JPH06172216A - 乳液状オイルアジュバント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 植物性油に非イオン性界面活性剤（Ａ）を加
えて混合した液（Ａ液）に、不活化抗原またはサブユニ
ット抗原に非イオン性界面活性剤（Ｂ）を加えて混合し
た液（Ｂ液）を前者：後者＝５０〜５５：５０〜４５
（容量比）の割合で加えた後、攪拌して得られる乳液状
オイルアジュバント。 【効果】 安価な植物性油を主成分とするアジュバント
を極めて簡単な製造法で効率よく得ることができる。ま
た、本アジュバントは低温下で保存しても流動性を保ち
注射し易い。さらに、接種部位に肉眼変状および組織変
状をほとんど残さないので、家畜畜産物としての製品価
値を保持できる。その上、本アジュバントは植物性油を
用いて作られるため、従来の鉱物性油を使用したものと
異なり、公害防止，安全食品の観点からもその利用価値
は極めて高い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、乳液状オイルアジュバ
ントに関し、詳しくは植物性油を用いた安全性の高い乳
液状オイルアジュバントに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現在
市販されているオイルアジュバントはFreund氏の考案し
たアジュバントであり、鉱物油の流動パラフィンを主体
としてものである。しかし、このオイルアジュバント
は、水中油（oil in water）の状態（クリームパフェ
状）で硬く、家畜等へ接種するのは極めて困難である。
そのため、このものは研究目的で実験動物の接種試験に
利用されているのみで、実用面での利用価値は低い。ま
た、本アジュバントは接種部位に硬結を形成し、それが
長期間残存するのみならず、付属リンパ節の腫脹も起こ
すなど、安全性の点からも問題が多く、わが国では家畜
に対する使用は許可されていない。

【０００３】一方，外国で開発され、輸入されているオ
イルアジュバントがわが国の市場に出回っているが、そ
の組成および製法は全く不明である。また、このオイル
アジュバントも、前記と同様に、接種部位に硬結が形成
され、長期間残存するため、食品に供さない頸部を接種
部位とする鶏用の不活化ワクチンと繁殖用豚のワクチン
にのみ使用が許可されており、他の家畜に対する使用は
許可されていない。

【０００４】以上の理由から現在のところ、わが国では
不活化およびサブユニットワクチンのアジュバントとし
て、リン酸アルミニウムゲルや水酸化アルミニウムゲル
が使用されている。しかし、これらのアジュバントは、
抗体の産生能や免疫の持続性の点でオイルアジュバン
トより劣っている；アジュバント効果が低いため、用
量を多く必要とする；製造過程において無菌的操作が
困難であるなど効力並びに製造上の点などで問題が多
い。そのため、わが国において安全で抗体の発現および
増強作用が高く、使用し易いアジュバントの開発が強く
求められてきている。

【０００５】家畜のワクチンは、これまで主として生ワ
クチンが数多く開発、実用化されてきた。しかし、血清
型の多い細菌性疾病やウイルス性疾病、新しいウイルス
の出現やウイルスの変異が起こりやすいアルボウイルス
感染症などの予防には、生ワクチンより不活化ワクチン
やサブユニットワクチンの使用が適切である。

【０００６】また、伝染性疾病の早期防圧のためのワク
チンとしても短期間に製造することができ、対応が可能
な不活化ワクチンやサブユニットワクチンの開発が望ま
れている。

【０００７】一方、家畜用ワクチンとして多くのワクチ
ンが市場に出回っているが、最近は畜産の安定的経営か
ら、畜産農家においてワクチン経費負担の軽減が望まれ
ており、ワクチンの使用頻度の低減、注射回数の軽減等
によるワクチンの低コスト化等が要求され、そのためコ
ンバインドワクチンや多価ワクチンの開発が強く求めら
れている。

【０００８】これらの理由から最近では、大量培養技術
や遺伝子組換え技術によりサブユニットワクチンやコン
ポーネントワクチンの開発研究も数多く行われ、既に免
疫原の蛋白質遺伝子の抽出やそれら抗原の大量培養が可
能となって来ている。しかし、不活化ワクチンおよびサ
ブユニットワクチンの素となる免疫原は単味ではワクチ
ンとしての免疫活性はほとんどなく、それらの安全性お
よび免疫効果の優劣、評価は使用するアジュバントに依
存している。

【０００９】そのため、各方面で優れたアジュバントの
開発・研究が行われてきたが、現在まで安全性および免
疫発現・増強作用の両条件を満たすアジュバントは開発
されていない。

【００１０】ところで、不活化およびサブユニットワク
チンの開発は、注射による副作用等がなく、安全で免疫
の発現および増強作用が高く、かつ使用し易いアジュバ
ントの開発に依存しているのが実情である。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々の油
性剤，界面活性剤等を用いて混合の度合い，混合の順
序，混合時の温度等の条件を種々検討し、試行錯誤によ
る繰り返し試験により、植物性油と非イオン性界面活性
剤を成分とした乳液状のオイルアジュバントの作出に成
功した。本アジュバントは流動性で注射し易く、接種部
位に肉眼変状及び組織変状を残さないこと、免疫増強作
用が従来のリン酸アルミニウムゲルや水酸化アルミニウ
ムゲルより優れていることを豚オーエスキー病のサブユ
ニットワクチンに応用し確認し、本発明を完成した。

