TW201311297A - 膜囊封奈米粒子及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供奈米粒子、其使用及製備方法。本發明奈米粒子包含a)包含非細胞物質之內部核心；及b)包含來源於細胞之細胞膜或來源於病毒之膜之外部表面。亦提供包含本發明奈米粒子之藥劑傳遞系統或醫藥組合物。本發明更提供包含本發明奈米粒子之免疫原性組合物、及使用本發明免疫原性組合物引發免疫反應及治療或預防疾病或病狀，諸如贅瘤或癌症或與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀的方法。亦提供包含含有本發明之奈米粒子之免疫原性組合物的疫苗。

Description

膜囊封奈米粒子及使用方法 [相關申請案之交叉參考]
本申請案主張2011年6月2日申請之美國臨時申請案第61/492,626號之優先權，其整個內容以引用的方式併入本文中。
[關於聯邦資助研究之聲明]
本發明在NSF授予號CMMI 1031239下、在NIH授予號U54CA119335下及在DMR授予號1216461下在政府支持下進行。政府具有本發明中之某些權利。
本發明係關於傳遞經細胞膜囊封之合成奈米粒子物質，包括醫藥活性劑之方法及組成物。
長循環聚合奈米粒子具有顯著臨床影響，因為其有希望經由被動機制與主動機制兩者達成持續全身性傳遞及較佳靶向性(1-3)。已探究包括對粒子尺寸、表面、形狀及可撓性進行改進在內之不同方法來延長粒子在活體內之滯留時間(4-6)。用於奈米粒子隱身包覆層之當前最佳標準物為聚乙二醇(PEG)。採用PEG作為奈米粒子表面上之隱身部分已使得若干臨床產品獲得極大成功(2,3)，但新近觀察到抗PEG免疫反應引起對其生物相關性進 行進一步研究之興趣(7)。已提出諸如聚(羧基甜菜鹼)及聚(磺基甜菜鹼)之合成兩性離子性物質為PEG之替代物，因為其具有高度對抗非特異性蛋白質吸附之強烈水合作用(8,9)。此外，分子及細胞生物學之新近進展啟發科學家及奈米技術學家仿效作為天然長循環傳遞載具之紅血球(RBC)對奈米載體進行模型化。已利用RBC之性質，諸如其結構及表面蛋白質作為設計下一代傳遞平臺之設計提示(10-12)。
儘管已投入大量努力來消除合成奈米物質與生物實體之間的差異，但模擬RBC之傳遞載具對於生物醫學研究者而言仍然難以實現。一個主要挑戰在於難以使奈米粒子官能化成具有生物細胞之複雜表面化學。儘管新進在聚苯乙烯珠粒與免疫抑制性RBC膜蛋白質CD47共軛之後，在減少巨噬細胞對聚苯乙烯珠粒之吞噬方面取得極大進展(11)，但當前化學基生物共軛技術常導致蛋白質變性。此外，此等由下而上方法(bottom-up approach)大部分不足以在奈米級基材上再現複雜蛋白質組成。
因此，對用於傳遞合成奈米粒子物質之改良方法及組成物存在需要。本發明解決此項技術中之此等及其他相關需要。
本發明提供新穎奈米粒子及其使用及製備方法。更特定言之，本發明奈米粒子包含a)包含非細胞物質之內部 核心；及b)包含來源於細胞之細胞膜或來源於病毒之膜之外部表面。在某些實施例中，本發明奈米粒子之內部核心包含生物相容性物質及/或合成物質，包括(但不限於)聚(乳酸共乙醇酸)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內酯、聚離胺酸、聚麩胺酸及任何其他適合合成物質或其類似物。
在某些實施例中，本發明奈米粒子之外部表面包含來源於單細胞(例如細菌或真菌)或多細胞生物體(例如植物、動物、非人類哺乳動物、脊椎動物或人類)之細胞膜，其包含質膜或細胞內膜。在某些實施例中，本發明奈米粒子之外部表面包含天然存在之細胞或病毒膜及/或還包含合成膜。
在某些實施例中，本發明奈米粒子之外部表面之細胞膜來源於血球(例如紅血球(RBC)、白血球(WBC)或血小板)。在其他實施例中，外部表面之細胞膜來源於免疫細胞(例如巨噬細胞、單核細胞、B細胞或T細胞)、腫瘤或癌細胞及其他細胞，諸如上皮細胞、內皮細胞或神經細胞。在其他實施例中，外部表面之細胞膜來源於非終末分化細胞，諸如幹細胞，包括造血幹細胞、骨髓幹細胞、間質幹細胞、心臟幹細胞、神經幹細胞。非終末分化細胞可以多能(pluripotent)狀態自組織分離或可誘導變為多能。在其他實施例中，細胞膜來源於細胞組分或細胞器，包括(但不限於)外泌體(exosome)、分泌小泡、突觸小泡、內質網(ER)、高基氏體(Golgi apparatus)、粒線體、空泡或細胞核。
在某些實施例中，本發明更規定本發明奈米粒子包含可釋放裝載物(cargo)，其可位於奈米粒子內部或表面上之任何位置。用於使可釋放裝載物自本發明奈米粒子釋放之觸發條件包括(但不限於)使奈米粒子與目標細胞、組織、器官或個體之間接觸，或改變奈米粒子周圍之環境參數，諸如pH值、離子條件、溫度、壓力及其他物理或化學變化。在某些實施例中，可釋放裝載物包含一或多種治療劑、預防劑、診斷劑或標記劑、預後劑(例如成像標記)或其組合。在某些其他實施例中，可釋放裝載物為金屬粒子、聚合粒子、樹枝狀聚合物(dendrimer)粒子或無機粒子。
本發明奈米粒子可具有任何適合形狀。舉例而言，本發明奈米粒子及/或其內部核心可具有球形、正方形、矩形、三角形、圓盤形、類立方形、立方形、長方體形(立方體)、錐形、圓柱形、棱柱形、金字塔形、直角圓柱形及其他規則或不規則形狀。本發明奈米粒子可具有任何適合尺寸。
本發明更規定在某些實施例中，本發明奈米粒子之直徑為約10 nm至約10 μm。在某些實施例中，本發明奈米粒子之直徑為約50 nm至約500 nm。在其他實施例中，奈米粒子之直徑可為約10 nm、20 nm、30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、110 nm、120 nm、130 nm、140 nm、150 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm、1 μm、2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm、7 μm、8 μm、9 μm及10 μm、或約10 nm至約10 μm範圍內之任何適合子範圍，例如直徑為約50 nm至約150 nm。在某些實施例中，內部核心支撐外部表面。
本發明更規定本發明奈米粒子實質上缺乏細胞膜所來源之細胞之組分或病毒膜所來源之病毒之組分。舉例而言，就類型及/或量而言，本發明奈米粒子可缺乏細胞膜所來源之細胞之組分或病毒膜所來源之病毒之組分的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在某些其他實施例中，本發明之奈米粒子實質上維持細胞膜、來源於病毒之膜或細胞膜或病毒膜之組分的天然結構完整性或活性。細胞膜之結構完整性包括細胞膜、來源於病毒之膜或細胞膜或病毒膜之組分的一級、二級、三級或四級結構，且細胞膜之活性包括(但不限於)正常天然存在之細胞膜、來源於病毒之膜或細胞膜或病毒膜之組分將具有之結合活性、受體活性、信號傳導路徑活性及任何其他活性。在某些實施例中，本發明之奈米粒子具有生物相容性及/或生物可降解性。舉例而言，就類型及/或量而言，本發明奈米粒子可維持細胞膜、來源於病毒之膜或細胞膜或病毒膜之組分之天然結構完整性或活性的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在某些實施例中，本發明之奈米粒子包含來源於紅血 球之細胞質膜及包含聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)之內部核心，其中奈米粒子實質上缺乏血色素(hemoglobin)。舉例而言，就類型及/或量而言，本發明奈米粒子可缺乏質膜所來源之紅血球之血色素的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
該本發明奈米粒子之活體內血液循環半衰期為聚乙二醇(PEG)包覆之類似奈米粒子之半衰期的至少約2-5倍。在某些實施例中，該本發明奈米粒子之活體內血液循環半衰期為至少約5至約40小時或40小時以上。
在某些實施例中，本發明奈米粒子實質上缺乏對細胞膜所來源之物種或個體之免疫原性。舉例而言，就類型及/或量而言，本發明奈米粒子可缺乏對細胞膜所來源之物種或個體之免疫原性的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
本發明更提供一種包含本發明奈米粒子之藥劑傳遞系統及/或醫藥組成物。在某些實施例中，本發明之藥劑傳遞系統及/或醫藥組成物還包含可與本發明之奈米粒子一起或組合投與之一或多種其他活性成分及/或醫學上或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
本發明更提供一種使用本發明奈米粒子、包含其之藥劑傳遞系統或醫藥組成物治療及/或預防有需要之個體之疾病或病狀的方法。在某些實施例中，用於本發明方法之 奈米粒子之細胞膜來源於個體之相同物種之細胞或來源於個體之細胞。在某些實施例中，用於本發明方法之奈米粒子之細胞膜來源於個體之相同物種之紅血球且該紅血球具有個體之相同血型。在某些實施例中，經由任何適合投藥途徑投與奈米粒子、藥劑傳遞系統或醫藥組成物。舉例而言，奈米粒子、藥劑傳遞系統或醫藥組成物可經由經口、經鼻、吸入、非經腸、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、皮內、局部或直腸途徑投與。
在其他實施例中，經由藥劑傳遞系統投與奈米粒子。在其他實施例中，本發明方法還包含向有需要之個體投與另一活性成分或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。本發明方法更規定本發明之奈米粒子可全身性投與或向有需要之個體之目標部位投與。亦提供有效量之本發明奈米粒子用於製造用於治療或預防有需要之個體之疾病或病狀之藥劑的用途。
此外，本發明提供一種包含有效量之奈米粒子之免疫原性組成物，該奈米粒子包含含有非細胞物質之內部核心、及包含來源於細胞之細胞膜或質膜及抗原或半抗原之外部表面。亦提供包含本發明之免疫原性組成物之疫苗。本發明更提供一種使用本發明免疫原性組成物引發需要此引發之個體中對抗原或半抗原之免疫反應的方法，及使用包含免疫原性組成物之本發明疫苗針對抗原或半抗原保護個體之方法。在某些實施例中，免疫反應為T細胞或B細胞介導之免疫反應。亦提供有效量之本發明奈米粒子用於 製造針對抗原或半抗原之免疫原性組成物的用途、及有效量之免疫原性組成物用於製造針對抗原或半抗原保護個體之疫苗的用途。
本發明更提供一種製備本發明之奈米粒子之方法，其包含在施加外源能量下混合包含非細胞物質之奈米粒子內部核心與來源於細胞之細胞膜或來源於病毒之膜以形成奈米粒子。在某些實施例中，外源能量為機械能，例如藉由擠壓施加之機械能。在其他實施例中，外源能量為聲能，例如藉由音波處理施加之聲能。在其他實施例中，外源能量為熱能，例如藉由加熱施加之熱能。在其他實施例中，本發明方法還包含在施加外源能量下混合包含非細胞物質之奈米粒子內部核心與來源於細胞之天然存在之細胞膜或來源於病毒之天然存在之膜及合成膜以形成包含內部核心及包含細胞膜或病毒膜及合成膜之外部表面的奈米粒子。
本發明更提供一種贅瘤特異性免疫原性組成物，其包含有效量之包含含有非細胞物質之內部核心、及包含來源於贅瘤細胞之細胞膜之外部表面的奈米粒子，其中該細胞膜實質上保留其用於引發對贅瘤細胞之免疫反應的結構完整性。舉例而言，就類型及/或量而言，本發明奈米粒子可維持其用於引發對贅瘤細胞之免疫反應之結構完整性的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在某些實施例中，內部核心支撐此等奈米粒子之外部表面。在某些實施例中，此等奈米粒子之內部核心包含 PLGA且外部表面包含來源於贅瘤細胞之質膜。在其他實施例中，此等奈米粒子之外部表面包含天然存在之細胞膜或病毒膜且還包含合成膜。
本發明贅瘤特異性免疫原性組成物中所含之奈米粒子實質上缺乏細胞膜所來源之贅瘤細胞之組分。舉例而言，就類型及/或量而言，本發明奈米粒子可缺乏細胞膜所來源之贅瘤細胞之組分的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在某些實施例中，本發明贅瘤特異性免疫原性組成物中之奈米粒子之直徑為約10 nm至約10 μm。在某些實施例中，此奈米粒子之直徑為約50 nm至約500 nm。在某些實施例中，本發明贅瘤特異性免疫原性組成物中之奈米粒子還包含另一活性成分或可釋放裝載物。在其他實施例中，本發明贅瘤特異性免疫原性組成物還包含免疫原性佐劑或免疫增強劑。
本發明更提供一種包含贅瘤特異性免疫原性組成物之疫苗。亦提供使用本發明贅瘤特異性免疫原性組成物或疫苗治療或預防有需要之個體之贅瘤的方法。本發明更提供有效量之本發明奈米粒子用於製造用於針對贅瘤治療或預防個體之癌症或贅瘤特異性免疫原性組成物或疫苗的用途。
本發明更提供一種包含本發明奈米粒子之用於治療或預防與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀的醫藥組成物， 其中該醫藥組成物中所含之該奈米粒子包含含有非細胞物質之內部核心及包含來源於目標細胞(例如紅血球)之細胞膜或質膜之外部表面。在某些實施例中，插入目標細胞之細胞膜或質膜中之毒素為天然病理學機制之一部分，或奈米粒子之外部表面中之細胞膜或質膜實質上保留該毒素。在某些實施例中，毒素為細菌(例如金黃色葡萄球菌(S.aureus))、植物、真菌或動物毒素。
在某些實施例中，內部核心支撐外部表面，且奈米粒子之外部表面中之細胞膜實質上保留其用於實質上保留毒素之結構完整性。在某些其他實施例中，奈米粒子之外部表面包含天然存在之細胞膜或病毒膜且還包含添加至細胞膜中之合成膜或合成或天然存在之組分。在某些其他實施例中，該醫藥組成物中所含之奈米粒子具有生物相容性、生物可降解性，或包含合成物質。在某些其他實施例中，本發明之醫藥組成物還包含另一活性成分或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
亦提供使用本發明之奈米粒子以及包含此等奈米粒子之醫藥組成物治療或預防與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀的方法。本發明更提供有效量之包含奈米粒子之醫藥組成物用於製造用於治療或預防有需要之個體之與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀之藥劑的用途。
此外，本發明提供一種包含有效量之奈米粒子之免疫原性組成物，該奈米粒子包含含有非細胞物質之內部核心及包含來源於細胞之細胞膜或質膜及細胞膜插入毒素之外 部表面。亦提供包含本發明之免疫原性組成物之疫苗。本發明更提供一種使用本發明免疫原性組成物引發需要此引發之個體中對細胞膜插入毒素之免疫反應的方法，及使用包含免疫原性組成物之本發明疫苗針對細胞膜插入毒素保護個體之方法。在某些實施例中，免疫反應為T細胞或B細胞介導之免疫反應。亦提供有效量之本發明奈米粒子用於製造針對細胞膜插入毒素之免疫原性組成物的用途、及有效量之免疫原性組成物用於製造用於針對細胞膜插入毒素保護個體之疫苗的用途。
本發明涵蓋治療、預防、診斷及/或預後任何疾病、病症或生理學或病理學病狀，包括(但不限於)感染性疾病、寄生蟲病、贅瘤、血液及血液形成器官之疾病、涉及免疫機制之病症、內分泌疾病、營養疾病及代謝疾病、精神及行為病症、神經系統疾病、眼及附件之疾病、耳及乳突之疾病、循環系統疾病、呼吸系統疾病、消化系統疾病、皮膚及皮下組織之疾病、肌肉骨骼系統及結締組織之疾病、泌尿生殖系統、妊娠、分娩及產後之疾病、發生於周產期之病狀、先天畸形、變形、染色體異常、損傷、中毒、外部病因之結果及罹病及死亡之外部病因。
在一些實施例中，本發明奈米粒子、藥劑傳遞系統、醫藥組成物及方法可用於治療或預防表1中所列之例示性癌症及腫瘤、傳遞表2中所列之例示性癌症藥物、治療或預防表3中所列之例示性眼部疾病或病狀、傳遞表4中所列之例示性眼部藥物、治療或預防表5中所列之影響肺之 例示性疾病或病狀、傳遞表6中所列之例示性肺/呼吸道疾病藥物、治療或預防表7中所列之影響心臟之例示性疾病或病狀、或傳遞表8中所列之例示性心臟藥物。在一些實施例中，本發明奈米粒子、藥劑傳遞系統、醫藥組成物及方法可用於治療或預防表9中所列之例示性病狀。表1-9由此附於本說明書之結尾。
在一些實施例中，本發明奈米粒子、藥劑傳遞系統、醫藥組成物及方法可用於傳遞由美國食品及藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration)出版之Orange Book：Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations(當前截至2012年3月)中所列之例示性藥物、The Merck Index(一種美國出版物，印刷第14版，Whitehouse Station,N.J.,USA)及其線上版本(The Merck Index OnlineSM，末次位於網站上：2012年5月01日星期二)中所列之例示性藥物、及由美國食品及藥物管理局出版之Biologics Products & Establishments中所列之例示性藥物，且可用於治療或預防相應疾病及病症。
熟習此項技術者將瞭解下述圖式僅出於說明性目的。圖式不欲以任何方式限制本發明教示之範疇。
除非另外指示，否則本發明之實施將採用奈米技術、奈米工程改造、分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、免疫學及藥理學之習知技術， 其在此項技術之技能範圍內。此等技術充分說明於文獻中，諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編，1987，及定期更新)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人編，1994)；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，(Lippincott,Williams & Wilkins 2003)。
除非另外定義，否則本文中使用之所有技術及科學術語皆具有與由一般熟習本發明所屬技術者通常理解相同之含義。本文中提及之所有專利、申請案、公開申請案及其他公開案皆以全文引用的方式併入本文中。若此章節中闡述之定義與以引用的方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他公開案中闡述之定義相反或以其他方式不一致，則此章節中闡述之定義勝於以引用的方式併入本文中之定義。
為便於理解本發明，如下定義如本文所用之許多術語及縮寫：當引入本發明或其較佳實施例之要素時，冠詞「一(a/an)」及「該(the/said)」欲意謂存在一或多個要素。術語「包含」、「包括」及「具有」意欲具有包括性且意謂可能存在除所列要素以外之其他要素。
