ES2277339T3 - Vacuna con adyuvante de aceite y metodo para su preparacion. - Google Patents
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Abstract
VACUNA DE ADYUVANTE OLEOSO DEL TIPO AGUA-EN-ACEITE QUE INCLUYE DEL 20% AL 90% DE PESO DE UNA FASE OLEOSA A) QUE SE HALLA EN ESTADO LIQUIDO A TEMPERATURA NORMAL; DEL 0,5% AL 30% DE PESO DE UN AGENTE EMULSIONANTE QUE INCLUYE UN SURFACTANTE NO IONICO B) QUE ES UN ESTER PARCIAL DERIVADO DE UN ALCOHOL POLIHIDRICO QUE LLEVA AL MENOS TRES GRUPOS HIDROXIL Y UN ACIDO GRASO Y QUE SE HALLA EN ESTADO LIQUIDO A 40 IDO GRASO HIDROXI DE POLIOXIETILENO (DE 20 A 60 MOLES) C) ; Y DE 5 A 75 % DE PESO DE UNA FASE ACUOSA D) QUE CONTIENE UNA CANTIDAD BIOLOGICAMENTE ACEPTABLE Y EFECTIVA DE ANTIGENOS, Y OPCIONALMENTE E) DEL 0.01 AL 10% DE PESO DE UN AMINOACIDO O COMPUESTO SALINO DE ESTE Y DEL 0.01 AL 10% DE PESO DE UN AZUCAR NO REDUCTOR O UN ALCOHOL DE AZUCAR QUE TENGA AL MENOS 5 GRUPOS HIDROXIL EN LA MOLECULA. ADEMAS, UNA VACUNA ADYUVANTE OLEOSA TIPO AGUA-ENACEITE-EN AGUA INCLUYE LA VACUNA ADYUVANTE OLEOSA DEL TIPO AGUAEN-ACEITE PRECEDENTE COMO UNA FASE INTERNA Y UNA FASE ACUOSA EXTERIOR F) QUE TIENE DEL 0.2 AL 20% DE PESO DE UN AGENTE EMULSIONANTE QUE INCLUYE UN SURFACTANTE NO IONICO Y QUE TIENE UN VALOR HLB TOTAL NO INFERIOR A 10. LAS VACUNAS ADYUVANTES DE ACEITE MUESTRAN UNA ALTA CAPACIDAD PARA INDUCIR UNA PRODUCCION DE ANTICUERPOS DURANTE UN LARGO PERIODO DE TIEMPO Y SON EXCELENTES EN LO QUE SE REFIERE A REQUISITOS EXIGIDOS A MEDICAMENTOS COMO SON LA ESTABILIDAD Y LA SEGURIDAD.
Description
Vacuna con adyuvante de aceite y método para su
preparación.
La presente invención se refiere a una vacuna
con adyuvante de aceite así como a un método para preparar la
vacuna.
La vacuna con adyuvante de aceite se conoce
desde hace tiempo como una vacuna para potenciar eficazmente la
inmunidad. Experimentalmente, todavía se ha usado el adyuvante de
Freund como adyuvante de aceite clásico de vacuna puesto que tienen
un efecto potenciador de la inmunidad bastante eficaz, en
particular, cuando se usa combinado con un antígeno inactivado. El
adyuvante de aceite que comprende un aceite mineral como componente
principal y representado por el adyuvante de Freund, muestra sin
duda un efecto fuerte de potenciación de la inmunidad, pero tiene
diferentes problemas tales como que causa una reacción de
inoculación grave y la formación de lesiones enconadas asépticas y
granuloma en y alrededor de los sitios inoculados, y que se observa
edema externo, hinchamiento, induración y necrosis y se sospecha que
tiende a permanecer (tendencia de permanencia) en el sitio de la
inyección, y por consiguiente esto se convierte en un obstáculo para
aplicarlo a las vacunas. Si dichas reacciones locales permanecen en
los animales domésticos, su carne no será adecuada para comer y por
lo tanto, sería conveniente reducir tanto como fuera posible dicha
tendencia de permanencia. Por esta razón, a veces están limitados
los sitios en que se inoculan las vacunas que usan el adyuvante de
aceite que comprenden principalmente un aceite mineral.
Es esencial potenciar la eficacia y duración de
la vacuna con el fin de asegurar la prevención de una enfermedad, o
lograr el objetivo de la vacuna. Sin embargo, la seguridad de la
vacuna es mucho más importante que la eficacia y la duración por el
hecho de que la vacuna se aplica para uso humano o veterinario.
En estas circunstancias, se han llevado a cabo
diferentes estudios para resolver los problemas anteriores. Por
ejemplo, la Publicación de Patente Japonesa examinada (en lo
sucesivo denominada "J.P. KOKOKU") nº Hei
6-81731 describe un adyuvante basado en aceite de
tipo agua en aceite, en el que se usa un manitol/éster de ácido
oleico anhidro como tensioactivo y parafina líquida como componente
oleoso. El documento WO91/00107 (TOKUHYO Hei
4-506521) describe un adyuvante basado en aceite de
tipo agua en aceite de baja viscosidad cuyo componente oleoso usado
comprende una mezcla de un aceite metabolizable tal como un aceite
vegetal y un aceite no metabolizable tal como un aceite mineral.
Además, la Publicación de Patente Japonesa no examinada (en lo
sucesivo denominada "J.P. KOKAI") nº Hei
6-172216 describe una vacuna con adyuvante de aceite
que comprende un aceite vegetal como componente oleoso y una mezcla
de un éster de ácido graso y sorbitán y un éster de
polioxietilenglicol y alquilsorbitán como componente tensioactivo, y
J.P. KOKOKU nº Hei 6-39386 describe una vacuna viva
con adyuvante que se prepara mezclando un inmunógeno vivo con una
emulsión de tipo aceite en agua que comprende un aceite
mineral.
Sin embargo, todas las vacunas con adyuvante de
aceite anteriores son insuficientes no solo en la reacción local
observada después de la inyección y la tendencia a permanecer en el
sitio de inyección, si no también por la estabilidad de las
preparaciones como vacunas.
La vacuna debe ser tan eficaz y segura como sea
posible puesto que se aplica al uso humano o veterinario y debe ser
tan estable como sea posible, a la vez que tiene en cuenta el hecho
de que es un producto farmacéutico.
Sin embargo, se sabe que en el caso de vacunas
con adyuvante de aceite, al efecto de potenciación de la inmunidad
de estas vacunas, y también a su estabilidad como preparaciones
farmacéuticas, les afecta considerablemente, por ejemplo, los tipos
de emulsiones y componentes oleosos usados así como los tipos de
tensioactivos incorporados. En este sentido, en particular para las
vacunas inactivadas, ha sido muy difícil preparar una vacuna que
pueda mostrar su efecto de inducir suficiente inmunidad protectora
durante un periodo de tiempo largo con buena reproducibilidad.
Además, también se han propuesto vacunas con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua con el fin de
eliminar los inconvenientes de las vacunas con adyuvante de aceite
de tipo agua en aceite convencionales, es decir, las reacciones
locales y la tendencia a permanecer en los sitios inyectados, pero
cualquier medio convencional tiene todavía problemas de estabilidad
a largo plazo de las preparaciones farmacéuticas resultantes, y por
consiguiente, el uso práctico de dichas vacunas estaría lejos.
El documento
EP-A-0135376 describe un
emulsionante basado en
polioxietileno-polioxipropileno junto con un
tensioactivo basado en un éter de glicol y un aceite así como una
fase acuosa como un adyuvante para vacuna.
En Chem. Abs., 119, 18, abstract 80201, se
describen tensioactivos no iónicos como emulsionantes para
adyuvantes de tipo agua en aceite, que muestran alta estabilidad y
efecto de larga duración cuando se usan en una vacuna.
El documento WO94 20071.A describe emulsiones
para vacunas de agua en aceite basadas en aceite que comprenden una
fase acuosa que contiene el antígeno, una fase de aceite y
emulsionantes que son ésteres de propilenglicol (aceites de ricino
polioxietilenados).
La presente invención se refiere a una vacuna
con adyuvante de aceite cuyas aplicaciones habitualmente se han
limitado debido a sus reacciones locales indeseables, la tendencia
de permanencia y la insuficiente estabilidad de las preparaciones
farmacéuticas, y por lo tanto, pretende resolver los problemas
asociados con dichas vacunas convencionales. Por consiguiente, un
objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna con
adyuvante de aceite que pueda mantener la capacidad de producir
anticuerpos durante un periodo de tiempo sin usar ninguna sustancia
de potenciación de la inmunidad en la formulación, y que no sea
perjudicial para el ser vivo y proporcione estabilidad a las
preparaciones farmacéuticas resultantes.
Los autores de esta invención han llevado a cabo
diferentes estudios para lograr el objetivo anterior. Como
resultado han encontrado que una vacuna con adyuvante de aceite de
tipo agua en aceite que comprende (i) un componente de aceite que
está en estado líquido a temperatura ambiente, (ii) un agente
emulsionante que comprende un tensioactivo no iónico lipófilo
específico y un triglicérido de hidroxi-ácido graso
polioxietilenado, y (iii) una fase acuosa que contiene un cantidad
biológicamente aceptable y eficaz de un componente antígeno; y una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua que
comprende una fase interna constituida por la emulsión de tipo agua
en aceite mencionada (es decir, el adyuvante de aceite mencionado) y
una fase acuosa externa que comprende un agente emulsionante
específico, presentan una excelente seguridad local tras ser
inoculadas y también presentan una excelente capacidad para inducir
una producción de anticuerpos durante un periodo de tiempo largo.
Además, han descubierto que se puede preparar una vacuna con
adyuvante de aceite que muestra una alta estabilidad incluso en una
región de muy baja viscosidad y que tiene una excelente capacidad
de inducir una producción de anticuerpos y una capacidad de mantener
una alta productividad de anticuerpos, mediante un método que
comprende las etapas de añadir a un componente de aceite que está en
estado líquido a temperatura ambiente, un tensioactivo que
comprende un tensioactivo no iónico lipófilo específico y un
triglicérido de hidroxi-ácido graso polioxietilenado, y un material
compuesto de tipo gel obtenido por emulsión de un tensioactivo no
iónico lipófilo específico y una solución acuosa que contiene un
aminoácido o una sal del mismo y un azúcar específico o alcohol de
azúcar; y después añadir a la mezcla resultante, una fase acuosa que
contiene antígenos para formar así una emulsión. Además, han
descubierto que se puede preparar una vacuna con adyuvante de aceite
de tipo agua en aceite en agua que tiene una excelente seguridad y
estabilidad y puede mostrar una excelente capacidad de larga
duración para inducir una producción de anticuerpos comparado con
vacunas convencionales del mismo tipo, por un método que comprende
las etapas de preparar una vacuna con adyuvante de aceite de tipo
agua en aceite por el método mencionado, y después añadir la vacuna
con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite a una fase acuosa
que contiene un agente emulsionante específico para así emulsionar
la misma. Basándose en los descubrimientos anteriores, han
completado la presente invención.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona una vacuna con adyuvante de aceite de
tipo agua en aceite que comprende de 20 a 90% en peso de una fase de
aceite A) que está en un estado líquido a una temperatura en el
intervalo de 15 a 25ºC; de 0,5 a 30% en peso de agente emulsionante
que comprende un tensioactivo no iónico B) que es un éster parcial
derivado de alcohol polihídrico que lleva al menos tres grupos
hidroxilo y ácido graso y que está en un estado líquido a 40ºC y un
triglicérido de hidroxi-ácido graso polioxietilenado (20 a 60
moles) c); de 5 a 75% en peso de una fase acuosa D) que contiene una
cantidad biológicamente aceptable y eficaz de antígenos; y, en peso
de la fase acuosa D), E) de 0,01 a 10% en peso de aminoácido o la
sal del mismo y de 0,01 a 10% en peso de azúcar no reductor o
alcohol de azúcar que tiene al menos 5 grupos hidroxilo en la
molécula.
