-2 e IFNy baixos, mas IL-4, IL-5, IL-10 elevados.

Uma vez que o padrão secretor é modulado ao nível do órgão linfóide secundário ou células, então a manipulação farmacológica do padrão de citocinas de TH específico pode influenciar o tipo e extensão da resposta imunitária gerada. 0 equilíbrio TH1-TH2 refere-se à inter-conversão das duas formas diferentes de células T auxiliares. As duas formas têm efeitos em grande escala e opostos no sistema imunitário. Se uma resposta imunitária favorece as células TH1, então estas células irão dirigir uma resposta celular, enquanto que as células TH2 irão dirigir uma resposta dominada por anticorpos. 0 tipo de anticorpos responsável por algumas reacções alérgicas é induzido por células TH2. A vacinação é a aplicação de princípios imunológicos à saúde humana melhor conhecida e com maior sucesso. Naturalmente, para ser introduzida e aprovada, uma vacina deve ser eficaz e a eficácia de todas as vacinas é revista de tempos a tempos. Há muitos factores que a afectam. Uma vacina eficaz deve: induzir o tipo certo de imunidade; ser estável em armazenamento; e ter uma imunogenecidade suficiente. Com vacinas não vivas, em particular, é muitas vezes necessário reforçar a sua imunogenecidade com um adjuvante. Isto também se pode aplicar a algumas vacinas vivas, e. g., atenuadas. Um adjuvante é uma substância que aumenta a resposta imunitária a um antigénio.

Durante trabalhos realizados nos anos 20 sobre a produção de anti-soros animais para terapia humana, verificou-se que algumas substâncias, em particular os sais de alumínio, adicionados a, ou emulsionados com um antigénio, aumentavam grandemente a

produção de anticorpos, i. e., eles actuam como adjuvantes. O 2 hidróxido de alumínio é ainda muito utilizado com, e. g., toxóides de difteria e tétano. 0 documento GB-A-1377074 descreve um processo para a preparação de co-precipitados de tirosina que têm um alergénio disperso neles. 0 documento GB-A-1492973 descreve um processo para preparar co-precipitados de tirosina que têm um alergénio modificado disperso neles. 0 alergénio foi modificado por tratamento com um agente, tal como gluteraldeído, que origina reticulação intra-molecular e reduz a alergenicidade do produto em relação ao alergénio não modificado. 0 lípido A 3-0-desacilo-monofosforilo é conhecido do documento GB-A-2220211 (Ribi). Quimicamente, ele é uma mistura de lípido A 3-0-desacilo-monofosforilo com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas e é fabricado pela Ribi Immunochem Montana. Uma forma preferida de lípido A 3-0-desacilo-monofosforilo está descrita no pedido de patente internacional N°. 92/16556. A publicação de patente internacional N°. W098/44947 descreve uma formulação para utilização na terapia de dessensibilização de pessoas que sofrem de alergia, que compreende um alergénio opcionalmente modificado, tirosina e lípido A 3-0-desacilo-monofosforilo. Têm sido feitos esforços consideráveis para produzir adjuvantes melhores, em particular para respostas mediadas por células-T, mas deve sublinhar-se que poucos destes adjuvantes mais recentes são já aceites para uma utilização de rotina em humanos. 3

Parece que o efeito dos adjuvantes é devido essencialmente a duas actividades: a concentração de antigénio num sitio em que os linfócitos estão expostos a ele (o efeito "depósito") e a indução de citocinas, que regulam a função dos linfócitos. Novos dispositivos, tais como lipossomas e complexos imuno-estimuladores (ISCOMS), alcançam o mesmo objectivo, ao assegurar que os antigénios neles encerrados são fornecidos a células que apresentam antigénios. Pensa-se que os produtos bacterianos, tais como paredes celulares micobacterianas, endotoxinas, etc., actuam estimulando a formação de citocinas. A indução de citocinas pode ser particularmente útil em doentes imunocomprometidos que muitas vezes não conseguem responder às vacinas normais. É esperado que esta indução de citocinas possa também ser útil para encaminhar a resposta imunitária na direcção desejada, e. g.r em doenças em que apenas é desejada uma resposta de células TH1 ou TH2 (Roitt et al. "Immunology" 4a edição).

Os requerentes proporcionam agora uma nova formulação de antigénio que pode fazer pender o equilíbrio TH1-TH2 a favor de uma resposta de TH1. A formulação é útil em imunoterapia, em particular no campo das vacinas. Também é útil no estudo de respostas imunitárias e na produção de anticorpos.

Exposição da invenção

De acordo com um aspecto da presente invenção proporciona-se uma composição compreendendo: 4 (A) um antigénio; (B) um adjuvante indutor de TH1; e (C) um aminoácido pouco solúvel ou um seu derivado.

De um modo preferido, o antigénio deriva de uma bactéria ou virus, ou outro organismo patogénico, ou neoplasma, ou do conhecimento das suas estruturas antigénicas.

De um modo preferido, o adjuvante indutor de TH1 é MPL, 3-DMPL ou um seu derivado ou sal.

De um modo preferido, o aminoácido pouco solúvel é tirosina, triptofano ou um seu derivado. A presente invenção também proporciona uma composição para utilização em medicina.