術語「及/或」在用於一列兩個或兩個以上項目時意謂任一所列項目可單獨採用或與任一或多個所列項目組合採用。舉例而言，表述「A及/或B」欲意謂A及B中之任一者或兩者，亦即單獨A、單獨B或A與B組合。表述「A、B及/或C」欲意謂單獨A、單獨B、單獨C、A與B組合、A與C組合、B與C組合、或A、B及C組合。
細胞膜：如本文所用之術語「細胞膜」係指細胞或新生(emergent)病毒粒子內或周圍之封閉或分隔結構、充當選擇性障壁之生物膜。細胞膜可選擇性滲透離子及有機分子且控制細胞內外物質之移動。細胞膜包含磷脂單層或雙層，且視情況締合蛋白質及碳水化合物。如本文所用，細胞膜係指自細胞或細胞器之天然存在之生物膜獲得之膜或來源於其之膜。如本文所用，術語「天然存在」係指事物存在於自然界中。如本文所用，術語「來源於其」係指對天然膜進行之任何後續修飾，諸如分離細胞膜、產生膜之部分或片段、自取自細胞或細胞器之膜移除某些組分(諸如脂質、蛋白質或碳水化合物)及/或添加某些組分至取自細胞或細胞器之膜中。膜可藉由任何適合方法自天然存在之膜獲得。舉例而言，膜可自細胞或病毒製備或分離且製備或分離之膜可與其他物質或材料組合以形成所得膜。在另一實例中，細胞或病毒可經重組工程改造以產生活體內併入其膜中之「非天然」物質，且細胞膜或病毒膜可自細胞或病毒製備或分離以形成所得膜。
在各種實施例中，覆蓋單層或多層奈米粒子中之任一者之細胞膜可進一步修飾以用其他脂質組分(諸如膽固醇、游離脂肪酸及磷脂)飽和或不飽和，亦可包括內源性或添加之蛋白質及碳水化合物，諸如細胞表面抗原。在此等情況下，過量其他脂質組分可添加至膜壁中，其將散佈直至膜壁中之濃度達到平衡，此可視奈米粒子環境而定。膜亦可包含可能增加或可能不增加奈米粒子之活性之其他藥劑。在其他實例中，諸如抗體及適體之官能基可添加至膜之外部表面以增強位點靶向性，諸如到達存在於癌細胞中之細胞表面抗原決定基。奈米粒子之膜亦可包含可為生物可降解之陽離子性奈米粒子之粒子，包括(但不限於)金、銀及合成奈米粒子。
合成或人工膜：如本文所用，術語「合成膜」或「人工膜」係指由有機物質(諸如聚合物及液體)以及無機物質產生之人造膜。廣泛多種合成膜在此項技術中為熟知的。
病毒膜：如本文所用，術語「來源於病毒之膜」係指覆蓋病毒之核酸或蛋白質衣殼，且通常含有來源於宿主細胞膜之部分(磷脂及蛋白質)之細胞膜蛋白質且包括一些病毒醣蛋白之病毒包膜。病毒包膜與宿主之膜融合，從而允許衣殼及病毒基因組進入並感染宿主。
奈米粒子：如本文所用之術語「奈米粒子」係指至少一維(例如高度、長度、寬度或直徑)介於約1 nm與約10 μm之間的奈米結構、粒子、小泡或其片段。對於全身 性使用，平均直徑為約50 nm至約500 nm、或100 nm至250 nm可較佳。術語「奈米結構」包括(但未必限於)粒子及經工程改造之特徵。粒子及經工程改造之特徵可具有例如規則或不規則形狀。此等粒子亦稱為奈米粒子。奈米粒子可由有機物質或其他物質構成，且可替代地實施成多孔粒子。奈米粒子之層可實施成呈單層之奈米粒子或具有奈米粒子聚集之層。如本文所用，奈米粒子由覆蓋有包含如本文所論述之膜之外部表面的內部核心組成。本發明涵蓋目前已知及以後開發之可用本文所述之膜包覆之任何奈米粒子。
醫藥活性：如本文所用之術語「醫藥活性」係指物質對活物(living matter)且特定言之對人體之細胞及組織之有益生物活性。「醫藥活性劑」或「藥物」為具有醫藥活性之物質且「醫藥活性成分」(API)為藥物中之醫藥活性物質。
醫藥學上可接受：如本文所用之術語「醫藥學上可接受」意謂除在動物中，且更特定言之人類及/或非人類哺乳動物中使用安全之其他調配物之外，亦由聯邦或州政府之管理機構核准或列於美國藥典(U.S.Pharmacopoeia)、其他通常公認之藥典中者。
醫藥學上可接受之鹽：如本文所用之術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明中之化合物(諸如多藥物共軛物)之酸加成鹽或鹼加成鹽。醫藥學上可接受之鹽為保留母體化合物之活性且對其所投與之個體及在投與其之情形下 不賦予任何有害或非所要影響的任何鹽。醫藥學上可接受之鹽可衍生自胺基酸，包括(但不限於)半胱胺酸。產生呈鹽形式之化合物之方法為熟習此項技術者所已知(參見例如Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use,Wiley-VCH；Verlag Helvetica Chimica Acta,Zürich,2002；Berge等人，J Pharm.Sci.66：1,1977)。在一些實施例中，「醫藥學上可接受之鹽」欲意謂本文呈現之化合物之游離酸或鹼的鹽，其無毒、可生物耐受或另外在生物學上適於向個體投與。大體參見Berge，等人，J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19。較佳醫藥學上可接受之鹽為具有藥理學有效性且適於與個體之組織接觸而無過度毒性、刺激或過敏反應之鹽。本文所述之化合物可具有酸性足夠之基團、鹼性足夠之基團、兩種類型之官能基、或各類型具有一個以上，且因此與許多無機或有機鹼、及無機及有機酸反應以形成醫藥學上可接受之鹽。
醫藥學上可接受之鹽之實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸單氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙鹽酸、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、丁二酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁炔-1,4-二酸鹽、己炔-1,6二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸 鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、磺酸鹽、甲基磺酸鹽、丙基磺酸鹽、苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、苯基乙酸鹽、苯基丙酸鹽、苯基丁酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、γ-羥基丁酸鹽、羥乙酸鹽、酒石酸鹽及杏仁酸鹽。
醫藥學上可接受之載劑：如本文所用之術語「醫藥學上可接受之載劑」係指與化合物(諸如多藥物共軛物)一起投與之賦形劑、稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑及/或媒劑。此等載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物；聚乙二醇；甘油；丙二醇或其他合成溶劑。抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；及調整張力之藥劑，諸如氯化鈉或右旋糖亦可為載劑。產生組成物與載劑之組合之方法為熟習此項技術者所已知。在一些實施例中，措辭「醫藥學上可接受之載劑」意欲包括與醫藥投藥相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。醫藥活性物質之此等介質及藥劑之使用在此項技術中為熟知的。參見例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，(Lippincott,Williams & Wilkins 2003)。除非任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容，否則涵蓋於組成物中之此使用。
磷脂：如本文所用之術語「磷脂」係指任何眾多脂質 含有二酸甘油酯、磷酸基及諸如膽鹼之簡單有機分子。磷脂之實例包括(但不限於)磷脂酸(磷脂酸酯)(PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂(cephalin))(PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂(lecithin))(PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、及磷酸肌醇，其包括(但不限於)磷脂醯肌醇(PI)、磷酸磷脂醯肌醇(PIP)、雙磷酸磷脂醯肌醇(PIP2)及三磷酸磷脂醯肌醇(PIP3)。PC之其他實例包括如此項技術中所定義之DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DRPC及DEPC。
治療有效量：如本文所用，術語「治療有效量」係指在鑒於特定個體之疾病或病狀之性質及嚴重性向彼個體投與時，將具有所要治療效果之彼等量，例如將治癒、預防、抑制或至少部分阻遏或部分預防目標疾病或病狀之量。更特定實施例包括在以下醫藥製備及投藥方法章節中。在一些實施例中，術語「治療有效量」或「有效量」係指在單獨或與另一治療劑組合向細胞、組織或個體投與時，有效預防或改善疾病或病狀(諸如感染)或疾病或病狀之進展之治療劑的量。治療有效劑量更指足以使得症狀改善，例如治療、治癒、預防或改善相關醫學病狀，或治療、治癒、預防或改善此等病狀之速率增加之治療劑的量。當應用於單獨投與之個別活性成分時，治療有效劑量係指彼單獨成分。當應用於組合時，治療有效劑量係指活性成分之產生治療效果的組合量，無論組合、連續或同時投與。
疫苗：能夠在患者中引發對特定抗原之有益主動或被 動免疫反應的組成物。儘管可能需要保護性免疫，但應瞭解各種程度之暫時免疫反應可為有益的。
「治療(Treating/treatment)」或「減輕」係指治療性治療，其中目標在於若非治癒則減緩(減輕)所靶向之病理學病狀或病症或防止病狀復發。若在接受治療量之治療劑之後，個體顯示特定疾病之一或多種徵象及症狀之可觀測及/或可量測減輕或不存在特定疾病之一或多種徵象及症狀，則個體受到成功「治療」。疾病之徵象或症狀之減輕亦可由患者感覺到。若患者經歷穩定疾病，則該患者亦視為受到治療。在一些實施例中，用治療劑進行之治療有效使患者在治療之後3個月、較佳在治療後6個月、更佳1年、甚至更佳2年或2年以上無疾病。評估疾病成功治療及改良之此等參數可易於藉由適當熟習此項技術之醫師所熟悉之常規程序量測。
術語「組合」係指一個劑量單位形式之固定組合、或用於組合投藥之分裝部分之套組，其中化合物及組合搭配物(例如如以下說明之另一藥物，亦稱為「治療劑」或「共藥劑」)可同時獨立地投與或在一定時間間隔內分開投與，尤其當此等時間間隔允許組合搭配物顯示協作效應，例如協同效應時。如本文中所用之術語「共投藥」或「組合投藥」或其類似術語意欲涵蓋向有需要之單一個體(例如患者)投與所選組合搭配物，且意欲包括藥劑不必藉由相同投藥途徑或在同時投與之治療方案。如本文所用之術語「醫藥組合」意謂由混合或組合一種以上活性成分產生 之產品且包括活性成分之固定組合與非固定組合兩者。術語「固定組合」意謂活性成分(例如化合物)與組合搭配物均以單一實體或劑量形式同時向患者投與。術語「非固定組合」意謂活性成分(例如化合物)與組合搭配物均以單獨實體形式同時、併行或依序在無特定時間限制下向患者投與，其中此投與在患者體內提供治療有效含量之兩種化合物。後者亦適用於雞尾酒療法(cocktail therapy)，例如投與三種或三種以上活性成分。
應瞭解本文所述之本發明之態樣及實施例包括「由態樣及實施例組成」及/或「基本上由態樣及實施例組成」。
在整篇本發明中，本發明之各種態樣以範圍格式呈現。應瞭解以範圍格式進行之描述僅為方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明範疇之剛性限制。因此，對範圍之描述應視為已明確揭示所有可能之子範圍以及彼範圍內之個別數值。舉例而言，對諸如1至6之範圍之描述應視為已明確揭示子範圍，諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等、以及彼範圍內之個別數值，例如1、2、3、4、5及6。無論範圍之寬度如何，此皆適用。
本發明之其他目標、優勢及特徵將根據連同隨附圖式進行之下列詳述而變得顯而易知。
本發明提供新穎奈米粒子、其使用及製備方法。更特定言之，本發明奈米粒子包含a)包含非細胞物質之內部核心；及b)包含來源於細胞之膜或來源於病毒之膜之外 部表面。
在某些實施例中，本發明奈米粒子之內部核心支撐外部表面且可具有任何形狀，包括(但不限於)球形、正方形、矩形、三角形、圓盤形、類立方形、立方形、長方體形(立方體)、錐形、圓柱形、棱柱形、金字塔形、直角圓柱形及其他規則或不規則形狀。在其他實施例中，內部核心之非細胞物質包含生物相容性合成物質，包括(但不限於)聚(乳酸共乙醇酸)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內酯、聚離胺酸、聚麩胺酸及任何其他適合合成物質或其類似物。
在某些實施例中，本發明奈米粒子之外部表面之膜包含來源於來自任何單細胞(例如細菌或真菌)或多細胞生物體(例如植物、動物、非人類哺乳動物或人類)之細胞之質膜的天然存在之細胞膜。天然存在之細胞質膜維持膜之天然結構完整性及活性。舉例而言，脂質雙層結構及其中包埋之至少一些締合膜蛋白質為完整的，以使得膜囊封實質上缺乏對膜所來源之物種或個體之免疫原性。
在某些實施例中，細胞包括(但不限於)血球，諸如紅血球(RBC)、白血球(WBC)及血小板；免疫細胞，諸如巨噬細胞、單核細胞、B細胞及T細胞；腫瘤或癌細胞；及其他細胞，諸如上皮細胞、內皮細胞及神經細胞。在其他實施例中，外部表面之膜來源於非終末分化或多能幹細胞，諸如造血幹細胞、骨髓幹細胞、間質幹細胞、心臟幹細胞或神經幹細胞。在其他實施例中，細胞膜來源於 包括(但不限於)外泌體、分泌小泡或突觸小泡在內之細胞組分。在某些實施例中，本發明之奈米粒子之外部表面還包含合成膜或合成組分以及天然來源之膜。
本發明之膜可藉由本文所述及此項技術中已知之方法獲得及組裝，例如參見Desilets等人，Anticancer Res.21：1741-47；Lund等人，J Proteome Res 2009,8(6),3078-3090；Graham,Methods Mol Biol 1993,19,97-108；Vayro等人，Biochem J 1991,279(第3部分),843-848；Navas等人，Cancer Res 1989,49(8),2147-2156；Henon等人，C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D 1977,285(1),121-122；及Boone等人，J Cell Biol 1969,41(2),378-392)，其整個內容以引用的方式併入本文中。
本發明更規定本發明奈米粒子包含可釋放裝載物，其可位於奈米粒子內部或表面上之任何位置。在某些實施例中，可釋放裝載物位於本發明奈米粒子之內部核心之內或之上。在其他實施例中，可釋放裝載物位於本發明奈米粒子之內部核心與外部表面之間。在其他實施例中，可釋放裝載物位於本發明奈米粒子之外部表面之內或之上。使可釋放裝載物自本發明奈米粒子釋放之觸發條件包括(但不限於)使奈米粒子與目標細胞、組織、器官或個體之間接觸，或改變奈米粒子周圍之環境參數，諸如pH值、離子條件、溫度、壓力及其他物理或化學變化。
在某些實施例中，可釋放裝載物包含一或多種治療劑、預防劑、診斷劑或標記劑、預後劑或其組合。治療劑之 實例包括(但不限於)抗生素、抗微生物劑、生長因子、化學治療劑或其組合。例示性診斷劑或預後劑可為成像標記。在某些其他實施例中，可釋放裝載物為金屬粒子，包含金粒子、銀粒子或氧化鐵粒子。在其他實施例中，可釋放裝載物為包含聚(乳酸共乙醇酸)(PCL)粒子、聚葡萄胺糖(chitosan)粒子、羥丙基甲基丙烯醯胺共聚物(HPMA)粒子之聚合粒子。在其他實施例中，可釋放裝載物為樹枝狀聚合物粒子或無機粒子，其包含二氧化矽粒子、多孔二氧化矽粒子、磷酸鈣粒子或量子點；或金屬粒子，其包含金粒子、銀粒子或氧化鐵粒子。
本發明更規定本發明奈米粒子可呈任何適合形狀，包括(但不限於)球形、正方形、矩形、三角形、圓盤形、類立方形、立方形、長方體形(立方體)、錐形、圓柱形、棱柱形、金字塔形、直角圓柱形或其他規則或不規則形狀，且直徑為約10 nm至約10 μm。在某些實施例中，本發明奈米粒子之直徑為約50 nm至約500 nm。
本發明更規定奈米粒子可實質上缺乏細胞膜所來源之細胞之組分或病毒膜所來源之病毒之組分。在某些實施例中，本發明之奈米粒子實質上缺乏細胞膜所來源之細胞之細胞質、細胞核及/或細胞器。在某些實施例中，本發明之奈米粒子實質上維持細胞膜、來源於病毒之膜或細胞膜或病毒膜之組分的天然結構完整性或活性。細胞膜之結構完整性包括細胞膜、來源於病毒之膜或細胞膜或病毒膜之組分的一級、二級、三級或四級結構，且細胞膜之活性包 括(但不限於)正常天然存在之細胞膜、來源於病毒之膜或細胞膜或病毒膜之組分將具有之結合活性、受體活性、信號傳導路徑活性及任何其他活性。在某些實施例中，本發明之奈米粒子具有生物相容性及/或生物可降解性。
在某些實施例中，本發明之奈米粒子包含來源於紅血球之細胞質膜及包含聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)之內部核心，其中奈米粒子實質上缺乏血色素且活體內血液循環半衰期為具有經聚乙二醇(PEG)包覆之聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)內部核心之奈米粒子之半衰期的至少約2-5倍。在某些實施例中，此奈米粒子之活體內血液循環半衰期為至少約5至約40小時。
本發明亦提供包含含有有效量之本發明之奈米粒子的藥劑傳遞系統之醫藥組成物。在某些實施例中，本發明之醫藥組成物還包含可與本發明之奈米粒子一起或組合投與之一或多種其他活性成分，同時存在或不存在醫學上或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
在某些實施例中，本發明之醫藥組成物為贅瘤特異性免疫原性組成物，其包含經來源於個體或細胞株之癌細胞(諸如良性贅瘤細胞、潛在惡性贅瘤細胞、腫瘤或癌細胞)之細胞膜包覆的奈米粒子，該細胞膜具有用於引發對贅瘤或癌細胞之免疫反應之結構完整性。在其他實施例中，本發明之醫藥組成物為包含贅瘤特異性免疫原性組成物之癌症疫苗。
在其他實施例中，本發明之醫藥組成物包含含有細胞 膜插入毒素之奈米粒子，其中奈米粒子之外部表面之細胞膜來源於目標細胞或細胞或細胞內組分，且保留細菌、真菌及動物來源之毒素。在某些實施例中，目標細胞包括(但不限於)血球，諸如紅血球(RBC)、白血球(WBC)及血小板；免疫細胞，諸如巨噬細胞、單核細胞、B細胞及T細胞；腫瘤或癌細胞；及其他細胞，諸如上皮細胞、內皮細胞及神經細胞；或非終末分化或多能幹細胞，諸如造血幹細胞、骨髓幹細胞、間質幹細胞、心臟幹細胞或神經幹細胞。在某些實施例中，目標細胞為紅血球。在其他實施例中，細胞內組分包括(但不限於)外泌體、分泌小泡或突觸小泡。在某些實施例中，醫藥組成物為包含在外部表面上經細胞膜包覆之奈米粒子之免疫原性組成物，該細胞膜保留用於保留毒素或引發對天然毒素之免疫反應之結構完整性。在其他實施例中，本發明之醫藥組成物為包含免疫原性組成物之疫苗。