Preferiblemente, una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1 contiene adicionalmente una fase acuosa externa F)
que comprende de 0,2 a 20% en peso de agente emulsionante que
comprende tensioactivo no iónico y que tiene un valor de HLB global
no menor que 10.
El componente A) de la vacuna con adyuvante de
aceite de acuerdo con la presente invención es un componente de
aceite que está en un estado líquido a temperatura ambiente. La
expresión "temperatura ambiente" usada en esta memoria
significa una temperatura que está dentro del intervalo de 15 a
25°C.
El componente de aceite que está en estado
líquido a temperatura ambiente y que se puede usar en la presente
invención se puede seleccionar según los casos de bases de aceite de
tipo éster o bases de aceite de tipo no éster que se han usado
habitualmente, por ejemplo, en alimentos, fármacos y cosméticos y
que están en estado líquido a temperatura ambiente. Los ejemplos de
bases de aceite de tipo no éster que están en estado líquido a
temperatura ambiente incluyen parafinas líquidas ligeras, escualeno,
escualeno y polibutenos. Además, los ejemplos de bases de aceite de
tipo éster que están en estado líquido a temperatura ambiente
incluyen diferentes ésteres derivados de ácidos grasos saturados de
cadena media tales como ácido caprílico y ácido cáprico o ácidos
grasos insaturados de cadena larga tales como ácido oleico y ácido
linoleico, y alcoholes; ésteres de ácidos grasos naturales, por
ejemplo, aceites vegetales líquidos tales como aceite de cacahuete,
aceite de oliva, aceite de semilla de girasol, aceite de cartamo y
aceite de jojoba y aceites líquidos procedentes de animales tales
como aceite de reloj anaranjado, que se pueden usar solos o
combinados dependiendo de los propósitos. Los aceites tales como
los derivados de éster de ácido oleico y aceites vegetales, entre
otros, tienen diferentes ventajas tal como que tienen una
estabilidad relativamente alta frente a la oxidación, tienen alta
afinidad por los tejidos de órganos y se puede reducir su
estimulación local y tendencia de permanencia, y por lo tanto, se
prefiere usar al menos un miembro seleccionado sólo de estos aceites
metabolizables como componente de aceite. Además, se prefiere en
particular usar una base de aceite de tipo éster que comprende un
derivado de éster de un ácido graso, que comprende no menos de 85%
en peso de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico y no
menos de 90% en peso de ácidos
cis-\Delta9-alquenoico, y un
alcohol tal como glicerol, diglicerol, propilenglicol, alcohol de
etilo, alcohol de decilo y alcohol de oleilo que comprenden no menos
de 85% en peso de
cis-\Delta9-octadecenol y no menos
de 90% en peso de
cis-\Delta9-alquenoles.
Alternativamente, en la presente invención también se puede usar
una mezcla del o los aceites de tipo éster anteriores con
escualeno.
El componente B) usado como uno de los agentes
emulsionantes que constituye la vacuna con adyuvante de aceite de
la presente invención es un tensioactivo no iónico lipófilo que es
un éster parcial derivado de un alcohol polihídrico que porta al
menos tres grupos hidroxilo y un ácido graso, y el cual está en
estado líquido a 40°C. El éster parcial precedente varía
dependiendo de las clases de alcoholes polihídricos usados. Por
ejemplo, si el alcohol polihídrico es glicerol que porta tres
grupos hidroxilo, el éster parcial es una mezcla que comprende
principalmente monoésteres, diésteres y una pequeña cantidad de
triésteres del mismo; si el alcohol polihídrico es diglicerol o
sorbitán que portan 4 grupos hidroxilo, el éster parcial es una
mezcla que comprende principalmente monoésteres, diésteres y
pequeñas cantidades de triésteres y tetraésteres de los mismos.
Estos ésteres parciales se pueden usar solos o en cualquier
combinación, siempre que estén en estado líquido a una temperatura
de 40ºC y sean lipófilos.
Los ejemplos de dichos alcoholes polihídricos
que portan al menos tres grupos hidroxilo, que se usan como
ingrediente para preparar el éster parcial, incluyen glicerol,
diglicerol, triglicerol, tetraglicerol, hexaglicerol, octaglicerol,
decaglicerol, xilitol, sorbitol, manitol y sorbitán.
Los ejemplos de ácidos grasos usados para
preparar los ésteres parciales son una variedad de ácidos grasos
conocidos tales como ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico,
ácido oleico y ácido linoleico, siempre que puedan reaccionar con
los alcoholes polihídricos anteriores para formar los ésteres
parciales precedentes que están en estado líquido a 40ºC. Entre
estos ácidos grasos, se prefiere en particular el ácido graso que
comprende no menos de 85% en peso de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico y no
menos de 90% en peso de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos.
Los ésteres parciales particularmente adecuados
usados como el componente B) son, por ejemplo, monooleato de
glicerol, monooleato de sorbitán, dioleato de sorbitán, monooleato
de diglicerol y dioleato de diglicerol, que derivan del ácido graso
que comprende no menos de 85% en peso de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico y no
menos de 90% en peso de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos. Puesto
que estos ésteres parciales contienen ácido oleico altamente
purificado que se incorpora en los mismos como un grupo acilo,
tienen una excelente estabilidad frente a la oxidación, que es
necesaria cuando se usan como agentes emulsionantes, pueden asegurar
un alto grado de orientación entre estas moléculas de tensioactivo
y por consiguiente tienen excelentes características funcionales
tales como acción estabilizante de la emulsión. Por lo tanto, estos
ésteres parciales permiten la mejora de la estabilidad de las
vacunas con adyuvante de aceite finalmente preparadas, y la mejora
sustancial de la seguridad cuando se inoculan, comparados con los
derivados de ácido oleico convencionales que se encuentran
actualmente en el mercado.
En el triglicérido de hidroxi-ácido graso
polioxietilenado (20 a 60 moles) usado en la vacuna con adyuvante
de aceite de la presente invención como el componente C), son
ejemplos de triglicéridos de hidroxi-ácido graso el aceite de
ricino y aceite de ricino hidrogenado. En este sentido, si el número
medio de óxidos de etileno es menor que 20, el uso de dicho
componente C) no permite la formación de una emulsión estable en una
región de baja viscosidad, y como resultado su uso no permitirá
nunca la preparación de una vacuna con adyuvante de aceite
satisfactoria. Por otra parte, si el número medio de óxidos de
etileno es mayor que 60 moles, la emulsión resultante tiene
tendencia a producir fácilmente la inversión de fase de la emulsión
y por lo tanto su uso nunca permitirá la preparación final de una
vacuna con adyuvante de aceite satisfactoria. La cantidad de
triglicérido de hidroxi-ácido graso polioxietilenado que se va a
incorporar en la vacuna preferiblemente está en el intervalo de 0,5
a 10% en peso, basado en el peso total de la formulación (el peso
total de la vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite).
Si es menor que 0,5% en peso, se puede reducir la estabilidad de la
vacuna emulsionada resultante. Por otra parte, si es mayor que 10%
en peso, la emulsión resultante produce fácilmente una inversión de
fase y por consiguiente se puede reducir la estabilidad de la
vacuna resultante.
En lo sucesivo se denomina "componente E)"
un aminoácido o una sal del mismo y un azúcar no reductor o un
alcohol de azúcar que tiene al menos 5 grupos hidroxilo en la
molécula, usado en la presente invención. La estabilidad de la
vacuna emulsionada de la presente invención se puede mejorar más
incorporando el componente E) en la vacuna con adyuvante de aceite,
es decir, un aminoácido o una sal del mismo y un azúcar no reductor
o un alcohol de azúcar que tiene al menos 5 grupos hidroxilo en la
molécula. El aminoácido o la sal del mismo usados en esta memoria
se pueden seleccionar de los usados habitualmente en los alimentos o
productos farmacéuticos especificados en diferentes fuentes
habituales tales como "Japanese Pharmacopoeia", "Standards
for Ingredients of Drugs not in the Japanese Pharmacopoeia" y
"Japanese Pharmaceutical Excipients". Son ejemplos de
aminoácidos la glicina, alanina, hidrocloruro de arginina,
asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, histidina,
leucina, isoleucina, prolina, hidroxiprolina, serina, treonina,
valina y fenilalanina, prefiriéndose entre ellos los aminoácidos
neutros. Además, son ejemplos de sales de aminoácidos las sales de
metales monovalentes tales como sales de sodio y potasio; y sales
de metales divalentes tales como sales de calcio y magnesio. Entre
estos aminoácidos y las sales de los mismos, se prefieren en
particular el monohidrato de aspartato sódico, dihidrato de
aspartato potásico, monohidrato de glutamato sódico y monohidrato de
glutamato potásico. Estos aminoácidos en general están en la forma
L, pero se pueden usar igualmente en la presente invención isómeros
de los mismos tales como la forma D o las formas DL que son mezclas
de estos isómeros.
El azúcar no reductor o el alcohol de azúcar
precedente que tienen al menos 5 grupos hidroxilo en la molécula
usados en esta memoria se pueden seleccionar de los usados
habitualmente en los alimentos o productos farmacéuticos
especificados en diferentes fuentes habituales tales como
"Japanese Pharmacopoeia", "Standards for Ingredients of
Drugs not in the Japanese Pharmacopoeia" y "Japanese
Pharmaceutical Excipients", usándose en particular
preferiblemente en la invención la trehalosa, xilitol, sorbitol,
manitol y lactitol.
Las cantidades del aminoácido o sal del mismo y
del azúcar no reductor o alcohol de azúcar que tienen al menos 5
grupos hidroxilo en la molécula usados en esta memoria, está de
forma adecuada en el intervalo de 0,01 a 10% en peso basado en el
peso total de la formulación (el peso total de la vacuna con
adyuvante de aceite), respectivamente.