De um modo preferido, a composição está na forma de uma vacina. A presente invenção também proporciona a utilização da composição anterior na preparação de um medicamento para o tratamento de, ou prevenção de uma infecção bacteriana, virai ou outra doença, tal como cancro. A presente invenção proporciona ainda um método para preparar uma imunoglobulina, compreendendo imunizar um animal com uma composição da presente invenção. A presente invenção também proporciona um método para preparar uma composição da presente invenção, compreendendo misturar uma solução de um antigénio e o adjuvante indutor de 5 ΤΗ1, com uma solução do aminoácido pouco solúvel ou derivado, num ácido aquoso forte, neutralizando ao mesmo tempo a mistura de soluções, co-precipitando assim o aminoácido pouco solúvel, antigénio e adjuvante. Este método pode compreender ainda a adição de um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Descrição detalhada A seguir serão descritas várias caracteristicas e formas de realização preferidas da presente invenção, a titulo de exemplo não limitativo. (A) Antigénio

Originalmente, o termo "antigénio" foi utilizado para qualquer molécula que induzisse células B a produzir um anticorpo especifico. Actualmente, no entanto, o termo pode ser utilizado para indicar qualquer molécula que pode ser especificamente reconhecida pelos elementos adaptativos da resposta imunitária, i. e., por células B ou células T, ou ambas. Assim, o antigénio é uma molécula que reage com o anticorpo pré-formado em receptores específicos em células T e B. No entanto, os requerentes excluem os que são tradicionalmente conhecidos como "alergénios", i. e., um agente, e. g., pólen, pó, que origina uma hipersensibilidade mediada por IgE.

Uma alergia é uma resposta a um antigénio do meio ambiente (alergénio) devido a anticorpos IgE pré-existentes ligados a 6 mastócitos. É produzida uma reacção de hipersensibilidade imediata pelos produtos de mastócitos (histaminas, etc.), causando asma, febre-dos-fenos, doença do soro, anafilaxia sistemática ou dermatite de contacto. Há quatro tipos destas reacções de hipersensibilidade (Tipos I, II, III e IV) . Os primeiros três são mediados por anticorpos; o quarto é mediado essencialmente por células T e macrófagos. Assim, a presente invenção não se refere à utilização de um "antigénio do meio ambiente" deste tipo.

Assim, de um modo preferido, o "antigénio" utilizado na presente invenção não inclui um alergénio derivado de qualquer substância causadora de alergia, tal como pólen (e. g., pólen de erva-de-santiago ou vidoeiro), alimentos, veneno de insectos, mofo, pêlo de animais ou ácaros de pó doméstico (D. farinae ou D. pteronyssinus) . A presente invenção pode, portanto, ser vista como sendo referente a antigénios que muitas vezes envolvem uma resposta celular, mediada por IgG2a ou IgG2b, e não uma resposta mediada por IgE ou IgGl. 0 antigénio utilizado na presente invenção é, de um modo preferido, um imunogénio, i. e., um antigénio que activa células imunitárias a produzirem uma resposta imunitária contra ele próprio.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção refere-se a uma formulação para utilização como uma vacina e o antigénio é um que é útil nesta vacina. 7 0 antigénio utilizado na presente invenção pode ser qualquer antigénio adequado, que está, ou se torna disponível. 0 tipo de antigénio utilizado numa vacina depende de muitos factores. Em geral, quantos mais antigénios do micróbio são retidos na vacina, melhor e os organismos vivos tendem a ser mais eficazes do que os que estão mortos. As excepções a esta regra são as doenças em que uma toxina é responsável por qualquer efeito patogénico. Neste caso, a vacina pode basear-se na toxina ou toxóide isolado. 0 antigénio utilizado na presente invenção pode ser derivado de quaisquer organismos vivos; organismos intactos ou não-vivos; fragmentos subcelulares; toxóides; antigénios baseados em ADN recombinante ou antigénios anti-idiotipo ou sintéticos. 0 antigénio pode ser derivado de organismos naturais ou atenuados e que podem ser virais ou bacterianos. 0 tipo de antigénio pode ser um polissacárido capsular, antigénio de superfície ou interno. Se baseado em ADN recombinante, o antigénio pode ser obtido a partir de um gene clonado e expresso ou ADN nu. 0 antigénio pode ser modificado por reacção, por exemplo, com um agente de reticulação, tal como um dialdeído, mais em particular gluteraldeído.

Por exemplo, os microorganismos contra os quais estão disponíveis ou são pretendidas vacinas, incluem Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Pasteurella, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Bordetella, Actinobacillus, Neisseria, Brucella, Haemophilus e Escherichia coli.

As vacinas preferidas incluem vacinia (para varíola); bacilo vole (para TB); polio; sarampo, papeira; rubéola; febre-amarela; varicela-zóster; BCG; raiva; influenza; hepatite A; tifo; tosse convulsa; tifoide; cólera; peste; penumococo; meningococo; Haemophilus influenzae; hepatite B; hepatite C; tétano e difteria. As vacinas baseadas em toxinas incluem Chlostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Vibrio cholerae e Clostridium perfringens.