包含本發明之奈米粒子之本發明醫藥組成物或藥劑傳遞系統可經由任何適合投藥途徑投與，包括(但不限於)經口、經鼻、吸入、非經腸、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、皮內、局部或直腸途徑。
本發明更提供一種引發對有需要之個體之目標細胞之免疫反應的方法。本發明方法包含向有需要之個體投與有效量之包含本發明之奈米粒子的醫藥組成物或藥劑傳遞系統，其中所投與之奈米粒子之細胞膜實質上保留用於引發對目標細胞之免疫反應之結構完整性。如本文所用，目標 細胞係指任何適合細胞，包括(但不限於)血球(例如RBC、WBC或血小板)、免疫細胞(例如B細胞、T細胞、巨噬細胞或單核細胞)、腫瘤或癌細胞(例如良性贅瘤細胞、惡性贅瘤細胞)、或幹細胞(例如造血幹細胞、骨髓幹細胞、間質幹細胞、心臟幹細胞或神經幹細胞)。在某些實施例中，目標細胞為紅血球。在其他實施例中，目標細胞為贅瘤或癌細胞。在某些實施例中，免疫反應為主動免疫反應。在其他實施例中，免疫反應為被動免疫反應。在其他實施例中，免疫反應為保護性疫苗接種。在某些實施例中，疫苗接種為贅瘤或癌症特異性疫苗接種。
本發明更提供一種在有需要之個體中引發針對細胞膜插入毒素之免疫反應的方法。本發明方法包含向有需要之個體投與有效量之包含本發明之奈米粒子的醫藥組成物或藥劑傳遞系統，其中奈米粒子之細胞膜保留毒素及所結合毒素之天然結構完整性用於傳遞至目標細胞已引發針對目標細胞之免疫反應。在某些實施例中，目標細胞為紅血球，且毒素為細菌、真菌或動物毒素。在某些實施例中，免疫反應為主動免疫反應。在其他實施例中，免疫反應為被動免疫反應。在其他實施例中，免疫反應為保護性疫苗接種。
本發明更規定本發明方法可用於治療或預防有需要之個體之疾病、病症或病狀，此疾病或病狀包括(但不限於)感染性疾病、寄生蟲病、贅瘤、血液及血液形成器官之疾病、涉及免疫機制之病症、內分泌疾病、營養疾病及代 謝疾病、精神及行為病症、神經系統疾病、眼及附件之疾病、耳及乳突之疾病、循環系統疾病、呼吸系統疾病、消化系統疾病、皮膚及皮下組織之疾病、肌肉骨骼系統及結締組織之疾病、泌尿生殖系統、妊娠、分娩及產後之疾病、發生於周產期之病狀、先天畸形、變形、染色體異常、損傷、中毒、外部病因之結果及罹病及死亡之外部病因。
在某些實施例中，本發明方法用於治療或預防由病原性微生物，諸如細菌、病毒、寄生蟲或真菌引起之感染性疾病。在其他實施例中，本發明方法用於治療或預防癌症或贅瘤病狀。如本文所用，有需要之個體係指動物、非人類哺乳動物或人類。如本文所用，「動物」包括寵物、農場動物、經濟動物、運動動物及實驗動物，諸如貓、狗、馬、母牛、公牛、豬、驢、綿羊、羔羊、山羊、小鼠、兔、雞、鴨、鵝、靈長類動物，包括猴及黑猩猩。在某些實施例中，用於本發明方法之奈米粒子之細胞膜來源於個體之相同物種之細胞。在某些實施例中，用於本發明方法之奈米粒子之細胞膜來源於個體之相同物種之紅血球且該紅血球具有個體相同血型。在某些實施例中，用於本發明方法中之奈米粒子之細胞膜來源於個體之細胞。
本發明更規定引發對有需要之個體之目標細胞之免疫反應或治療或預防疾病、病症或病狀的本發明方法還包含與包含本發明奈米粒子之醫藥組成物或藥劑傳遞系統一起或組合向有需要之該個體在存在或不存在醫藥學上可接受之載劑、佐劑或賦形劑下投與一或多種其他活性成分。本 發明方法更規定本發明之奈米粒子投與有需要之個體之目標部位，包括(但不限於)目標皮膚部位、血液或血漿、目標器官、目標腫瘤部位或目標細胞，且更提供一種觸發可釋放裝載物在目標部位處釋放之機制。觸發可釋放裝載物之機制包括(但不限於)使本發明之奈米粒子與目標細胞、組織、器官或個體之間接觸，或改變本發明之奈米粒子周圍之環境參數，諸如pH值、離子條件、溫度、壓力及其他物理或化學變化。
本發明更提供一種製備奈米粒子以及包含其奈米粒子之醫藥組成物或藥劑傳遞系統之方法。製備奈米粒子之此本發明方法包含a)組合包含非細胞物質之內部核心與包含來源於細胞或病毒之膜及視情況選用之合成膜之外部表面，及b)對組合施加外源能量以形成奈米粒子，其中該內部核心支撐該外部表面。在某些實施例中，外源能量為藉由擠壓施加之機械能。在其他實施例中，外源能量為藉由音波處理施加之聲能。在其他實施例中，外源能量為藉由加熱施加之熱能。本發明方法涵蓋目前存在或以後開發之任何其他適合外源能量傳遞系統用於形成奈米粒子。
癌症特異性免疫原性組成物或疫苗
本發明提供一種包含有效量之奈米粒子之贅瘤特異性免疫原性組成物，該奈米粒子包含含有非細胞物質之內部核心及包含來源於贅瘤細胞之細胞膜以及視情況選用之合成膜之外部表面。在某些實施例中，細胞膜來源於良性贅 瘤細胞、潛在惡性贅瘤細胞或癌細胞。在某些實施例中，細胞膜來源於癌細胞株。在其他實施例中，細胞膜來源於個體之癌細胞。本發明之贅瘤特異性免疫原性組成物可更規定奈米粒子之外部表面中之細胞膜實質上保留其用於引發對贅瘤細胞之免疫反應之結構完整性。如本文所用，結構完整性包括細胞膜或其組分之一級、二級、三級或四級結構。
在某些實施例中，內部核心包含生物相容性或合成物質，且支撐奈米粒子之外部表面。內部核心物質之實例包括(但不限於)聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內酯(PCL)、聚離胺酸、聚麩胺酸及目前已知或以後開發之可用於此目的之任何其他合成物質或其類似物。在某些實施例中，內部核心包含PLGA且外部表面包含來源於贅瘤細胞之質膜。
在某些實施例中，本發明之贅瘤特異性免疫原性組成物包含奈米粒子，該奈米粒子還包含一或多種活性成分或可釋放裝載物，且可呈任何形狀，包括(但不限於)球形、正方形、矩形、三角形、圓盤形、類立方形、立方形、長方體形(立方體)、錐形、圓柱形、棱柱形、金字塔形、直角圓柱形及其他規則或不規則形狀。奈米粒子之直徑可為約10 nm至約10 μm。在某些實施例中，贅瘤特異性免疫原性組成物中之奈米粒子之直徑為約10 nm、20 nm、30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、110 nm、120 nm、130 nm、140 nm、150 nm、 200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm、1 μm、2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm、7 μm、8 μm、9 μm及10 μm。在某些實施例中，贅瘤特異性免疫原性組成物中之奈米粒子實質上缺乏細胞膜所來源之贅瘤細胞之組分。
本發明更規定贅瘤特異性免疫原性組成物還包含免疫原性佐劑或免疫增強劑。如本文所用，「免疫原性佐劑」為可誘導及/或增強針對抗原之免疫反應之物質或組成物。如本文所用，「免疫增強劑」係指在接種時會增強免疫反應之藥劑。本發明涵蓋目前已知或以後開發之任何適合免疫原性佐劑或免疫增強劑，且與本發明之奈米粒子一起或組合使用之免疫原性佐劑或免疫增強劑的類型不受特別限制。例示性免疫原性佐劑可為弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)，其為輕質礦物油、Arlacel清潔劑及不活化結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis bacilli)之混合物。例示性免疫增強劑包括卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)、短小棒狀桿菌(Corynebacterium Parvum)、流產布氏桿菌萃取物(Brucella abortus extract)、葡聚糖、左旋咪唑(levamisole)、泰洛倫(tilorone)、酶及非毒性病毒。
本發明更提供一種含有上述贅瘤特異性免疫原性組成物及抗原之疫苗。在某些實施例中，抗原由一種或兩種或兩種以上選自由以下組成之群之抗原組成：腫瘤組織、腫瘤細胞、腫瘤細胞成分、腫瘤抗原蛋白質及腫瘤抗原肽， 且其用於腫瘤之預防性及/或治療性治療。若使用外源蛋白質作為抗原，則針對抗原之抗體可用上述贅瘤特異性免疫原性組成物在除人類以外之哺乳動物中高效產生。因此，本發明提供產生抗體之動物及來源於產生抗體之動物的產生抗體之細胞或抗體基因。因此，本發明提供一種包含上述贅瘤特異性免疫原性組成物之腫瘤疫苗，其係用於投與至包括人類在內之個體之腫瘤組織中以在哺乳動物活體中誘導抗腫瘤免疫反應。
本發明更提供一種誘導全身性或抗腫瘤免疫反應，由此治療或預防個體之贅瘤的方法，此方法包含向有需要之個體投與有效量之上述贅瘤特異性免疫原性組成物或由其獲得之疫苗的步驟，其中上述贅瘤特異性免疫原性組成物或疫苗中之奈米粒子之外部表面的細胞膜實質上保留其用於引發對贅瘤細胞之免疫反應的結構完整性。如本文所用，免疫反應可為T細胞介導之免疫反應及/或B細胞介導之免疫反應。如本文所用，贅瘤係指良性贅瘤、潛在惡性贅瘤或癌症。在特定實施例中，贅瘤為癌症，且可藉由本發明方法治療或預防之癌症之類型不受限制。
在某些實施例中，上述贅瘤特異性免疫原性組成物或疫苗中之奈米粒子之外部表面的細胞膜來源於個體之相同或不同物種或相同或不同個體的癌細胞株或癌細胞。如本文所用，「個體」係指非人類哺乳動物、動物或人類。
本發明更規定與上述贅瘤特異性免疫原性組成物或疫苗一起或組合向有需要之個體在存在或不存在醫藥學上可 接受之載劑或賦形劑下投與一或多種其他活性成分。本發明之贅瘤特異性免疫原性組成物或疫苗以及其他活性成分可經由任何適合投藥途徑單獨或組合投與，該投藥途徑包括(但不限於)經口、經鼻、吸入、非經腸、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、皮內、局部或直腸。在某些實施例中，本發明之贅瘤特異性免疫原性組成物或疫苗以及其他活性成分經由藥劑傳遞系統向有需要之個體投與。本文中使用之投藥途徑之類型或其他活性成分之類型不受特別限制。
治療與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀
本發明提供一種治療或預防與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀之醫藥組成物，該醫藥組成物包含有效量之奈米粒子，該奈米粒子包含含有非細胞物質之內部核心及包含來源於目標細胞之細胞膜以及視情況選用之合成膜之外部表面。在某些實施例中，內部核心支撐外部表面且包含生物相容性或合成物質。生物相容性或合成物質之實例包括(但不限於)聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內酯(PCL)、聚離胺酸、聚麩胺酸及任何其他適合生物相容性或合成物質。本發明涵蓋目前已知或以後開發之可用於奈米粒子之內部核心中的任何生物相容性或合成物質，且此物質之類型不受特別限制。
在某些實施例中，細胞膜為來源於紅血球之質膜，且 其中奈米粒子之外部表面中之細胞膜或質膜實質上保留其用於實質上保留毒素之結構完整性。在某些實施例中，毒素作為天然病理學機制之一部分插入目標細胞之細胞膜或質膜中。
如本文所用，「毒素」係指植物、動物、微生物(包括(但不限於)細菌、病毒、真菌、立克次體(rickettsiae)或原蟲)之毒性物質或產物、或感染性物質、或重組或合成分子，無論其來源及產生方法如何。在某一實施例中，「毒素」包括在活細胞或生物體內產生之細菌、真菌或動物毒素。
在某些實施例中，細菌毒素包括外毒素及內毒素。如本文所用，「外毒素」由細菌產生且主動分泌，而「內毒素」為細菌自身之一部分(例如細菌外膜)，且其直至細菌由免疫系統殺死方才釋放。本發明涵蓋目前已知及以後發現之任何外毒素及內毒素。插入細胞膜中之細菌毒素之類型不受特別限制。在某些實施例中，細菌毒素為來自金黃色葡萄球菌之細胞膜插入毒素，諸如α-溶血素(alpha-hemolysin)。
本發明更涵蓋目前已知及以後發現之任何真菌毒素，包括(但不限於)黃曲毒素(aflatoxin)、桔黴素(citrinin)、麥角胺(ergotamine)、伏馬毒素(fumonisins)、麥角纈鹼(ergovaline)、赭曲毒素(ochratoxin)、擬莖點黴毒素(phomopsin)、流涎胺(slaframine)、孢疹毒素(sporidesmin)、新月毒素( trichothecenes)(例如芝麻黴菌毒素(satratoxin)、去氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol))、玉米烯酮(zearalenone)。插入細胞膜中之真菌毒素之類型不受特別限制。
本發明中涵蓋之動物毒素包括由動物產生之任何有毒物質。動物毒素之實例包括(但不限於)心血管毒素、胃腸毒素、呼吸道毒素、神經毒素、腎/器官衰竭毒素。本發明涵蓋目前已知及以後發現之任何動物毒素，且插入細胞膜中之動物毒素之類型不受特別限制。在某些實施例中，插入細胞膜中之動物毒素來自節胺動物，諸如昆蟲、蜘蛛及甲殼動物；或爬行動物，諸如鱷目(crocodilia)、喙頭目(rhynchocephalia)、有鱗目(squamata)(包括蜥蜴及蛇)及龜鱉目(testudines)。
在某些實施例中，用於治療或預防與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀的本發明之醫藥組成物包含還包含一或多種其他活性成分或可釋放裝載物之奈米粒子，同時存在或不存在醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。此醫藥組成物中所含之奈米粒子具有生物可降解性，且可呈任何形狀，包括(但不限於)球形、正方形、矩形、三角形、圓盤形、類立方形、立方形、長方體形(立方體)、錐形、圓柱形、棱柱形、金字塔形、直角圓柱形及其他規則或不規則形狀。奈米粒子之直徑可為約10 nm至約10 μm。在某些實施例中，贅瘤特異性免疫原性組成物中之奈米粒子之直徑為約10 nm、20 nm、30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、 70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、110 nm、120 nm、130 nm、140 nm、150 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm、1 μm、2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm、7 μm、8 μm、9 μm及10 μm。
本發明更提供一種治療或預防個體之與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀的方法，該方法包含向需要此治療或預防之個體投與有效量之上述醫藥組成物。如本文所用，「個體」係指非人類哺乳動物、動物或人類。在某些實施例中，上述醫藥組成物中之奈米粒子之外部表面的細胞膜來源於個體之相同物種之細胞。在某些實施例中，質膜來源於個體之相同物種之紅血球且RBC具有個體相同血型。在其他實施例中，細胞膜或質膜來源於個體之細胞。
本發明更規定與上述醫藥組成物一起或組合向有需要之個體在存在或不存在醫藥學上可接受之載劑或賦形劑下投與一或多種其他活性成分。本發明之上述醫藥組成物以及其他活性成分可經由任何適合投藥途徑單獨或組合投與，該投藥途徑包括(但不限於)經口、經鼻、吸入、非經腸、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、皮內、局部或直腸。在某些實施例中，本發明之上述醫藥組成物以及其他活性成分經由藥劑傳遞系統向有需要之個體投與。本文中使用之投藥途徑之類型或其他活性成分之類型不受特別限制。
用於與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀之疫苗
本發明提供一種免疫原性組成物，該免疫原性組成物包含有效量之奈米粒子，該奈米粒子包含含有非細胞物質之內部核心及包含來源於細胞之細胞膜及細胞膜插入毒素以及視情況選用之合成膜之外部表面。在某些實施例中，內部核心支撐外部表面且包含生物相容性或合成物質。生物相容性或合成物質之實例包括(但不限於)聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內酯(PCL)、聚離胺酸、聚麩胺酸及任何其他適合生物相容性或合成物質。本發明涵蓋目前已知或以後開發之可用於奈米粒子之內部核心中的任何生物相容性或合成物質，且此物質之類型不受特別限制。
在某些實施例中，細胞膜為來源於諸如紅血球之細胞之質膜，且其中奈米粒子之外部表面中之細胞膜或質膜實質上保留其用於實質上保留毒素或引發對天然毒素之免疫反應的結構完整性。如本文所用，毒素之結構完整性包括結合於目標細胞時之毒素之一級、二級、三級及/或四級結構。在某些實施例中，毒素作為天然病理學機制之一部分插入目標細胞之細胞膜或質膜中。上文充分描述「毒素」之定義及類型。在某些實施例中，上述免疫原性組成物中之奈米粒子具有生物可降解性。
在某些實施例中，本發明之免疫原性組成物包含奈米粒子，該奈米粒子還包含一或多種活性成分或可釋放裝載物，且可呈任何形狀，包括(但不限於)球形、正方形、矩形、三角形、圓盤形、類立方形、立方形、長方體形( 立方體)、錐形、圓柱形、棱柱形、金字塔形、直角圓柱形及其他規則或不規則形狀。奈米粒子之直徑為約10 nm至約10 μm。在某些實施例中，贅瘤特異性免疫原性組成物中之奈米粒子之直徑為約10 nm、20 nm、30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、70 nm、80 nm、90 nm、100 nm、110 nm、120 nm、130 nm、140 nm、150 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800 nm、900 nm、1 μm、2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm、7 μm、8 μm、9 μm及10 μm。在某些實施例中，免疫原性組成物中之奈米粒子實質上缺乏細胞膜所來源之細胞之組分。
本發明更規定免疫原性組成物還包含免疫原性佐劑或免疫增強劑。上文充分描述免疫原性佐劑或免疫增強劑之定義及類型。本發明涵蓋目前已知或以後開發之任何適合免疫原性佐劑或免疫增強劑，且與本發明之奈米粒子一起或組合使用之免疫原性佐劑或免疫增強劑的類型不受特別限制。
本發明更提供一種含有上述免疫原性組成物之疫苗。在此實施例中，使用細胞膜插入毒素作為抗原，針對細胞膜插入毒素之抗體可用上述免疫原性組成物在除人類以外之哺乳動物中高效產生。因此，本發明提供產生抗體之動物及來源於產生抗體之動物之產生抗體之細胞或抗體基因。因此，本發明提供一種包含上述免疫原性組成物之疫苗，其係用於投與至包括人類在內之個體之目標組織中以在 哺乳動物活體中誘導免疫反應。
