JPH08505866A - 組換えサブユニット生ワクチン組成物及びその製造方法 - Google Patents
組換えサブユニット生ワクチン組成物及びその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
注射可能なエマルジョンと組み合わせられた組換えサブユニット生ワクチンからなる組換えサブユニット生ワクチン組成物、その製造方法、およびその使用。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えサブユニット生ワクチン組成物及びその製造方法
本発明は、動物またはヒトの医薬として投与するための、特に油中水(W/O
)型、水中油(O/W)型、または水中油中水(W/O/W)型の、注射可能な
エマルジョンに組み込まれた組換えサブユニット生ワクチンが結合した新規ワク
チン組成物に関する。
より具体的には、本発明は組換え生ワクチンであって、微生物、特にエンベロ
ープを有するウイルスに対する自己防衛的な免疫反応に関与する組換えタンパク
質が、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルスまたは
バキュロウイルスのようなエンベロープを持たないウイルスからなるウイルスベ
クターをによって生体内で発現される、組換え生ワクチンに関する。
生きている微生物を用いたワクチン接種は、良く知られているように、死んだ
微生物または単離されたペプチドもしくはタンパク質による非生ワクチンによる
ワクチン接種に比べて多くの長所を有する。
生ワクチンにおいては、弱毒化された生ワクチンが広く用いられている。しか
し、これには発病の危険という欠点がある。というのは、一方ではウイルスの核
酸が宿主のゲノムに融合し、他方では毒性を有する生活型を回復するといった可
能性が常に存在するからである。
さらに、突然変異または欠失による弱毒化生ワクチンのさ
らなる弱毒化は、ときには免疫応答の低減を生じ、ワクチン組成物の注射量を増
大する必要を生じさせることもある。この免疫応答の低減を克服するために、ア
ジュバントの使用がこれまで試みられてきた。
したがって、ヨーロッパ特許EP129923号では、水中油(O/W)型の
油性アジュバントが免疫応答の増強に用いられている。
このようにすることで免疫応答のある程度の改善が得られるが、弱毒化ウイル
ス生体のような弱毒化微生物生体は、通常凍結乾燥品であり、本質的に水性の溶
媒中に溶解する必要がある。この水相に導入し得る油成分の量は、著しく制限さ
れる。
加えて、弱毒化生ワクチンから調製できるのは、水中油(O/W)型のエマル
ジョンだけである。
さらに、エンベロープをもつウイルスの弱毒化生体のような弱毒化微生物生体
には、油成分または油相への直接の接触により、生体膜に破損が生じるために不
活性化してしまうものもある。
遺伝子工学の進歩は、これまでよりも純度の高い抗原、または完全な合成抗原
からなる組換えサブユニットワクチンを得ることを可能にする。
組換えサブユニットワクチンの高い純度は、ワクチンの安全性という点では、
弱毒生ワクチンに比べて問題にならないくらい優れた長所を与える。
通常、組換えサブユニットワクチンは、組換え微生物によ
って作られ宿主に注射される、1種類またはそれ以上の種類の精製されたタンパ
ク質からなる。
他ならぬその純度のために、これら組換えサブユニット非生ワクチン、すなわ
ち組換え微生物によって産生され精製されたタンパク質からなるワクチンでは、
普通は免疫学的な作用効率の低下という結果に導かれる。これが、組換えサブユ
ニットワクチンの使用が抗原の大量使用を必要とする理由である。
さらに、組換えサブユニット非生ワクチンは、複数回の注射を必要とするのだ
が、これでは経済的な要請にほとんど応えることができない。
ごく最近では、一般的に、組換えベクターである外来遺伝子が挿入されたウイ
ルスを用いた微生物生体からなる、組換えサブユニット生ワクチンが製造されて
いる。そういった発明によれば、免疫反応誘発のために、組換えサブユニット生
ワクチンが宿主に直接導入され、前記微生物に挿入された外来遺伝子のタンパク
質が宿主の生体内で発現される。
この様なワクチンは、学術雑誌の記事(M.Eloit et al.,Journal of Genera
l Virology(1990),71,2425-2431)に、あるいは国際出願WO−A−91,
00107号公報に記載されている。後者の公報の方が、組換えサブユニット生
ワクチンを使ってヒトまたは動物に免疫応答させる方法について、より正確な記
載がなされている。ただし、それはHIV逆転写酵素(HIVRT)をコードす
るベクターからなる別なワクチンと組み合わせる必要があるものである。
これら2種のワクチンはそれぞれ別々に、数日から数週間の間隔をおいて注射
される。HIVRTワクチンは、油中水(W/O)型エマルジョン、無機塩類、
ポリヌクレオチドまたはバクテリア起源の天然物のようなアジュバントと組み合
わせられる。HIVRTワクチンは、組換えサブユニット生ワクチンの免疫促進
剤として有用である。
組換えサブユニット生ワクチンを用いることで、組換えサブユニット非生ワク
チンの欠点を部分的に克服できる。しかしながら、この場合には組換えウイルス