Outras doenças importantes para as quais as vacinas poderão ser úteis incluem: VIH, vírus de herpes, adenovírus, rinovírus, estafilococos, estreptococos do grupo A, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia, Candida, Pneumocystis, malária, tripanossomíase; doença de Chagas; esquistossomíase e oncocercose. A presença de antigénios de tumor também foi demonstrada e, como resultado, surgiu o conceito de vacinação contra o cancro. Além disso, em princípio, a concepção e implantação podem ser interrompidas por indução de imunidade contra uma vasta gama de hormonas da gravidez e outras hormonas reprodutivas. (B) Adjuvante indutor de TH1 0 termo "adjuvante indutor de TH-1" significa um adjuvante que aumenta a resposta de TH1 a um antigénio. A eficácia de um adjuvante como adjuvante indutor de TH1 pode ser avaliada determinando o perfil de anticorpos dirigidos contra um antigénio, resultante da administração deste antigénio em vacinas que também são constituídas pelos vários adjuvantes. 9

De um modo preferido, o adjuvante é um lipopolissacárido modificado. Como descrito na patente US N°. 4912094, o lipopolissacárido enterobacteriano (LPS) é um imunoestimulante poderoso. No entanto, ele pode também desencadear respostas prejudiciais e, por vezes, fatais. É conhecido que as actividades endotóxicas associadas com LPS resultam do seu componente de lipido A. Deste modo, a presente invenção utiliza de um modo mais preferido um derivado de lipido A destoxifiçado. A Ribi ImmunoChem produziu um derivado de lipido A originalmente conhecido como endotoxina destoxifiçada refinada (RDE), mas que se tornou conhecida como lipido A monofosforilo (MPL). Como descrito na patente US N°. 4912094, o MPL é produzido levando ao refluxo LPS ou lipido A, obtido de mutantes heptose-deficientes de bactérias gram negativas (e. g. Salmolella sp.) em soluções de ácido mineral de força moderada (e. g. HC1 0,1 N), durante um periodo de cerca de 30 minutos. Este tratamento resulta na perda da unidade fosfato na posição 1 da glucosamina terminal redutora. Adicionalmente, o hidrato de carbono nuclear é removido da posição 6' da glucosamina não redutora durante este tratamento.

De um modo preferido, no entanto, utiliza-se um LPS modificado ou lipido A, em que o lipido A destoxifiçado retém a unidade nuclear ligada à posição 6' da glucosamina não redutora. Estes derivados de LPS e lipido A também estão descritos na patente US N°. 4912094. Em maior detalhe, a patente US 4912094, descreve um lipopolissacárido modificado que é obtido pelo método de remover selectivamente apenas o resíduo de acilo β-hidroximirístico do lipopolissacárido que tem uma ligação éster com a glucosamina terminal redutora na posição 3' do referido lipopolissacárido, que compreende submeter o referido 10 lipopolissacárido a hidrólise alcalina. Este lipido A O-desacilo-monofosforilo (MPL), lipido A difosforilo (DPL) e LPS podem ser utilizados na presente invenção. Assim, numa forma de realização preferida, a presente invenção utiliza MPL, DPL ou LPS, em que a posição 3' da glucosamina terminal redutora é O-desacilada. Estes compostos são conhecidos como 3-DMPL, 3-DDPL e 3-DLPS, respectivamente.

Na patente US 4987237 descrevem-se derivados de MPL com a fórmula:

R

N

-0P03H2 e em que R1 e R2 são H, R3 é um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada composto por C, H e opcionalmente 0, N e S, que, no caso de mais do que um átomo, podem ser o mesmo ou diferentes, em que o número total de átomos de C não excede 60 e o circulo representa um núcleo de MPL.

Alternativamente, o derivado de MPL tem a fórmula

H

3-OP03H2 em que o segmento do derivado representado por 11

contém 2-60 átomos de C e em que R3 é um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada composto por C, H e, opcionalmente O, N e S, que, no caso de mais do que um átomo, podem ser o mesmo ou diferentes e x é um minimo de 1 e pode ser qualquer número inteiro, de modo a que o número total de átomos C em todos os segmentos x não exceda 60 e em que a estrutura quimica de cada R pode ser a mesma ou diferente em cada um destes segmentos e em que o circulo representa um núcleo de MPL.

Todos estes derivados ou sais de LPS ou lipido A que estão, ou se tornam disponíveis, podem ser utilizados na presente invenção. De um modo preferido, os derivados e sais são uns que são farmaceuticamente aceitáveis. O adjuvante indutor de TH1 pode ser misturado com os outros componentes da composição antes de administração. Alternativamente, ele pode ser formulado juntamente com os outros componentes durante o fabrico do produto. Alternativamente, ele pode ser administrado num sitio ou numa altura diferente, relativamente a outros componentes. A administração pode ser por várias vias. (C) Aminoácido pouco solúvel O aminoácido deve ser pouco solúvel numa solução aquosa, de modo a permitir que o adjuvante e o antigénio produzam uma resposta imunitária. 12 A maioria dos aminoácidos é apenas pouco solúvel em água, como consequência das forças intermoleculares fortes que actuam na rede do cristal. As excepções são a glicina, prolina, lisina, treonina, cisterna e arginina que são todas bastante solúveis em água e não formam parte da invenção. A solubilidade em água dos aminoácidos é dada na tabela seguinte:

Aminoácido Solubilidade em água g/100 mL H20 a 25 °C Glicina 25 Alanina 16, 7 Valina 8, 9 Leucina 2,4 Isoleucina 4,1 Metionina 3,4 Prolina 162 Fenilalanina 3, 0 Triptofano 1,1 Serina 5, 0 Treonina Muito Cisteína Muito Tirosina 0,04 Asparagina 3, 5 Glutamina 3,7 Ácido aspártico 0,54 Ácido glutâmico 0,86 Lisina Muito Arginina 15 Histidina 4,2 13

De um modo preferido, a solubilidade em água do aminoácido utilizado na invenção é de cerca de 1,1 ou menos g/100 mL de H2O a 25 °C. São particularmente preferidos a tirosina ou o triptofano; sendo preferida a mais insolúvel, tirosina. Os derivados destes aminoácidos também estão incluidos no âmbito da presente invenção, tais como benzil-O-octadecanoil-L-tirosina. De um modo preferido, o derivado é um que é farmaceuticamente aceitável.

Tipicamente, o antigénio é disperso no e/ou adsorvido no aminoácido, e. g., por co-precipitação ou mistura, respectivamente.

Preparação A composição da presente invenção pode ser preparada misturando uma solução aquosa do antigénio com uma solução do aminoácido num ácido aquoso forte, neutralizando a mistura da solução, co-precipitando desse modo o aminoácido e antigénio, misturando o produto com o adjuvante indutor de TH1 e adicionando opcionalmente um diluente, excipiente ou veiculo fisiologicamente aceitável, antes ou depois da mistura anteriormente mencionada. Alternativamente, o adjuvante indutor de TH1 pode ser co-precipitado com o antigénio. Além de ser misturado ou co-precipitado com os outros componentes da composição antes de administração, o adjuvante indutor de TH1 pode ser administrado num sitio e/ou numa altura diferente, relativamente aos outros componentes. 14

Tipicamente, uma solução aquosa do antigénio, de um modo preferido a pH 7+1, obtida por solvatação de um sólido, é misturada com uma solução do aminoácido num ácido aquoso forte. 0 ácido forte é normalmente um ácido inorgânico, de um modo preferido ácido clorídrico. A solução de antigénio utilizada neste passo contém tipicamente entre 0,1 yg/mL e 1000 yg/mL de proteína de antigénio, por exemplo cerca de 400 yg/mL. A razão antigénio:aminoácido na mistura é tipicamente na gama de 1:4 x 105 a 1:1 x 102 p/p. A mistura de soluções de antigénio e aminoácido resultante é neutralizada. Por neutralização entenda-se um ajuste do pH para um valor na gama de 4,0 a 7,5. É desejável que, em nenhuma altura, ou pelo menos não num tempo prolongado durante a neutralização, o pH da solução suba consideravelmente acima de 7,5. Esta condição pode ser satisfeita agitando vigorosamente a solução e utilizando apenas a quantidade necessária de base, se desejado. Vários agentes tampão podem ser utilmente adicionados às soluções de antigénio para auxiliar no controlo do pH durante as fases de mistura e neutralização.

Um método particularmente útil de realizar a neutralização é fazer correr correntes separadas da solução de aminoácido e de base neutralizante para a solução de antigénio. O caudal das soluções adicionadas é controlado pelo estado do pH, isto é pelo equipamento que regula o fluxo de uma ou ambas as soluções, de modo a que o pH da mistura reaccional permaneça substancialmente constante a um nível pré-determinado. Os requerentes verificaram que se obtêm normalmente resultados óptimos por controlo do pH na gama de 6,5 a 7,5, embora o pH preciso possa variar de acordo com a natureza do antigénio. 15 0 resultado da neutralização é a precipitação imediata do aminoácido no qual e/ou sobre o qual a solução de antigénio é absorvida e/ou adsorvida. Após a precipitação, a mistura é, ou lavada imediatamente, ou deixada em repouso durante um periodo de algumas horas, até um dia ou dois antes da lavagem. 0 precipitado resultante pode ser removido da solução por centrifugação ou filtração e lavado, e. g., com fenol-solução salina, antes de ser ressuspenso, se necessário, num veículo, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável. 0 MPL (ou outro adjuvante indutor de TH1) que foi dissolvido pelo método descrito na Preparação 3 a seguir, ou por sonicação, pode ser diluído por vários meios antes da sua adição a adsorvatos de antigénio de aminoácidos. A preparação de MPL é inicialmente feita a uma concentração tipicamente entre 0,5 mg por mL e 4 mg por mL, por exemplo 1 mg por mL. Ela pode ser diluída para uma concentração entre 500 pg/mL e 20 pg/mL, de um modo preferido de 100 pg/mL. Esta diluição pode ser feita em água pura, ou em solução aquosa de glicerol contendo entre 1% e 4%, de um modo preferido, 2% de glicerol. Estas diluições podem então ser adicionadas a uma suspensão de adsorvato de aminoácidos, preparado como descrito acima. Por conveniência, a concentração da solução de MPL e da suspensão de adsorvato de aminoácidos, respectivamente, podem ser seleccionadas de modo a que sejam misturados volumes aproximadamente iguais de cada, para obter o produto final para injecção. Um produto final típico contém cerca de 100 pg/mL de antigénio e cerca de 250 pg/mL de MPL.