En la vacuna con adyuvante de aceite, la
relación del componente de aceite A) al componente D), es decir, la
fase acuosa que contiene antígenos, se pueden seleccionar de forma
adecuada dependiendo de las aplicaciones, propósitos del adyuvante
o de la clase de antígeno seleccionado. En particular, la vacuna con
adyuvante de aceite de la presente invención mantiene su alta
estabilidad debido al uso de una combinación de un componente de
aceite específico y un agente emulsionante específico y por
consiguiente, la relación del componente de aceite a la fase acuosa
que contiene un antígeno puede variar en un amplio intervalo. En
general, la relación se puede seleccionar de forma adecuada de
forma que la relación en peso del componente de aceite a la fase
acuosa esté en el intervalo de 90:5 a 20:75, preferiblemente de
80:15 a 30:65.
En la preparación del adyuvante, la cantidad
total del componente B) precedente, es decir, el tensioactivo no
iónico y el componente C), es decir, el triglicérido de
hidroxi-ácido graso polioxietilenado (20 a 60 moles) está
convenientemente en el intervalo de 0,5 a 30% en peso,
preferiblemente de 3 a 20% en peso basándose en el peso total de la
formulación. Esto se debe a que si es menor que 0,5% en peso, no se
puede preparar cualquier sistema emulsionado estable, mientras que
el uso del agente emulsionante en una cantidad mayor que 30% en
peso da como resultado la formación de un adyuvante que presenta una
alta reactividad en el sitio local inyectado y no puede
proporcionar cualquier vacuna con adyuvante de aceite deseada de la
presente invención que tenga alta estabilidad.
Una primera realización de la vacuna con
adyuvante de aceite de acuerdo con la presente invención se refiere
a una vacuna con adyuvante de aceite que comprende el componente de
aceite anterior, agente emulsionante y fase acuosa que contiene un
antígeno, y la vacuna con adyuvante de aceite se puede preparar, por
ejemplo, por el siguiente método. El método comprende añadir a un
componente de aceite como el componente A), un tensioactivo no
iónico [componente B)] que está en estado líquido a 40ºC y un
triglicérido de hidroxi-ácido graso polioxietilenado (20 a 60
moles) [componente C)], seguido de la mezcla de estos ingredientes
con agitación, y después añadir una fase acuosa [componente D)] que
contiene una cantidad biológicamente aceptable y eficaz de
antígenos, y mezclarlos con agitación para dar una emulsión. Este
método permite preparar una vacuna con adyuvante de aceite de tipo
agua en aceite que está en un buen estado emulsionado.
En la presente invención, se puede preparar una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que tiene una
viscosidad baja y tiene alta estabilidad incluso cuando se almacena
a baja temperatura, sin afectar a su seguridad, por un método que
comprende las etapas de añadir, a una fase de aceite A) que está en
un estado líquido a temperatura ambiente, un tensioactivo no iónico
B) que es un éster parcial derivado de un alcohol polihídrico que
porta al menos tres grupos hidroxilo y un ácido graso y que está en
estado líquido a 40ºC, un triglicérido de hidroxi-ácido graso
polioxietilenado (20 a 60 moles) C), y un producto que se obtiene
mezclando el tensioactivo no iónico como componente B) y una
solución acuosa que contiene el componente E), en una relación en
peso del tensioactivo no iónico como componente B) a la solución
acuosa del componente E) en el intervalo de 1:1 a 1:20, y después
emulsionar la mezcla hasta que se forma un material compuesto de
tipo gel firme; después mezclar estos ingredientes para formar así
una dispersión; añadir una fase acuosa D) que contienen una
cantidad biológicamente aceptable y eficaz de antígenos a la
dispersión resultante; y mezclarlos con agitación para así
emulsionar la fase acuosa. Si la temperatura de los ingredientes
aumenta debido a la acción de una máquina agitadora en la etapa
precedente para preparar el material compuesto de tipo gel firme que
comprende el componente B), es decir, un tensioactivo no iónico que
es un éster parcial derivado de un alcohol polihídrico que porta al
menos tres grupos hidroxilo y un ácido graso y que está en un estado
líquido a 40ºC y la solución acuosa que contiene el componente E,
la operación de agitación se puede llevar a cabo mientras se enfrían
los ingredientes para mantener la temperatura a un nivel no mayor
que la temperatura
ambiente.
ambiente.
En este sentido, la relación de mezcla óptima
del componente B) a la solución acuosa del componente E) se puede
seleccionar adecuadamente dependiendo de las clases y
concentraciones del aminoácido o sal del mismo y del azúcar no
reductor o alcohol de azúcar presentes en la solución acuosa del
componente E). Si la solución acuosa del componente E) es, por
ejemplo, una solución acuosa que contiene 5% en peso de monohidrato
de L-glutamato sódico y 5% en peso de lactitol, la
relación en peso del componente B) a la solución acuosa del
componente E) se ajusta de forma adecuada al intervalo de 1:2 a
1:10. Además, si la solución acuosa comprende 30% en peso de
monohidrato de L-glutamato sódico y 20% en peso de
lactitol, la relación en peso del componente B) a la solución
acuosa del componente E) se ajusta de forma adecuada al intervalo de
1:2 a 1:15. En este sentido, es conveniente que la concentración
del componente E) en la solución acuosa se ajuste a un nivel tan
alto como sea posible dentro del intervalo de solubilidad del
aminoácido o la sal del mismo y el azúcar no reductor o alcohol de
azúcar, respectivamente.
Una realización adicional de la vacuna con
adyuvante de aceite de acuerdo con la presente invención se refiere
a una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
que comprende una fase interna que comprende la vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite anterior; y una fase
acuosa exterior que comprende al menos un tensioactivo no iónico
que tiene un valor de HLB global (equilibrio
hidrófilo-lipófilo) no menor que 10.
En esta memoria descriptiva, el valor de
"HLB" (equilibrio hidrófilo-lipófilo) se
determina de acuerdo con la ecuación propuesta por W.C. Griffin
(véase W.C. Griffin, J. Soc. Cosmetic Chemists, 1949, 1, p.
311).
El agente emulsionante que tiene un valor de HLB
global no menor que 10 y usado en la fase exterior que constituye
la vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua de
la presente invención, puede estar solo o en cualquiera de sus
combinaciones con la condición de que tenga un valor de HLB global
no menor que 10. El tensioactivo no iónico que tiene un valor de
HLB global no menor que 10 se puede seleccionar de los usados
normalmente en el campo de los productos farmacéuticos, por ejemplo,
triglicéridos de hidroxi-ácido graso polioxietilenado, ésteres de
ácido graso y sorbitán polioxietilenados, éteres de
polioxietilen-alquil(alquenilo),
polioxietilen-polioxipropilenglicol, los cuales
tienen un valor de HLB global no menor que 10.
Entres estos, los triglicéridos de hidroxi-ácido
graso polioxietilenado que tienen un valor de HLB no menor que 10
pueden ser los mismos que los usados como ingredientes de la vacuna
con adyuvante de aceite, es decir, triglicéridos de hidroxi-ácido
graso polioxietilenado tales como aceite de ricino y/o aceite de
ricino hidrogenado, que tienen un número medio de óxidos de etileno
no menor que 20, preferiblemente de 20 a 60. Esto se debe a que el
uso de triglicéridos de hidroxi-ácido graso polioxietilenado que
tienen un número medio de óxidos de etileno menor que 20 no
permiten la dispersión estable del adyuvante de aceite de tipo agua
en aceite que sirve como fase interna dentro de la fase externa, y
por consiguiente no permite la formación de una buena vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua. Por otra parte,
si es mayor que 60, la fase de emulsión de agua en aceite interna
resultante tiene tendencia a producir fácilmente la inversión de
fase y por lo tanto su uso nunca permitirá la preparación final de
una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
satisfactoria.
Además, los ésteres de ácido graso y sorbitán
polioxietilenados que tienen un valor de HLB no menor que 10 pueden
ser, por ejemplo, ésteres de ácido graso insaturado (tal como ácido
oleico) y sorbitán polioxietilenados y ésteres de ácido graso
saturado (tal como ácido láurico y ácido caprílico) y sorbitán
polioxietilenados, que tienen un número medio de óxidos de etileno
no menor que 10. En particular, se usan preferiblemente los ésteres
de ácido graso y sorbitán polioxietilenados en los que el ácido
graso comprende no menos de 85% en peso ácido
cis-\Delta9-octadecenoico y no
menos de 90% en peso de ácidos
cis-\Delta9-alquenoico y tienen
un número medio de óxidos de etileno en el intervalo de 10 a 40.
Esto se debe a que si el número medio de óxidos de etileno es menor
que 10, el adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que sirve de
fase interna no se puede dispersar de forma estable en la fase
acuosa exterior, y por consiguiente su uso nunca permitirá la
preparación de una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en
aceite en agua satisfactoria. Por otra parte, si es mayor que 40,
el adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que sirve como fase
interna tiene tendencia a producir fácilmente la inversión de fase
de la emulsión y por lo tanto su uso nunca permitirá la preparación
final de una vacuna con un adyuvante de aceite de tipo agua en
aceite en agua satisfactoria.
Los éteres de
polioxietilen-alquilo(alquenilo) pueden ser,
por ejemplo, tensioactivos de tipo éteres de alquilo habitualmente
conocidos tales como éteres de
polioxieitlen-alquilo, por ejemplo, éter de
polioxietilen-laurilo y éter de
polioxietilen-cetilo; y éteres de
polioxietilen-alquenilo, por ejemplo, éter de
polioxietilen-oleilo. Se prefieren los que llevan
un grupo alquilo(alquenilo) que tiene de 12 a 18 átomos de
carbono y que tiene un número medio de óxidos de etileno no menor
que 10 y preferiblemente de 10 a 40. En particular, los éteres de
polioxietilen-oleilo en los que los alcoholes oleilo
comprenden no menos de 85% en peso de
cis-\Delta9-octadecenol y no
menos de 90% en peso de
cis-\Delta9-alcanoles y de 10 a 40
moles de óxido de etileno. En este sentido, si el número de átomos
de carbono en el grupo alquilo(alquenilo) es menor que 12, el
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que sirve de fase
interna tiene tendencia a producir fácilmente la inversión de fase
de la emulsión y por lo tanto su uso nunca permitirá la preparación
final de una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite
en agua satisfactoria, mientras que si es mayor que 18, el adyuvante
de aceite de tipo agua en aceite que sirve de fase interna no se
puede dispersar de forma estable en la fase acuosa externa y por
consiguiente su uso nunca permitirá la preparación final de una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
satisfactoria. Además, el uso de un éter de
polioxietilen-alquilo(alquenilo) que tiene
un número medio de óxidos de etileno menor que 10 no permite la
dispersión estable del adyuvante de aceite de tipo agua en aceite
que sirve de fase interna en la fase externa, y por consiguiente no
permite la formación de una buena vacuna con adyuvante de aceite de
tipo agua en aceite en agua. Por otra parte, si es mayor que 40, el
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que sirve como fase
interna tiene tendencia a producir fácilmente la inversión de fase
de la emulsión y por lo tanto su uso nunca permitirá la preparación
final de una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite
en agua satisfactoria.