のような組換え微生物を大量かつ高濃度で注射する必要がある。
しかしこの方法さえも、得られる免疫応答はいまだ不十分なままにとどまる。
こういった短所を回避するために、前出の国際出願WO−A−91,00107
号公報で推奨されているように、組換えサブユニットワクチンに加えて、免疫促
進剤として作用する他のワクチンを注射することが必要であると考えられている
。
本発明は、この点において上記欠点が克服された組換えサブユニット生ワクチ
ンよりなる。
驚くべきことに、本発明はさらに、エンベロープを有するウイルスの少なくと
も1つの抗原を発現する組換えウイルス生体のような微生物生体に対して、多量
の油成分を直接組み合わせることをも可能にする。
本発明は、新規な組換え生ワクチン組成物であって、(i)少なくとも1種類
の水相および(ii)少なくとも1種類の油成分を含有する油相を含む、注射可能
なエマルジョンと組み合
わされた、少なくとも1種類の組換えサブユニット生ワクチンを含むことを特徴
とする生ワクチン組成物に関する。
より具体的には、本発明のワクチンは、組換えベクターとしての組換えウイル
スを含有する組換えサブユニット生ワクチンである。このウイルスはエンベロー
プを持たない方が有利であり、特に、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、カ
ナリアポックスウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスから選ぶことが
できる。
本発明の組換えワクチンはまた、油分と、水分と、適切な場合は乳化系と、好
ましくはエンベロープを有するウイルスの複製に不可欠ではない部分に挿入され
た、上記エンベロープを有するウイルスもしくは病原微生物に対する抗体の合成
及び/または防御機能を誘発する抗原サブユニットをコードする配列がゲノム中
に含まれるエンベロープを持たないウイルス生体とに基づく、注射可能なエマル
ジョンとの組み合わせによって特徴づけられる。抗原サブユニットは、例えば、
エンベロープを有するウイルス、細菌もしくは寄生虫のような微生物の感染に対
して免疫原及び/または防御的機能となるタンパク質、糖タンパク質、ペプチド
またはペプチド分画であり得る。
上記のエマルジョンは、水中油(O/W)型、油中水(W/O)型、または水
中油中水(W/O/W)型であり得る。
本発明の有用性は、液状で、免疫原性を有する、安定な組成物を油性のエマル
ジョンとして得られることにあり、該組成物は驚くべきことに、同じ免疫原の水
性の組成物に比べて
免疫原の量を低減することが可能である。
本発明のワクチン組成物に用いることができる、エマルジョンの油相を構成す
る油分は、毒性がないか、もしくは毒性が低いことが周知であるような、天然も
しくは合成の鉱物油または植物、動物もしくは合成起源の非鉱物油から選択され
る液状油が好ましい。
それらは、貯蔵温度(+4℃)において液体であるか、さもなければ、少なく
ともその温度で液状エマルジョンを形成するものでなければならない。
好ましくは16より大きい炭素原子数を有する直鎖の鉱物油が選択され、芳香
族化合物は除かれる。
公知の例を挙げれば、MARCOL−52(フランス、エッソ製)とDRAK
EOL−6VR(合衆国、ペレンコ製)である。
また、ポリイソブタンまたはポリイソプロペンのような合成油も用いることが
できる。
植物油の中では、生分解性で、オレイン酸含有量の高い不飽和油が選択される
。例えば、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、大豆油及び小麦胚芽油である。
動物油としては、耐性及び免疫学的効率について同様の水準が要求される。動
物油の例としては、スクアレン、スクアランおよび鯨ロウ油が挙げられる。
上記の油脂類の混合物は、本発明の枠組みの中で有利に用いられる。
通常は、本発明のワクチン組成物は、さらに乳化系をも含
有する。
それは、液状で、安定な油中水(W/O)型、水中油(O/W)型、または水
中油中水(W/O/W)型の注射可能な製剤を与えるために適用されなければな
らない。
それは、混合物において、親油性または親水性がHLB(親水親油平衡)数で
1から19の間の値で特徴づけられる1種またはそれ以上の種類の界面活性剤に
より作られる。
乳化剤は、好ましくは、20℃で液体の脂肪酸とマンニトール、グルコース、
スクロースなどの糖もしくはグリセロールとの縮合により得られたエステル、ま
たはその誘導体である。
飽和脂肪酸は、少なくとも炭素原子数を16以上持つものが好ましく、特にオ
レイン酸、リノレン酸、リシノレン酸、ケトステアリン酸が好ましい。
マンニトールエステルまたはマンニトールエステルの誘導体が好ましく用いら
れる。マンニトールエステルとしては、1−4位または2−6位で環化する多水
酸化された炭素鎖の脱水で得られるオレイン酸マンニトールが挙げられる。
上記エステル誘導体は、アルコール、ポリオール、エチレンオキサイド、プロ
ピレンオキサイド、カルボン酸、アミン、アミドのような親水性官能基をグラフ
トすることにより、その親水性を改良したエステルであり得る。
使用する全ての乳化剤は、注射剤中に用いる上で薬学的に許容可能でなければ
ならず、特に、重金属を含有せず、酸価および過酸化物が極めて低いものでなけ
