CN106620684A - 一种泛耐药菌的纳米疫苗及其制备方法 - Google Patents

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石学银
吴广喜
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Abstract

本发明提供了一种泛耐药菌的纳米疫苗及其制备方法，其特征在于：由细菌细胞膜和纳米颗粒组成；其中，所述细菌细胞膜包裹于纳米颗粒的外表面。使用完整的细菌细胞膜包被纳米颗粒制备成纳米疫苗，既减轻了病原体的毒性，又保留了完整的免疫相关的抗原表位。

Description

一种泛耐药菌的纳米疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及细菌疫苗领域，具体地，涉及一种泛耐药菌的纳米疫苗及其制备方法。
背景技术
纳米疫苗是当今生命科学研究的热点之一,是基于纳米技术研发的一种新型疫苗,具有安全、稳定、高效、无需佐剂等特点,具有良好的发展前景。
纳米疫苗血清稳定性良好，且纳米疫苗接种后，启动完全模拟病原体的免疫反应，产生针对此种病原体的高滴度的特异性抗体及记忆性B细胞。当病原体感染免疫过的动物时，动物不会出现感染性疾病。
但是，目前只有使用细菌外膜囊泡包被的纳米颗粒。由于在不同的培养条件下，得到的外膜囊泡成分不一样。而且细菌外膜囊泡上含有的抗原只是细胞膜上的部分抗原。所以使用外膜囊泡包被纳米颗粒制备的疫苗存在不足。
此外，对于细菌外膜囊泡，仅G-菌和少部分G+可以分泌外膜囊泡，故而，使用外膜囊泡来制备细菌疫苗无法普遍的适用于所有细菌，故而，使该种制备疫苗的方法受到限制。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供应用前景广阔的纳米疫苗。
具体地，本发明提供的一种泛耐药菌的纳米疫苗，其特征在于：由细菌细胞膜和纳米颗粒组成；
其中，上述细菌细胞膜包裹于纳米颗粒的外表面。
该纳米颗粒可选自任何可作为生物载体等功能的纳米材料，优选如：金属纳米颗粒、蛋白纳米颗粒、高分子纳米颗粒等。
另外，本发明还提供了上述一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：在机械力的作用下，采用挤入包裹的方式，将细菌细胞膜包被于纳米颗粒的表层形成细菌疫苗。
进一步地，本发明提供的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，还具有这样的特点：即、上述细菌细胞膜的用量为纳米颗粒的表面积与细菌细胞膜的表面积比值的1-1.5倍。即、根据不同纳米颗粒的表面积/平均表面的大小，以及不同分离获得的细菌细胞膜的表面积/平均表面的大小，通过计算机计算的方式计算出每个纳米颗粒需要包裹的细菌细胞膜的数量后进行配比。
进一步地，本发明提供的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，还具有这样的特点：即、上述纳米颗粒的粒径为10-200nm优选为30-100nm。
进一步地，本发明提供的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，还具有这样的特点：即、上述纳米颗粒选自金属纳米颗粒、蛋白纳米颗粒、高分子纳米颗粒中的一种。
进一步地，本发明提供的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，还具有这样的特点：即、上述金属纳米颗粒选自纳米金、纳米银、纳米铁；
上述蛋白纳米颗粒来源于动物蛋白质或植物蛋白质；
上述高分子纳米颗粒选自聚乳酸类高分子聚合物。
进一步地，本发明提供的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，还具有这样的特点：即、上述蛋白纳米颗粒选自来源于酪蛋白、乳清蛋白胶原质、鸡卵清蛋白、牛血清蛋白、大豆蛋白、牛奶蛋白或小麦麦质的蛋白纳米材料中的一种。
进一步地，本发明提供的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，还具有这样的特点：即、上述高分子纳米颗粒选自PGLC、PLGE、PLLA、PLGA中的一种。
进一步地，本发明提供的细菌疫苗的制备方法，还具有这样的特点：即、具体制造方法如下所示：
步骤一、培养细菌；
步骤二、去除细胞壁；如：使用溶菌酶去除细胞壁等方案
步骤三、离心分离、收集细菌细胞膜。
步骤四、合成纳米材料；该纳米材料一般由热聚法合成；也可以为使用现有的纳米材料。
步骤五、将细菌细胞膜和纳米颗粒混合，在机械力的作用下，将细菌细胞膜包裹在纳米颗粒表层。
该机械力搅拌的过程一般为0.5-72小时不等。
该过程一般通过多次过膜(如：7-10次左右)的方式来实现，其后采用透析过滤/超滤等类似的材料来实现，排除未成型的杂质，获得目标粒径疫苗的结果。
进一步地，本发明提供的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，还具有这样的特点：即、在步骤一中，当细菌为含有荚膜的细菌时，通过调整培养条件(如：改变培养基成分，pH值，CO2浓度等条件)，使细菌不产生荚膜。
本发明的作用和效果：