El
polioxietilen-polioxipropilenglicol que se puede
usar en esta memoria se puede seleccionar de los usados
habitualmente en los productos farmacéuticos y cosméticos que tienen
un valor de HLB no menor que 10. Entre esos, los preferidos son los
que tienen un número de óxidos de etileno (grado medio de
polimerización) en el intervalo de 50 a 200, un número medio de
óxidos de propileno (grado medio de polimerización) en el intervalo
de 5 a 80 y la relación del número molar (grado medio de
polimerización) de óxidos de etileno al de óxidos de propileno no
es menor que 2:1. Esto se debe a que si la relación molar es menor
que 2:1, el adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que sirve de
fase interna no se puede dispersar de forma estable en la fase
acuosa externa y por consiguiente su uso nunca permitirá la
preparación final de una vacuna con adyuvante de aceite de tipo
agua en aceite en agua satisfactoria.
\newpage
Como se ha explicado antes, el agente
emulsionante usado en la fase externa que constituye la vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua de la presente
invención puede ser uno que tenga un valor de HLB menor que 10 o
una mezcla de dos o más agentes emulsionantes en la que al menos uno
de los agentes es un tensioactivo no iónico que tiene un valor de
HLB alto y al menos uno de los agentes es un tensioactivo no iónico
que tiene un valor de HLB bajo y en la que el valor de HLB global
no es menor que 10. En este sentido, los tensioactivos no iónicos
que tienen un valor de HLB bajo que se pueden usar en esta memoria
se pueden seleccionar de los usados habitualmente en el campo
farmacéutico y similar, tales como monooleato de sorbitán,
sesquioleato de sorbitán y monooleato de glicerol. Un ejemplo de la
mezcla de tensioactivos no iónicos que tienen un valor de HLB alto
y tensioactivos no iónicos que tienen un valor de HLB bajo, incluyen
los que comprenden monooleato de sorbitán polioxietilenado que
tiene un valor de HLB de 15,0 y sesquioleato de sorbitán que tiene
un valor de HLB de 3,7. En este caso, el primero se mezcla con el
último en una relación en peso de 2:1 para dar una mezcla de
agentes emulsionantes que tienen un valor de HLB global de
aproximadamente 11,2.
En la presente invención, la estabilidad de las
vacunas con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
pretendidas se pueden mejorar más si se usa como agente emulsionante
incorporado en la fase externa, una combinación de la mezcla
anterior de agentes emulsionantes que tiene un valor de HLB global
no menor que 10 con un glicerofosfolípido.
Los glicerofosfolípidos usados combinados con la
mezcla de agentes emulsionantes que tiene un valor de HLB global no
menor que 10, que se pueden usar en esta memoria se pueden
seleccionar según los casos de glicerofosfolípidos naturales tales
como los derivados de soja (p. ej., lecitina de soja y lecitina de
soja hidrogenada), los derivados de yema de huevo (p. ej.,
fosfolípido de yema de huevo y fosfolípido de yema de huevo
hidrogenada); diferentes fosfolípidos muy purificados (p. ej.,
fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina); y lisofosfolípidos, que
se pueden usar solos o combinados. Cuando se usa la mezcla anterior
de agentes emulsionantes que tiene un valor de HLB global no menor
que 10 y un glicerofosfolípido, la relación de mezcla (en peso): de
mezcla de tensioactivos no iónicos/glicerofosfolípido es ajusta de
forma adecuada en el intervalo de 20:1 a 1:2.
La cantidad de agente emulsionante usada en la
fase externa que constituye la vacuna con adyuvante de aceite de
tipo agua en aceite en agua de la presente invención está en el
intervalo de 0,2 a 20% en peso y en particular preferiblemente de
0,5 a 10% en peso basándose en el peso total de la fase externa.
Estos se debe a que si la cantidad de agente emulsionante es menor
que 0,2% en peso, no se puede obtener cualquier emulsión de tipo
agua en aceite en agua estable, mientras que si supera el 20% en
peso, la viscosidad de la vacuna con adyuvante de aceite resultante
aumenta a un nivel tal que la vacuna no sería buena para su
inoculación y seguridad en el caso de inyección, ya que su
seguridad a veces disminuye.
Además, la relación de mezcla de la fase de
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que sirve como fase
interna a la fase acuosa externa en la vacuna con adyuvante de
aceite de tipo agua en aceite en agua de acuerdo con la presente
invención se puede ajustar de forma adecuada, dependiendo de los
propósitos, de forma que esté dentro del intervalo de 2:1 a 1:10,
expresado en términos de relación en peso.
En la vacuna con adyuvante de aceite de tipo
agua en aceite en agua preparada así, los antígenos se pueden
incorporar de forma eficaz en la fase acuosa interna por el
siguiente método en dos etapas, en el que se prepara una vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite primero, usando una fase
acuosa que contiene el antígeno, y después añadiendo la emulsión de
agua en aceite resultante como fase interna a una fase acuosa
externa que comprende un agente emulsionante específico para formar
así una emulsión.
La vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua
en aceite en agua de acuerdo con la presente invención se puede
preparar, por ejemplo, por el siguiente método. El método comprende
las etapas de preparar primero una vacuna con adyuvante de aceite
de tipo agua en aceite que contiene antígeno de acuerdo con la
presente invención, y después añadir la vacuna con adyuvante de
aceite de tipo agua en aceite a una fase acuosa que comprende un
agente emulsionante mezclado que contiene al menos un tensioactivo
no iónico y que tiene un valor de HLB global no menor que 10 o una
combinación de un agente emulsionante mezclado que contiene al menos
un tensioactivo no iónico y que tiene un valor de HLB global no
menor que 10 con un glicerofosfolípido para así emulsionar otra vez
la vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que
contiene antígeno. En la presente invención, el método de emulsión
en dos etapas permite la formación de una vacuna con adyuvante de
aceite de tipo agua en aceite en agua muy estable que tiene una
excelente seguridad.
Más específicamente, se puede preparar una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua que
tenga una estabilidad más alta sin afectar a su seguridad, mediante
la adición primero a un componente de aceite que está en estado
líquido a temperatura ambiente, un tensioactivo no iónico lipófilo
(componente B) que es un éster parcial derivado de un alcohol
polihídrico que porta al menos tres grupos hidroxilo y un ácido
graso que está en estado líquido a 40ºC, un triglicérido de
hidroxi-ácido graso polioxietilenado (20 a 60 moles) (componente
C), y un producto obtenido mezclando el tensioactivo no iónico como
componente B y una solución acuosa que contiene un componente E, en
una relación en peso del primero respecto al último en el intervalo
de 1:1 a 1:20, y después agitar estos ingredientes hasta que se
forma un material compuesto de tipo gel firme; después mezclarlos y
dispersarlos; después añadir una fase acuosa externa (componente D)
que contienen una cantidad biológicamente aceptable y eficaz de
antígenos a la dispersión resultante, después mezclarlos con
agitación para emulsionar la fase acuosa en la fase de aceite y así
dar una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite muy
estable; y después añadir la vacuna con adyuvante de aceite de tipo
agua en aceite a una fase acuosa externa que comprende un agente
emulsionante mixto que contiene al menos un tensioactivo no iónico
y que tiene un valor de HLB global no menor que 10 o una combinación
de un agente emulsionante mixto que contiene al menos un
tensioactivo no iónico y que tiene un valor de HLB global no menor
que 10 con un glicerofosfolípido para así volver a emulsionar la
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite que contiene
antígeno en la fase acuosa.
La fase acuosa de la vacuna con adyuvante de
aceite de tipo agua en aceite de la presente invención, la fase
acuosa interna de la vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en
aceite en agua de la presente invención, o la fase acuosa externa
de la vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
de la presente invención se pueden seleccionar de las usadas en
vacunas convencionales tales como soluciones de tampón de fosfato,
solución salina fisiológica o solución salina tamponada con
fosfato.
En la vacuna con adyuvante de aceite de tipo
agua en aceite en agua de la presente invención, dependiendo por
ejemplo de las condiciones de preparación, el antígeno puede estar
presente sólo en la fase acuosa interna dentro de la emulsión de
tipo agua en aceite que sirve de fase interna, o en ambas fases
acuosas, es decir, la fase acuosa interna y la fase acuosa externa
debido a su escape parcial de la fase acuosa interna, pero en
cualquier caso, no se afectaría en absoluto el efecto de la vacuna
con adyuvante de aceite de la presente invención.
En la presente invención, la fase de aceite y la
fase acuosa interna que constituyen el adyuvante de aceite, la fase
acuosa externa que constituye la vacuna con adyuvante de aceite de
tipo agua en aceite en agua o similares pueden comprender, por
supuesto, diferentes componentes que no están directamente
implicados en la actividad adyuvante, tal como un tampón, un
estabilizante y/o un componente regulador de la presión osmótica,
que se usan en diferentes productos farmacéuticos.
Además, se puede usar cualquier medio que en
general permita la emulsión, por ejemplo, emulsionantes usados
actualmente tales como un mezclador, un homogeneizador y CLEARMIX
(disponible en M TECHNIQUE Co., Ltd.) y una
membrana-emulsionador que usa una membrana de vidrio
porosa, cuando prepara la vacuna con adyuvante de aceite de la
presente invención.
Los antígenos que se van a incorporar en la fase
acuosa que constituye la vacuna con adyuvante de aceite de acuerdo
con la presente invención, pueden incluir diferentes clases y
diferentes formas de antígenos, por ejemplo, células bacterianas
muertas y partículas víricas inactivadas usadas habitualmente en la
preparación de vacunas, así como antígenos protectores tales como
proteínas de unión y envueltas. Sin embargo, se puede usar una gran
variedad de antígenos previstos en una cantidad biológicamente
aceptable y eficaz puesto que la vacuna con adyuvante de aceite de
la presente invención que es muy estable, se puede obtener
fácilmente usando una combinación de un componente de aceite
específico y un agente emulsionante específico.
Además, la vacuna con adyuvante de aceite de la
presente invención puede comprender en la emulsión, por supuesto,
diferentes fármacos tales como antibióticos en lugar del
antígeno.
Como se ha discutido antes con detalle, la
presente invención permite la preparación de diferentes clases de
composiciones farmacéuticas inyectables tales como vacunas con
adyuvante de aceite, seleccionado según el caso los componentes que
se van a incorporar en las composiciones. Por ejemplo, las vacunas
para uso veterinario pueden inducir la potenciación inmunitaria por
administración de las mismas por inyección subcutánea o inyección
intramuscular y por administración de las mismas por vía oral,
rectal y nasal, pero las vías de administración se pueden
seleccionar de forma adecuada dependiendo de cada propósito en
particular.
Cuando se prepara el adyuvante, se deben
esterilizar los constituyentes tales como la base de aceite, los
tensioactivos y la fase acuosa que se van a usar. El método de
esterilización se puede seleccionar teniendo en cuenta las
propiedades características de estos compuestos.
Como se ha explicado antes, la vacuna con
adyuvante de aceite preparada por la presente invención está en una
emulsión de alta calidad y bastante estable. Por lo tanto, la vacuna
tiene una estabilidad y seguridad excelentes y se puede administrar
a una variedad de organismos asegurándose tanto de la eficacia como
de la seguridad.
En lo sucesivo la presente invención se
describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos,
pero la presente invención no está limitada por los estos Ejemplos
específicos. En los siguientes Ejemplos, el término "parte"
significa "parte en peso" salvo que se especifique lo
contrario.