ればならない。
それらは、例えば、S.S.BERLINによる報告(Annals of allergy,1
962,20,473)に記載されている安全性試験の基準をも充足していることが望ま
しい。
使用される乳化剤は、上記の選択された油と共に透明かつ安定で均一な油相を
形成し、各注射剤に適した水性溶媒と共に乳化される。
表1は、鉱物油または非鉱物油別の(即ち、いわば油の代謝的性質)、得られ
たワクチンエマルジョンのタイプ、およびこれらの油の基本的特徴を要約したも
のである。
本発明のワクチン組成物は、ヒトまたは動物、特にブタ、ヒツジ、ウシ、アミ
ア類(Amidae)、ネコ類(Feli−dae)、家禽類及び魚類に接種す
ることを意図したワクチンの製造に用い得る。
本発明の組成物における組換えサブユニット生ワクチンの濃度は、接種される
動物の性質及びワクチンの性質に応じて様々に異なり得る。この濃度は、一般的
に、1ml当り102から1015の微生物個体数もしくはウイルス個体数であり、好
ましくは、1ml当り105から1012の微生物個体数もしくはウイルス個体数であ
る。
本発明のワクチン組成物のヒトまたは動物への注射容量は、ワクチンの性質と
共に接種対象の重量にも依存する。これは、10μlから5mlの範囲であれば
よい。ヒトまたは体重がヒトに近い動物(例えば霊長類)に対しては、注射容量
は0.25から2mlの範囲であればよい。
通常、本発明のワクチン組成物中の抗原量は、1μg/m
l未満であり、好ましくは0.3μg/ml未満である。ただし、この抗原量は
、上記組成物の注射に先立って、組換えサブユニット生ワクチンの外来遺伝子の
量として表されたものである。実際のところ、本発明によれば、免疫現象を誘発
する抗原は、接種対象であるヒトまたは動物に注射された後に、上記ワクチンに
よって本質的に生体内で発現される。
本発明のワクチン組成物は、例えばヨーロッパ特許EP480981号公報お
よびヨーロッパ特許EP480982号公報に記載の方法にしたがうなどして、
様々な従来の方法により調製できる。本発明の組成物を製造するための方法は、
組換え生ワクチンを水溶液中で、鉱物油もしくは非鉱物油または鉱物油と非鉱物
油との混合物と共に、油中水(W/O)型、水中油(O/W)型、または水中油
中水(W/O/W)型のエマルジョンの形態に乳化することよりなる。油は、ア
ブリジンのような細胞免疫のためのアジュバントと組み合わせても良い。
エマルジョンにおける、組み合わされた油分および、場合によっては乳化系を
も含む油相とまたは活性成分を含有する水相との重量比は、それぞれ広い範囲を
とり、95から5%の水相に対して5から95%の油相であり、特に75から2
5%の水相に対して25から75%の油相である。
油相と水相の混合は、20℃から40℃の温度範囲で撹拌により、従来の手法
にしたがって為される。得られた製剤はすべて安定でなければならない。即ち、
エマルジョン製には相分離があってはならず、このことは、この種の製品の普通
の貯蔵条件の下では、抗原相もしくは油相の離脱がないことを意味する。本発明
の組成物は、4℃で12か月以上の保存安定性を有し得る。
さらに、このワクチン製剤は、ブルックフィールド型粘度測定器により組成物
中でローターを回転させて計測された粘度が25℃で200mPa・s未満、好
ましくは300 mPa・s未満であるような液体である。
エマルジョン連続相の油性または水性の性質は、1cm当りのマイクロジーメ
ンス単位で計測される伝導度により特徴づけられる。
室温で得られる油性連続相の伝導度の値は、1cm当り約20マイクロジーメ
ンス未満である。
前期ワクチンにおけるコード配列が、例えばHIV1もしくはHIV2のよう
なHIVウイルスまたはFIVウイルスの抗原サブユニットをコードし、この抗
原サブユニットの発現が上記のウイルスに対する抗体の合成および/または防御
的作用を誘発する組換え生ワクチンもまた、本発明の一部をなす。
下記の例において、用いられるワクチン組成物は、シュードラビーズウイルス
(PRV)の糖タンパク質のgp50を発現する不完全アデノウイルスである。
組換えアデノウイルスAd−gp50の調製、細胞培養における抗原gp50の
発現、並びにAd−gp50のワクチン接種によるネズミおよびウサギの免疫反
応および防御反応は、刊行物(M.Eloit et al.,Journal of General Virology
(1990),71:2425-
2431)に記載されている。
その概略を説明すると、タイプ5のアデノウイルス(Ad−5)により形質転
換されたヒト胎生由来のセルライン293(Graham et al.,1977,Journal of
General Virology,36:59-72参照)が、上記の組換えアデノウイルスの形質転
換、増幅および滴定に用いられた。
Ad−gp50の調製には、ウイルスの増殖に影響のないE3領域に欠失が存
在するAd−5が用いられる。
Ad−gp50は、E1A遺伝子を補ったセルライン又は補わないセルライン
、特にE1A遺伝子を欠失したHela細胞において、高レベルのgp50を発
現する。
著者らは、PRVの感染による攻撃誘発後に、マウスまたはウサギに与えられ