Assim, embora a formulação da invenção possa ser administrada directamente, de um modo preferido a formulação é 16 combinada com um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, para produzir uma composição farmacêutica que pode ser para utilização em humanos, ou em veterinária. Os veículos e diluentes fisiologicamente aceitáveis incluem soluções salinas isotónicas, por exemplo solução salina tamponada com fosfato, fenol-solução salina e água estéril. As composições podem ser formuladas para administração parentérica, intramuscular, intravenosa, subcutânea, intra-ocular ou transdérmica.

As vias de administração e dosagens aqui descritas pretendem apenas servir de guia, uma vez que um especialista na técnica será capaz de determinar facilmente a via de administração e dosagem óptimas, para qualquer doente e condição particulares.

Preparação de vacinas

As vacinas podem ser preparadas a partir da formulação da presente invenção. A preparação de vacinas que contêm um antigénio como ingrediente activo é conhecida de um especialista na técnica. Tipicamente, estas vacinas são preparadas como injectáveis, quer como soluções líquidas ou suspensões; também se podem preparar formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão num líquido, antes da injecção. A preparação também pode ser emulsionada, ou a formulação encapsulada em lipossomas. Como acima indicado, a formulação pode ser misturada com veículos, diluentes e excipientes que são farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com a formulação. Estes excipientes são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. 17

Adicionalmente, se desejado, a vacina pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes humidificadores ou emulsionantes, agentes de tamponamento de pH e/ou outros adjuvantes que melhoram a eficácia da vacina. A proporção de antigénio e adjuvante pode variar numa gama alargada, desde que ambos estejam presentes em quantidades eficazes. De forma conveniente, as vacinas são formuladas de modo a conter uma concentração final de antigénio na gama de 0,2 yg/mL a 200 pg/mL, de um modo preferido de 5 pg/mL a 50 pg/mL, de um modo muito preferido cerca de 15 pg/mL.

Após a formulação, a vacina pode ser incorporada num recipiente estéril que é então selado e armazenado a baixa

temperatura, por exemplo 40 °C, ou pode ser liofilizado. A liofilização permite um armazenamento a longo prazo, numa forma estabilizada.

As vacinas são convencionalmente administradas parentericamente, por injecção, por exemplo, quer subcutânea, quer intramuscularmente. Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, nalguns casos, formulações orais. Para supositórios, os ligantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos; estes supositórios podem ser formados a partir de misturas que contêm o ingrediente activo na gama de 0,5% a 10%, de um modo preferido, de 1% a 2%. As formulações orais incluem os excipientes normalmente utilizados, tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Estas composições tomam a forma de soluções, 18 suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação controlada ou pós e contêm de 10% a 95% de ingrediente activo, de um modo preferido, de 25% a 70%. Quando a composição de vacina é liofilizada, o material liofilizado pode ser reconstituído antes da administração, e. g., como uma suspensão. A reconstituição é, de um modo preferido, efectuada em tampão.

As cápsulas, comprimidos e pílulas para administração oral a um doente podem ser providas de um revestimento entérico compreendendo, por exemplo, Eudragit "S", Eudragit "L", acetato de celulose, acetatoftalato de celulose ou hidroxipropilmetilcelulose.

Os antigénios utilizados na invenção podem ser formulados na vacina como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição de ácido (formados com grupos amino livres do péptido) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico e maleico. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férricos e bases orgânicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina e procaína.

Dosagem e administração de vacinas

As vacinas são administradas de um modo compatível com a formulação da dosagem e numa quantidade tal que seja profilática e/ou terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada, 19 que é geralmente na gama de 5 yg a 250 yg de antigénio por dose, depende do indivíduo a ser tratado, da capacidade do sistema imunitário do indivíduo de sintetizar anticorpos e do grau de protecção desejado. Uma gama preferida é de cerca de 20 yg a cerca de 40 yg por dose.

Um tamanho de dose adequado é de cerca de 0,5 mL. Deste modo, uma dose para injecção intramuscular, por exemplo, compreenderá 0,5 mL contendo 20 yg de imunogénio em mistura com 0,5% de adjuvante.

As quantidades precisas de ingrediente activo necessárias para ser administradas podem depender do critério do médico e podem ser peculiares para cada indivíduo. A vacina pode ser administrada num esquema de dose única ou, de um modo preferido, num esquema de dose múltipla. Um esquema de dose múltipla é aquele em que uma primeira via de vacinação pode ser com 1-10 doses separadas, seguido de outras doses administradas a intervalos de tempo subsequentes, necessários para manter e ou reforçar a resposta imunitária, por exemplo, de 1 a 4 meses para uma segunda dose e, se necessário, uma dose(s) subsequente (s) após vários meses. O regime de dosagem será também determinado, pelo menos em parte, pela necessidade do indivíduo e dependerá do critério do médico.

Adicionalmente, a vacina que contém o(s) antigénio (s) pode ser administrada em conjunção com outros agentes imunorreguladores, por exemplo, imunoglobulinas. 20

Preparação de anticorpos utilizando a formulação da invenção

As composições de acordo com a invenção podem ser utilizadas directamente como imunogénios, sem a utilização de outros adjuvantes para produzir anti-soros e anticorpos monoclonais. A invenção proporciona assim um método para induzir a produção de imunoglobulinas especificas do antigénio, compreendendo os passos de: a) imunizar um animal com uma composição de acordo com a presente invenção; e b) recuperar imunoglobulinas especificas para uma região do antigénio da composição, a partir do soro do animal.