Las vacunas con adyuvante de aceite usadas en
los siguientes Ejemplos se prepararon cada una por el siguiente
método. Se esterilizaron todos los componentes incluidos en las
formulaciones por calentamiento o filtración, que se seleccionó
teniendo en cuenta las propiedades características de cada
componente particular. Además, todas las operaciones tales como la
agitación y emulsión se llevaron a cabo en un taller limpio en
condiciones de esterilización.
Ejemplo
Comparativo
En este Ejemplo se usó oleato de etilo
["NOFABLE® EO-90", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente A. A 12 partes del componente de aceite se
añadieron 1,6 partes de sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE®
SO-992", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 99%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en
peso] y 0,4 partes de aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado
(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente agitación, y adición
gradual de 6 partes de una fase acuosa (solución salina tamponada
con fosfato) que contiene un antígeno, a la mezcla anterior con
agitación, y después mezcla y emulsión a temperatura ambiente y 800
rpm durante 10 minutos usando un CLEARMIX CLM-0,8S
(disponible en M TECHNIQUE Co., Ltd.) para dar así una vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite a.
Ejemplo
Comparativo
En este Ejemplo el componente A comprendía una
mezcla de 6 partes de aceite de semilla de girasol purificado y 6
partes de escualeno. Al componente de aceite se añadieron 1,6 partes
de sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE®
SO-902", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 0,4 partes de aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado
(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente agitación, y adición
gradual de 8 partes de una fase acuosa (solución salina tamponada
con fosfato) que contenía un antígeno, a la mezcla anterior con
agitación y después mezcla y emulsión de la mezcla resultante por
los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 1 para dar así una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite b.
Ejemplo
Comparativo
En este Ejemplo se usó oleato de etilo
["NOFABLE® OO-9080", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente A. A 12 partes del componente de aceite se
añadieron 0,8 partes de sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE®
SO-902", disponible en NOF CORPORATION,
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso]y 0,7 partes de monooleato de glicerol ["NOFABLE®
GO-901", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 0,5 partes de aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado
(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente agitación, y adición
gradual de 8 partes de una fase acuosa (solución salina tamponada
con fosfato) que contiene un antígeno, a la mezcla precedente con
agitación, y después mezcla y emulsión de la mezcla resultante por
los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 1 para dar así una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite c.
En este Ejemplo se usaron 5 partes de monooleato
de glicerol ["NOFABLE® GO-901", disponible en
NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente B y una solución acuosa obtenida disolviendo 3
partes de monohidrato de L-glutamato sódico y una
parte de manitol en 6 partes de agua destilada como componente E.
El componente B y la solución acuosa del componente E se mezclaron y
emulsionaron a temperatura ambiente y 10.000 rpm durante 10 minutos
usando un CLEARMIX® CLM-0,8S (disponible en M
TECHNIQUE Co., Ltd.) para dar un producto de tipo gel
Después, a una mezcla de 6 partes de oleato de
oleilo ["NOFABLE® OO-9080", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 6 partes de escualeno como componente A, se añadieron 1,6
partes de sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE®
SO-902", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en
peso] como componente B y 0,4 partes de aceite de ricino hidrogenado
polioxietilenado(40) calentado a 50ºC como componente C,
seguido de suficiente agitación, adición de una parte del producto
de tipo gel precedente a la mezcla resultante para así dispersar el
primero en la fase de aceite, adición gradual de 8 partes de una
fase acuosa que comprende solución salina tamponada con fosfato que
contiene un antígeno, a la mezcla anterior con agitación, y después
mezcla y emulsión a temperatura ambiente y 8000 rpm durante 10
minutos usando un CLEARMIX® CLM-0,8S (disponible en
M TECHNIQUE Co., Ltd.) para dar así una vacuna con adyuvante de
aceite de tipo agua en aceite X1.
En este Ejemplo se usaron 6 partes de monooleato
de diglicerol ["NOFABLE® PGO-9021L", disponible
en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente B y una solución acuosa obtenida disolviendo 4
partes de monohidrato de L-glutamato sódico y una
parte de lactitol en 7 partes de agua destilada como componente E.
El componente B y la solución acuosa del componente E se mezclaron y
emulsionaron por los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 4,
para dar un producto de tipo gel.
Después, a una mezcla de 6 partes aceite de
semilla de girasol purificado y 6 partes de oleato de etilo
["NOFABLE® EO-90", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente de aceite, se añadieron 1,6 partes de
sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE® OP-83RAT",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico de
55% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso] y 0,4 partes de aceite de ricino hidrogenado
polioxietilenado(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente
agitación, adición de una parte del producto de tipo gel precedente
a la mezcla resultante para así dispersar el primero en la fase de
aceite, adición gradual de 8 partes de una fase acuosa que comprende
solución salina tamponada con fosfato que contiene un antígeno, a
la mezcla anterior con agitación, y después mezcla y emulsión por
los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 4, para dar así una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite X2.
En este Ejemplo se usaron 4 partes de monooleato
de glicerol ["NOFABLE® GO-991P", disponible en
NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 99%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en
peso] y 4 partes de dioleato de glicerol ["NOFABLE®
GO-902P", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente B y una solución acuosa obtenida disolviendo
4 partes de monohidrato de L-aspartato sódico y una
parte de trehalosa en 11 partes de agua destilada como componente
E. El componente B y el componente E se mezclaron y emulsionaron por
los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 4, para dar un
producto de tipo gel.
Después, a una mezcla de 8 partes de oleato de
decilo ["NOFABLE® DO-99", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 99%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en
peso] y 4 partes de escualeno como componente de aceite, se
añadieron 0,8 partes de sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE®
SO-992", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 99%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en
peso], 1,2 partes de monooleato de glicerol ["NOFABLE®
GO-991", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 99%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en
peso] y 0,4 partes de aceite de ricino hidrogenado
polioxietilenado(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente
agitación, adición de una parte del producto de tipo gel precedente
a la mezcla resultante para así dispersar el primero en la fase de
aceite, adición gradual de 10 partes de una fase acuosa que
comprende solución salina tamponada con fosfato que contiene un
antígeno, a la mezcla anterior con agitación, y después mezcla y
emulsión por los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 4, para
dar así una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite
X3.
Ejemplo
Comparativo
En este Ejemplo se usó oleato de etilo
["NOFABLE® EO-99", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 99%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en
peso] como componente A. A 12 partes del componente de aceite se
añadieron 1,7 partes de sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE®
SO-902", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 0,3 partes de aceite de ricino hidrogenado
polioxietilenado(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente
agitación, adición gradual de 8 partes de una fase acuosa (solución
salina tamponada con fosfato) que contenía un antígeno, a la mezcla
precedente con agitación, y después mezcla y emulsión por los
mismos procedimientos usados en el Ejemplo 1 para dar así una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite.
Después se añadieron 0,4 partes de
polioxietilen(160)-polioxipropilen(30)-glicol
(que tiene un valor de HLB de 16,0) como tensioactivo y se
disolvieron uniformemente en 10 partes de solución salina tamponada
con fosfato, seguido de la adición gradual de 10 partes del
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite anterior a la dispersión
con agitación y después mezcla y emulsión a temperatura ambiente y
8.000 rpm durante 5 minutos usando un CLEARMIX®
CLM-0,8S (disponible en M TECHNIQUE Co., Ltd.) para
dar así una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite
en agua d.
Ejemplo
Comparativo
En este Ejemplo se usó una mezcla de 6 partes de
aceite de jojoba purificado y 6 partes de escualeno como componente
A. A este componente de aceite se le añadieron 1,6 partes de
sesquioleato de sorbitán ["NONION® OP-83RAT",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico
de 55% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso] y 0,4 partes de aceite de ricino hidrogenado
polioxietilenado(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente
agitación, adición gradual de 8 partes de una fase acuosa (solución
salina tamponada con fosfato) que contenía un antígeno, a la mezcla
precedente con agitación, y después mezcla y emulsión por los
mismos procedimientos usados en el Ejemplo 1 para dar así una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite.
Después se añadieron 0,2 partes de monooleato de
sorbitán polioxietilenado(20) ["NONION
OT-221", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 55%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso; HLB: 15,8] como tensioactivo, y se disolvieron uniformemente
en 10 partes de solución salina tamponada con fosfato, seguido de la
adición gradual de 10 partes del adyuvante de aceite de tipo agua
en aceite anterior a la dispersión con agitación y después mezcla y
emulsión por el mismo método usado en el Ejemplo 7, para dar así
una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
e.
Ejemplo
Comparativo
En este Ejemplo se usó como el componente A, una
mezcla que comprendía 6 partes de oleato de etilo
["NOFABLE® OO-9080", disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido cis-\Delta9-octadecenoico de 88% en peso y contenido de ácidos cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en peso] y 6 partes de trioleato de glicerol ["NOFABLE® GO-993", disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido cis-\Delta9-octadecenoico de 99% en peso y contenido de ácidos cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en peso]. Al componente de aceite se añadieron 0,9 partes de sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE® SO-902", disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido cis-\Delta9-octadecenoico de 88% en peso y contenido de ácidos cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en peso], 0,8 partes de monooleato de glicerol ["NOFABLE® GO-991", disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido cis-\Delta9-octadecenoico de 99% en peso y contenido de ácidos cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en peso] y 0,3 partes de aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente agitación, adición gradual de 8 partes de una fase acuosa (solución salina tamponada con fosfato) que contenía un antígeno, a la mezcla anterior con agitación, y después mezcla y emulsión por los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 1 para dar así una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite.
["NOFABLE® OO-9080", disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido cis-\Delta9-octadecenoico de 88% en peso y contenido de ácidos cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en peso] y 6 partes de trioleato de glicerol ["NOFABLE® GO-993", disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido cis-\Delta9-octadecenoico de 99% en peso y contenido de ácidos cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en peso]. Al componente de aceite se añadieron 0,9 partes de sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE® SO-902", disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido cis-\Delta9-octadecenoico de 88% en peso y contenido de ácidos cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en peso], 0,8 partes de monooleato de glicerol ["NOFABLE® GO-991", disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido cis-\Delta9-octadecenoico de 99% en peso y contenido de ácidos cis-\Delta9-alquenoicos de 99% en peso] y 0,3 partes de aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente agitación, adición gradual de 8 partes de una fase acuosa (solución salina tamponada con fosfato) que contenía un antígeno, a la mezcla anterior con agitación, y después mezcla y emulsión por los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 1 para dar así una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite.
Después se añadieron 0,14 partes de aceite de
ricinio hidrogenado polioxietilenado(60) (que tiene un valor
de HLB de 14,8) y 0,06 partes de lecitina de soja hidrogenada
("COATSOME® NC-21", disponible en NOF
CORPORATION) como tensioactivos y se disolvieron uniformemente en
10 partes de solución salina tamponada con fosfato, seguido de la
adición gradual de 10 partes del adyuvante de aceite de tipo agua en
aceite anterior a la dispersión con agitación y después mezcla y
emulsión por el mismo método usado en el Ejemplo 7, para dar así una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
f.