る防御反応が小さいにもかかわらず、ELISA試験で測定された、高濃度のA
d−gp50に対する抗体応答は顕著であることに注目している。
本発明の有用性は、このタイプの組換え生ワクチンを上述の乳化剤と組み合わ
された油分中にエマルジョン化することによって、一方では、注射されるウイル
ス生体の投与量を減らしつつ免疫力と防御力を増強させ、他方では、特にIL2
およびIL6に代表されるインターロイキンのようなサイトカイン類の合成能を
増幅することにある。
下記の別の例でのオージェスキーウイルスとは、PRVと同じものである。
例1(比較例):アジュバントを用いない場合の抗体の誘発およびワクチン接 種の効果
ワクチンは、上記の組換えアデノウイルスAd−gp50からなる。
このワクチン組成物は、第0日に、C1、C2およびC3の3種のAd−gp
50の濃度で、1グループ当たり10個体からなる3グループに分けたOF1マ
ウスの皮下に、1個体当たり100μlの割合で接種される。用いられた3種の
ワクチン濃縮物は、以下のように定義される。
‐109ウイルス/ml,すなわち 108TCID50/マウス(C1)
‐3xl08ウイルス/ml,すなわち 107.4TCID/50マウス(C2)
‐3x1O7ウイルス/ml,すなわち 106.4TCID/50マウス(C3)
ワクチン製剤の効果を評価するための手順は、図1に記載されている。
ワクチン製剤により誘発された抗gp50抗体の定量のために、2週間後に血
清試料が集められる。
ワクチンの効果を評価するために、予備実験で決定された20 LD50濃度
の有毒なオージェスキーウイルス製剤の存在下で攻撃誘発試験が実施される。
上記濃度は、ワクチン接種されないマウスが100%死亡する濃度に相当する
。
死亡は、240時間に亘って観察する。これ以上の時間では、マウスはすべて
、攻撃への抵抗力を獲得する。次の2変数が確認される。
一つは、実験終了時に観察される、百分率表示の生存レベルである。
もう一つは、死亡の動態(カイネティックス)である。
結果
‐抗gp50抗体の測定:
血清試料は、免疫付与の2週間後に採取された。抗gp50抗体の測定は、
エロワらの記載による技術(Eloit et al.coll.,Veterinary Record,1989,1
24:91-94.)を用いたELISAで行う。
得られた結果は図2に示す。それによれば、
‐C1、C2およびC3は、次の3種類のAd−gp50濃度を示す:109、3
x108および3x107ウイルス/ml;
‐力価はy軸に示され、バックグラウンドノイズより大きなOD(吸光度)を
得るために必要な希釈度が示されている;
‐Tは、ワクチン接種されていない絶対標準を示す。
アジュバントが無い場合、抗体の誘発は109Ad−gp50/ml濃度のもの
のみであり、3x108および3x107Ad−gp50/ml濃度のものでは、抗gp5
0抗体は検出されなかった。
‐有毒ウイルスによる攻撃誘発
オージェスキーウイルスによる攻撃への耐性は、C1、C2およびC3の3
種類のウイルス濃度において評価される。攻撃誘発後の生存レベルは図3に示さ
れる。生存百分率は、y軸に表される。
攻撃誘発に対する不完全な(50%)防御が、C1(109
Ad−gp50/ml)の存在の下で観察される。
C2(3x108/ml)およびC3(3x107/ml)では、ワクチン接種されてい
ない絶対標準と比べて目立った防御は観察されない。ワクチン接種されていない
絶対標準の死亡率は100%である。
図4は、アジュバントなしで免疫感作した後の、オージェスキーウイルス感染
攻撃に対する生残の動態を表す。
生存率は、百分率でy−軸上に表わされている。
120時間以前に、対照試料ならびにC2およびC3濃度について死亡が観察
されることが注目される。
従って、アジュバントが無い場合、109Ad−gp50/ml未満の濃度の組
換えアデノウイルスは、オージェスキーウイルスの感染による攻撃に対して、抗
gp50抗体の誘発もいかなる防御の誘発もなし得ないことがわかる。濃度が109
Ad−gp50/mlのときには、わずかに不十分な防御反応が得られる。‐例2:W/O、O/W、W/O/W型の油性アジュバントの存在下でのオージ ェスキーウイルスの攻撃に対する免疫反応および防御の誘発:
下記の表1に記載の6種類のアジュバントについて、例1に示した伝染性のオ
ージェスキーウイルスによる攻撃後の抗gp50抗体の誘発および抵抗力の誘発
をする潜在能力を試験した。ワクチン製剤は、以下に示す処方で、アジュバント
と例1で定義したC1、C2およびC3の濃度の組換えウイルスとを、シリンジ
を用いて混合して作られる。
1)W/O型ワクチン製剤
製剤No.1
25%アジュバント(油+乳化系)(1)
75%免疫原組成物
(1)=モンタニド(Montanide)ISA25
製剤No.2
25%アジュバント(油+乳化系+アブリジン)(2)
75%免疫原組成物
(2)=モンタニドISA25A
製剤No.3
20%アジュバント(油+乳化系)(3)
80%免疫原組成物
(3)モンタニドISA28
2)W/O/W型ワクチン製剤
製剤No.4
50%アジュバント(油十乳化系)(4)
50%免疫原組成物
(4)モンタニドISA206
3)W/O型ワクチン製剤
製剤No.5
55%アジュバント(油+乳化系)(5)
45%免疫原組成物