Os animais utilizados para a produção de anticorpo podem ser quaisquer animais normalmente utilizados para esse fim, em particular mamiferos. São especialmente indicados os ratinhos, ratos, porquinhos-da-índia e coelhos. A imunização é realizada de acordo com técnicas estabelecidas (ver "Antibodies, A Laboratory Mannual" de E. Harlow e D. Lane (1988) Cold Spring Harbor, EUA). A composição purificada (cerca de 1 mg) foi injectada num coelho.

Administrou-se uma injecção de reforço de 0,5 mg da composição, 4 semanas após a injecção inicial. Os anticorpos são isolados do soro de coelho e testados quanto à reactividade. Obtêm-se por estes método anticorpos capazes de se ligar selectivamente ao antigénio escolhido.

Mais em particular, pode-se utilizar a formulação da presente invenção compreendendo o antigénio para produzir anticorpos, quer policlonais, quer monoclonais. Quando se 21 pretendem anticorpos policlonais, imuniza-se um mamífero seleccionado (e. g., um ratinho, coelho, cabra, cavalo, etc.) . 0 soro do animal imunizado é recolhido e tratado de acordo com processos conhecidos. Se o soro contém anticorpos policlonais contra outros antigénios, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade. As técnicas para produzir e processar anti-soros policlonais são conhecidas na técnica.

Os anticorpos monoclonais dirigidos contra antigénios utilizados na invenção também podem ser facilmente produzidos por um especialista na técnica. A metodologia geral para produzir anticorpos monoclonais por hibridomas é bem conhecida. Podem-se criar linhas celulares produtoras de anticorpos, imortais, por fusão celular e também por outras técnicas, tais como transformação directa de linfócitos B com ADN oncogénico, ou transfecção com virus de Epstein-Barr. Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra antigénios podem ser pesquisados quanto a várias propriedades/ i. e., quanto ao isotipo e afinidade para o epitopo.

Uma técnica alternativa envolve pesquisar bibliotecas de apresentação em fagos em que, por exemplo, o fago expressa fragmentos scFv na superfície do seu revestimento, com uma grande variedade de regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Esta técnica é bem conhecida na técnica.

Os anticorpos, quer monoclonais, quer policlonais, que são dirigidos contra antigénios, são particularmente úteis no diagnóstico e os que são neutralizantes são úteis na imunoterapia passiva. Os anticorpos monoclonais, em particular, podem ser utilizados para produzir anticorpos anti-idiotipo. Os 22 anticorpos anti-idiotipo são imunoglobulinas que transportam uma "imagem interna" do antigénio do agente infeccioso contra o qual se pretende obter protecção.

As técnicas para produzir anticorpos anti-idiotipo são bem conhecidas na técnica. Estes anticorpos anti-idiotipo podem também ser úteis para tratamento, bem como para uma elucidação das regiões imunogénicas dos antigénios.

Para os fins da presente invenção, o termo "anticorpo", salvo especificação em contrário, inclui fragmentos de anticorpos totais, que retêm a sua actividade de ligação para um antigénio alvo. Estes fragmentos incluem fragmentos Fv, F(ab') e F(ab')2, bem como anticorpos de cadeia simples (scFv). Além disso, os anticorpos e seus fragmentos podem ser anticorpos humanizados, por exemplo, como descrito no documento EP-A-239400. A invenção será descrita com referência aos exemplos seguintes que pretendem ser apenas ilustrativos e não limitativos.

Exemplo de referência

Preparação 1

Dissolveram-se 8 mg de ovalbumina (XOA) como alergénio modelo, misturando em 20 mL de solução EVANS. Em seguida, adicionaram-se 6,9 mL de tampão fosfato, com mistura. A solução foi colocada num copo de 100 mL contendo uma barra de agitação magnética. Sob mistura, utilizando um agitador magnético, 23 adicionaram-se em simultâneo, gota a gota, 6,9 mL de NaOH 3,2 N e 6,9 mL de HC1 3,8 N, contendo tirosina a 24% p/v, durante um periodo de 5 minutos, para formar um precipitado. Deixou-se a mistura a agitar por mais 5 minutos e em seguida transferiu-se para um tubo de centrifuga de 50 mL e centrifugou-se durante 10 minutos, a 2500 rpm. Após centrifugação, o sobrenadante foi decantado e o precipitado sedimentado foi ressuspenso em 40 mL de tampão fosfato. A mistura foi centrifugada durante 5 minutos a 2500 rpm. Após centrifugação, o sobrenadante foi decantado e o precipitado foi ressuspenso em 40 mL de tampão fosfato. A mistura foi centrifugada durante 5 minutos a 2500 rpm. Após centrifugação, o sobrenadante foi decantado e o precipitado sedimentado foi ressuspenso em 40 mL de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,2 contendo glicerol a 0,4% v/v e timerosal a 0,01% p/v, como conservante. O produto final continha aproximadamente 40 mg/mL de adsorvato de tirosina. Assumindo 100% de ligação de XOA ao adsorvato de tirosina, o XOA estava a 200 yg/mL no produto final. O adsorvato de tirosina de XOA foi armazenado a 4 °C, até ser necessário.