En este Ejemplo se usaron 5 partes de monooleato
de glicerol ["NOFABLE® GO-901", disponible en
NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente B y una solución acuosa obtenida disolviendo 3
partes de monohidrato de L-glutamato sódico y una
parte de manitol en 6 partes de agua destilada como componente E.
El componente B y el componente E se mezclaron y emulsionaron por
los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 4, para dar un
producto de tipo gel
Después, a 12 partes de oleato de decilo
["NOFABLE® EO-90", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente de aceite, se añadieron 1,7 partes de
sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE® SO-902",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico
de 88% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 0,3 partes de aceite de ricino hidrogenado
polioxietilenado(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente
agitación, adición de una parte del producto de tipo gel anterior a
la mezcla resultante para así dispersar el primero en la fase de
aceite, adición gradual de 8 partes de una fase acuosa que
comprende solución salina tamponada con fosfato que contiene un
antígeno a la mezcla anterior con agitación y después mezcla y
emulsión por los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 4, para
dar así una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en
aceite.
\newpage
Después se añadieron 0,4 partes de
polioxietilen(160)-polioxipropilen(30)-glicol
(que tiene un valor de HLB de 16,0) como tensioactivo y se
disolvieron uniformemente en 10 partes de solución salina tamponada
con fosfato, seguido de la adición gradual de 10 partes del
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite anterior a la dispersión
con agitación, y después mezcla y emulsión y mezcla a temperatura
ambiente y 8.000 rpm durante 5 minutos usando un CLEARMIX®
CLM-0,8S (disponible en M TECHNIQUE Co., Ltd.) para
dar así una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite
en agua X4.
En este Ejemplo se usaron 6 partes de monooleato
de sorbitán ["NOFABLE® SO-901", disponible en
NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] como componente B y una solución acuosa obtenida disolviendo 4
partes de monohidrato de L-glutamato sódico y una
parte de lactitol en 7 partes de agua destilada como componente E.
El componente B y el componente E se mezclaron y emulsionaron por
los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 4, para dar un
producto de tipo gel.
Después, a una mezcla que comprendía 10 partes
de aceite de semilla de girasol purificado y 2 partes de escualeno
como el componente de aceite, se añadieron 1,7 partes de
sesquioleato de sorbitán ["NOFABLE® SO-902",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico de
88% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 0,3 partes de aceite de ricino hidrogenado
polioxietilenado(40) calentado a 50ºC, seguido de suficiente
agitación, adición de una parte del producto de tipo gel anterior a
la mezcla resultante para así dispersar el primero en la fase de
aceite, adición gradual de 8 partes de una fase acuosa que
comprende solución salina tamponada con fosfato que contiene un
antígeno a la mezcla anterior con agitación y después mezcla y
emulsión por los mismos procedimientos usados en el Ejemplo 1, para
dar así una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en
aceite.
Después se añadieron 0,14 partes de monooleato
de sorbitán polioxietilenado(20) ["NONION
OT-221", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 55%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso; HLB: 15,8] y 0,06 partes de lecitina de soja hidrogenada
("COATSOME® NC-21", disponible en NOF
CORPORATION) como tensioactivos y se disolvieron uniformemente en
10 partes de solución salina tamponada con fosfato, seguido de la
adición gradual de 10 partes del adyuvante de aceite de tipo agua
en aceite anterior a la dispersión con agitación y después mezcla y
emulsión por el mismo método usado en el Ejemplo 7, para dar así
una vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
X5.
Ejemplo Comparativo
1
A 6 partes de parafina líquida ligera
("CRYSTOL® 52" disponible en ESSO Corporation) como el
componente de aceite, se añadieron 0,8 partes de sesquioleato de
sorbitán ("NONION OP-83RAT", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 55%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 83% en
peso) y 0,2 partes de monooleato de sorbitán
polioxietilenado(20) ("NONION OT-221",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico
de 55% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso), seguido de adición gradual de 3 partes de una fase acuosa
(solución salina tamponada con fosfato) que contiene un antígeno,
con suficiente agitación y después mezcla y emulsión por el mismo
método usado en el Ejemplo 1, para dar así una vacuna con adyuvante
de aceite de tipo agua en aceite g.
Ejemplo Comparativo
2
A una mezcla de 6 partes de oleato de etilo
("NOFABLE® OO-9080", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 6 partes de escualeno como componente A, se añadieron 1,6
partes de sesquioleato de sorbitán ("NONION
OP-83RAT", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 55%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso) y 0,4 partes de monooleato de sorbitán
polioxietilenado(20) ("NONION® OT-221",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico de
55% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso), seguido de suficiente agitación, adición gradual de 8 partes
de una fase acuosa (solución salina tamponada con fosfato) que
contenía un antígeno, con agitación y después mezcla y emulsión por
el mismo método usado en el Ejemplo 1 para dar así una vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite h.
\newpage
Ejemplo Comparativo
3
A una mezcla que comprendía 6 partes de oleato
de oleilo ("NOFABLE® OO-9080", disponible en
NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 6 partes de escualeno como componente A, se añadieron 1,6
partes de sesquioleato de sorbitán ("NONION
OP-83RAT", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 55%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso) y 0,4 partes de monooleato de sorbitán
polioxietilenado(20) ("NONION® OT-221",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico de
55% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso), seguido de suficiente agitación, adición gradual de 8
partes de una fase acuosa (solución salina tamponada con fosfato)
que contenía un antígeno con agitación y después mezcla y emulsión
por el mismo método usado en el Ejemplo 1 para dar así una vacuna
con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite.
Después se añadieron 0,14 partes de aceite de
ricino hidrogenado polioxietilenado(60) (HLB: 14,8) y 0,06
partes de lecitina de soja hidrogenada ("COATSOME®
NC-21", disponible en NOF CORPORATION) como
tensioactivos y se añadieron y dispersaron uniformemente en 10
partes de solución salina tamponada con fosfato, seguido de la
adición gradual de 10 partes del adyuvante de aceite de tipo agua en
aceite anterior a la dispersión con agitación y después mezcla y
emulsión por el mismo método usado en el Ejemplo 7, para dar así una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
comparativa i.
Ejemplo Comparativo
4
Se preparó un producto de tipo gel emulsionando
5 partes de monooleato de sorbitán ["NOFABLE®
SO-901", disponible en NOF CORPORATION;
composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y una solución acuosa obtenida disolviendo 4 partes de
lactitol en 6 partes de agua destilada por el mismo método usado en
el Ejemplo 4.
Después, a 12 partes de trioleato de glicerol
["NOFABLE® GO-903", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] se añadieron una parte de sesquioleato de sorbitán
["NOFABLE® SO-902", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 88%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 94% en
peso] y 0,5 partes de monooleato de sorbitán
polioxietilenado(20) ("NONION OT-221",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico
de 55% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso), seguido de suficiente agitación, adición de una parte del
producto de tipo gel anterior a la mezcla resultante, para así
dispersar el mismo en la fase de aceite, adición gradual de 6
partes de una fase acuosa que comprende solución salina tamponada
con fosfato que contenía un antígeno, a la mezcla anterior con
agitación, y después mezcla y emulsión por los mismos
procedimientos usados en el Ejemplo 4 para dar así una vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite comparativa Y1.
Ejemplo Comparativo
5
A 6 partes de parafina líquida ligera
("CRYSTOL® 52" disponible en ESSO Corporation) como el
componente de aceite, se añadieron 0,8 partes de sesquioleato de
sorbitán ("NONION OP-83RAT", disponible en NOF
CORPORATION; composición de acilo: contenido de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico de 55%
en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso) y 0,2 partes de monooleato de sorbitán
polioxietilenado(20) ("NONION OT-221",
disponible en NOF CORPORATION; composición de acilo: contenido de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico
de 55% en peso y contenido de ácidos
cis-\Delta9-alquenoicos de 78% en
peso), seguido de adición gradual de 3 partes de una fase acuosa
que comprendía solución salina tamponada con fosfato que contiene un
antígeno, con suficiente agitación y después mezcla y emulsión por
el mismo método usado en el Ejemplo 1, para dar así una vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite.
Después se añadieron 0,2 partes de aceite de
ricino hidrogenado polioxietilenado(60) (HLB: 14,80) como
tensioactivos y se dispersaron uniformemente en 10 partes de
solución salina tamponada con fosfato, seguido de la adición
gradual de 10 partes del adyuvante de aceite de tipo agua en aceite
anterior a la dispersión con agitación y después mezcla y emulsión
por el mismo método usado en el Ejemplo 10, para dar así una vacuna
con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua comparativa
Y2.
Después se llevaron a cabo ensayos de
inmunización usando vacunas con adyuvante de aceite específicas que
contenían diferentes antígenos. En la identificación de vacunas
individuales, cada símbolo unido a una vacuna específica indica que
la vacuna correspondiente es una preparada basándose en la
formulación descrita en el Ejemplo o Ejemplo Comparativo y
especificada por cada símbolo correspondiente.
Ejemplo de Ensayo
1
Se inoculó una cepa NG-22 de
Actinobacillus pleuropenumoniae (serotipo 2) en un medio, seguido de
cultivo con aireación-agitación centrífuga a 37ºC,
inactivación del medio de cultivo resultante con formalina,
recolección de las células bacterianas mediante centrifugación y
lavado de las células. Las células resultantes se usaron como un
antígeno. El antígeno se dispersó en solución salina tamponada con
fosfato con una concentración de 10^{10} UFC (unidad formadora de
colonia) (antes de la inactivación) por dosis y la dispersión
resultante se usó como una fase acuosa que contenía antígeno.
Con respecto a los grupos inmunizados (cada
grupo comprendía 5 cerdos SPF (sin patógeno específico) de 4 semanas
de edad) se inyectaron por vía intramuscular 1 ml/cerdo de la
vacuna a, c o X2, o 2 ml/cerdo de la vacuna d, f o X4, dos veces en
intervalos de 4 semanas. Mientras que se inyectaron por vía
intramuscular 1 ml/cerdo de la vacuna g o h, o 2 ml/cerdo de la
vacuna i o Y2, dos veces, a cada cerdo que pertenecía a los grupos
inmunizados comparativos (cada grupo comprendía cinco cerdos de 4
semanas de edad SPF), en intervalos de 4 semanas. Además, el grupo
testigo no inmunizado comprendía cinco cerdos y el grupo testigo se
albergó con cualquiera de los grupos inmunizados. Se examinaron los
síntomas clínicos en cada animal incluyendo la observación del
sitio de inyección, durante 2 semanas después de cada vacunación, se
recogió el suero de cada animal a intervalos adecuados a lo largo
del periodo de ensayo y se examinó en el suero la valoración de
anticuerpos determinado por el ensayo de fijación del complemento
(FC). El sitio de inyección se examinó mediante autopsia después de
16 semanas desde la inyección inicial de la vacuna para así
determinar el tamaño y distribución de los nódulos formados que se
evaluaron basándose en la clasificación de la lesión (nada; 0;
\sim grave: 3), seguido de cálculo de la media de 5 animales en
cada grupo.