本發明更提供一種誘導全身性或抗疾病免疫反應，由此治療或預防個體之目標疾病的方法，此方法包含向有需要之個體投與有效量之上述免疫原性組成物或由其獲得之疫苗的步驟，其中上述免疫原性組成物或疫苗中之奈米粒子之外部表面的細胞膜實質上保留其用於引發對目標疾病細胞之免疫反應的結構完整性。如本文所用，免疫反應為T細胞介導之免疫反應、B細胞介導之免疫反應。本發明涵蓋任何疾病、病症或生理學或病理學病狀，包括(但不限於)感染性疾病、寄生蟲病、贅瘤、血液及血液形成器官之疾病、涉及免疫機制之病症、內分泌疾病、營養疾病及代謝疾病、精神及行為病症、神經系統疾病、眼及附件之疾病、耳及乳突之疾病、循環系統疾病、呼吸系統疾病、消化系統疾病、皮膚及皮下組織之疾病、肌肉骨骼系統及結締組織之疾病、泌尿生殖系統、妊娠、分娩及產後之疾病、發生於周產期之病狀、先天畸形、變形、染色體異常、損傷、中毒、外部病因之結果及罹病及死亡之外部病因。
在某些實施例中，上述免疫原性組成物或疫苗中之奈米粒子之外部表面的細胞膜來源於個體之相同或不同物種或相同或不同個體的細胞株或疾病細胞。如本文所用，「個體」係指非人類哺乳動物、動物或人類。
本發明更規定與上述免疫原性組成物或疫苗一起或組合向有需要之個體在存在或不存在醫藥學上可接受之載劑 或賦形劑下投與一或多種其他活性成分。本發明之上述免疫原性組成物或疫苗以及其他活性成分可經由任何適合投藥途徑單獨或組合投與，該投藥途徑包括(但不限於)經口、經鼻、吸入、非經腸、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、皮內、局部或直腸。在某些實施例中，本發明之免疫原性組成物或疫苗以及其他活性成分經由藥劑傳遞系統向有需要之個體投與。本文中使用之投藥途徑之類型或其他活性成分之類型不受特別限制。
實例
本發明教示之態樣可根據下列實例得到進一步理解，該等實例不應解釋為以任何方式限制本發明教示之範疇。本文所述之一些實例亦描述於Hu等人，PNAS,108(27)：10980-10985(2011)中，其內容以全文引用的方式併入本文中。
實例1 經紅血球膜偽裝之聚合奈米粒子作為仿生傳遞平臺
藉由擠壓聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)粒子與預先形成之RBC膜源性小泡，本發明者用包括脂質與相應表面蛋白質兩者之雙層RBC膜包覆小於100 nm之聚合粒子。此方法旨在用紅血球外表偽裝奈米粒子表面以達成較長循環同時保留聚合核心之可用性。本發明者報導此仿生奈米粒子傳遞平臺之物理特性、物理化學性質、蛋白質含量、 藥物動力學及生物分佈。
RBC膜包覆之奈米粒子之製備過程分成兩部分：自RBC獲得膜小泡及小泡-粒子融合(第1圖)。獲得RBC膜小泡遵循先前報導之方法，同時略作修改(13)。簡言之，首先藉由離心及PBS洗滌自來自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)之雄性ICR小鼠(6-8週)的新鮮血液純化RBC。經分離RBC接著於低張環境中經受膜破裂以移除其細胞內內含物。接著，洗滌排空之RBC且擠壓穿過100 nm多孔膜以產生RBC膜源性小泡。為合成經RBC膜偽裝之聚合奈米粒子，首先使用溶劑置換法自0.67 dL/g羧基封端PLGA聚合物製備直徑約70 nm之PLGA粒子(14)。
所得PLGA奈米粒子隨後經由機械擠壓與RBC膜源性小泡融合。基於自PLGA聚合物密度、奈米粒子尺寸、紅血球脂質含量及脂質分子之估計投影面積之計算，每毫克PLGA奈米粒子與自1 mL血液獲得之小泡混合以達成完全粒子包覆。混合物物理擠壓穿過具有100 nm孔之裝置。機械力促進小於100 nm之PLGA奈米粒子穿過脂質雙層，從而導致小泡-粒子融合。重複穿過擠壓機會克服先前報導之有關脂質體-粒子融合之問題，諸如粒度分佈較寬、粒子包覆不完全及脂質殼不一致(15)。亦應注意RBC膜之雙層結構在整個製備過程期間得到保留以使膜蛋白質之損失及破壞最小。
為表徵RBC膜包覆之PLGA奈米粒子，粒子首先用 乙酸鈾醯進行負染色且接著使用透射電子顯微術(TEM)觀測(第2A圖)。所得影像揭示在脂質雙層包覆之聚合粒子中存在如所預期之核心-殼結構。粒度為約80 nm且匹配藉由動態光散射(DLS)量測之水力直徑。仔細檢查揭示聚合核心之直徑為約70 nm且外部脂質殼之厚度為7~8 nm。脂質層之厚度與報導之RBC膜寬度(16)一致，表明膜成功移位至聚合粒子表面。
為檢查所得RBC模擬奈米粒子之長期穩定性，將其以1 mg/mL之濃度懸浮於1×PBS中且接著藉由DLS監測粒度、多分散性指數(PDI)及ζ電位(第2B圖)。歷經兩週之跨度，粒度自85增加至130 nm，ζ電位自-10.2減小至-12.7 mV，且PDI保持在相對相同之0.26下。尺寸及ζ電位之變化可能由少量過量小泡於粒子溶液中融合引起。為驗證核心-殼粒子結構之完整性，將疏水性DiD螢光團(激發/發射=644 nm/655 nm)及親脂性若丹明(rhodamine)-DMPE染料(激發/發射=557 nm/571 nm)分別裝載至聚合核心及RBC膜源性小泡中，隨後進行小泡-粒子融合。所得雙重螢光團標記之奈米粒子與HeLa細胞一起培育6小時且使用螢光顯微術觀測。在第2C圖中，DiD(紅色)及若丹明-DMPE(綠色)，其各自對應於不同粒子區室，在相同位置中重疊。此螢光共定位指示在奈米粒子由細胞內化之後，其具有完整核心-殼結構。
在結構研究之後，檢查粒子之蛋白質含量。RBC膜包覆之奈米粒子用30 nm多孔膜透析24小時以移除未結合 蛋白質且隨後用十二烷基硫酸鈉(SDS)處理以溶解膜蛋白質。併行製備排空RBC及RBC膜源性小泡之樣品作為比較。藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)進行之蛋白質分離指示膜蛋白質之組成在整個粒子合成期間大部分得以維持且可在RBC膜包覆之PLGA奈米粒子上鑒別(第3A圖)。此研究結果表明雙層細胞膜之移位亦將締合之膜蛋白質轉移至奈米粒子表面。因為固體PLGA核心阻止蛋白質進入且未結合蛋白質藉由透析濾出，所以偵測到之膜蛋白質最可能錨定於圍繞奈米粒子之雙層脂質膜中。所得含蛋白質脂質膜包覆之粒子可比作經充分研究之聚合物支撐平面脂質雙層模型，其已顯示保留膜締合蛋白質之官能性(15)。然而，觀察到蛋白質組成之微小改變，因為51 kDa附近之色帶顯著變弱。微弱色帶可能對應於與血影蛋白(spectrin)細胞骨架蛋白質關聯之周邊膜蛋白質，其在達成小泡-粒子融合之機械擠壓期間損失，如可藉由丟失在約200 kDa處之色帶所觀察到。
本發明者接著測定RBC膜包覆之奈米粒子之血清穩定性及活體內循環半衰期。為透視該等結果，分別使用類似尺寸之裸PLGA奈米粒子(約75 nm)及結構類似之PEG(Mw 2000)官能化脂質-聚合物雜交奈米粒子(約80 nm)作為陰性對照及陽性對照。對於血清穩定性測試，使用先前引用之吸光度方法來監測在胎牛血清(FBS)存在下之粒度變化(17,18)。因為較大粒子誘導較高光散射，所以可藉由監測吸光度值之增加來觀測不穩定粒子 之聚集。將各類型之奈米粒子懸浮於100% FBS中，其中最終奈米粒子濃度為1 mg/mL。所有樣品皆在37℃下培育且溫和振盪，隨後進行各吸光度量測。在560 nm下量測之吸光度值表明RBC膜包覆之奈米粒子之血清穩定性與PEG官能化脂質-聚合物雜交奈米粒子相等，因為兩個樣品在4小時內均未顯示任何可觀察到之吸光度變化(第3B圖)。相反，裸PLGA奈米粒子顯示極低穩定性，因為其在與血清溶液混合後即刻聚集。
為研究各類型奈米粒子之全身性循環時間，本發明者將疏水性DiD螢光染料裝載至所有三種類型之奈米粒子。染料顯示最小釋放(72小時內<20%)且已廣泛引用作為對奈米粒子之循環研究之標記(19,20)。對於各粒子類型，將150 μL 3mg/mL DiD裝載之奈米粒子經由尾靜脈注射來注射至一組6只小鼠中。為避免與不同血型相關之免疫反應，經受循環研究之小鼠為自其收集RBC以製備奈米粒子之相同品系。在注射之後之各種時間點，自小鼠之眼窩(eye socket)收集20 μL血液進行螢光量測。
第3C圖顯示RBC膜包覆之奈米粒子之血液滯留優於PEG官能化奈米粒子。在24及48小時標時時，相較於由PEG包覆之奈米粒子展現之11%及2%，RBC膜包覆之奈米粒子分別展現29%及16%總滯留。另一方面，在2分鐘標時時，在首次抽血時，裸PLGA奈米粒子顯示可忽略信號，預期此係基於其在血清中快速聚集。第3C圖之插圖中之半對數圖更好地說明藥物動力學概況之差異，因為循 環半衰期可由半對數信號之斜率獲得。基於先前研究中已應用於擬合奈米粒子之循環結果之兩區室模型(21,22)，消除半衰期經計算對於RBC膜包覆之奈米粒子而言為39.6小時且對於PEG包覆之奈米粒子而言為15.8小時。
或者，第3C圖中之循環資料可經由單因子非線性清除模型解釋，其中連續耗乏奈米粒子清除之原因(清除位點及調理素(opsonin)蛋白質之可用性)以使粒子攝取變慢。Simberg等人已報導藉由在注射初始粒子之前注射「誘餌(decoy)」粒子，初始粒子之循環半衰期可延長接近5倍(23)。合理預期RES系統之飽和可延遲其他粒子攝取且引起非線性粒子消除率。基於此非線性消除模型，第一表觀半衰期(亦即50%粒子清除)對於RBC膜包覆之奈米粒子而言為9.6小時且對於PEG包覆之奈米粒子而言為6.5小時。無論藥物動力學模型如何，RBC膜包覆之奈米粒子皆具有較長消除半衰期，此表明RBC膜包覆相較於習知PEG隱身包覆在延遲活體內清除方面具有優越性。此研究結果進一步確認奈米粒子經含有抑制巨噬細胞攝取之免疫抑制性蛋白質之RBC膜上的功能性組分修飾(24)。因為此等膜蛋白質來自自宿主血液收集之天然RBC，所以預期其在移位至聚合奈米粒子之表面後會刺激可忽略之免疫反應。根據TEM觀測、SDS-PAGE結果及循環半衰期研究，本發明者證明使用所報導之技術轉移細胞膜及相應功能性表面蛋白質來達成奈米粒子官能化。
本發明者接著測定RBC膜包覆之奈米粒子之活體內 組織分佈以進一步評估其作為傳遞載具之潛力。對於生物分佈研究，18只小鼠經由尾靜脈接受注射150 μL 3 mg/mL DiD裝載之奈米粒子。在粒子注射之後24、48及72小時之各時間點，對6只小鼠施以安樂死且收集其肝、腎、脾、腦、肺、心臟及血液。對於螢光定量，洗滌在不同時間點收集之器官、稱重、於1 mL PBS中均質化，且接著藉由螢光光度計量測。第4A圖顯示每公克組織之奈米粒子含量。RES系統之兩個主要器官肝及脾含有最高量之奈米粒子。然而，亦在3個時間點在血液中觀察到顯著螢光量。
為更好地瞭解總體粒子分佈，將螢光信號乘以相應器官之量測重量，其中血液重量估計為總體重之6%。第4B圖顯示各器官中相對於總螢光校正之相對信號。在考慮組織質量之後，可觀察到奈米粒子主要分佈在血液及肝中。來自血液之螢光信號與來自循環半衰期研究之資料充分相關，其中在24、48及72小時標時時，奈米粒子滯留分別為21%、15%及11%。此外，隨血液螢光降低，觀察到肝中信號相應增加，此指示血液中之螢光源最終由RES系統吸收。此結果證實觀察到之血液螢光來自長循環奈米粒子而非染料洩漏，染料將由腎分泌且導致來自肝之信號強度降低。值得注意的是RBC膜包覆之聚合奈米粒子相較於先前報導之RBC源性脂質體具有顯著較長之循環時間，該等脂質體會在小於30分鐘內自血液循環清除(13)。由RBC膜包覆之奈米粒子達成之循環時間延長可歸因 於結構剛性較高、粒子穩定性較佳及裝載物/染料囊封更可靠。相較於關於小鼠模型中之奈米粒子循環之其他公開資料(14,25,26)，該等資料大多數顯示在24小時之後血液滯留可忽略，RBC膜包覆之奈米粒子展現優越活體內滯留時間且具有作為穩固傳遞平臺用於生物醫學應用之巨大潛力。
本文報導之紅血球膜包覆之奈米粒子在結構上類似於常引用之脂質-聚合物雜交奈米粒子，該等雜交奈米粒子係作為有希望之含有脂質體與聚合奈米粒子兩者之合意特徵的多功能藥物傳遞平臺快速興起(27,28)。脂質-聚合物雜交奈米粒子相較於尺寸類似之聚合奈米粒子已顯示藥物釋放概況更持續，原因為脂質單層包覆層所提供之擴散障壁。預期RBC膜包覆之奈米粒子之藥物釋放動力學甚至更平緩，因為RBC膜提供更緻密之雙層脂質障壁來對抗藥物擴散。此研究中之膜包覆方法亦可延伸至其他奈米結構，因為脂質包覆之通用性已使其進展至二氧化矽奈米粒子及量子點(29-31)。可藉由在製備RBC膜包覆之奈米結構之前插入經修飾之脂質、脂質衍生物或跨膜蛋白質至脂質膜中來達成進一步粒子官能化。
關於將此等RBC膜包覆之奈米粒子轉變為臨床藥物傳遞載具，前方存在許多挑戰及機遇。不同於在動物研究中，人類紅血球含有可分類為許多不同血型之眾多表面抗原。為使粒子最佳化以達成長循環藥物傳遞，如同在輸血之情況中，粒子需要與患者之血液交叉匹配。為在廣大患 者群體中之應用更通用，粒子在合成步驟期間可選擇性耗乏彼等免疫原性蛋白質。或者，此仿生傳遞平臺可為個人化醫學之精確方法，藉此藉由使用其自身RBC膜作為粒子包覆層，針對個別患者定製藥物傳遞奈米載體以使免疫原性風險降至極低。
總之，本發明者證明合成經紅血球膜偽裝之聚合奈米粒子達成長循環裝載物傳遞。所採用之技術經由由上而下方法(top-down approach)提供偽造之細胞模擬奈米粒子，該方法繞過蛋白質鑒別、純化及共軛之費力過程。所提出之方法亦提供用於跨膜蛋白質錨定之雙層介質且避免可能會破壞目標蛋白質之完整性及官能性之化學修飾。本發明者證明脂質層可直接自活細胞獲得。天然細胞膜及其相關官能性移位至粒子表面代表奈米粒子官能化之一種獨特及穩固之由上而下方法。
材料及方法
獲得紅血球(RBC)血影。遵循經修改之先前公開之方案，製備缺乏細胞質內含物之RBC血影(32)。首先使用含有一滴肝素溶液(Cole-Parmer,Vernon Hills,IL)之注射器經由心臟穿刺來自獲自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)之雄性ICR小鼠(6-8週)抽取全血。接著在4℃下在2000 rpm下離心全血5分鐘，此後小心移除血清及白血球層。所得壓縮之RBC於冰冷1×PBS中洗滌，隨後用低張介質處理以達成溶血。將 經洗滌之RBC在冰浴中懸浮於0.25×PBS中20分鐘且在2000 rpm下離心5分鐘。移除血色素而收集粉紅色集結粒。使用相差顯微術驗證所得RBC血影，其揭示細胞內含物改變之完整細胞結構(第5圖)。
製備RBC膜源性小泡。使用FS30D浴音波器(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)在頻率42 kHz及功率100 W下使收集之RBC血影於加蓋玻璃小瓶中進行音波處理5分鐘。使用Avanti小型擠壓機(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)，所得小泡隨後連續擠壓依次穿過400 nm及100 nm聚碳酸酯多孔膜。為觀測RBC膜源性小泡中之脂質體區室，在小泡製備過程中使1 mL全血與20 μg 1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(麗絲胺若丹明B磺醯基)(銨鹽)(DMPE-RhB)(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)混合。在各製備步驟之後，藉由動態光散射(DLS)量測RBC膜源性小泡之尺寸(第6圖)。
製備PLGA奈米粒子。使用0.67 dL/g羧基封端50：50聚(DL-丙交酯共乙交酯)(LACTEL可吸收聚合物，Cupertino,CA)用溶劑置換法製備PLGA聚合核心。PLGA聚合物首先以1 mg/mL濃度溶解於丙酮中。為製備1 mg PLGA奈米粒子，逐滴添加1 mL溶液至3 mL水中。混合物接著敞開攪拌2小時。所得奈米粒子溶液用10K MWCO Amicon Ultra-4離心過濾器(Millipore,Billerica,MA)過濾且再懸浮於1 mL PBS(1×，pH=7.4)中。出 於螢光顯微術成像及活體內粒子追蹤目的，添加2 μg 1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3-四甲基吲哚二碳菁、4-氯苯磺酸鹽(DiD)染料(Invitrogen,Carlsbad,CA)至PLGA丙酮溶液中，隨後合成PLGA奈米粒子。使用透析方法檢查DiD染料自PLGA奈米粒子之釋放，其中100 μL所製備奈米粒子溶液裝載至分子量截斷值為3.5 kDa之Slide-A-Lyzer MINI透析微管(Pierce,Rockford,IL)中。奈米粒子在37℃下於PBS緩衝液中透析。在透析過程中，每12小時更換PBS溶液。在各預定時間點，分別收集來自三個小型透析裝置之奈米粒子溶液以使用Infinite M200多盤讀取器(TeCan,Switzerland)定量染料(第7圖)。作為對照粒子，經由奈米沈澱方法製備PEG包覆之脂質-PLGA雜交奈米粒子。
組織培養及奈米粒子內飲作用。人類上皮癌細胞株(HeLa)維持在補充有10%胎牛白蛋白、青黴素/鏈黴素(Gibco-BRL)、L-麩醯胺酸(Gibco-BRL)、MEM非必需胺基酸(Gibco-BRL)、碳酸氫鈉(Cellgro,Herndon,VA)及丙酮酸鈉(Gibco-BRL)之RPMI(Gibco BRL,Grand Island,NY)中。細胞在37℃及5% CO2下培養且塗鋪在具有上述培養基之腔室載片(Cab-Tek II，8孔；Nunc,Rochester,NY)中。在實驗當天，細胞用預熱PBS洗滌且與預熱RPMI培養基一起培育30分鐘，隨後添加100 μg DMPE-RhB及DiD標記之RBC膜包覆之PLGA奈米粒子。奈米粒子與細胞一起在37℃下培育4小時。細胞接著 用PBS洗滌3次，用組織固定劑(Millipore,Bellerica,MA)在室溫下固定30分鐘，用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI，細胞核染色)染色，封裝在ProLong Gold抗螢光衰減試劑(Invitrogen)中，且使用解迴旋掃描螢光顯微鏡(DeltaVision System,Applied Precision,Issaquah,WA)成像。使用100×油浸物鏡分別在DAPI、FITC及CY5濾光片下獲得藍色、綠色及紅色螢光之數位影像。使用softWoRx軟體對影像進行覆蓋及解迴旋。
RBC膜源性小泡與PLGA奈米粒子融合。為融合RBC膜源性小泡與PLGA奈米粒子，將1 mg PLGA奈米粒子與自1 mL全血製備之RBC膜源性小泡混合且接著使用Avanti小型擠壓機擠壓穿過100 nm聚碳酸酯多孔膜7次。基於RBC之膜體積及為充分包覆1 mg PLGA奈米粒子所需之總膜體積估計混合比。用於估計之參數包括小鼠RBC之平均表面積(75 μm2)(34)、RBC之膜厚度(7 nm)、50：50 PLGA奈米粒子之密度(1.34 g/cm3)(35)、小鼠血液中之紅血球濃度(70億/毫升)(36)、及在RBC膜包覆之前及之後藉由DLS測得之平均粒度(第8圖)。使用過量血液以補償在獲得RBC血影及擠壓期間的膜損失。所得RBC膜包覆之PLGA奈米粒子相對於30 nm多孔膜(Avanti Polar Lipids)透析24小時且經由氮氣淨化濃縮。在透析及濃縮之後，粒度及多分散性保持相同。