Preparação 2

Preparou-se uma solução de 4 mg/mL de 1,2-dipalmitoil-SN-glicero-3-fosfocolina (DPPC) em etanol absoluto. Para cada 1,0 mg de sal de MPL® -TEA (trietilamina) a ser solubilizado, adicionaram-se 27 μΐ de DPPC para dissolver o MPL®. O MPL pode ser preparado como descrito acima. O etanol foi removido, injectando suavemente uma corrente de N2 para dentro do frasco. Em seguida, adicionou-se 1,0 mL de água isenta de pirogénio para injecção, por cada mg de MPL® na mistura seca MPL®/DPPC. A solução foi sonicada num banho sonicador a 60-70 °C, até estar 24 límpida. A solução de MPL®/DPPC foi então esterilizada por filtração através de um filtro de 0,2 ym SFCA 290-4520 da Nalgene. A solução de MPL®/DPPC foi dispensada de forma asséptica a 1,0 mg/mL nos frascos despirogenados, rotulados com MPL®-AF (MPL solubilizado no tensioactivo DPPC) e armazenados a 4 °C.

Actividade biológica A actividade indutora de TH1 em ratinhos pode ser considerada como equivalente à produção de anticorpos IgG2a e IgG2b e a actividade indutora de TH2, com a produção de anticorpos IgGl e anticorpos IgE.

Deste modo, como um exemplo, realizou-se uma experiência em ratinhos para demonstrar os perfis dos anticorpos específicos para o alergénio, para um exemplo de ovalbumina (XOA) que é um alergénio derivado de ovos de galinha, bem conhecido. Confirmou-se que uma formulação que consistia de MPL + XOA + tirosina estimulou um perfil de anticorpos mais vantajoso do que MPL + XOA, XOA + tirosina ou XOA isolada.

Injectaram-se subcutaneamente na área inguinal, grupos de 8 ratinhos fêmea BALB/c com 6-8 semanas de idade, com 0,2 mL de uma das seguintes vacinas. XOA + tirosina O adsorvato de tirosina de XOA preparado na Preparação 1 acima foi diluído com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato, no espaço de 30 minutos antes da inj ecção. 25 ΧΟΑ + tirosina + MPL 0 adsorvato de tirosina de XOA preparado na Preparação 1 acima foi diluído com um volume igual de MPL®-AF a 500 yg/mL em solução salina tamponada com fosfato, no espaço de 30 minutos antes da injecção. XOA + MPL Dissolveu-se XOA a 200 yg/mL em solução salina tamponada com fosfato e diluiu-se com um volume igual de MPL®-AF a 500 yg/mL em solução salina tamponada com fosfato, no espaço de 30 minutos antes da injecção. XOA isolada Dissolveu-se XOA a 200 yg/mL em solução salina tamponada com fosfato e diluiu-se com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato.

Vinte e um dias mais tarde, os quatro grupos de ratinhos levaram um reforço de 0,2 mL de vacinas preparadas de fresco. Catorze dias após o reforço, os ratinhos foram sangrados e os soros foram separados e armazenados a -70 °C, até serem testados.

Os soros foram testados por técnica de ELISA convencional, utilizando anticorpos IgGi, IgG2a e IgG2b de cabra anti-ratinho, conjugados com rábano, adquiridos da Southern Biotechnology Inc. (Birmingham, AL, EUA) e utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Os títulos de IgGi, IgG2a e IgG2b representam a diluição de soro recíproca que origina uma leitura > 0,1 unidades de DO a A49o.

Os níveis de IgE no soro foram medidos utilizando um ELISA de captura de anti-IgE, seguido de utilização de uma sonda de ovalbumina biotinilada. A ligação foi medida após a adição de 26 uma preparação de estreptavidina conjugada com rábano. Os resultados são descritos como unidades de DO a A49o. É de particular importância o facto de a combinação de alergénio + tirosina + MPL induzir menos anticorpos IgE específicos para o antigénio do que outras combinações. Além disso, a razão entre os anticorpos IgG2a ou IgG2b e IgGi é maior e consistente com os niveis mais elevados dos dois primeiros isotipos de anticorpo observados na experiência nos ratinhos que receberam antigénio + tirosina + MPL, do que em qualquer outro grupo de ratinhos. Isto é indicativo de uma melhor razão de indução de células TH1 em relação a células TH2 neste grupo, em comparação com a induzida nos outros grupos de ratinhos.

Exemplos de acordo com a presente invenção

Preparação A A uma solução neutra de polipéptido purificado que apresenta antigenecidade para o virus de hepatite B (os detalhes do modo de preparação de um polipéptido deste tipo podem ser encontrados nos documentos EP-A-0182442 e W098/44947) adiciona-se solução tamponada com fosfato a um pH de 7 + 1. A solução de antigénio é co-precipitada com tirosina pela adição simultânea de um volume de 1-tirosina em HC1 (preparada dissolvendo 24 g de L-tirosina para 100 mL com HC1 3,8 M) e um volume de NaOH 3,2 M, a quatro volumes de solução de antigénio, com agitação vigorosa. A suspensão assim formada foi centrifugada, lavada repetidamente com solução salina tamponada, pH 6+1. 27

Preparação B

Tal como para a Preparação 1 do Exemplo de Referência, excepto que a XOA é substituída com um polipéptido que apresenta antigenecidade para o vírus de hepatite (HBV).