(5)モンタニドISA50
製剤No.6
70%アジュバント(油+乳化系)(6)
30%免疫原組成物
(6)モンタニドISA708
上記のモンタニドISAはすべて、SEPPIC社により製造販売されている
。それらに含まれる乳化剤は、マンニトールエステル誘導体である。
これらの製剤は以下のものと比較される:
‐例1に記載の、アジュバントのないワクチン製剤(T1)
‐2つのグループの標準試料、すなわち1つはワクチン接種されていないマウ
ス(T2)、もう1つはAd−gp50を含まないモンタニドISA50アジュ
バントを注射されたマウス(T3)
抗gp50抗体の測定、生存レベルの百分率の計測および死亡の動態の計測は
、上記例1記載の方法にしたがって行われる。
得られた結果は、下記の表2および図5、6、7、8、9、10に要約される
。なお、そこでのC1、C2およびC3の意味は、例1における意味と同じであ
る。
a) W/O型エマルジョンでの結果
‐抗gp50抗体の測定
表2は、抗gp50抗体のレベルが、アジュバントなしの対照試料並びにモ
ンタニドISA25、モンタニドISA25に細胞免疫の刺激剤であるアブリジ
ンを付け加えたモンタニドISA25A、およびモンタニドISA28のそれぞ
れにみられるよりも著しく大きいことを示す。
‐有毒ウイルスによる攻撃
図5、6、7は、対照試料T2と比較して、3種類のワクチン濃度での生存
百分率を時間の関数として示している。これらは、モンタニドISA25(図5
)、モンタニドISA25A(図6)およびモンタニドISA28(図7)につ
いてのものである。
アジュバントの効果は、アジュバントなしで得られた結果と比較して図4に示
される。
b) W/O/W型エマルジョンでの結果:
‐抗gp50抗体の測定
表2に表された結果は、モンタニドISA206の存在の下で得られた抗g
p50抗体のレベルが、試験された3種類のgp50の濃度について、対照試料
T2で得られたレベルよりも著しく大きいことを明瞭に示している。
‐有毒ウイルスによる攻撃誘発
図8は、Ad−gp50と組み合わせた鉱物油モンタニドISA206によ
る攻撃誘発後に得られた結果を示す。
70%および50%の生存レベルが、Ad−gp50の最
低濃度で得られた。
c)W/O型エマルジョンでの結果
‐抗gp50抗体の測定
表2は、3x108 Ad−gp50/mlの濃度において、有意に検出可能な
抗体のレベルを示す。一方、同じ濃度でも、アジュバントの不存在下では抗gp
50抗体の検出は不可能であることを示す。
‐有毒ウイルスによる攻撃誘発
モンタニドISA50(鉱物油)およびモンタニドISA708(鉱物油)
により得られた結果は、それぞれ図9および図10に示されている。
Ad−gp50のすべての濃度において、モンタニドISA50では60%を
超える生存レベルが、またモンタニドISA708では50%を超える生存レベ
ルが得られた。
本発明では、アジュバントが存在しないときは、C2およびC3の濃度での生
存レベルは10%であることが思い起こされる(図4参照)。
表2はそれ故、本発明のアジュバントの存在下における抗gp50抗体レベル
は、油性アジュバントの不存在下で得られる抗体レベルよりもはるかに大きいこ
とを明瞭に示している。
図4から図10は、本発明の油性アジュバントを欠くにもかかわらず、109A
d−gp50/mlの存在下では攻撃誘発に対して部分的な防御(50%)が見
られ、3x108および3x107Ad−gp50/mlの存在下では防御が欠如するこ
と(10%)を示す。(図4参照)。
モンタニドISAの使用により、最大濃度(109Ad−gp50/ml)での
100%の防御を初め、90%(3x108Ad−gp50/ml)および60%(3
x107Ad−gp50/ml)の防御レベルを得ることが可能となる。
この研究は全体として、発現された遺伝子に対して特異的な抗体レベルおよび
感染媒体に対する防御レベルを著しく向上できる組換えサブユニット生ワクチン
において、本発明による油性アジュバントを用いることの有用性を示し得るもの
である。
最初のワクチン接種において、3つの重要な結果が得られる。
試験された有効なアジュバント含有ワクチンについて、結果として以下のこと
がいい得る。
‐W/O型ワクチン(モンタニドISA50およびISA708):
*これらは、109および3x108Ad−gp50/mlの濃度では高い抗体レベ
ルを誘発するが、3x107Ad−gp50/mlの濃度では、抗体レベルを検出で
きない。
*これらは、試験された3種類の濃度において、50%を超えるレベルで伝
染性オージェスキーウイルスによる攻撃誘発に対する防御を達成する。
以上より、この場合は、生存レベルと抗gp50抗体の誘発との間に厳密な相
関がみられない。
この現象は、以下のことと関連しているかも知れない:
‐使用したELISA測定法によっては検出できないイムノグロブリンのクラ
スが極めて高度に誘発されている(IgM,IgA,IgE)。
‐および/または細胞性免疫が誘発されている。
‐W/O/W型ワクチン(モンタニドISA206):
*これらは、試験された3種類の濃度のAd−gp50(109/ml、3x108
/mlおよび3x107/ml)について極めて高いレベルの抗体を誘発する。