表徵RBC膜包覆之PLGA奈米粒子。使用ZEN3600 型Nano-ZS(Malvern,U.K.)，藉由DLS量測奈米粒子尺寸(直徑，nm)、多分散性及表面電荷(ζ電位，mV)。將奈米粒子(約500 μg)懸浮於1×PBS(約1 mL)中且在室溫下持續2週一式三份進行量測。藉由將奈米粒子懸浮於100%胎牛血清(FBS)(Hyclone,Logan,UT)中來進行血清穩定性測試，其中最終奈米粒子濃度為1 mg/mL。首先濃縮粒子至2 mg/mL且隨後添加相等體積之濃縮2×FBS。使用Infinite M200多盤讀取器進行吸光度量測。樣品在37℃下在輕微振盪下培育，隨後進行各量測。歷經4小時之時期約每30分鐘獲取560 nm下之吸光度。
透射電子顯微術成像。使用透射電子顯微鏡檢查RBC膜包覆之奈米粒子之結構。一滴濃度為4 μg/mL之奈米粒子溶液沈積於輝光放電碳包覆柵格上。在樣品沈積之後5分鐘，柵格用10滴蒸餾水沖洗。添加一滴1%乙酸鈾醯染色劑至柵格中。隨後乾燥柵格且使用FEI 200KV Sphera顯微鏡觀測。
使用SDS-PAGE表徵蛋白質。於SDS樣品緩衝液(Invitrogen)中製備RBC血影、RBC膜源性小泡及經透析之RBC膜包覆之PLGA奈米粒子。接著使用NovexSureLockXcell電泳系統(Invitrogen)，在NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris 10孔小型凝膠上，於3-(N-嗎啉基)丙烷磺酸(MOPS)操作緩衝液中對樣品進行電泳。樣品在150 V下電泳1小時，且所得聚丙烯醯胺凝 膠於SimplyBlue(Invitrogen)中染色隔夜以進行觀測。
藥物動力學及生物分佈研究。所有動物程序皆遵守加州大學聖迭哥學院動物照護及使用委員會(University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committee)之指南。利用來自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)之雄性ICR小鼠(6-8週)進行實驗。為評估RBC膜包覆之奈米粒子之循環半衰期，將150 μL DiD裝載之奈米粒子注射至小鼠之尾靜脈中。在注射之後1、5、15、30分鐘及1、2、4、8、24、48及72小時收集20 μL血液。亦併行測試含有相同劑量之DiD之PEG包覆之脂質-PLGA雜交奈米粒子及裸PLGA奈米粒子作為對照。各粒子組含有6只小鼠。收集之血液樣品於96孔盤中用30 μL PBS稀釋，隨後進行螢光量測。計算藥物動力學參數以擬合兩區室模型。
為研究奈米粒子在各種組織中之生物分佈，18只小鼠經由尾靜脈接受注射150 μL 3 mg/mL DiD裝載之奈米粒子。在粒子注射之後24、48及72小時之各時間點，隨機選擇6只小鼠並施以安樂死。收集其肝、腎、脾、腦、肺、心臟及血液。收集之器官小心稱重且接著於1 mL PBS中均質化。血液總重量估計為小鼠體重之6%。藉由Infinite M200多盤讀取器測定各樣品之螢光強度。
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實例2 用於控制藥物裝載及釋放之紅血球膜遮蔽之聚合奈米粒子
由紅血球膜(RBCm)遮蔽之聚合奈米粒子(NP)賦予循環壽命較長及藥物滯留及釋放受控制之組合優勢。為開發用於先進藥物傳遞應用之此細胞模擬NP平臺，在本文中，本發明者進行研究以對其藥物裝載、藥物釋放動力學及細胞基功效獲得更好的瞭解。特定言之，為研究藥物自RBCm遮蔽之NP之釋放，本發明者比較將小紅莓(doxorubicin，DOX)(一種模型抗癌藥物)裝載至RBCm遮蔽之NP中的兩種策略：物理囊封及化學共軛。藉由使用急性骨髓性白血病(AML)Kasumi-1細胞株來檢查活體外功效。
本發明者發現化學共軛策略導致藥物釋放概況更持續。此外，藉由調配聚合核心與RBCm遮蔽之NP相同但表面包覆層不同之聚乙二醇化NP，本發明者證明RBCm遮蔽物提供延遲囊封藥物分子向外擴散之障壁。用AML Kasumi-1細胞株進行功效研究，RBCm遮蔽之NP相較於游離DOX展現較高毒性。此等結果指示RBCm遮蔽之NP 為一種控制及持續傳遞治療劑來治療諸如血液癌症之各種疾病的有價值傳遞平臺。
引言
在過去10年間，在奈米規模上工程改造物質之進步已產生用於臨床應用中之大量基於奈米粒子(NP)之藥物傳遞系統[1,2]。此等奈米醫藥之獨特優勢，特定言之其經由改變藥物動力學及生物分佈概況對現有治療劑之改良決定其能夠在血流中循環一段延長之時期[3,4]。因此，相當多的研究關注集中於搜尋天然產生及合成製得之允許NP繞過巨噬細胞攝取及全身性清除的新穎物質[5,6]。同時，亦已廣泛探究旨在經由改進NP物理化學性質(包括尺寸、形狀、變形性及表面特徵)來延長粒子活體內滯留時間之策略[7,8]。
從此角度來看，本發明者新近開發一種紅血球膜(RBCm)遮蔽之NP藥物傳遞系統，其具有RBC之長循環壽命及聚合粒子之控制藥物滯留及釋放的組合優勢[9]。基於擠壓聚合粒子與預先形成之RBCm源性小泡之混合物的由上而下方法使整個RBCm與保留之膜蛋白質一起移位至小於100 nm聚合核心之表面，從而使得NP由紅血球外表遮蔽以達成較長全身性循環。此細胞模擬策略提供圍繞聚合核心之細胞膜介質以達成跨膜蛋白質錨定，因此避免習知NP表面官能化中之可能破壞蛋白質之完整性及官能性的化學修飾。
在進一步開發用於先進藥物傳遞應用之此細胞模擬NP平臺之持續努力中，在本文中，本發明者報導將諸如小紅莓(DOX)(一種模型抗癌藥物)之小分子化學療法藥物裝載至NP中之調配策略且研究藥物釋放動力學，其中強調由RBCm遮蔽物在藥物滯留方面所起之作用。特定言之，為將DOX分子裝載至NP核心中，本發明者探究兩種不同策略：使藥物分子物理囊封至聚合物基質中及使藥物分子化學共軛於聚合物骨架，且顯示其產生不同藥物裝載量及釋放動力學。本發明者進一步調配聚合物核心與RBCm遮蔽之NP相同但由聚(乙二醇)(PEG，聚乙二醇化NP)而非RBCm包覆之NP。兩種傳遞系統之藥物釋放概況之比較證明RBCm遮蔽物提供延遲囊封藥物分子向外擴散之障壁，且因此可能用於更好地控制藥物釋放。另外，在檢查RBCm遮蔽之NP之治療潛力時，本發明者選擇急性骨髓性白血病(AML)Kasumi-1細胞株且顯示DOX裝載之RBCm遮蔽之NP相較於相同量之游離DOX展現較高毒性。
材料及方法 2.1.獲得RBC血影
遵循先前公開之方案製備缺乏細胞質內含物之RBC血影[9,10]。簡言之，離心(800×g，5分鐘，4℃)經由用含有一滴肝素溶液(Cole-Parmer)之注射器進行心臟穿刺自雄性ICR小鼠(6-8週，Charles River Laboratories)抽取之全血以移除血清及白血球層。壓縮之RBC於冰冷1×PBS中洗滌，藉由低張介質處理以達成溶血，且接著於冰浴中懸浮於0.25×PBS中20分鐘。藉由在800×g下離心懸浮液5分鐘來移除血色素。收集呈粉紅色集結粒形式之RBC血影。
2.2.製備RBCm源性小泡
使用FS30D浴音波器(Fisher Scientific)在頻率42 kHz及功率100 W下對收集之RBC血影於加蓋玻璃小瓶中進行音波處理5分鐘。藉由使用Avanti小型擠壓機(Avanti Polar Lipids)，所得小泡隨後重複擠壓依次穿過400 nm及200 nm聚碳酸酯多孔膜。在各擠壓之後，藉由動態光散射(DLS，ZEN3600型Nano-ZS)監測RBCm源性小泡之尺寸。
2.3. L-丙交酯之開環聚合
基於公開方案[11,12]合成DOX-聚(乳酸)(PLA)共軛物。簡言之，L-丙交酯(Sigma-Aldrich,USA)之開環聚合由烷氧基錯合物(BDI)ZnN(SiMe3)2在用氬氣填充之手套箱中在室溫下催化。(BDI)ZnN(SiMe3)2(6.4 mg，0.01 mmol)及DOX(Jinan Wedo Co.,Ltd.,Jinan,China)(5.4 mg，0.01 mmol)混合於無水四氫呋喃(THF，0.5 mL)中，其中逐滴添加溶解於2 mL無水THF中之L-丙交酯(101 mg，0.7 mmol)。在如藉由1H NMR(Varian Mercury 400 MHz光譜儀)所指示L-丙交酯完全消耗之後，於冷乙醚中沈澱粗產物且藉由多個溶解-沈澱循環進行純化。共軛藉由1H NMR確認且共軛物之分子量藉由凝膠滲透層析(GPC，Viscotek,USA)所測定為約10,000 g/mol。
2.4.製備NP核心及裝載DOX
首先將DOX-PLA共軛物溶解於乙腈中以形成1 mg/mL溶液且逐滴添加1 mL此溶液至3 mL水中。混合物接著敞開攪拌2小時，從而使乙腈蒸發。NP核心之所得溶液藉由Amicon Ultra-4離心過濾器(Millipore,10 kDa截斷值)過濾且接著再懸浮於1 mL蒸餾水中。為物理囊封DOX，首先將1 mg聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA，0.67 dL/g，羧基封端，LACTEL可吸收聚合物)溶解於1 mL乙腈中，隨後添加預先溶解於25 μL二甲亞碸(DMSO)中之DOX。遵循如上所述之類似程序以產生含有NP核心之懸浮液。
2.5. RBCm源性小泡與NP核心融合
為融合RBCm源性小泡與上述NP核心，首先混合含有1 mg NP核心之懸浮液與自1 mL全血製備之RBCm源性小泡。混合物接著用Avanti小型擠壓機擠壓穿過100 nm聚碳酸酯多孔膜11次。為充分包覆1 mg NP核心，使用過量血液以補償在獲得RBC血影及擠壓期間的膜損失 [9]。
2.6.製備聚乙二醇化NP
首先將重量比1：1之DOX-PLA共軛物及PLA-PEG-COOH(10 kDa，PDI=1.12)[13]以1 mg/mL之濃度溶解於乙腈中，隨後進行如上所述之相同程序以產生NP懸浮液。為將DOX物理囊封至聚乙二醇化NP中，首先將1 mg聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA，0.67 dL/g，羧基封端，LACTEL可吸收聚合物)溶解於1 mL乙腈中，隨後添加溶解於25 μL DMSO中之100 μg DOX。使用如上所述之相同程序產生NP懸浮液。
2.7. NP穩定性研究
藉由使用DLS監測粒度來評估NP於PBS中之穩定性。特定言之，將500 μg NP懸浮於1 mL 1×PBS中且在室溫下歷經一週之時期每24小時一式三份量測尺寸。在量測之間，在37℃下在溫和振盪下培育樣品。藉由監測560 nm波長下之UV吸光度來評估NP血清穩定性。特定言之，NP首先於PBS中濃縮至2 mg/mL，隨後添加相等體積之2×胎牛血清(FBS，Hyclone)。藉由使用Infinite M200多盤讀取器在37℃下歷經2小時之時期約每1分鐘量測吸光度。
2.8.量測藥物裝載量及釋放
藉由利用480 nm之激發波長量測580 nm下之螢光強度來測定溶液中DOX之濃度。為測定NP之DOX裝載量，在將100 μL NP溶液與100 μL 0.1 M HCl之乙腈溶液一起培育24小時之後進行以上螢光量測。為繪製DOX釋放概況，將200 μL NP溶液(1 mg/mL)裝載至Slide-A-Lyzer MINI透析微管(Pierce,Rockford,IL，分子量截斷值=3.5 kDa)中且接著在37℃下相對於2 L PBS(pH=7.4)透析。在整個透析過程中，每12小時更換PBS緩衝液。在各預定時間點，收集來自三個小型透析裝置之NP溶液且量測DOX濃度。
2.9.細胞活力分析
使用MTT分析(Promega Corporation,Madison,WI,USA)評估游離DOX及DOX裝載之NP針對自急性骨髓性白血病(AML)患者之周邊血液建立之Kasumi-1細胞株的細胞毒性。細胞首先接種(每孔約5×103個)於96孔盤中且接著培育24小時。在添加游離DOX或DOX裝載之NP之後，再培育細胞72小時。接著遵循由製造商提供之方案，藉由使用MTT分析測定細胞活力。
結果及論述 3.1.製備RBCm遮蔽之NP
RBCm遮蔽之NP之製備過程係基於先前公開之方案且示意性說明於第9圖中[9]。簡言之，經純化之RBC首 先於低張環境中經受膜破裂以移除其細胞內內含物。接著，洗滌排空之RBC(直徑約2 μm)且擠壓穿過100 nm多孔膜以產生RBC膜源性小泡(直徑約200 nm)。同時，藉由使用溶劑置換法製備聚合核心(直徑約70 nm)，諸如由PLA或PLGA製得者。所得聚合核心隨後與RBC膜源性小泡混合且混合物物理擠壓穿過100 nm孔，其中兩種組分在機械力下融合且形成RBCm遮蔽之NP(直徑約90 nm)。
3.2.將小紅莓(DOX)裝載至RBCm遮蔽之NP中
在此研究中，本發明者檢查用以將作為模型藥物之DOX裝載至RBCm遮蔽之NP中的兩種不同方法：物理囊封及化學共軛。物理囊封藉由首先於乙腈中混合DOX及聚合物，隨後於水中沈澱達成。在此情況下，藥物裝載量可經由不同調配參數而改變。舉例而言，當使DOX與PLGA之初始重量比自5%改變至20%時，裝載量自0.9%增加至1.8%(參見第10圖)。
或者，DOX分子可藉由使藥物分子共價共軛於聚合物骨架而裝載至NP核心中。直觀地，DOX分子可經由羥基直接共軛於羧基封端之PLA鏈；然而，此方法導致聚合物-藥物共軛物具有異質性，主要由於聚合物鏈之多分散性、對含有多個羥基之DOX分子之區位選擇性及化學選擇性共軛缺乏控制、及對共軛效率缺乏控制。因此，本發明者採用一種替代方法，其中在L-丙交酯單體及作為 催化劑之(BDI)ZnN(SiMe3)2存在下，利用DOX之羥基來引發開環聚合(ROP)且導致形成PLA-DOX共軛物[11,12]。在此方法中，因為聚合反應由藥物分子自身引發，所以可達成接近100%之共軛效率。此外，金屬醯胺基催化劑(BDI)ZnN(SiMe3)2優先在DOX之C14-OH位置處而非其空間位阻更大之C4'-OH及C9-OH位置處允許PLA增長。在反應終止之後，產物藉由使用重複溶解-沈澱循環進行純化且接著藉由使用1H-NMR光譜法表徵。存在對應於DOX分子與PLA骨架兩者之質子共振峰，包括介於δ=7.5與8.0 ppm之間的DOX之芳族質子、在δ=1.5 ppm處之PLA之-CH3基團的質子、及在δ=5.2 ppm處之PLA之-CH基團的質子，因此確認形成PLA-DOX共軛物[11]。
與藥物裝載量主要取決於調配參數之物理囊封不同，在化學共軛中，藥物裝載量受聚合物鏈長度支配，該聚合物鏈長度又由諸如引發劑(DOX)與單體比率之聚合條件決定。舉例而言，發現在吾人之研究中合成之PLA-DOX共軛物具有10 kDa之分子量及1.16之窄多分散性指數(PDI)，對應於在共軛物調配至NP中之後約5%之DOX裝載量(參見第10圖)。
3.3. DOX裝載之RBCm遮蔽之NP的活體外穩定性
接著，本發明者研究DOX裝載之RBCm遮蔽之NP在生理相關緩衝溶液中之穩定性。在PBS中，藉由量測不同時間點時之NP尺寸來監測NP穩定性，因為不穩定 粒子傾向於聚集且其尺寸增加。在此研究中(第11A圖)，藉由使用物理囊封與化學共軛兩者用DOX分子裝載之NP顯示類似初始直徑約90 nm，歷經1週跨度尺寸無顯著增加。類似地，歷經相同時間跨度，僅觀察到NP之PDI有微小變化，指示DOX裝載之RBCm遮蔽之NP在PBS中具有高度穩定性。藉由監測560 nm下之UV吸光度來進一步檢查NP在血清中之穩定性，560 nm為反映粒子聚集程度之特徵性波長[14,15]。藉由物理囊封或化學共軛用DOX分子裝載之RBCm遮蔽之NP顯示歷經2小時之時間跨度在560 nm下之吸光度接近恆定(第11B圖)，表明NP在100%胎牛血清(FBS)中高度穩定。相反，由PLGA製得之裸聚合核心或無RBCm遮蔽物之PLA-DOX共軛物在添加至FBS中後，吸光度即刻增加。此等結果顯示RBCm遮蔽物在使NP於緩衝溶液與血清兩者中穩定方面起顯著作用。就實踐角度來看，未包覆聚合粒子在緩衝溶液中快速聚集提供一種在製備RBCm遮蔽之NP之後選擇性沈澱未包覆粒子並自RBCm遮蔽之NP移除未包覆粒子的方法。
3.4. DOX自RBCm遮蔽之NP之釋放動力學
在調配穩定的DOX裝載之RBCm遮蔽之NP之後，本發明者繼續研究其DOX釋放動力學(第12圖)。本發明者首先檢查不同藥物裝載機制將如何影響DOX自RBCm遮蔽之NP的釋放。結果顯示當DOX分子物理囊封 於聚合物基質中時，藥物釋放速率顯著加快，因為20%之DOX分子在前2小時內自RBCm遮蔽之NP釋放。相反，當檢查化學共軛之調配物時，在前2小時內，僅釋放5%之DOX分子。此差異已歸因於以下事實：DOX分子共價鍵結於聚合物骨架需要藥物分子首先藉由本體溶蝕(bulk erosion)自聚合物水解，隨後其可擴散出聚合基質以達成釋放[11,12,16]。由藥物-聚合物共價共軛所產生之更持續釋放概況亦表明當開發用於先進藥物傳遞應用之RBCm遮蔽之NP時，可對環境觸發物起反應之化學連接子可達成受到更好的控制之藥物釋放[13,17]。
為對由RBCm遮蔽物在藥物滯留方面所起之作用獲得更好的瞭解，本發明者遵循用以藉由摻合PLA-PEG二嵌段共聚物來產生NP之確立程序且得到聚乙二醇化NP，其中NP核心由圍繞之PEG層而非RBCm遮蔽物包覆及穩定[18]。若兩種調配物具有類似NP核心，則藥物釋放之差異主要由RBCm遮蔽物及表面PEG包覆層在藥物滯留方面之能力不同引起。藉由比較DOX自RBCm遮蔽之NP之釋放與自聚乙二醇化NP之釋放，本發明者發現RBCm遮蔽之NP之釋放速率較低：在前72小時內RBCm遮蔽之NP中有約20%之DOX釋放，而歷經相同時間跨度有40%之DOX自聚乙二醇化NP釋放。實際上，藉由使用由PLGA-PEG二嵌段共聚物調配之NP，已發現表面PEG分子會阻礙藥物自NP核心釋放[19]。
因此，相較於RBCm遮蔽之NP，DOX以較高速率自 PEG包覆之NP釋放之觀測結果指示RBCm實際上充當DOX釋放之擴散障壁。此觀測結果亦符合顯示磷脂包覆層可充當藥物擴散障壁之先前研究[20]。由RBCm遮蔽物所起之該種作用進一步表明除藉由包埋於聚合物核心中之化學共軛達成之策略[21]之外，旨在工程改造脂質膜包覆層之策略亦可使得藥物在某些環境因素下自RBCm遮蔽之NP反應性釋放。
為對膜包覆對藥物滯留之影響獲得定量瞭解，使用在先前粒子藥物釋放研究中建立之數學模型分析藥物釋放概況。因為PLGA在約數週內降解[22,23]，此顯著慢於關於物理裝載系統所觀察到之藥物釋放，所以對於含有物理囊封DOX之RBCm包覆之NP與聚乙二醇化NP兩者應用擴散支配性希古契(Higuchi)模型。相對於時間之平方根繪製藥物釋放百分比產生線性擬合，其中RBCm遮蔽之NP及聚乙二醇化NP之R2分別為0.98及0.96(第12B圖)。擬合良好暗示擴散控制藥物釋放機制且進一步允許經由下列希古契方程推導出擴散係數[24,25]：M t =Kt 1/2 (1)