【００１２】本発明は、植物性油に非イオン性界面活性
剤（Ａ）を加えて混合した液（Ａ液）に、不活化抗原ま
たはサブユニット抗原に非イオン性界面活性剤（Ｂ）を
加えて混合した液（Ｂ液）を前者：後者＝５０〜５５：
５０〜４５（容量比）の割合で加えた後、攪拌して得ら
れる乳液状オイルアジュバントに関する。

【００１３】植物性油としては、コーン油，ナタネ油，
ゴマ油，オリーブ油，べに花油，サラダ油，綿実油のほ
か混合植物性油などが用いられる。

【００１４】上記のＡ液を調製するために用いる非イオ
ン性界面活性剤（Ａ）としては、ソルビタン脂肪酸エス
テル（アラセル系界面活性剤，スパン系界面活性剤）が
好ましく、脂肪酸としてはラウリン酸，パルミチン酸，
ステアリン酸，オレイン酸などが用いられ、いずれも食
品への添加が許容されているものである。界面活性剤
は、使用に先立ち加熱滅菌しておくべきである。植物性
油と非イオン性界面活性剤（Ａ）の配合は、前者：後者
＝８０〜９０：１０〜１５（容量比）、好ましくは８
５：１３（容量比）が適当である。

【００１５】本発明に用いられる不活化抗原またはサブ
ユニット抗原としては、家畜および家禽のウイルス，細
菌および原虫の病原体などがあり、特にこれら病原体の
外皮構成糖蛋白が好適である。

【００１６】また、上記のＢ液を調製するために用いる
非イオン性界面活性剤（Ｂ）としては、ポリオキシエチ
レングリコールソルビタンアルキルエステル（トゥイー
ン系界面活性剤）が好ましく、アルキル基としては炭素
数１１〜１８のものが用いられる。この中ではポリオキ
シエチレンソルビタンモノパルミテート（商品名：トゥ
イーン４０）が特に好適である。この界面活性剤も、予
め加熱滅菌して用いるべきである。不活化抗原またはサ
ブユニット抗原と非イオン性界面活性剤（Ｂ）の配合
は、前者：後者＝１００：1.８〜2.２（容量比）、好ま
しくは１００：1.９（容量比）が適当である。

【００１７】Ａ液とＢ液は、使用目的に応じて適量を用
いればよいが、通常は両者を前者：後者＝５０〜５５：
５０〜４５（容量比）の割合で混合する。混合液は、例
えばホモゲナイザーなどを用いて攪拌し、均一に混ぜ、
乳液状とする。得られた乳液状のオイルアジュバントと
は、冷暗室（温度は４〜６℃が適当）に貯蔵することに
より長期保存が可能である。

【００１８】本発明のアジュバントは流動性で注射し易
く、接種部位に肉眼変状および組織変状を残さない。ま
た、本アジュバントは植物性油で作られるため、従来の
鉱物性油を用いたものと異なり、公害防止，安全食品の
観点からもその利用価値は極めて高い。本アジュバント
を免疫の発現・増強用アジュバントとして利用すること
により、家畜の不活化およびサブユニットワクチンの開
発・実用化は著しく進展することが期待される。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により、本発明によるオイルア
ジュバントの製造法およびアジュバントとして豚オーエ
スキー病のサブユニットワクチンに応用した場合の安全
性と免疫効果について詳しく説明する。

【００２０】実施例１ オイルアジュバントの製造 （１）植物性油（ゴマ油），非イオン性界面活性剤（商
品名：Arlacel およびTween-40) を１２０℃で２０分間
加熱滅菌した。 （２）植物性油８５容量に対して上記Arlacel を約１３
容量滴下、混合してＡ液を調製した。 （３）一方、３０℃に加温した不活化抗原またはサブユ
ニット抗原（豚オーエスキー病のサブユニット抗原）１
００容量に対して３７℃に加温したTween-40を２容量滴
下、混合してＢ液を調製した。 （４）上記のようにして得たＡ液およびＢ液を３０℃に
加温した後、Ａ液１００容量に対してＢ液を約等量滴
下、混合した。 （５）次いで、該混合液をホモゲナイザーにより攪拌
し、乳液状とした。 （６）得られた製品（豚オーエスキー病のサブユニット
ワクチン）は４〜６℃の冷暗室に貯蔵した。

【００２１】この製品は４〜６℃の冷暗室に貯蔵して
も、水性部分と油性部分はほとんど分離せず、固まら
ず、しかも流動性であり、２６Ｇ×１／２”針（０．４
５×１３ｍｍ）の注射針での吸引もスムースであった。
また、同注射針によるワクチンの注射（吹出し）も容易
であった。