*これらは、試験された3種類の濃度について、伝染性のオージェスキーウ
イルスに対して50%を超えるレベルの防御を達成する。
‐モンタニドISA25およびISA28によるO/W型ワクチン
*これらは、109および3x108Ad−gp50/mlの濃度において、特異的
な抗gp50抗体を高いレベルで誘発する。一方、モンタニドISA28の存在
の下では、最も低いAd−gp50濃度(3x107/ml)でもやはり抗gp50
抗体の存在を検出できる。
*これらは、伝染性のオージェスキーウイルスに対して、モンタニドISA
28では、40から55%のレベルでの防御を達成する。
しかしながら、このタイプのワクチン(O/W型)は、W/O型またはW/O
/W型ワクチンに比べて全体的に効果が小さいことは明らかである。
‐細胞性免疫アジュバント併用のO/W型ワクチン。
モンタニドISA25へのアブリジンタイプにアジュバントを付加すること
により、最高濃度のAd−gp50濃度(109/ml)による攻撃誘発に対して
も、大量の抗gp50抗体を誘発することなく、100%の防御を得ることがで
きる。
‐局所反応の観察:
マクロ的な観察では、注射部位に局所反応も肉芽腫も見られない。例3 抗体およびインターロイキンの合成の誘発
表1に記載の6種類のアジュバントについて、インターロイキンIL2の合成
を誘発する能力を試験した。
上記のアジュバントを含有するワクチン組成物が、それぞれ10個体のマウス
からなる異なるグループに注射された。
それぞれのグループは、6種類のアジュバントのひとつと、例1において定義
したC1、C2またはC3濃度のAd−gp50とを含有するワクチン組成物に
よりワクチン接種された。
比較の対照として、本発明のアジュバントもしくはAd−gp50のいずれか
を含まない組成物、またはアジュバントおよびAd−gp50のいずれをも含ま
ない組成物を10個体のマウスからなるグループに注射した。
すべての場合について、それぞれのマウスは100μlの組成物で処理された
。
ワクチン接種の14日後に得られた血清IL2の力価は、下記の表3に示され
る。この力価は、ゲンザイム社(Genzyme corp)から販売されているELISA
技術で測定された。
得られた結果から明らかなように、IL2の合成は、本発明に従って、Ad−
gp50と組み合わせられたアジュバントにより強い刺激を受ける。例4
表1に記載のアジュバントであるモンタニドISA25、モンタニドISA2
06およびモンタニド50について、インターロイキンIL6の合成を誘発する
能力が試験された。
上記アジュバントを含有するワクチン組成物は、それぞれ10個体のハツカネ
ズミからなる異なるグループに注射された。
それぞれのグループは、上記のアジュバントのひとつと、例1でC1、C2およ
びC3として定義された濃度のAd−gp50とを含有するワクチン組成物で接
種された。
比較のために、10個体のマウスからなる異なるグループが、本発明のアジュ
バントもしくはAd−gp50のいずれかを含まない組成物またはアジュバント
およびAd−gp50のいずれをも含まない組成物を注射することにより治療さ
れた。すべての場合において、100μlの組成物がそれぞれのマウスに注射さ
れた。注射14日後に得られた血清IL6の力価は、下記の表4に表されている
。このIL6の力価は、エンドジェン社(Endogen)から販売されている従来の
ELISA測定法により計測された。
上記で得られた結果から明らかなように、IL6の合成は、Ad−gp50と
組み合わせられた、モンタニドISA206アジュバントを含有するW/O/W
型エマルジョンであるワクチン組成物により刺激される。
例5
表1に記載された6種類のアジュバントについて、4種類の異なるサブクラス
の抗gp50抗体、すなわちIgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3
の産生を誘発する能力を試験した。
ワクチン組成物は、それぞれ10個体のマウスからなるグループに注射された
。それぞれのマウスのグループは、6種のアジュバントのひとつ並びに、例1で
C1、C2およびC3として定義された濃度のAd−gp50を含有するワクチン
組成物で接種された。
比較のために、10個体のマウスからなる異なるグループが、本発明のアジュ
バントもしくはAd−gp50のいずれかを欠いた組成物、またはアジュバント
およびAd−gp50のいずれも含まない組成物の注射によって治療された。
すべての場合において、マウスは、それぞれ100μlの本発明の組成物また
は比較例の組成物の注射により治療された。
上記組成物の注射14日後に得られた血清の力価(アジュバントを含むがAd
−gp50を含まない組成物による比較対照品よりも吸着度が大きくなる最終希
釈で示される)は、下記の表5に表される。この血清の力価は、従来のELIS
A測定法により測定された。
結果から明らかなように、本発明のワクチン組成物は、4種類のサブクラスの
抗gp50抗体の合成を促す。
いうまでもなく、上記の例は例示のために記載したものでる。本発明は、乳化
系と組み合わせられた、モンタニドISAの物理化学的特性を有する鉱物油、非
鉱物油もしくは(鉱物油+非鉱物油の)混合油のいずれかを含み、かつ組換えワ
クチンを含有する水溶液とのエマルジョン化が可能であり、前記ワクチンにおい