K=A(2C ini DC s ) 1/2 (2)其中M t 為在時間t(以小時計)時之藥物釋放，K為希古契常數，C ini 為初始藥物濃度，C s 為藥物溶解度，A為粒子之總表面積，且D為擴散係數。鑒於粒子尺寸、藥物 裝載量、DOX在水中之溶解度(1.18 g/L)及藥物釋放資料，RBCm遮蔽之NP及聚乙二醇化NP之擴散係數分別確定為6.6×10-16 cm2/s及8.2×10-16 cm2/s，此亦與先前報導之藥物自PLGA/PLA NP之擴散性一致[26]。在吾人之研究中，雙層膜包覆使藥物擴散性降低1.2倍。由RBCm遮蔽物達成之此延遲效應將可能隨不同粒度、聚合物類型及治療裝載物而變化。
另一方面，對化學共軛DOX之藥物釋放概況應用零級、一級及希古契模型產生不良擬合(資料未示)，指示當額外藥物裂解與藥物擴散出聚合物基質聯合時，釋放動力學為複雜的。由RBCm遮蔽物對化學共軛DOX施加之延遲效應之精確模型化超出此研究之範疇。
然而，當相同粒子核心存在於RBCm遮蔽之NP及聚乙二醇化NP中時，聚合物基質鬆弛及鍵聯之水解裂解並非促成DOX釋放概況中觀察到之差異的主要因素。相反，本發明者將RBCm遮蔽之NP之釋放速率較慢歸於兩種擴散支配組分：水擴散至聚合物基質中及裂解之藥物向外擴散穿過聚合物基質[27]。因為膜包覆層顯示會降低藥物在物理截留系統中之擴散性，所以其可能影響共價共軛物系統中水流入與裂解藥物流出兩者，由此產生更持續之藥物釋放概況。
3.5. DOX裝載之RBCm遮蔽之NP的細胞毒性
最後，本發明者檢查DOX裝載之RBCm遮蔽之NP 針對AML Kasumi-1細胞株的治療潛力。AML，一種特徵在於血流中之白血病母細胞之生長及累積不受控制的疾病選作疾病目標，因為RBCm遮蔽之NP在血流中之循環壽命較長且其藥物釋放概況持續。AML之當前照護標準為高劑量蒽環黴素(anthracycline)，其會產生嚴重心臟毒性擔憂[28]。以持續方式釋放治療化合物之長循環NP提供降低必要給藥且改良治療功效之機會。物理裝載或共價共軛DOX之RBCm遮蔽之NP相較於游離DOX歷經72小時培育期展現較高毒性(第13圖)。此功效增強可能歸因於NP之內飲攝取，此使得高有效裝載物之藥物能夠進入細胞內區域[29]。相反，游離DOX依賴於被動膜擴散進入細胞，其效率較低且易受膜結合之藥物流出泵影響[30-32]。此研究表明具有延長之循環壽命、持續藥物釋放及改良之細胞內化的RBCm遮蔽之NP為治療血液癌症之平臺。批準進一步研究來研究此等NP在活體內之治療潛力。
結論
總而言之，在本文中，本發明者檢查將藥物裝載至RBCm遮蔽之NP傳遞系統中之兩種策略：物理囊封及化學共軛。釋放研究表明化學共軛策略產生更持續之藥物釋放概況。本發明者進一步調配相較於RBCm遮蔽之NP，具有相同NP核心但表面包覆層不同之聚乙二醇化NP。藉由比較此兩種傳遞系統之藥物釋放概況，本發明者證明 RBCm遮蔽物提供減緩囊封藥物分子向外擴散之障壁。此等結果表明對NP核心中之藥物-聚合物鍵聯進行化學修飾及對NP表面包覆層進行工程改造可對RBCm遮蔽之NP之藥物釋放獲得更好的控制。在藉由使用AML Kasumi-1細胞株進行之後續功效研究中，RBCm遮蔽之NP相較於游離DOX展現較高毒性。先前觀察到之在血流中之長全身性循環壽命及據此報導之持續藥物釋放動力學指示此仿生藥物傳遞系統提供用於治療諸如血液癌症之各種疾病之有效裝載物的可行全身性傳遞。此等RBCm遮蔽之NP提供組合合成聚合物與天然細胞膜兩者之優勢的穩固藥物傳遞系統。
RBCm遮蔽之NP代表使RBC之長循環壽命與合成聚合物之控制藥物滯留及釋放組合在一起之一類新穎NP調配物。此NP調配物可藉由工程改造該兩個部分來進一步定製以改良治療性有效裝載物之全身性傳遞。此調配物提供穩固傳遞平臺且對生物醫學應用與奈米技術研究兩者均產生顯著影響。
此實例之執行概述提供如下：為組合RBC之長循環壽命及聚合粒子之控制藥物滯留及釋放的優勢，本發明者調配尺寸小於100 nm之RBCm遮蔽之NP，其含有：由PLA或PLGA製得之小於100 nm之聚合核心、及由具有保留之膜蛋白質之RBCm製得之紅血球外表。
本發明者檢查用以將作為模型藥物之DOX裝載至 RBCm遮蔽之NP中之兩種不同方法：物理囊封，所得裝載量在0.9%至1.8%之範圍內；及共價共軛，產生5%之近似裝載量。
藉由監測NP尺寸及UV吸光度，本發明者發現當與無RBCm遮蔽物之裸聚合核心比較時，RBCm遮蔽之NP具有優越穩定性，暗示RBCm遮蔽物在使NP於生物溶液中穩定方面起顯著作用。
釋放研究顯示藥物-聚合物共價共軛方法比物理囊封具有更持續之釋放概況，證明當開發用於先進藥物傳遞應用之RBCm遮蔽之NP時，對環境觸發物起反應之化學連接子可達成受到更好控制的藥物釋放。
藉由比較RBCm遮蔽之NP與聚乙二醇化NP，本發明者發現RBCm充當DOX釋放之擴散障壁。此觀測結果與使用希古契方程進行之定量分析一致。因此，旨在工程改造脂質膜包覆層之策略亦可使得藥物能夠在某些環境因素下自RBCm遮蔽之NP反應性釋放。
當與游離DOX比較時，DOX裝載之RBCm遮蔽之NP增強針對AML Kasumi-1細胞之功效。此功效增強可能歸因於NP之內飲攝取，此使得高有效裝載物之藥物能夠進入細胞內區域。
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實例3 用於個人化免疫療法之具有癌細胞膜之奈米粒子
本實例提供一種具有優於現有方法之若干優勢之免疫治療系統。
1)當前策略僅專注於由所述一般癌症類型表現之個別腫瘤相關抗原(TAA)。癌症為一種異質性疾病，且該種方法之一個限制為某一患者之癌症之抗原表現可能完全不同於另一患者。此導致作為接受此等治療之實際候選者之患者的百分比小於最佳。另一擔憂為靶向單一TAA會導致針對癌症之總體免疫反應較弱，從而使其最終突變且發展抗性。所述本發明藉由自各個別患者之自體腫瘤收集膜物質，定製針對各個別患者之治療來解決此等問題。此方法允許在奈米粒子上精確重建抗原表現概況，此給予免疫系統建立針對癌症之強烈多管齊下反應之機會。
2)當前策略之另一限制為其大部分情況下需要TAA化學共軛於免疫佐劑。進行此舉以共定位抗原與佐劑，此最終使免疫系統建立針對本來將具有低免疫原性之自身抗原之反應。伴隨該種方法之問題為化學共軛通常會扭曲抗原，從而導致APC之呈現不良。另外，化學共軛之隨機性質可導致低產率且導致不能將該種系統一般化以供同時用於不同種類之TAA。所述本發明處理此等上述兩個問題。藉由將整個細胞膜移位至奈米粒子上，所有表面膜TAA皆處於其天然環境中且因此由APC以其天然形式如實呈現。使用奈米粒子核心允許在可調整之佐劑與抗原比率下共傳遞免疫佐劑與抗原性物質，該情形用傳統化學共 軛系統不能進行。
3)大多數當前癌症疫苗為具有不利藥物動力學及生物分佈之小化合物。一旦注射至活體內，此等化合物即可擴散離開目標部位或降解，隨後由APC攝取。所述本發明以多種方式克服此問題。首先，因為膜由奈米粒子表面支撐，所以其與非所要目標融合之可能性小得多。以此方式，抗原可以其最佳形式保留及穩定化直至由APC攝取。另外，奈米粒子系統之數量級大於小化合物；奈米粒子之尺寸亦可在較大範圍內精細調整。藉由控制奈米粒子核心尺寸為約200-300 nm，可防止擴散離開目標部位，從而允許APC高效接近及攝取粒子。同時，奈米粒子之小尺寸亦允許膜物質可駐留之表面積最大化，從而使得每劑量可傳遞更多抗原性物質。
本實例規定癌細胞膜物質來源於患者之腫瘤或已建立之細胞株且用於包覆內部裝載有免疫佐劑之奈米粒子以產生有效癌症疫苗(第14圖)。使用此平臺，有可能將所有抗原性物質自癌細胞之表面傳遞至抗原呈現細胞(APC)。另外，共傳遞免疫佐劑將使免疫系統建立針對本來免疫原性微弱之物質之強反應。此策略可用於治療多種癌症類型，包括(但不限於)：膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、胰臟癌、肺癌、皮膚癌及前列腺癌。
所述癌症疫苗可用於預防目的與治療目的兩者。使用已建立之癌細胞株作為膜來源，患者可針對表現共同抗原 基元之癌症進行疫苗接種。另一方面，使用來源於個別患者之腫瘤之膜物質，可建立針對患者之確切癌症類型之強免疫反應。鑒於患者與患者之間疾病之異質性，此對於治療癌症將具有廣泛意義。
治療劑製備：
1)癌細胞來源於患者之切除腫瘤或常見癌細胞株，
2)使用諸如分級分離之方法，自細胞獲得膜物質。一實例如下：- 對癌細胞進行機械均質化以破壞膜，- 組織均漿進行短暫離心以集結細胞內內含物且收集含有膜之上清液。
3)使用諸如奈米沈澱之方法製備裝載有佐劑之奈米粒子。一實例如下：- 將聚合物(例如PLGA)及佐劑(例如單磷醯基脂質A)溶解於有機相中，- 有機相於水相中奈米沈澱以形成具有所要尺寸之奈米粒子。
4)最終免疫治療粒子製備如下：- 對自癌細胞收集之膜物質進行物理擠壓以製備較小膜小泡，- 先前製備之佐劑裝載之核心與小泡一起擠壓以形成最終粒子(第15圖)。
治療劑投與：
1)皮下投與奈米粒子調配物
2)或者，靜脈內投與治療劑
作用機制(第16圖)：1)在注射至患者體內後，觸發初級免疫反應，2)APC遷移至發炎部位且攝取粒子，3)在攝取後，粒子降解，從而釋放免疫佐劑，4)在偵測到免疫佐劑後，APC成熟，5)處於奈米粒子表面上之抗原物質目前呈現在APC之外表上，6)成熟APC上之抗原呈現至CD8+ T細胞，7)在與癌症特異性抗原對接後，CD8+ T細胞活化且變成細胞毒性T細胞，及8)針對癌細胞抗原之細胞毒性T細胞增殖且攻擊腫瘤。
本實例提供一種基於癌細胞包覆之奈米粒子的免疫治療疫苗及製造該種疫苗之可行性(第17圖)。本發明者已確認可製造具有囊封有效裝載物之癌細胞膜包覆之奈米粒子。自癌細胞獲得之膜物質缺乏較大細胞內內含物且高效移位至奈米粒子表面。另外，本發明者已確認在由細胞攝取後，奈米粒子核心之內含物及外部膜物質共定位，此表示驗證成功設計之最重要資料。在本文中，本發明者進行為證明平臺之功效所需之活體外及活體內實驗。此等實驗包括：1)確認癌細胞抗原性物質經由吾人奈米粒子調 配物對不成熟樹突狀細胞之脈衝而呈現，2)確認CD8+ T細胞在與來自第一實驗之成熟樹突狀細胞共培養後活化，3)用B16黑素瘤鼠類模型使用C57BL/6測定活體內治療功效且在直接投與治療劑後觀察腫瘤尺寸減小。
所述本發明具有巨大商業化潛力。因為其易於製造、可針對各個別患者個人化且可針對幾乎任何形式之癌症一般化，所以此技術可能最終留在癌症治療之前線。就治療方面來看，此免疫治療性治療可與手術一起使用。使用來自切除腫瘤之物質製備疫苗，將其投與患者以破壞任何腫瘤殘餘物且防止腫瘤復發。就預防方面來看，治療可一般化以使用常見癌症之已建立細胞株來針對許多癌症類型進行疫苗接種。
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實例4 仿生毒素奈米海綿
抗毒素治療劑提供淨化具有可能引起眾多健康威脅(包括細菌感染、有毒損傷及生物武器)之毒性因素之身體的潛力。然而，儘管開發抗毒素之努力不斷增加，但安全且有效之治療選擇仍然有限。在本文中，本發明者構建仿生奈米海綿且證明其能夠吸收及中和來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之α-毒素。此等奈米海綿由聚合奈米粒子支撐之RBC膜雙層組成，其易於吸收膜損害性毒素且使其轉移離開其細胞目標。在一小鼠模型中，奈米海綿顯著降低毒素之毒性。此自生物學得到啟迪之奈米調配物呈現關於抗毒素治療之奈米醫藥的進步。
對毒素介導之疾病及損傷日益增長之瞭解促使搜尋更安全且更有效之抗毒素解決方案。此外，由於抗生素抗性細菌之威脅日益增加，毒素靶向抗毒性療法正作為針對感染性疾病之有吸引力的策略興起(1)。現有抗毒素平臺，諸如抗血清(2)、單株抗體(3,4)、小分子抑制劑 (5,6)及分子印記聚合物(7,8)藉由靶向毒素分子結構來中和毒素。然而，包括高免疫原性、低生物相容性、不良藥物動力學以及需要毒素特異性定製合成在內之因素限制其臨床採用。使用生物可降解性PLGA聚合物及紅血球之膜組分，本發明者構建靶向成孔毒素(PFT)之作用機制之仿生奈米海綿。
PFT為在自然界中發現之最常見蛋白質毒素(9,10)。此等毒素藉由在細胞膜中形成孔且改變其滲透性來破壞細胞。在細菌感染中，PFT之攻擊藉由在微生物防禦及滋養中發揮關鍵作用而構成主要毒性機制(10)。已發現在金黃色葡萄球菌中，膜損害性α-毒素表現量與菌株之毒性直接相關(11)。研究已證明抑制α-毒素可降低金黃色葡萄球菌感染之嚴重性(11,12)，且類似PFT靶向策略已顯示針對其他病原體，包括產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、大腸桿菌(Escherichia coli)(13)、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)(14,15)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)(16)及肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(17,18)之治療潛力。
除其在細菌發病機理中之作用外，PFT常用於動物之有毒攻擊中，包括海葵、蠍子及蛇之攻擊(19)。顯而易見針對此等廣泛分佈之細胞溶解性毒素之有效治療將處理許多健康問題。已鑒別出超過80個PFT家族，其顯示不同分子結構及獨特抗原決定基目標。儘管存在此等差異，但此等毒素之間使細胞膜穿孔之功能相似性提供設計具有 廣泛適用性之機制靶向抗毒素平臺的提示。一般而言，PFT經由自發性併入磷脂雙層中來破壞細胞膜。與脂質膜相互作用之此傾向已啟示基於雙層膜平臺之許多應用(20-22)。在本文中，本發明者藉由使用奈米粒子穩定化之RBC膜來吸收及阻遏膜損害性蛋白質。使用葡萄球菌α-毒素作為PFT模型，本發明者證明此等奈米海綿可中和毒素之毒性成孔活性(第18A圖)。
藉由擠壓紅血球膜小泡與70 nm PLGA奈米粒子來製備毒素奈米海綿(第22圖)，產生直徑約85 nm之核心-殼奈米結構(第18B、18C圖)。RBC膜小泡係來源於自小鼠全血純化之RBC，且PLGA粒子由奈米沈澱方法製備。先前報導此紅血球膜包覆技術以偽裝奈米粒子，從而改良其血清穩定性並延長其活體內循環半衰期(23)。在本研究中，探究此等粒子支撐RBC膜與溶血α-毒素之間的相互作用。在透射電子顯微鏡下，奈米海綿顯示由聚合核心包覆於RBC雙層中組成之核心-殼結構(第18C圖)。
為確定奈米海綿能夠中和α-毒素，使200 μg奈米海綿與3 μg α-毒素於PBS中混合30分鐘。混合物隨後與5%經純化小鼠RBC混合。作為比較，使等量聚乙二醇化PLGA粒子、聚乙二醇化脂質體及尺寸類似之RBC膜小泡與毒素混合。在培育30分鐘之後，離心溶液且觀察上清液中釋放之血色素。如第19A圖中所示，奈米海綿樣品顯著不同於其他樣品，展現指示RBC未受損害之澄清上清液。使用毒素處理之RBC溶液及PBS處理之RBC溶液 作為陽性對照及陰性對照，藉由量測上清液在540 nm下之吸光度來定量溶血程度。儘管聚乙二醇化PLGA奈米粒子、聚乙二醇化脂質體及RBC膜小泡未能阻止毒素之溶血活性，但具有奈米海綿之樣品顯示完全毒素抑制。
為更好地闡明α-毒素抑制背後之機制，經由Sepharose® CL-4B管柱過濾奈米調配物/毒素混合物以分離出自由浮動之未結合毒素。鑒於α-毒素傾向於自發併入紅血球膜(24)及基材支撐之膜雙層(25)中，因此預期RBC膜小泡及奈米海綿在流過過濾管柱之後保留毒素。在SDS-PAGE分析之後，發現RBC膜小泡與奈米海綿兩者均保留大多數α-毒素(分別為95.3及90.2%)，如藉由強度類似於毒素參照物之34 kDa蛋白質色帶所指示(第19C圖)。另一方面，毒素蛋白質色帶幾乎不存在於聚乙二醇化PLGA NP及聚乙二醇化脂質體樣品中(分別為3.4及4.7%)，此表明聚乙二醇化調配物與毒素之相互作用極少。此缺乏毒素滯留可歸因於親水性PEG包覆層，其經由空間推斥來阻礙蛋白質相互作用。由固體核心穩定且由RBC膜組分偽裝之奈米海綿可直接與毒素目標相互作用。
儘管RBC膜小泡亦吸收α-毒素，但其不能降低毒素之溶血活性強調奈米海綿中之聚合核心的作用。為更好地瞭解RBC膜小泡之中和能力與奈米海綿之中和能力之間的差異，使用用膜染料DMPE-若丹明製備之兩種奈米調配物進行細胞攝取研究。螢光顯微術生動揭示在與細胞一 起培育後兩種奈米調配物之不同命運(第19D圖)。在具有RBC膜小泡之樣品中，廣泛分佈之紅色螢光投射至整個細胞區域，此可由此等不穩定小泡與細胞膜融合說明。此觀測結果與先前關於脂質體RBC膜小泡之研究一致，該等膜小泡易於吸收於細胞膜上且不經受細胞內飲作用(26)。相反，奈米海綿在細胞內區域內顯露為明顯區分之螢光粒子，從而證明聚合核心能夠穩定RBC膜組分且使得其能夠由細胞攝取。此等研究結果有助於證明溶血研究之結果，在該情況下結合有α-毒素之RBC小泡可能與RBC融合且因此不能阻止溶血。另一方面，奈米海綿能夠阻遏毒素且使其遠離其他RBC膜。此外，第19D圖表明奈米海綿可促進膜結合毒素之內飲攝取。此奈米粒子誘導之進入機制將增強所吸收蛋白質之內溶酶體消化，從而防止毒素可能造成之進一步損害。
為進一步表徵奈米海綿，經由滴定研究檢查其毒素吸收能力。不同量之α-毒素與200 μl含1 mg/ml奈米海綿之PBS一起培育30分鐘。作為對照，在不存在奈米海綿下製備相同濃度之α-毒素。隨後添加毒素/奈米海綿混合物至1.8 mL含有5% RBC之PBS溶液中，且在培育30分鐘之後監測溶血(第19E圖)。在不存在奈米海綿下，在1.2 μg α-毒素下觀察到顯著溶血(42%)且在3.6 μg α-毒素下達成接近完全溶血。然而，在奈米海綿處理之情況下，在多達9 μg α-毒素下觀察到可忽略之溶血且在30 μg毒素下達成完全溶血。此資料指示奈米海綿顯著降低α- 毒素活性但具有能力限制。總毒素含量固定在9 μg下之奈米海綿的另一滴定研究揭示溶血活性之抑制與奈米海綿之量直接相關(第19F圖)。大致9 μg毒素可由200 μg奈米海綿完全中和。基於滴定資料、奈米海綿之尺寸、PLGA之密度及毒素之分子量，奈米海綿之吸收能力估計為每個粒子173個毒素單體。作為比較，根據奈米海綿之表面積及毒素蛋白質之投影面積估計理論能力為每個粒子約2000個毒素單體。實驗值較低可歸因於毒素分子間之空間位阻及在奈米海綿之表面上存在RBC膜蛋白質。
藉由皮下投藥來活體內測試奈米海綿中和α-毒素之能力。在右側腹皮膚下注射α-毒素或α-毒素/奈米海綿混合物之後72小時比較小鼠中之皮膚病變形成。在以濃度12 μg/mL注射150 μL之後，單獨α-毒素在對照組中誘發伴有明顯水腫及發炎之嚴重皮膚病變(第20A圖)。然而，與100 μg奈米海綿混合(毒素與粒子之比率約69：1)似乎中和毒素，因為在小鼠上不存在可觀察到之損害(第20B圖)。仔細檢查自對照組收集之皮膚組織顯示壞死、細胞凋亡及嗜中性白血球之發炎性浸潤，同時伴有皮膚水腫(第20C圖)。此外，毒素對下層肌肉組織造成損害，如藉由原纖維間水腫、肌肉纖維上之撕裂及嗜中性白血球自周圍血管結構大量外滲所證實(第20E圖)。此與接受毒素/奈米海綿混合物之小鼠之組織樣品中的觀測結果形成強烈對比(第20D及20F圖)，彼觀測結果顯示皮膚組織結構中之上皮結構正常且纖維結構完整，在肌肉組 織結構中無可見浸潤(第20D、20F圖)。