本发明提供了一种全新的，采用细菌细胞膜制备的纳米细菌疫苗。
所有的细菌都有细胞膜，而细菌细胞膜上含有病原体相关分子模式(PAMP)等，故而，使用完整的细菌细胞膜包被纳米颗粒制备成纳米疫苗，既减轻了病原体的毒性，又保留了完整的免疫相关的抗原表位。
而且纳米颗粒结构、形状、大小便于控制。所以使用细菌细胞膜包被的纳米疫苗有广阔的应用前景。
此外，常见多糖疫苗，使用提纯的荚膜多糖，对于2岁以下的小孩和老年人，几乎没有免疫保护效果；多糖结合疫苗，对2岁以下小孩和老年人，有免疫保护作用，但是同时存在“载体蛋白诱导的表位抑制”。而针对“载体蛋白诱导的表位抑制”，常用的方法有增加免疫次数、加大免疫剂量，但是，其效果并不理想。
然，本发明提供的方法制造的纳米疫苗有望缓解多糖结合疫苗常见的“载体蛋白诱导的表位抑制”这个问题。
此外，采用本发明的方法，可制备不同形状和大小的细菌疫苗，例如，根据细菌的形态或大小来制造相似造型的纳米颗粒后进行细胞膜的包裹。
具体实施方式
实施例一、基于肺炎克雷伯菌的细菌疫苗
1、细胞膜的收集
将-80℃冻存的肺炎克雷伯菌菌株接种于LB琼脂平板，37℃孵箱孵育24h，挑取单个菌落于无菌LB液体培养基37℃摇床培养16h；转移至1L无菌LB液继续培养至D600nm为1.0。将培养至对数生长期的菌液以1000×g，离心10min,收集沉淀。用新鲜的培养基轻微吹匀沉淀，转移至新的容器中。使用溶菌酶去除细胞壁。以1000×g，离心10min,收集上清。
将Optiprep梯度离心液用50mmol/LHepes-150mmol/LNaCl稀释至以下浓度：60％、40％、35％、30％、25％和20％。将收集的上清转移至无菌超滤离心管中，50000×g，离心1h，将沉淀重悬于1ml 50mmol/LHepes(pH6.8)后与4.5ml60％Optiprep充分混匀后加入到35ml容量的无菌超滤离心管底部，在此之上从下至上小心加入以下密度的Optiprep梯度离心液：6mL40％、6mL35％、9mL30％、6mL25％和3mL20％Optiprep/10mmoL/Hepes-0.85％NaCl,100000×g,离心16h(4℃)，离心完毕后，吸取第二层和第三层交界面液体0.5mL保存于10mmol/L HEPES(pH6.8)中。低温保存。
2、纳米材料的合成
(1)、样品瓶、转子，二次水清洗后，超声清洗。吹风机吹干，备用。透析缸清洗干净，备用。
(2)、调整磁力加热搅拌器，设定温度为72℃，转速为750r/min。
(3)、称量5mg的OVA，使用二次水溶解至终浓度1mg/ml。
(4)、5ml的样品瓶，加入小转子，2.5ml的OVA，然后加入配制好的pH＝6.0的MES，至满瓶。
(5)、样品搅拌均匀后，预热3次，每次约3s.
(6)、加热约2min15s。待颜色达到估计约50nm时，取出样品瓶，转移至冰水混合物中终止反应。
(6)动态光散射粒度仪测量粒径。
(7)使用30k透析袋透析。
按细菌膜的表面面积进行计算机计算，将细菌细胞膜和1:1的50nm粒径的OVA纳米颗粒混合，在机械力的作用下，搅拌15分钟，将细菌细胞膜包裹在纳米颗粒表层，过膜7次。
实施例二、基于耐甲氧西林金葡菌的细菌疫苗
将-80℃冻存的耐甲氧西林金葡菌菌株接种于LB琼脂平板，37℃孵箱孵育24h，挑取单个菌落于无菌LB液体培养基37℃摇床培养16h；转移至1L无菌LB液继续培养至D600nm为1.0.
将培养至对数生长期的菌液以1000×g，离心10min,收集沉淀，转移至新的容器中。使用溶菌酶去除细胞壁。以1000×g，离心10min,收集上清。
将Optiprep梯度离心液用50mmol/LHepes-150mmol/LNaCl稀释至以下浓度：60％、40％、35％、30％、25％和20％。将收集的上清转移至无菌超滤离心管中，50000×g，离心1h，将沉淀重悬于1ml50mmol/LHepes(pH6.8)后与4.5ml60％Optiprep充分混匀后加入到35ml容量的无菌超滤离心管底部，在此之上从下至上小心加入以下密度的Optiprep梯度离心液：6mL40％、6mL35％、9mL30％、6mL25％和3mL20％Optiprep/10mmoL/Hepes-0.85％NaCl,100000×g,离心16h(4℃)，离心完毕后，吸取第二层和第三层交界面液体0.5mL保存于10mmol/L HEPES(pH6.8)中。低温保存。
合成纳米材料
(1)、样品瓶、转子，二次水清洗后，超声清洗。吹风机吹干，备用。透析缸清洗干净，备用。
(2)、调整磁力加热搅拌器，设定温度为72℃，转速为750r/min。
(3)、称量5mg的OVA，使用二次水溶解至终浓度1mg/ml。
(4)、5ml的样品瓶，加入小转子，2.5ml的OVA，然后加入配制好的pH＝6.0的MES，至满瓶。
(5)、样品搅拌均匀后，预热3次，每次约3s.
(6)、加热约2min40s。待颜色达到估计约100nm时，取出样品瓶，转移至冰水混合物中终止反应。
(6)动态光散射粒度仪测量粒径。
(7)使用30k透析袋透析。
按细菌膜的表面面积进行计算机计算，将细菌细胞膜和1:1.5的100nm粒径的OVA纳米颗粒混合，在机械力的作用下，搅拌25分钟，将细菌细胞膜包裹在纳米颗粒表层，过膜10次。
在上述实施例中，还可将OVA纳米颗粒替换粒径为10-200nm不等的纳米金或纳米PLGE等纳米材料。