て、いずれかの病原体の免疫原性のタンパク質またはペプチドは油性エマルジョ
ンに適合した複製可能なベクターによって発現されるような、あらゆる組成物に
も関するものである。
【手続補正書】特許法第184条の8
【提出日】1995年3月6日
【補正内容】
請求の範囲
1.組換えサブユニット生ワクチン組成物であって、(i)少なくとも1種類
の水相および(ii)少なくとも1種類の油成分からなる油相を有する注射可能な
エマルジョンと組み合わされた、少なくとも1種類の組換えサブユニット生ワク
チンを含有することを特徴とする生ワクチン組成物。
2.前記組換えサブユニット生ワクチンが組換えウイルス、好ましくはエンベ
ロープを持たないウイルスからなる組換えベクターを有することを特徴とする請
求項1に記載の組成物。
3.前記組換えウイルスがアデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポ
ックスウイルス、ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスから選ばれることを
特徴とする請求項2に記載の組成物。
4.前記組換えウイルスがアデノウイルスであることを特徴とする請求項2ま
たは3に記載の組成物。
5.前記組換えウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする
請求項2または3に記載の組成物。
6.前記組換えウイルスがバキュロウイルスウイルスであることを特徴とする
請求項2または3に記載の組成物。
7.前記油相に乳化系が含まれることを特徴とする請求項1ないし6のいずれ
か1項に記載の組成物。
8.前記エマルジョンが水中油中水(W/O/W)型または油中水(W/O)
型であることを特徴とする請求項1ないし7のいずれか1項に記載の組成物。
9.エンベロープを有するウイルスまたは病原微生物に対
する生ワクチン組成物であって、水と、少なくとも1種類の油および適切であれ
ば乳化系を含む油相と、エンベロープを有するウイルスまたは病原微生物に対す
る抗体の産生および/または防御効果を誘発する抗原サブユニットをコードする
配列がゲノム中に含まれるウイルス生体の組換えベクターからなる組換えサブユ
ニット生ワクチンとを基本成分とする、注射可能なエマルジョンとの組み合わせ
であることを特徴とする生ワクチン組成物。
10.前記ウイルスベクターがエンベロープを持たないウイルスであることを
特徴とする請求項9または10に記載の組成物。
11.前記配列がHIV1またはHIV2ウイルスのようなHIVウイルスに
対する防御効果を誘発する抗原サブユニットをコードすることを特徴とする請求
項9または10のいずれか1項に記載の組成物。
12.前記配列がFIVウイルスに対する防御効果を誘発する抗原サブユニッ
トをコードすることを特徴とする請求項9または10のいずれか1項に記載の組
成物。
13.前記配列がオージェスキーウイルスに対する防御効果を誘発する抗原サ
ブユニットをコードすることを特徴とする請求項9または10のいずれか1項に
記載の組成物。
14.ウイルスベクターのゲノムに含まれる配列が、オージェスキーウイルス
の糖タンパク質であるgp50をコードする配列であり、かつオージェスキーウ
イルスの感染に対して防御的であることを特徴とする請求項13に記載の組成物
。
15.前記油が鉱物性または非鉱物性であることを特徴とする請求項1ないし
14のいずれか1項に記載の組成物。
16.4℃において12か月以上の安定性を有することおよび粘性が25℃に
おいて300ミリパスカル・秒未満であることを特徴とする請求項1ないし15
のいずれか1項に記載の組成物。
17.油分および必要な場合はさらに乳化系をも含む油相と、抗原または活性
成分を含有する水相との重量比がそれぞれ、95〜5%の水相に対して5〜95
%の油相、特に75〜25%の水相に対して25〜75%の油相の範囲であるこ
とを特徴とする請求項1ないし16のいずれか1項に記載の組成物。
18.前記油相が、(i)20℃で液体の脂肪酸と糖またはグリセロールとの
縮合により得られたエステル、および/または(ii)そのエステルの誘導体から
なる乳化系を含むことを特徴とする請求項1ないし17のいずれか1項に記載の
組成物。
19.前記糖がマンニトールであることを特徴とする請求項18に記載の組成
物。
20.請求項1ないし19のいずれか1項に記載の組換え生ワクチン組成物の
製造方法であって、組換え生ワクチンの水溶液を、鉱物油もしくは非鉱物油、ま
たは鉱物油と非鉱物油との混合物とともに、油中水(W/O)型、水中油(O/
W)型、または水中油中水(W/O/W)型のエマルジョン
に乳化する工程を具備することを特徴とする方法。
21.前記鉱物油もしくは非鉱物油がアブリジンのような細胞性免疫アジュバ
ントと組み合わされることを特徴とする請求項20に記載の製造方法。
22.ヒトまたは動物を対象としたワクチンの製造における、請求項1ないし
19のいずれか1項に記載の組成物の使用。
23.特にインターロイキンであるサイトカインの産生を誘発することを目的
としたワクチンの製造における、請求項1ないし19のいずれか1項に記載の組
成物の使用。