經由於小鼠中全身性投藥來評估奈米海綿之去毒能力。首先藉由對小鼠靜脈內注射80 mg/kg奈米海綿來驗證奈米海綿之安全性。該劑量良好耐受，因為接種組歷經2週時期未顯示死亡(資料未示)。在確認調配物之安全性後，檢查經由前接種與後接種兩者進行之治療。經由尾靜脈注射已知會在小鼠中誘導急性死亡之快速注射致死劑量之α-毒素(75 μg/kg)。在兩個實驗組中，在毒素注射之前或之後2分鐘注射80 mg/kg之奈米海綿。在對照組中，在毒素注射6小時內觀察到100%死亡率(n=9，第21圖)。在用奈米海綿後接種之組中，死亡率顯著降低至56%(p值為0.0091；n=9)。在前接種組中，存活率進一步改良，其中僅觀察到11%死亡率(p值<0.0001；n=9)。結果表明奈米海綿在活體內賦予針對α-毒素之保護。發現當預防性給予時，奈米海綿之益處較大，鑒於α-毒素溶血之快速動力學，此並不令人驚訝(27)。在兩個治療組中，在6小時標時之後未觀察到額外死亡，表明所吸收毒素得到去毒而非僅使其毒性延遲。此等結果指示此等奈米海綿有潛力臨床應用於預防性及緩解性配置中。
總之，鑒於PFT之功能性質，構建由PLGA奈米粒子支撐RBC膜組成之奈米海綿作為一種抗毒素解決方案。本發明者證明膜可及性及結構穩定性為使得毒素能夠經由此平臺中和之關鍵態樣。奈米海綿在活體外抑制α-毒素之溶血活性且在小鼠中極大降低毒素之損害。此毒素吸收 平臺呈現治療性奈米粒子與抗毒素治療兩者中之一種新穎範式。不同於經由親水性包覆層阻礙蛋白質相互作用之習知隱身策略，RBC膜覆蓋之奈米海綿可與有毒蛋白質相互作用且在活體內充當毒素誘餌。且不同於其他結構特異性抗毒素平臺，奈米海綿處理常見膜破壞機制且具有治療多種PFT誘發之損傷及疾病之潛力。更重要的是在局部或全身性投藥後，平臺造成極低併發症風險，因為其完全由生物相容性及生物可降解性物質構成。聚合核心亦可取代為其他治療裝載物以產生針對感染性疾病之多模態治療。因為PFT為最常見之毒素，所以奈米海綿平臺在臨床中具有巨大治療意義。
奈米海綿之實驗吸收能力
PLGA之密度：p=1.2 g/mL
聚合物核心之半徑：r=35 nm
奈米海綿之質量：Mns==每個粒子2.2×10-16 g=每莫耳1.30×108 g
α-毒素之質量：Mt=每莫耳34,000 g
基於9 μg毒素可由200 μg NP完全吸收之觀測結果：200 μg奈米海綿約1.5×10-12莫耳
9 μg α-毒素約2.6×10-10莫耳
毒素：NP=173：1
奈米海綿之理論吸收能力
奈米海綿之平均直徑：rns=42.5 nm
奈米海綿表面積：Ans=4π rns 2=22697 nm2
假定奈米海綿上之α-毒素之七聚環充分壓縮。
基於寡聚α-毒素環之10 nm外部直徑(1)，環之投影面積為：A毒素七聚體==78.5 nm2
每個奈米海綿之寡聚環之數目=22697/78.5=289個七聚環
每個奈米海綿之α-毒素單體=289×7=2024
材料及方法 製備毒素奈米海綿
如先前所報導合成奈米海綿粒子(2)。在800×g下離心自6週齡雄性ICR小鼠(Charles River Laboratories)收集之全血5分鐘以分離RBC。RBC接著經受低張處理且藉由在800×g下離心5分鐘來收集RBC血影。使用小型擠壓機(Avanti Polar Lipids)，所得血影連續擠壓穿過400 nm及100 nm聚碳酸酯多孔膜。使用0.67 dL/g羧基封端50：50聚(DL-丙交酯共乙交酯)(LACTEL可吸收聚合物)，利用溶劑置換法併行製備PLGA聚合核心。將PLGA以1 mg/mL溶解於乙腈中。為製備1 mg粒子，逐滴添加1 mL PLGA溶液至3 mL水中。所得混合物敞開攪拌2小時且使用10 kDa分子量截斷值Amicon Ultra-4離心過濾器(Millipore)進行濃縮。藉由PLGA奈米粒子與 自新鮮血液製備之小泡(每1 mL血液1 mg PLGA)擠壓穿過100 nm聚碳酸酯膜來合成最終RBC奈米海綿。必要時使用氮氣淨化來濃縮奈米粒子。對於針對奈米海綿引述之所有後續質量值，使用PLGA聚合物之重量。自使用Malvern ZEN 3600 Zetasizer進行之三次重複動態光散射量測獲得奈米海綿之尺寸，其顯示平均尺寸為85 nm。
毒素奈米海綿之透射電子顯微術
將100 μg RBC奈米海綿與3 μg金黃色葡萄球菌α-毒素(Sigma Aldrich)一起培育15分鐘。使一滴奈米粒子溶液以奈米海綿濃度4 μg/mL沈積於輝光放電碳包覆柵格上。在沈積之後1分鐘，小滴用10滴蒸餾水洗去且用1%乙酸鈾醯染色。樣品在200 kV下在FEI Sphera顯微鏡下成像。
製備聚乙二醇化PLGA奈米粒子、聚乙二醇化脂質體及RBC膜小泡
遵循奈米沈澱方法製備聚乙二醇化奈米粒子。簡言之，將1 mg PEG-PLGA二嵌段共聚物溶解於1 mL乙腈中且在恆定攪拌下添加至含有3 mL水之小瓶中。有機溶劑接著在通風櫥中蒸發2小時。NP溶液接著使用分子量截斷值為10 kDa之Amicon Ultra-4離心過濾器(Millipore)洗滌3次。藉由機械擠壓製備聚乙二醇化脂質體。簡言之，將1 mg Egg PC及200 μg DSPE-PEG-羧基(Avanti Polar Lipids)溶解於1 mL氯仿中。有機溶劑接著蒸發以形成乾燥脂質薄膜。脂質薄膜用1 mL PBS再水合，隨後渦旋1分鐘且於FS30D浴音波器(Fisher Scientific)中音波處理3分鐘。調配物隨後擠壓穿過100 nm孔徑聚碳酸酯膜11次以形成狹窄分佈之脂質體。遵循如對於奈米海綿製備所述之RBC純化及膜擠壓方案來製備RBC膜小泡。自使用動態光散射進行之三次重複量測獲得奈米調配物之尺寸，其顯示聚乙二醇化PLGA奈米粒子、聚乙二醇化脂質體及RBC膜小泡之平均尺寸分別為90、105及120 nm。
RBC奈米海綿競爭性中和分析
將3 μg α-毒素與200 μL含有1 mg/mL RBC奈米海綿、聚乙二醇化PLGA奈米粒子、聚乙二醇化脂質體及RBC膜小泡之PBS溶液一起培育30分鐘。用9 μg α-毒素於PBS中製備陰性對照。溶液接著與1.8 mL 5%經純化小鼠RBC一起再培育30分鐘。在培育之後，各樣品在14,000 rpm下於Beckman Coulter Microfuge® 22R離心機中短暫離心10分鐘。使用Tecan Infinite M200多盤讀取器在540 nm下分析上清液中血色素之吸光度以分析RBC溶解程度。一式三份進行實驗。
RBC奈米海綿結合研究
將9 μg α-毒素與200 μL含有1 mg/mL RBC奈米海綿 、聚乙二醇化PLGA奈米粒子、聚乙二醇化脂質體及RBC膜小泡之PBS溶液一起培育30分鐘。在培育之後，樣品經由Sepharose® CL-4B尺寸排阻管柱進行過濾以移除未結合毒素。樣品接著凍乾且於SDS樣品緩衝液(Invitrogen)中製備。與經過濾樣品併行製備9 μg純α-毒素作為參照。使用Novex® XCell SureLock電泳系統(Invitrogen)，製備之樣品在4-12% Bis-Tris 10孔小型凝膠上，於MOPS操作緩衝液中分離。樣品在200 V下電泳50分鐘，且所得聚丙烯醯胺凝膠於SimplyBlue(Invitrogen)中染色隔夜以進行觀測。為定量毒素滯留，使用ImageJ分析34 kDa處之色帶強度，其中毒素標準物自0.3、1、3及9 μg純α-毒素製備。
α-毒素滴定研究
將200 μL含1 mg/mL奈米海綿之PBS與30、9、3.6、1.2、0.6及0.3 μg α-毒素一起培育30分鐘。作為對照組，亦在不存在奈米海綿下製備含有相同濃度之α-毒素之溶液。樣品及對照溶液接著與1.8 mL含5%小鼠RBC之PBS一起培育30分鐘。各樣品在14,000 rpm下短暫離心10分鐘。在540 nm下分析上清液中血色素之吸光度以分析RBC溶解程度。一式三份進行實驗。
奈米海綿滴定研究
製備含有具有200、60、20、6及2 μg之各種量之毒 素奈米海綿的PBS溶液。各奈米海綿溶液與含9 μg α-毒素之PBS混合且稀釋至最終體積200 μL。在培育30分鐘之後，添加溶液至1.8 mL含5%小鼠RBC之PBS中且培育30分鐘。溶液接著在14,000 rpm下短暫離心10分鐘。在540 nm下分析上清液中血色素之吸光度以分析RBC溶解程度。一式三份進行實驗。
RBC奈米海綿之細胞攝取
為檢查在細胞攝取之後奈米海綿及RBC膜小泡之膜物質，添加10 μg DMPE-若丹明(Avanti Polar Lipids)至由1 mL全血獲得之RBC血影中，隨後機械擠壓成膜小泡。使用所得染料裝載之RBC膜小泡製備奈米海綿。將螢光奈米海綿及膜小泡與在補充有100 U/mL青黴素及100 μg/mL鏈黴素(Invitrogen)及50 μg/mL內皮細胞生長補充劑(Biomedical Technologies,Inc.)之含漢克氏BSS(Hanks' BSS)、L-麩醯胺酸、HEPES及1.4 g/L NaHCO3(Lonza)之培養基199中濃度為300 μg/mL之人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(ATCC #CRL-1730)一起培育1小時。接著吸出培養基且細胞於新鮮培養基中培育1小時。在第二培育期之後，細胞用PBS洗滌，用10%福馬林(formalin)(Millipore)固定，且用含DAPI之Vectashield®(Invitrogen)封裝。在Applied Precision DeltaVision解迴旋掃描螢光顯微鏡上使用60×油浸物鏡使細胞成像。
經由皮下途徑中和毒素
將RBC奈米海綿與α-毒素在最終濃度0.67 mg/mL奈米海綿及12 μg/mL a-毒素下一起於PBS中培育15分鐘。150 μL體積之混合物接著皮下注射至6週齡雌性nu/nu裸小鼠(Charles River Laboratories)之側腹區域中。在注射之後第3天，使小鼠成像。切割5 μm之皮膚及肌肉樣品且使用H&E染色以進行組織學分析。
經由全身性途徑中和毒素
事先於蒸餾水中製備濃度為20 mg/mL之RBC奈米海綿及濃度為60μg/mL之α-毒素。對於前接種研究，對6週齡雄性ICR小鼠經由尾靜脈靜脈內注射80 mg/kg(每體重之劑量)之奈米海綿，隨後在2分鐘後注射75 μg/kg之α-毒素。對於後接種研究，首先對6週齡雄性ICR小鼠注射75 μg/kg之α-毒素，隨後在2分鐘後注射80mg/kg之奈米海綿。對照僅注射75 μg/kg之α-毒素溶液。各組之樣品規模為9只。
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實例5 用於毒素主動免疫之細胞膜包覆之奈米粒子
當前，毒素疫苗接種中之主要方法係經由使用變性毒素。然而，此方法在中和毒素毒性方面可能無效且可能破壞毒素蛋白質抗原性所必要的天然結構。已投與毒性降低之遺傳工程改造毒素來進行毒素疫苗接種。然而，此等調配物需要針對特定毒素物質進行定製且製造成本高。
用於安全毒素免疫之毒素中和粒子為獨特的且先前未描述。現有毒素免疫方法需要經由加熱或化學品進行變性(此可影響毒素之免疫原性)或可能昂貴且麻煩之工程改造非毒性蛋白質對應物。降低毒素毒性與保留疫苗抗原性之間的權衡已呈現毒素免疫中之重大挑戰。本發明提供優於現有技術之主要優勢，因為其中和毒素毒性而不破壞其天然結構。其易於製備且適用於許多毒素物質。
使用包覆細胞膜中之奈米粒子作為傳遞相關抗原用於 主動免疫之平臺。已顯示膜雙層包覆之粒子可吸收細菌毒素並使其去毒。此等結合粒子之經中和蛋白質喪失其毒性且仍然保留其免疫原性且在活體內傳遞以誘導免疫反應。此策略用於使毒素鈍化以用於主動免疫，此後個體獲得針對初始毒素目標之防禦(第23圖)。技術處理廣泛多種感染及疾病，包括(但不限於)產氣莢膜芽胞梭菌、大腸桿菌、單核球增多性李氏菌、炭疽桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)。次微米尺寸之粒子使得平臺易於由抗原呈現細胞攝取。
成孔毒素，諸如來自金黃色葡萄球菌之α-溶血素藉由刺穿細胞膜而導致細胞損害。本文所述之毒素奈米海綿由包覆於紅血球之膜物質中之聚合核心組成。類似於真實細胞，奈米粒子上之膜與毒素相互作用。一旦毒素黏附於奈米海綿，其即藉由穩定結構鎖定且因此不能造成進一步損害(第24圖)。中和毒素保留其天然結構及構形以誘導針對毒素目標之適應性免疫性(adaptive immunity)。
本實例提供用於毒素主動免疫之細胞膜包覆之奈米粒子。使用自小鼠之紅血球及PLGA聚合物製備之奈米粒子，本發明者已成功中和金黃色葡萄球菌之α溶血素且將其皮下傳遞於小鼠中而未造成任何可觀察到之損害(第25圖)。在用粒子/毒素調配物進行3次接種過程後，小鼠以與用熱變性毒素接種之小鼠相同之程度展現針對毒素目標的血清效價(第26圖)。因此，本發明者已證明粒子/毒素免疫之小鼠之血清可抑制α-溶血素之溶血活性(第 27圖)。在對一組10只小鼠靜脈內注射致死劑量之毒素之毒素攻擊中，粒子/毒素免疫之小鼠顯示100%存活率，而在6小時標時之後非免疫小鼠無一存活(第28圖)。
成孔毒素為許多主要感染性疾病，包括(但不限於)葡萄球菌感染、肺炎、炭疽、氣性壞疽(gas gangrene)及鏈球菌咽炎(strep throat)中之關鍵毒性因素。本發明可用作毒素疫苗接種以治療或預防此等感染。
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提供上述[實施方式]以幫助熟習此項技術者實施本發明。然而，本文所述及所主張之本發明之範疇不欲受限於本文揭示之特定實施例，因為此等實施例意欲作為本發明若干態樣之說明。任何等效實施例皆意欲屬本發明之範疇。實際上，除本文所示及所述之修改之外，本發明之不脫離本發明發現之精神或範疇的各種修改將根據以上描述而變得為熟習此項技術者顯而易知。此等修改亦意欲屬隨附申請專利範圍之範疇。
本申請案中引用之所有公開案、專利、專利申請案及其他參考文獻皆出於所有目的以全文引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已特定地且個別地將各個別公開案、專利、專利申請案或其他參考文獻出於所有目的以全文引用的方式併入一般。本文對參考文獻之引用不應解釋為承認其為本發明之先前技術。
群多普利(trandolapril)、瑪維克(Mavik)
第1圖. RBC膜包覆之PLGA奈米粒子(NP)之製備過程之示意圖。
第2圖. RBC膜包覆之PLGA奈米粒子之結構表徵。第2A圖.奈米粒子用乙酸鈾醯負染色且隨後用TEM進行觀測。第2B圖.歷經14天對奈米粒子之尺寸、多分散性指數(PDI)及表面ζ電位的DLS量測結果。第2C圖.掃描螢光顯微術影像顯示在由HeLa細胞內化之後，RBC膜(用綠色若丹明-DMPE染料觀測)與聚合核心(用紅色DiD染料觀測)共定位。RBC膜包覆之奈米粒子與HeLa細胞一起培育6小時。洗出過量奈米粒子且隨後固定細胞進行成像。
第3圖. RBC膜包覆之奈米粒子(NP)之膜蛋白質保留、粒子於血清中之穩定性及活體內循環時間。第3A圖.排空RBC、RBC膜源性小泡及經純化RBC膜包覆PLGA奈米粒子中之蛋白質溶解並於聚丙烯醯胺凝膠上解析。第3B圖. RBC膜包覆之PLGA奈米粒子、PEG包覆之脂質-PLGA雜交奈米粒子及裸PLGA奈米粒子於100%胎牛血清中培育且持續4小時監測其在560 nm下之吸光度。第3C圖. DiD裝載之奈米粒子經由小鼠之尾靜脈靜脈內注射。在各種時間點，眶內抽取血液且量測其在670 nm下之螢光以評估奈米粒子之全身性循環壽命(n=每組6只)。
第4圖. RBC膜包覆之聚合奈米粒子之生物分佈。螢光標記之奈米粒子靜脈內注射至小鼠體內。在各時間點( 分別為24、48及72小時)，收集來自隨機分組之子組之小鼠的器官、均質化且定量其螢光。第4A圖.每公克組織之螢光強度(n=每組6只)。第4B圖.每個器官之相對信號。
第5圖.在於低張溶液中進行溶血處理之前(左版面)及之後(右版面)小鼠紅血球(RBC)之相差顯微術影像。藉由指示RBC內部之介質改變的相差變化驗證RBC內部內含物(血色素)之喪失。
第6圖.在獲得RBC血影、音波處理5分鐘、400 nm擠壓及100 nm擠壓之後，RBC膜源性小泡之平均直徑，如藉由動態光散射(DLS)所量測。
第7圖.歷經72小時之時期，聚乙二醇化脂質-PLGA雜交奈米粒子(NP)中之DiD染料的螢光保留。
第8圖.在RBC膜包覆之前(左)及之後(右)，PLGA奈米粒子(NP)之平均粒子直徑，如藉由DLS所量測。
第9圖. RBCm遮蔽之NP之構建物質及製備過程的圖解說明。藉由DLS量測RBC血影、RBCm源性小泡、聚合核心及RBCm遮蔽之NP之水力尺寸。
第10圖.在各種初始藥物輸入量下，RBCm遮蔽之NP中之小紅莓(DOX)裝載量。藥物分子經由兩種不同裝載機制裝載至NP中，亦即分別為物理囊封及化學共軛。
第11圖. DOX裝載之RBCm遮蔽之NP的活體外穩定 性測試。DOX經由化學共軛或物理囊封裝載至NP中。第11(A)圖DOX裝載之RBCm遮蔽之NP就在室溫下持續7天之時期監測的粒度(直徑，nm)及於PBS緩衝液中之多分散性指數(PDI)而言的長期穩定性。第11(B)圖藉由量測在560 nm波長下之UV吸光度評估DOX裝載之RBCm遮蔽之NP及裸NP核心(無RBCm遮蔽物)於100% FBS中之穩定性。
第12(A)圖 RBCm遮蔽之NP及聚乙二醇化NP的DOX釋放概況。對於此等釋放研究，NP內部之初始DOX濃度對於化學共軛及物理囊封而言分別為5 wt%及1.8 wt%。第12(B)圖對於物理囊封系統，將藥物釋放百分比相對於時間之平方根繪圖，此使用擴散支配性希古契模型產生線性擬合。
第13圖.針對自AML患者之周邊血液建立之Kasumi-1細胞株的比較細胞毒性研究，其中正方形代表具有化學共軛之DOX之RBCm遮蔽之NP，圓圈代表具有物理囊封之DOX之RBCm遮蔽之NP，且三角代表游離DOX。所有樣品皆在MTT分析之前與Kasumi-1細胞一起培育72小時(n=4)。
第14圖.癌細胞膜遮蔽之免疫刺激性奈米粒子作為癌症治療疫苗之圖解說明。
第15圖.製備癌細胞膜遮蔽之聚合奈米粒子之三步過程的說明：合成佐劑裝載之聚合奈米粒子、製備癌細胞膜源性小泡、及使聚合奈米粒子與小泡融合。
第16圖.圖解說明所提出之個人化癌症治療疫苗之工作機制：(i)自個別患者之腫瘤收集癌細胞且使用天然癌細胞膜包覆佐劑裝載之奈米粒子；(ii)此等免疫刺激性奈米粒子由不成熟樹突狀細胞吸收且因此觸發其成熟；(iii)成熟之樹突狀細胞向細胞毒性T細胞呈現癌症抗原且活化針對抗原之免疫反應；(iv)活化之細胞毒性T細胞破壞表現特定癌症抗原之腫瘤。
第17a圖. TEM影像顯示癌細胞膜遮蔽之PLGA奈米粒子之核心-殼結構。第17b圖.如藉由DLS所量測之奈米粒子直徑。第17c圖.經透析癌細胞膜遮蔽之奈米粒子與完整癌細胞之蛋白質及DNA含量之SDS-PAGE的比較。第17d圖.解迴旋螢光顯微術影像證明膜物質與PLGA核心共傳遞。癌細胞膜用NBD染料(綠色)染色，聚合核心用DiD染料(紅色)裝載，且細胞核用DAPI(藍色)染色。