Los resultados de seguridad se listan en la
Tabla 1. Los grupos inmunizados no tienen fiebre y no muestran
ninguna anomalía en los síntomas clínicos. En los grupos inmunizados
comparativos, se observó un aumento transitorio de la temperatura
corporal y estaban deprimidos. En la autopsia después de 16 semanas
después desde la inyección de vacuna inicial, no se observó ninguna
lesión particular en los grupos inmunizados, pero se observaron
nódulos que se habrían formado debido a las sustancias inyectadas
para los grupos inmunizados comparativos.
Los resultados de las eficacias de las vacunas
se resumen en las Tablas 2-1 y 2-2.
En estos grupos, en los que se han inyectado las vacunas a, c o X2,
entre los grupos inmunizados, la valoración de anticuerpos FC
empieza a aumentar después de 4 semanas a partir de la inyección de
la vacuna y se observó una buena respuesta de anticuerpos (1:128 a
1:256) después de 8 semanas desde la inyección de la vacuna, que era
casi igual a la observada para los grupos inmunizados comparativos,
a los que se había inyectado la vacuna g como testigo, y obviamente
era mayor que la observada para el grupo al que se había inyectado
la vacuna h. La vacuna X4 que era la vacuna con adyuvante de aceite
de tipo agua en aceite en agua de la presente invención podía estar
en emulsiones buenas y presentar buenas respuestas de anticuerpos
casi idénticas a las observadas para la vacuna con adyuvante de
aceite de tipo emulsión de agua en aceite mencionada. Las vacunas y
e Y2 preparadas antes y usadas en los grupos inmunizados
comparativos como controles eran emulsiones inestables y estos
grupos a los que se había inyectado vacuna presentaron claramente
una respuesta de anticuerpos más baja que la observada para
aquellos a los que se había inyectado vacunas
d y f.
d y f.
Los resultados anteriores prueban claramente que
la vacuna con adyuvante de aceite de la presente invención muestra
un efecto potenciador de la inmunidad aproximadamente igual al
observado para las vacunas que contienen aceite mineral no
metabolizable, incluso cuando el primero contiene sólo un aceite
metabolizable, y que el primero tiene una excelente reactividad
local comparado con las vacunas que contienen aceite mineral.
Además, estos resultados también demuestran que
la vacuna con adyuvante de aceite preparada por el método de la
presente invención tiene una alta estabilidad incluso cuando
comprende sólo un aceite metabolizable, que la vacuna presenta un
efecto de inmunización aproximadamente idéntico al alcanzado por las
vacunas con adyuvante de aceite convencionales que comprenden sólo
aceites minerales no metabolizables, en un periodo de tiempo largo,
y que la primera tiene excelente reactividad local comparada con las
vacunas convencionales que comprenden sólo aceites minerales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Ensayo
2
Se inoculó la cepa Ishii del virus de la
enfermedad de Newcastle (10^{5,0} DIE/huevo) en la cavidad
alantoica de huevos embrionados de 10 días de edad seguido de
cultivo a 37ºC durante 4 días y recolección del líquido alantoico.
El líquido se inactivó con una solución acuosa de formalina y se usó
como antígeno. Como fase acuosa se usó una solución salina
tamponada con fosfato a la que se añadió formalina y cuyo contenido
de virus antes de la inactivación se ajustó a 10^{8,0}
DIE_{80}/dosis.
Para los grupos inmunizados (cada grupo
comprendía 10 pollos SPF de 5 semanas de edad), se inyectaron por
vía intramuscular 0,5 ml/pollo de las vacunas a o b, o 1 ml/pollo de
las vacunas d o e, y para otros grupos inmunizados (cada grupo
comprendía 20 pollos SPF de 5 semanas de edad), se inyectaron por
vía intramuscular 0,5 ml/pollo de la vacuna X1 o X2, o 1,5 ml/pollo
de la vacuna X5. Para los grupos inmunizados comparativos (cada
grupo comprendía 10 pollos SPF de 5 semanas de edad, se inyectaron
por vía intramuscular 0,5 ml/pollo de la vacuna g o 1 ml/pollo de
la vacuna i, y para otros grupos inmunizados comparativos (que
comprendían 20 pollos SPF de 5 semanas de edad) se inyectaron 0,5
ml/pollo de la vacuna Y2. Además, los grupos de control no
inmunizados que comprendía cada uno 10 ó 20 pollos se albergaron con
los grupos inmunizados que comprendía cada uno 10 ó 20 pollos cada
uno, respectivamente.
Para las vacunas a, b, d y e, se inspeccionó en
cada animal los síntomas clínicos incluyendo la observación del
sitio de inyección durante 10 semanas después de la vacunación, el
suero de cada animal se recogió después de 10 semanas a partir de
la vacunación y se inspeccionó la valoración de anticuerpos de
inhibición de hemoaglutinación (HI) en los sueros. El sitio de
inyección se examinó por autopsia (5 animales por grupo) después de
10 semanas desde la vacunación para determinar así el grado y
distribución de residuos que se evaluaron basándose en la
clasificación de la lesión (nada: 0; \sim grave: 3), seguido del
cálculo de la media para cada grupo. Los 5 animales restantes en
cada grupo se estimularon por inyección intramuscular de cepa Sato
del virus EN con una cantidad de 10^{4} DLM (dosis letal
mínima)/pollo, seguido de la observación de los síntomas clínicos
en 2 semanas, después de la estimulación y recolección simultánea de
muestras de sangre después de 2 semanas desde la estimulación,
inspección de la sangre recogida para la valoración de anticuerpos
de HI para así determinar si los animales se infectaron con el
virus o no.
Para las vacunas X1, X2, X5 e Y2, se inspeccionó
en cada animal los síntomas clínicos incluyendo la observación del
sitio de inyección durante 20 semanas después de la vacunación, se
recogió el suero de cada animal y se inspeccionó la valoración de
anticuerpos de inhibición de hemoaglutinación (HI). El sitio de
inyección se examinó por autopsia (10 animales por grupo) después
de 10 semanas desde la vacunación para determinar así el grado y
distribución de residuos que se evaluaron basándose en la
clasificación de la lesión (nada: 0; \sim grave: 3), seguido del
cálculo de la media para cada grupo. Los 10 animales restantes en
cada grupo se estimularon por inyección intramuscular de cepa Sato
del virus EN con una cantidad de 10^{4} DLM (dosis letal
mínima)/pollo después de 20 semanas desde la inyección seguido de la
observación de los síntomas clínicos en 2 semanas después de la
estimulación y recolección simultánea de muestras de sangre después
de 2 semanas desde la estimulación, inspección en la sangre
recogida de la valoración de anticuerpos de HI para así determinar
si los animales se infectaron con el virus o no.
Los resultados de seguridad se listan en las
Tablas 5-1 y 5-2. Los grupos
inmunizados comparativos en los que se inyectaron las vacunas g, i
e Y2 sufrieron claudicación transitoria inmediatamente después de la
vacunación. Por otra parte, todos los grupos inmunizados en los que
se había inyectado las vacunas de esta invención no mostraron
ninguna anomalía a lo largo del periodo de ensayo. En la autopsia
después de 10 semanas desde la vacunación se observó una pequeña
cantidad de una sustancia aceitosa en dos de cinco animales que
pertenecían al grupo en el que se había inyectado la vacuna b, en
tres de cinco que pertenecían al grupo en el que se había inyectado
la vacuna X2, pero no había ninguna lesión en los otros grupos
inmunizados. Sin embargo, en todos los grupos inmunizados
comparativos en los que se habían inyectado las vacunas g, y e Y2,
se observó la presencia de residuos de medios a graves.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
TABLA 5-2
(continuación)
Los resultados sobre la inspección de las
vacunas para la eficacia se resumen en las Tablas
6-1 y 6-2. Cuando se comparan los
resultados observados para las vacunas a, b, X1 y X2 inyectadas a
los grupos inmunizados que eran vacunas con adyuvante de aceite de
tipo agua en aceite con los observados para la vacuna g inyectada
al grupo inmunizado comparativo, no se observó ninguna diferencia
entre ellos, y por lo tanto se consideraba que eran idénticos entre
sí. Por otra parte, cuando se comparan los resultados observados
para las vacunas d, e y X5 inyectadas a los grupos inmunizados que
eran vacunas con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua
con los observados para las vacunas y e Y2 inyectadas a los grupos
inmunizados comparativos, las valoraciones de anticuerpos de HI
para estas últimas eran claramente más bajos que los observados para
las primeras.
Los resultados anteriores prueban claramente que
la vacuna con adyuvante de aceite de la presente invención muestra
un efecto de inmunización que es aproximadamente igual al observado
para las vacunas que contienen aceite mineral no metabolizable,
incluso cuando la primera comprende sólo un aceite metabolizable y
que la última tiene una reactividad local considerablemente buena
comparada con las vacunas con adyuvante de aceite que contienen
aceite mineral.
Además, estos resultados también demuestran que
la vacuna con adyuvante de aceite preparada por el método de la
presente invención tiene una estabilidad alta, que la vacuna
presenta un efecto de inmunización aproximadamente idéntico al
logrado por las vacunas con adyuvante de aceite convencionales que
comprenden sólo aceites minerales no metabolizables y que la
primera tiene una reactividad local excelente comparada con las
vacunas con adyuvante de aceite convencionales. Además, también
prueban que la vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite
en agua preparada por la presente invención tiene también
estabilidad alta y muestra una eficacia excelente a lo largo de un
periodo de tiempo largo, mientras que también tiene una excelente
reactividad local.
Ejemplo de Ensayo
3
Se inocularon células HmLu-1
formadas en una monocapa de células con cepa YHL del virus de la
fiebre efímera bovina (FEB) de modo que la MDI (multiplicidad de
infección) se fijó en 0,01, seguido de adsorción del virus sobre la
capa a 37ºC durante 60 minutos, y después cultivo de las mismas a
34ºC durante 3 días para añadir un medio e inactivación del líquido
sobrenadante con formalina. Como fase acuosa se usó una solución
salina tamponada con fosfato a la que se añadió formalina y cuyo
contenido de virus antes de la inactivación se ajustó a 10^{5,0}
DICT_{80}/dosis.
Respecto a los grupos inmunizados (cada grupo
comprendía dos animales bovinos, cada uno con un peso de
aproximadamente 150 kg), se inyectaron por vía intramuscular 1
ml/animal bovino de la vacuna a, X1 o X3, o 3 ml/animal bovino de
la vacuna d, mientras que se inyectaron por vía intramuscular 1
ml/animal bovino de la vacuna g o Y1 en cada animal bovino que
pertenecía a los grupos inmunizados comparativos (cada grupo
comprendía dos animales bovinos que tenían un peso corporal de 150
kg). Además, el grupo de control no inmunizado compuesto de dos
animales bovinos y el grupo de control se albergaron con uno de los
grupos inmunizados. Se inspeccionó en cada animal los síntomas
clínicos incluyendo la observación del sitio de inyección y su
temperatura corporal en 2 semanas después de la vacunación. Además,
se recogió el suero de cada animal a intervalos constantes después
de la inyección de la vacuna y se inspeccionó en el suero la
valoración de anticuerpos neutralizantes. El sitio de inyección se
examinó por autopsia después de 20 semanas desde la inyección de la
vacuna.