24.前記インターロイキンがIL2またはIL6であることを特徴とする請
求項23に記載の使用。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.組換えサブユニット生ワクチン組成物であって、(i)少なくとも1種類 の水相および(ii)少なくとも1種類の油成分からなる油相を有する注射可能な エマルジョンと組み合わされた、少なくとも1種類の組換えサブユニット生ワク チンを含有することを特徴とする生ワクチン組成物。 2.前記組換えサブユニット生ワクチンが組換えウイルス、好ましくはエンベ ロープを持たないウイルスからなる組換えベクターを有することを特徴とする請 求項1に記載の組成物。 3.前記組換えウイルスがアデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポ ックスウイルス、ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスから選ばれることを 特徴とする請求項2に記載の組成物。 4.前記組換えウイルスがアデノウイルスであることを特徴とする請求項2ま たは3に記載の組成物。 5.前記組換えウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする 請求項2または3に記載の組成物。 6.前記組換えウイルスがバキュロウイルスウイルスであることを特徴とする 請求項2または3に記載の組成物。 7.前記油相に乳化系が含まれることを特徴とする請求項1ないし6のいずれ か1項に記載の組成物。 8.前記エマルジョンが水中油中水(W/O/W)型または油中水(W/O) 型であることを特徴とする請求項1ないし7のいずれか1項に記載の組成物。 9.エンベロープを有するウイルスまたは病原微生物に対 する生ワクチン組成物であって、水と、少なくとも1種類の油および適切であれ ば乳化系を含む油相と、エンベロープを有するウイルスまたは病原微生物に対す る抗体の産生および/または防御効果を誘発する抗原サブユニットをコードする 配列がゲノム中に含まれるウイルス生体の組換えベクターからなる組換えサブユ ニット生ワクチンとを基本成分とする、注射可能なエマルジョンとの組み合わせ であることを特徴とする生ワクチン組成物。 10.前記ウイルスベクターがエンベロープを持たないウイルスであることを 特徴とする請求項9または10に記載の組成物。 11.前記配列がHIV1またはHIV2ウイルスのようなHIVウイルスに 対する防御効果を誘発する抗原サブユニットをコードすることを特徴とする請求 項9または10のいずれか1項に記載の組成物。 12.前記配列がFIVウイルスに対する防御効果を誘発する抗原サブユニッ トをコードすることを特徴とする請求項9または10のいずれか1項に記載の組 成物。 13.前記配列がオージェスキーウイルスに対する防御効果を誘発する抗原サ ブユニットをコードすることを特徴とする請求項9または10のいずれか1項に 記載の組成物。 14.ウイルスベクターのゲノムに含まれる配列が、オージェスキーウイルス の糖タンパク質であるgp50をコードする配列であり、かつオージェスキーウ イルスの感染に対して防御的であることを特徴とする請求項13に記載の組成物 。 15.前記油が鉱物性または非鉱物性であることを特徴とする請求項1ないし 14のいずれか1項に記載の組成物。 16.4℃において12か月以上の安定性を有することおよび粘性が25℃に おいて300ミリパスカル・秒未満であることを特徴とする請求項1ないし15 のいずれか1項に記載の組成物。 17.油分および必要な場合はさらに乳化系をも含む油相と、抗原または活性 成分を含有する水相との重量比がそれぞれ、95〜5%の水相に対して5〜95 %の油相、特に75〜25%の水相に対して25〜75%の油相の範囲であるこ とを特徴とする請求項1ないし16のいずれか1項に記載の組成物。 18.前記油相が、(i)20℃で液体の脂肪酸と糖またはグリセロールとの 縮合により得られたエステル、および/または(ii)そのエステルの誘導体から なる乳化系を含むことを特徴とする請求項1ないし17のいずれか1項に記載の 組成物。 19.前記糖がマンニトールであることを特徴とする請求項18に記載の組成 物。 20.組換え生ワクチン組成物の製造方法であって、組換え生ワクチンの水溶 液を、鉱物油もしくは非鉱物油、または鉱物油と非鉱物油との混合物とともに、 油中水(W/O)型、水中油(O/W)型、または水中油中水(W/O/W)型 のエマルジョンに乳化する工程を具備することを特徴とする方法。 21.前記鉱物油もしくは非鉱物油がアブリジンのような細胞性免疫アジュバ ントと組み合わされることを特徴とする請求項20に記載の製造方法。 22.ヒトまたは動物を対象としたワクチンの製造における、請求項1ないし 19のいずれか1項に記載の組成物の使用。 23.特にインターロイキンであるサイトカインの産生を誘発することを目的 としたワクチンの製造における請求項1ないし19のいずれか1項に記載の組成 物の使用。 24.前記インターロイキンがIL2またはIL6であることを特徴とする請 求項23に記載の使用。
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