Preparação C

Igual à Preparação 2 do Exemplo de Referência

Actividade Biológica A actividade indutora de TH1 em ratinhos pode ser considerada como equivalente à produção de anticorpos IgG2a e IgG2b e a actividade indutora de TH2, como a produção de anticorpos IgGl e anticorpos IgE.

Assim, como um exemplo, realiza-se uma experiência em ratinhos para demonstrar os perfis dos anticorpos específicos para o antigénio contra um exemplo de antigénio (HBV) que é um antigénio bem conhecido. Confirma-se que uma formulação consistindo de MPL + HBV + tirosina estimulou um perfil de anticorpos mais vantajoso do que MPL + HBV, HBV + tirosina ou HBV isolado.

Injectaram-se subcutaneamente na área inguinal, grupos de 8 ratinhos fêmea BALB/C, de 6-8 semanas de idade, com 0,2 mL de uma das seguintes vacinas. 28 HBV + tirosina 0 adsorvato de tirosina de HBV preparado na preparação A acima foi diluído com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato, no espaço de 30 minutos antes da inj ecção. HBV + tirosina + MPL O adsorvato de tirosina de HBV preparado na preparação A acima foi diluído com um volume igual de MPL®-AF a 500 pg/mL em solução salina tamponada com fosfato, no espaço de 30 minutos antes da injecção. HBV + MPL Dissolveu-se HBV em solução salina tamponada com fosfato a 200 pg/mL e diluiu-se com um volume igual de MPL®-AF a 500 pg/mL em solução salina tamponada com fosfato, no espaço de 30 minutos antes da injecção. HBV isolado Dissolveu-se HBV a 200 pg/mL em solução salina tamponada com fosfato e diluiu-se com um volume igual de solução salina tamponada com fosfato.

Vinte e um dias mais tarde, os quatro grupos de ratinhos levam um reforço de 0,2 mL de vacinas preparadas de fresco. Catorze dias após o reforço, os ratinhos são sangrados e os soros separados e armazenados a -70 °C, até serem testados. Os soros são testados por técnica de ELISA convencional, utilizando anticorpos IgGi, IgG2a e IgG2b de cabra anti-ratinho, conjugados com rábano, adquiridos da Southern Biotechnology Inc. (Birmingham, AL, EUA) e utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Os títulos de IgGi, IgG2a e IgG2b representam a diluição de soro recíproca que origina uma leitura > 0,1 unidades de DO a A490 . Os níveis de IgE no soro são medidos utilizando um ELISA de captura de anti-IgE, seguido de utilização de uma sonda de ovalbumina biotinilada. A ligação é 29 medida após a adição de uma preparação de estreptavidina conjugada com rábano. É de particular importância o facto de a combinação de antigénio + tirosina + MPL induzir menos anticorpos IgE específicos para o antigénio do que as outras combinações. Além disso, a razão entre os anticorpos IgG2a ou

IgG2b e IgGl pode ser maior e consistente com os niveis mais elevados dos dois primeiros isotipos de anticorpo observados na experiência nos ratinhos que receberam antigénio + tirosina + MPL, do que em qualquer outro grupo de ratinhos. Isto é indicativo de uma melhor razão de introdução de células TH1 em relação a células TH2 neste grupo, em comparação com a induzida nos outros grupos de ratinhos.

Lisboa, 7 de Dezembro de 2006 30

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo: 2 . (A) um antigénio derivado de uma bactéria, virus ou neoplasma; (B) um adjuvante indutor de TH1; e (C) um aminoácido pouco solúvel em água ou um seu derivado.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o antigénio está na forma de um polipéptido, ou um vector compreendendo um polinucleótido que codifica para um polipéptido antigénico e ligado de forma operacional a uma sequência reguladora que permite a expressão do polinucleótido.
3. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o adjuvante indutor de TH1 é MPL, 3-DMPL ou um seu derivado.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o aminoácido pouco solúvel é tirosina, triptofano ou um seu derivado.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização em medicina.
6. Composição farmacêutica compreendendo a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, 1 juntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
7. Composição de vacina compreendendo a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, juntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
8. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, adaptada para administração parentérica.
9. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para o fabrico de um medicamento para o tratamento, ou prevenção, ou redução da susceptibilidade a uma infecção bacteriana ou virai, ou cancro, num humano ou animal.
10. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, num método para produzir anticorpos que reconhecem o antigénio.
11. Método para produzir anticorpos que reconhecem o antigénio, em que o método compreende administrar uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 a um mamífero não humano.
12. Método para preparar uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo misturar uma solução de um antigénio e o adjuvante indutor de TH1, com uma solução do aminoácido pouco solúvel, ou seu derivado, num ácido aquoso forte, neutralizando ao mesmo tempo a 2 mistura de soluções, co-precipitando assim o aminoácido pouco solúvel, antigénio e adjuvante. compreendendo ou excipiente
13. Método de acordo com a reivindicação 12, ainda adicionar um veiculo, diluente farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 7 de Dezembro de 2006 3