【００２２】実施例２ 豚オーエスキー病サブユニットワクチンに応用した場合
の安全性と中和抗体産生能 （１）安全性 ａ．マウスに対する安全性 ６週齢のｄｄＹ種マウス１８匹を用い、植物性油（ゴマ
油）をオイルアジュバントとして作製した製品（豚オー
エスキー病サブユニットワクチン、実施例１で得た製
品）０．２ｍｌを皮下に接種後、１週ごとに３匹ずつ肉
眼変状及び組織変状を病理学的に調べた。

【００２３】結果を第１表に示す。表から明らかな通
り、肉眼変状は接種１週後から全く見られなかった。組
織変状も２週後から治癒するマウスが見られ、４週後の
組織変状としてはマクロファージによる油滴の取り巻き
（オイルシスト形成、これは光学顕微鏡写真により確認
した。）が見られる程度であった。６週後にはいずれの
マウスにも接種部位に著変は見られなかった（光学顕微
鏡写真により確認）。

【００２４】

【表１】

【００２５】ｂ．豚に対する安全性 生後約１か月齢、体重１０〜１５ｋｇの豚４頭の頸側筋
肉内に植物性油（ゴマ油）をオイルアジュバントとして
作製した製品（豚オーエスキー病サブユニットワクチ
ン、実施例１で得た製品）２ｍｌを接種し、２週後にブ
ースター注射として初回接種と同部位に製品２ｍｌを接
種した。２回目接種の２週後と６週後に接種部位を病理
学的に観察した。

【００２６】その結果、解剖時にいずれの豚の接種部位
にも肉眼変状は見られなかった。組織変状としては、接
種２週後に解剖した豚でマウス同様、マクロファージに
よる油滴の取り巻き（オイルシスト形成、これは光学顕
微鏡写真により確認した。）が見られる程度であった。
しかし、６週後の豚では接種部位に著変は見られなかっ
た（光学顕微鏡写真により確認）。

【００２７】（２）中和抗体産生能 ａ．マウスにおける中和抗体産生能 ６週齢のｄｄＹ種マウスに植物性油のゴマ油，ベニ花
油，混合油（植物油６種類），オリーブ油，綿実油をオ
イルアジュバントとして作製した製品（豚オーエスキー
病サブユニットワクチン）０．２ｍｌを皮下に接種後、
１週ごとに中和抗体の産生能を調べた。

【００２８】その結果、中和抗体の検出時期はマウスに
より差は見られず、いずれの植物性油のアジュバントで
も接種４週後（ブースター接種１週後）から中和抗体が
産生された。また、中和抗体価はマウスの個体により差
は見られたが、植物性油アジュバント間の中和抗体価に
大きな差は認められなかった。なお、従来より使用され
ているリン酸アルミニウムゲルのアジュバントとの比較
では、抗体産生能および抗体価ともに植物性油のオイル
アジュバントは極めて優れていることが示された（第２
表）。

【００２９】

【表２】

【００３０】ｂ．豚における中和抗体産生能 生後約１か月齢、体重１０〜１５ｋｇの豚４頭の頸側筋
肉内に植物性油のゴマ油をオイルアジュバントとして作
製した製品（豚オーエスキー病サブユニットワクチン）
２ｍｌを接種し、４週後に同量のブースター注射を行っ
た。

【００３１】その結果、ブースター接種１週後に３２〜
６４倍（平均：３８．１倍）の抗体が産生された。本ア
ジュバントによる平均抗体価は、抗原を約２倍量含んだ
リン酸アルミニウムゲルを使用した場合より約1.４倍高
く、本アジュバントの抗体産生能は豚でも優れているこ
とが示された（第３表）。

【００３２】

【表３】

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、安価な植物性油を主成
分とするアジュバントを極めて簡単な製造法で効率よく
得ることができる。また、本アジュバントは低温下で保
存しても流動性を保ち注射し易い。さらに、接種部位に
肉眼変状および組織変状をほとんど残さないので、家畜
畜産物としての製品価値を保持できる。その上、本アジ
ュバントは植物性油を用いて作られるため、従来の鉱物
性油を使用したものと異なり、公害防止，安全食品の観
点からもその利用価値は極めて高い。このように本アジ
ュバントをワクチンの免疫発現および免疫増強用アジュ
バントとして利用することにより、家畜・家禽の不活化
およびサブユニットワクチンの開発・実用化は著しく進
展することが期待される。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物性油に非イオン性界面活性剤（Ａ）
   を加えて混合した液（Ａ液）に、不活化抗原またはサブ
   ユニット抗原に非イオン性界面活性剤（Ｂ）を加えて混
   合した液（Ｂ液）を前者：後者＝５０〜５５：５０〜４
   ５（容量比）の割合で加えた後、攪拌して得られる乳液
   状オイルアジュバント。
2. 【請求項２】 非イオン性界面活性剤（Ａ）がソルビタ
   ン脂肪酸エステルであり、非イオン性界面活性剤（Ｂ）
   がポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエ
   ステルである請求項１記載のオイルアジュバント。