Los resultados de seguridad se listan en la
Tabla 7. Los grupos inmunizados y los grupos inmunizados
comparativos no mostraron ninguna anomalía en los síntomas clínicos
ni en la temperatura corporal. En la autopsia de los sitios de
inyección de la vacuna, sólo se observó que quedaba vacuna en los
sitios para los grupos inmunizados comparativos.
Los resultados de la inspección de las vacunas
para la eficacia se resumen en las Tablas 8-1 y
8-2. Las valoraciones de anticuerpos de los grupos
inmunizados empezaron a aumentar 4 semanas después de la vacunación
y mostraban un cambio en la valoración de anticuerpos idéntico al
observado para los grupos inmunizados comparativos, los grupos
inmunizados en los que se habían inyectado las vacunas X1 y X3
mostraron cambios en las valoraciones de anticuerpos mayores a los
observados para el grupo inmunizado comparativo en el que se había
inyectado la vacuna Y1, y esta tendencia se mantuvo hasta 20
semanas después de la vacunación.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados anteriores indican claramente que
la vacuna con adyuvante de aceite de la presente invención,
presenta un efecto de inmunización casi idéntico al observado para
el aceite mineral no metabolizable, incluso cuando la vacuna con
adyuvante de aceite de la presente invención comprendía sólo un
aceite metabolizable, y que la primera tiene una reactividad local
considerablemente buena comparado con la vacuna con adyuvante que
contiene aceite mineral.
Estos resultados también prueban que la vacuna
con adyuvante de aceite preparada por el método de la presente
invención tiene estabilidad alta, muestra un efecto de inmunización
en un periodo de tiempo largo y también tiene una reactividad local
excelente.
Después se inspeccionó la estabilidad en las
vacunas con adyuvante de aceite preparadas en los Ejemplos 4 a 6 y
7 a 11 y los Ejemplos Comparativos 4 a 5, inmediatamente después de
su preparación de acuerdo con los siguientes procedimientos. Estos
resultados se resumen en la siguiente Tabla 9.
Ejemplo de ensayo
4
Se puso cada una de las vacunas con adyuvante de
aceite de tipo agua en aceite (5 ml) en un tubo Spitz de
polipropileno de 15 ml de volumen (esterilizado) equipado con un
tapón para evaluar así su estabilidad en diferentes condiciones de
temperatura. Cada tubo se observó visualmente después de un día, 3
meses y 12 meses desde la preparación, seguido de la observación de
cada muestra usando un microscopio de contraste de fase (aumento: x
1000) (5 campos visuales cada uno) y los resultados así obtenidos se
evaluaron basándose en los siguientes criterios de evaluación:
\circledcirc: No se observó (o se observó
poca) separación de fase y no se observó (o se observó poco) cambio
del tamaño de las gotas
O: Se observó separación pequeña de la fase de
aceite solo, y/o pequeño cambio del tamaño de las gotas
\Delta: Se observó separación de la fase
acuosa, y/o se observó "rotura"* parcial de las gotas.
X: Se observó separación tanto de la fase de
aceite como de la fase acuosa, y/o se observó claramente
"rotura"* de las gotas.
XX: Se observó claramente separación de fase,
y/o apenas se mantuvo el antígeno en la fase interna.
*) "Rotura" es la unión espontánea de
pequeñas gotas en la emulsión para formar otras más grandes
(coalescencia).
Ejemplo de ensayo
5
Se introdujo cada una de las vacunas con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua (10 ml) en un
tubo de vidrio con rosca de 20 ml de volumen (esterilizado) equipado
con un tapón, para evaluar así su estabilidad en diferentes
condiciones de temperatura. Cada tubo se observó visualmente después
de un día, 3 meses y 12 meses desde la preparación, seguido de la
observación de cada muestra usando un microscopio de contraste de
fase (aumento: x 1000) (5 campos visuales cada uno) y los resultados
así obtenidos se evaluaron basándose en los siguientes criterios de
evaluación:
\circledcirc: No se observó (o se observó
poca) separación de fase y no se observó (o se observó poco) cambio
del tamaño de las gotas.
O: Se observó un pequeño cambio del tamaño de
las gotas, pero permanecía la forma de agua en aceite en agua.
\Delta: Se observó claramente coalescencia de
las gotas, pero la forma de agua en aceite en agua permanecía.
X: Se observó claramente "rotura" de las
gotas, de manera que la forma de agua en aceite en agua no
permanecía de forma satisfactoria.
XX: La forma de agua en aceite en agua
prácticamente se rompió, y se observó claramente la separación de
fase.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados listados en las Tablas indican
claramente que se pueden preparar por la presente invención las
vacunas con adyuvante de aceite excelentes tanto en cuanto a
seguridad como capacidad para inducir una producción de
anticuerpos, que las vacunas con adyuvante de aceite que tienen
viscosidad baja y tienen tanto una excelente estabilidad a largo
plazo como capacidad sostenida para inducir una producción de
anticuerpos, se pueden preparar por el método que comprende las
etapas de añadir, a un componente de aceite, un triglicérido de
ácido graso polioxietilenado y una sustancia de tipo gel que
comprende una solución acuosa de los componentes B y E de la
presente invención, mezclar estos ingredientes y después añadir una
fase acuosa que contiene una cantidad biológicamente aceptable y
eficaz de antígenos para así emulsionar la fase acuosa en la fase de
aceite, y que se puede obtener una vacuna con adyuvante de aceite
de tipo agua en aceite en agua excelente tanto en seguridad como en
capacidad de producción de anticuerpos por el método que comprende
la etapa de añadir la vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua
en aceite preparada por el método anterior a una fase acuosa que
contiene el agente emulsionador mixto de la presente invención para
así volver a emulsionar la vacuna en la fase acuosa.
\newpage
Como se ha discutido antes con detalle, la
presente invención permite preparar vacunas con adyuvante de aceite
útiles que muestran capacidad de inducir la producción de
anticuerpos en un periodo de tiempo sin usar, en productos
farmacéuticos, ningún estimulador de la inmunidad tal como lecitinas
vegetales, y tienen requisitos para medicinas tales como la
estabilidad y seguridad.
Claims (10)
1. Una vacuna con adyuvante de aceite de
tipo agua en aceite que comprende de 20 a 90% en peso de una fase
de aceite A) que está en un estado líquido a una temperatura en el
intervalo de 15 a 25ºC; de 0,5 a 30% en peso de agente emulsionante
que comprende un tensioactivo no iónico B) que es un éster parcial
derivado de alcohol polihídrico que porta al menos tres grupos
hidroxilo y ácido graso y que está en un estado líquido a 40ºC y un
triglicérido de hidroxi-ácido graso polioxietilenado (20 a 60 moles)
c); de 5 a 75% en peso de una fase acuosa D) que contiene una
cantidad biológicamente aceptable y eficaz de antígenos; y, en peso
de la fase acuosa D), E) de 0,01 a 10% en peso de aminoácido o la
sal del mismo y de 0,01 a 10% en peso de azúcar no reductor o
alcohol de azúcar que tiene al menos 5 grupos hidroxilo en la
molécula.
2. Una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, que contiene adicionalmente una fase acuosa
externa F) que comprende de 0,2 a 20% en peso de agente
emulsionante que comprende tensioactivo no iónico y que tiene un
valor de HLB global no menor que 10.
3. Una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 2, en la que la fase acuosa externa F) incluye
glicerofosfolípido.
4. Una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 2 ó 3, que contiene de 30 a 90% en peso de la fase de
aceite A).
5. Una vacuna de acuerdo con la
reivindicación 2 ó 3 ó 4, que contiene de 5 a 65% en peso de la fase
acuosa D).
6. Una vacuna de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que la fase de aceite A) que está
en un estado líquido a una temperatura en el intervalo de 15 a 25ºC
es un éster de ácido graso opcionalmente mezclado con
escualeno.
7. Una vacuna de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que la fase de aceite A) que está
en un estado líquido a una temperatura en el intervalo de 15 a 25ºC
comprende un éster derivado de ácido graso que comprende no menos
de 85% en peso de ácido
cis-\Delta9-octadecenoico y no
menos de 90% en peso de ácido
cis-\Delta9-alquenoico y
alcohol.
8. Una vacuna de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en la que el componente de ácido graso
de tensioactivo no iónico B) comprende no menos de 85% en peso de
ácido cis-\Delta9-octadecenoico y
no menos que 90% en peso de ácido
cis-\Delta9-alquenoico.
9. Un método para preparar una vacuna
con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende las etapas de añadir a una fase de
aceite A) que está en un estado líquido a una temperatura en el
intervalo de 15 a 25ºC, tensioactivo no iónico B) que es un éster
parcial derivado de alcohol polihídrico que porta al menos tres
grupos hidroxilo y ácido graso y que está en un estado líquido a
40ºC, y un triglicérido de hidroxi-ácido graso polioxietilenado (20
a 60 moles) c), y un producto obtenido mezclando y emulsionando el
tensioactivo no iónico B) y una solución acuosa que contiene el
aminoácido E) o una sal del mismo y un azúcar no reductor o alcohol
de azúcar que tiene al menos 5 grupos hidroxilo en la molécula,
estando la relación en peso del tensioactivo no iónico B) a la
solución acuosa del componente E) en el intervalo de 1:1 a 1:20, y
después añadir una fase acuosa D) que contiene una cantidad
biológicamente aceptable y eficaz de antígenos, y así emulsionar la
fase acuosa en la fase de aceite.
10. Un método para preparar una vacuna con
adyuvante de aceite de tipo agua en aceite en agua de acuerdo con
la reivindicación 2, que comprende las etapas de añadir a una fase
de aceite A) que está en un estado líquido a una temperatura en el
intervalo de 15 a 25ºC, tensioactivo no iónico B) que es un éster
parcial derivado de alcohol polihídrico que porta al menos tres
grupos hidroxilo y ácido graso y que está en un estado líquido a
40ºC, y triglicérido de hidroxi-ácido graso polioxietilenado (20 a
60 moles) c), y un producto obtenido mezclando y emulsionando el
tensioactivo no iónico B) y una solución acuosa que contiene el
aminoácido E) o una sal del mismo y un azúcar no reductor o alcohol
de azúcar que tiene al menos 5 grupos hidroxilo en la molécula,
estando la relación en peso del tensioactivo no iónico B) a la
solución acuosa del componente E) en el intervalo de 1:1 a 1:20, y
después añadir una fase acuosa D) que contiene una cantidad
biológicamente aceptable y eficaz de antígenos, para formar así una
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite; y añadir la
vacuna con adyuvante de aceite de tipo agua en aceite a una fase
acuosa F) que contiene de 0,2 a 20% en peso de agente emulsionante
que comprende tensioactivo no iónico y que tiene un valor de HLB
global no menor que 10.
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