第18(A)圖 毒素奈米海綿中和PFT之示意圖。奈米海綿由基材支撐之其中可併入PFT之RBC雙層膜組成。第18(B)圖在α-毒素存在下對單一奈米海綿之TEM觀測。樣品於乙酸鈾醯中負染色(標尺=20 nm)。第18(C)圖對與α-毒素混合之奈米海綿之TEM觀測(標尺=80 nm)。
第19(A)圖 與於PBS中製備之α-毒素一起培育30分鐘之後的離心RBC、聚乙二醇化PLGA奈米粒子、聚乙二醇化脂質體、RBC膜小泡及毒素奈米海綿溶液。各管於 最終體積2 mL PBS中含有5%經純化RBC、3 μg α-毒素及200 μg相應奈米調配物。第19(B)圖基於540 nm下之吸光度對RBC溶血之定量。第19(C)圖過濾與3 μg α-毒素混合之200 μg奈米調配物且藉由SDS-PAGE分析其毒素吸收。製備3 μg未過濾α-毒素作為參照物。第19(D)圖將親脂性染料DMPE-若丹明(紅色)與奈米調配物合併以指示膜物質在與細胞一起培育後的分佈。在與人類臍靜脈內皮細胞一起培育1小時之後，染料之廣泛分佈(左)表明膜小泡可能與細胞膜融合，且獨特顆粒(右)指示奈米海綿之膜物質吸收至細胞內。第19(E)圖不同量之α-毒素在先前與或未與奈米海綿混合之情況下的溶血活性。總奈米海綿含量固定在200 μg下且於2 mL含有5%之RBC之PBS溶液中檢查溶血。第19(F)圖用不同量之奈米海綿抑制α-毒素溶血。總毒素含量固定在9 μg下且於2 mL含有5%之RBC之PBS溶液中檢查溶血。
第20圖.將150 μL 12 μg/mL α-毒素及由100 μg奈米海綿中和之相同調配物皮下注射至小鼠之側腹區域中。第20(A)圖在注射之後3天在毒素注射之小鼠上觀察到代表性皮膚病變。第20(B)圖奈米海綿中和之毒素注射顯示對皮膚無可觀察到之影響。第20(C)圖組織切片揭示毒素在表皮中施以明顯發炎性浸潤、細胞凋亡、壞死及水腫。(標尺=80 μm)第20(D)圖在注射奈米海綿中和之毒素之後未觀察到表皮中有異常。(標尺=80 μm)第20(E)圖肌肉纖維上之撕裂、原纖維間水腫及嗜中性白血 球自周圍血管結構之外滲揭示毒素對肌肉之損害。(標尺=20 μm)第20(F)圖正常肌肉纖維結構及缺乏發炎性徵象表明毒素由奈米海綿中和。(標尺=20 μm)
第21圖.靜脈內注射75 μg/kg α-毒素之後歷經15天時期的小鼠存活率(黑色)；在毒素注射之後(紅色)或之前(藍色)2分鐘靜脈內投與80 mg/kg之奈米海綿。使用對數秩檢定(log-rank test)獲得p值。毒素注射之小鼠僅具有0%存活率；用奈米海綿後接種之小鼠具有44%存活率(p=0.0091)；用奈米海綿前接種之小鼠具有89%存活率(p<0.0001)。所有注射皆經由尾靜脈，經由靜脈內途徑進行(n=9)。
第22圖.毒素奈米海綿之製備過程之示意圖。
第23圖.膜包覆之奈米粒子用於毒素主動免疫之圖解說明。
第24圖.經葡萄球菌α-溶血素、熱變性毒素或奈米粒子中和之毒素在頸部區域中皮下接種之小鼠的代表性影像。在接種之後72小時，檢查小鼠且在粒子/毒素接種之小鼠上未觀察到皮膚病變。
第25圖.在每週一次接種熱變性毒素或奈米粒子中和之毒素3次之後，萃取經接種小鼠之血清且使用ELIZA檢查其針對α溶血素之抗體效價。奈米粒子/毒素組顯示與熱變性毒素組相等之抗體效價。
第26圖.藉由首先將毒素與來自經接種小鼠之血清之稀釋液一起培育來進行紅血球溶血分析。混合物隨後與 RBC混合且檢查其溶血活性。來自奈米粒子/毒素接種之小鼠之血清顯示顯著抑制毒素活性。
第27圖.小鼠用奈米粒子中和之α溶血素每週一次接種3次，隨後經受毒素攻擊，其中靜脈內注射致死劑量之α溶血素。非免疫小鼠用相同劑量之毒素注射作為對照。粒子/毒素免疫之小鼠在72小時標時時顯示100%存活率而在6小時標時之後非免疫小鼠無一存活(n=10)。
第28圖.膜包覆之奈米粒子用於毒素中和之圖解說明。

Claims (81)

  1. 一種奈米粒子，其包含：a)包含非細胞物質之內部核心；及b)包含來源於細胞之細胞膜或來源於病毒之膜的外部表面。
  2. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中該內部核心包含選自下述之生物相容性物質或合成物質：聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內酯(PCL)、聚離胺酸及聚麩胺酸。
  3. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中該內部核心支撐該外部表面。
  4. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中該細胞膜包含質膜或細胞內膜。
  5. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中該細胞膜來源於選自細菌或真菌之單細胞生物體、或選自植物、脊椎動物、非人類哺乳動物或人類之多細胞生物體。
  6. 如申請專利範圍第5項之奈米粒子，其中該細胞膜來源於血球、腫瘤細胞、癌細胞、免疫細胞、幹細胞、內皮細胞、外泌體、分泌小泡或突觸小泡。
  7. 如申請專利範圍第6項之奈米粒子，其中該細胞膜包含來源於紅血球之質膜。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之奈米粒子，其另包含可釋放裝載物(cargo)。
  9. 如申請專利範圍第8項之奈米粒子，其中該可釋 放裝載物位於該內部核心之內或之上、該內部核心與該外部表面之間、或該外部表面之內或之上。
  10. 如申請專利範圍第8項之奈米粒子，其中該可釋放裝載物之釋放係藉由使該奈米粒子與標的細胞、組織、器官或個體接觸或藉由改變該奈米粒子周圍之物理參數觸發。
  11. 如申請專利範圍第8項之奈米粒子，其中該可釋放裝載物為治療劑、預防劑、診斷劑或標記劑、預後劑或彼等之組合。
  12. 如申請專利範圍第8項之奈米粒子，其中該可釋放裝載物為金屬粒子、聚合粒子、樹枝狀聚合物粒子或無機粒子。
  13. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子之直徑為約10 nm至約10 μm。
  14. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子實質上缺乏該細胞膜所來源之細胞的組分或該病毒膜所來源之病毒的組分。
  15. 如申請專利範圍第14項之奈米粒子，其中該細胞膜包含來源於紅血球之質膜且該奈米粒子實質上缺乏血色素。
  16. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子實質上維持該細胞膜、來源於病毒之膜或該細胞膜或病毒膜之多重組分的天然結構完整性或活性。
  17. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子具有生物相容性或生物可降解性。
  18. 如申請專利範圍第1項之奈米粒子，其中該內部核心包含PLGA且該外部表面包含來源於紅血球之質膜。
  19. 如申請專利範圍第18項之奈米粒子，其中該奈米粒子之活體內血液循環半衰期為PEG包覆之類似奈米粒子的半衰期的至少約2-5倍，或活體內血液循環半衰期為至少約5至約40小時。
  20. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之奈米粒子，其中該奈米粒子實質上缺乏對該細胞膜所來源之物種或個體之免疫原性。
  21. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之奈米粒子，其中該外部表面包含天然存在之細胞膜或病毒膜且另包含合成膜。
  22. 一種藥劑傳遞系統，其包含有效量之如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之奈米粒子。
  23. 如申請專利範圍第22項之藥劑傳遞系統，其另包含另一活性成分、或醫學上或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  24. 一種醫藥組成物，其包含有效量之如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之奈米粒子及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  25. 如申請專利範圍第24項之醫藥組成物，其另包含另一活性成分。
  26. 一種有效量之如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之奈米粒子之用途，其係用於製造供治療或預防有需要之個體之疾病或病狀的藥劑。
  27. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該個體為人類或非人類哺乳動物。
  28. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該奈米粒子中該細胞膜來源於該個體之相同物種之細胞或來源於該個體之細胞。
  29. 如申請專利範圍第28項之用途，其中該奈米粒子中該細胞膜來源於該個體之相同物種之紅血球且該紅血球具有與該個體之相同之血型。
  30. 如申請專利範圍第26項至第29項中任一項之用途，其中該藥劑另包含另一活性成分或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，或該奈米粒子係經由藥劑傳遞系統投予。
  31. 一種製備奈米粒子之方法，其包含：a)使包含非細胞物質之內部核心與包含來源於細胞之細胞膜或來源於病毒之膜的外部表面組合；及b)對該組合施加外源能量以形成包含該內部核心及該外部表面之奈米粒子。
  32. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該外源能量為機械能、聲能或熱能。
  33. 如申請專利範圍第31項之方法，其中該細胞膜為來源於細胞之天然存在之細胞膜，或該膜為來源於病毒之天然存在之膜。
  34. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該外部表面另包含合成膜，且所產生之該奈米粒子包含該內部核心及包含該細胞膜或病毒膜及該合成膜之外部表面。
  35. 一種贅瘤特異性免疫原性組成物，其包含有效量之奈米粒子，該奈米粒子包含內部核心和外部表面，該內部核心包含非細胞物質且該外部表面包含來源於贅瘤細胞之細胞膜。
  36. 如申請專利範圍第35項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其中該細胞膜來源於良性贅瘤細胞、潛在惡性贅瘤細胞、癌細胞、癌細胞株或個體之癌細胞。
  37. 如申請專利範圍第35項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其中該奈米粒子之外部表面中之該細胞膜實質上保留其用於引發針對該贅瘤細胞之免疫反應之結構完整性。
  38. 如申請專利範圍第35項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其中該內部核心支撐該外部表面。
  39. 如申請專利範圍第35項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其中該內部核心包含PLGA且該外部表面包含來源於贅瘤細胞之質膜。
  40. 如申請專利範圍第35項至第39項中任一項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其中該奈米粒子另包含另一活性成分或可釋放裝載物。
  41. 如申請專利範圍第35項至第39項中任一項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其中該奈米粒子之直徑為約10 nm至約10 μm。
  42. 如申請專利範圍第35項至第39項中任一項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其中該奈米粒子實質上缺乏該細胞膜所來源之該贅瘤細胞之組分。
  43. 如申請專利範圍第35項至第39項中任一項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其另包含免疫原性佐劑或免疫增強劑。
  44. 如申請專利範圍第35項至第39項中任一項之贅瘤特異性免疫原性組成物，其中該奈米粒子之外部表面包含天然存在之細胞膜或病毒膜且另包含合成膜。
  45. 一種疫苗，其包含如申請專利範圍第35項至第44項中任一項之贅瘤特異性免疫原性組成物。
  46. 一種有效量之如申請專利範圍第1項至第21項中任一項之奈米粒子或有效量之如申請專利範圍第35項至第44項中任一項之贅瘤特異性免疫原性組成物之用途，該奈米粒子係用於製造贅瘤或癌症特異性免疫原性組成物，且該贅瘤特異性免疫原性組成物係用於製造供針對贅瘤的治療或保護個體拮抗贅瘤之疫苗。
  47. 如申請專利範圍第46項之用途，其中該個體為人類或非人類哺乳動物。
  48. 如申請專利範圍第46項之用途，其中該細胞膜來源於該個體之相同物種之贅瘤細胞或該個體之贅瘤細胞。
  49. 如申請專利範圍第46項至第48項中任一項之用 途，其中該免疫原性組成物或疫苗另包含另一活性成分或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  50. 一種用於治療或預防與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀之醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含有效量之奈米粒子，該奈米粒子包含內部核心和外部表面，該內部核心包含非細胞物質且該外部表面包含來源於標的細胞之細胞膜或質膜。
  51. 如申請專利範圍第50項之醫藥組成物，其中該毒素作為天然病理機制之一部分插入該標的細胞之細胞膜或質膜，或該奈米粒子之外部表面中之該細胞膜或質膜實質上保留該毒素。
  52. 如申請專利範圍第50項之醫藥組成物，其中該毒素為細菌、真菌或動物毒素。
  53. 如申請專利範圍第50項至第52項中任一項之醫藥組成物，其中該內部核心支撐該外部表面，且該奈米粒子之外部表面中之該細胞膜實質上保留其用於實質上保留該毒素之結構完整性。
  54. 如申請專利範圍第50項至第52項中任一項之醫藥組成物，其中該奈米粒子之外部表面包含天然存在之細胞膜或病毒膜且另包含合成膜。
  55. 如申請專利範圍第50項至第52項中任一項之醫藥組成物，其中該奈米粒子具有生物相容性、生物可降解性，或包含合成物質。
  56. 如申請專利範圍第50項至第52項中任一項之醫 藥組成物，其中該外部表面包含來源於紅血球之質膜。
  57. 如申請專利範圍第50項至第52項中任一項之醫藥組成物，其另包含另一活性成分或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  58. 一種有效量之如申請專利範圍第50項至第57項中任一項之醫藥組成物之用途，其係用於製造供治療或預防個體之與細胞膜插入毒素相關之疾病或病狀的藥劑。
  59. 如申請專利範圍第58項之用途，其中該個體為人類或非人類哺乳動物。
  60. 如申請專利範圍第58項之用途，其中該細胞膜或質膜來源於該個體之相同物種之細胞或該個體之細胞。
  61. 如申請專利範圍第60項之用途，其中該質膜來源於該個體之相同物種之紅血球且該紅血球具有與該個體相同之血型。
  62. 如申請專利範圍第58項至第61項中任一項之用途，其中該藥劑另包含另一活性成分或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  63. 一種免疫原性組成物，其包含有效量之奈米粒子，該奈米粒子包含內部核心和外部表面，該內部核心包含非細胞物質且該外部表面包含來源於細胞之細胞膜及細胞膜插入毒素。
  64. 如申請專利範圍第63項之免疫原性組成物，其中該細胞膜為來源於細胞之質膜。
  65. 如申請專利範圍第63項之免疫原性組成物，其 中該毒素作為天然病理機制之一部分插入該標的細胞之細胞膜或質膜，或該奈米粒子之外部表面中之該細胞膜或質膜實質上保留該毒素。
  66. 如申請專利範圍第63項至第65項中任一項之免疫原性組成物，其中該奈米粒子之外部表面中之該毒素實質上保留其用於引發針對天然毒素之免疫反應之天然結構完整性。
  67. 如申請專利範圍第63項至第65項中任一項之免疫原性組成物，其中該毒素為細菌、真菌或動物毒素。
  68. 如申請專利範圍第63項至第65項中任一項之免疫原性組成物，其中該奈米粒子之外部表面包含天然存在之細胞膜或病毒膜且另包含合成膜。
  69. 如申請專利範圍第63項至第65項中任一項之免疫原性組成物，其中該奈米粒子具有生物相容性、生物可降解性，或包含合成物質。
  70. 如申請專利範圍第63項至第65項中任一項之免疫原性組成物，其中該內部核心支撐該外部表面。
  71. 如申請專利範圍第63項至第65項中任一項之免疫原性組成物，其中該外部表面包含來源於紅血球之質膜。
  72. 如申請專利範圍第63項至第65項中任一項之免疫原性組成物，其另包含另一活性成分或免疫原性佐劑或免疫增強劑。
  73. 一種疫苗，其包含如申請專利範圍第63項至第 72項中任一項之免疫原性組成物。
  74. 一種有效量之奈米粒子之用途，其係用於製造針對個體內細胞膜插入毒素之免疫原性組成物，其中該奈米粒子包含內部核心和外部表面，該內部核心包含非細胞物質且該外部表面包含來源於細胞之細胞膜及該細胞膜插入毒素。
  75. 一種有效量之如申請專利範圍第63項至第72項中任一項之免疫原性組成物之用途，其係用於製造針對細胞膜插入毒素的保護個體之疫苗。
  76. 如申請專利範圍第74項或第75項之用途，其中該毒素為細菌、真菌或動物毒素。
  77. 如申請專利範圍第74項或第75項之用途，其中該個體為人類或非人類哺乳動物。
  78. 如申請專利範圍第74項或第75項之用途，其中該細胞膜或質膜來源於該個體之相同物種之細胞或該個體之細胞。
  79. 如申請專利範圍第78項之用途，其中該質膜來源於該個體之相同物種之紅血球且該紅血球具有與該個體相同之血型。
  80. 如申請專利範圍第74項或第75項之用途，其中該免疫原性組成物或疫苗另包含另一活性成分或醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  81. 如申請專利範圍第74項或第75項之用途，其中該免疫反應為T細胞介導之免疫反應或B細胞介導之免疫 反應。
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