Claims (10)

1.一种泛耐药菌的纳米疫苗，其特征在于：由细菌细胞膜和纳米颗粒组成；其中，所述细菌细胞膜包裹于纳米颗粒的外表面。
2.一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：
在机械力的作用下，采用挤入包裹的方式，将细菌细胞膜包被于纳米颗粒的表层形成细菌疫苗。
3.如权利要求1所述的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：所述细菌细胞膜的用量为纳米颗粒的表面积与细菌细胞膜的表面积比值的1-1.5倍。
4.如权利要求2所述的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：所述纳米颗粒的粒径为10-200nm。
5.如权利要求2所述的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：所述纳米颗粒选自金属纳米颗粒、蛋白纳米颗粒、高分子纳米颗粒中的一种。
6.如权利要求5所述的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：所述金属纳米颗粒选自纳米金、纳米银、纳米铁；
所述蛋白纳米颗粒来源于动物蛋白质或植物蛋白质；
所述高分子纳米颗粒选自聚乳酸类高分子聚合物。
7.如权利要求5所述的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：所述蛋白纳米颗粒选自来源于酪蛋白、乳清蛋白胶原质、鸡卵清蛋白、牛血清蛋白、大豆蛋白、牛奶蛋白或小麦麦质的蛋白纳米材料中的一种。
8.如权利要求3所述的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：所述高分子纳米颗粒选自PGLC、PLGE、PLLA、PLGA中的一种。
9.如权利要求2-8任一所述的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于，具体制造方法如下所示：
步骤一、培养细菌；
步骤二、去除细胞壁；
步骤三、离心分离、收集细菌细胞膜。
步骤四、合成纳米材料；
步骤五、将细菌细胞膜和纳米颗粒混合，在机械力的作用下，将细菌细胞膜包裹在纳米颗粒表层。
10.如权利要求9所述的一种泛耐药菌的纳米疫苗的制备方法，其特征在于：在步骤一中，当细菌为含有荚膜的细菌时，通过调整培养条件，使细菌不产生荚膜。
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